專利名稱：抗家畜和水產(chǎn)病原體的特異性IgY或復(fù)合IgY及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸醫(yī)領(lǐng)域，具體涉及一種抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性IgY或復(fù)合IgY以及這種IgY在飼料添加劑和預(yù)配劑等中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對(duì)于家畜中經(jīng)常發(fā)生的感染性疾病，如感染性胃腸炎、流行性腹瀉等，水產(chǎn)中經(jīng)常發(fā)生的爛鰓病、腸炎病、爛尾病、細(xì)菌性敗血癥等，目前世界各地基本上主要采用抗生素和各種化學(xué)殺菌劑來(lái)防治。但是，一方面，家畜和魚(yú)類中許多感染性疾病是由病毒引起的，抗生素對(duì)病毒是沒(méi)有作用的；另一方面，全球都關(guān)注抗生素和化學(xué)藥的殘留問(wèn)題，它會(huì)污染肉、魚(yú)、蛋、奶等產(chǎn)品以及環(huán)境，危害人類健康；而且，濫用抗生素，還會(huì)誘發(fā)病菌發(fā)生變異，產(chǎn)生耐藥菌，增加對(duì)這些疾病的治療難度。開(kāi)發(fā)一種安全有效的防治這樣常見(jiàn)家畜和水產(chǎn)品感染性疾病的新方法，尋找既無(wú)藥殘，又無(wú)污染，又能提高飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)效益的抗生素替代品，成為擺在世界各國(guó)畜產(chǎn)、水產(chǎn)科學(xué)家和畜醫(yī)學(xué)界的重要課題。
也有學(xué)者試圖從豬的糞便中分離出一種大腸桿菌、一種傳染性胃腸炎病毒、一種流行性腹瀉病毒和輪狀病毒，培飬后制作疫苗，用其免疫雞，直接就采用母雞卵黃干燥后作食品添加劑。由于引致豬腹瀉的病菌除了大腸桿菌外，尚有魏氏梭菌和豬鏈球菌，而大腸桿菌、魏氏梭菌和豬鏈球菌又有幾十種不同的型。引起傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒也有許多不同種型，而且經(jīng)常發(fā)生變異。另外，未經(jīng)提取的卵黃僅含有少量抗體成份，抗體活性很低，而且還含有許多脂蛋白和雜蛋白，直接用于治療豬腹瀉等疾病，效果成疑。因此，采用常規(guī)的方法所制成的認(rèn)為可防治豬腹瀉的僅可能對(duì)付個(gè)別細(xì)菌或病毒的、低活性的卵黃粉，對(duì)于種型繁多的頑固的致病菌及經(jīng)常變異的病毒是難以真正達(dá)到實(shí)際效果的。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上敘缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種抗家畜和水產(chǎn)病原體的特異性IgY或復(fù)合IgY，通過(guò)對(duì)大腸桿菌、魏氏梭菌、鏈球菌菌株和病毒抗原的特殊處理方法以及采用基因工程重組傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒表達(dá)蛋白，提高其抗原性；并采用純水提取IgY的工藝和納米技術(shù)等方法，以增強(qiáng)所制備的卵黃免疫球蛋白的實(shí)際療效。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的1.篩選引致家畜和水產(chǎn)感染性疾病的主要病原體，并根據(jù)這些有代表性的病原體的「抗原交叉性」進(jìn)行分類組合。
1.1豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉1.1.1細(xì)菌類1.1.1.1腸毒性大腸埃希氏菌1.1.1.2 C型魏氏梭菌菌株1.1.1.3豬鏈球菌1.1.2病毒類1.1.2.1豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)1.1.2.2豬流行性腹瀉病毒(PEDV)1.1.2.3豬輪狀病毒(HRV)1.2水產(chǎn)類主要感染病原體
1.2.1細(xì)菌類1.2.1.1柱狀嗜纖維菌1.2.1.2嗜水氣單胞菌1.2.1.3氣單胞菌1.2.1.4孤菌1.2.2真菌類1.2.2.1水霉菌1.2.2.2綿霉菌1.2.2.3絲囊霉菌1.2.2.4鰓霉菌1.2.3病毒類1.2.3.1呼腸孤病毒1.2.3.2魚(yú)皰疹病毒1.3牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉1.3.1細(xì)菌類1.3.1.1牛腸毒性大腸埃希氏菌1.3.1.2 B型魏氏梭菌菌株1.3.2病毒類1.3.2.1牛傳染性胃腸炎病毒(TGEV)1.3.2.2牛流行性腹瀉病毒(PEDV)1.3.2.3牛輪狀病毒(HRV)2.在篩選和分類組合各種家畜、水產(chǎn)類感染性疾病病原體的基礎(chǔ)上，分別制備多種復(fù)合抗原
2.1豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉兩種抗原2.1.1豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌復(fù)合抗原2.1.2制備致病菌抗原成份由于大腸桿菌型種太多，簡(jiǎn)單地用一種大腸桿菌免疫母雞所制成的卵黃抗體對(duì)大多數(shù)大腸桿菌是無(wú)效的。針對(duì)這一難題，本發(fā)明采取以下兩個(gè)方法解決2.1.2.1細(xì)菌超聲粉碎，增加抗原性向美國(guó)病毒中心(ATCC)購(gòu)買腸毒性大腸埃希氏菌(ATCC#51659)、C型魏氏梭菌(ATCC#12917)、豬鏈球菌(ATCC#700794)標(biāo)準(zhǔn)菌株按照腸毒性大腸埃希氏菌C型魏氏梭菌以及豬鏈球菌的培養(yǎng)特性和最適培養(yǎng)條件，分別選擇適宜的培養(yǎng)基，進(jìn)行菌株大量繁殖，收集培養(yǎng)物，提純、分裝；然后將腸毒性大腸埃希氏菌、C型魏氏梭菌、豬鏈球菌三種細(xì)菌按1∶1∶1的比例混合，再采用超聲粉碎機(jī)將所培飬的大腸桿菌等粉碎，獲得含全菌和菌體成份的混合物。
2.1.2.2用豬大腸桿菌k88、k99兩種纖毛作為抗原成份委托新加坡國(guó)立大學(xué)培飬豬大腸桿菌k88、k99兩種纖毛。由于這兩種纖毛對(duì)是大多數(shù)大腸桿菌都具有抗原性；將其作為抗原成份，就可解決大腸桿菌型種繁復(fù)的難題。
2.1.3制作致病菌抗原同樣，采取兩種不同方法2.1.3.1菌體抗原制作把超聲粉碎后所得到的大腸桿菌等的全菌和菌體成份混合物按1-10∶10-1的比例加入福氏佐劑，再置入高速勻漿機(jī)中，以30,000rpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌菌體組合復(fù)合抗原。
2.1.3.2桿菌纖毛抗原制作將培飬好的豬大腸桿菌k88、k99兩種纖毛混合先按1∶1比例混合均勻后按1-10∶10-1的比例加入福氏佐劑，再置入高速勻漿機(jī)中，以30,000rpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌纖毛組合復(fù)合抗原。
2.1.4豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒復(fù)合抗原2.1.4.1本發(fā)明采用二種方法制作病毒抗原成份。
2.4.1.1.1病毒裂解法向美國(guó)病毒中心(ATCC)購(gòu)買豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)-(ATCC#VR-743)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)-(ATCC#VR-669)以及豬輪狀病毒(ATCC#VR-892)等三種病毒之標(biāo)準(zhǔn)毒株，采用常規(guī)方法增殖培飬，再提純。將所增殖并提純的豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)以及豬輪狀病毒按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，然后加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為1.8-2.5％，裂解30分鐘，即分別得到豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)以及豬輪狀病毒組合的病毒裂解液。經(jīng)SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢驗(yàn)分析，濃縮膠4％，分離膠7％，240V，電泳30分鐘?？棘斒狭了{(lán)染色，觀察蛋白帶。
2.1.4.1.2采用基因工程重組技術(shù)分別制備豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的表達(dá)蛋白，具體步驟如下
2.1.4.1.2.1制備豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)表達(dá)蛋白用RT-PCR方法從豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)之RNA克隆基因去掉信號(hào)肽和穿膜區(qū)的片段。先插入pGEM-T裁體。測(cè)序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達(dá)裁體pPIC9K連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，電轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌(Pichiapastoris)KM71和GS115。在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉(zhuǎn)化株。挑取單個(gè)菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過(guò)夜。稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)菌濃度達(dá)到OD600的吸光值約為0.8時(shí)，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。于培養(yǎng)的不同時(shí)間采樣，用ELISA法測(cè)定表達(dá)量。選表達(dá)量最高的時(shí)間收獲。離心去除細(xì)胞沉淀。上清中即含大量表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸餾水透析24小時(shí)以及SephacrylS-200和Sephacryl S-100柱層析后，即獲得純化的豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)表達(dá)蛋白。
2.1.4.1.2.2制備豬流行性腹瀉病毒(PEDV)表達(dá)蛋白用RT-PCR方法從豬流行性腹瀉病毒(PEDV)之RNA克隆基因去掉信號(hào)肽和穿膜區(qū)的片段。先插入pGEM-T裁體。測(cè)序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達(dá)裁體pPIC9K連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，電轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉(zhuǎn)化株。挑取單個(gè)菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過(guò)夜。稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)菌濃度達(dá)到OD600的吸光值約為0.8時(shí)，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。于培養(yǎng)的不同時(shí)間采樣，用ELISA法測(cè)定表達(dá)量。選表達(dá)量最高的時(shí)間收獲。離心去除細(xì)胞沉淀。上清中即含大量表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸餾水透析24小時(shí)以及Sephacryl S-200和Sephacryl S-100柱層析后，即獲得純化的豬流行性腹瀉病毒(PEDV)表達(dá)蛋白。
2.1.5制備病毒復(fù)合抗原2.1.5.1病毒裂解抗原將豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒以及豬輪狀病毒以三者組合的病毒裂解液的比例以1-10∶1-10的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉的病毒裂解復(fù)合抗原。
2.1.5.2基因工程病毒表達(dá)蛋白復(fù)合抗原將純化的豬傳染性胃腸炎病毒表達(dá)蛋白和純化的豬流行性腹瀉病毒表達(dá)蛋白以1-10∶1-10的比例混合均勻，然后再以1-10∶1-10的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉的病毒表達(dá)蛋白復(fù)合抗原。
2.2水產(chǎn)類三種復(fù)合抗原2.2.1水產(chǎn)致病菌復(fù)合抗原
2.2.1.2向美國(guó)病毒中心(ATCC)購(gòu)買柱狀嗜纖維菌、嗜水氣單胞菌、氣單胞菌、孤菌四種標(biāo)準(zhǔn)菌株，按照這四種細(xì)菌的培養(yǎng)特性和最適培養(yǎng)條件，分別選擇適宜的培養(yǎng)基，進(jìn)行菌株大量繁殖，收集培養(yǎng)物，提純、分裝；2.2.1.2將所培飬好的嗜纖維菌、嗜水氣單胞菌、氣單胞菌、孤菌按1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合，然后加以超聲粉碎，再按1-10∶10-1的比例加入福氏佐劑，再置入高速勻漿機(jī)中，以30,000rpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得水產(chǎn)致病菌復(fù)合抗原。
2.2.2水產(chǎn)真菌復(fù)合抗原2.2.2.1向美國(guó)病毒中心(ATCC)購(gòu)買水霉菌、綿霉菌、絲囊霉菌、鰓霉菌四種標(biāo)準(zhǔn)真菌株，按照這四種真菌的培養(yǎng)特性和最適培養(yǎng)條件，分別選擇適宜的培養(yǎng)基，進(jìn)行真菌株大量繁殖，收集培養(yǎng)物，提純、分裝；2.2.2.2將所培飬好的水霉菌、綿霉菌、絲囊霉菌、鰓霉菌四種真菌按1∶1∶1∶1的比例混合，然后加以超聲粉碎，再按1-10∶10-1的比例加入福氏佐劑，再置入高速勻漿機(jī)中，以30,000rpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得水產(chǎn)真菌復(fù)合抗原。
2.2.3水產(chǎn)病毒復(fù)合抗原向中國(guó)福建省水產(chǎn)研究所購(gòu)買現(xiàn)成的草魚(yú)出血病疫苗(抗呼腸孤病毒)和斑點(diǎn)叉尾鮰病毒疫苗(抗魚(yú)皰疹病毒)采用本發(fā)明的特殊方法進(jìn)行加工處理將其按1∶1比例混合后進(jìn)行超高速離心分離，再濃縮加工；然后加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為1.8-2.5％，裂解30分鐘。再以1-10∶10-1比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以30,000rpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得特別的水產(chǎn)病毒疫苗式復(fù)合抗原。
2.2.4呼腸孤病毒抗原向中國(guó)福建省水產(chǎn)研究所購(gòu)買現(xiàn)成的草魚(yú)出血病疫苗(抗呼腸孤病毒)采用本發(fā)明的特殊方法進(jìn)行加工處理將其置入超高速離心分離，再濃縮加工；然后加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為1.8-2.5％，裂解30分鐘。再以1-10∶10-1比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以30,000rpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得特別的呼腸孤病毒抗原。
2.2.4魚(yú)皰疹病毒抗原向中國(guó)福建省水產(chǎn)研究所購(gòu)買現(xiàn)成的斑點(diǎn)叉尾鮰病毒疫苗(抗魚(yú)皰疹病毒)采用本發(fā)明的特殊方法進(jìn)行加工處理將其置入超高速離心分離，再濃縮加工；然后加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為1.8-2.％，裂解30分鐘。再以1-10∶10-1比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以30,000rpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得特別的抗魚(yú)皰疹病毒抗原。
2.3牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉兩種抗原2.3.1牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌復(fù)合抗原同樣參照豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌復(fù)合抗原的兩種制備方法制作2.3.1.1制備致病菌抗原成份細(xì)菌超聲粉碎，增加抗原性向美國(guó)病毒中心(ATCC)購(gòu)買牛腸毒性大腸埃希氏菌(ATCC#4350)、B型魏氏梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC#12915)；按照牛腸毒性大腸埃希氏菌和B型魏氏梭菌的培養(yǎng)特性和最適培養(yǎng)條件，分別選擇適宜的培養(yǎng)基，進(jìn)行菌株大量繁殖，收集培養(yǎng)物，提純、分裝；然后將腸毒性大腸埃希氏菌、B型魏氏梭菌兩種細(xì)菌按1∶1的比例混合，再采用超聲粉碎機(jī)將所培飬的牛大腸桿菌等粉碎，獲得含全菌和菌體成份的混合物。
2.3.1.2用牛大腸桿菌纖毛作為抗原成份委托新加坡國(guó)立大學(xué)培飬牛大腸桿菌纖毛，將其作為抗原成份。制作致病菌抗原同樣，采取兩種不同方法2.3.1.2.1菌體抗原制作把超聲粉碎后所得到的牛大腸桿菌等的全菌和菌體成份混合物按1-10∶10-1的比例加入福氏佐劑，再置入高速勻漿機(jī)中，以30,000rpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌菌體組合復(fù)合抗原。
2.3.1.2.2桿菌纖毛抗原制作將培飬好的牛大腸桿菌纖毛混合均勻后按1-10∶10-1的比例加入福氏佐劑，再置入高速勻漿機(jī)中，以30,000rpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌纖毛組合復(fù)合抗原。
2.3.2牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒復(fù)合抗原2.3.2.1本發(fā)明采用二種方法制作病毒抗原成份。
2.3.2.1.1病毒裂解法向美國(guó)病毒中心(ATCC)購(gòu)買牛傳染性胃腸炎病毒(TGEV)-(ATCC#VR-758)和牛流行性腹瀉病毒(PEDV)-(ATCC#VR-1422)以及牛輪狀病毒(ATCC#VR-2101)等三種病毒之標(biāo)準(zhǔn)毒株，采用常規(guī)方法增殖培飬，再提純。將所增殖并提純的牛傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和牛流行性腹瀉病毒(PEDV)以及牛輪狀病毒按1∶1∶1的比例混合，然后加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為1.8-2.5％，裂解30分鐘，即分別得到牛傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和牛流行性腹瀉病毒(PEDV)以及牛輪狀病毒組合的病毒裂解液。經(jīng)SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢驗(yàn)分析，濃縮膠4％，分離膠7％，240V，電泳30分鐘。考瑪氏亮藍(lán)染色，觀察蛋白帶。
2.3.2.1.2采用基因工程重組技術(shù)分別制備牛傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和牛流行性腹瀉病毒(PEDV)的表達(dá)蛋白，具體步驟如下2.3.2.1.2.1制備牛傳染性胃腸炎病毒(TGEV)表達(dá)蛋白用RT-PCR方法從牛傳染性胃腸炎病毒(TGEV)之RNA克隆基因去掉信號(hào)肽和穿膜區(qū)的片段。先插入pGEM-T裁體。測(cè)序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達(dá)裁體pPIC9K連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，電轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉(zhuǎn)化株。挑取單個(gè)菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過(guò)夜。稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)菌濃度達(dá)到OD600的吸光值約為0.8時(shí)，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。于培養(yǎng)的不同時(shí)間采樣，用ELISA法測(cè)定表達(dá)量。選表達(dá)量最高的時(shí)間收獲。離心去除細(xì)胞沉淀。上清中即含大量表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸鎦水透析24小時(shí)以及Sephacryl S-200和Sephacryl S-100柱層析后，即獲得純化的牛傳染性胃腸炎病毒(TGEV)表達(dá)蛋白。
2.3.2.1.2.2制備牛流行性腹瀉病毒(PEDV)表達(dá)蛋白用RT-PCR方法從牛流行性腹瀉病毒(PEDV)之RNA克隆基因去掉信號(hào)肽和穿膜區(qū)的片段。先插入pGEM-T裁體。測(cè)序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達(dá)裁體pPIC9K連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，電轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉(zhuǎn)化株。挑取單個(gè)菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過(guò)夜。稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)菌濃度達(dá)到OD600的吸光值約為0.8時(shí)，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。于培養(yǎng)的不同時(shí)間采樣，用ELISA法測(cè)定表達(dá)量。選表達(dá)量最高的時(shí)間收獲。離心去除細(xì)胞沉淀。上清中即含大量表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)50％硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸鎦水透析24小時(shí)以及Sephacryl S-200和Sephacryl S-100柱層析后，即獲得純化的牛流行性腹瀉病毒(PEDV)表達(dá)蛋白。
2.3.2.2制備病毒復(fù)合抗原2.3.2.2.1病毒裂解抗原
將牛傳染性胃腸炎病毒和牛流行性腹瀉病毒以及牛輪狀病毒以三者組合的病毒裂解液的比例以1-10∶1-10的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得牛傳染性胃腸炎和牛流行性腹瀉的病毒裂解復(fù)合抗原。
2.3.2.2.2基因工程病毒表達(dá)蛋白復(fù)合抗原將純化的牛傳染性胃腸炎病毒表達(dá)蛋白和純化的牛流行性腹瀉病毒表達(dá)蛋白以1-10∶1-10的比例混合均勻，然后再以1-10∶1-10的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得牛傳染性胃腸炎和牛流行性腹瀉的病毒表達(dá)蛋白復(fù)合抗原。
3.制備含高活性抗體的免疫蛋選擇具有高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋的健康無(wú)特定病原體攜帶的(SPF)健康產(chǎn)蛋禽類(雞、鴨、鵝、火雞、鴕鳥(niǎo)等)，分別采用上敘制備的3.1豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌復(fù)合抗原、3.2豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒復(fù)合抗原、3.3水產(chǎn)致病菌復(fù)合抗原、3.4水產(chǎn)真菌復(fù)合抗原、3.5水產(chǎn)病毒復(fù)合抗原、3.6呼腸孤病毒抗原、3.7魚(yú)皰疹病毒抗原3.8牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌復(fù)合抗原、3.9牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒復(fù)合抗原等九種復(fù)合抗原在皮下注射，在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開(kāi)始揀取高免疫蛋，并對(duì)應(yīng)不同的抗原，對(duì)所檢取的免疫蛋進(jìn)行編碼標(biāo)記。
4.抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性復(fù)合IgY或IgY粗品的制備將不同抗原分別免疫的禽類所產(chǎn)高免疫蛋用0.5％新潔而滅溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無(wú)菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液調(diào)節(jié)PH至5.5-6.0，4-6℃下靜置過(guò)夜，稀釋液8,000-12,000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮。
然后，采用美國(guó)Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒過(guò)濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌。
第一道細(xì)菌濾除裝置是用0.22μm膜除菌過(guò)濾器除去沙門菌(Salmonella)等細(xì)菌；第二道支原體濾除裝置是用0.1μm膜除支原體過(guò)濾器除去支原體；第三道病毒濾除裝置是用Ultipor VFTM DV50除病毒過(guò)濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒。
最后，將所得濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得九種不同的抗家畜和水產(chǎn)病原體的特異性復(fù)合IgY或IgY粗品，分別為4.1抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性復(fù)合IgY、4.2抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒特異性復(fù)合IgY、4.3抗水產(chǎn)致病菌特異性復(fù)合IgY、4.4抗水產(chǎn)真菌特異性復(fù)合IgY復(fù)合抗原、
4.5抗水產(chǎn)病毒特異性復(fù)合IgY、4.6抗呼腸孤病毒特異性IgY、4.7抗魚(yú)皰疹病毒抗原特異性IgY、4.8抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性復(fù)合IgY、4.9抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒特異性復(fù)合IgY。
5.抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性復(fù)合IgY或IgY純品制備將所制得的抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性復(fù)合IgY或IgY粗品分別過(guò)離子交換柱和凝膠交換柱進(jìn)行純化，即得純復(fù)合IgY；應(yīng)用SDS-PAGE電泳測(cè)定法，對(duì)按以上工藝所制取的抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性復(fù)合IgY或IgY純品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得其中IgY含量為98％以上。
采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)得抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性復(fù)合IgY或IgY生物活性效價(jià)達(dá)1∶100,000。這是一般抗原制備方法和一般免疫方法所做不到的，更是直接將雞蛋黃干燥制成的普通蛋黃粉所不可相提并論的。這樣高的生物活性才有可能用于治療和真正預(yù)防家畜和水產(chǎn)的疾病，才有可能替代目前廣泛使用的抗生素；也只有具有這樣高的生物活性才能當(dāng)以高比例與飼料混合或用水高度稀釋后仍然有效，才真正的具有在低價(jià)值的飬殖業(yè)實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。
6.取所述抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性復(fù)合IgY或IgY干粉，加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之間、粒度超過(guò)≥15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性復(fù)合IgY或IgY干粉。這種納米化的抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性復(fù)合IgY或IgY更容易滲透進(jìn)入家畜或水產(chǎn)的胃腸粘膜發(fā)生作用。
7.實(shí)際應(yīng)用將0.01-20.0％的抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性復(fù)合IgY或IgY(上列九種中的其中一種或數(shù)種)配以99.99-80.0％的玉米蛋白粉或小麥粉或氨基酸粉或工業(yè)葡萄糖等載體成份或輔料，可制成各種家畜用和水產(chǎn)用飼料添加劑或預(yù)配料或注射劑或者水產(chǎn)專用之浸浴劑。用于預(yù)防和治療各種家畜和水產(chǎn)感染性疾病。
7.1用于豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉將采用豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌復(fù)合抗原高免疫禽類所制得的抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性IgY和采用豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒復(fù)合抗原高免疫禽類所制得的抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒特異性IgY按1∶1的比例混合均勻，制成一種抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY，用其配以各種載體或輔料，就可代替抗生素和化學(xué)藥用于預(yù)防和治療豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉等感染性疾病。也可分別將其中一種抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性IgY或抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒IgY配以各種載體或輔料，代替抗生素和化學(xué)藥用于預(yù)防和治療豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉等感染性疾病。
7.2用于水產(chǎn)常見(jiàn)的感染性疾病將采用水產(chǎn)致病菌復(fù)合抗原高免疫禽類所制得的抗水產(chǎn)常見(jiàn)致病菌特異性復(fù)合IgY和采用水產(chǎn)真菌復(fù)合抗原高免疫禽類所制得的抗水產(chǎn)真菌特異性復(fù)合IgY以及采用水產(chǎn)病毒復(fù)合抗原高免疫禽類所制得的抗水產(chǎn)常見(jiàn)病毒特異性復(fù)合IgY按1∶1∶1的比例混合均勻，制成一種抗水產(chǎn)感染性疾病特異性復(fù)合IgY，用其配以各種載體或輔料，就可代替抗生素和化學(xué)藥用于預(yù)防和治療水產(chǎn)常見(jiàn)感染性疾病，如爛鰓病、草魚(yú)出血病、鯉痘瘡病、魚(yú)腸炎病、敗血癥魚(yú)膚霉病和鰓霉病等水產(chǎn)類常見(jiàn)的感染性疾病。也可分別將其中一種抗水產(chǎn)常見(jiàn)致病菌特異性復(fù)合IgY或抗水產(chǎn)真菌特異性復(fù)合IgY或抗水產(chǎn)常見(jiàn)病毒特異性復(fù)合IgY或者抗呼腸孤病毒特異性IgY、抗魚(yú)皰疹病毒抗原特異性IgY配以各種載體或輔料，代替抗生素和化學(xué)藥用于預(yù)防和治療水產(chǎn)常見(jiàn)感染性疾病。
7.3用于牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉將采用牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌復(fù)合抗原高免疫禽類所制得的抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性IgY和采用牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒復(fù)合抗原高免疫禽類所制得的抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒特異性IgY按1∶1的比例混合均勻，制成一種抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY，用其配以各種載體或輔料，就可代替抗生素和化學(xué)藥用于預(yù)防和治療牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉等感染性疾病。也可分別將其中一種抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性IgY或抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒IgY配以各種載體或輔料，代替抗生素和化學(xué)藥用于預(yù)防和治療牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉等感染性疾病。
本發(fā)明的技術(shù)方案在以下方面有很大不同1.由于腸毒性大腸埃希氏菌和魏氏梭菌型別很多，除了一部分大腸桿菌之間有抗原交叉外，許多型號(hào)互相間并沒(méi)有抗原交叉；如果只是簡(jiǎn)單地選一種大腸桿菌來(lái)作抗原免疫雞，所制成的抗體將只會(huì)僅對(duì)所免疫的那一種大腸桿菌有一定作用；對(duì)其他型號(hào)的大腸桿菌則沒(méi)有作用，對(duì)經(jīng)常發(fā)生的魏氏梭菌和豬鏈球菌更根本無(wú)效。為解決這一難題，本發(fā)明從兩大途徑來(lái)解決這一難題第一，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查針對(duì)不同家畜選擇最常發(fā)生的一種型號(hào)的大腸桿菌和魏氏梭菌以及鏈球菌，同時(shí)在制作抗原時(shí)采用專有技術(shù)將細(xì)菌超聲粉碎，得到菌體成份，這樣細(xì)菌表面的抗原表位與細(xì)菌菌體部分的抗原表位相結(jié)合，就大大增強(qiáng)了抗原表位，顯著提高了其抗原性。使所制得的抗致病菌IgY對(duì)同種不同型的細(xì)菌都有抑制作用；第二，根據(jù)對(duì)大腸桿菌結(jié)構(gòu)的研究，不同型種的大腸桿菌之間有共同的纖毛組織，我們以其共同的大腸桿菌纖毛作為抗原來(lái)免疫禽類，所制得的卵黃抗體就會(huì)對(duì)常見(jiàn)的各種不同的大腸桿菌有抑制作用。這一優(yōu)點(diǎn)在下文的試驗(yàn)實(shí)例中己得到了驗(yàn)證。
2.由于引致家畜和水產(chǎn)感染性疾病的病毒往往會(huì)發(fā)生變異，如果采用常規(guī)方法制備卵黃抗體，對(duì)用以制作抗原的那一種病毒在某一次試驗(yàn)中也許表現(xiàn)有效；但是，這病毒是會(huì)不斷變異的，這種卵黃抗體對(duì)變異了的病毒抑制作用就差得多。本發(fā)明人在深入研究病毒分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，針對(duì)病毒的變異性，采用了兩大措施提高抗原性，特別是擴(kuò)展抗原交叉范圍一是采用獨(dú)創(chuàng)的方法將病毒裂解后再制作抗原，使病毒內(nèi)部的抗原表位暴露出來(lái)，從而增加病毒的抗原表位，提高其抗原性；二是從強(qiáng)化抗原性和簡(jiǎn)化生產(chǎn)流程出發(fā)，應(yīng)用基因工程技術(shù)制作了多種病毒表達(dá)蛋白，并用這種表達(dá)蛋白制備抗原，再用這種強(qiáng)化抗原性的表達(dá)蛋白抗原免疫禽類。這樣，就使所制得的特殊IgY對(duì)容易變異的病毒一樣有很強(qiáng)的抑滅作用，從而大大提高了最終產(chǎn)品的實(shí)際療效，增強(qiáng)了其實(shí)用性。另外，采用基因工程表達(dá)蛋白制作抗原，也省略了病毒增殖的復(fù)雜程序；由于表達(dá)蛋白生產(chǎn)速度比病毒增殖快得多，也為大規(guī)模生產(chǎn)卵黃抗體創(chuàng)造了條件。
3.發(fā)明人在反復(fù)研究禽類對(duì)各種微生物抗原的免疫應(yīng)答中發(fā)現(xiàn)，禽類對(duì)病毒和細(xì)菌的免疫應(yīng)答反應(yīng)是不一樣的；另外，抗原所包含的微生物種類不可太多，否則會(huì)影響抗體的效價(jià)。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人特地將抗原組成分成細(xì)菌組和病毒組，并采取特別的免疫啟動(dòng)方法進(jìn)行免疫；從而，增強(qiáng)了被免疫的禽類之免疫應(yīng)答，提高了所制成的特異性抗體的活性。
4.由于許多魚(yú)類感染性疾病是真菌引發(fā)的，因此，發(fā)明人篩選了最有代表性的四種真菌制作抗原制備了一種抗水產(chǎn)霉菌特異性復(fù)合IgY，把它作為副作用很大的殺真菌化學(xué)藥的最佳替代。
5為了使所制備的IgY抗體進(jìn)入家畜或水產(chǎn)胃腸道后，更容易滲透到腸道粘膜發(fā)揮有效作用；本發(fā)明人應(yīng)用納米技術(shù)將所制得的IgY抗體納米化，并在實(shí)際配方中加入了表皮滲透劑；從而，進(jìn)一步提升了其功效。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)試驗(yàn)例與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明。
一.試驗(yàn)例試驗(yàn)例1抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY和抗水產(chǎn)感染性疾病特異性復(fù)合IgY以及抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY的含量檢測(cè)應(yīng)用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉一聚丙烯凝膠)電泳測(cè)定法，分別對(duì)按以上工藝所制取的不同的抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY和抗水產(chǎn)感染性疾病特異性復(fù)合IgY以及抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY粗提物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果含IgY 45-52％。IgY粗提物經(jīng)二次過(guò)柱純化后，得到純IgY。經(jīng)SDS-PAGE分析，純度達(dá)到PAGE純，如下表所示


試驗(yàn)例2抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性IgY活性檢測(cè)分別采用按本發(fā)明之兩種豬致病菌抗原方案所制備的兩種抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性IgY和只用一種分離所得的豬大腸桿菌作抗原免疫母雞所得到的卵黃粉，共三種卵黃抗體，以(1)豬腸毒性大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)株和纖毛蛋白、(2)臺(tái)灣豬場(chǎng)分離得到的豬腸毒性大腸埃希氏菌野生株、(3)C型魏氏梭菌、(4)B型魏氏梭菌、(5)豬鏈球菌、(6)分離所得野生豬大腸桿菌等六種細(xì)菌作為檢測(cè)抗原，用“ELISA”方法檢測(cè)所制得的抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性IgY的抗體效價(jià)。結(jié)果如下表

從以上檢測(cè)結(jié)果可看出，無(wú)論采取(1)預(yù)先將抗原細(xì)菌超聲粉碎制作含菌體成份的抗原，所制備的抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性IgY不但對(duì)直接作為抗原免疫的菌型之細(xì)菌有很高的抗體結(jié)合效價(jià)，對(duì)沒(méi)有作為抗原免疫的同型細(xì)菌也有很高效價(jià)，對(duì)沒(méi)有作為抗原免疫的不同型細(xì)菌也有理想的效價(jià)。試驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明所采用的方法對(duì)提高所制備的IgY抗體的抗原性確實(shí)有理想的效果。反之，只用一種分離所得的豬大腸桿菌直接制備抗原免疫母雞，收集卵黃干燥所得到的含少量抗體的卵黃粉，僅會(huì)對(duì)作為抗原那一種大腸桿菌有一點(diǎn)效價(jià)，對(duì)大多數(shù)其它種類繁多的大腸桿菌是沒(méi)有作用的；上列的試驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。
試驗(yàn)例3抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒特異性IgY活性檢測(cè)分別以豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)標(biāo)準(zhǔn)株和臺(tái)灣豬場(chǎng)分離得到的野生株以及豬流行性腹瀉病毒(PEDV)標(biāo)準(zhǔn)株和臺(tái)灣豬場(chǎng)分離得到的野生株作為檢測(cè)抗原，用“ELISA”方法檢測(cè)以病毒裂能解成分作為抗原免疫所制得的抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性IgY的抗體效價(jià)。結(jié)果如下表

從以上檢測(cè)結(jié)果可看出，采用發(fā)明人的特殊方法將作為抗原的病毒裂解后將制作含裂解成份的抗原，所制備的特異性IgY，不但對(duì)直接作為抗原免疫的病毒有很高的抗體結(jié)合效價(jià)，對(duì)沒(méi)有作為抗原免疫的有變異的同種病毒也有很高效價(jià)。試驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明的病毒裂解法對(duì)提高所制備的病毒抗原的抗原性確實(shí)很好的效果。
試驗(yàn)例4各種不同抗流感病毒特異性IgY和抗繼發(fā)感染細(xì)菌特異性IgY的活性檢測(cè)取抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY(以表達(dá)蛋白制作病毒抗原)和抗水產(chǎn)感染性疾病特異性復(fù)合IgY以及抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY(以表達(dá)蛋白制作病毒抗原)，分別以豬、魚(yú)、牛常見(jiàn)的病原體為檢測(cè)抗原，采用“ELISA法”(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))進(jìn)行活性檢測(cè)。結(jié)果如下表所列三種特異性復(fù)合IgY效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果顯示，所制得的三種不同特異性復(fù)合IgY，其中抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)以及豬輪狀病毒(HRV)等病毒的抗體結(jié)合效價(jià)都達(dá)到1∶51,200以上，對(duì)腸毒性大腸埃希氏菌和C型魏氏梭菌以及豬鏈球菌的抗體結(jié)合效價(jià)也達(dá)到1∶2,048以上。而抗水產(chǎn)感染性疾病特異性復(fù)合IgY對(duì)柱狀嗜纖維菌等致病菌的抗體結(jié)合效價(jià)達(dá)到1∶2,048以上；對(duì)水霉菌等真菌的抗體結(jié)合效價(jià)也達(dá)到1∶1,024以上；對(duì)呼腸孤病毒和皰疹病毒的抗體結(jié)合效價(jià)則達(dá)到1∶51,200以上。而抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY則對(duì)牛傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和牛流行性腹瀉病毒(PEDV)以及牛輪狀病毒(HRV)三種病毒的抗體結(jié)合效價(jià)也都達(dá)到1∶51,200以上；對(duì)腸毒性大腸埃希氏菌和B型魏氏梭菌兩種致病菌的抗體結(jié)合效價(jià)也都達(dá)到1∶2,048以上。
所作的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明人的特殊抗原制作法和免疫啟動(dòng)方法以及改進(jìn)的工藝技術(shù)所制得的抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY和抗水產(chǎn)感染性疾病特異性復(fù)合IgY以及抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY分別對(duì)豬常見(jiàn)的致病菌和病毒、水產(chǎn)常見(jiàn)致病菌、真菌、病毒以及牛常見(jiàn)致病菌和病毒都有很強(qiáng)的抑制作用，既使高度稀釋，在很低的使用濃度下仍然會(huì)有效，完全可滿足在家畜和水產(chǎn)品中大面積使用的要求。
二.實(shí)施例實(shí)施例1用基因工程法制備抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒特異性復(fù)合鴨IgY1.制備兩種病毒的表達(dá)蛋白抗原成份，具體包括以下步驟
用RT-PCR方法分別從抗豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)之RNA克隆基因去掉信號(hào)肽和穿膜區(qū)的片段。先插入pGEM-T裁體。測(cè)序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達(dá)裁體pPIC9K連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，電轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉(zhuǎn)化株。挑取單個(gè)菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過(guò)夜。稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)菌濃度達(dá)到OD600的吸光值約為0.8時(shí)，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。于培養(yǎng)的不同時(shí)間采樣，用ELISA法測(cè)定表達(dá)量。選表達(dá)量最高的時(shí)間收獲。離心去除細(xì)胞沉淀。上清中即含大量表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸鎦水透析24小時(shí)以及Sephacryl S-200和Sephacryl S-100柱層析后，即分別獲得純化的豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)表達(dá)蛋白和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)表達(dá)蛋白。
2.制備基因工程表達(dá)蛋白抗原將以上所制成的基因工程所述方法而制得的純化的豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)表達(dá)蛋白和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)表達(dá)蛋白按1∶1比例混和(濃度200微克/mL)，充分混合均勻；然后以1-10∶10-1加入福氏佐劑，置入高速勻漿器，采用30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得基因工程表達(dá)蛋白抗原。
3.制備免疫蛋1)優(yōu)選具有高免疫應(yīng)答能力的良種母鴨用所制得的基因工程表達(dá)蛋白抗原免疫100只產(chǎn)蛋母鴨，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再?gòu)?qiáng)化注射一次，共三次；于第一次注射后第7個(gè)月，把這些產(chǎn)蛋母鴨所產(chǎn)的蛋分別標(biāo)記后，再按常規(guī)方法分別提取其中的IgY；以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法分別檢測(cè)所制得的IgY的效價(jià)，如果某只母鴨所產(chǎn)蛋制成的IgY的效價(jià)大于1∶1024，則選出該只母鴨；再用所選出母鴨所產(chǎn)的蛋孵出優(yōu)良鴨種；待其長(zhǎng)大至2～3個(gè)月，作為優(yōu)選的高免疫應(yīng)答能力的特種母鴨。
2)分別對(duì)優(yōu)選的特種母鴨進(jìn)行強(qiáng)化免疫用所制備的基因工程表達(dá)蛋白抗原，采用皮下注射的強(qiáng)化免疫法，分別對(duì)優(yōu)選的特種母鴨進(jìn)行免疫，每只母鴨每次注射量達(dá)到1～2ml抗原，每隔二周再?gòu)?qiáng)化注射一次，共免疫三次；第一次免疫20天后，檢取母鴨所產(chǎn)免疫蛋。
3)制備抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒特異性復(fù)合鴨IgY粗提物用流動(dòng)水洗凈免疫鴨蛋，再用酒精擦洗消毒；然后用打蛋機(jī)將免疫蛋打碎，蛋黃篩濾去蛋清，留下蛋黃并攪拌均勻；按蛋黃體積的4～6倍加入蒸餾水，進(jìn)行稀釋并混合均勻；用1.0N HCI溶液調(diào)pH至5.5～6.0；將調(diào)好pH值的稀釋液進(jìn)一步充分?jǐn)嚢杈鶆颍缓髮⑵淅鋮s至2～6℃，靜置12小時(shí)～24小時(shí)；將上述稀釋液于10000rpm條件下，離心20分鐘；取分離所得的上清再加入超濾器中進(jìn)行超濾并濃縮15倍；加入2.0％海藻酸鈉溶液，至終濃度為0.1％，攪拌至出現(xiàn)渾濁沉淀，再加入2.0％CaCl2溶液，至終濃度為0.1％，攪拌均勻，并于4℃條件下過(guò)夜；于8000rpm條件下離心20分鐘，取上清，再用0.45um膜過(guò)濾除菌；再進(jìn)行冷凍干燥，即制得抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒特異性復(fù)合鴨IgY的粗提物干粉。
4)提純將所述抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒特異性復(fù)合鴨IgY的粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸鹽緩沖液)，再先后過(guò)離子交換柱、凝膠層析柱，再用美國(guó)Pall膜除菌過(guò)濾器和除病毒過(guò)濾器去除細(xì)菌和病毒，得到純化的抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒特異性復(fù)合鴨IgY純品。
實(shí)施例2用魚(yú)用疫苗作抗原制備抗水產(chǎn)常見(jiàn)病毒特異性火雞IgY具體實(shí)施步驟如下向中國(guó)福建省水產(chǎn)研究所購(gòu)買現(xiàn)成的草魚(yú)出血病疫苗(抗呼腸孤病毒)和斑點(diǎn)叉尾鮰病毒疫苗各50支(每支300μg/1.5mL)先將二者混勻，然后置入超高速離心機(jī)中分離病毒成份。再加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為1.8-2.5％，于37℃裂解30分鐘，即得到病毒裂解液。
再將這種裂解液按1-10∶10-1的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器中，以30,000rpm高速勻化，形成油包水液體，即制成疫苗成份裂解抗原，計(jì)150mL。再以這種疫苗式抗原免疫健康的產(chǎn)蛋火雞50只，每只肌內(nèi)注射1mL，每隔二周注射一次，共計(jì)三次。
第一次注射后第20天開(kāi)始檢取免疫蛋，至第50天，共檢取1,200只免疫蛋；將其用流動(dòng)水沖凈，75％乙醇消毒，晾干破碎蛋殼，以蛋黃篩濾去蛋清，留取蛋黃加5倍蒸餾水?dāng)噭?，?.0N HCI調(diào)pH至5.5-6.0，攪拌均勻，2-6℃靜置過(guò)夜，于10,000rpm離心20分鐘，取上清進(jìn)行超濾濃縮10-20倍；繼而加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為0.1％，攪拌至出現(xiàn)渾濁；再加入2.0％CaCI2液，至終濃度為0.1％，攪拌均勻，4℃過(guò)夜；8,000rpm離心20分鐘，取上清；0.45μm膜串連0.22μm膜過(guò)濾除菌，Ultipor VFTM DV50除病毒過(guò)濾器除去病毒；冷凍干燥；即制得抗水產(chǎn)常見(jiàn)病毒特異性火雞IgY粗提物120克。
將以上IgY粗提物先后過(guò)離子交換樹(shù)脂柱和凝膠層析柱層析，即制得一種以疫苗成份裂解抗原免疫的抗水產(chǎn)常見(jiàn)病毒特異性火雞IgY純品25克。
檢驗(yàn)生物活性將制備得到抗水產(chǎn)常見(jiàn)病毒特異性火雞IgY分別以呼腸孤病毒和魚(yú)皰疹病毒作為檢測(cè)抗原，用ELISA法檢測(cè)這種抗水產(chǎn)常見(jiàn)病毒特異性火雞IgY對(duì)這兩種病毒的抗體結(jié)合效價(jià)。結(jié)果如下面所示

實(shí)施例3將抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY和抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY的納米化，提高生物利用度，進(jìn)一步增強(qiáng)其療效納米化IgY干粉的制備將本發(fā)明所制備的抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY和抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY干粉經(jīng)超精細(xì)方法加工成1～100nm之間的超微顆粒，就成為納米級(jí)的IgY超微粉末。本發(fā)明是將這兩種IgY之一加入“超微粉碎機(jī)”中碾磨粉碎，得到≥15,000目的超微粒子。將這種抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY和抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY納米干粉，做成預(yù)配料或飼料添加劑供家畜食用，可使其中的IgY對(duì)胃腸粘膜的吸附能力和滲透能力大幅度提高，更易進(jìn)入粘膜層中發(fā)揮抑制病毒和病菌的作用。
實(shí)施例4抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY預(yù)配料的配制用前敘方法分別制備抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性致病菌特異性IgY和抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性病毒特異性IgY，然后將二者按1-2∶2-1比例混合成抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY200g，以此作為主要原料制成一種可預(yù)防和治療豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的豬飼料綠色預(yù)配料。
豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY 200g工業(yè)用葡萄糖 20,000g把兩個(gè)成份加入混料機(jī)中充分?jǐn)噭?。然后用包裝機(jī)按每袋100g分裝，再裝箱。抽樣檢驗(yàn)合格后出廠。
實(shí)施例5抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY預(yù)配料的配制用前敘方法分別制備抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性致病菌特異性IgY和抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性病毒特異性IgY，然后將二者按1-2∶2-1比例混合成抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY600g，以此作為主要原料制成一種可預(yù)防和治療牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的牛飼料綠色預(yù)配料。
牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY600g工業(yè)用葡萄糖 60,000g把兩個(gè)成份加入混料機(jī)中充分?jǐn)噭?。然后用包裝機(jī)按每袋100g分裝，再裝箱。抽樣檢驗(yàn)合格后出廠。拌在飼料中喂食，或用水稀釋供乳?；虿∨ｏ嬘?。
實(shí)施例6抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY預(yù)配料的實(shí)際應(yīng)用在飼料中添加量
人工乳、教槽料2kg/MT哺乳料1kg/MT肉豬料0.5kg/MT母豬料0.3-0.5kg/MT配成飲水劑加護(hù)離乳豬飲用1kg泡5-10升水普通豬只飲用 1kg泡100升水疫情嚴(yán)重治療，可加大用量使用。
實(shí)施例7治療牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉注射劑制造配方如下表所示

取上述配方一為例，制備工藝如下取注射用水800L加Pluronic和聚乙烯吡咯浣酮加熱溶解，另取聚山梨醇酯-80加PEG400混勻，在攪拌下加入上述混合液中，再加0.1％針用活性碳，60℃下攪拌15分鐘，脫炭過(guò)濾，再將濾液密封加熱至100℃，30分鐘；然后冷卻至室溫備用。
另取用針用活性炭吸附，脫炭，煮沸，并冷至室溫的注射用水剩余量，于無(wú)菌容器中加入IgY凍干粉溶解，繼續(xù)攪拌下，呈細(xì)注加入第1)項(xiàng)之溶液中，用脫炭無(wú)菌注射用水補(bǔ)足全量。
用美國(guó)Pall膜除菌過(guò)濾器和除病毒過(guò)濾器去除細(xì)菌和病毒，于無(wú)菌灌裝機(jī)中灌裝于無(wú)菌容器中，每支50ml，含IgY 150毫克，印字，包裝即得。實(shí)施例8治療豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉注射劑制造用前述的方法制備抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY 500g，按下丁配方制成一種治療豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的新型注射劑。
抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY500gPluronic F681,000g聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 1,000gPEG400 1,1000g聚山梨醇酯-801,000g注射用水 加至100L注射用水，加入Pluronic和PVP，加熱溶解；另取聚山梨醇酯-80，加入PEG400混勻；在攪拌下加入上述混合液中；再加0.1％針用活性炭，60℃攪拌15min；脫炭過(guò)濾；濾液密閉加熱100℃ 30min，冷卻至室溫備用。
取經(jīng)活性炭處理過(guò)的滅菌注射用水，于滅菌容器中加入抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY凍干粉溶解，繼續(xù)攪拌下，以細(xì)流加于上述混合液中，用0.1mol的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0～7.5，用脫炭滅菌注射用水補(bǔ)足全量。
已滅菌的0.45μm串聯(lián)0.22μm微孔濾膜除菌過(guò)濾。于無(wú)菌灌封機(jī)中灌封于無(wú)菌容器中。每支5mL含抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY純凍干粉12.5mg。燈檢、檢漏、印字、包裝即得20000支IgY注射劑。規(guī)格12.5mg/5mL。
實(shí)施例9魚(yú)用綠色飼料配制配方如下表所示飼料組成 配比(％)抗水產(chǎn)感染性疾病特異性復(fù)合Igy 0.05葵花仔餅粉20花生餅粉 20小麥粉30麩皮 5豌豆粉5碎米 9混合維生素0.95啤酒酵母 10按配方，制備工藝如下先將配方中除IgY和混合維生素以外成份依次加入攪拌機(jī)中充分混合均勻，80℃干燥2小時(shí)，冷至室溫，按等量遞加法與IgY、混合維生素混勻；用全自動(dòng)包裝機(jī)，按每袋100克分袋包裝密封，打碼。抽樣檢測(cè)合格后出廠。
實(shí)施例10水產(chǎn)用新一代水產(chǎn)飼料的配制用前敘方法制備抗水產(chǎn)感染性疾病特異性復(fù)合IgY干粉100克，以這種復(fù)合IgY為主要原料，制成新一代水產(chǎn)飼料，用于魚(yú)類腸炎病、爛鰓病、孤菌病、紅鰭病(鰻魚(yú))以及蝦類黑鰓病紅腿病、爛眼病等；對(duì)水產(chǎn)其它病毒性、細(xì)菌性、霉菌性水產(chǎn)疾病也都有顯著療效。
配方如下表抗水產(chǎn)感染性疾病特異性復(fù)合IgY干粉100g全蛋粉 900g制備工藝如下將全蛋粉按等量遞加法與IgY混勻；用全自動(dòng)包裝機(jī)，按每袋100克分袋包裝密封，打碼。抽樣檢測(cè)合格后出廠。
用法及用量拌飼口服，預(yù)防用量為50-100mg/kg體重，治療用量為100-200mg/kg體重。制成藥餌投喂；每日一次，連用5-7日。
也可直接將抗水產(chǎn)感染性疾病特異性復(fù)合Igy干粉或者抗呼腸孤病毒特異性IgY、抗魚(yú)皰疹病毒抗原特異性IgY干粉之其中一種或二種以萬(wàn)分之一至千分之五的濃度用水稀釋，然后采用這種“無(wú)藥殘，又無(wú)污染”的IgY水溶液浸浴水產(chǎn)，達(dá)到除菌消毒的目的。
實(shí)施例11治療草魚(yú)出血病注射劑制造用前述的方法制備抗呼腸孤病毒特異性IgY 50g，按下丁配方制成一種治療草魚(yú)出血病的新型注射劑。
抗呼腸孤病毒特異性IgY 50gPluronic(聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的加聚物)F68100g聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 100g
PEG400 1,100g聚山梨醇酯-80 100g注射用水 加至10L注射用水，加入Pluronic和PVP，加熱溶解；另取聚山梨醇酯-80，加入PEG400混勻；在攪拌下加入上述混合液中；再加0.1％針用活性炭，60℃攪拌15min；脫炭過(guò)濾；濾液密閉加熱100℃ 30min，冷卻至室溫備用。
取經(jīng)活性炭處理過(guò)的滅菌注射用水，于滅菌容器中加入抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY凍干粉溶解，繼續(xù)攪拌下，以細(xì)流加于上述混合液中，用0.1mol的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0～7.5，用脫炭滅菌注射用水補(bǔ)足全量。
已滅菌的0.45μm串聯(lián)0.22μm微孔濾膜除菌過(guò)濾。于無(wú)菌灌封機(jī)中灌封于無(wú)菌容器中。每支5mL含抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY純凍干粉12.5mg。燈檢、檢漏、印字、包裝即得2000支IgY注射劑。規(guī)格12.5mg/5mL。
實(shí)施例12治療魚(yú)皰疹病毒病注射劑制造用前述的方法制備抗魚(yú)皰疹病毒抗原特異性IgY 50g，按下丁配方制成一種治療魚(yú)皰疹病毒病注射劑。
抗魚(yú)皰疹病毒抗原特異性IgY50gPluronic F68100g聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 100gPEG400 1,100g聚山梨醇酯-80100g注射用水 加至10L注射用水，加入Pluronic和PVP，加熱溶解；另取聚山梨醇酯-80，加入PEG400混勻；在攪拌下加入上述混合液中；再加0.1％針用活性炭，60℃攪拌15min；脫炭過(guò)濾；濾液密閉加熱100℃ 30min，冷卻至室溫備用。
取經(jīng)活性炭處理過(guò)的滅菌注射用水，于滅菌容器中加入抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY凍干粉溶解，繼續(xù)攪拌下，以細(xì)流加于上述混合液中，用0.1mol的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0～7.5，用脫炭滅菌注射用水補(bǔ)足全量。
已滅菌的0.45μm串聯(lián)0.22μm微孔濾膜除菌過(guò)濾。于無(wú)菌灌封機(jī)中灌封于無(wú)菌容器中。每支5mL含抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY純凍干粉12.5mg。燈檢、檢漏、印字、包裝即得2000支IgY注射劑。規(guī)格12.5mg/5mL。
實(shí)施例13動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)際應(yīng)用效果試驗(yàn)材料普通飼料加抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY預(yù)配料(2kg/MT)試驗(yàn)動(dòng)物出生至70齡仔豬數(shù)量683只試驗(yàn)地點(diǎn)臺(tái)灣臺(tái)南市豬場(chǎng)


從試驗(yàn)結(jié)果可以清楚看出給剛出生的幼豬喂食含抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉特異性復(fù)合IgY的飼料，可使仔豬的存活率大幅度提高，仔豬體重也明顯增加。
權(quán)利要求
1.一種抗家畜和水產(chǎn)病原體的特異性IgY或復(fù)合IgY，其特征在于，該IgY是選自抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性IgY、抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒特異性IgY、抗水產(chǎn)致病菌特異性復(fù)合IgY、抗水產(chǎn)真菌特異性復(fù)合IgY、抗水產(chǎn)病毒特異性復(fù)合IgY、抗呼腸孤病毒特異性IgY、抗魚(yú)皰疹病毒抗原特異性IgY、抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性IgY和抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒特異性IgY中的一種或一種以上的組合。
2.一種制備抗家畜和水產(chǎn)病原體的特異性IgY或復(fù)合IgY的方法，其特征在于，包括一下步驟1)篩選引致家畜和水產(chǎn)類感染性疾病的主要病原體，并按照這些病原體的“抗原交叉性”進(jìn)行分類組合；2)針對(duì)篩選和分類組合出的各種家畜、水產(chǎn)類感染性疾病病原體，制備相應(yīng)的抗原；3)制備含高活性抗體的免疫蛋取上述抗原，選擇具有高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋的健康無(wú)特定病原體攜帶的健康產(chǎn)蛋禽類，對(duì)其進(jìn)行免疫注射，首次免疫注射時(shí)對(duì)每只產(chǎn)蛋禽注射抗原1ml，第一次注射后間隔7天，以同樣劑量注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量、方法注射第3次；從第一次注射后第20天開(kāi)始揀取產(chǎn)蛋禽所產(chǎn)出的高免疫蛋，并對(duì)應(yīng)不同的抗原，對(duì)所檢取的免疫蛋進(jìn)行編碼標(biāo)記；4)制備抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性IgY或復(fù)合IgY粗品取上述高免疫蛋用消毒液浸泡15～30分鐘消毒，再經(jīng)無(wú)菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃，加入4～8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值至5.5～6.0，4～6℃下靜置過(guò)夜，稀釋液在8,000-12,000r/min下高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮；除菌后，將所得濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗家畜和水產(chǎn)病原體的特異性IgY或復(fù)合IgY粗品；5)制備抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性IgY或復(fù)合IgY純品將上述制得的抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性IgY或復(fù)合IgY粗品經(jīng)離子交換柱和凝膠交換柱純化，即得純特異性IgY或復(fù)合IgY。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1)中篩選和提取出的病原體是引起豬、牛、水產(chǎn)致病的細(xì)菌類、病毒類、真菌類病原體，包括腸毒性大腸埃希氏菌、C型魏氏梭菌菌株、豬鏈球菌、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒、柱狀嗜纖維菌、嗜水氣單胞菌、氣單胞菌、孤菌、水霉菌、綿霉菌、絲囊霉菌、鰓霉菌、呼腸孤病毒、魚(yú)皰疹病毒、牛腸毒性大腸埃希氏菌、B型魏氏梭菌菌株、牛傳染性胃腸炎病毒、牛流行性腹瀉病毒以及牛輪狀病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)中制備的家畜和水產(chǎn)病原體抗原包括豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌復(fù)合抗原、豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒復(fù)合抗原、水產(chǎn)致病菌復(fù)合抗原、水產(chǎn)真菌復(fù)合抗原、水產(chǎn)病毒復(fù)合抗原、呼腸孤病毒抗原、魚(yú)皰疹病毒抗原、牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌復(fù)合抗原、牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒復(fù)合抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中制備豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌復(fù)合抗原的方法是取腸毒性大腸埃希氏菌、C型魏氏梭菌、豬鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行培養(yǎng)繁殖，收集培養(yǎng)物，提純后得到腸毒性大腸埃希氏菌、C型魏氏梭菌、豬鏈球菌，然后將此三種細(xì)菌按1∶1∶1的比例混合，再采用超聲粉碎機(jī)粉碎，獲得含全菌和菌體成份的混合物；將混合物按1～10∶10～1的比例加入福氏佐劑，再置入高速勻漿機(jī)中粉碎勻化，形成油包水溶液，制得牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌菌體組合復(fù)合抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中制備豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌復(fù)合抗原的方法是培養(yǎng)豬大腸桿菌k88、k99兩種纖毛，再將培養(yǎng)好的兩種纖毛先按1～10∶10～1的比例混合均勻后按1～10∶10～1的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中粉碎勻化，形成油包水溶液，制得傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌纖毛組合復(fù)合抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中制備豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒復(fù)合抗原的方法是取豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒以及豬輪狀病毒三種病毒的標(biāo)準(zhǔn)毒株，采用常規(guī)方法增殖培養(yǎng)、提純，將所增殖并提純的三種病毒按1∶1∶1的比例混合，然后加入十二烷基硫酸鈉，最終濃度為1.8～2.5％，裂解30分鐘，即分別得到豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒以及豬輪狀病毒組合的病毒裂解液；再將這些病毒裂解液以1～10∶1～10的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中粉碎勻化，形成油包水乳液，即制得豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉的病毒裂解復(fù)合抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟4)、5)中制備的抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性IgY或復(fù)合IgY包括抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性IgY、抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒特異性IgY、抗水產(chǎn)致病菌特異性復(fù)合IgY、抗水產(chǎn)真菌特異性復(fù)合IgY、抗水產(chǎn)病毒特異性復(fù)合IgY、抗呼腸孤病毒特異性IgY、抗魚(yú)皰疹病毒抗原特異性IgY、抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性IgY、抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒特異性IgY。
9.一種制備抗家畜和水產(chǎn)病原體的飼料添加劑或預(yù)混料的方法，其特征在于，包含以下步驟1)篩選引致家畜和水產(chǎn)類感染性疾病的主要病原體，包括豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌、豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒、水產(chǎn)致病菌、水產(chǎn)真菌、水產(chǎn)病毒、呼腸孤病毒、魚(yú)皰疹病毒、牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌、牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒，并按照這些病原體的“抗原交叉性”進(jìn)行分類組合；2)針對(duì)篩選和分類組合出的上述各種家畜、水產(chǎn)類感染性疾病病原體，制備相應(yīng)的抗原；3)制備含高活性抗體的免疫蛋取上述抗原，選擇具有高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋的健康無(wú)特定病原體攜帶的健康產(chǎn)蛋禽類，對(duì)其進(jìn)行免疫注射，首次免疫注射時(shí)對(duì)每只產(chǎn)蛋禽注射抗原1ml，第一次注射后間隔7天，以同樣劑量注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量、方法注射第3次；從第一次注射后第20天開(kāi)始揀取產(chǎn)蛋禽所產(chǎn)出的高免疫蛋，并對(duì)應(yīng)不同的抗原，對(duì)所檢取的免疫蛋進(jìn)行編碼標(biāo)記；4)制備抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性IgY或復(fù)合IgY粗品取上述高免疫蛋用消毒液浸泡15～30分鐘消毒，再經(jīng)無(wú)菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃，加入4～8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值至5.5～6.0，4～6℃下靜置過(guò)夜，稀釋液在8,000-12,000r/min下高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮；除菌后，將所得濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗家畜和水產(chǎn)病原體的特異性IgY或復(fù)合IgY粗品；5)制備抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性IgY或復(fù)合IgY純品將上述制得的抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性IgY或復(fù)合IgY粗品經(jīng)離子交換柱和凝膠交換柱純化，即得純特異性IgY或復(fù)合IgY；6)取上述抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性IgY或復(fù)合IgY的干粉，加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之間、粒度≥15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化IgY或復(fù)合IgY干粉；7)按重量百分比稱取0.01～20.0％的上述納米化IgY或復(fù)合IgY干粉，加入到99.99～80.0％的飼料添加劑或預(yù)混料的輔料之中，混和均勻，即得含抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性IgY或復(fù)合IgY的飼料添加劑或預(yù)混料。
10.一種抗家畜和水產(chǎn)病原體注射劑的方法，其特征在于，包含以下步驟1)篩選引致家畜和水產(chǎn)類感染性疾病的主要病原體，包括豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌、豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒、水產(chǎn)致病菌、水產(chǎn)真菌、水產(chǎn)病毒、呼腸孤病毒、魚(yú)皰疹病毒、牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌、牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒，并按照這些病原體的“抗原交叉性”進(jìn)行分類組合；2)針對(duì)篩選和分類組合出的上述各種家畜、水產(chǎn)類感染性疾病病原體，制備相應(yīng)的抗原；3)制備含高活性抗體的免疫蛋取上述抗原，選擇具有高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋的健康無(wú)特定病原體攜帶的健康產(chǎn)蛋禽類，對(duì)其進(jìn)行免疫注射，首次免疫注射時(shí)對(duì)每只產(chǎn)蛋禽注射抗原1ml，第一次注射后間隔7天，以同樣劑量注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量、方法注射第3次；從第一次注射后第20天開(kāi)始揀取產(chǎn)蛋禽所產(chǎn)出的高免疫蛋，并對(duì)應(yīng)不同的抗原，對(duì)所檢取的免疫蛋進(jìn)行編碼標(biāo)記；4)制備抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性IgY或復(fù)合IgY粗品取上述高免疫蛋用消毒液浸泡15～30分鐘消毒，再經(jīng)無(wú)菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃，加入4～8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值至5.5～6.0，4～6℃下靜置過(guò)夜，稀釋液在8,000-12,000r/min下高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮；除菌后，將所得濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗家畜和水產(chǎn)病原體的特異性IgY或復(fù)合IgY粗品；5)制備抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性IgY或復(fù)合IgY純品將上述制得的抗家畜和水產(chǎn)病原體特異性IgY或復(fù)合IgY粗品經(jīng)離子交換柱和凝膠交換柱純化，即得純特異性IgY或復(fù)合IgY；6)取注射用水加Pluronic以及聚乙烯吡咯烷酮加熱溶解，另取聚山梨醇酯-80與PEG400的混合物，在攪拌下加入上述溶解液中，再加0.1％針用活性碳，60℃下攪拌15分鐘，脫炭過(guò)濾，再將濾液密封加熱至100℃，30分鐘，然后冷卻至室溫備用；另取用針用活性炭吸附，脫炭，煮沸，并冷至室溫的注射用水剩余量，于無(wú)菌容器中加入上述制得的純特異性IgY或復(fù)合IgY干粉溶解，繼續(xù)攪拌下，呈細(xì)注加入前述制得的備用溶液中，用脫炭無(wú)菌注射用水補(bǔ)足余量，滅菌、罐裝，即得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗家畜和水產(chǎn)病原體的特異性IgY或復(fù)合IgY，其特征在于，該IgY是選自抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性IgY、抗豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒特異性IgY、抗水產(chǎn)致病菌特異性復(fù)合IgY、抗水產(chǎn)真菌特異性復(fù)合IgY、抗水產(chǎn)病毒特異性復(fù)合IgY、抗呼腸孤病毒特異性IgY、抗魚(yú)皰疹病毒抗原特異性IgY、抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉致病菌特異性IgY和抗牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的病毒特異性IgY中的一種或一種以上的組合。本發(fā)明還涉及該抗家畜和水產(chǎn)病原體的特異性IgY或復(fù)合IgY的制備方法，以及該特異性IgY或復(fù)合IgY在注射劑、浸浴劑、飼料添加劑以及預(yù)配料中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101081866SQ200610081289
公開(kāi)日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2006年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月29日
發(fā)明者包晟, 王長(zhǎng)安, 蔡婷英, 謝彥博 申請(qǐng)人:雅臣藥業(yè)集團(tuán)(遠(yuǎn)東)有限公司