專利名稱：靈芝糖肽產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于真菌功能產(chǎn)品開發(fā)領(lǐng)域，特別是涉及靈芝糖肽產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
靈芝[Ganoderema lucidum(Leyss ex Fr.)karst]，又稱靈芝草，屬擔(dān)子菌亞門、多孔菌目、靈芝科、靈芝屬。歷代的醫(yī)典把靈芝歸位于“上上藥”，其排位在人參之前。《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》記載，靈芝可明目、補(bǔ)肝氣、安神、益精、益心氣、益脾氣、益肺氣、益腎氣、通九竅、耳聰、目明、利關(guān)節(jié)、利尿、養(yǎng)顏美容，是上好的滋補(bǔ)佳品。
靈芝糖肽是一類以靈芝多糖結(jié)構(gòu)為主連接有多肽、氨基酸的大分子物質(zhì)，靈芝糖肽主要存在于靈芝菌子實(shí)體、菌絲體和發(fā)酵液中。靈芝糖肽是靈芝菌生長(zhǎng)過(guò)程中代謝形成的生物活性物質(zhì)。靈芝糖肽能促進(jìn)蛋白質(zhì)、核酸的合成，對(duì)血清、肝臟及骨髓細(xì)胞蛋白質(zhì)或核酸的更新、合成有促進(jìn)作用，它是靈芝扶正固本的主要有效成分之一。靈芝糖肽的功能性與其分子量有一定的關(guān)系。靈芝糖肽結(jié)構(gòu)中的多糖分子為分支結(jié)構(gòu)，糖苷鍵以β-1，4鍵為主，β-1，6鍵為輔。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈芝糖肽產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法和用途。
本發(fā)明的靈芝糖肽產(chǎn)品組成為分子量分布在2000DA以上。糖肽含量占20-40％，其余部分為靈芝多糖。
本發(fā)明產(chǎn)品可以做成膠囊或片劑形式。
本發(fā)明靈芝糖肽產(chǎn)品生產(chǎn)方法概述如下(1)發(fā)酵液的獲得采用斜面菌種逐級(jí)擴(kuò)培獲得靈芝真菌液體深層發(fā)酵液；(2)外加酶酶解將步驟(2)中得到的發(fā)酵液分別調(diào)整溫度和pH，使溫度為45～65℃，pH為5～7，發(fā)酵液中加入混合酶，混合酶與發(fā)酵液的重量百分比為0.03～0.05％，混合酶按重量百分比組成為纖維素酶30～60％、其余為β-葡聚糖酶，酶解時(shí)間0.3～3小時(shí)，酶解過(guò)程中不斷攪拌；(3)滅酶酶控制反應(yīng)結(jié)束后，將發(fā)酵液升溫到90～95℃，保持10～30分鐘，進(jìn)行滅酶；(4)均質(zhì)處理將發(fā)酵液輸送給膠體磨，調(diào)整膠體磨定子與轉(zhuǎn)子的間隙為10～50微米，對(duì)發(fā)酵液中菌絲體進(jìn)行破碎，膠體磨流量為1～5噸/小時(shí)；再經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)處理，調(diào)整高壓均質(zhì)機(jī)壓力為20～60Mpa，高壓均質(zhì)流量為0.5～3噸/小時(shí)，顯微鏡鏡檢菌絲體破壁率為100％；
(5)濃縮將發(fā)酵液濃縮至原體積的1/5～1/10，濃縮所用方法可以是單效、多效真空濃縮和冷凍濃縮；(6)醇沉向濃縮濾液中加入70～100％的乙醇進(jìn)行醇沉，其體積比為1∶3～4，處理時(shí)間14小時(shí)；(7)沉淀物溶解沉淀物加熱水溶解。
(8)膜過(guò)濾采用2000DA膜進(jìn)行過(guò)濾，收集2000DA以上的組分。
(9)噴霧干燥將上述收集的濾液通過(guò)噴霧干燥得到干粉。
本發(fā)明中靈芝真菌液體深層發(fā)酵液的培養(yǎng)見徐錦堂編《中國(guó)藥用真菌學(xué)》。
本發(fā)明中靈芝真菌保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，菌種分別為cicc14025，cicc14028，cicc14029.
本發(fā)明中采用酶解處理工藝有效的實(shí)現(xiàn)了靈芝糖肽中大分子糖鏈的切割，有效提高了產(chǎn)物中高活性糖肽的含量。
本發(fā)明中得到的靈芝糖肽干粉可以原料、膠囊或片劑形式存在。
本發(fā)明在培養(yǎng)得到的靈芝真菌發(fā)酵液的基礎(chǔ)上，巧妙地利用外加的混合酶在適宜的條件下對(duì)真菌發(fā)酵液進(jìn)行酶解，酶解后經(jīng)過(guò)提取分離得到含量在20-40％的靈芝糖肽粗產(chǎn)品，其余部分為靈芝多糖。
本發(fā)明中采用高壓均質(zhì)工藝實(shí)現(xiàn)了菌絲體功能因子的高效溶出和完全利用。
本發(fā)明中靈芝糖肽的檢測(cè)主要采用電泳和苯酚硫酸測(cè)定法，具體測(cè)定方法見舉例本發(fā)明產(chǎn)品在抑制腫瘤細(xì)胞繁殖方面效果顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見具體舉例。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例110噸發(fā)酵液生產(chǎn)靈芝糖肽方法(1)采用斜面菌種逐級(jí)擴(kuò)培獲得靈芝液體深層發(fā)酵液將靈芝斜面菌種接入裝有100毫升培養(yǎng)基的500毫升搖瓶中進(jìn)行一級(jí)種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件旋轉(zhuǎn)式搖床150轉(zhuǎn)/分，28℃培養(yǎng)50小時(shí)。然后將一級(jí)搖瓶種子以10％接種量接入裝有100毫升培養(yǎng)基的500毫升搖瓶中進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)，按照與一級(jí)搖瓶相同的條件進(jìn)行培養(yǎng)。然后再以10％的接種量將二級(jí)種子轉(zhuǎn)接入裝有1000毫升培養(yǎng)基的5000毫升搖瓶中進(jìn)行三級(jí)種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，28℃培養(yǎng)50小時(shí)。然后再以10％的接種量把三級(jí)種子接入裝有0.1噸發(fā)酵培養(yǎng)基的總?cè)莘e為0.15噸的一級(jí)種子罐。培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度150轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量(V/V)1∶0.5，罐壓0.05Mpa，培養(yǎng)48小時(shí)。同樣將一級(jí)種子罐的菌液以10％的接種量轉(zhuǎn)接入裝有1噸發(fā)酵培養(yǎng)基的總?cè)莘e為1.5噸二級(jí)種子罐中，二級(jí)種子罐與一級(jí)種子罐的培養(yǎng)條件相同。最后以10％的接種量將二級(jí)種子罐種子接入裝有10噸發(fā)酵培養(yǎng)基的總?cè)莘e為15噸的發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量(V/V)1∶0.5，罐壓0.05Mpa，培養(yǎng)120小時(shí)。
(2)外加酶酶解在55℃，pH為6的條件下，向經(jīng)步驟(1)得到的10噸發(fā)酵液中加入纖維素酶1.5公斤，β-葡聚糖酶1.5公斤。酶解時(shí)間3小時(shí)，酶解過(guò)程中開啟攪拌；(3)滅酶外加酶酶解結(jié)束后，將發(fā)酵液升溫到95℃，30分鐘，進(jìn)行滅酶；(4)均質(zhì)處理將發(fā)酵液輸送給膠體磨，調(diào)整膠體磨定子與轉(zhuǎn)子的間隙為30微米，對(duì)發(fā)酵液中菌絲體進(jìn)行破碎，膠體磨流量為3噸/小時(shí)；再經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)處理，調(diào)整高壓均質(zhì)機(jī)壓力為40Mpa，高壓均質(zhì)流量為2噸/小時(shí)，顯微鏡鏡檢菌絲體破壁率為100％；(5)濃縮減壓濃縮濾液體積到1噸；(7)醇沉加入3.8噸95％的乙醇，醇析14小時(shí)；(8)沉淀物溶解沉淀物加熱水溶解。
(9)膜過(guò)濾采用2000DA的膜進(jìn)行過(guò)濾，收集2000DA以上的組分。
(10)噴霧干燥將上述收集的濾液通過(guò)噴霧干燥得到干粉。
本產(chǎn)品中靈芝糖肽含量在30％，其余部分為靈芝多糖。
本發(fā)明中靈芝菌種購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌號(hào)CICC 14025。
本例中斜面培養(yǎng)基組成馬鈴薯(煮汁)20％，葡萄糖2％，磷酸二氫鉀0.2％，硫酸鎂0.10％，瓊脂2.0％。
本例中各級(jí)種子和發(fā)酵生產(chǎn)所用培養(yǎng)基組成為蔗糖4％，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，脫脂大豆蛋白粉2.0％，磷酸氫二鉀0.2％，硫酸鎂0.1％，維生素B12PPm，PH6.0。
實(shí)施例2(發(fā)酵液10噸)10噸發(fā)酵液生產(chǎn)靈芝糖肽方法(1)發(fā)酵液的制備方法同例1。
(2)外加酶酶解在55℃，pH為6的條件下，向經(jīng)步驟(1)得到的10噸發(fā)酵液中加入纖維素酶2公斤，β-葡聚糖酶1.5公斤。酶解時(shí)間3小時(shí)，酶解過(guò)程中開啟攪拌；(3)滅酶外加酶酶解結(jié)束后，將發(fā)酵液升溫到95℃，30分鐘，進(jìn)行滅酶；(4)均質(zhì)處理采用均質(zhì)機(jī)和膠體磨依次處理發(fā)酵液，對(duì)菌絲體細(xì)胞壁進(jìn)行破壁處理；調(diào)整膠體磨定子與轉(zhuǎn)子的間隙為0.5微米，利用其剪切力作用對(duì)發(fā)酵液中的菌絲體進(jìn)行一級(jí)破壁處理，膠體磨流量為0.3噸/小時(shí)，使破壁后的菌絲體顆粒度為0.4微米的占70％；然后采用破碎粒度在0.3微米的高壓均質(zhì)機(jī)，利用其高壓釋放力、空穴效應(yīng)、剪切等力的作用，對(duì)發(fā)酵液中的菌絲體進(jìn)行超微破壁，調(diào)整高壓均質(zhì)機(jī)壓力為80Mpa，高壓均質(zhì)流量為0.4噸/小時(shí)，使處理后物料粒度為60納米的占80％；(5)濃縮減壓濃縮濾液體積到1噸；(7)醇沉加入3.8噸95％的乙醇，醇析14小時(shí)；(8)沉淀物溶解沉淀物加熱水溶解。
(9)膜過(guò)濾采用5000DA和70000DA的膜進(jìn)行過(guò)濾，收集5000DA和70000DA之間的組分。
(10)噴霧干燥將上述收集的濾液通過(guò)噴霧干燥得到干粉。
產(chǎn)品經(jīng)檢測(cè)其中靈芝糖肽含量占30％。
本發(fā)明中靈芝菌種購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌號(hào)CICC 14028。
實(shí)施例3。
靈芝糖肽檢測(cè)方法1.1儀器設(shè)備………………………………………………………..
垂直板電泳槽(北京六一儀器廠)直流穩(wěn)壓電源(北京六一儀器廠)1.2實(shí)驗(yàn)材料………………………………………………………..
Tris、甘氨酸、過(guò)硫酸銨、鹽酸、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺1.3試劑配置1)電極緩沖液稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。
2)10％過(guò)硫酸銨稱取1.0克過(guò)硫酸銨，加入10毫升蒸餾水溶解。
3)1.5mol/LPh8.8Tris-HCl緩沖液稱取Tris18.2g，加入50ml水，用濃鹽酸調(diào)pH8.8，最后用蒸餾水定容至100ml。
4)1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液稱取Tris12.1g，加入50ml水，用濃鹽酸調(diào)pH6.8，最后用蒸餾水定容至100ml。
5)30％丙烯酰胺(Acr)稱Acr30g，甲叉雙丙烯酰胺(Bis)0.8g，加蒸餾水至100ml，過(guò)濾后置棕色瓶中，4℃貯存可用1-2月。
6)5％苯酚溶液稱取(分析純)重蒸苯酚5.000克，溶解于蒸餾水中，并定容到100ml.
7)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取分析純葡萄糖粉3.0克左右，105度干燥30分鐘，至恒重；在干燥的條件下稱取0.100克溶于蒸餾水中，并定容到100ml.
8)考馬斯亮藍(lán)G-250顯色液精確稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 75mg，溶于12.5ml 95％乙醇中，同時(shí)加入120ml 85％磷酸，最后定容到250ml.
9)蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液精確稱取牛血清白蛋白0.100克溶于蒸餾水中并定容到100ml.
2靈芝糖肽檢測(cè)方法………………………………………2.1測(cè)定方法的選擇2.1.1多糖測(cè)定方法1)苯酚硫酸法多糖在硫酸和苯酚的作用下顯色；顯色時(shí)間短，且顏色穩(wěn)定。
2.1.2蛋白測(cè)定方法考馬斯亮藍(lán)受特異性氨基酸影響，簡(jiǎn)便迅速，靈敏度高，最低可達(dá)1ug/ml，受其他物質(zhì)干擾小。
為了保證測(cè)定的準(zhǔn)確性，選擇考馬斯亮藍(lán)法作為蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法。
2.2測(cè)定原理根據(jù)蛋白質(zhì)分子本身帶有氨基和羧基，在一定的ph值溶液中，分子表現(xiàn)一定強(qiáng)度的極性，有電場(chǎng)存在的情況下，會(huì)發(fā)生位置遷移，從而達(dá)到分離的目的2.3準(zhǔn)確度測(cè)定方法是在page電泳分離的基礎(chǔ)上，分別測(cè)定多糖(苯酚硫酸法)與蛋白(考馬斯亮藍(lán)法)的含量，然后計(jì)算結(jié)合物的含量。測(cè)定精度與多糖和蛋白的測(cè)定精度直接相關(guān)。苯酚硫酸法測(cè)定多糖與考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白的準(zhǔn)確度為10ug/ml。
2.4適用范圍適用于測(cè)定分子量在10萬(wàn)以下，經(jīng)過(guò)分離純化的真菌糖肽含量的測(cè)定。
2.5樣品處理1)多糖溶液加入無(wú)水乙醇汁混合液中乙醇濃度達(dá)到75％，4℃2小時(shí)醇沉，然后離心得多糖。
2)丙酮洗滌稱取適量多糖固體，加入5倍量的丙酮攪拌2-3分鐘，離心分離；重復(fù)洗滌兩次，然后將多糖固體低溫吹干備用。
3)溶解將多糖固體溶于適量熱水中，攪拌至固體不再溶解為止，濾紙過(guò)濾，濾液備用。
4)透析用截流分子量小于500的透析袋進(jìn)行逆向流水透析脫鹽。
5)純化向多糖溶液中加入2倍體積的脫蛋白試劑，劇烈振搖后，離心分層，用分液漏斗分離；重復(fù)兩次，分離后的多糖溶液加熱蒸發(fā)掉殘余的有機(jī)溶劑，濃縮定容，使溶液中多糖濃度大于50mg/ml。
2.6糖肽的分離2.6.1分離方法糖肽類物質(zhì)含有蛋白質(zhì)，選擇非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳作為分離手段。
2.6.2膠板制作1)將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干，準(zhǔn)備2個(gè)干凈的錐形瓶。
2)把玻璃板在灌膠支架上固定好。
3)按比例配好10％分離膠，用移液管快速加入，大約5厘米左右，之后加少許蒸餾水，靜置聚合.
4)倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，同時(shí)按比例配好濃縮膠溶液，連續(xù)平穩(wěn)的加入濃縮膠至離邊緣5mm處，插入樣梳，靜置聚合.
5)在電泳槽中加入緩沖液后，拔出樣梳。
2.6.3點(diǎn)樣1)用微量進(jìn)樣器在凝膠板左側(cè)點(diǎn)樣孔距點(diǎn)樣槽底三分之一處點(diǎn)樣，中間點(diǎn)樣孔點(diǎn)適量溴酚蘭溶液作為電泳進(jìn)度的指示，右側(cè)點(diǎn)樣孔作為空白對(duì)照。
2)接通電源及冷卻水，進(jìn)行電泳，開始電壓恒定在100V；當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后電壓升至200V，溴酚藍(lán)遷移至距凝膠底邊緣約5mm時(shí)，停止電泳。
2.7溶解與測(cè)定2.7.1凝膠切分電泳結(jié)束后，取下并撬開玻璃板，將多糖溶液所在的點(diǎn)樣孔的分離膠條帶全部切下，同時(shí)在右側(cè)切下等面積的分離膠作為空白對(duì)照(中間的溴酚蘭條帶保留)，用少量蒸餾水輕輕沖洗凝膠表面，然后分別放入三角瓶中。
2.7.2將凝膠分別研磨成泥狀，然后洗入三角瓶中，加入100ml水煮沸10分鐘，冷卻后過(guò)濾；濾渣加水重復(fù)煮沸兩次，合并濾液，真空濃縮并定容至10ml。
2.7.3測(cè)定將分離膠中定容后的多糖及空白溶液分別測(cè)定多糖及蛋白質(zhì)含量。
2.8結(jié)果計(jì)算分別計(jì)算出電泳后凝膠中多糖及蛋白的含量(扣除空白因素影響)，求和即為糖肽含量，將分離膠中定容后的多糖及空白溶液分別測(cè)定多糖及蛋白質(zhì)含量。
例5.靈芝糖肽功能性試驗(yàn)在北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所，選擇60名腫瘤患者，采用靈芝糖肽輔助平消膠囊治療腫瘤患者，60天一個(gè)療程，每日服用4g，服用2個(gè)療程，試驗(yàn)結(jié)果如下表，通過(guò)靈芝糖肽的服用復(fù)合治療的效果比對(duì)照提高了80％。試驗(yàn)表明靈芝糖肽在配合治療腫瘤方面具有良好的效果。
表1靈芝糖肽輔助治療效果表(對(duì)照組單獨(dú)服用平消膠囊)

權(quán)利要求
1.一種靈芝糖肽產(chǎn)品，其特征在于所述靈芝糖肽產(chǎn)品分子量在2000DA以上，其中靈芝糖肽含量占20-40％。
2.一種如權(quán)力要求1所述的靈芝糖肽產(chǎn)品制備方法包括如下步驟(1)發(fā)酵液的獲得采用斜面菌種逐級(jí)擴(kuò)培獲得靈芝真菌液體深層發(fā)酵液；(2)外加酶酶解將步驟(2)中得到的發(fā)酵液分別調(diào)整溫度和pH，使溫度為45～65℃，pH為5～7，發(fā)酵液中加入混合酶，混合酶與發(fā)酵液的重量百分比為0.03～0.05％，混合酶按重量百分比組成為纖維素酶30～60％、其余為β-葡聚糖酶，酶解時(shí)間0.3～3小時(shí)，酶解過(guò)程中不斷攪拌；(3)滅酶酶控制反應(yīng)結(jié)束后，將發(fā)酵液升溫到90～95℃，保持10～30分鐘，進(jìn)行滅酶；(4)均質(zhì)處理采用均質(zhì)機(jī)和膠體磨依次處理發(fā)酵液，對(duì)菌絲體細(xì)胞壁進(jìn)行破壁處理；(5)濃縮將發(fā)酵液濃縮至原體積的1/5～1/10，濃縮所用方法可以是單效、多效真空濃縮和冷凍濃縮；(6)醇沉向濃縮濾液中加入70～100％的乙醇進(jìn)行醇沉，其體積比為1∶3～4，處理時(shí)間14小時(shí)；(7)沉淀物溶解沉淀物加熱水溶解；(8)膜過(guò)濾采用5000DA和70000DA的膜進(jìn)行過(guò)濾，收集5000DA和70000DA之間的組分；(9)噴霧干燥將上述收集的濾液通過(guò)噴霧干燥得到干粉。
3.一種如權(quán)力要求1和2所述的靈芝糖肽產(chǎn)品在防治腫瘤方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種靈芝糖肽產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法和用途。本發(fā)明屬于真菌功能產(chǎn)品開發(fā)領(lǐng)域，特別是涉及靈芝糖肽產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法。本發(fā)明的靈芝糖肽產(chǎn)品中糖肽含量占20－40％，其余部分為靈芝多糖。本發(fā)明產(chǎn)品可以做成膠囊或片劑形式。靈芝糖肽產(chǎn)品生產(chǎn)方包括發(fā)酵液的培養(yǎng)，外加酶酶解，滅酶，均質(zhì)處理，濃縮，醇沉，沉淀物溶解，膜過(guò)濾，噴霧干燥。本發(fā)明產(chǎn)品在防治腫瘤方面具有良好的用途。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1896095SQ20061008149
公開日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2006年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月24日
發(fā)明者蔡永峰, 岳國(guó)海, 李績(jī), 張貴林 申請(qǐng)人:中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院