專利名稱：：水蛭和/或地龍分子量5800道爾頓以下的提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種水蛭和/或地龍的提取物，具體來說，涉及水蛭和/或地龍5800道爾頓以下分子量的提取物，以及其藥物組合物、制備方法和用途，用于制備預(yù)防、治療血栓性疾病的藥物。
背景技術(shù)：
：水蛭作為經(jīng)典的破血逐淤藥物，為中國藥典所收載。中國藥典收載的水蛭藥材品種有三種，其中作為藥用主要品種為水蛭科動物螞蟥(粉W歷a/7iaWhitman)。水蛭的主要成分為蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核酸、酶、糖類以及微量元素等。對水蛭中蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類及微量元素等成分的定性、定量研究已多有報道，主要方法為薄層色譜法、高效液相色譜法、電泳法等。其中小分子成分主要為次黃嘌呤、黃嘌呤、尿嘧啶、尿苷等，嘧淀和嘌呤均為含有N原子的不飽和的雜環(huán)化合物。"地龍作為傳統(tǒng)中藥，具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿之功效，為中國藥典所收載。中國藥典收載的地龍藥材品種有四種，其中作為藥用主要品種為鉅引科動物參環(huán)毛蚓(尸力ere"/zaa砂eT^77iM(E.Perrier)),習(xí)稱廣地龍。地龍的主要成分為蛋白質(zhì)、氮基酸、核酸、酶、糖類等。對地龍中蛋白質(zhì)、氨基酸等成分的定性、定量研究已有報道。其中小分子成分主要為次黃嘌呤及含氮化合物。疏血通注射液，是由水蛭、地龍兩味藥材的水提取物作為藥物活性成分的中藥注射劑是一種高效速效的治療心腦血管疾病的注射劑。中國專利申請03148281.3、200410101538.3以及200510000266.7分別公開了疏血通注射液及其制備過程，前述申請的全部內(nèi)容，引入本申請作為參考。具有免疫原性的物質(zhì)通常為大分子物質(zhì)，相對分子量越大，免疫原性越強。而小分子多肽則免疫原性較弱或無免疫原性?？乖ǔ榇蠓肿游镔|(zhì)的可能原因是(1)抗原相對分子量越大，表面特殊化學(xué)基因(抗原決定簇)就越多，因而就越能有效地刺激免疫細(xì)胞，產(chǎn)生免疫應(yīng)答；(2)大分子抗原物質(zhì)化學(xué)組成復(fù)雜、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被破壞和清除，在體內(nèi)停留時間較長，故可持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答。醫(yī)學(xué)上，通常將由51個氨基酸組成的人胰島素(人胰島素標(biāo)準(zhǔn)分子量為5800道爾頓)作為分界限，將分子量大于5800道爾頓的物質(zhì)統(tǒng)稱為高分子量物質(zhì)。受到嚴(yán)格的限量控制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種水蛭和/或地龍分子量5800道爾頓以下的提取物及其制備方法和用于制備藥物的用途。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的提取物在臨床上應(yīng)用更加安全。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種水蛭和/或地龍的提取物，其以水蛭和/或地龍作為原料經(jīng)提取而制成的，其特征在于所述提取物的分子量5800道爾頓(dalton)以下。上述所述的水蛭和/或地龍的提取物，是指水蛭的提取物、地龍的提取物或者水蛭和地龍混和在一起的提取物。本發(fā)明所述提取物可通過包含用截留分子量6000道爾頓的超濾膜或超濾柱進(jìn)行過濾步驟的方法制備的。例如，本發(fā)明上述所述的提取物，通過用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)方法制備，將所得到的提取物(半成品或中間體)用截留分子量6000道爾頓的超濾膜或超濾柱進(jìn)行過濾，以得到分子量5800道爾頓以下的水蛭和/或地龍?zhí)崛∥铩Ｆ渲?，作為?yōu)選，本發(fā)明所述的提取物是通過包含如下步驟的方法制備的-(1)原料用注射用水或生理鹽水洗凈，低溫浸漬，過濾，得到濾液和藥渣；(2)藥渣破碎后，與步驟(1)的濾液混合，形成勻漿，將勻漿反復(fù)冷凍和解融，離心分離，取上清液；(3)將步驟(2)所得上清液進(jìn)行超濾，得到透過液或濾液；(4)將步驟(3)所得透過液或濾液進(jìn)行熱壓處理后，用截留分子量6000道爾頓的超濾膜或超濾柱進(jìn)行過濾。其中，作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的提取物是也可以通過包含如下步驟的方法制備的(1)原料用注射用水或生理鹽水洗凈，破碎形成勻漿，經(jīng)反復(fù)冷凍和解融，離心分離，取上清液；(2)將步驟(1)所得上清液進(jìn)行超濾，得到透過液或濾液；(3)將步驟(2)所得透過液或濾液用離子交換柱層析處理；(4)將步驟(3)所得洗脫液經(jīng)脫鹽處理后，用截留分子量6000道爾頓的超濾膜或超濾柱進(jìn)行過濾；或者將步驟(3)所得洗脫液用截留分子量6000道爾頓的超濾膜或超濾柱進(jìn)行過濾后，進(jìn)行脫鹽處理。本發(fā)明所述的提取物，其中含有多肽、氨基酸和次黃嘌呤成份。本發(fā)明所述的水蛭和/或地龍的提取物，原料水蛭和/或地龍可以是干品，也可以是鮮品。水蛭、地龍可以分別提取，分別得到水蛭提取物、地龍?zhí)崛∥?，也可以水蛭和地龍混合在一起進(jìn)行提取，得到水蛭和地龍混和在一起的提取物。本發(fā)明所述的提取物，可以為提取液，也可以經(jīng)脫水干燥后，形成固體形式。本發(fā)明還提供一種所述提取物的制備方法，所述方法包括用截留分子量6000道爾p的超濾膜或超濾柱進(jìn)行過濾的步驟。例如，可通過用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)方法提取、分離水蛭和/或地龍，將所得到的提取物(半成品或中間體)最后用截留分子量6000道爾頓的超濾膜或超濾柱進(jìn)行過濾，以得到分子量5800道爾頓以下的水蛭和/或地龍?zhí)崛∥?。作為?yōu)選，本發(fā)明的提取物的制備方法，包括(1)原料用注射用水或生理鹽水洗凈，低溫浸漬，過濾，得到濾液和藥渣；(2)藥渣破碎后，與步驟(1)的濾液混合，形成勻漿，將勻漿反復(fù)冷凍和解融，離心分離，取上清液；(3)將步驟(2)所得上清液進(jìn)行超濾，得到透過液或濾液；(4)將步驟(3)所得透過液或濾液進(jìn)行熱壓處理后，用截留分子量6000道爾頓的超濾膜或超濾柱進(jìn)行過濾。本發(fā)明提取物中物質(zhì)分子量的測定，通過用人胰島素(分子量為5800)作為參照物，測定分子量大于人胰島素的物質(zhì)的含量作為高分子量物質(zhì)含量。本發(fā)明采用高效液相色譜法進(jìn)行測定，具體方法如下一、試驗材料與儀器1、標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量物質(zhì)人胰島素(Insulin),分子量5800,規(guī)格lmg/支，購自中國藥品生物制品檢定所2、儀器可見紫外分光光度計(日本日立U-3210)高效液相色譜儀Waters600系統(tǒng)高效液相色譜儀AgilentHpllOO3、試劑三氟醋酸化學(xué)純(理工大學(xué)化工與材料學(xué)院)乙腈色譜純(迪馬公司)二、色譜條件色譜柱凝膠色譜柱(TSKGEL2000SWxl7.8咖X300讓)；流動相三氟醋酸-乙腈-水，按體積比為0.025:30:70;紫外檢測器，檢測波長為214土lmn;流速為0.7ral/min。三、測定精密量取供試品適量，用流動相制成供試品溶液；精密量取人胰島素適量，用流動相制成對照品溶液；分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液，注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，記錄色譜圖，測定分子量大于人胰島素的物質(zhì)的含量，即計算保留時間小于人胰島素峰保留時間的色譜峰所對應(yīng)的物質(zhì)的含量，作為供試品中高分子量(分子量大于5800道爾頓)的物質(zhì)含量。本發(fā)明所述的水蛭和/或地龍?zhí)崛∥?，可以作為制備各種制劑的原料，因此，本發(fā)明也涉及一種藥物組合物，包含上述所述的提取物作為活性成分和藥學(xué)上可接受的輔料。其中所述的藥物組合物，可以為片劑、膠囊劑、顆粒劑、膜劑、貼劑、貼片、栓劑、丸劑、散劑,軟膏劑、合劑(如口服液)、糖漿劑、酊劑、眼用制劑、鼻用制劑、注射液、注射用無菌粉末、注射用濃溶液或其緩釋、控釋制劑。所述的制劑為常規(guī)藥物制劑，因此，通過本領(lǐng)域的常規(guī)制藥技術(shù)可以制得上述所述的制劑。上述所述的提取物或藥物組合物，具有預(yù)防、治療血栓性疾病的作用，可用于制備預(yù)防、治療血栓性疾病的藥物。例如，可以用于預(yù)防、治療高脂血癥、動脈粥樣硬化、心肌梗死、心絞痛、動脈硬化性腦梗死、腦栓塞、靜脈血栓形成、肺栓塞、肺梗死、血栓閉塞性脈管炎、動脈硬化性閉塞癥、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、外科手術(shù)并發(fā)血栓形成和血栓栓塞、肝梗死、腎臟梗死、膽囊梗死、腸系膜梗死、肢體壞疽、糖尿病外周神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜血管阻塞i突發(fā)性聾等疾病。本發(fā)明的水蛭和/或地龍?zhí)崛∥?，其突出的?yōu)點表現(xiàn)在其分子量5800道爾頓以下，相對分子質(zhì)量(分子量)較小，因此免疫原性較弱或無免疫原性。而且，在不溶性微粒的數(shù)量、粒徑方面，與已有的水蛭和/地龍?zhí)崛∥锵啾容^，本發(fā)明的水蛭和/或地龍?zhí)崛∥镏胁蝗苄晕⒘５臄?shù)量少得多、粒徑小得多，因而安全性顯著提高。所以，相對于已有的水蛭和/或地龍?zhí)崛∥铮景l(fā)明具有令人意想不到的顯著效果。圖l:人胰島素(分子量5800道爾頓)檢測圖。圖2:本發(fā)明的提取物檢測圖。具體實施例方式以下通過具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。實施例l取水蛭藥材原料(干品或鮮品)，用生理鹽水或注射用水浸泡，使其表面充分展開，再反復(fù)用生理鹽水或注射用水洗凈，置于2—4倍的的生理鹽水或注射用水中于低溫0-4攝氏度浸漬24小時，過濾，濾液和藥渣分別存放備用。將藥渣用組織搗碎機搗碎，再用膠體磨與上述濾液混合勻漿，磨成直徑小于0.5微米的勻漿液，將勻漿液在零下15攝氏度以下冷凍15—30小時后取出，于低溫0—4攝氏度條件下解融，再按上述條件反復(fù)冷凍解融至少2次。將上述凍融液置于離心機離心分離，得到上清液，通過分子量50000道爾頓的超濾柱進(jìn)行粗濾，濾液再通過分子量10000道爾頓的超濾柱過濾純化。取通過分子量10000道爾頓超濾柱的濾液，再通過分子量6000道爾頓的超濾柱進(jìn)一步純化，濾液經(jīng)105—136攝氏度熱壓10—45分鐘處理，再通過分子量6000的超濾柱過濾，得到提取液。經(jīng)過高分子量(分子量大于5800道爾頓)的物質(zhì)含量檢測，提取液中未發(fā)現(xiàn)分子量大于5800道爾頓的物質(zhì)。因此所得到的水蛭提取物的分子量在5800道爾頓以下。如果需要，可以將上述得到的提取液脫水干燥成固體。實施例2取地龍藥材原料(干品或鮮品)。按照實施例1所述相同方法進(jìn)行提取分離，制成地龍?zhí)崛∥?。?jīng)過高分子量(分子量大于5800道爾頓)的物質(zhì)含量檢測，提取液中未發(fā)現(xiàn)分子量大于5800道爾頓的物質(zhì)。因此所得到的地龍?zhí)崛∥锏姆肿恿吭?800道爾頓以下。如果需要，可以將上述得到的提取液脫水干燥成固體。實施例3取等量的水蛭(干品)、地龍(干品)，按照實施例l所述相同方法進(jìn)行提取分離，分別制得水蛭提取液和地龍?zhí)崛∫?，將所制得的兩種提取液混合均勻后，得到水蛭地龍?zhí)崛∥?下稱本發(fā)明的提取物)，經(jīng)過高分子量(分子量大于5800道爾頓)的物質(zhì)含量檢測，提取物中未發(fā)現(xiàn)分子量大于5800道爾頓的物質(zhì)。結(jié)果見圖1和2。圖1和圖2各峰數(shù)據(jù)分別見表1和表2。表1人胰島素檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>試驗結(jié)果表明，本發(fā)明的提取物與ZL03148281.3提取物在可見異物方面，存在顯著區(qū)別。本發(fā)明的提取物的燈檢合格率和短小纖維顯著優(yōu)異于ZL03148281.3提取物，本發(fā)明的提取物應(yīng)用時更加安全。2、不溶性微粒檢測按照中國藥典(2005版)制劑通則注射劑項下規(guī)定，對本發(fā)明的提取物與ZL03148281.3提取物中的不溶性微粒進(jìn)行檢測，結(jié)果見表4。表4不溶性檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>試驗結(jié)果表明，本發(fā)明的提取物與ZL03148281.3提取物在不溶性微粒方面，也存在顯著區(qū)別。本發(fā)明的提取物不溶性微粒顯著少于ZL03148281.3提取物，因此本發(fā)明的提取物應(yīng)用時更加安全。上述試驗結(jié)果說明，本發(fā)明的水蛭和/或地龍分子量5800道爾頓以下提取物，相對于已有的提取物(例如ZL03148281.3中通過分子量10000道爾頓的提取物)，在可見異物和不溶性微粒方面，存在顯著差異，本發(fā)明產(chǎn)品提取物因其相對分子質(zhì)量較小，產(chǎn)品的安全性得以大大提高。本發(fā)明的提取物和ZL03148281.3提取物，按照ZL03148281.3的藥效試驗，經(jīng)過對小鼠凝血時間的影響、對大鼠血小板的影響以及對血栓的影響試驗，結(jié)果表明，本發(fā)明的提取物與ZL03148281.3提取物無明顯差異。因此，本發(fā)明的提取物相對于己有的水蛭地龍?zhí)崛∥铮谒幬锘钚圆皇苡绊懙那闆r下，藥物的安全性被顯著地提高。權(quán)利要求1.一種水蛭和/或地龍的提取物，其以水蛭和/或地龍作為原料經(jīng)提取而制成的，其特征在于所述提取物的分子量5800道爾頓以下。全文摘要本發(fā)明提供一種水蛭和/或地龍分子量5800道爾頓以下提取物及其制備方法和藥物組合物、用途。所述的水蛭和/或地龍分子量5800道爾頓以下提取物，在產(chǎn)品的可見異物和不溶性微粒等方面，明顯優(yōu)于已有的水蛭和/或地龍?zhí)崛∥?，產(chǎn)品的安全性也大大提高。本發(fā)明的產(chǎn)品可用于制備預(yù)防或治療血栓性疾病的藥物。文檔編號A61P9/10GK101095697SQ200610086680公開日2008年1月2日申請日期2006年6月28日優(yōu)先權(quán)日2006年6月28日發(fā)明者李振國申請人:李振國