專利名稱：一種天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于組織工程細胞培養(yǎng)用的天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法，特別涉及到所用納米纖維為天然納米蜘蛛絲纖維、天然納米蠶絲纖維、天然納米纖維素纖維、天然納米甲殼素纖維以及天然納米膠原纖維的組織工程細胞支架的制備，屬于生物醫(yī)學(xué)材料制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在已有納米纖維基細胞支架的制備方法中，常采用的先是靜電紡絲或濕法紡絲制備納米纖維膜或納米纖維絲，然后將納米纖維膜處理成為細胞培養(yǎng)支架，或者將納米纖維絲進行編織縫合成為三維結(jié)構(gòu)，從而制備三維支架。
靜電紡絲制備細胞支架的方法為首先制備高分子溶液，而后加入到一個帶有毛細端的塑料管內(nèi)，然后把一根與電源正高壓相連的銅電極插到前驅(qū)體溶液中。塑料管的前方安裝一個能夠旋轉(zhuǎn)的接地鐵鼓，其上鋪一層鋁箔作為接收板。在噴頭與接收板之間形成一個電場，從噴頭噴出的高分子溶液在電場力作用下，在幾秒內(nèi)拉成直徑大約30～400nm的纖維絲落到旋轉(zhuǎn)的接收板上，從而可制備出高分子納米纖維膜，作為細胞培養(yǎng)的支架，如在國內(nèi)公開號為CN03137309.7的發(fā)明專利“利用電紡絲制備組織工程支架材料的方法及裝置”公開了采用電紡絲技術(shù)制備組織工程支架材料。
濕法紡絲制備細胞支架的方法為將高分子紡絲原液加入到凝固液中凝固，形成高分子初絲纖維，而后經(jīng)過第一拉伸浴與第二拉伸浴最終形成高分子微納米纖維，將微納米纖維進行編織縫合等工序形成三維結(jié)構(gòu)，用以作為細胞支架，如在國內(nèi)公開號為CN 1372023A的發(fā)明專利“一種組織工程用支架纖維及其制備方法”公開了采用絲素蛋白溶液濕法紡絲技術(shù)制備組織工程支架纖維，可通過后道加工制成三維支架。
靜電紡絲與濕法紡絲方法工序復(fù)雜，能耗大，制備出的納米纖維屬再生納米纖維。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于它針對具有多尺度(從宏觀、微觀至納觀等)分級結(jié)構(gòu)的天然生物材料，克服現(xiàn)有的制備納米纖維基組織工程細胞支架的缺點，提供一種極為簡便、工序少、設(shè)備簡單、能耗小、投入資金少、適合實驗室研究制備和大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的制備天然納米纖維基組織工程細胞支架的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法，該制備方法包括以下步驟(1)將天然生物材料完全浸泡在含有溶劑的容器中，開啟一定頻率一定功率的超聲波裝置，將超聲波發(fā)射探頭深入裝載有天然生物材料溶液的容器中，進行超聲波解離，從而制備得到天然納米纖維；(2)將步驟(1)所得天然納米纖維與一定天然高分子溶液混合，然后將混合溶液與一定交聯(lián)劑進行交聯(lián)形成凝膠，在室溫靜置，隨后完全浸入甘氨酸水溶液中室溫再次靜置；(3)將步驟(2)制備的凝膠在一定溫度下進行預(yù)冷凍一段時間，然后在冷凍干燥機中冷凍干燥一段時間，即得到天然納米纖維基組織工程細胞支架。
由步驟(1)、步驟(2)與步驟(3)，從而可以方便且大規(guī)模地制備天然納米纖維基組織工程細胞支架。
所述的天然生物材料具有以微原纖、原纖、纖維等不同尺度的分級結(jié)構(gòu)，包括蜘蛛絲、家蠶絲、野蠶絲、羊毛、魚鱗、竹纖維、骨膠原纖維、木纖維。
所述溶劑為弱酸、弱堿、純水或超純水中的任何一種或多種。
所述超聲波裝置是發(fā)射出超聲波頻率在10千赫茲～10兆赫茲，功率在100瓦特～2000瓦特的儀器設(shè)備；功率與頻率越大，所需的超聲波解離時間越短。
所述天然高分子為海藻酸、明膠、殼聚糖、糖蛋白、糖胺聚糖中的任何一種；天然納米纖維的重量含量為天然高分子溶液的1％～60％。
所述交聯(lián)劑為戊二醛、甲醛、碳二亞胺、葡萄糖二醛中的任何一種；交聯(lián)劑的重量含量為混合溶液的0.1％～10％。
所述甘氨酸的含量為甘氨酸水溶液的0.1～10摩爾/升。
所述預(yù)冷凍溫度為-20～-100℃，預(yù)冷凍時間為4～32小時。
所述的冷凍干燥設(shè)備，功率為100瓦特～5000瓦特；冷凝器溫度為-20～-100℃。
所述冷凍干燥溫度為-20～-100℃；凍干燥時間為4～120小時。
本發(fā)明的超聲波解離是基于超聲波的聲空化效應(yīng)，即集中聲場能量并迅速釋放的過程。足夠強度的超聲波通過液體時，在聲波負壓半周期如果聲壓幅值超過液體內(nèi)部靜壓強，存在于液體中的微小氣泡(空化核)就會迅速增大，在相繼而來的聲波正壓周期中，氣泡又絕熱壓縮而崩潰，在崩潰瞬間產(chǎn)生極短暫的強壓力脈沖，氣泡中間會產(chǎn)生接近5000K的高溫，壓力超過50MPa，氣泡與液體的界面處溫度可達2000K，持續(xù)幾微秒后，該熱點隨之冷卻(溫度變化率達109K/s)，并伴有強烈的沖擊波(對于均相液體媒質(zhì))和時速高達400km的射流(對于非均相媒質(zhì))，這就為天然納米纖維的制備創(chuàng)造了一個極端的物理環(huán)境。因此，對于具有不同尺度、分級結(jié)構(gòu)的天然生物材料，在聲空化效應(yīng)的作用下，不斷解離，從宏觀解離到微觀，從微觀解離到納觀，從而制備出純天然的納米纖維。聲化學(xué)反應(yīng)主要源于聲空化——液體中空腔的形成、振蕩、生長、收縮至崩潰及其引發(fā)的物理、化學(xué)變化。
本發(fā)明冷凍干燥是把含有大量水分物質(zhì)，預(yù)先進行降溫凍結(jié)成固體，然后在真空的條件下使水蒸汽直接升華出來，而物質(zhì)本身剩留在凍結(jié)時的冰架中，因此它干燥后體積不變，可形成疏松多孔三維材料。冷凍干燥是在低溫下進行，因此對于許多熱敏性的物質(zhì)特別適用，如蛋白質(zhì)、微生物之類不會發(fā)生變性或失去生物活力；由于在凍結(jié)的狀態(tài)下進行干燥，因此體積幾乎不變，保持了原來的結(jié)構(gòu)，不會發(fā)生濃縮現(xiàn)象；由于干燥在真空下進行，氧氣極少，因此一些易氧化的物質(zhì)得到了保護干燥，且能排除95％～99％以上的水份，使干燥后產(chǎn)品能長期保存而不致變質(zhì)，它在生物醫(yī)學(xué)上得到廣泛地應(yīng)用。
本發(fā)明天然納米纖維與天然高分子溶液混合是基于增強細胞支架的強度，用以調(diào)控細胞支架的孔隙率，改善細胞的親和性與支架的生物相容性。
本發(fā)明的優(yōu)點(1)本發(fā)明工藝簡單、能耗少、資金投入少、可操作性強、易于實施，并對環(huán)境友好，無污染；適合實驗室研究制備和大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
(2)本發(fā)明適合面廣，只要具有不同尺度分級結(jié)構(gòu)的天然生物材料，均可采用本發(fā)明制備相應(yīng)的天然納米纖維基組織工程細胞支架；(3)本發(fā)明制備的天然納米纖維直接從天然生物材料中解離而得，不是再生納米纖維；(4)本發(fā)明的天然納米纖維基組織工程細胞支架的形狀與孔隙率及其強度具有可控制性，可通過超聲波的頻率與功率、冷凍干燥機的功率、天然納米纖維的含量以及溶劑成分來實現(xiàn)。制備出的天然納米纖維基組織工程細胞支架有著很好的承載強度、可調(diào)控的支架孔隙率、很好的生物相容性與細胞親和性，在組織工程細胞培養(yǎng)上有著廣泛的應(yīng)用前景。


圖1是一種本發(fā)明采用的超聲波解離裝置設(shè)備示意圖。
圖2是一種本發(fā)明采用的冷凍干燥設(shè)備示意圖。
圖3是本發(fā)明流程示意圖。
圖4是本發(fā)明實施例1制備的天然蜘蛛絲納米纖維基組織工程細胞支架表面的掃描電鏡照片。
圖5是本發(fā)明本發(fā)明實施例3制備的天然蠶絲纖維基組織工程細胞支架表面的掃描電鏡照片。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細地說明。
圖1是一種本發(fā)明采用的超聲波解離裝置設(shè)備示意圖。(超聲波細胞粉碎儀的照片，其型號為JY92-II型，生產(chǎn)廠家為寧波新芝生物科技有限公司)，其規(guī)格為頻率20千赫茲，最大功率900瓦特。顯然，實施例是為了說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的，在本發(fā)明中還可以采用其他能產(chǎn)生符合要求的頻率和功率的超聲波發(fā)生設(shè)備。類似的此類設(shè)備還有超聲波細胞粉碎機、超聲波塑料焊接機、超聲波打孔機、超聲波納米制備機、超聲波振蕩器、超聲波勻漿機等具有超聲波發(fā)生器和超聲波振動系統(tǒng)(主要包括超聲波換能器、超聲波變幅桿和超聲波探頭)的超聲波類裝置。
圖2是一種本發(fā)明采用的冷凍干燥設(shè)備的照片，其型號為LGJ-18型真空冷凍干燥機(生產(chǎn)廠家為湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)，其規(guī)格為功率為3500瓦特，冷凝器溫度為-45℃。顯然，實施例是為了說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的，在本發(fā)明中還可以采用其他能冷凍干燥的符合溫度與功率要求的冷凍干燥設(shè)備。類似的此類設(shè)備一般由致冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、加熱系統(tǒng)、和控制系統(tǒng)四個主要部分組成，在結(jié)構(gòu)上由凍干箱或稱干燥箱、冷凝器或水汽凝集器、冷凍機、真空泵和閥門、電氣控制元件等組成。
實施例1采用如圖1與圖2所示的裝置，按照圖3的工藝制備天然蜘蛛絲納米纖維基組織工程細胞支架天然納米纖維將蜘蛛絲浸泡在裝有超純水的燒杯中；超聲波的功率為600瓦特，頻率為20千赫茲，將超聲波發(fā)生器的探頭深入到燒杯中，超聲解離2.5個小時，制備出30～120納米的天然蜘蛛絲納米纖維，將重量含量為明膠溶液60％的天然納米纖維與明膠溶液混合，加入重量含量為混合溶液的10％的戊二醛進行交聯(lián)形成天然蜘蛛絲納米纖維凝膠，在室溫靜置24個小時，隨后放入10mol/升的甘氨酸水溶液中室溫靜置24小時，然后將甘氨酸反應(yīng)后的凝膠在-20℃進行預(yù)冷凍4個小時，然后在冷凍干燥機中冷凍干燥4小時，冷凍干燥的功率為3500瓦特，冷凝器溫度為-45℃，即可制備出天然蜘蛛絲納米纖維基組織工程細胞支架，如圖4所示。
實施例2采用如圖1與圖2所示的裝置，按照圖3的工藝制備天然甲殼素納米纖維基組織工程細胞支架天然納米纖維將天然甲殼素纖維浸泡在裝有超純水的燒杯中；超聲波的功率為600瓦特，頻率為20千赫茲，將超聲波發(fā)生器的探頭深入到燒杯中，超聲解離2.5個小時，制備出30～120納米的天然甲殼素納米纖維，將重量含量為明膠溶液20％的天然納米纖維與明膠溶液混合，加入重量含量為混合溶液的5％的甲醛進行交聯(lián)形成天然甲殼素納米纖維凝膠，在室溫靜置12小時，隨后放入5mol/升的甘氨酸水溶液中室溫靜置12小時，然后將甘氨酸反應(yīng)后的凝膠在-20℃進行預(yù)冷凍14個小時，然后在冷凍干燥機中冷凍干燥14小時，冷凍干燥的功率為3500瓦特，冷凝器溫度為-85℃，即可制備出天然甲殼素納米纖維基組織工程細胞支架。
實施例3采用如圖1與圖2所示的裝置，按照圖3的工藝制備天然蠶絲納米纖維基組織工程細胞支架天然納米纖維將自蠶繭上繅絲出的蠶絲浸泡在裝有超純水的燒杯中；超聲波的功率為600瓦特，頻率為20千赫茲，將超聲波發(fā)生器的探頭深入到燒杯中，超聲空化1.5個小時，制備出30～120納米的天然蠶絲納米纖維，將重量含量為殼聚糖溶液10％的天然蠶絲納米纖維與殼聚糖溶液混合，加入重量含量為混合溶液的2％的碳二亞胺進行交聯(lián)形成天然蠶絲納米纖維凝膠，在室溫靜置12小時，隨后放入2mol/升的甘氨酸水溶液中室溫靜置1小時，然后將甘氨酸反應(yīng)后的凝膠在-20℃進行預(yù)冷凍10個小時，然后在冷凍干燥機中冷凍干燥10小時，冷凍干燥的功率為3500瓦特，冷凝器溫度為-85℃，即可制備出天然蠶絲納米纖維基組織工程細胞支架，如圖5所示。
實施例4采用如圖1與圖2所示的裝置，按照圖3的工藝制備天然膠原納米纖維基組織工程細胞支架天然納米纖維將處理后的魚鱗浸泡在裝有超純水的燒杯中；超聲波的功率為600瓦特，頻率為20千赫茲，將超聲波發(fā)生器的探頭深入到燒杯中，超聲空化3.5個小時，制備出30～120納米的天然膠原納米纖維，將重量含量為海藻酸溶液1％的天然膠原納米纖維與海藻酸溶液混合，加入重量含量為混合溶液的0.1％的戊二醛進行交聯(lián)形成天然膠原納米纖維凝膠，在室溫靜置0.1小時，隨后放入0.1mol/升的甘氨酸水溶液中室溫靜置0.1小時，然后將甘氨酸反應(yīng)后的凝膠在-20℃進行預(yù)冷凍32個小時，然后在冷凍干燥機中冷凍干燥120小時，冷凍干燥的功率為3500瓦特，冷凝器溫度為-100℃，即可制備出天然膠原納米纖維基組織工程細胞支架。
實施例5采用如圖1與圖2所示的裝置，按照圖3的工藝制備天然纖維素納米纖維基組織工程細胞支架天然納米纖維將處理后的木纖維浸泡在裝有超純水的燒杯中；超聲波的功率為600瓦特，頻率為20千赫茲，將超聲波發(fā)生器的探頭深入到燒杯中，超聲空化5.5個小時，制備出30～120納米的天然纖維素納米纖維，將重量含量為糖蛋白溶液1％的天然纖維素納米纖維與糖蛋白溶液混合，加入重量含量為混合溶液的1％的葡萄糖二醛進行交聯(lián)形成天然纖維素納米纖維凝膠，在室溫靜置0.1小時，隨后放入1mol/升的甘氨酸水溶液中室溫靜置1小時，然后將甘氨酸反應(yīng)后的凝膠在-20℃進行預(yù)冷凍32個小時，然后在冷凍干燥機中冷凍干燥120小時，冷凍干燥的功率為3500瓦特，冷凝器溫度為-20℃，即可制備出天然纖維素納米纖維基組織工程細胞支架。
權(quán)利要求
1.一種天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟(1)將天然生物材料完全浸泡在含有溶劑的容器中，開啟一定頻率一定功率的超聲波裝置，將超聲波發(fā)射探頭深入裝載有天然生物材料溶液的容器中，進行超聲波解離，制備得到天然納米纖維；(2)將步驟(1)所得天然納米纖維與一定天然高分子溶液混合，然后將混合溶液與一定交聯(lián)劑進行交聯(lián)形成凝膠，在室溫靜置，隨后完全浸入甘氨酸水溶液中室溫再次靜置；(3)將步驟(2)制備的凝膠在一定溫度下進行預(yù)冷凍一段時間，然后在冷凍干燥機中冷凍干燥一段時間，即得到天然納米纖維基組織工程細胞支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法，其特征在于，所述天然生物材料為蜘蛛絲、家蠶絲、野蠶絲、羊毛、魚鱗、竹纖維、骨膠原纖維、甲殼質(zhì)纖維、木纖維中的任何一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法，其特征在于，所述溶劑為弱酸、弱堿、純水或超純水中的任何一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法，其特征在于，所述的超聲波裝置頻率為10千赫茲～10兆赫茲，功率為10瓦特～2000瓦特。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法，其特征在于，所述天然高分子為海藻酸、明膠、殼聚糖、糖蛋白、糖胺聚糖中的任何一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法，其特征在于，所述天然納米纖維的重量含量為天然高分子溶液的1％～60％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑為戊二醛、甲醛、碳二亞胺、葡萄糖二醛中的任何一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑的重量含量為混合溶液的0.1％～10％。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法，其特征在于，所述甘氨酸水溶液甘氨酸的含量為甘氨酸水溶液的0.1～10摩爾/升。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法，其特征在于，所述預(yù)冷凍溫度為-20～-100℃；預(yù)冷凍時間為4～32小時。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法，其特征在于，所述的冷凍干燥設(shè)備，功率為100瓦特～5000瓦特；冷凝器溫度為-20～-100℃。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法，其特征在于，所述冷凍干燥溫度為-20～-100℃，凍干燥時間為4～120小時。
全文摘要
一種天然納米纖維基組織工程細胞支架的制備方法，涉及天然納米蜘蛛絲纖維、天然納米蠶絲纖維、天然納米纖維素纖維、天然納米甲殼素纖維以及天然納米膠原纖維基組織工程細胞支架的制備，屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。天然生物材料浸泡在溶劑中，并通過超聲波解離制得天然納米纖維，與天然高分子溶液混合交聯(lián)形成凝膠，預(yù)冷凍一段時間，然后在冷凍干燥機中冷凍干燥一段時間，即得到天然納米纖維基組織工程細胞支架。制備出的天然納米纖維基組織工程細胞支架有著很好的承載強度、可調(diào)控的支架孔隙率、很好的生物相容性與細胞親和性，在組織工程細胞培養(yǎng)上有著廣泛應(yīng)用前景；本發(fā)明操作簡便，工序少，能耗小，投入資金少，適合實驗室研究制備和大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號A61L27/38GK1895684SQ200610089499
公開日2007年1月17日 申請日期2006年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月30日
發(fā)明者馮西橋, 趙紅平 申請人:清華大學(xué)