專利名稱：生物結(jié)構(gòu)HAP/β－TCP組織工程化骨的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，特別涉及到一種生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP組織工程化骨的制備方法
背景技術(shù)：
各種原因如復(fù)雜創(chuàng)傷、骨腫瘤刮除術(shù)后引起的骨缺損修復(fù)尤其是較大缺損的修復(fù)，其供骨源仍是有待解決的問題。由于自體骨骨量有限，且有供骨部位引起血腫、感染、疼痛等并發(fā)癥的可能；異體骨存在免疫炎癥反應(yīng)、傳播疾病等潛在危險(xiǎn)。因此，研究組織工程化骨作為骨缺損修復(fù)材料有重要意義。組織工程涉及支架材料、種子細(xì)胞及誘導(dǎo)或生長因子，其中支架材料及種子細(xì)胞是組織工程的關(guān)鍵。
生物無機(jī)材料是骨組織工程支架的重要研究對(duì)象，羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HAP)是骨的天然無機(jī)成分，具有良好的生物相容性及能與骨鍵性結(jié)合等生物學(xué)特性，因此，用不同方法研制出多種多樣不同性狀和結(jié)構(gòu)的HAP已用于修復(fù)骨缺損。但HAP在體內(nèi)較穩(wěn)定而難以降解限制了它在臨床上的應(yīng)用。β-磷酸三鈣(β-Tri-calcium Phosphate，β-TCP)同樣具有良好的生物相容性，降解較HAP快，但降解速度不穩(wěn)定難以控制。有研究顯示移植HAP與β-TCP的復(fù)合材料比它們其中的單一材料更利于缺損骨的修復(fù)。
人工合成的HAP/β-TCP復(fù)合材料往往因孔隙形態(tài)不均一，呈紡錘形，孔與孔連接處孔徑較小，且孔徑的大小分布差異較大，從數(shù)10微米到700微米均有，甚至有大泡形成，孔之間不能達(dá)到完全連通，部分孔隙是低效或無效孔隙。因此，人工合成多孔HA/β-TCP對(duì)種植細(xì)胞的養(yǎng)份、代謝物交換及骨的內(nèi)向性生長有很大的影響。
異種松質(zhì)骨鍛燒后的無機(jī)支架的孔隙與松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)相似，異種松質(zhì)骨經(jīng)理化方法祛除脂類、蛋白和膠原后主要獲得HAP，HAP再經(jīng)酸性磷酸鹽處理，部分轉(zhuǎn)化成β-TCP，因而獲得HAP/β-TCP復(fù)合材料，該復(fù)合材料從材料的結(jié)構(gòu)上比人工合成HAP/β-TCP更適合用于骨缺損修復(fù)。目前，從異種松質(zhì)骨鍛燒獲得的HAP/β-TCP復(fù)合材料制備方法中普遍采用了煮沸5-10小時(shí)的工藝，不僅使鈣離子及磷酸根丟失，更主要的是導(dǎo)致松質(zhì)骨的微結(jié)構(gòu)變形、塌陷、小梁斷裂，最終獲得的HAP/β-TCP復(fù)合材料的微結(jié)構(gòu)與松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)差異很大，因此，有必要對(duì)現(xiàn)有方法進(jìn)行改進(jìn)以獲得形態(tài)、微結(jié)構(gòu)與松質(zhì)骨完全相似的生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP復(fù)合材料，更好地滿足骨組織工程種子細(xì)胞對(duì)支架材料的結(jié)構(gòu)要求。
在老年性骨質(zhì)疏松、腫瘤、糖尿病等病人骨折后的骨缺損，其修復(fù)較慢，重要原因之一是全身及/或缺損局部作為新骨形成源泉的向成骨細(xì)胞分化的干細(xì)胞數(shù)量大大減少，治療此類骨缺損用單純的支架材料效果較差或愈合時(shí)間延長，仍是需要解決的難題，因此，需要發(fā)展用生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP無機(jī)支架材料種植骨髓基質(zhì)干細(xì)胞并予以成骨定向誘導(dǎo)構(gòu)建的組織工程化骨，既為新骨形成提供支架又提供種子細(xì)胞，以加快骨缺損的修復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種便于體內(nèi)降解、降解速度可控，形態(tài)和微結(jié)構(gòu)與松質(zhì)骨完全相似，更利于骨缺損修復(fù)的生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP組織工程化骨的制備方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了如下述的技術(shù)方案一種生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP組織工程化骨的制備方法，包括制備具有生物結(jié)構(gòu)的HAP/β-TCP復(fù)合材料支架，基質(zhì)干細(xì)胞體外分離、擴(kuò)增及向成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)，構(gòu)建組織工程化骨，其特點(diǎn)是1.生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP復(fù)合材料支架的制備，用成年牛的椎體、股骨頭或股骨下端松質(zhì)骨為原料，經(jīng)多次清洗祛雜及化學(xué)方法祛除脂類、蛋白后，再經(jīng)多次漂洗、脫水后干燥，進(jìn)行第一次高溫處理，溫度從低到高的區(qū)間內(nèi)設(shè)置多個(gè)溫度程序段，以獲得保持松質(zhì)骨小梁結(jié)構(gòu)的HAP，將HAP與0.5-2.0M濃度的NH4H2PO4反應(yīng)1-8小時(shí)后，經(jīng)第二次高溫處理，獲得HAP與β-TCP比例為80-30比20-70的生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP復(fù)合材料支架；2.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSC)體外分離、擴(kuò)增，在被抽取動(dòng)物體內(nèi)常規(guī)局部麻醉，髂后上嵴穿刺，抽取骨髓液約2-6ml，肝素抗凝，PBS稀釋，加入Ficoll分離液梯度離心，將MSC層吸出，加入PBS，離心，接種于培養(yǎng)瓶，加入高糖DMEM培養(yǎng)液，入孵箱37℃5％CO2培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀況進(jìn)行換液，平衡PH值，細(xì)胞生長達(dá)90％時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞傳代消化用胰蛋白酶，傳代培養(yǎng)數(shù)次后骨髓基質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量達(dá)到106-107個(gè)/ml后收集備用；3.構(gòu)建組織工程化骨，將上述生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP材料支架在高純水中超聲清洗、干燥、封裝、消毒，用前將材料于少量培養(yǎng)基中浸泡并在超凈臺(tái)中晾干，將106-107/ml細(xì)胞均勻滴在塊狀支架材料上，37℃5％CO2孵育2-5小時(shí)，再加入培養(yǎng)基，24小時(shí)后DMEM培養(yǎng)基換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2-3無換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，12-16天細(xì)胞長滿支架材料內(nèi)部孔隙后構(gòu)建成具有生物結(jié)構(gòu)的HAP/β-TCP的組織工程化骨。
以上技術(shù)方案中所述的1.生物結(jié)構(gòu)HAP/-TCP復(fù)合材料支架的制備中，第一次高溫處理溫度從100℃至1000℃設(shè)置12-18個(gè)溫度程序段，最快升溫速率15-30℃/分，最慢升溫速率2-5℃/分，自然降溫；第二次高溫處理800-1000℃持溫3-5小時(shí)，升溫速率5-12℃，自然降溫。
以上技術(shù)方案中所述的2.髓基質(zhì)干細(xì)胞體外分離、擴(kuò)增中，高糖DMEM培養(yǎng)液的配方為高糖DMEM原液配制(1000ml)DMEM干粉一袋用少量高純?nèi)ルx子水先溶葉酸6mg精氨酸-鹽酸 116mg谷氨酰胺216mg天冬氨酸36mgHeper acid 4.766g葡萄糖 4g碳酸氫鈉(后加) 2g4萬單位的慶大酶素 1ml配制所用水為高純?nèi)ルx子水而胰蛋白酶細(xì)胞消化液配方為稱0.25g胰蛋白酶干粉溶于100ml無鈣鎂Hank’s液中，充分混勻后無菌過濾分裝備用。
無鈣、鎂Hank’s液的制備(PH＝7.24℃保存)氯化鈉 8g氯化鉀 0.4g磷酸氫二鈉 0.7g磷酸二氫鉀 0.06g葡萄糖 1ml雙蒸水 1000ml1％酚紅 2ml所述3.構(gòu)建組織工程化骨中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為，含β-甘油磷酸鈉10-3mol/L，地塞米松10-8mol/L，維生素C 50mg/L，BMP2100ng/ml的高糖DMEM培養(yǎng)基。
由于本發(fā)明采用了生物學(xué)方法制備出具有生物結(jié)構(gòu)的HAP/β-TCP復(fù)合材料、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外分離、擴(kuò)增及向成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，并用生物結(jié)構(gòu)的HAP/β-TCP復(fù)合材料作為支架種植骨髓基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建成為組織工程化骨，由于該組織工程化骨的形態(tài)、微結(jié)構(gòu)與松質(zhì)骨完全相似，具有生物結(jié)構(gòu)的HAP/β-TCP復(fù)合材料支架在體內(nèi)便于降解、降解速度可以控制，而生物結(jié)構(gòu)的HAP/β-TCP復(fù)合無機(jī)材料支架上種植骨髓基質(zhì)干細(xì)胞并予以成骨定向誘導(dǎo)，既為新骨形成提供支架又提供種子細(xì)胞，所以大大加快了骨缺損的修復(fù)，從而使得具有生物結(jié)構(gòu)的HAP/β-TCP組織工程化骨在骨移植領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景，生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP組織工程化骨應(yīng)用的范圍是1.修復(fù)因創(chuàng)傷、腫瘤及先天性假關(guān)節(jié)切除后的骨缺損；2.椎體間融合、椎旁融合、椎管擴(kuò)大術(shù)中的骨橋植入；3.脛骨平臺(tái)、跟骨壓縮性骨折及Colles骨折后復(fù)位形成的骨缺損填充重建；4.股骨頭壞死病灶清理術(shù)后骨缺損的填充重建；5.人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后骨溶解病灶處理或翻修術(shù)時(shí)假體周圍骨缺損的填充重建；6.頜骨缺損修復(fù)、牙槽嵴增高；7.取自體骨后供骨區(qū)骨缺損的回填。


圖1本發(fā)明生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP組織工程化骨結(jié)構(gòu)2生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP支架材料的微結(jié)構(gòu)360周HAP/β-TCP組織工程化骨修復(fù)1.5cm兔橈骨節(jié)段性缺損460周單純HAP/β-TCP材料支架修復(fù)1.5cm兔橈骨節(jié)段性缺損圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例構(gòu)建兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP組織工程化骨及應(yīng)用一、生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP支架材料的制備1.松質(zhì)骨的來源取3歲成年牛股骨下端松質(zhì)骨，切取30mm×20mm×15mm塊料，(也可取牛椎體或牛股骨頭代替牛股骨下端)；2.原料高壓流水沖洗，溫水浸泡，去離子水漂洗各2-5次去除雜質(zhì)、骨髓及部分脂肪；3.1-2M的KOH或NaOH浸泡24-48小時(shí)，去離子水漂洗2-4次；4.2％-20％H2O2浸泡24-48小時(shí)，去離子水漂洗2-4次，晾干；5.75％-100％系列酒精脫水24-48小時(shí)，晾干；6.60℃-100℃干燥4-24小時(shí)；7.第一次高溫處理，從100℃至1000℃設(shè)置12-18個(gè)溫度程序段，最快升溫速率15-30℃/分，最慢升溫速率2-5℃/分，溫度程序段具體分配如下1)室溫 升至100-130℃10-20分鐘，持溫10-20分鐘；2)100-130℃升至200-220℃10-30分鐘，持溫60-90分鐘；3)200-220℃升至250-260℃15-25分鐘，持溫20-40分鐘；4)250-260℃升至280-310℃5-15分鐘，持溫10-20分鐘；5)280-310℃升至320-330℃8-15分鐘，持溫20-60分鐘；
6)320-330℃升至360-400℃5-10分鐘，持溫20-35分鐘；7)360-400℃升至450-500℃10-20分鐘，持溫10-30分鐘；8)450-500℃升至540-560℃5-20分鐘，持溫10-20分鐘；9)540-560℃升至580-610℃15-25分鐘，持溫30-60分鐘；10)580-610℃升至660-680℃6-15分鐘，持溫10-20分鐘；11)660-680℃升至750-800℃10-15分鐘，持溫15-20分鐘；12)750-800℃升至880-910℃15-25分鐘，持溫15-30分鐘；13)880-910℃升至940-960℃10-20分鐘，持溫90-180分鐘；14)自然降溫至室溫；8.材料超聲清洗3-5遍，80-100℃干燥4-8小時(shí)；9.材料浸于濃度為0.95-1.50M的NH4H2PO4中3-6小時(shí)，80℃干燥4小時(shí)；10.第二次高溫處理800-1000℃持溫3-5小時(shí)，升溫速率5-12℃，自然降溫；11.材料超聲清洗1-3遍，80-100℃干燥4-8小時(shí)，獲得HAP與β-TCP比例為65/35的生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP復(fù)合材料支架；12.雙層封裝，鈷60消毒。
其HAP/β-TCP支架材料的微結(jié)構(gòu)見圖2。
二、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外分離、擴(kuò)增、誘導(dǎo)標(biāo)本獲取與細(xì)胞分離常規(guī)局部麻醉，髂后上棘穿刺，抽取骨髓液約4ml，肝素抗凝。
1抽二月齡兔骨髓2ml，PBS稀釋2倍，混勻，放入20ml離心管中；2準(zhǔn)備10ml離心管2只，各加入淋巴細(xì)胞分離液3ml，用5ml注射器抽取骨髓稀釋液，沿10ml離心管壁慢慢注入，制成單細(xì)胞懸液；3離心2000rpm，15min；4將MSC層吸出(白色渾濁狀)，放入另外一個(gè)離心管中，加入PBS，離心1500rpm，7-8min；
5重復(fù)洗一次，棄PBS，3×105/ml的濃度接種于25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入高糖DMEM(12％FBS，慶大霉素4萬單位/100ml)5ml，37℃5％CO2培養(yǎng)。
細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增原代培養(yǎng)36小時(shí)細(xì)胞貼壁，洗掉懸浮細(xì)胞，全部換液。
傳代培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞生長狀況進(jìn)行換液，細(xì)胞生長達(dá)90％時(shí)進(jìn)行傳代1吸出培養(yǎng)液，加入2ml PBS，輕輕晃動(dòng)，棄PBS；225cm2培養(yǎng)瓶加入胰酶3ml，37℃3min，顯微鏡觀察細(xì)胞全部懸浮，高糖DMEM等量加入，終止消化；3吸取細(xì)胞懸液放入離心管，1500rpm，3min；4離心后，棄PBS，依細(xì)胞數(shù)加入PBS 3-5ml，計(jì)數(shù)，離心1500rpm，3min；5棄PBS，加入培養(yǎng)基，約2000cm2接種，37℃5％CO2培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)1)誘導(dǎo)方法生長良好的MSC，按2000/cm2種于預(yù)置有IWAKI玻片的6孔板中。24小時(shí)后，換用成骨誘導(dǎo)體系，每2-3天換液一次，12天組織化學(xué)法(鈣-鈷法)堿性磷酸酶染色，苦味酸天狼猩紅染I、III型膠原；2)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)體系含β-甘油磷酸鈉10-3mol/L，地塞米松10-8mol/L，維生素C 50mg/L，BMP2100ng/ml的高糖DMEM培養(yǎng)基；其中，兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSC)培養(yǎng)用液為高糖DMEM原液配制(1000ml)DMEM干粉一袋用少量高純?nèi)ルx子水先溶葉酸6mg精氨酸-鹽酸 116mg谷氨酰胺216mg天冬氨酸36mgHeper acid 4.766g葡萄糖 4g碳酸氫鈉(后加) 2g4萬單位的慶大酶素 1ml配制所用水為高純?nèi)ルx子水；
胰蛋白酶配制稱0.25g胰蛋白酶干粉溶于100ml無鈣鎂Hank’s液中，充分混勻后無菌過濾分裝備用。
無鈣、鎂Hank’s液的制備(PH＝7.24℃保存)氯化鈉 8g氯化鉀 0.4g磷酸氫二鈉 0.7g磷酸二氫鉀 0.06g葡萄糖 1ml雙蒸水 1000ml1％酚紅 2ml血清為胎牛血清56℃水浴中滅活30min以破壞補(bǔ)體和某些傳染的病毒。
淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)，密度1.077g/ml，用于梯度分離骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞。
三、生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP種植兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化骨的制備1.將生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP支架在高純水中超聲清洗、干燥、封裝、消毒；2.將材料于少量高糖DMEM培養(yǎng)基中浸泡并在超凈臺(tái)中晾干；3.將0.2-0.5ml 106-107/ml MSC細(xì)胞均勻滴在0.4-1ml的塊狀支架材料上，37℃5％CO2孵育2-5小時(shí)，再加入高糖DMEM培養(yǎng)基；4.24-48小時(shí)后高糖DMEM培養(yǎng)基換成MSC誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2-3天換一次培養(yǎng)基，第一第二次用MSC誘導(dǎo)培養(yǎng)基換液，以后用高糖DMEM培養(yǎng)基，14天細(xì)胞長滿支架材料內(nèi)部孔隙構(gòu)建成組織工程化骨。
生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP組織工程化骨結(jié)構(gòu)見圖1。
四、生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP種植兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化骨修復(fù)骨缺損動(dòng)物試驗(yàn)1.用體重3.0-3.4kg的成年新西蘭兔8只，速眠新0.25ml·kg-1肌肉注射麻醉，施行無菌手術(shù)，用磨鉆在雙側(cè)橈骨造1.5cm節(jié)段性缺損，鉆時(shí)用生理鹽水不斷沖洗。兩側(cè)分別植入直徑3mm長1.5mm的柱狀生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP組織工程化骨、生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP，術(shù)后慶大霉素4萬單位/只肌注三天，單籠飼養(yǎng)；2.60周處死動(dòng)物，取雙側(cè)橈尺骨入10％的福爾馬林固定、梯度乙醇脫水、PMMA包埋，連續(xù)切片(Leica SM2500E)，Von kossa麗春紅染；。
3.組織學(xué)顯示60周生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP組織工程化骨已修復(fù)1.5cm橈骨節(jié)段性缺損，見圖3，支架材料大部分降解，成骨效果優(yōu)于單純生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP材料，見圖4。
以上是構(gòu)建兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP組織工程化骨及應(yīng)用的具體實(shí)施例，如果按照本制備方法還可以構(gòu)建成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP組織工程化骨，用于人體的骨缺損、骨移植的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP組織工程化骨的制備方法，包括制備具有生物結(jié)構(gòu)的HAP/β-TCP復(fù)合材料支架，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外分離、擴(kuò)增及向成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)，構(gòu)建組織工程化骨，其特征在于(1)生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP復(fù)合材料支架的制備，用成年牛的椎體、股骨頭或股骨下端松質(zhì)骨為原料，經(jīng)多次清洗祛雜及化學(xué)方法祛除脂類、蛋白后，再經(jīng)多次漂洗、脫水后干燥，進(jìn)行第一次高溫處理，溫度從低到高的區(qū)間內(nèi)設(shè)置多個(gè)溫度程序段，以獲得保持松質(zhì)骨小梁結(jié)構(gòu)的HAP，將HAP與0.5-2.0M濃度的NH4H2PO4反應(yīng)1-8小時(shí)后，經(jīng)第二次高溫處理，獲得HAP與β-TCP比例為80-30比20-70的生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP復(fù)合材料支架；(2)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外分離、擴(kuò)增，在被抽取動(dòng)物體內(nèi)常規(guī)局部麻醉，髂后上嵴穿刺，抽取骨髓液約2-10ml，肝素抗凝，PBS稀釋，加入淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)分離液梯度離心，將MSC層吸出，加入PBS，離心，接種于培養(yǎng)瓶，加入高糖DMEM培養(yǎng)液，入孵箱37℃ 5％CO2培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀況進(jìn)行換液，平衡PH值，細(xì)胞生長達(dá)90％時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞傳代消化使用胰蛋白酶，傳代培養(yǎng)數(shù)次后骨髓基質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量達(dá)到106-107個(gè)/ml后收集備用；(3)構(gòu)建組織工程化骨，將上述生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP材料支架在高純水中超聲清洗、干燥、封裝、消毒，用前將材料于少量培養(yǎng)基中浸泡并在超凈臺(tái)中晾干，將106-107/ml細(xì)胞均勻滴在塊狀支架材料上，37℃5％CO2孵育2-5小時(shí)，再加入培養(yǎng)基，24小時(shí)后高糖DMEM培養(yǎng)基換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2-3天換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，12-16天細(xì)胞長滿支架材料內(nèi)部孔隙后構(gòu)建成具有生物結(jié)構(gòu)的HAP/β-TCP的組織工程化骨。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述組織工程化骨的制備方法，其特征在于所述(1)生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP復(fù)合材料支架的制備中，第一次高溫處理溫度程序段是從100℃至1000℃溫度區(qū)間內(nèi)設(shè)置12-18個(gè)溫度程序段，最快升溫速率15-30℃/分，最慢升溫速率2-5℃/分，自然降溫；第二次高溫處理800-1000℃持溫3-5小時(shí)，升溫速率5-12℃，自然降溫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述組織工程化骨的制備方法，其特征在于所述(1)生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP復(fù)合材料支架的形狀為方形體塊狀，也可以經(jīng)破碎、篩選后形成0.5mm-2mm的顆粒狀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述組織工程化骨的制備方法，其特征在于所述(1)生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP復(fù)合材料支架中，制備HAP與β-TCP比例分別為80/20，65/35，50/50，30/70的生物結(jié)構(gòu)HAP/β-TCP復(fù)合材料的NH4H2PO4濃度分別為0.50～0.9M、0.95～1.30M、1.35～1.70M、1.75～2.0M，反應(yīng)時(shí)間為1～8小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述組織工程化骨的制備方法，其特征在于所述(2)髓基質(zhì)干細(xì)胞體外分離、擴(kuò)增中，高糖DMEM培養(yǎng)液的配方為高糖DMEM原液配制(1000ml)DMEM干粉一袋用少量高純?nèi)ルx子水先溶葉酸6mg精氨酸-鹽酸 116mg谷氨酰胺216mg天冬氨酸36mgHeper acid 4.766g葡萄糖 4g碳酸氫鈉(后加) 2g4萬單位的慶大酶素 1ml配制所用水為高純?nèi)ルx子水胰蛋白酶消化液配方為稱0.25g胰蛋白酶干粉溶于100ml無鈣鎂Hank’s液中，充分混勻后無菌過濾分裝備用。無鈣、鎂Hank’s液的制備(PH＝7.24℃保存)氯化鈉 8g氯化鉀 0.4g磷酸氫二鈉 0.7g磷酸二氫鉀 0.06g葡萄糖 1ml雙蒸水 1000ml1％酚紅2ml
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述組織工程化骨的制備方法，其特征在于所述(3)構(gòu)建組織工程化骨中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為，含β-甘油磷酸鈉10-3mol/L，地塞米松10-8mol/L，維生素C 50mg/L，BMP2100ng/ml的高糖DMEM培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物結(jié)構(gòu)HAP/β－TCP組織工程化骨的制備方法，包括1.以牛股骨下端松質(zhì)骨為原料，經(jīng)祛除骨髓、脂、蛋白，漂洗、干燥，高溫處理，獲得HAP，將HAP與NH
文檔編號(hào)A61L27/00GK1883719SQ20061009067
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月6日
發(fā)明者陳大福, 田偉 申請(qǐng)人:北京市創(chuàng)傷骨科研究所