專利名稱：肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉及作為免疫佐劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的免疫活性物質(zhì)和免疫佐劑化合物。
背景技術(shù)：
魚腥草素為從魚腥草中提取的活性成份，具有抗菌、提高免疫功能等多種活性，其化學(xué)名字為“葵酰乙醛”。由于高純度的葵酰乙醛不穩(wěn)定，通常制備成性質(zhì)穩(wěn)定而生物活性不變的“葵酰乙醛亞硫酸鹽”，商品名字為“合成魚腥草素”。根據(jù)魚腥草素的分子結(jié)構(gòu)合成了系列化合物，這些化合物也具有類似于魚腥草的生物活性(參見①、Ye Xiaoli(葉小利)，LiXuegang(李學(xué)剛).Effect ofthe Surface Activity on the Antibacterial Activity of Octadecanoyl Acetal SodiumSulfite Series(十八烷酰乙醛亞硫酸鈉的表面活性和抗菌活性).Colloids and Surfaces A(膠體與界面科學(xué)).2005，V26885～89。②、Ye Xiaoli(葉小利)，Li Xuegang(李學(xué)剛).“Relationshipbetween the antibacterial and immunologic activities of Houttuyfonate homologues and their surfaceactivities”(魚腥草素類似物的抗菌活性和免疫活性與表面活性的關(guān)系).Journal of Asian NaturalProducts Research(亞洲天然產(chǎn)物雜志)，2006，V8(4)327～334。上述兩篇文獻(xiàn)中均不涉及肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉，也未涉及免疫佐劑的內(nèi)容。王大勇等提出了魚腥草素的免疫活性和免疫佐劑方面的活性(王大勇，《合成魚腥草素的免疫調(diào)節(jié)及佐劑作用》，沈陽藥科大學(xué)博士學(xué)位論文，2003)。但是，到目前為止，尚未見關(guān)于肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉的報(bào)道，更未見關(guān)于肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉免疫活性和免疫佐劑的報(bào)道。
免疫佐劑是在制劑過程中加入疫苗，通過特異性或非特異性免疫增強(qiáng)作用提高血清抗體水平的物質(zhì)。減毒活病毒或細(xì)菌的免疫激活作用通常較強(qiáng)，可以在沒有佐劑的情況下刺激機(jī)體在較長的時(shí)期內(nèi)產(chǎn)生足夠多的抗體。但是大多數(shù)可溶性純化蛋白質(zhì)疫苗或者含有純化病原微生物的有效抗原組分的亞單位疫苗的免疫激活作用非常弱，不足以刺激機(jī)體產(chǎn)生足夠量的抗體，因此必須在疫苗的制造過程中加入免疫佐劑。
胞壁酞二膚(MDP)最初源于分枝桿菌細(xì)胞壁中的雜多糖。在佐劑中MDP及其衍生物的免疫藥理作用是最強(qiáng)的。但MDP是致熱源，所以不能用于人類疫苗。目前，被批準(zhǔn)用于人類疫苗生產(chǎn)和應(yīng)用的佐劑只有鋁或鈣化合物膠體。但鋁化合物提高可溶性蛋白質(zhì)疫苗、純化蛋白質(zhì)亞單位疫苗抗體產(chǎn)量的作用較差，而純化亞單位疫苗無疑是疫苗的未來發(fā)展方向；另外，鋁化合物的佐劑作用在超過一定劑量以后會逐漸下降；其它問題還有，含有鋁化合物的疫苗不能采用低溫凍干技術(shù)生產(chǎn)，也不能冷凍保存等。
因此，開發(fā)新型免疫佐劑具有理論和實(shí)際價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要保護(hù)的免疫活性物質(zhì)和免疫佐劑，其化學(xué)名稱為肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉，化學(xué)分子式C16H31O5SNa；分子結(jié)構(gòu)式 本化合物為白色針狀或者片狀結(jié)晶，熔點(diǎn)為167～169℃，微溶于冷乙醇，易溶于熱乙醇，不溶于水、丙酮、乙醚和石油醚；高溫下容易分解。
合成肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉的方法如下①、按分子比為肉豆蔻酸∶冰醋酸∶氫氧化鈣＝1∶2～6∶2～5的比例，將氫氧化鈣與0.6～2.0倍量的水混合，攪拌成糊狀；再將肉豆蔻酸和醋酸混合物，倒入石灰糊中，不斷攪拌，反應(yīng)形成鈣鹽。鈣鹽干餾，獲得油狀物；進(jìn)行真空分子蒸餾，獲得高純度中間體——甲十三酮。
②、按中間體∶甲酸乙酯∶金屬鈉＝1∶0.4～0.8∶0.1～0.3的比例，將中間體、甲酸乙酯、以及中間體15～20倍量的無水苯，倒入園底燒瓶中。再將金屬鈉以小塊形式，加入反應(yīng)器中，不時(shí)震蕩，保持溫度在40℃以下，反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)后生成的混合物用1～4倍體積的水分3～4次萃取提取，合并提取液。
③、按中間體∶亞硫酸氫鈉∶醋酸＝1∶0.5～3.0∶0.1～1.0的比例，在水提液中加入亞硫酸氫鈉溶液(亞硫酸氫鈉溶于適量水和冰醋酸中)，立即生成大量沉淀，搖均勻后過夜。第二天過濾，沉淀用50％乙醇重結(jié)晶，即得鱗片或針狀結(jié)晶。
本產(chǎn)品為一種免疫活性藥物，具有提高動物免疫活性的能力，尤其是具有免疫佐劑的功能，可以作為免疫增強(qiáng)劑和免疫佐劑使用。
作為免疫佐劑的用法將肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉與疫苗一起按疫苗(或者抗原)∶佐劑＝1∶0.01～100的比例(總量百分比)復(fù)配后，按疫苗的常規(guī)處理，即可得到高活性的疫苗。
本化合物具有三個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)①、免疫活性非常高。肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉的免疫活性明顯高于合成魚腥草素和新魚腥草素，在烷酰乙醛亞硫酸鈉同系物中其免疫增強(qiáng)能力最高。
②、具有極強(qiáng)的免疫佐劑功能。肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉能夠顯著提高牛血清抗原產(chǎn)生抗體的能力，能夠顯著增加疫苗的活性。在同類化合物中，其增強(qiáng)抗原生產(chǎn)抗體的能力最強(qiáng)，是最強(qiáng)的免疫佐劑。
③、肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉作為免疫佐劑的安全性高。肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉為魚腥草素的類似物，其安全性較好；尤其是沒有熱源性問題。因此，從安全性的角度講可望取代MDP開發(fā)為一種免疫佐劑功能很強(qiáng)的新型佐劑。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1，按以下步驟合成肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉①、中間體的合成將消石灰1.5公斤，加水1.2公斤，攪拌成糊狀；再加入肉豆蔻酸0.6125公斤，醋酸1.5公斤，混合均勻后，倒入石灰糊中，不斷攪拌，即形成2.5公斤鈣鹽。干餾后，得到粗品0.5公斤；粗品減壓蒸餾，收集恒定餾分，得淺黃色中間體0.377公斤。
②、接枝將377克中間體與20克甲酸乙酯溶于無水苯2升中，倒入5升園底燒瓶中。再將5.76克金屬鈉切碎，分次加入反應(yīng)液中，不時(shí)震蕩，保持溫度在40℃以下。室溫放置過夜。用1500毫升水提取4次，合并水提液。
③、產(chǎn)品在水提液中加入亞硫酸氫鈉溶液(45.7克溶于90毫升水與13.4克冰醋酸的混合液)，立即生成大量沉淀，搖均勻后過夜。第二天過濾，沉淀用50％乙醇1350毫升重結(jié)晶，即得鱗片或針狀結(jié)晶，過濾(用少量乙醇洗滌)，干燥，得392克產(chǎn)品。
實(shí)施例2，按以下步驟合成肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉①、中間體的合成將消石灰1公斤，加水0.8公斤，攪拌成糊狀；再加入肉豆蔻酸0.5公斤，醋酸1公斤，混合均勻后，倒入石灰糊中，不斷攪拌，即形成1.5公斤鈣鹽。干餾后，得到粗品0.3公斤；粗品減壓蒸餾，收集恒定餾分，得淺黃色中間體0.25公斤。
②、接枝將250克中間體與15克甲酸乙酯溶于無水苯1.5升中，倒入5升園底燒瓶中。再將4.6克金屬鈉切碎，分次加入反應(yīng)液中，不時(shí)震蕩，保持溫度在40℃以下。室溫放置過夜。用1000毫升水提取3次，合并水提液。
③、產(chǎn)品在水提液中加入亞硫酸氫鈉溶液(40克溶于60毫升水與10克冰醋酸的混合液)，立即生成大量沉淀，搖均勻后過夜。第二天過濾，沉淀用50％乙醇800毫升重結(jié)晶，即得鱗片或針狀結(jié)晶，過濾(用少量乙醇洗滌)，干燥，得205克產(chǎn)品。
實(shí)施例3，按以下步驟合成肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉①、中間體的合成將消石灰2公斤，加水1.6公斤，攪拌成糊狀；再加入肉豆蔻酸0.75公斤，醋酸2公斤，混合均勻后，倒入石灰糊中，不斷攪拌，即形成4公斤鈣鹽。干餾后，得到粗品0.9公斤；粗品減壓蒸餾，收集恒定餾分，得淺黃色中間體0.67公斤。
②、接枝將670克中間體與30克甲酸乙酯溶于無水苯3升中，倒入5升園底燒瓶中。再將7.6克金屬鈉切碎，分次加入反應(yīng)液中，不時(shí)震蕩，保持溫度在40℃以下。室溫放置過夜。用1800毫升水提取3次，合并水提液。
③、產(chǎn)品在水提液中加入亞硫酸氫鈉溶液(60克溶于120毫升水與18.3克冰醋酸的混合液)，立即生成大量沉淀，搖均勻后過夜。第二天過濾，沉淀用50％乙醇1500毫升重結(jié)晶，即得鱗片或針狀結(jié)晶，過濾(用少量乙醇洗滌)，干燥，得524克產(chǎn)品。
實(shí)施例4，肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉作為免疫活性物質(zhì)的使用方法將肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉1g、TWeen-80 1g，溶于1升蒸餾水中，滅菌后，分裝為200瓶(每瓶5毫克肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉)。對于經(jīng)常感冒和免疫低下者，注射肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉針劑即可增強(qiáng)抵抗感冒等疾病的能力；或者感冒引發(fā)咽喉炎，注射肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉針劑將具有良好的治療效果。
實(shí)施例5，肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉作為免疫佐劑提高禽流感疫苗接種率的使用方法禽流感疫苗1份，加入肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉10份，混合均勻后，接種。即可顯著提高疫苗的接種成功率。
實(shí)施例6，肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉作為乙肝疫苗免疫佐劑的使用方法乙肝疫苗1份，加入肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉0.1份，混合均勻后，接種。即可顯著提高疫苗的接種成功率。對于乙肝疫苗接種效果差的人群，將乙肝疫苗與肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉混合后一起使用，可望接種乙肝疫苗成功。
實(shí)施例7，肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉的免疫活性試驗(yàn)(雞紅細(xì)胞吞噬法)小白鼠(18～22克/只)分為7組(每組10只)，按50mg/Kg劑量口服給藥，對照組喂養(yǎng)同等劑量的生理鹽水，連續(xù)6天。最后一次給藥后1小時(shí)，每只動物腹腔注射5％的雞紅細(xì)胞懸液1ml，輕輕按揉腹部，使雞紅細(xì)胞懸液分散并與腹腔液混合均勻。20分鐘后，將動物斷頭處死，每只動物腹腔注射生理鹽水1ml，輕輕揉動腹部3分鐘。分別抽取每只動物腹腔液0.5ml，1000rpm離心10分鐘，用生理鹽水溶液混懸沉降下來的細(xì)胞，制備涂片，涂片干后用冷甲醇固定。甲醇自然揮發(fā)以后，加入適量瑞氏染液染色1min，按1∶1～2的比例滴加pH 6.5的PBS，輕輕吹動使染液與PBS混勻，此時(shí)可以觀察到染料逐漸浮到液面上來形成折射出斑斕色彩的油狀薄膜。室溫靜置10～15分鐘。用自來水小心沖去染液，干燥后用油鏡檢查巨噬細(xì)胞吞噬百分率，吞噬標(biāo)準(zhǔn)為紅細(xì)胞大半進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)(注如染色過深，可用95％乙醇沖洗；染色過淺可重染)。吞噬百分率等于吞噬了雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)除以經(jīng)過計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞總數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
表1、巨噬細(xì)胞吞噬能力試驗(yàn)結(jié)果

可見，肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉的免疫活性明顯高于合成魚腥草素和新魚腥草素，在烷酰乙醛亞硫酸鈉同系物中其免疫增強(qiáng)能力最高。
實(shí)施例7免疫佐劑試驗(yàn)(家兔接種牛血清法)動物(健康家兔，3月齡)分成7組(每組8只)，每組動物分別單次皮下注射藥物劑量為10mg/只家兔的牛血清(BSA)，初次免疫接種液0.2ml或不含佐劑的BSA初次免疫接種液(對照組)。初次免疫接種21天以后，每組動物單次皮下注射0.2ml BSA再次免疫接種液。再次免疫接種10天以后，采集動物外周血液，以3000rpm離心15分鐘分離血清。采用ELISA檢測兔血清抗體效價(jià)。
表2、魚腥草素類似物為佐劑時(shí)兔血清的檢測結(jié)果(OD450值)


可見，肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉能夠顯著提高牛血清抗原產(chǎn)生抗體的能力，能夠顯著增加疫苗的活性。在同類化合物中，其增強(qiáng)抗原生產(chǎn)抗體的能力最強(qiáng)，是最強(qiáng)的免疫佐劑；與免疫佐劑功能極強(qiáng)的MDP相比(目前生產(chǎn)上應(yīng)用的免疫活性最強(qiáng))，其免疫佐劑能力更強(qiáng)；肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉的免疫佐劑功能明顯高于氫氧化鋁。
實(shí)施例8安全性實(shí)驗(yàn)(兔子熱源試驗(yàn)法)動物(健康家兔，3月齡)分成2組(每組8只)，恒溫動物房飼養(yǎng)；每組動物分別單次皮下注射藥物劑量為100mg/只家兔的藥物(肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉和MDP)，通過兔子肛門測量兔子體溫的變化，觀察注射藥物后兔子體溫升高情況。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射MDP后，兔子的提問升高0.9℃，具有明顯的致熱源性(升高0.5℃即為熱源不合格)；注射肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉后，兔子提問升高0.15℃，沒有熱源問題。
由此可見，肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉為魚腥草素的類似物，其安全性較好；尤其是沒有熱源性問題。因此，從安全性的角度講可望取代MDP開發(fā)為一種免疫佐劑功能很強(qiáng)的新型佐劑。
權(quán)利要求
1.一種作為免疫活性物質(zhì)和免疫佐劑使用的化合物，其化學(xué)名稱為肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉，化學(xué)分子式C16H31O5SNa；分子結(jié)構(gòu)式
2.權(quán)利要求1所述的化合物在提供動物的免疫活性方面的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的化合物在作為免疫佐劑方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種新的免疫活性物質(zhì)和免疫佐劑化合物肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉，其化學(xué)名稱為肉豆蔻酰乙醛亞硫酸鈉，化學(xué)分子式C
文檔編號A61K39/39GK101019845SQ20061009537
公開日2007年8月22日 申請日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者葉小利, 李學(xué)剛, 袁呂江 申請人:西南大學(xué)