專利名稱：知母提取物在制備改善胰島素抵抗藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
二、技術(shù)背景胰島素抵抗是指靶細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性下降，需要更多的胰島素才能維護(hù)正常的血糖濃度，表現(xiàn)為外周組織尤其是肌肉、脂肪組織對(duì)葡萄糖的利用障礙。發(fā)病早期胰腺β細(xì)胞可以代嘗性地增加胰島素的分泌量以彌補(bǔ)其效應(yīng)不足，但隨著胰島β細(xì)胞功能的逐步衰竭，即代償機(jī)制的喪失，就會(huì)表現(xiàn)出胰島素抵抗，高胰島素癥，高血糖等繼而引發(fā)糖尿病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，胰島素抵抗是眾多心血管疾病及糖尿病的共同危險(xiǎn)因素，會(huì)引起多種代謝相關(guān)疾病。
UCP2是胰島素分泌的負(fù)調(diào)節(jié)分子。它介導(dǎo)了線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子滲漏，這已被一系列的研究所證明，這些研究的對(duì)象涵蓋了原脂質(zhì)體、線粒體以及完整細(xì)胞(Krauss S，et al.Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.99118-122，2002)。在胰島β細(xì)胞中，UCP2介導(dǎo)的質(zhì)子滲漏使得糖生成的ATP數(shù)量降低，從而負(fù)調(diào)節(jié)胰島素分泌。ob/ob小鼠是肥胖導(dǎo)致的糖尿病動(dòng)物模型，在該小鼠胰島中，UCP2表達(dá)顯著升高。另外，高血糖也能導(dǎo)致胰島內(nèi)UCP2表達(dá)升高。更重要的是，在ob/ob小鼠中敲除UCP2，胰島素分泌的第一相能得到恢復(fù)，并且血清中胰島素含量升高，高血糖癥狀也得到改善(Zhang CY，et.al.Cell 105745-755，2001)。這些結(jié)果充分說明，UCP2在高血糖以及肥胖導(dǎo)致的胰島功能異常中發(fā)揮了重要作用。因此，設(shè)法抑制UCP2在的表達(dá)在制備改善胰島素抵抗的藥物中具有廣闊的前景。
知母為百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides)的干燥根莖，具有滋陰降火，潤(rùn)燥滑腸的功效，臨床為多味治療消渴癥方劑的君藥；中醫(yī)講究“陰陽(yáng)調(diào)和”，認(rèn)為疾病是由于寒熱失調(diào)所引起的，然而這些理論過于虛幻，缺少現(xiàn)代分子生物學(xué)研究支持。因此，我們以知母提取物為研究對(duì)象，充分運(yùn)用分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段證實(shí)了知母可以通過抑制UCP2的表達(dá)從而改善胰島素抵抗的目的，為改善并治療胰島素抵抗提供了新的效果顯著的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的需要解決的問題是利用知母提取物抑制UCP2蛋白的表達(dá)并將知母提取物開發(fā)成改善胰島素抵抗的藥物。
1.本發(fā)明所述知母提取物的制備，知母的主要成分是皂苷、黃酮、雙苯吡酮、木質(zhì)素等。
2.知母水提物通過特異性抑制UCP2蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到治療胰島素抵抗的實(shí)驗(yàn)方法知母水提物給小鼠灌胃2次，間隔8h，用量為90mg/kg；發(fā)現(xiàn)在第2次灌胃后6小時(shí)后處死小鼠，UCP2的信使核糖核酸在腎臟中的表達(dá)量下降了約30％。
3.知母水提取物可以制備成一種改善胰島素抵抗的藥物。
本發(fā)明首次闡明了知母水提取物具有特異性抑制UCP2的效應(yīng)。目前中醫(yī)和現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究還沒有很好的結(jié)合起來，中藥作用的特異性靶位點(diǎn)更是知之甚少。本研究室首次提出UCP2是胰島素分泌的負(fù)調(diào)控因子(Zhang CY，et.al.Cell 105745-755，2001)，在肥胖導(dǎo)致的胰島功能異常中扮演了重要角色。在此基礎(chǔ)上，又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)知母的提取物作用的靶位點(diǎn)就是UCP2，通過特異性抑制UCP2的表達(dá)來提高胰島素分泌，從而達(dá)到改善胰島素抵抗的目的?？芍苽涑梢环N改善胰島素抵抗的藥物。
對(duì)胰島素抵抗的治療目前臨床上多以西藥為主，不僅有副作用，用久了還會(huì)產(chǎn)生“治療失效”；中藥作為我國(guó)的傳統(tǒng)治療藥物，從臨床和實(shí)驗(yàn)研究的角度，均證實(shí)其藥性溫和持久且副作用小(W.L.Li，et al.J Ethnopharmacol，921，2004)，因而知母開發(fā)作為改善胰島素抵抗的藥物具有巨大的應(yīng)用前景，是一種原料價(jià)格低廉、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、副作用小的改善胰島素抵抗的藥物。
四

圖1為給藥2次后用普通PCR(RT-PCR)定性檢測(cè)小鼠腎臟中UCP2信使核糖核酸的表達(dá)情況(從左向右1-5為對(duì)照組，6-10為給藥組)；圖2為給藥2次后用定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)分析小鼠腎臟中UCP2信使核糖核酸表達(dá)的變化的結(jié)果圖。
五具體實(shí)施例方式
材料與來源試劑，Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄酶和Tag酶購(gòu)于大連寶生物工程有限公司。
手術(shù)器械剪刀，彎頭小鑷等購(gòu)自江蘇思來科技有限公司。
其它器材Heidolph DIAX900勻漿器；ABI Prism 7000 Sequence DetectionSystem PCR儀；C57BL/6小鼠購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物中心實(shí)施例1.知母提取物的濃縮方法150g知母加入1L的蒸餾水，加熱至沸騰后，煎煮2h，留取上清，殘?jiān)貜?fù)上述過程一次。兩次上清轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃蒸發(fā)4h后，低溫凍干；于4℃保存。
2.小鼠給藥及組織的分離保存實(shí)驗(yàn)用小鼠為SPF級(jí)的野生型雄性小鼠，品系C57BL/6，8周齡，飼養(yǎng)于南京市鼓樓醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。用灌胃針按90mg/kg藥量灌胃給藥2次，時(shí)間間隔8h；對(duì)照組小鼠用等體積的生理鹽水灌胃。第2次灌胃后6h處死小鼠；取小鼠腎臟組織，生理鹽水漂洗干凈，立即放于凍存管中，于液氮中保存?zhèn)溆谩?br> 3.組織RNA的提取、RT-PCR和real-time PCR取適量組織加1ml Trizol量于Heidolph DIAX900組織勻漿器將組織充分勻漿(3檔90秒)，將勻漿液轉(zhuǎn)入潔凈的1.5ml離心管中，加入200μl氯仿，13200rpm離心10分鐘，小心吸取上清至另一潔凈的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，13200rpm離心10分鐘，棄上清，75％乙醇洗滌沉淀，室溫干燥，20μl DEPC水溶解，紫外分光法檢測(cè)濃度和純度。2μg RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20μl，含2μg RNA，1mMdNTP，RNA酶抑制劑1 U/μl，Oligo(dT)18引物2.5 pmol/μl，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5U/μl，輕輕混勻，42℃1小時(shí)，冰上放置2分鐘，所得cDNA可用于real-timePCR。real-time PCR為20μl反應(yīng)體系，分別含0.5μl(檢測(cè)GAPDH)和1.5μl(檢測(cè)UCP2)cDNA，2mM MgCl2，0.2mM dNTP，各1pmol/μl上、下游引物及相應(yīng)的探針，0.025U/μlTag酶，混勻。PCR反應(yīng)條件95℃5分鐘；95℃30秒，60℃1分鐘(40個(gè)循環(huán))；4℃5分鐘。引物和探針序列如下GAPDH上游引物5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3下游引物5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3
探針序列5’-CCGCCTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3’UCP2上游引物5’-CCAATGTTGCCCGWAATG-3’，下游引物5’-TGAGGTTGGCTTTCAGGAG-3探針序列5’-CTGGTGACCTATGACCTCATCAAAG-3’結(jié)果用ABI Prism 7000 SDS Software分析，見附圖。
從附圖可以看出，給藥組小鼠腎臟中的UCP2的信使核糖核酸的表達(dá)量有顯著的降低，說明該知母提取物可以通過抑制小鼠基因UCP2的表達(dá)從而達(dá)到提高胰島素分泌進(jìn)而改善胰島素抵抗的效果。
權(quán)利要求
1.一種知母提取物，其特征是從中藥知母中提取，其主要成分是皂苷、黃酮、雙苯吡酮、木質(zhì)素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述知母提取物的提取方法，其特征是150g知母加入1L的蒸餾水，加熱至沸騰后，煎煮2h，留取上清，殘?jiān)貜?fù)上述過程一次。兩次上清轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃蒸發(fā)4h后，低溫凍干；于4℃保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的知母提取物在制備改善胰島素抵抗藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的知母水提物特異性抑制UCP2蛋白的表達(dá)，其特征是知母提取物給小鼠灌胃2次，間隔8h，用量為90mg/kg；在第2次灌胃后6小時(shí)后處死小鼠，UCP2的信使核糖核酸在腎臟中的表達(dá)量下降30％。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，包括用知母水提物給小鼠灌胃的方法，發(fā)現(xiàn)能夠通過特異性抑制解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)的表達(dá)，從而治療胰島素抵抗。本發(fā)明將知母經(jīng)過水煎煮，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮以及減壓凍干，得到晶體狀濃縮提取物。用該提取物配置成一定濃度的水溶液給小鼠灌胃，發(fā)現(xiàn)能夠顯著的抑制小鼠腎臟中UCP2的表達(dá)。本發(fā)明闡明了知母水提物能夠特異抑制UCP2蛋白在腎臟中的表達(dá)，可開發(fā)為改善和治療胰島素抵抗的藥物。
文檔編號(hào)A61K125/00GK1943705SQ20061009725
公開日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2006年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月26日
發(fā)明者姜曉宏, 張辰宇, 項(xiàng)陽(yáng), 孫凌冰, 張紅杰, 孫國(guó)勛, 鄒季虹, 徐琛 申請(qǐng)人:南京大學(xué)