專利名稱：參芪扶正注射液的質量控制方法
技術領域：
本發(fā)明涉及參芪扶正注射液的質量控制方法，特別是涉及參芪扶正注射液的指紋圖譜控制方法。
背景技術：
黨參(Radix Codonopsis)藥性平和，用途廣，具有多方面的藥理活性，不僅對消化、心血管系統(tǒng)有作用，而且還能調節(jié)免疫系統(tǒng)功能，增強機體的抵抗力，毒性甚微。黃芪(Radix Astragalus)是補氣主藥，能明顯增加巨噬細胞的吞噬功能，與黨參合用，能使巨噬細胞吞噬有害物質的作用增強。參芪扶正注射液是由黨參、黃芪經(jīng)提取制成的純中藥制劑，以益氣扶正為主。黨參和黃芪兩種藥物的性味及歸經(jīng)一致，功效基本相同，兩者相加，起到君臣相佐、相使的協(xié)同作用，明顯增強了臨床療效。但是，目前還沒有參芪扶正注射液指紋圖譜的控制方法，難于保證產品的穩(wěn)定性和臨床使用安全性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種高效、靈敏的參芪扶正注射液的質量控制方法。
本發(fā)明所提供的參芪扶正注射液的質量控制方法，包括如下步驟1)參芪扶正注射液樣品的測試溶液制備將參芪扶正注射液樣品濃縮后通過大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用一定濃度的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液濃縮至干，殘渣加水或一定濃度的乙醇溶解，得參芪扶正注射液樣品的測試溶液；2)對照品溶液的制備將毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品溶于甲醇，作為酚酸類指紋圖譜的對照品溶液；將黃芪甲苷對照品溶于甲醇，作為皂苷類指紋圖譜的對照品溶液。
3)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙睛-水為流動相，梯度洗脫；以紫外檢測器分別檢測200-215nm和250-280nm下的酚酸類指紋圖譜；以蒸發(fā)光散射檢測器檢測皂苷類指紋圖譜；4)高效液相色譜檢測取參芪扶正注射液樣品的測試溶液和對照品溶液，注入高效液相色譜儀，進行高效液相色譜檢測，得到參芪扶正注射液樣品的指紋圖譜三張酚酸類指紋圖譜兩張和皂苷類指紋圖譜一張；5)比對將所得參芪扶正注射液樣品的指紋圖譜分別與參芪扶正注射液的對照指紋圖譜進行比對，相似度大于0.9的參芪扶正注射液樣品是合格產品；①200-215nm下的酚酸類指紋圖譜共有8個色譜峰，以毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的色譜峰的保留時間和峰面積為1計算其他峰的相對保留時間和相對峰面積，1號峰相對保留時間為0.20-0.30，相對峰面積為1.60-3.50；2號峰相對保留時間為0.25-0.33，相對峰面積為0.70-1.50；3號峰相對保留時間為0.40-0.50，相對峰面積為1.20-2.90；S號峰相對保留時間為1，相對峰面積為1；4號峰相對保留時間為0.90-1.20，相對峰面積為0.22-0.40；5號峰相對保留時間為1.20-1.40，相對峰面積為0.22-0.40；6號峰相對保留時間為1.38-1.46，相對峰面積為0.90-1.50；7號峰相對保留時間為1.42-1.53，相對峰面積為0.23-0.42；②250-280nm下的酚酸類指紋圖譜共有6個色譜峰，以毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的色譜峰的保留時間和峰面積為1計算其他峰的相對保留時間和相對峰面積，1號峰相對保留時間為0.15-0.28，相對峰面積為0.80-1.80；2號峰相對保留時間為0.25-0.33，相對峰面積為1.25-2.50；3號峰相對保留時間為0.25-0.33，相對峰面積為0.80-1.70；S號峰相對保留時間為1，相對峰面積為1；4號峰相對保留時間為0.33-0.40，相對峰面積為0.50-1.30；5號峰相對保留時間為0.40-0.50，相對峰面積為1.20-2.50；S號峰相對保留時間為1，相對峰面積為1；③皂苷類指紋圖譜共有9個色譜峰，以黃芪甲苷的色譜峰的保留時間和峰面積為1計算其他峰的相對保留時間和相對峰面積，1號峰相對保留時間為0.51-0.58，相對峰面積為0.70-1.20；2號峰相對保留時間為0.74-0.82，相對峰面積為0.45-1.20；3號峰相對保留時間為0.78-0.85，相對峰面積為0.15-0.23；4號峰相對保留時間為0.88-0.93，相對峰面積為0.17-0.25；5號峰相對保留時間為0.90-1.00，相對峰面積為0.09-0.17；S號峰相對保留時間為1，相對峰面積為1；6號峰相對保留時間為0.95-1.10，相對峰面積為0.30-0.40；7號峰相對保留時間為0.98-1.10，相對峰面積為0.60-0.80；8號峰相對保留時間為0.10-1.15，相對峰面積為0.60-1.0。
其中，酚酸類指紋圖譜的測試溶液制備過程優(yōu)選為精密量取參芪扶正注射液樣品25ml，置水浴中濃縮至約5ml，緩緩通過AB-8大孔吸附樹脂柱(柱內徑為1.5cm，柱長為20cm)，用水70ml洗脫，棄去水洗脫液，續(xù)用70％乙醇80ml洗脫，收集70％乙醇洗脫液，置水浴中濃縮至干，殘渣加水溶解并轉移至10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。
皂苷類指紋圖譜的測試溶液制備過程優(yōu)選為精密量取參芪扶正注射液樣品200ml，置水浴中濃縮至約10ml，緩緩通過AB-8大孔吸附樹脂柱(柱內徑為1.5cm，柱長為20cm)，用水80ml洗脫，棄去水洗脫液；續(xù)用20％乙醇80ml洗脫，棄去20％乙醇洗脫液；再用80％乙醇100ml洗脫，收集80％乙醇洗脫液，置水浴中濃縮至干，殘渣加80％乙醇溶解并轉移至5ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。
步驟2)所述對照品溶液的制備過程優(yōu)選為取毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品適量，加甲醇制成每1ml溶液中含0.06mg的溶液，作為酚酸類指紋圖譜的對照品溶液；取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1ml溶液中含0.1mg的溶液，作為皂苷類指紋圖譜的對照品溶液。
步驟3)色譜條件優(yōu)選為色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，型號為Discovery C18，250×4.6mm，5μm，理論塔板數(shù)在酚酸類指紋圖譜中按毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷計不低于3000，在皂苷類指紋圖譜中按黃芪甲苷計不低于4000。柱溫30℃；酚酸類指紋圖譜用紫外檢測器檢測，檢測波長為208nm、266nm；皂苷類指紋圖譜用蒸發(fā)光散射檢測器檢測，以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；

步驟4)高效液相色譜檢測過程優(yōu)選為精密吸取對照品溶液和參芪扶正注射液樣品的測試溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，記錄時間為70分鐘。
本發(fā)明的原理是建立起參芪扶正注射液的HPLC指紋圖譜，對參芪扶正注射液中的酚酸類成分和皂苷類成分用多張指紋圖譜分別檢測，從各個色譜圖的整體面貌特征上把握參芪扶正注射液質量情況，避免了因只測定一、二個化學成分而評價參芪扶正注射液整體質量的片面性，減少了為質量達標而人為處理的可能性。本發(fā)明具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握等特點，同時可用本方法區(qū)分與參芪扶正注射液在外觀色澤十相似的中藥注射劑，以防假冒，應用前景廣闊。


圖1～圖3分別為參芪扶正注射液的標準指紋圖譜(分別為266nm、208nm的酚酸類指紋圖譜和皂苷類指紋圖譜)；圖4為酚酸類指紋圖譜(208nm)S峰的確定；圖5為酚酸類指紋圖譜(266nm)S峰的確定；圖6為皂苷類指紋圖譜S峰的確定；圖7A-圖7C分別為黃芪注射液指紋圖譜(分別為266nm、208nm的酚酸類指紋圖譜和皂苷類指紋圖譜)；圖8A-圖8C分別為丹參滴注液指紋圖譜(分別為266nm、208nm的酚酸類指紋圖譜和皂苷類指紋圖譜)；圖9A-圖9C分別為參芪扶正注射液指紋圖譜(分別為266nm、208nm的酚酸類指紋圖譜和皂苷類指紋圖譜)。
具體實施例方式
實施例1、參芪扶正注射液的標準指紋圖譜的建立1、標準測試溶液的制備①酚酸類指紋圖譜的測試樣品精密量取參芪扶正注射液樣品25ml，置水浴中濃縮至約5ml，緩緩通過AB-8大孔吸附樹脂柱(柱內徑為1.5cm，柱長為20cm)，用水70ml洗脫，棄去水洗脫液，續(xù)用70％乙醇80ml洗脫，收集70％乙醇洗脫液，置水浴中濃縮至干，殘渣加水溶解并轉移至10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。
②皂苷類指紋圖譜的測試樣品精密量取參芪扶正注射液樣品200ml，置水浴中濃縮至約10ml，緩緩通過AB-8大孔吸附樹脂柱(柱內徑為1.5cm，柱長為20cm)，用水80ml洗脫，棄去水洗脫液；續(xù)用20％乙醇80ml洗脫，棄去20％乙醇洗脫液；再用80％乙醇100ml洗脫，收集80％乙醇洗脫液，置水浴中濃縮至干，殘渣加80％乙醇溶解并轉移至5ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。
2、對照品溶液的制備取毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品適量，加甲醇制成每1ml溶液中含0.06mg的溶液，作為酚酸類指紋圖譜的對照品溶液；取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1ml溶液中含0.1mg的溶液，作為皂苷類指紋圖譜的對照品溶液；3、色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，型號為Discovery C18，250×4.6mm，5μm，以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表1的梯度進行梯度洗脫；柱溫30℃；酚酸類指紋圖譜用紫外檢測器檢測，檢測波長為208nm、266nm；皂苷類指紋圖譜用蒸發(fā)光散射檢測器檢測。理論塔板數(shù)在酚酸類指紋圖譜中按毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷計不低于3000，在皂苷類指紋圖譜中按黃芪甲苷計不低于4000。
表1 洗脫梯度表

4、測定精密吸取標準測試溶液和對照品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀中，記錄70分鐘的色譜圖，即得，并計算相似度。
5、確定共有峰
①酚酸類指紋圖譜(208nm)共有峰的確定建立酚酸類指紋圖譜(208nm)，是對酚酸類指紋圖譜(266nm)的輔助檢測，可檢測到在266nm波長處檢測不到的成分，主要集中在35～50min內，故將這段內較穩(wěn)定的4，5，6，7色譜峰均列入共有峰內，另選擇峰面積較大的色譜峰也列為共有峰。對比毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品溶液的色譜圖，選擇S峰，見圖4。
選擇20批參芪扶正注射液(麗珠集團利民制藥廠提供)模擬出參照譜圖。
在相似度軟件里，對共有峰進行匹配后，計算相似度結果如下

綜上所述，參芪扶正注射液的酚酸類指紋圖譜(208nm)如圖2所示。
②酚酸類指紋圖譜(266nm)共有峰的確定所選擇的共有峰峰面積較大，較為穩(wěn)定，其余峰峰面積小，受基線干擾大，重現(xiàn)性不佳，故在相似度計算時不對其進行校正，不列為共有峰。對比毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品溶液的色譜圖，選擇S峰，見圖5。
在相似度軟件里，對共有峰進行匹配后，計算相似度結果如下

綜上所述，參芪扶正注射液的酚酸類指紋圖譜(266nm)如圖1所示。
③皂苷類指紋圖譜共有峰的確定在圖譜上，35～45min內的色譜峰多且不穩(wěn)定，45～70min內的色譜峰為皂苷類成份，故主要選擇這一段內的色譜峰為共有峰。對比黃芪甲苷對照品溶液的色譜圖，選擇S峰，見圖6。
在相似度軟件里，對共有峰進行匹配后，計算相似度結果如下

綜上所述，參芪扶正注射液的皂苷類指紋圖譜如圖3所示。
6、指紋圖譜的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性實驗①酚酸類指紋圖譜(208nm)取參芪注射液050815，進行了穩(wěn)定性，精密度，重現(xiàn)性的方法學試驗。對其相似度計算結果如下表2，表3，表4。
表2穩(wěn)定性試驗相似度計算結果表

表3精密度試驗相似度計算結果表

表4重現(xiàn)性試驗相似度計算結果表

結果顯示本方法穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性良好。
②酚酸類指紋圖譜(266nm)取參芪注射液050815，進行了穩(wěn)定性，精密度，重現(xiàn)性的方法學試驗。對其相似度計算結果如下表5，表6，表7。
表5穩(wěn)定性試驗相似度計算結果表

表6精密度試驗相似度計算結果表

表7重現(xiàn)性試驗相似度計算結果表

結果顯示本方法穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性良好。
③皂苷類指紋圖譜
取參芪注射液050815，進行了穩(wěn)定性，精密度，重現(xiàn)性的方法學試驗。對其相似度計算結果如下表8，表9，表10。
表8穩(wěn)定性試驗相似度計算結果表

表9精密度試驗相似度計算結果表

表10重現(xiàn)性試驗相似度計算結果表

結果顯示本方法穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性良好。
實施例2、本方法應用于參芪扶正注射液的質量控制選取市售的黃芪注射液，丹參滴注液，參芪扶正注射液，按照實施例1的方法測定其指紋圖譜，與標準指紋圖譜進行比較，相似度大于0.9的為參芪扶正注射液，其余的均低于0.9，可用于判別參芪扶正注射液的真?zhèn)巍?br> 黃芪注射液208nm、266納米的酚酸類指紋圖譜以及皂苷類指紋圖譜分別如圖7A-圖7C，其相似度分別為0.409、0.315、0.611。
丹參滴注液208nm、266納米的酚酸類指紋圖譜以及皂苷類指紋圖譜分別如圖8A-圖8C，其相似度分別為0.292、0.257、0.000。
參芪扶正注射液208nm、266納米的酚酸類指紋圖譜以及皂苷類指紋圖譜分別如圖9A-圖9C，其相似度分別為0.983、0.985、0.981。
對市售的多批參芪扶正注射液按照實施例1的方法測定其指紋圖譜，與標準指紋圖譜進行比較，相似度均大于0.9，證實未發(fā)現(xiàn)劣質產品。
權利要求
1.一種參芪扶正注射液的質量控制方法，包括如下步驟1)參芪扶正注射液樣品的測試溶液制備將參芪扶正注射液樣品濃縮后通過大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液濃縮至干，殘渣加水或乙醇溶解，得參芪扶正注射液樣品的測試溶液；2)對照品溶液的制備將毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品溶于甲醇，作為酚酸類指紋圖譜的對照品溶液；將黃芪甲苷對照品溶于甲醇，作為皂苷類指紋圖譜的對照品溶液；3)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙睛-水為流動相，梯度洗脫；以紫外檢測器分別檢測200-215nm和250-280nm下的酚酸類指紋圖譜；以蒸發(fā)光散射檢測器檢測皂苷類指紋圖譜。4)高效液相色譜檢測取參芪扶正注射液樣品的測試溶液和對照品溶液，注入高效液相色譜儀，進行高效液相色譜檢測，得到參芪扶正注射液樣品的指紋圖譜；5)比對將所得參芪扶正注射液樣品的指紋圖譜與參芪扶正注射液的對照指紋圖譜進行比對，相似度大于0.9的參芪扶正注射液樣品是合格產品；①200-215nm下的酚酸類指紋圖譜共有8個色譜峰，以毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的色譜峰的保留時間和峰面積為1計算其他峰的相對保留時間和相對峰面積，1號峰相對保留時間為0.20-0.30，相對峰面積為1.60-3.50；2號峰相對保留時間為0.25-0.33，相對峰面積為0.70-1.50；3號峰相對保留時間為0.40-0.50，相對峰面積為1.20-2.90；S號峰相對保留時間為1，相對峰面積為1；4號峰相對保留時間為0.90-1.20，相對峰面積為0.22-0.40；5號峰相對保留時間為1.20-1.40，相對峰面積為0.22-0.40；6號峰相對保留時間為1.38-1.46，相對峰面積為0.90-1.50；7號峰相對保留時間為1.42-1.53，相對峰面積為0.23-0.42；②250-280nm下的酚酸類指紋圖譜共有6個色譜峰，以毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的色譜峰的保留時間和峰面積為1計算其他峰的相對保留時間和相對峰面積，1號峰相對保留時間為0.15-0.28，相對峰面積為0.80-1.80；2號峰相對保留時間為0.25-0.33，相對峰面積為1.25-2.50；3號峰相對保留時間為0.25-0.33，相對峰面積為0.80-1.70；S號峰相對保留時間為1，相對峰面積為1；4號峰相對保留時間為0.33-0.40，相對峰面積為0.50-1.30；5號峰相對保留時間為0.40-0.50，相對峰面積為1.20-2.50；S號峰相對保留時間為1，相對峰面積為1；③皂苷類指紋圖譜共有9個色譜峰，以黃芪甲苷的色譜峰的保留時間和峰面積為1計算其他峰的相對保留時間和相對峰面積，1號峰相對保留時間為0.51-0.58，相對峰面積為0.70-1.20；2號峰相對保留時間為0.74-0.82，相對峰面積為0.45-1.20；3號峰相對保留時間為0.78-0.85，相對峰面積為0.15-0.23；4號峰相對保留時間為0.88-0.93，相對峰面積為0.17-0.25；5號峰相對保留時間為0.90-1.00，相對峰面積為0.09-0.17；S號峰相對保留時間為1，相對峰面積為1；6號峰相對保留時間為0.95-1.10，相對峰面積為0.30-0.40；7號峰相對保留時間為0.98-1.10，相對峰面積為0.60-0.80；8號峰相對保留時間為0.10-1.15，相對峰面積為0.60-1.0。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于酚酸類指紋圖譜的測試溶液制備過程為精密量取參芪扶正注射液樣品25ml，置水浴中濃縮至5ml，緩緩通過AB-8大孔吸附樹脂柱，柱內徑為1.5cm，柱長為20cm；先用水70ml洗脫，棄去水洗脫液，續(xù)用70％乙醇80ml洗脫，收集70％乙醇洗脫液，置水浴中濃縮至干，殘渣加水溶解并轉移至10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于皂苷類指紋圖譜的測試溶液制備過程為精密量取參芪扶正注射液樣品200ml，置水浴中濃縮至10ml，緩緩通過AB-8大孔吸附樹脂柱，柱內徑為1.5cm，柱長為20cm；先用水80ml洗脫，棄去水洗脫液；續(xù)用20％乙醇80ml洗脫，棄去20％乙醇洗脫液；再用80％乙醇100ml洗脫，收集80％乙醇洗脫液，置水浴中濃縮至于，殘渣加80％乙醇溶解并轉移至5ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。
4.根據(jù)權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于對照品溶液的制備過程為取毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品適量，加甲醇制成每1ml溶液中含0.06mg的溶液，作為酚酸類指紋圖譜的對照品溶液；取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1ml溶液中含0.1mg的溶液，作為皂苷類指紋圖譜的對照品溶液；
5.根據(jù)權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于步驟3)色譜條件為色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，型號為Discovery C18，250×4.6mm，5μm，理論塔板數(shù)在酚酸類指紋圖譜中按毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷計不低于3000，在皂苷類指紋圖譜中按黃芪甲苷計不低于4000；柱溫30℃；酚酸類指紋圖譜用紫外檢測器檢測，檢測波長為208nm、266nm；皂苷類指紋圖譜用蒸發(fā)光散射檢測器檢測；以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫，梯度洗脫的洗脫梯度如下時間(分鐘)乙腈(％) 水(％)0～8 2→5 98→958～18 5→1295→8818～4012→25 88→7540～5025→32.5 75→67.550～6532.5→55 67.5→4565～7055→95 45→570～7595 575～7895→25→9878～83298
6.根據(jù)權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于步驟4)高效液相色譜檢測過程為精密吸取對照品溶液和參芪扶正注射液樣品的測試溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，記錄時間為70分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了參芪扶正注射液的質量控制方法。本發(fā)明方法包括如下步驟1)參芪扶正注射液樣品的測試溶液制備；2)對照品溶液的制備；3)選擇色譜條件；4)高效液相色譜檢測，得到參芪扶正注射液樣品的指紋圖譜；5)比對將所得參芪扶正注射液樣品的指紋圖譜與標準指紋圖譜進行比對，相似度大于0.9的參芪扶正注射液樣品是合格產品。本發(fā)明的原理是建立起參芪扶正注射液的HPLC指紋圖譜，從色譜的整體面貌特征上把握參芪扶正注射液質量情況，避免了因只測定一、二個化學成分而評價參芪扶正注射液整體質量的片面性，減少了為質量達標而人為處理的可能性。本發(fā)明具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握等特點，同時可用本方法區(qū)分與參芪扶正注射液在外觀色澤十相似的中藥注射劑，以防假冒，應用前景廣闊。
文檔編號A61P37/04GK1899362SQ20061009895
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月19日 優(yōu)先權日2006年7月19日
發(fā)明者劉學華, 屠芳芳, 陶德萍 申請人:麗珠集團利民制藥廠