專(zhuān)利名稱(chēng)：用單糖和二糖類(lèi)化合物預(yù)防和治療傳染病和其他疾病的方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2001年5月18日，申請(qǐng)?zhí)枮?1811488.1，發(fā)明名稱(chēng)同上的專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
天然免疫系統(tǒng)通過(guò)一個(gè)系統(tǒng)協(xié)調(diào)對(duì)病原體的炎性反應(yīng)，此系統(tǒng)通過(guò)識(shí)別僅由微生物合成的分子種類(lèi)的受體區(qū)分自身(病原體)和非自身(病原體)。這些種類(lèi)有時(shí)被稱(chēng)為病原體相關(guān)的分子模式(PAMPs)并包括例如，脂多糖(LPS)、肽葡聚糖、脂磷壁酸質(zhì)和細(xì)菌脂蛋白(BLPs)。
LPS是一種被天然免疫系統(tǒng)識(shí)別的來(lái)源于革蘭氏陰性細(xì)菌的豐富的細(xì)胞壁外組分。雖然已經(jīng)知道LPS的化學(xué)結(jié)構(gòu)有一段時(shí)間，但是僅在最近開(kāi)始闡明了血清蛋白質(zhì)和/或細(xì)胞識(shí)別LPS的分子基礎(chǔ)。在最近的一系列報(bào)告中，已將受體家族，被稱(chēng)為T(mén)oll樣受體(TLRs)，與對(duì)LPS和其他微生物成分的有效的天然免疫應(yīng)答相聯(lián)系。所有TLR家族的成員都是有單一跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域約200個(gè)氨基酸，并類(lèi)似地與IL-1受體的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域分享。蛋白質(zhì)Toll家族的胞外域相對(duì)較大(約550-980個(gè)氨基酸)并可以含有多個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)。
對(duì)于至少兩種Toll樣受體，Tlr2和Tlr4，已明確證實(shí)了TLR在對(duì)LPS的免疫應(yīng)答中的重要性。例如，用胚胎腎細(xì)胞進(jìn)行的轉(zhuǎn)染研究顯示人的Tlr2足以使LPS產(chǎn)生響應(yīng)能力(Yang等，自然(Nature)395284-288(1998)；Kirschning等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J Exp Med.)112091-97(1998))。LPS產(chǎn)生的強(qiáng)烈的反應(yīng)看來(lái)需要LPS-結(jié)合蛋白(LBP)和CD14二者，它以高親合力與LPS結(jié)合。觀察到了LPS與Tlr2以較低親合力的直接結(jié)合，提示輔助蛋白質(zhì)可能在體內(nèi)通過(guò)LPS促進(jìn)Tlr2的結(jié)合和/或活化。
利用在lps突變小鼠品系中進(jìn)行的定位克隆證明了Tlr4在對(duì)LPS的免疫應(yīng)答中的重要性。已識(shí)別了小鼠lps基因的兩個(gè)突變等位基因，出現(xiàn)在C3H/HeJ品系中的半顯性等位基因和出現(xiàn)在C57BL/10ScN和C57BL/10ScCr品系中的第二隱性等位基因。對(duì)lps的突變等位基因純合的小鼠對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌引起的感染敏感，并能抵抗LPS-誘導(dǎo)的膿毒性休克。克隆這些品系的lps基因座，證明在兩個(gè)例子中突變均改變小鼠Tlr4基因(Portorak等，科學(xué)(Science)2822085-2088(1998)；Qureshi等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志4615-625(1999))。從這些報(bào)告得出結(jié)論Tlr4對(duì)于對(duì)LPS的應(yīng)答是必需的。
LPS的生物活性內(nèi)毒素的亞結(jié)構(gòu)部分是脂質(zhì)A，磷?；亩嘀刂舅狨；咸前范?，用以將整個(gè)結(jié)構(gòu)固定在革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜上。我們以前報(bào)道了可以通過(guò)脂質(zhì)A的選擇性化學(xué)修飾生成一磷酰基脂質(zhì)A化合物而改善脂質(zhì)A的毒性作用(MPL免疫刺激劑；CorixaCorporation；Seattle，WA)。在疫苗佐劑和其他應(yīng)用中制備和使用MPL免疫刺激劑和結(jié)構(gòu)類(lèi)似化合物的方法已有記載(見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094；4,987,237；Johnson等，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志(J Med Chem)424640-4649(1999)；Ulrich和Myers，疫苗設(shè)計(jì)亞單位和佐劑探討(Vaccine DesignThe Subunit and Adjuvant Approach)；Powell和Newman，編輯；Plenum紐約，495-524，1995；將這些文獻(xiàn)公開(kāi)的內(nèi)容全部引入文本作為參考)。特別地，這些和其他參考資料證明在疫苗制劑中與蛋白質(zhì)和糖類(lèi)抗原共同使用以促進(jìn)體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)于抗原的免疫時(shí)，MPL免疫刺激劑和相關(guān)化合物具有顯著的佐劑活性。
另外，我們以前描述了一磷?；|(zhì)A的一類(lèi)合成的單糖和二糖模擬物，稱(chēng)為氨烷基氨基葡糖苷磷酸脂(AGPs)，例如在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/853,826、09/074,720、09/439,839和在PCT/US 98/09385中，將這些申請(qǐng)公開(kāi)的內(nèi)容全部引入本文作為參考。如同一磷酰基脂質(zhì)A，已證明當(dāng)與抗原配制在疫苗組合物中時(shí)，這些化合物保留顯著的佐劑特性，另外，當(dāng)與一磷?；|(zhì)A比較時(shí)，有相似或改良的毒性全貌。AGPs所提供的顯著的優(yōu)勢(shì)是它們能通過(guò)合成手段容易地以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。
雖然原來(lái)已記載了一磷?；|(zhì)A和AGPs在疫苗制劑中與抗原結(jié)合使用，但以前并沒(méi)有報(bào)道過(guò)在沒(méi)有抗原時(shí)，它們作為單一治療劑在預(yù)防和/或治療植物和動(dòng)物疾病-例如傳染病、自身免疫性疾病和變應(yīng)性疾病中的用途。
本發(fā)明作為對(duì)成為一磷?；|(zhì)A和AGP化合物活性基礎(chǔ)的某些機(jī)制的理解加深的結(jié)果，使本文記載的新的治療機(jī)會(huì)成為可能。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)施用有效量的具有下式的化合物及其藥物可接受的鹽治療、改善或基本上預(yù)防動(dòng)物疾病的方法 其中X是-O-或-NH-；R1和R2各自獨(dú)立地是(C2-C24)?；?，包括飽和、不飽和及分支的?；?；R3是-H或-PO3R11R12，其中R11和R12各自獨(dú)立地是-H或(C1-C4)烷基；R4是-H、-CH3或-PO3R13R14，其中R13和R14各自獨(dú)立地選自-H和(C1-C4)烷基；Y是選自下式的基團(tuán)
其中下標(biāo)n、m、p和q各自獨(dú)立地是從0至6的整數(shù)；R5是(C2-C24)?；?如上所述，包括飽和、不飽和和分支的?；?；R6和R7獨(dú)立地選自H和CH3；R8和R9獨(dú)立地選自H、OH、(C1-C4)烷氧基、-PO3H2、-OPO3H2、-SO3H、-OSO3H、-NR15R16、-SR15、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R15、-CONR15R16、-PO3R15R16、-OPO3R15R16、-SO3R15和-OSO3R15，其中R15和R16各自獨(dú)立地選自H和(C1-C4)烷基；R10選自H、CH3、-PO3H2、ω-膦?；醮?C2-C24)烷基和ω-羧基(C1-C24)烷基；Z是-O-或-S-；限制條件為當(dāng)R3是-PO3R11R12時(shí)，R4不是-PO3R13R14。
在本發(fā)明的某些說(shuō)明性方面，在治療、改善或基本上預(yù)防傳染病、自身免疫性疾病和變應(yīng)性疾病中使用上述方法。
在其他方面，本發(fā)明提供了在適宜的賦形劑中含有一或多種上述化合物的藥物組合物，在沒(méi)有外源性抗原的情況下配制和/或給藥。
對(duì)附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1是描述小鼠在一磷?；|(zhì)A(MPL)給藥后或給藥同時(shí)對(duì)抗致命性流感攻擊的非特異性保護(hù)的曲線圖。
圖2是描述L-絲氨?；被榛被咸擒樟姿嶂?AGPs)對(duì)小鼠鼻內(nèi)給藥后臨床癥狀的曲線圖。
圖3是描述L-絲氨?；被榛被咸擒樟姿嶂?AGPs)單獨(dú)治療和流感冒攻擊后的臨床癥狀的曲線圖。
圖4-6是描述RC522對(duì)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用，與在全血的過(guò)夜培養(yǎng)物中MPL對(duì)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用相比較的曲線圖，全血的過(guò)夜培養(yǎng)物來(lái)源于3個(gè)人的供體(分別為供體A-C)。
圖7是描述RC522對(duì)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用與來(lái)源于供體A的全血的短時(shí)間培養(yǎng)物中的MPL對(duì)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用比較的曲線圖。
圖8是描述RC522對(duì)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用與小鼠(Balb/c和C3H/HEJ)的脾細(xì)胞培養(yǎng)物中的MPL對(duì)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用比較的曲線圖。
圖9是描述RC529和RC552對(duì)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用與人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的MPL對(duì)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用比較的曲線圖。
對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明性實(shí)施方案的描述說(shuō)明性的預(yù)防和治療性應(yīng)用本發(fā)明廣泛涉及通過(guò)施用有效量的本文所述的一或多種單糖和二糖化合物或含有一或多種此化合物的藥物組合物治療某些疾病和其他內(nèi)科病癥的預(yù)防和治療方法。雖然已記載某些單糖和二糖化合物在疫苗制劑中作為佐劑與外源性給藥的抗原聯(lián)用，和用于某些其他應(yīng)用，但是本發(fā)明提供了優(yōu)選在單一治療應(yīng)用中-即在沒(méi)有外源性給藥的抗原的情況下-采用此化合物的新的治療方法。
因此，本發(fā)明一方面提供了治療、改善和/或基本上預(yù)防真核生物-特別是動(dòng)物，優(yōu)選人-傳染病的方法。TLR-介導(dǎo)的信號(hào)傳輸在對(duì)微生物進(jìn)攻的天然免疫應(yīng)答中的重要性是已知的，選擇性地并以最小毒性刺激這些途徑的能力代表用于對(duì)抗廣泛范圍的傳染因子的預(yù)防和/或治療用藥程式的一種有力的方法。
本文描述的方法適用于對(duì)抗基本上任何種類(lèi)的傳染因子，包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)和真菌。示例性地，本發(fā)明對(duì)于預(yù)防和/或治療假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、變形桿菌屬(Proteus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、念珠菌屬(Candida)、葡萄球菌屬(Staphylococci)、鏈球菌屬(Streptococci)、衣原體屬(Chlamydia)、支原體屬(Mycoplasma)和許多其他種屬的菌種引起的細(xì)菌感染是有效的?？梢园凑毡景l(fā)明治療的示例性的病毒性疾病包括由流感病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸合胞體病毒(RSVs)、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、肝炎病毒，例如乙型肝炎和丙型肝炎病毒，及其他病毒引起的疾病。示例性的真菌包括，例如，曲霉菌(Aspergillis)、白色念珠菌(Candida albicans)、新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)、粗球胞菌(Coccidioides immitus)及其他。
在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)已發(fā)生感染或具有發(fā)生感染的危險(xiǎn)-例如醫(yī)源性(nosocomial)細(xì)菌和病毒感染-的接受治療者，特別是無(wú)免疫應(yīng)答的接受治療者進(jìn)行治療的方法。每年住院的4千萬(wàn)個(gè)體中約有2百萬(wàn)在逗留期間發(fā)生了醫(yī)源性感染，他們中的約1％，或約400,000患者發(fā)生了醫(yī)源性肺炎，其中超過(guò)7000人死亡。這使醫(yī)源性肺炎成為導(dǎo)致在醫(yī)院發(fā)生的感染中死亡的主要原因。因此，本實(shí)施方案滿足了在治療醫(yī)源性感染中對(duì)于有效預(yù)防方法的重大需求。
在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防性治療無(wú)免疫應(yīng)答患者的方法，例如HIV-陽(yáng)性患者，他們由于偶然的感染或已受到抑制的或潛伏的感染的重激活而發(fā)生肺炎或有發(fā)生肺炎的危險(xiǎn)。在1992年，僅美國(guó)就報(bào)道了約20,000例艾滋病患者中的卡氏肺囊蟲(chóng)(Pneumocystiscarinii)感染。另外，全部艾滋病患者中的60-70％在其生病的某些時(shí)候感染了卡氏肺囊蟲(chóng)。因此，本發(fā)明在此實(shí)施方案中為此高危群體提供了有效的預(yù)防方法。
在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于治療其他可能是無(wú)免疫應(yīng)答的和/或存在發(fā)生傳染病的危險(xiǎn)的患者群體，例如，包括膽囊纖維化、慢性阻塞性肺病和其他無(wú)免疫應(yīng)答和/或被收容入院的患者。
為支持本發(fā)明的這些和其他實(shí)施方案，我們已證實(shí)在受到攻擊前將本發(fā)明的示例性化合物對(duì)無(wú)免疫應(yīng)答的小鼠給藥，能提供對(duì)抗卡氏肺囊蟲(chóng)感染的顯著的預(yù)防性保護(hù)作用(見(jiàn)實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一方面，在治療、改善或基本上預(yù)防變應(yīng)性疾病和病癥，例如竇炎、慢性鼻竇炎、哮喘、異位性皮炎和牛皮癬的方法中使用本文記載的單糖和二糖化合物。此方法至少部分基于單糖和二糖化合物激活靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力，此細(xì)胞因子能與定型化變應(yīng)性類(lèi)型細(xì)胞因子的應(yīng)答競(jìng)爭(zhēng)，此應(yīng)答以IL-4的產(chǎn)生或?qū)L-4活性的超強(qiáng)響應(yīng)能力為特征。施用本文記載的某些單糖和二糖化合物導(dǎo)致IFN-γ和IL-12從抗原加工和呈遞細(xì)胞及其他細(xì)胞中表達(dá)，導(dǎo)致與變應(yīng)性應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞因子，例如IL-4，5，6，10和13的減量調(diào)節(jié)。
在本發(fā)明的另一方面，在治療自身免疫性疾病和病癥的方法中采用單糖和二糖化合物。用于此實(shí)施方案中的單糖和二糖化合物將典型地選自能拮抗、抑制或負(fù)調(diào)制一或多個(gè)Toll樣受體，特別是Tlr2和/或Tlr4，以致與特定的病癥相關(guān)的自身免疫應(yīng)答得到改善或基本上被阻止的化合物。示例性地，在治療疾病-例如腸炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥和牛皮癬中可以用本實(shí)施方案提供的方法。
不希望被理論所束縛，認(rèn)為上述預(yù)防和治療性應(yīng)用的功效至少部分基于單糖和二糖化合物參與調(diào)節(jié)Toll樣受體的活性。特別地，認(rèn)為T(mén)oll樣受體Tlr2、Tlr4和其他將被特異性地活化、競(jìng)爭(zhēng)性地抑制或受到本文公開(kāi)的無(wú)毒的LPS衍生物和模擬物的影響。因此，本發(fā)明的方法提供了調(diào)節(jié)動(dòng)物天然免疫應(yīng)答途徑的有效的和選擇性的方法，而不引起通常與正常刺激這些途徑的天然細(xì)菌組分相關(guān)的毒性。
說(shuō)明性的單糖和二糖化合物在上述預(yù)防和治療性應(yīng)用中采用的說(shuō)明性的單糖或二糖化合物包含具有下式的化合物
和其藥物可接受的鹽，其中X是-O-或-NH-，R1和R2各自獨(dú)立地是(C2-C24)?；?，包括飽和、不飽和和分支的?；籖3是-H或-PO3R11R12，其中R11和R12各自獨(dú)立地是-H或(C1-C4)烷基；R4是-H、-CH3或-PO3R13R14，其中R13和R14各自獨(dú)立地選自-H和(C1-C4)烷基；Y是選自下式的基團(tuán)
其中下標(biāo)n、m、p和q各自獨(dú)立地是從0至6的整數(shù)；R5是(C2-C24)酰基(如上所述，包括飽和、不飽和和分支的?；?；R6和R7獨(dú)立地選自H和CH3；R8和R9獨(dú)立地選自H、OH、(C1-C4)烷氧基、-PO3H2、-OPO3H2、-SO3H、-OSO3H、-NR15R16、-SR15、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R15、-CONR15R16、-PO3R15R16、-OPO3R15R16、-SO3R15和-OSO3R15，其中R15和R16各自獨(dú)立地選自H和(C1-C4)烷基；R10選自H、CH3、-PO3H2、ω-膦?；醮?C2-C24)烷基和ω-羧基(C1-C24)烷基；Z是-O-或-S-；限制條件為當(dāng)R3是-PO3R11R12時(shí)，R4不是-PO3R13R14。
另外，當(dāng)R3是-PO3H2，R4是H，R10是H，R1是正十四烷酰基，R2是正十八烷?；?，R5是正十六烷?；鶗r(shí)，X不是-O-。
在上述通式中，連接正常的脂肪酸?；鶜埢?’立體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生中心的構(gòu)型是R或S型，但優(yōu)選R型。連接R6和R7的碳原子的立體化學(xué)構(gòu)型是R或S型。所有立體異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體及其混合物都被認(rèn)為包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在一組優(yōu)選實(shí)施方案中，Y具有下式
在這組實(shí)施方案中，將選擇?；鵕1、R2和R5使該組中的至少兩個(gè)是(C2-C6)?；＿M(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案是其中R1、R2和R5中的碳原子總數(shù)是約6至約22，更優(yōu)選約12至約18。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，X是O，Z是O。下標(biāo)n、m、p和q優(yōu)選0-3的整數(shù)，更優(yōu)選0-2的整數(shù)。在剩余的取代基中，R6和R7優(yōu)選H。本發(fā)明進(jìn)一步關(guān)注優(yōu)選的取代基結(jié)合在一個(gè)分子中的實(shí)施方案。
在另一組實(shí)施方案中，R1、R2和R5選自(C12-C20)酰基，限制條件是R1、R2和R5中的碳原子總數(shù)是從約44至約60。更優(yōu)選R1、R2和R5的碳原子總數(shù)是從約46至約52。另外進(jìn)一步優(yōu)選的是其中X和Z均為-O-的實(shí)施方案。
在另一組實(shí)施方案中，Y具有下式
對(duì)于上面提供的優(yōu)選的實(shí)施方案組，在此組中也將選擇?；鵕1、R2和R5使至少兩個(gè)基團(tuán)是(C2-C6)?；?。進(jìn)一步優(yōu)選的是其中R1、R2和R5的碳原子總數(shù)是約6至約22，更優(yōu)選約12至約18的實(shí)施方案。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，X是O。在剩余的取代基中，R3優(yōu)選膦?；?-PO3H2)，R4優(yōu)選H。本發(fā)明進(jìn)一步關(guān)注這樣的實(shí)施方案其中優(yōu)選取代基的各種組合結(jié)合在一個(gè)分子中。
在另一組實(shí)施方案中，R1、R2和R5選自(C12-C24)?；?，前提條件是R1、R2和R5中的碳原子總數(shù)是從約44至約60。更優(yōu)選地，R1、R2和R5中碳原子的總數(shù)是從約46至約52。對(duì)于R1、R2和R5特別優(yōu)選的脂肪酸基團(tuán)是正常的C14、C16和C18脂肪酸基團(tuán)。進(jìn)一步優(yōu)選的是其中的X是-O-的實(shí)施方案。類(lèi)似于上面提供的較短?；湹膶?shí)施方案，R3優(yōu)選膦?；?-PO3H2)，R4優(yōu)選H。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Y是式(Ib)的基團(tuán)，X是O，R3是膦?；琑4是H，R1、R2和R5選自(C12-C24)?；疤釛l件是R1、R2和R5中的碳原子總數(shù)是從約46至約52。進(jìn)一步優(yōu)選其中的R2是(C16-C18)?；幕衔?。
除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“烷基”本身或作為另一取代基的一部分，是指直鏈或支鏈或環(huán)狀烴基團(tuán)，或其組合，可以完全飽和，單-或多不飽和，并可以包括二價(jià)和多價(jià)基團(tuán)，有指定的碳原子數(shù)(即，C1-C10意味著1-10個(gè)碳)。飽和烴基團(tuán)的例子包括這樣的基團(tuán)如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和異構(gòu)體，及類(lèi)似基團(tuán)。不飽和烷基是有1或多個(gè)雙鍵或三鍵的基團(tuán)。不飽和烷基的例子包括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁間二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基，和高級(jí)的同系物和異構(gòu)體。典型地，烷基將有1-24個(gè)碳原子。“低級(jí)烷基”是較短鏈的烷基，通常有8個(gè)或更少的碳原子。
術(shù)語(yǔ)“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫代基團(tuán)”(或硫代烷氧基)按其通常的概念使用，分別指通過(guò)氧原子、氨基或硫原子連接到分子的殘余部分上的烷基。
術(shù)語(yǔ)“?；敝竿ㄟ^(guò)從有機(jī)酸中除去羥基而得到的基團(tuán)。?；睦影ㄒ阴；?、丙?；?、十二烷?；⑹耐轷；惗□；邦?lèi)似基團(tuán)。因此，術(shù)語(yǔ)“?；卑硗舛x為-C(O)-烷基的基團(tuán)。
上述每個(gè)術(shù)語(yǔ)(例如“烷基”“?；?包括所示基團(tuán)的取代和未取代形式。對(duì)于每種類(lèi)型基團(tuán)優(yōu)選的取代基是下面列出的。
烷基和?；娜〈梢允且韵露喾N基團(tuán)-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R、-NR”C(O)2R’、-NH-C(NH2)＝NH、-NR’C(NH2)＝NH、-NHC(NH2)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-CN和-NO2，其數(shù)值范圍是0-(2m’+1)，其中m’是在這些基團(tuán)中的碳原子總數(shù)。R’、R”和R各自獨(dú)立地指氫和未取代的(C1-C8)烷基。當(dāng)R’和R”連接到同樣的氮原子上時(shí)，它們可以與氮原子結(jié)合形成5-、6-或7-元環(huán)。例如，NR’R”包括1-吡咯烷基和4-嗎啉基。從以上對(duì)取代基的討論，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解術(shù)語(yǔ)“烷基”包括如鹵代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)這樣的基團(tuán)和類(lèi)似基團(tuán)。
術(shù)語(yǔ)“藥物可接受的鹽”包括根據(jù)在本文記載的化合物上發(fā)現(xiàn)的特定的取代基，與相對(duì)無(wú)毒的酸或堿制備的活性化合物的鹽。當(dāng)本發(fā)明的化合物含有相對(duì)酸性的官能團(tuán)時(shí)，可以通過(guò)使此化合物的中性形式與足夠量的所需的堿直接接觸，或在適合的惰性溶劑中相接觸，得到堿加成鹽。藥物可接受的堿加成鹽的例子包括鈉、鉀、鈣、銨、有機(jī)胺鹽或鎂鹽或類(lèi)似的鹽。當(dāng)本發(fā)明的化合物含有相對(duì)堿性的官能團(tuán)時(shí)，可以通過(guò)使此化合物的中性形式與足夠量的所需的酸直接接觸，或在適合的惰性溶劑中相接觸，得到酸加成鹽。藥物可接受的酸加成鹽的例子包括從無(wú)機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、一氫碳酸、磷酸、一氫磷酸、二氫磷酸、硫酸、一氫硫酸、氫碘酸或亞磷酸及類(lèi)似物，以及從相對(duì)無(wú)毒的有機(jī)酸如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來(lái)酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富馬酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對(duì)-甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸及類(lèi)似物衍生得到的鹽。也包括氨基酸的鹽，例如精氨酸鹽和類(lèi)似物，及有機(jī)酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸及類(lèi)似物的鹽(見(jiàn)，例如，Berge，S.M.，等，“藥用鹽”，藥物科學(xué)雜志(“Pharmaceutical Salts”，Journal ofPharmaceutical Science)，66，1-19，1977)。本發(fā)明某些特定的化合物同時(shí)含有酸性和堿性官能團(tuán)，使化合物既能轉(zhuǎn)變成堿加成鹽，也能轉(zhuǎn)變成酸加成鹽。
可以通過(guò)使鹽與堿或酸接觸，并按通常的方式分離母體化合物而再生成化合物的中性形式。化合物的母體形式在某些物理性質(zhì)-例如在極性溶劑中的溶解度等方面不同于各種鹽的形式，但對(duì)于本發(fā)明的目的這些鹽與化合物的母體形式是等同的。
除鹽的形式外，本發(fā)明提供了前藥形式的化合物。本文記載的化合物前藥是在生理?xiàng)l件下易經(jīng)受化學(xué)變化產(chǎn)生本發(fā)明化合物的化合物。另外，前藥能在體外環(huán)境中通過(guò)化學(xué)或生物化學(xué)方法轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的化合物。例如，當(dāng)與適宜的酶或化學(xué)試劑置于透皮貼劑儲(chǔ)器中時(shí)，前藥能緩慢轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明的某些化合物可以以非溶劑化形式及溶劑化形式存在，包括水合形式。一般地，溶劑化形式等同于非溶劑化形式，均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的某些化合物可以以多晶型或無(wú)定形形式存在。一般地，所有物理形式對(duì)于本發(fā)明所關(guān)注的用途都是等同的，都在本本發(fā)明的某些化合物有不對(duì)稱(chēng)的碳原子(光學(xué)中心)或雙鍵；外消旋體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體和單個(gè)異構(gòu)體都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的化合物也可以在構(gòu)成此化合物的一或多個(gè)原子處含有非天然比例的原子同位素。例如，可以用放射性同位素-例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)放射性標(biāo)記此化合物。本發(fā)明化合物的所有同位素變體，無(wú)論是否有放射性，都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可以用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽鋯翁呛投腔衔?，其中許多方法已公開(kāi)。例如，可用于本發(fā)明的某些化合物記載在共同未決專(zhuān)利申請(qǐng)08/853,826、09/439,839(1999年11月12日遞交)和PCT/US98/09385中，將公開(kāi)的內(nèi)容全部并入本文作為參考。可以按類(lèi)似于美國(guó)專(zhuān)利6,013,640中記載的制備RC-552(L34)的方法制備其他化合物。可以用在Johnson，等，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志(J.Med.Chem).424640-4649(1999)，Johnson，等，Bioorg.Med.Chem.Lett.92273-2278(1999)，和PCT/US98/50399中概述的方法制備另外的其他化合物。可以按例如，美國(guó)專(zhuān)利4,436,727、4,877,611、4,866,034、4,912,094和4,987,237制備另外的其他化合物。一般地，在上述參考文獻(xiàn)中記載的合成方法和其他本領(lǐng)域熟知的合成方法廣泛適用于制備這些化合物。例如，在制備有不同的?；腿〈幕衔镏校绢I(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可以修改本文記載的會(huì)聚性方法，以使用替代的酰化劑，或可以用商業(yè)可得的附加有合適的酰基的物料引發(fā)反應(yīng)。
說(shuō)明性的藥物組合物及其送遞在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在對(duì)細(xì)胞、組織、動(dòng)物或植物給藥的藥物可接受的載體/賦形劑中單獨(dú)含有本文所述的一或多種單糖和二糖化合物，或?qū)⑵渑c一或多種其他治療形式聯(lián)合的藥物組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在無(wú)外源性抗原存在時(shí)配制藥物組合物，即，將該藥物組合物用于單一治療應(yīng)用中。對(duì)于許多這樣的實(shí)施方案，本發(fā)明的藥物組合物將含有一或多種本文所述的單糖化合物。
用于配制藥物組合物的說(shuō)明性載體包括，例如，水包油或油包水乳液、包含或不包含適于靜脈使用的有機(jī)共溶劑的水性組合物、脂質(zhì)體或含有表面活性劑的泡囊、微球、微珠和微粒體、粉末、片劑、膠囊、栓劑、水性懸浮液、氣霧劑和對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的其他載體。
在某些實(shí)施方案中，藥物組合物將含有一或多種緩沖劑(例如中性緩沖鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水)、糖類(lèi)(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸-例如甘氨酸，抗氧化劑、抑菌劑、鰲合劑-例如EDTA或谷胱甘肽、佐劑(例如氫氧化鋁)，使制劑相對(duì)于接受者的血液為等滲、低滲或弱高滲的溶質(zhì)，懸浮劑，增稠劑和/或防腐劑。
對(duì)于某些應(yīng)用，優(yōu)選水性制劑，特別是含有有效量的一或多種表面活性劑的制劑。例如，組合物可以是含有至少一種適宜的表面活性劑，例如磷脂類(lèi)表面活性劑的膠束分散體形式。磷脂的說(shuō)明性實(shí)例包括二?；字；视?，例如二肉豆蔻酰基磷脂?；视?DPMG)、二棕櫚?；字；视?DPPG)和二硬脂?；字；视?DSPG)；二酰基磷脂酰膽堿，例如二肉豆蔻酰基磷脂酰膽堿(DPMC)、二棕櫚酰基磷脂酰膽堿(DPPC)和二硬脂?；字Ｄ憠A(DSPC)；二?；字?，例如二肉豆蔻?；字?DPMA)、二棕櫚?；字?DPPA)和二硬脂酰基磷脂酸(DSPA)；和二?；字；掖及罚缍舛罐Ⅴ；字；掖及?DPME)、二棕櫚?；字；掖及?DPPE)和二硬脂?；字；掖及?DSPE)。典型地，在水性制劑中表面活性劑單糖/二糖的摩爾比將從約10∶1至約1∶10，更典型地在約5∶1至約1∶5，然而在水性制劑中可以用任何有效量的表面活性劑以最好地適合感興趣的特定的目的。
本發(fā)明的化合物和藥物組合物可以配制成用于基本上任何給藥途徑，例如注射、經(jīng)口或鼻的途徑吸入、直腸、陰道或氣管滴注、食入或經(jīng)皮或經(jīng)粘膜途徑，以及類(lèi)似方式。按這種方法，根據(jù)本發(fā)明的特定應(yīng)用的具體需要，本發(fā)明的方法和組合物可以達(dá)到的治療效果可以是，例如，全身性、局部、組織特異性的等。
可以制備說(shuō)明性的制劑并胃腸外給藥，即腹膜內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。靜脈用藥的載體的一個(gè)說(shuō)明例包括10％USP(美國(guó)藥典)乙醇，40％USP丙二醇或聚乙二醇600和余量的USP注射用水(WFI)的混合物。另外的說(shuō)明性載體包括10％USP乙醇和USP WFI；0.01-0.1％三乙醇胺的USP WFI溶液或0.01-0.2％二棕櫚?；字Ｄ憠A的USPWFI溶液；和1-10％角鯊烯或胃腸外水包植物油乳液。通常選擇藥物學(xué)可接受的胃腸外溶劑以使它們提供可以濾過(guò)0.22微米濾器而不去除活性成分的溶液或分散體。
用于皮下或肌肉內(nèi)使用的載體的說(shuō)明性例子包括磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液，5％葡萄糖的WFI溶液和0.01-0.1％三乙醇胺在5％葡萄糖中形成的溶液或0.9％氯酸鈉的USP WFI溶液，或10％USP乙醇與40％丙二醇的1∶2或1∶4的混合物且余量為可接受的等滲溶液如5％葡萄糖或0.9％氯化鈉；或0.01-0.2％二棕櫚?；字Ｄ憠A的USP WFI溶液和1-10％角鯊烯或胃腸外水包植物油乳液。
通過(guò)粘膜表面用給藥的載體的例子取決于特定的給藥途徑，例如口服、舌下用藥、鼻內(nèi)給藥等等?？诜o藥時(shí)，說(shuō)明例包括藥物級(jí)的甘露醇、淀粉、乳糖、硬酯酸鎂、糖鈉、纖維素、碳酸鎂和類(lèi)似物，優(yōu)選甘露醇。鼻內(nèi)給藥時(shí)，說(shuō)明例包括聚乙二醇、磷脂、乙二醇和糖脂類(lèi)、蔗糖和/或甲基纖維素，有或無(wú)填充劑如乳糖和防腐劑如苯扎氯銨、EDTA的粉末懸浮液。在一個(gè)特定的說(shuō)明性實(shí)施方案中，磷脂1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)作為0.01-0.2％的等滲水性載體，用于本發(fā)明的化合物以約0.1至3.0毫克/毫升的濃度鼻內(nèi)給藥。
在通過(guò)吸入給藥時(shí)，說(shuō)明性載體包括聚乙二醇或乙二醇、DPPC、甲基纖維素、粉末化分散劑，和防腐劑，優(yōu)選聚乙二醇和DPPC。在許多實(shí)例中，單糖或二糖化合物優(yōu)選以噴霧形式用于吸入式給藥。說(shuō)明性地，可以使用一次性給藥裝置、噴霧器、氣息活化的粉末吸入器、氣霧劑定量吸入器(MDI))或本領(lǐng)域可利用的其它多種噴霧送遞裝置來(lái)遞送藥物。另外，也可以使用霧帷或通過(guò)氣管直接給藥。通過(guò)氣管或鼻咽方式送遞藥物對(duì)于某些適應(yīng)癥是有效的。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到以上描述只是說(shuō)明性的而不是窮舉性的。實(shí)際上，許多其它制劑技術(shù)和藥物可接受的賦形劑和載體溶液是為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，是在各種治療方式中使用本文記載的特定組合物的適當(dāng)給藥和治療方式的發(fā)展。
可以用各種測(cè)定方式評(píng)估此化合物，以確定并選擇具有最適合本發(fā)明的特定應(yīng)用的特性的化合物。例如，可以使用動(dòng)物模型確定并評(píng)估單糖和/或二糖化合物給藥后細(xì)胞因子向全身循環(huán)釋放的曲線圖。并且，存在各種體外和體內(nèi)模型來(lái)檢查對(duì)于不同抗原成分的免疫應(yīng)答的一或多方面的變化，以確定最適于引起感興趣的特異性免疫應(yīng)答的化合物。例如，一種化合物可以與靶細(xì)胞-如巨噬細(xì)胞、樹(shù)狀細(xì)胞或朗格罕氏細(xì)胞在體外接觸，可以測(cè)量加工后的(elaborated)細(xì)胞因子。并且，可以使用基因表達(dá)陣列來(lái)確定由感興趣的特定的單糖或二糖激活或抑制的特異性路徑。
將能理解的是如果需要，本文公開(kāi)的化合物可以與其它治療形式聯(lián)合給藥，如與抗微生物、抗病毒和抗真菌的化合物或療法，與各種以DNA為基礎(chǔ)的治療劑、以RNA為基礎(chǔ)的治療劑、以多肽為基礎(chǔ)的治療劑，和/或與其它免疫效應(yīng)物聯(lián)合給藥。實(shí)際上，也可以包括基本上任何其它組分，只要此附加的組分不會(huì)在與靶細(xì)胞或宿主組織接觸時(shí)引起明顯反作用。因此該組合物可以與所實(shí)施的本發(fā)明的特定實(shí)施方案所需的或期望的各種其他藥劑一起送遞。
說(shuō)明性地，本發(fā)明的藥物組合物可以包括編碼一或多種治療性蛋白質(zhì)的DNA、反義RNA、核酶或類(lèi)似物，或與它們聯(lián)合使用。DNA可以存在于任何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的各種送遞系統(tǒng)，包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)中。大量基因送遞技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的，如Rolland在Crit.Rev.Therap.Drug Carrierr Systems15143-198，1998和其中所引用的參考文獻(xiàn)中所描述的那些技術(shù)。適當(dāng)?shù)暮怂岜磉_(dá)系統(tǒng)含有在接受治療者中表達(dá)的必需DNA序列(如合適的啟動(dòng)子和終止信號(hào))。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，可以使用病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如牛痘或其它痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒)引入DNA，此系統(tǒng)可能包括使用非致病性(缺損的)、可復(fù)制病毒。例如，在以下的文獻(xiàn)中公開(kāi)了適合的系統(tǒng)Fisher-Hoch等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)86317-321，1989；Flexner等，Ann.N.Y.Acad.Sci.56986-103，1989；Flexner等，疫苗(Vaccine)817-21，1990；美國(guó)專(zhuān)利4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美國(guó)專(zhuān)利4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner，生物技術(shù)6616-627，1988；Rosenfeld等，科學(xué)252431-434，1991；Kolls等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)91215-219，1994；Kass-Eisler等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)9011498-11502，1993；Guzman等，循環(huán)(Circulation)882838-2848，1993；和Guzman等，循環(huán)研究(Cir.Res.)731202-1207，1993。使DNA摻入這些表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)是為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的。
DNA也可以是“裸露的”，如在Ulmer等，科學(xué)2591745-1749，1993中所述的和Cohen所綜述的(科學(xué)2591691-1692，1993)。通過(guò)將DNA涂布在生物降解性珠粒上能增加對(duì)裸DNA的攝取，所述珠粒可被有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。顯然本發(fā)明的藥物組合物可以含有多核苷酸和蛋白質(zhì)組分。
本發(fā)明的組合物中可以包含各種附加的免疫刺激劑中的任何一種。例如，包含細(xì)胞因子-如GM-CSF、干擾素或白介素以進(jìn)一步調(diào)節(jié)所感興趣的免疫應(yīng)答。例如，在某些實(shí)施方案中，在組合物中可以包含附加成分以進(jìn)一步增強(qiáng)的Th1-型細(xì)胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)的誘導(dǎo)作用。另外，對(duì)于某些治療應(yīng)用可能需要高水平的Th2-型細(xì)胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)。可以用標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法容易地確定這些細(xì)胞因子的水平。對(duì)于細(xì)胞因子家族的綜述，參見(jiàn)Mosmann和Coffman，免疫學(xué)年鑒(Ann.Rev.Immunol.)7145-173，1989。
用于誘導(dǎo)Th1-型細(xì)胞因子的示例性組合物例如包括，如WO96/02555、WO 99/33488和美國(guó)專(zhuān)利6,008,200和5,856,462中所記載的含CpG的寡核苷酸的組合(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)。例如，Sato等在科學(xué)(Science)273352，1996中也記載了免疫刺激性DNA序列。其它合適的免疫刺激劑包括皂甙，如QS21(AquilaBiopharmaceuticals Inc.，F(xiàn)ramingham，MA)，和相關(guān)的皂甙衍生物及其模擬物。
可以與本發(fā)明聯(lián)合使用的其它示例性的免疫刺激劑包括Montanide ISA 720(Seppic，法國(guó))、SAF(Chiron，California，美國(guó))、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列的佐劑(例如SBAS-2或SBAS-4，可從SmithKline Beecham，Rixensart，比利時(shí)獲得)，和EnhanzynTM免疫刺激劑(Corixa，Hamilton，MT)。WO 99/52549A1記載了聚氧乙烯醚免疫刺激劑。
一般的定義本文使用的“有效量”是指顯示超過(guò)賦形劑或陰性對(duì)照的響應(yīng)值的量。如上所述，給患者施用的本發(fā)明化合物的精確劑量將取決于給藥途徑、藥物組合物和患者。
術(shù)語(yǔ)“藥物可接受”是指在對(duì)人給藥時(shí)不引起過(guò)敏或類(lèi)似不期望的反應(yīng)的分子和組合物。
本文使用的“載體”或“賦形劑”包括任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、賦形劑、包衣材料、稀釋劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、緩沖劑、載體溶液、懸浮液、膠體和類(lèi)似物。對(duì)于藥物活性物質(zhì)使用這樣的介質(zhì)和藥劑在本領(lǐng)域中是眾所周知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑與活性成分不相容，可以考慮它在治療組合物中的應(yīng)用。
實(shí)施例實(shí)施例1通過(guò)預(yù)防性施用一磷酰基脂質(zhì)A防止卡氏肺囊蟲(chóng)感染用L3T4抗-CD4抗體預(yù)處理小鼠最少2周(每周注射2次，每次0.2毫克)或直到外周CD4計(jì)數(shù)降低至少約50％。
制備在水中含有1mg/ml 3-O-去?；涣柞；|(zhì)A和108μg/ml表面活性劑DPPC的水性制劑。在開(kāi)始研究前24小時(shí)將此制劑通過(guò)一根小插管經(jīng)氣管內(nèi)給藥并在此研究的剩余時(shí)間內(nèi)每周給藥兩次。下表1指明給藥濃度。在第0天通過(guò)氣管接種1百萬(wàn)卡氏肺囊蟲(chóng)。每周治療兩次，持續(xù)7周，摘除肺并制作壓痕涂片。用吉姆薩染劑(Giemsa)和銀將載玻片染色并如下所述對(duì)卡氏肺囊蟲(chóng)的存在評(píng)分。
分?jǐn)?shù) 5＞100/1000×視野410-100/視野31-10/視野21-10/10視野11-10/50視野00/50視野這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果概括在下表1中表1

重復(fù)此研究并得到以下結(jié)果(表2)

結(jié)果顯示一磷?；|(zhì)A的肺部送遞促進(jìn)了無(wú)免疫應(yīng)答小鼠體內(nèi)對(duì)卡氏肺囊蟲(chóng)感染的非特異性抵抗力。吸入一磷?；|(zhì)A導(dǎo)致局部(和末梢)天然免疫應(yīng)答的活化，產(chǎn)生增強(qiáng)的非特異性保護(hù)作用。一磷?；|(zhì)A主要通過(guò)能導(dǎo)致吞噬活性增強(qiáng)和免疫刺激性細(xì)胞因子釋放的抗原呈遞細(xì)胞的活化來(lái)介導(dǎo)這種保護(hù)作用。對(duì)從肺部灌洗出的細(xì)胞進(jìn)行FACS分析顯示了活化的嗜中性粒細(xì)胞的標(biāo)記物，但作為整體炎性反應(yīng)(ARDS)特征的白細(xì)胞流入不明顯。脾細(xì)胞分析顯示CD11b或CD69的負(fù)表達(dá)，提示此應(yīng)用中一磷酰基脂質(zhì)A制劑及其作用不是全身性的而是局限在肺中。
實(shí)施例2通過(guò)一磷酰基脂質(zhì)A的預(yù)防性給藥防止致命性流感攻擊在致命性流感攻擊前2天或當(dāng)天以劑量為20μg的一磷?；|(zhì)A(MPL)對(duì)多組雌性BALB/c小鼠鼻下(i.n.)給藥。鼻內(nèi)給予大約2LD50傳染性流感A/HK/68對(duì)所有小鼠進(jìn)行攻擊。流感攻擊后監(jiān)測(cè)死亡率21天。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖1。這些數(shù)據(jù)顯示一磷酰基脂質(zhì)A的鼻內(nèi)送遞促進(jìn)了對(duì)小鼠體內(nèi)用致命性流感攻擊引起的感染的非特異性抵抗力。
實(shí)施例3L-絲氨?；被榛被咸擒樟姿嶂?AGPs)鼻內(nèi)給藥后的臨床癥狀按照全部引入本文作為參考的2000年9月5日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利6,113,918和1999年11月12日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/439,839制備一系列L-絲氨?；被榛被咸擒樟姿嶂?AGPs)。
通過(guò)鼻內(nèi)(i.n.)給藥給多組雌性BALB/c小鼠施用劑量為20μg的L-絲氨?；鵄GPs(RC-526、RC-554、RC-555、RC-537、RC-527、RC-538、RC-560、RC-512和單純的賦形劑)。在AGP給藥后的最初4天中，對(duì)小鼠監(jiān)測(cè)疾病的三項(xiàng)主觀指征(即疾病指數(shù))，包括觀察發(fā)皺的皮毛、隆起的體態(tài)和緩慢的呼吸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖2。這些數(shù)據(jù)顯示RC-537、RC-527、RC-538和RC-560以20μg的給定劑量鼻內(nèi)給藥在小鼠體內(nèi)誘發(fā)一定的毒性。
實(shí)施例4
L-絲氨?；被榛被咸擒樟姿嶂?AGPs)鼻內(nèi)給藥和流感攻擊后的臨床癥狀在致命性流感攻擊前2天或當(dāng)天以劑量為20μg的L-絲氨?；鵄GPs(RC-526、RC-554、RC-555、RC-537、RC527、RC-538、RC-560、RC-512和單純的賦形劑)對(duì)多組雌性BALB/c小鼠鼻內(nèi)(i.n.)給藥。鼻內(nèi)給予大約2LD50傳染性流感A/HK/68對(duì)所有小鼠進(jìn)行攻擊。在流感攻擊后4-19天內(nèi)監(jiān)測(cè)疾病指數(shù)(發(fā)皺的皮毛、隆起的體態(tài)和緩慢的呼吸)。在流感攻擊后監(jiān)測(cè)體重減輕和死亡率21天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖3。
這些數(shù)據(jù)證明了AGP化合物RC-538、RC560和RC-512在提供對(duì)流感攻擊的實(shí)質(zhì)保護(hù)作用方面的功效。
實(shí)施例5使用人全血培養(yǎng)物和小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物的RC552和MPL比較本實(shí)施例揭示了使用人全血培養(yǎng)物和小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物的合成脂質(zhì)A化合物RC552與經(jīng)過(guò)修飾的天然物質(zhì)一磷酰基脂質(zhì)A(MPL)相比細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用。
將脂質(zhì)A化合物在0.2％三乙醇胺的沖洗用無(wú)菌水溶液中重建，進(jìn)行試驗(yàn)，在56℃保溫并在37℃超聲波處理2×10分鐘。將LPS 055B5(Sigma-Aldrich；St Louis，MO)稀釋到PBS中。
將化合物加入到450μl人全血中，并攪拌培養(yǎng)5到24小時(shí)。選擇三個(gè)供試者(圖4-6，分別為供試者A-C)。經(jīng)離心收集上清液并用等體積PBS稀釋到1/2(不認(rèn)為此稀釋是細(xì)胞因子計(jì)算的稀釋因子)。借助ELISA(R&D Systems；Minneapolis，MN)利用全濃度或稀釋十倍之多的所需體積的上清液測(cè)定細(xì)胞因子的加工產(chǎn)物(elaboration)。
從Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)購(gòu)買(mǎi)BALB/c、DBA/2和C3H/HEJ小鼠。在下午2點(diǎn)和3點(diǎn)之間從小鼠體內(nèi)取出脾臟，并得到每個(gè)小鼠品系的單獨(dú)的單細(xì)胞懸浮液。利用Tris-氯化銨溶液(Sigma-Aldrich)將紅細(xì)胞溶解，清洗細(xì)胞并用臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue)(Sigma-Aldrich)排除法計(jì)數(shù)。在每孔1.0mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)一百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞。設(shè)計(jì)脾細(xì)胞培養(yǎng)基(SCM)用于5天或更長(zhǎng)時(shí)間的小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)，該培養(yǎng)基由用胎牛血清(HyClone；Logan，UT)補(bǔ)充到5％的RPMI 1640(Sigma-Aldrich)、100μg/mL慶大霉素(Sigma-Aldrich)、250ng/mL兩性霉素(InVitrogen Life Technologies；Carlsbad，California)、lx ITS(牛胰島素500ng/mL，人轉(zhuǎn)移(human transferring)500ng/mL、亞硒酸鈉250ng/mL，Sigma)、β-巰基乙醇43nM(Sigma-Aldrich)、丙酮酸(purivic acid)1mM(Sigma Aldrich)、HEPES10mM(Sigma-Aldrich)組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖8。
利用人全血培養(yǎng)物，測(cè)定了四種細(xì)胞因子IL-10、MIP-1β、TNFα和IL-8。兩名供試者被測(cè)試了一次，而一名供試者被測(cè)試了兩次。值得注意的是這名被測(cè)試了兩次的供試者在一次測(cè)試中有很高的背景TNFα，但在一個(gè)月之后背景TNFα很低。但很明顯，這是因培養(yǎng)的時(shí)間跨度所致。用5.5小時(shí)的培養(yǎng)物得到高背景TNFα，而用過(guò)夜-大約24小時(shí)的培養(yǎng)物得到低背景TNFα。然而，即使是用5.5小時(shí)的培養(yǎng)物得到的低背景TNFα(約600pg/ml)也比用某些以前的培養(yǎng)物得到的值(在5小時(shí)測(cè)試中為518.2pg/ml；在4小時(shí)測(cè)試中為417pg/ml；在4小時(shí)為0pg/ml，低應(yīng)答者)。
在3個(gè)24小時(shí)培養(yǎng)物中的2個(gè)，和1個(gè)5.5小時(shí)的培養(yǎng)物中，在TNFα加工產(chǎn)物方面RC552近似于MPL。然而在所有三種情況下RC552對(duì)IL-8的誘導(dǎo)作用與MPL不同。在兩個(gè)過(guò)夜培養(yǎng)物中RC552對(duì)IL-8的誘導(dǎo)作用比MPL低，而在另外一個(gè)過(guò)夜培養(yǎng)物中比MPL高。
對(duì)于所有過(guò)夜培養(yǎng)物，RC552對(duì)IL-10的誘導(dǎo)比MPL低。在三個(gè)過(guò)夜培養(yǎng)物中，一個(gè)的MIP-1β誘導(dǎo)作用降低。
比較了MPL和RC552在BALB/c和C3H/HEJ中產(chǎn)生的應(yīng)答。由于在toll樣受體4中的突變，C3H/HEJ小鼠對(duì)于LPS是遺傳性低應(yīng)答者。在這些培養(yǎng)物中，用寡核苷酸刺激劑作為C3H/HEJ培養(yǎng)物的陽(yáng)性對(duì)照。寡核苷酸在BALB/c小鼠和C3H/HEJ小鼠中誘導(dǎo)出大量IL-6(分別為1000pg/mL和488.5pg/mL)。類(lèi)似地，在BALB/c和C3H/HEJ培養(yǎng)物中誘導(dǎo)出MIP-1β(589pg/mL和554pg/mL)，同樣，分別響應(yīng)于10μg/mL MPL或RC552，誘導(dǎo)了IL-10(342pg/mL和609pg/mL)和TNFα(204pg/mL和30pg/mL)。
利用C3H/HEJ脾細(xì)胞，無(wú)論是MPL還是RC552都沒(méi)有引起細(xì)胞因子應(yīng)答。但在BALB/c脾細(xì)胞培養(yǎng)物中，誘導(dǎo)出IL-10、MIP-1β、TNFα和IL-6。在同樣的濃度下，與MPL相比，RC552誘導(dǎo)出較少的MIP-1β、TNFα和IL-6。與MPL相比(1144.1至176.6pg/mL)，RC552誘導(dǎo)出非常少的IL-10(10.4至11.6pg/mL)。
在人全血的三個(gè)過(guò)夜培養(yǎng)物中的兩個(gè)，和一個(gè)短期培養(yǎng)物中，在0.2％三乙醇胺溶液中測(cè)試時(shí)，RC552與MPL有相似的但不相同的對(duì)TNFα的誘導(dǎo)作用的促炎性曲線圖。見(jiàn)圖4-6(分別是供試者A-C的過(guò)夜培養(yǎng)物)和圖7(供試者A的短期培養(yǎng)物)。另外，在三個(gè)過(guò)夜培養(yǎng)物的兩個(gè)中RC552產(chǎn)生的對(duì)MIP-1β的誘導(dǎo)作用是相似的。在一個(gè)過(guò)夜培養(yǎng)物中RC552比MPL誘導(dǎo)出減少的IL-10。在所有測(cè)試?yán)?，RC552產(chǎn)生的對(duì)IL-8的誘導(dǎo)作用均與MPL不同。
使用受體缺陷的小鼠，很清楚RC552是通過(guò)toll樣受體4發(fā)出信號(hào)。使用對(duì)脂質(zhì)A有應(yīng)答的BALB/c小鼠，在測(cè)試濃度下RC552誘導(dǎo)出減弱的細(xì)胞因子曲線圖。有趣的是，測(cè)試濃度位于一劑量應(yīng)答關(guān)系的高端，并且RC552在低測(cè)試濃度(10μg/mL)下要比在高測(cè)試濃度(20μg/mL)下誘導(dǎo)出稍高的MIP-1β和TNFα。
比較人和小鼠的細(xì)胞因子曲線圖，當(dāng)在高刺激劑濃度下測(cè)試時(shí)，在2日小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中和在3個(gè)人血液過(guò)夜培養(yǎng)物的1個(gè)中，合成脂質(zhì)A化合物RC552減弱了對(duì)IL-10的誘導(dǎo)能力。一般地，在人血液過(guò)夜培養(yǎng)物中RC552比MPL誘導(dǎo)出較少的TNFα。在短期(5.5小時(shí))人血液培養(yǎng)物中RC552和MPL誘導(dǎo)出大約相同水平的TNFα。采用由RC552和MPL刺激的人巨噬細(xì)胞得到的RNA的微陣列數(shù)據(jù)表明，對(duì)于兩種化合物都有早期(1小時(shí))TNFαRNA而無(wú)晚期TNFαRNA。但與MPL有能測(cè)出的6小時(shí)RNA相反，RC552誘導(dǎo)出很少的6小時(shí)TNFα。
實(shí)施例6RC529與MPL和RC552相比的刺激能力此實(shí)施例證明當(dāng)使用人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的IL-6、IL-10和MIP-1β加工產(chǎn)物評(píng)價(jià)時(shí)，RC529具有比MPL高的免疫刺激能力。相反，對(duì)于IL-8加工產(chǎn)物，RC529與MPL的誘導(dǎo)能力相似。
PBMC在使用前一直冷凍儲(chǔ)藏。指定PBMC供試者為AD112。在48孔的平板中，將密濃度為6.26×105的PBMC置于含有1.0ml培養(yǎng)基的每孔。培養(yǎng)基由RPMI-1640加碳酸氫鈉、10％胎牛血清、4mM谷氨酰胺、100μg/ml慶大霉素和10mM HEPES組成。在二氧化碳培養(yǎng)箱中，在37℃將PBMC培養(yǎng)22小時(shí)。收集上清液，用ELISA(R&DSystems)測(cè)試IL-6、IL-8、IL-10和MIP-1β濃度。比較此上清液中與從同樣培養(yǎng)但未受刺激的PBMC獲取的上清液中的細(xì)胞因子濃度。
在測(cè)試劑量下，最低劑量的RC529未達(dá)到對(duì)于IL-6或IL-8的劑量響應(yīng)能力。與MPL相比，RC529誘導(dǎo)出更多IL-6、IL-10和MIP-1β。作為二糖化合物，以質(zhì)量計(jì)，RC552的刺激能力一般是中等的。見(jiàn)圖9。這些數(shù)據(jù)顯示RC529是從冷凍的人PBMC中誘導(dǎo)IL-6、IL-10和MIP-1β的強(qiáng)誘導(dǎo)物。
在此說(shuō)明書(shū)中引用的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)都引入本文作為參考，如同具體地并單獨(dú)地指出每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)都作為參考結(jié)合在本文中。雖然為了清楚地理解，通過(guò)圖表和實(shí)施例對(duì)上述發(fā)明作了詳細(xì)描述，但對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，可以對(duì)本發(fā)明作出某些改變和改進(jìn)，而不背離所附權(quán)利要求書(shū)的要旨或范圍。
權(quán)利要求
1.一種在沒(méi)有外源性抗原的情況下配制和給藥的藥物組合物，該組合物含有一或多種具有下式的化合物及其藥物可接受的鹽 其中X選自-O-和-NH-；R1和R2各自獨(dú)立地選自(C2-C24)酰基；R3選自-H和-PO3R11R12，其中R11和R12各自獨(dú)立地選自-H或(C1-C4)烷基；R4選自-H、-CH3和-PO3R13R14，其中R13和R14各自獨(dú)立地選自-H和(C1-C4)烷基；并且Y是選自下式的基團(tuán) 其中下標(biāo)n、m、p和q各自獨(dú)立地是從0至6的整數(shù)；R5是(C2-C24)?；?；R6和R7獨(dú)立地選自H和CH3；R8和R9獨(dú)立地選自H、OH、(C1-C4)烷氧基、-PO3H2、-OPO3H2、-SO3H、-OSO3H、-NR15R16、-SR15、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R15、-CONR15R16、-PO3R15R16、-OPO3R15R16、-SO3R15和-OSO3R15，其中R15和R16各自獨(dú)立地選自H和(C1-C4)烷基；R10選自H、CH3、-PO3H2、ω-膦?；醮?C2-C24)烷基和ω-羧基(C1-C24)烷基；Z是-O-或-S-；限制條件為當(dāng)R3是-PO3R11R12時(shí)，R4不是-PO3R13R14，進(jìn)一步的限制條件是當(dāng)R3是-PO3H2，R4是H，R10是H，R1是正十四烷酰基，R2是正十八烷酰基和R5是十六烷?；鶗r(shí)，X不是-O-。
2.權(quán)利要求1所述的藥物組合物，進(jìn)一步含有一或多種表面活性劑。
3.權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中所述的一或多種表面活性劑選自二肉豆蔻?；字；视?DPMG)、二棕櫚?；字；视?DPPG)、二硬脂?；字；视?DSPG)、二肉豆蔻酰基磷脂酰膽堿(DPMC)、二棕櫚酰基磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂?；字Ｄ憠A(DSPC)、二肉豆蔻?；字?DPMA)、二棕櫚?；字?DPPA)、二硬脂?；字?DSPA)、二肉豆蔻?；字；掖及?DPME)、二棕櫚?；字；掖及?DPPE)和二硬脂酰基磷脂?；掖及?DSPE)。
全文摘要
提供了治療或改善疾病和其他癥狀，例如傳染病、自身免疫性疾病和變應(yīng)性疾病的方法和組合物。此方法使用單糖和二糖類(lèi)化合物以選擇性地刺激動(dòng)物和植物的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1907289SQ20061010803
公開(kāi)日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2001年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月19日
發(fā)明者D·H·珀辛, R·T·克瑞恩, G·T·埃利奧特, J·T·阿爾里奇, M·J·萊西, D·A·約翰森, J·R·鮑德里奇, R·王 申請(qǐng)人:科里克薩有限公司