專利名稱：一種具有抗血管新生協(xié)同作用的中藥有效成分組合配方的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物配方技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種具有抗血管新生協(xié)同作用的中藥有效成分組合配方。
背景技術(shù)：
“血管新生”(新生血管形成)是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、腫瘤等危害人民生命健康的重大疾病的共性病理環(huán)節(jié)?？寡苄律幬锸亲钄囝愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病變進(jìn)程，“餓死腫瘤”(治療實(shí)體腫瘤)等疾病發(fā)生發(fā)展的重要途徑。以類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為例，目前，在中國類風(fēng)濕藥物市場上主要為非甾體類抗炎藥物、慢作用藥物和中成藥。目前專用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中藥以中成藥為主，包括以下12種風(fēng)濕寒痛片，痹苦乃停片，麝香丸，血痹大易方，防風(fēng)丸，痹隆清安片，正清風(fēng)痛寧，石楠散，燥濕化痰丸，虎骨丸，益腎蠲痹丸，活血丹。以上中成藥處方較大，特色不突出，同時作用機(jī)理不夠明確。成份較為明確的中藥提取物主要為昆明山海棠片，雷公藤總苷片，該二藥具有免疫抑制作用，但其嚴(yán)重的胃腸道、腎臟和生殖毒性卻限制了它們的應(yīng)用，同時也面臨自然資源枯竭的問題。
“清絡(luò)飲”是一種用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中藥復(fù)方。其主要藥物組成為苦參，青風(fēng)藤，黃柏，粉萆。該方由李濟(jì)仁教授、張舜華主任醫(yī)師長期臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)所得。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，“清絡(luò)飲”方劑具有抗炎、減少滑膜毛細(xì)血管新生、防止血管翳的形成，改善軟骨破壞、減輕滑膜細(xì)胞亢進(jìn)的分泌功能及代謝活性，并在分子、組織、病理等多層次上表現(xiàn)出抑制“血管新生”的顯著效果，被國際上認(rèn)為是目前進(jìn)行中醫(yī)方劑與血管新生的代表性研究之一。因此，“清絡(luò)飲”作為標(biāo)本兼治、特點(diǎn)突出、安全的抗血管新生相關(guān)病種如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的中藥，具有充足的成長動力和充分的成長空間。
然而，“清絡(luò)飲”復(fù)方的藥物成份復(fù)雜，同時方劑之間不是藥物成份的單純迭加，各成份間還存在著復(fù)雜的相互作用。因此采用中藥飲片形式進(jìn)行配伍的原有“清絡(luò)飲”復(fù)方存在成分繁雜，質(zhì)量難以控制，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，藥物作用機(jī)理不清晰等現(xiàn)有中藥方劑所普遍存在的諸多不足與局限。
總的看來，目前抗血管新生相關(guān)疾病(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的治療現(xiàn)狀是(1)尚缺乏治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效中藥。(2)沒有以抗血管新生為特點(diǎn)的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的中成藥及中藥制劑。(3)沒有以中藥有效組合形式申報(bào)專利的抗血管新生相關(guān)疾病的中藥組合。(4)面對患者人群龐大且不斷增長的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等血管新生相關(guān)疾病的市場，治療需求遠(yuǎn)未得到滿足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服已有技術(shù)的不足之處，提出一種具有抗血管新生協(xié)同作用的中藥有效成分組合配方，該配方是中藥“清絡(luò)飲”復(fù)方飲片配伍中提取的，具有“增效減毒”的效果，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、實(shí)體腫瘤等血管新生相關(guān)疾病具有明顯的治療作用，且藥效物質(zhì)基礎(chǔ)明確，同時又保存了傳統(tǒng)中藥方劑配伍的特性。
本發(fā)明提出的具有抗血管新生協(xié)同作用的中藥有效成分組合配方，其特征在于由苦參堿與青藤堿混合而成，該兩種成分的用量比例為苦參堿∶青藤堿＝1∶0.05～1。
上述配方的臨床一次用量為苦參堿總量44.69mg～191.48mg，青藤堿對應(yīng)的范圍為2.23mg～191.48mg。
本配方還可作用于其它對象(動物、細(xì)胞等)的用量，可按照藥理實(shí)驗(yàn)公式推廣使用。
上述也可由苦參堿與青藤堿中的衍生物或鹽類混合而成，其用量按衍生物或鹽類的分子量推算。
本發(fā)明的組合配方可采用常規(guī)的制備方法制成中、西藥的各種劑型。
本發(fā)明所述苦參堿(別名母菊堿，英文名matrine)與青藤堿(或稱鹽酸青藤堿能夠?qū)︻愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、實(shí)體腫瘤等血管新生相關(guān)疾病發(fā)揮治療作用，同時在苦參堿與青藤堿的作用上存在“增效減毒”的交互作用。
苦參堿(別名母菊堿、a-苦參堿；英文名matrine、(+)-Matrine、α-Matrine)，分子式為C15H24N2O；分子量為248.36；結(jié)構(gòu)式為 苦參堿(Matrine)結(jié)構(gòu)式青藤堿(或稱鹽酸青藤堿Sinomenine hydrochloride；別名青風(fēng)堿、防己堿、毛防己堿；英文名sinomenine，Cucoline)，分子式為C19H23N04；分子量為329.39；結(jié)構(gòu)式為 青藤堿(Sinomenine)結(jié)構(gòu)式本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)及效果(1)采用液相色譜-質(zhì)譜連用分析技術(shù)，通過對實(shí)驗(yàn)動物口服“清絡(luò)飲”水煎液后，不同時間點(diǎn)血漿中的藥物成分分析，發(fā)現(xiàn)“清絡(luò)飲”經(jīng)代謝吸收入血的成分主要為苦參堿和青藤堿。同時，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示苦參堿和青藤堿具有較強(qiáng)的抗血管增生藥理活性，二者的適當(dāng)組合具有“增效減毒”的協(xié)同作用效果。因此，苦參堿和青藤堿應(yīng)為“清絡(luò)飲”的主要藥效物質(zhì)。
(2)在配方比例上，通過“清絡(luò)飲”單味藥及全方水煎液中，對苦參堿和青藤堿等生物堿含量進(jìn)行高效液相(HPLC)分析測定，同時考慮到氧化苦參堿在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為苦參堿，按轉(zhuǎn)化率為50％～100％，得到苦參堿與青藤堿組合的比例為(53.04∶28.81)～(92.83∶28.29)，即1.84∶1至3.28∶1之間。考慮到苦參為君藥，在臨床使用時的劑量范圍為10克至25克，因此苦參堿與青藤堿的配比為1∶(0.05～1)，臨床一次口服量為苦參堿44.69mg～191.48mg，青藤堿對應(yīng)的范圍為2.23mg～～191.48mg。
(3)對于代表血管新生的內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿、青藤堿二者均有明顯的抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用。通過苦參堿和青藤堿組合的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，采用國際公認(rèn)的等效線方法評價(jià)二者抑制作用的交互效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦參堿和青藤堿上述的比例范疇內(nèi)，例如1∶0.05、1∶0.22、1∶0.44、1∶1時，均具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的明顯交互作用(詳見實(shí)驗(yàn)三)。以上結(jié)果表明苦參堿和青藤堿的組合具有“增效減毒”的交互作用，即與青藤堿的適當(dāng)?shù)嘏湮榻M合，既可使抗血管新生的功效加強(qiáng)，同時又可有效地避免苦參堿用量過大所可能帶來的毒性。動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿和青藤堿的有效組合對于實(shí)驗(yàn)動物的抗血管新生治療效果與原方“清絡(luò)飲”相當(dāng)，部分方面優(yōu)于原方以及雷公藤總苷片對照組。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1其一次用量的配方為苦參堿的劑量為2000μg/ml，青藤堿劑量為100μg/ml，苦參堿和青藤堿的比例為1∶0.05。本實(shí)施例抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的交互作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)80.16％；實(shí)施例2其一次用量的配方為苦參堿的劑量為1350μg/ml，青藤堿劑量為300μg/ml，苦參堿和青藤堿的比例為1∶0.22。本實(shí)施例具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的交互作用，抑制率達(dá)72.02％；實(shí)施例3其一次用量的配方為苦參堿的劑量為888μg/ml，青藤堿劑量為394μg/ml，苦參堿和青藤堿的比例為1∶0.44。本實(shí)施例具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的交互作用，抑制率達(dá)70.91％；實(shí)施例4其一次用量的配方為苦參堿的劑量為445μg/ml，青藤堿劑量為445μg/ml，苦參堿和青藤堿的比例為1∶1。本實(shí)施例具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的交互作用，抑制率達(dá)54.12％。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)及效果實(shí)驗(yàn)一 實(shí)驗(yàn)動物口服清絡(luò)飲水煎液的入血成分分析實(shí)驗(yàn)方案采用液相色譜-紫外-質(zhì)聯(lián)用儀、高效液相色譜儀等儀器分析方法，對實(shí)驗(yàn)大鼠口服“清絡(luò)飲”水煎液后，不同時間點(diǎn)血漿中的藥物成分分析，測試“清絡(luò)飲”代謝吸收入血的成分。本實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行清絡(luò)飲水煎液和各單味藥的分析測試、清絡(luò)飲樣品與清絡(luò)飲加空白血漿樣品分析、空白及含藥(給藥清絡(luò)飲濃縮液20min，1h，2h取血)血漿樣品的質(zhì)譜分析與比較。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃給藥清絡(luò)飲后，清絡(luò)飲中迅速進(jìn)入到血漿中的成分主要包括330(青藤堿)和249(苦參堿)，此外尚有少量的205(N-甲基金雀花堿)和247(槐果堿)，可以認(rèn)為清絡(luò)飲最主要的入血成分為青藤堿和苦參堿。因此，我們通過對實(shí)驗(yàn)動物口服“清絡(luò)飲”水煎液后，不同時間點(diǎn)血漿中的藥物成分分析，發(fā)現(xiàn)“清絡(luò)飲”的經(jīng)代謝吸收入血的成分主要為苦參堿和青藤堿，故可以推斷清絡(luò)飲抗血管新生的主要藥效物質(zhì)至少包括了苦參堿和青藤堿，為對這兩個成分進(jìn)行組合研究提供了堅(jiān)實(shí)的科學(xué)依據(jù)。
實(shí)驗(yàn)二 清絡(luò)飲水煎液中苦參堿與青藤堿等生物堿的含量測定實(shí)驗(yàn)方案采用高效液相色譜儀等儀器分析方法，對于清絡(luò)飲水煎液及單味藥水煎液中苦參堿(以及在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為苦參堿的氧化苦參堿)與青藤堿的含量進(jìn)行測定。供含量測定對照所用的苦參堿、氧化苦參堿、青藤堿標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所。本實(shí)驗(yàn)所建立的生物堿測試方法在工作曲線濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)達(dá)0.999以上，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)都在3％以內(nèi)，低中高濃度回收率亦都在94％以上。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果清絡(luò)飲水煎液及單味藥水煎液中苦參堿、氧化苦參堿與青藤堿的含量測試結(jié)果見表1?？梢姾霞搴笱趸鄥A的含量下降，而苦參堿的濃度則比單煎時幾乎增加了一倍，青藤堿濃度增加了8.28％。通過應(yīng)用該法對清絡(luò)飲水煎液中相應(yīng)生物堿含量進(jìn)行分析測定，同時考慮到氧化苦參堿在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為苦參堿，按轉(zhuǎn)化率為50％～100％，可得苦參堿與青藤堿組合的比例為(53.04∶28.81)～(92.83∶28.29)，即1.84∶1～3.28∶1之間。
表1 三個生物堿在清絡(luò)飲及其單味藥水煎液中的濃度

變化率，指的是用復(fù)方中的濃度與單味藥濃度之差再比上單味藥濃度所得的百分比。
實(shí)驗(yàn)三 苦參堿和青藤堿分子組合交互作用的細(xì)胞試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方案在苦參堿和青藤堿獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法設(shè)計(jì)苦參堿和青藤堿不同的劑量與配比組合，運(yùn)用評價(jià)交互作用的經(jīng)典理論與方法(等效曲線法，反應(yīng)曲面法)，對苦參堿和青藤堿組合進(jìn)行抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)觀察并繪出量效曲線，以對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50)為指標(biāo)進(jìn)行交互效應(yīng)評價(jià)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦參堿、青風(fēng)藤堿在抗血管新生的作用上，具有明顯的“減毒增效”的協(xié)同作用。苦參堿和青藤堿的比例為1∶0.05(苦參堿的劑量為2000μg/ml，青藤堿劑量為100μg/ml)時，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的交互作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)80.16％，相當(dāng)于單獨(dú)使用苦參堿5097.7μg/ml的效果；苦參堿和青藤堿的比例為1∶0.22(苦參堿的劑量為1350μg/ml，青藤堿劑量為300μg/ml)時，具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的交互作用，抑制率達(dá)72.02％，相當(dāng)于單獨(dú)使用苦參堿4441.4μg/ml的效果；苦參堿和青藤堿的比例為1∶0.44(苦參堿的劑量為888μg/ml，青藤堿劑量為394μg/ml)時，具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的交互作用，抑制率達(dá)70.91％，相當(dāng)于單獨(dú)使用苦參堿4351.9μg/ml的效果；苦參堿和青藤堿的比例為1∶1(苦參堿的劑量為445μg/ml，青藤堿劑量為445μg/ml)時，具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的交互作用，抑制率達(dá)54.12％，相當(dāng)于單獨(dú)使用苦參堿2998.2μg/ml的效果。
實(shí)驗(yàn)四 苦參堿和青藤堿組合對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方案采用國際公認(rèn)的膠原誘導(dǎo)性的關(guān)節(jié)炎大鼠(CIA，II型膠原從大鼠軟骨肉瘤組織中獲得，純度達(dá)99.99％以上，由瑞典Lund大學(xué)提供)模型，隨機(jī)分為5組，每組8只，即正常對照組、模型組、雷公藤總苷片治療組(簡稱雷公藤組，為三九醫(yī)藥集團(tuán)黃石制藥產(chǎn)品)，清絡(luò)飲治療組，苦參堿和青藤堿組合治療組(簡稱苦青組)，進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)。檢測指標(biāo)包括關(guān)節(jié)炎指數(shù)(ArthritisIndex，AI)；大鼠踝關(guān)節(jié)切片、HE染色后在光鏡下觀察滑膜、軟骨、骨的病理改變；取大鼠血清采用ELISA法進(jìn)行抗CII抗體含量測定。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)苦參堿和青藤堿組合組可以顯著降低CIA大鼠在免疫第28天(P＜0.05)、35天(P＜0.01)、42天的關(guān)節(jié)炎積分(P＜0.01)，效果相對優(yōu)于清絡(luò)飲治療組，與雷公藤總苷片治療組相近。(2)病理光鏡觀察結(jié)果可見CIA組關(guān)節(jié)腔及滑囊均內(nèi)可見明顯的滑膜組織增生，滑膜細(xì)胞增生呈的乳頭狀，滑膜組織內(nèi)見有擴(kuò)張的血管及新生毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞，并伴有淋巴細(xì)胞侵潤。踝關(guān)節(jié)各跗骨關(guān)節(jié)軟骨的基質(zhì)及軟骨細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的退行性，嚴(yán)重處軟骨壞死剝脫，變性、壞死剝脫的軟骨表面，可見由滑膜細(xì)胞和毛細(xì)血管增生所形成的血管翳；膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見滑膜組織增生，血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨見有不同程度的退行性變?？鄥A和青藤堿組合組可以明顯改善CIA的血管新生病變并改善關(guān)節(jié)炎癥，表現(xiàn)為增生的滑膜組織內(nèi)的炎細(xì)胞、滑膜細(xì)胞及毛細(xì)血管數(shù)量減少，滑膜組織充血水腫明顯減輕，血管新生受到明顯抑制。但纖維結(jié)締組織增生，并有膠原化。仍可見有退變的軟骨組織，未見有新的軟骨壞死及剝脫的軟骨區(qū)，血管翳纖維化。清絡(luò)飲組，雷公藤組也能夠不同程度改善CIA的關(guān)節(jié)病變。(2)抗CII抗體含量測定結(jié)果表明，苦參堿和青藤堿組合可明顯降低CIA大鼠血清異常增高的抗II型膠原抗體含量(P＜0.01)，清絡(luò)飲治療組與雷公藤總苷片治療組也有一定改善(P＜0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合表明，苦參堿和青藤堿的有效組合能有效地改善膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹，減輕血管翳形成，降低其血清中抗II膠原抗體含量，提示對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎癥血管新生大鼠具有明顯的治療作用。同時，苦參堿和青藤堿的有效組合對于實(shí)驗(yàn)動物的抗血管新生治療效果與原方“清絡(luò)飲”相當(dāng)，部分方面優(yōu)于原方“清絡(luò)飲”以及雷公藤總苷片對照組。
權(quán)利要求
1.一種具有抗血管新生協(xié)同作用的中藥有效成分組合配方，其特征在于該配方由苦參堿與青藤堿混合而成，該兩種成分的用量比例為苦參堿∶青藤堿＝1∶0.05～1。
2.如權(quán)利要求1所述的配方，其特征在于所述配方的臨床一次用量為苦參堿總量44.69mg～191.48mg，青藤堿對應(yīng)的范圍為2.23mg～191.48mg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抗血管新生協(xié)同作用的中藥有效成分組合配方，屬于藥物配方技術(shù)領(lǐng)域。該配方由苦參堿與青藤堿混合而成，該兩種成分的用量比例為苦參堿∶青藤堿＝1∶0.05～1。本發(fā)明具有“增效減毒”的協(xié)同作用效果，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、實(shí)體腫瘤等血管新生相關(guān)疾病具有明顯的治療作用，且藥效物質(zhì)基礎(chǔ)明確，同時又保存了傳統(tǒng)中藥方劑配伍的特性。
文檔編號A61K31/4375GK1965830SQ20061011422
公開日2007年5月23日 申請日期2006年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月2日
發(fā)明者李梢, 吳敏 申請人:清華大學(xué)