專利名稱：鉤藤醇提取物及其在制備靶器官保護(hù)藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及中藥鉤藤醇提取物及其藥物新用途，具體涉及鉤藤醇提取物及其在制備靶器官保護(hù)藥物中的新用途。
背景技術(shù)：
靶器官損傷是高血壓、糖尿病等全身性疾病患者因病致殘和致死的根本原因。靶器官損傷常累及心、腎等重要臟器。其發(fā)生機(jī)制包括多條相互獨(dú)立的作用途徑。例如1、靶器官內(nèi)小血管壁增生、肥厚，其主要原因?yàn)樵l(fā)病如高血壓、糖尿病等誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增生。在心臟表現(xiàn)為冠狀動脈管腔狹窄，血流量下降，造成心肌缺血，甚至發(fā)生心肌梗死、心功能衰竭；在腎臟，表現(xiàn)為入球小動脈狹窄，繼而誘發(fā)腎小球硬化，損害腎功能，最終發(fā)生腎功能衰竭。2、靶器官內(nèi)小動脈舒縮功能紊亂，導(dǎo)致臟器內(nèi)供血小動脈異常收縮，使臟器血流量下降而造成靶器官缺血性損害。3、原發(fā)病誘發(fā)靶器官間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生，繼而分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，堆積于心、腎等靶器官的間質(zhì)中，使其逐漸發(fā)生纖維化而喪失其正常功能。4、原發(fā)病造成氧化應(yīng)激反應(yīng)，在體內(nèi)釋放大量氧自由基而對靶器官造成損害。
由于高血壓、糖尿病所造成的靶器官損傷由多種獨(dú)立的危險(xiǎn)因素所引起，目前的化學(xué)合成藥物多是針對其中某一條作用途徑而設(shè)計(jì)的，因此往往只能獲得部分療效。
鉤藤是茜草科植物鉤藤、大葉鉤藤、毛鉤藤、華鉤藤或無柄果鉤藤的干燥帶鉤莖枝。已知鉤藤性甘、涼。歸肝、心包經(jīng)。具有清熱、平肝，息風(fēng)定驚的功效。現(xiàn)有技術(shù)公開了鉤藤具有持久、明確的降壓作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供中藥鉤藤醇提取物及其在制備靶器官保護(hù)藥物中的新用途。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供鉤藤醇提取物在制備保護(hù)心血管和/或防治腎功能衰竭藥物中的用途。
本發(fā)明通過下述方法制備鉤藤醇提取物，1)取正品鉤藤，粉碎后加濃度大于70％的乙醇，加熱提取數(shù)次，過濾，合并濾液；2)濾液減壓濃縮成稠浸膏，加0.1-10％鹽酸溶解、洗滌，取濾液；3)堿性條件下，濾液加氯仿數(shù)次萃取后合并氯仿液；4)將氯仿液減壓濃縮后即得鉤藤醇提取物。
本發(fā)明鉤藤醇提取物經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，具有以下心血管保護(hù)作用1、對抗缺血-再灌注所導(dǎo)致的心肌損傷，可縮小心肌梗死面積。
2、抑制成纖維細(xì)胞增生，抗組織器官纖維化。
3、抑制血管平滑肌細(xì)胞增生，抑制血管壁肥厚。
4、抗氧化，清除自由基，從而保護(hù)靶器官。
5、抑制腎臟成纖維細(xì)胞增生，抑制腎小球纖維化，防治腎功能衰竭。
本發(fā)明鉤藤醇提取物可作為藥物制劑的原料。進(jìn)一步制備靶器官保護(hù)藥物。具體涉及制備保護(hù)心血管和/或防治腎功能衰竭的藥物。


圖1鉤藤提取物對心肌埂死面積的作用圖2鉤藤醇提取物對心臟成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用其中，*與空白對照相比，P＜0.05；#與溶劑對照相比，P＜0.05。
圖3鉤藤醇提取物對血管平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用其中，*與空白對照相比，P＜0.05；#與溶劑對照相比，P＜0.05。
圖4鉤藤醇提取物的抗氧化活性高于丹參水提取物其中，*與丹參水提取物組相比P＜0.001。
圖5鉤藤醇提取物對腎臟系膜細(xì)胞增殖的抑制作用其中，*與空白對照相比，P＜0.05；#與溶劑對照相比，P＜0.05。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1制備鉤藤醇提取物1)取正品鉤藤10公斤，粉碎后加濃度80％的乙醇，加熱提取5次，過濾，合并濾液；2)濾液減壓濃縮成稠浸膏，加濃度0.5％鹽酸溶解、洗滌，收集濾液；3)濾液加氯仿萃取，采用堿性溶液調(diào)濾液至pH值8，數(shù)次后合并氯仿液；4)將氯仿液減壓濃縮后即得鉤藤醇提取物。實(shí)施例2、鉤藤醇提取物的藥理作用實(shí)驗(yàn)(一)抗缺血-再灌注所導(dǎo)致的心肌損傷，縮小心肌梗死面積。
實(shí)驗(yàn)方法90只體重為250到300克的Wistar大鼠隨機(jī)分為以下3組后給予藥物/溶劑灌胃1、假手術(shù)組每日1次給予植物油(1毫升/公斤體重)。
2、缺血再灌注組每日1次給予植物油(1毫升/公斤體重)。
3、缺血再灌注+鉤藤醇提取物組每日1次給予鉤藤醇提取物的植物油混懸劑(劑量100毫克/公斤體重；混懸劑濃度100毫克/毫升)。
所述3組大鼠按以上述方案每日給予藥物或溶劑1次，連續(xù)7天后，行假手術(shù)或冠狀動脈阻斷術(shù)。冠狀動脈阻斷30分鐘后再灌注48小時(shí)后，測定心肌梗死面積。
大鼠缺血再灌注術(shù)是在麻醉后作氣管插管人工機(jī)械通氣的條件下進(jìn)行的。開胸后，在距離肺動脈起始部2-3毫米處以6-0絲線將冠狀動脈左前降支結(jié)扎(結(jié)扎時(shí)置一小段塑料管與冠狀動脈一起結(jié)扎，以便于在隨后的復(fù)灌中剪開結(jié)扎線)。在冠脈血流被阻斷后，即刻可見左室游離壁出現(xiàn)蒼白的外觀，尤以心尖部為明顯；缺血區(qū)的自主運(yùn)動消失，向外有膨出，并隨左心室的搏動而作反向被動運(yùn)動，缺血區(qū)周邊有一條充血帶。阻斷冠脈血流30分鐘后，在靠近與冠狀動脈一起被結(jié)扎的塑料管處(注意不剪及心肌組織)剪斷結(jié)扎線，使冠脈血流恢復(fù)(即再灌注)。在假手術(shù)組動物，則在冠狀動脈旁的心肌組織上作一不影響冠脈血流的結(jié)扎。手術(shù)后縫合腹腔及皮膚。存活的大鼠于術(shù)后48小時(shí)檢測心肌梗死面積。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明鉤藤醇提取物能使缺血再灌注大鼠心肌梗死的面積明顯縮小，具有抗心肌梗死作用，P＜0.01；其中，缺血再灌注組，n＝19；缺血再灌注+鉤藤醇提取物組，n＝22。
表1是各組大鼠手術(shù)后48小時(shí)的生存率(％)。
表1

(二)抑制成纖維細(xì)胞增生，抗組織器官纖維化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法心臟成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)材料0～2日齡SD大鼠10只，雌雄不拘。
試劑小牛血清，DMEM-F12培養(yǎng)液，PBS，0.1％胰蛋白酶消化液。
1.先后用碘伏、75％乙醇消毒乳鼠皮膚，開胸取心臟；2.將心臟放入冷PBS液中，漂凈殘留的積血，去除附著的結(jié)締組織；3.吸去PBS，更換少量的胰蛋白酶(0.1％)溶液，將心臟制成1mm3大??；4.將組織塊轉(zhuǎn)移到50ml三角燒杯中，加胰蛋白酶(0.1％)溶液至10ml，放入磁力攪拌子，37℃水浴消化10min，棄上清，重復(fù)一次；5.在組織塊中加入12ml胰蛋白酶(0.1％)溶液，37℃水浴消化15min，①取上層消化液，加適量小牛血清終止消化，1500rpm離心10min，棄上清，沉淀用含10％小牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液重懸；②在沉淀的組織中再加入胰蛋白酶(0.1％)消化，重復(fù)以上步驟，至組織塊基本消化完全；6.收集各次消化所得的細(xì)胞懸液，接種到50ml培養(yǎng)瓶中，每瓶10ml；7.培養(yǎng)1h后換液，貼壁者為成纖維細(xì)胞，未貼壁者繼續(xù)培養(yǎng)可得心肌細(xì)胞。
活細(xì)胞生長曲線測定試劑KHR98(100mg/ml)，用DMSO配制，開博通(2mg/ml)，研碎后用DMEM培養(yǎng)液配制，DMEM或1640培養(yǎng)液。
方法KHR98大劑量(0.1mg/ml)、KHR98中劑量(0.05mg/ml)、KHR98小劑量(0.025mg/ml)、DMSO溶劑對照(5μl/ml)、開博通(0.01mg/ml)、細(xì)胞對照組；1.消化培養(yǎng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度至1~4×104/ml；2.將細(xì)胞懸液接種于6塊96孔板，每組每塊板設(shè)5孔，每孔200μl細(xì)胞懸液；3.每組每塊板另設(shè)一個(gè)空白孔，不含細(xì)胞，培養(yǎng)液同實(shí)驗(yàn)孔；4.各組加相應(yīng)劑量的藥物，KHR98各組、DMSO組、開博通組；5.每兩天換液一次，同時(shí)加相應(yīng)藥物；6.用MTT比色法每天測定一塊96孔板；測定前每孔加MTT(5mg/ml)20μl，孵育4h后，吸棄孔內(nèi)液體，加150μlDMSO，振蕩10min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上于490nm波長進(jìn)行比色測定；7.將每天測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，繪制生長曲線。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明鉤藤醇提取物對培養(yǎng)的大鼠心臟成纖維細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。證實(shí)本發(fā)明鉤藤醇提取物可以通過抑制心臟成纖維細(xì)胞的增殖而抑制心肌間質(zhì)的纖維化。鑒于高血壓等心血管疾病可導(dǎo)致心臟成纖維細(xì)胞的增殖，繼而發(fā)生纖維化，從而對心臟產(chǎn)生損害作用，其表現(xiàn)為降低心肌的順應(yīng)性，干擾心肌的收縮、舒張運(yùn)動并增加心肌耗氧量；心臟纖維化還可發(fā)生在心肌內(nèi)小動脈周圍，并以血管為中心而發(fā)生，從而壓迫心肌內(nèi)小動脈，使其血流量降低，造成心肌缺血，是一種完全不同于冠狀動脈粥樣硬化造成心肌缺血的發(fā)病機(jī)制，針對冠心病的傳統(tǒng)治療方法，如抗凝、溶栓、冠狀動脈內(nèi)介入手術(shù)等對上述病因的冠狀動脈缺血是無效的。因此，本發(fā)明的突出貢獻(xiàn)體現(xiàn)在用鉤藤醇提取物防治冠狀動脈血管周圍纖維化的新療法，對于心臟成纖維細(xì)胞增殖的抑制也可增加心肌的順應(yīng)性，從而改善心肌的收縮、舒張功能。
表2是心臟成纖維細(xì)胞生長曲線(mtt法)。
表2心臟成纖維細(xì)胞生長曲線(mtt法)

(三)抑制血管平滑肌細(xì)胞的增生，抑制血管壁肥厚實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法主動脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)材料新西蘭大耳白兔1只試劑小牛血清，DMEM培養(yǎng)液，D-Hanks平衡鹽溶液方法將新鮮實(shí)驗(yàn)家兔主動脈放入D-Hanks液中(內(nèi)含青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml)；1.在超凈臺內(nèi)，用D-Hanks液洗去殘血，剝離血管外結(jié)締組織；2.將血管剪開，用鑷子撕去外膜，盡量去除干凈；3.將剝?nèi)ネ饽さ难苷蛊剑描囎逾g部在內(nèi)膜面輕輕刮去內(nèi)皮細(xì)胞；4.取血管中膜，用眼科剪剪碎，滴加1～2滴小牛血清保持濕潤；5.將剪碎的組織接種到培養(yǎng)瓶中，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊朝上，加入含20％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液；
6.37℃，CO2培養(yǎng)箱干涸培養(yǎng)3～4h，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液浸沒組織塊，4～7天后可見細(xì)胞從組織塊爬出，長滿后傳代。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明鉤藤醇提取物對血管平滑肌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。現(xiàn)有技術(shù)已證明，高血壓等心血管疾病均會引起全身重要臟器內(nèi)小動脈壁血管平滑肌細(xì)胞增生，繼而導(dǎo)致血管壁肥厚、管腔狹窄，造成血供障礙，從而產(chǎn)生對心、腦、腎、大血管等重要臟器的損害，成為高血壓等心血管疾病致殘和致死的另一重要原因。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)鉤藤醇提取物具有抑制血管平滑肌細(xì)胞增生的作用，具有防治因血管平滑肌細(xì)胞增生而導(dǎo)致心血管疾病的新功能。
表3是平滑肌細(xì)胞生長曲線(mtt法，490nm)。
表3平滑肌細(xì)胞生長曲線(mtt法，490nm)

(四)抗氧化，清除自由基，保護(hù)靶器官實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法ABTS(2，2’-azinobis[3-ethylbenzothiazoline 6-sulphonate])試驗(yàn)A.實(shí)驗(yàn)材料a)藥物及試劑丹參對照品，用10倍體積的三蒸水在95℃條件下回流提取1小時(shí)，連續(xù)3次，合并濾液，60℃減壓濃縮而得；ABTS、Trolox、K2S2O8均購自Sigma公司b)實(shí)驗(yàn)儀器紫外分光光度計(jì)，Beckman DU6408型。
B.實(shí)驗(yàn)方法稱取1.25mg Trolox溶于2ml三蒸水中得2mM Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，再以1∶10倍稀釋，得到1mM標(biāo)準(zhǔn)品；取38.41mg ABTS溶于9.5ml三蒸水中得7mM ABTS溶液；取33.11mg K2S2O8溶于5ml水中得24.5mM K2S2O8。取1ml 24.5mM K2S2O8加入9mi 7mM ABTS中，混勻后避光置室溫中12小時(shí)，取上述混合液1ml加入79ml 10mM，pH 7.4的磷酸緩沖液中，即為ABTS+溶液。按以下方法在733nm波長處測定紫外吸收值(Abs 733)a)空白管1mlABTS+溶液，b)基礎(chǔ)吸收管在980μl ABTS+溶液中分別加入20μl磷酸緩沖液，c)標(biāo)準(zhǔn)管在980μl ABTS+溶液中分別加入20μl 1mM Trolox，d)樣品管在980μl ABTS+溶液中分別加入20μl本發(fā)明鉤藤醇提取物(5mg/ml)或丹參水提取物溶液(5mg/ml)，各管均在管內(nèi)溶液總量達(dá)1ml后的3分鐘時(shí)測定Abs733。樣品管備同樣的二管，分別測定Abs733。
待測藥物的清除自由基能力以“與Trolox相當(dāng)?shù)目寡趸钚?Trolox equivalentantioxidant capacity，TEAC)”表示。
3.計(jì)算I＝(基礎(chǔ)吸收管Abs733-樣品管Abs733)II＝(基礎(chǔ)吸收管Abs733-標(biāo)準(zhǔn)管Abs733)TEAC＝(I/II)×藥物的稀釋系數(shù)*×100％*(所述實(shí)驗(yàn)的藥物稀釋系數(shù)為50)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明鉤藤醇提取物具有在抗氧化方面的新功能，其抗氧化活性比已被大量研究證實(shí)為強(qiáng)抗氧化劑的丹參水提取物還要高。
氧化應(yīng)激已被大量實(shí)驗(yàn)證明是人體內(nèi)重要靶器官損傷的又一獨(dú)立的危險(xiǎn)因子。在高血壓、心衰等心血管疾病，以及糖尿病等代謝性疾病中都伴有氧化應(yīng)激的現(xiàn)象，氧化應(yīng)激是這些疾病中人體重要靶器官損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。因此，本發(fā)明的另一突出貢獻(xiàn)是證實(shí)了鉤藤醇提取物可以對抗氧化應(yīng)激，從而保護(hù)靶器官免受氧自由基的損害，可制備新型抗靶器官損傷藥物。
(五)抑制腎臟成纖維細(xì)胞增生，抑制腎小球纖維化，防治腎功能衰竭實(shí)驗(yàn)方法腎小球系膜細(xì)胞的培養(yǎng)材料150～180g SD大鼠2只，試劑小牛血清，RPMI1640培養(yǎng)液，胰島素(1mg/ml)，膠原酶Ⅳ型(0.1％)，D-Hanks平衡鹽溶液，方法1.無菌條件下取實(shí)驗(yàn)動物腎臟；2.剔取腎皮質(zhì)，用D-Hanks液沖洗干凈；3.在一100ml干凈燒杯上疊放3個(gè)細(xì)胞篩網(wǎng)，從上到下依次為80目、150目和200目；4.將腎皮質(zhì)剪碎，置于80目篩網(wǎng)，用注射器針蕊研磨，并不時(shí)用D-Hanks液沖洗，至研磨完全；5.取200目篩網(wǎng)上截留物，先后用D-Hanks液和1640培養(yǎng)液沖洗。鏡檢，絕大部分為脫去了腎小囊的腎小球；6.將上述腎小球置于0.1％IV型膠原酶溶液中，37℃消化15～20min；7.1000rpm離心10min，棄上清，再用1640培養(yǎng)液洗一次；8.用含20％小牛血清的1640培養(yǎng)液懸浮消化后的腎小球，接種于塑料培養(yǎng)瓶，添加胰島素，終濃度為5μg/ml；9.靜置培養(yǎng)，3～4天腎小球貼壁，系膜細(xì)胞從小球中長出；10.4～6天后首次更換培養(yǎng)液，約2周時(shí)系膜細(xì)胞布滿瓶底進(jìn)行傳代。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明鉤藤醇提取物具有抑制腎臟系膜細(xì)胞增殖的作用，其效應(yīng)呈劑量依賴性。腎小球纖維化是高血壓、糖尿病等慢性全身疾病導(dǎo)致腎功能衰竭過程中的共同病理變化，是一種獨(dú)立的重要危險(xiǎn)因素。腎臟系膜細(xì)胞增殖是形成腎小球纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。抑制腎臟系膜細(xì)胞的增殖已被證明可以有效抑制腎小球纖維化過程，從而防治腎功能衰竭。本發(fā)明證明鉤藤醇提取物具有抑制腎臟系膜細(xì)胞增殖的新功能，可制備防治腎小球纖維化和繼發(fā)的腎功能衰竭的藥物。
表4是系膜細(xì)胞生長曲線(mtt法--波長490nm)。
表4系膜細(xì)胞生長曲線(mtt法--波長490nm)

權(quán)利要求
1.鉤藤醇提取物，其特征是通過下述方法制備1)取正品鉤藤，粉碎后加濃度大于70％的乙醇，加熱提取數(shù)次，過濾，合并濾液；2)濾液減壓濃縮成稠浸膏，加0.1-10％鹽酸溶解、洗滌，取濾液；3)堿性條件下，濾液加氯仿數(shù)次萃取后合并氯仿液；4)將氯仿液減壓濃縮后即得鉤藤醇提取物。
2.按權(quán)利要求1的鉤藤醇提取物在制備靶器官保護(hù)藥物中的用途。
3.按權(quán)利要求2的用途，其中所述的靶器官是心血管和/或腎臟。
4.按權(quán)利要求2的用途，其中所述的靶器官保護(hù)是對抗缺血-再灌注所導(dǎo)致的心肌損傷，縮小心肌梗死面積。
5.按權(quán)利要求2的用途，其中所述的靶器官保護(hù)是抑制成纖維細(xì)胞增生，抗組織器官纖維化。
6.按權(quán)利要求2的用途，其中所述的靶器官保護(hù)是抑制血管平滑肌細(xì)胞增生，抑制血管壁肥厚。
7.按權(quán)利要求2的用途，其中所述的靶器官保護(hù)是抗氧化，清除自由基。
8.按權(quán)利要求2的用途，其中所述的靶器官保護(hù)是抑制腎臟成纖維細(xì)胞增生，抑制腎小球纖維化，防治腎功能衰竭。
全文摘要
本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及鉤藤醇提取物及其在制備靶器官保護(hù)藥物中的新用途。本發(fā)明經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，所制得的鉤藤醇提取物具有靶器官保護(hù)的作用，包括對抗缺血－再灌注所導(dǎo)致的心肌損傷，縮小心肌梗死面積；抑制成纖維細(xì)胞增生，抗組織器官纖維化；抑制血管平滑肌細(xì)胞增生，抑制血管壁肥厚；抗氧化，清除自由基，從而保護(hù)靶器官；抑制腎臟成纖維細(xì)胞增生和/或抑制腎小球纖維化。本發(fā)明鉤藤醇提取物可作為藥物制劑的原料進(jìn)一步制備靶器官保護(hù)藥物，涉及保護(hù)心血管和/或防治腎功能衰竭的藥物。
文檔編號A61P39/06GK1939453SQ20061011651
公開日2007年4月4日 申請日期2006年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月26日
發(fā)明者朱依純, 朱依諄, 姚泰 申請人:復(fù)旦大學(xué)