專利名稱：：增加胰島素敏感性的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)和藥學領(lǐng)域，具體涉及一種增加胰島素敏感性的方法和組合物。
背景技術(shù)：
：全世界糖尿病的人數(shù)目前已增加至1.7億，預計至2030年這一數(shù)字將達到3.6億，嚴重威脅人類健康。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗(InsulinResistance,IR)是II型糖尿病的主要病理特征，其原因是胰島素分泌相對不足及胰島素作用環(huán)節(jié)障礙所致。所以，通過增強胰島素刺激的葡萄糖利用，減少脂肪酸氧化代謝，抑制肝糖輸出而增加胰島素的敏感性是一條有效的治療II型糖尿病的途徑。目前，增強胰島素敏感性的藥物主要包括噻唑烷二酮類、胰高血糖素受體拮抗劑及雙胍類降血糖藥。噻唑烷二酮類是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新型胰島素增敏劑，代表藥有曲格列酮(Troglitazone)，羅格列酮(Rosiglitazone)和吡格列酮(Pioglitazone)。該類藥物的作用靶點是核過氧化物酶-增殖體活化受體(PPAR7)。但此類藥物在有效地降低血糖、增強胰島素敏感性的同時，往往會誘發(fā)低血糖、體重增加和肝功能受損等副作用(Yki-J&rvinenH.Thiazolidinediones.NEngJMed2004351:1106-1118)。胰高血糖素是由29個氨基酸組成的多肽，生理作用為促進肝糖元分解、異生和脂肪分解，其受體拮抗劑可阻斷其上述作用，從而增強胰島素敏感性(OureshiSA等，Anovelglucagonsreceptorantagonistinhibitsglucagons國mediatedbiologicaleffects.Diabetes200453:3267-3473)。目前研究發(fā)現(xiàn)胰高血糖素受體拮抗劑主要為釩類化合物，但該類藥物在骨骼、腎臟和肝臟易產(chǎn)生蓄積，并引起嘔吐、脫水等不良反應。雙胍類口服降血糖藥主要有二甲雙胍，苯乙雙胍和丁雙胍，其作用機理主要通過加強外圍組織對胰島素的敏感性，增加外圍組織對葡萄糖的攝取，減少肝中糖原異生。乳酸性中毒是雙胍類藥物主要的潛在不良反應，苯乙雙胍和丁雙胍就是由于這種嚴重的不良反應而停止銷售。因此，本領(lǐng)域還需要尋找新的具有更高的生物安全性的提高胰島素敏感性的藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種SIRT1蛋白或其激動劑或上調(diào)劑的新用途。在本發(fā)明的第一方面，提供一種SIRT1蛋白或其激動劑或上調(diào)劑的用途，其特征在于，用于制備提高胰島素敏感性的組合物。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述SIRT1蛋白或其激動劑或上調(diào)劑用于制備胰島素抵抗情況下提高胰島素敏感性的組合物。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的SIRT1蛋白或其激動劑或上調(diào)劑還用于制備抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-lB轉(zhuǎn)錄或表達的組合物。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述組合物用于治療胰島素敏感性下降相關(guān)的疾病。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的胰島素敏感性下降相關(guān)的疾病包括(但不限于)胰島素抵抗、2型糖尿病、高胰島素血癥、糖尿病酮癥酸中毒、高滲性非酮癥糖尿病昏迷、乳酸性酸中毒。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的SIRT1蛋白的激動劑或上調(diào)劑選自白藜蘆醇或其類似物、紫鉚因(Butein)、異甘草素(Isoliquiritigenin)、漆黃素(Fisetin)、或四羥反式芪(Piceata腸l;3,4，3，5-羥基苯乙烯)。在本發(fā)明的第二方面，提供一種篩選可用于提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括將候選物質(zhì)與表達SIRT1蛋白的體系接觸，檢測候選物質(zhì)對SIRT1蛋白的影響；若所述候選物質(zhì)可提高SIRT1蛋白的表達或促進SIRT1蛋白的活性，則表明該候選物質(zhì)是可用于提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述方法還包括觀察體系中蛋白酪氨酸磷酸酶-IB的表達情況或活性，若蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的表達或活性降低，則表明該候選物質(zhì)是可用于提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的體系選自溶液體系、亞細胞體系、細胞體系、組織體系、器官體系、或動物體系。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的方法包括以下步驟(a)在測試組中，在可以表達或已經(jīng)表達SIRT1蛋白的體系中添加候選物質(zhì)，并檢測SIRT1蛋白的表達情況或活性，并且，在對照組中，在不添加所述候選物質(zhì)的、在可以表達或已經(jīng)表達SIRT1蛋白的體系中，檢測SIRT1蛋白的表達情況或活性，(b)將步驟(a)測試組中SIRTl蛋白的表達情況或活性與對照組中SIRTl蛋白的表達情況或活性進行比較，如果測試組中SIRT1蛋白的表達或活性在統(tǒng)計學上高于(優(yōu)選顯著高于，如高15%;更優(yōu)選的，高30%)對照組，就表明該候選物質(zhì)是可用于提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的第三方面，提供一種通過所述的方法獲得的可用于提高胰島素敏感性的物質(zhì)。在本發(fā)明的第四方面，提供一種組合物，所述的組合物含有(i)有效量(如0.00001-0.1克/60千克體重/天)的SIRTl蛋白或其激動劑或上調(diào)劑；(ii)有效量(如0.0005-0.1克/60千克體重/天)的選自下組的物質(zhì)雙胍類糖尿病藥物、磺酰脲類糖尿病藥物、葡萄糖苷酶抑制劑類藥物、胰島素增敏類藥物、醛糖還原酶抑制劑類藥物、促胰島素釋放類藥物；以及(iii)藥學上或食品學上可接受的載體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的雙胍類糖尿病藥物包括(但不限于)二甲雙胍、或苯乙雙胍。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的磺酰脲類糖尿病藥物包括(但不限于)格列本脲、格列吡嗪、格列齊持、格列波脲、格列美脲、或格列喹酮。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的葡萄糖苷酶抑制劑類藥物包括(但不限于)阿卡波糖(acarbose)、伏格利波糖(vokibose)、或米格列醇(migkitok)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的胰島素增敏類藥物包括(但不限于)環(huán)格列酮(cigktazone)、曲格列酮(trogkitazone)、羅格列酮(rosigkitazone)、或吡格列酮(piogkitazone)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的醛糖還原酶抑制劑類藥物包括(但不限于)阿司他丁(akrestain)、依巾白司他(印akrestat)、波拉司他(ponakrestat)、或托瑞司他(tokrestat)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的促胰島素釋放類藥物包括(但不限于)瑞格列奈(repagkinide)、或那格列奈(nategkinide)。另一方面，本發(fā)明還提供一種提高胰島素敏感性的方法，所述的方法包括上調(diào)受試者體內(nèi)(更優(yōu)選的為肌肉、肝臟或脂肪內(nèi))的SIRT1蛋白的活性或表達水平。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1A顯示了C2C12細胞經(jīng)棕櫚酸誘導后產(chǎn)生胰島素抵抗；圖1B顯示了SIRT1蛋白在胰島素抵抗的C2C12細胞中下降；圖1C為B圖數(shù)量化表示；圖1D顯示了HepG2細胞經(jīng)葡萄糖胺誘導后產(chǎn)生胰島素抵抗；圖1E顯示了SIRT1蛋白在胰島素抵抗的HepG2細胞中下降；圖1F顯示了E圖數(shù)量化表示；(*p<0.05;**p<0.01，Student'sTest;NS表示不顯著)。圖2A顯示了慢病毒(Lentivirus)感染HepG2細胞照片；圖2B顯示了慢病毒介導的SIRT1表達下降；圖2C顯示了SIRT1表達下降導致胰島素受體磷酸化水平降低；圖2D顯示了SIRT1表達下降阻止了胰島素誘導的糖元合成；圖2E顯示了SIRTl抑制劑Sirtinol阻止了胰島素誘導的糖元合成。(**，##p<0.01，Student'sTest;NS表示不顯著)。圖3A顯示了正常情況下上調(diào)SIRT1蛋白水平對葡萄糖攝入沒有影響；圖3B顯示了胰島素抵抗情況下，上調(diào)SIRT1蛋白水平可促進葡萄糖的攝入；圖3C顯示了SIRT1蛋白水平上調(diào)對胰島素激活信號的影響。(*p<0.05，與沒加胰島素和HSV-SIRT1病毒組相比；#p<0.05，與單加胰島素組相比；Student'sTest)圖4A顯示了正常情況下白藜戸醇處理促進了葡萄糖攝入；圖4B顯示了胰島素抵抗情況下白藜蘆醇處理促進了葡萄糖的攝入；圖4C顯示了白藜蘆醇處理對胰島素激活信號的影響。(*p<0.05，與沒加胰島素和HSV-SIRT1病毒組相比；#p<0.05,##p<0.01，與單加胰島素組相比。Student'sTest)。圖5顯示了SIRT1RNAi病毒可以下調(diào)SIRTl蛋白水平0p<0.05,**p<0.01，與對照病毒無白藜蘆醇處理組相比.Student'sTest)。圖6A顯示了胰島素抵抗情況下SIRT1蛋白水平上調(diào)可降低PTP-1B蛋白水平；圖6B顯示了胰島素抵抗情況下SIRTl蛋白水平上調(diào)可降低PTP-lBmRNA水平；圖6C顯示了白藜戸醇處理降低了PTP-1B蛋白水平；圖6D顯示了白藜蘆醇處理降低了PTP-lB的mRNA水平；圖6E為對圖6B各PTP-1BmRNA檢測條帶的量化；圖6F為對圖6D各PTP-1BmRNA檢測條帶的量化(*p<0.05;**p<0.01，與單獨胰島素處理相比。Student'sTest)。圖7A顯示了皰疹病毒(HSV)介導的PTP-1B蛋白水平上調(diào)；圖7B顯示了PTP-1B蛋白水平上調(diào)逆轉(zhuǎn)了SIRT1蛋白水平上調(diào)導致的葡萄糖攝入升高^p〈0.05，與無病毒無胰島素處理組相比；將p〈0.01，與胰島素和SIRT1病毒處理組相比。Student'sTest)。圖8A顯示了白藜產(chǎn)醇可以抑制高脂誘導的高胰島素血癥；圖8B顯示了白藜戶醇可以改善高脂誘導的葡萄糖耐受；圖8C顯示了白藜蘆醇可以改善高脂誘導的胰島素耐受；圖8D顯示了白藜蘆醇可以降低高脂誘導的總膽固醇水平升高；圖8E顯示了白藜蘆醇可以降低高脂誘導的低密度脂蛋白水平升高(印<0.05，**p<0.01，與高脂組相比)。具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次論證了SIRT1(Sirtuin1)能夠提高胰島素的敏感性，其可用于預防或治療由蛋白酪氨酸磷酸酶-lB表達異常(特別是表達升高)或活性異常(特別是活性提高)、或胰島素敏感性降低引起的相關(guān)疾病?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。具體地，本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)SIRT1能夠降低蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)的表達，且能夠提高胰島素敏感性。更特別的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，SIRT1不增強正常情況下的胰島素敏感性，僅當產(chǎn)生胰島素抵抗時才可以增加胰島素的敏感性。這樣通過上調(diào)SIRT1蛋白的水平或活性來增強胰島素的敏感性，不易產(chǎn)生胰島素敏感性過高導致的低血糖等副作用，因此具有更高的生物安全性和更低的副作用。同時，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，SIRTl蛋白激動劑白藜蘆醇(Resveratrol)，不僅可以激活SIRT1并且也可以上調(diào)SIRT1的蛋白水平。同時動物實驗也顯示白藜戸醇可以顯著緩解糖尿病的癥狀，包括降低血糖、下調(diào)過高的胰島素、膽固醇和低密度脂蛋白水平。白藜蘆醇是一種食品中存在的天然化合物，安全性較高，可以直接添加在食品或飲料中口服。并且，本發(fā)明人對劑量的研究發(fā)現(xiàn)，白藜^醇對于防治胰島素敏感性降低相關(guān)疾病的有效濃度大大低于以往白藜^醇用于防治腫瘤和心血管疾病的濃度。有效濃度的較低一方面大大降低產(chǎn)品成本，另一方面可以增加產(chǎn)品的安全性。深入的研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1和白藜蘆醇對于胰島素的主要靶組織脂肪、肌肉和肝臟都有增強胰島素的敏感性的作用，作用范圍較廣，更加有利增強不同組織的胰島素的敏感性。并且對于白藜蘆醇來說，在增加胰島素敏感性的同時不但不會增加體重，反而還有較好的減肥作用。SIRT1(Sirtuin1)SIRT1是一種廣泛存在于生物體中、高度保守的、依賴于NAD+的組蛋白去乙酰化酶。以往，SIRT1因具有可延長果蠅、線蟲壽命的活性而引起廣泛關(guān)注(Blander,G.和Guarente，L.2004.THESIR2FAMILYOFPROTEINDEACETYLASES.^"應/ieWewo/^oc/zem—73:417-435.)。在本發(fā)明中，所用的SIRT1蛋白可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自哺乳動物。此外，所述的SIRT1蛋白也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因工程重組技術(shù)來生產(chǎn)重組SIRT1蛋白。優(yōu)選的，本發(fā)明可采用重組的SIRTl蛋白。任何適合的SIRT1蛋白均可用于本發(fā)明。所述的SIRTl蛋白包括全長的SIRT1蛋白或其生物活性片段。優(yōu)選的，所述的SIRTl蛋白的氨基酸序列可以與GenBank登錄號NM012238(PubMed)所示的序列基本上相同。經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的SIRTl蛋白的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。SIRTl蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實施并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認識到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。見Watson等MolecularBiologyofTheGene，第四版，1987，TheBenjamin/CummingsPub.Co.P224。任何一種SIRT1蛋白的生物活性片段都可以應用到本發(fā)明中。在這里，SIRT1蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的SIRT1蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持5(m的全長SIRTl蛋白的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長SIRT1蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的SIRT1蛋白，比如，可采用為了促進其半衰期、有效性、代謝、和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的SIRTl蛋白。所述經(jīng)過修飾或改良的SIRT1蛋白可以是一種SIRT1蛋白的共軛物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述經(jīng)過修飾或改良的SIRT1蛋白可以是與天然存在的SIRT1蛋白具有較小的共同點，但也能提高哺乳動物的胰島素敏感性，且不會帶來其它不良影響或毒性。也就是說，任何不影響SIRT1蛋白的生物活性的變化形式都可用于本發(fā)明中。SIRT1的用途基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了SIRT1蛋白或其激動劑或上調(diào)劑的用途，用于制備提高胰島素敏感性的組合物；或用于篩選提高胰島素敏感性的物質(zhì)。優(yōu)選的，所述的SIRT1蛋白或其激動劑或上調(diào)劑還用于制備抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-lB轉(zhuǎn)錄或表達的組合物。優(yōu)選的，所述SIRT1蛋白、其激動劑或上調(diào)劑、或含有上述成份的組合物可用于治療胰島素敏感性下降相關(guān)的疾病。更優(yōu)選的，所述的胰島素敏感性下降相關(guān)的疾病包括胰島素抵抗、2型糖尿病、高胰島素血癥以及胰島素抵抗導致的其它相關(guān)疾病，如糖尿病酮癥酸中毒、高滲性非酮癥糖尿病昏迷、乳酸性酸中毒。例如，所述的SIRT1蛋白或其激動劑或上調(diào)劑可用于(i)制備降低蛋白酪氨酸磷酸酶-lB表達的藥物或食物；(ii)制備增加胰島素敏感性的藥物或食物(更優(yōu)選的，制備胰島素抵抗情況下增加胰島素敏感性的藥物或食物)；或(iii)制備預防或治療胰島素抵抗或胰島素抵抗相關(guān)代謝疾病的藥物或食物。為了論證SIRT1的上述用途，本發(fā)明人以C2C12細胞和H印G2細胞為細胞模型進行研究，發(fā)現(xiàn)①下調(diào)SIRT1水平可導致胰島素抵抗的發(fā)生；②上調(diào)SIRT1蛋白水平對正常情況下的葡萄糖攝入量和胰島素激活信號無影響，但可以顯著增強胰島素抵抗情況下葡萄糖攝入和胰島素激活信號；③經(jīng)過白藜蘆醇處理(即使SIRT1活性提高或表達增加)后，促進細胞對于葡萄糖的攝入，且增強了胰島素激活信號；④白藜蘆醇增強肝細胞糖原合成需要SIRT1的參與。這些結(jié)果均證明SIRT1蛋白能夠增強胰島素抵抗情況下胰島素的敏感性，從而可用于預防或治療胰島素敏感性下降相關(guān)的疾病。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在胰島素抵抗情況下，上調(diào)SIRT1蛋白水平或白藜蘆醇處理(g卩使SIRT1活性提高或表達增加)可降低蛋白酪氨酸磷酸酶-lB(PTP-lB)蛋白和mRNA水平。而PTP-1B本身是一種胰島素信號的負性調(diào)節(jié)因子，與肥胖癥和2型糖尿病等代謝類疾病的發(fā)病及發(fā)展關(guān)系密切，對PTP-1B基因敲除小鼠的研究表明，缺失PTP-1B小鼠的胰島素敏感性明顯增加。因此證明，可通過采用SIRT1蛋白來下調(diào)PTP-1B蛋白的表達或活性，從而達到提高胰島素敏感性的目的。此外，本發(fā)明人用高脂誘導C57/BL6小鼠胰島素抵抗模型，研究白藜盧醇的服用(即使SIRT1活性提高或表達增加)對于胰島素敏感性等糖尿病相關(guān)癥狀的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇的服用可以抑制高脂誘導的高胰島素血癥、改善高脂誘導的葡萄糖耐受、改善高脂誘導的胰島素耐受、降低高脂誘導的總膽固醇水平升高、以及降低高脂誘導的低密度脂蛋白水平升高。這些結(jié)果均證明，白藜蘆醇的施用、或SIRT1表達水平或活性的提高均能夠達到緩解胰島素敏感性等糖尿病相關(guān)癥狀的目的。SIRT1的激動劑或上調(diào)劑及其用途任何可提高SIRT1蛋白的活性、維持SIRT1蛋白的穩(wěn)定性、促進SIRT1蛋白的表達、延長SIRT1蛋白有效作用時間、或促進SIRT1的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為可用于提高胰島素敏感性的有效物質(zhì)。優(yōu)選的，所述的SIRT1蛋白的激動劑或上調(diào)劑包括(但不限于)白藜戸醇及白藜蘆醇類似物，如紫鉚因(butein)、異甘草素(isoliquiritigenin)、漆黃素(fisetin)、或四羥反式甚(Piceatannol;3，4,3，5-羥基苯乙烯)。由于SIRT1的激動劑或上調(diào)劑可促進SIRT1的表達和/或提高SIRT1的活性，因此，所述的SIRT1的激動劑或上調(diào)劑也可通過對SIRT1的影響來調(diào)節(jié)胰島素的敏感性，達到預防或治療胰島素敏感性下降相關(guān)疾病的目的。組合物本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.0000-0.01克/60千克體重/天:優(yōu)選的，為0.0001-0.005克/60千克體重/天)的所述的SIRTl蛋白或其激動劑(如白藜聲醇)或上調(diào)劑，以及藥學上或食品學上可接受的載體。本發(fā)明的組合物可直接用于胰島素敏感性下降相關(guān)疾病的預防或治療。此外，還可同時與其它治療劑或輔劑聯(lián)合使用。優(yōu)選的，所述的組合物中同時含有有效量的SIRT1蛋白和白藜蘆醇。優(yōu)選的，所述的組合物還含有有效量(如0.0005-0.1克/60千克體重/天；優(yōu)選的，為0.001-0.05克/60千克體重沃)的選自下組的物質(zhì)雙胍類糖尿病藥物、磺酰脲類糖尿病藥物、葡萄糖苷酶抑制劑類藥物、胰島素增敏類藥物、醛糖還原酶抑制劑類藥物、促胰島素釋放類藥物。作為優(yōu)選方式，所述的雙胍類糖尿病藥物包括(但不限于)二甲雙胍、或苯乙雙胍；或者，所述的磺酰脲類糖尿病藥物包括(但不限于)格列本脲、格列吡嗪、格列齊持、格列波脲、格列美脲、或格列喹酮；或者，所述的葡萄糖苷酶抑制劑類藥物包括(但不限于)阿卡波糖(acarbose)、伏格利波糖(vokibose)、或米格列醇(migkitok);或者，所述的胰島素增敏類藥物包括(但不限于)環(huán)格列酮(cigkteizone)、曲格歹,(trogkitazone)、羅格歹U酮(rosigkitazone)、或批格列酮(piogkitazone)或者，所述的醛糖還原酶抑制劑類藥物包括(但不限于)阿司他丁(akrestain)、依帕司他(印akrestat)、波拉司他(ponakrestat)、或托瑞司他(tokrestat);或者，所述的促胰島素釋放類藥物包括(但不限于)瑞格列奈(repagkinide)、或那格列奈(nategkinide)。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。如本文所用，術(shù)語"含有"表示各種成分可一起應用于本發(fā)明的混合物或組合物中。因此，術(shù)語"主要由...組成"和"由...組成"包含在術(shù)語"含有"中。如本文所用，術(shù)語"有效量"或"有效劑量"是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。如本文所用，"藥學上可接受的"的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態(tài)反應)的，即具有合理的效益/風險比的物質(zhì)。術(shù)語"藥學上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.,N.J.1991)中可找到關(guān)于藥學上可接受的載體的充分說明。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。本發(fā)明的組合物含有安全有效量的SIRTl蛋白以及藥學上可接受的載體。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應與給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。本發(fā)明的組合物還可作為一種食物或膳食添加劑，直接服用或添加到其它食品中服用。優(yōu)選的，所述的"食品上學可接受的載體"選自填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、矯味劑、包覆材料、膳食制品、賦形劑、或緩/控釋劑。提髙胰島素敏感性的方法以及給藥方式本發(fā)明提供了一種提高胰島素敏感性(如預防或治療胰島素敏感性下降相關(guān)疾病)的方法，包括給予受試者有效量的SIRT1蛋白或可表達SIRT1蛋白的系統(tǒng)(如細胞或病毒)。當用于治療人的胰島素敏感性下降相關(guān)疾病時，優(yōu)選采用重組的SIRTl蛋白。應理解，當用于治療哺乳動物胰島素敏感性下降相關(guān)疾病時，所用的SIRTl的有效劑量可隨待治療的對象的嚴重程度而變化。具體情況根據(jù)受試者的個體情況來決定，這在熟練醫(yī)師或營養(yǎng)師可以判斷的范圍內(nèi)。在得知了所述的SIRT1蛋白的用途后，可以采用本領(lǐng)域熟知的多種方法來將所述的SIRT1蛋白或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動物。優(yōu)選的，可采用基因治療的手段進行，比如可直接將SIRT1蛋白通過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶SIRT1基因的表達單位(比如表達載體或病毒等)遞送到靶點上，并使之表達活性的SIRT1蛋白。作為本發(fā)明的一種實施方式，可將所述的SIRT1蛋白直接給藥于哺乳動物(比如人)，或者，可將編碼SIRT1蛋白的基因通過常規(guī)的方法克隆到適當?shù)妮d體(如常規(guī)原核或真核表達載體、或病毒載體如皰疹病毒載體或腺病毒載體)中，將所述的載體導入到可表達所述SIRT1蛋白的細胞中，使所述的細胞表達SIRT1蛋白?？赏ㄟ^將適量的所述細胞引入到哺乳動物身體的適當部位，實現(xiàn)體內(nèi)SIRT1蛋白的表達。優(yōu)選的，可將編碼SIRT1的基因或攜帶所述基因的載體通過常規(guī)的方法引入到耙細胞或靶組織中實現(xiàn)SIRT1蛋白的表達。所述的靶細胞包括但不限于肌肉細胞、肝臟細胞、脂肪細胞等；所述細胞可以轉(zhuǎn)移入哺乳動物身體的適當部位中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含SIRT1蛋白編碼基因的序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當基因序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CH0、C0S、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。所述的基因在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的畫A轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的蛋白。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組蛋白可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學'的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的方法在得知了所述的SIRT1蛋白的用途后，可以采用本領(lǐng)域熟知的多種方法來篩選提高胰島素敏感性的物質(zhì)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，提供一種篩選提高胰島素敏感性的物質(zhì)的方法，所述的方法包括將候選物質(zhì)與表達SIRT1蛋白的體系接觸，檢測候選物質(zhì)對SIRT1蛋白的影響；若所述候選物質(zhì)可提高SIRT1蛋白的表達或促進SIRT1蛋白的活性，則表明其是可用于提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。更優(yōu)選的，所述方法還包括觀察體系中蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的表達情況或活性，若蛋白酪氨酸磷酸酶-lB的表達或活性降低，則表明該候選物質(zhì)是可用于提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明中，所述的體系包括(但不限于)溶液體系、亞細胞體系、細胞體系、組織體系、器官體系、或動物體系。所述的體系中可含有SIRT1，用于在其中加入候選物質(zhì)，觀察候選物質(zhì)對SIRT1的影響；或者，所述的體系中可同時含有SIRT1以及PTP-1B，用于在其中加入候選物質(zhì)，同時觀察候選物質(zhì)對于SIRT1以及PTP-1B的影響。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠?qū)τ谔岣咭葝u素的敏感性有用的物質(zhì)。因此，本發(fā)明還包括通過所述的篩選方法獲得的物質(zhì)，所述的物質(zhì)可用于提高胰島素的敏感性。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)本發(fā)明首次證明了SIRT1可用于提高胰島素敏感性，揭示了SIRT1可下調(diào)胰島素信號的負性調(diào)節(jié)因子PTP-1B，為胰島素敏感性下降相關(guān)疾病的預防或治療提供了有效的新靶點。(2)本發(fā)明還證實，SIRT1不增強正常情況下的胰島素敏感性，僅當產(chǎn)生胰島素抵抗時才可以增加胰島素的敏感性，因此具有更高的生物安全性和更低的副作用。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，紐約冷泉港實驗室出版社)中所述的條件，或者按照制造廠商所建議的條件。I.通用材料和方法1、細胞培養(yǎng)C2C12細胞(購自美國ATCC)用DMEM培養(yǎng)基(高糖，內(nèi)含10%胎牛血清)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37'C，5%C02。當細胞長至50-60%時種板，長滿后換含2%馬血清的DMEM培養(yǎng)基誘導分化4天，即分化為成熟的肌肉細胞，用于以下實驗oHepG2細胞(購自美國ATCC公司)用DMEM培養(yǎng)基(高糖，內(nèi)含10%胎牛血清)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37'C，5%C02。長至70-80%時用胰酶消化種板，備用。2、胰島素抵抗誘導C2C12細胞用內(nèi)含棕櫚酸(7.5mM)的高糖DMEM培養(yǎng)液誘導18h，使之產(chǎn)生胰島素抵抗；HepG2細胞用內(nèi)含葡萄糖胺(18mM)的低糖無血清培養(yǎng)液誘導16h，使之產(chǎn)生胰島素抵抗。3、葡萄糖轉(zhuǎn)運測定將分化好的C2C12細胞培養(yǎng)于含有低糖無血清DMEM培養(yǎng)液的24孔板(購自美國Corning公司)中，饑餓3h，100nM胰島素刺激20min，每孔加0.5/iCi3H標記的脫氧葡萄糖，孵育5min，吸掉培養(yǎng)液，將細胞板置于冰上，PBS洗滌3次。每孔加200yl0.2MNaOH，收集細胞裂解液，采用液閃儀測定放射強度。4、糖原合成測定HepG2細胞培養(yǎng)于24孔板，低糖無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓16h，力QIOOnM胰島素和/或0.5MCi3H標記的葡萄糖培養(yǎng)3h，吸掉培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，每孔加200iU30。/。NaOH，收集細胞裂解液80。C裂解30min，離心，力[]2倍體積的無水乙醇，混勻，-20。C靜置過夜。靜置后冷凍離心，棄上清，加無水乙醇洗滌，離心，重復二次。將最后沉淀晾干，O.lNHCl溶解沉淀，采用液閃儀測定放射強度。5、蛋白Western印跡向細胞培養(yǎng)板中加入適量裂解液，10(TC裂解5min，離心備用。取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE分離蛋白。并將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，再用含5。/。脫脂奶粉的TBS封閉lh，加各種相應抗體(分別是抗Sirtl抗體(購自美國Upstate公司)和抗Tubulin抗體(購自美國Sigma公司))，4。C過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫輕搖lh，充分洗滌后用化學發(fā)光反應試劑盒(購自美國PIERCE公司)反應2min，即刻與X光片曝光，洗片后用激光掃描儀進行定量分析。6、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)6.1引物設(shè)計及合成引物由上海生工生物工程公司合成。Actin(片段大小為444bp):正鏈5'ATCACTGCCACCCAGAAGAC，3(SEQIDNO:1)，反鏈5'ATGAGGCCACCACCCTG，3(SEQIDNO:2);PTP-lB(片段大小為384bp):正鏈5'CTGACACCTGCCTCTTACTG，3(SEQIDNO:3)，反鏈5'CACTTGACTGGGCTCTGC，3(SEQIDNO:4)。6.2總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄取適量細胞用常規(guī)的TrizolReagent進行總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄。6.3PCR擴增反應體系為50pi,10mmol/LldNTP125mmol/LMgCl24jul，10xbuffer5jid，3，primer0.5pd，5，primer0.5/^1，cDNA4pl，Taq酶2U，去離子水補足至50pl，反應條件95。C預變性5min，進入循環(huán)，(95。C變性45s，按PTP1B:65°C;Actin:57。C的溫度退火45s，72。C延伸45s)，其中PTP1B行30個循環(huán)，GAPDH行25個循環(huán)。擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外透射儀下觀察擴增產(chǎn)物特異條帶。產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像及分析系統(tǒng)進行圖像分析，以Actin作為內(nèi)參照，用PTPlB條帶的吸光度與Actin比值表示其表達的相對水平。7、SIRT1及PTP-1B過表達7.1PTP-1B基因克隆設(shè)計引物正鏈(SEQIDNO:5):5'GGATACGCGTATGGAGATGGAGAAGGAGTTCGAG3';反鏈(SEQIDNO:6):5'GGAAGTCGACAGTGCTCCCAGTCTGTCAGTGAA3'總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄取適量C2C12細胞用Trizo1Reagent進行總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄。PCR擴增反應體系為50pl，10mmol/LldNTP1pi;25mmol/LMgCl24pl，10xbuffer5/xl，3，primer0.5jtd，5，primer0.5]ul，cDNA4pd，Taq酶2U，去離子水補足至50/xl，反應條件95r預變性5min，進入循環(huán)，(95'C變性45s，60。C退火45s，72。C延伸45s)，30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物切膠回收，經(jīng)MluI和SalI酶切，與經(jīng)過同樣酶切的pHSVPrPUC載體(購自美國Clontech公司)連接，連接產(chǎn)物涂板，挑取克隆鑒定。7.2PTP-1B皰疹病毒(HSV)的包裝病毒包裝用2-2細胞(購自哈佛大學醫(yī)學院)完成，過程如下取適量7.1步驟獲得的含PTP1B的載體用脂轉(zhuǎn)法(Lipofactamine2000)導入2-2細胞，培養(yǎng)24h后加入病毒包裝所需的輔助病毒helper(購自哈佛大學醫(yī)學院)，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞變圓，用低滲法收取病毒，將初次收取的病毒加入2-2細胞擴增培養(yǎng)，同樣方法收取病毒(HSV-PTP-1B)，-S(TC凍存，備用。7.3SIRT1基因克隆SIRT1cDNA片段是從質(zhì)粒pBabepuro-SIRTl(購自哈佛大學醫(yī)學院)經(jīng)BamHI酶切得到，并將其插入到pCMV-Tag3A(購自美國Stratagene公司)質(zhì)粒中的BamHI酶切位置。7.4SIRT1皰疹病毒的包裝SIRT1皰診病毒的包裝過程與PTP-1B皰疹病毒的包裝過程相同，取適量7.3步驟獲得的含SIRT1的載體用脂轉(zhuǎn)法(Lipofactamine2000)導入2-2細胞，培養(yǎng)24h后加入病毒包裝所需的輔助病毒helper，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞變圓，用低滲法收取病毒，將初次收取的病毒加入2-2細胞擴增培養(yǎng)，同樣方法收取病毒(HSV-SIRT)，-80"凍存，備用。7.5SIRT1及PTP-1B過表達檢測將上述HSV病毒加入到C2C12細胞，36h感染后Westera檢測過表達效率。8、SIRT1RNA干預(RNAi)參照文獻(PicardFetal.SirtlpromotesfatmobilizationinwhiteadipocytesbyrepressingPPAR-gamma.Nature200417:771-776)所提供的方法，合成以下兩段寡核苷酸用以制備SIRT1RNAi:CTTCATCTTTTTTGGAAA-3'(SEQIDNO:7);GGAGGTCAACTTCATCG-3，(SEQIDNO:8)。將以上兩段寡核苷酸混合退火后與慢病毒表達載體pLentiLox3.7-Hl(購自哈佛大學醫(yī)學院)連接(通過BamHI和XhoI酶切位點)，所獲質(zhì)粒與HIV-1包裝質(zhì)粒A8.9及VSVG質(zhì)粒(均購自哈佛大學醫(yī)學院)外共轉(zhuǎn)導入293T細胞(購自美國ATCC公司)，48h后收取含有慢病毒(lentivirus)的上清，-80"凍存，備用。用以制備對照病毒熒光素酶RNAi(LucRNAi)寡核苷酸序列如下GCGCTACTTTTTTGGAAG國3，(SEQIDNO:9);ATAATACACCGCGCTACG-3，(SEQIDNO:10)。其包裝過程與SIRT1RNAi過程相同。SIRT1RNAi干預實驗在HepG2細胞完成，用上述所制備的慢病毒感染細胞，Westem檢測。9、SIRT1抑制劑處理SIRTl抑制劑Sirtinol(50^M)處理HepG2細胞12h，通過前述的方法測定糖原合成。10、動物實驗C57/BL6小鼠用高脂誘導胰島素抵抗模型造模，在飼喂高脂飼料的同時白藜蘆醇(Resveratrol)給藥(濃度為25mg/kg/day)。四周后測定小鼠糖耐量(GTT)、胰島素耐量(ITT)、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)及低密度脂蛋白(LDL)水平。II.實施例實施例lSIRT1蛋白水平在胰島素抵抗情況下降低1.以C2C12為細胞模型根據(jù)前述方法，制備經(jīng)棕櫚酸誘導后產(chǎn)生胰島素抵抗的C2C12細胞，測定細胞中SIRT1蛋白的表達情況。結(jié)果見圖1A-圖1C。圖1A為通過前述的葡萄糖轉(zhuǎn)運測定方法，測定C2C12細胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運情況(相對葡萄糖攝入量)，結(jié)果顯示，C2C12細胞經(jīng)棕櫚酸誘導后產(chǎn)生胰島素抵抗(即在胰島素不存在和存在下，相對葡萄糖攝入量變化不顯著)。圖lB為采用前述的WesternBlot法測定SIRTl蛋白表達情況的結(jié)果，SIRT1蛋白在胰島素抵抗的C2C12細胞中下降；圖1C為圖1B的數(shù)量化表示。圖中，tubulin(微管蛋白)為電泳上樣量對照。因此可見，SIRT1蛋白在胰島素抵抗的C2C12細胞中表達量下降。2.以HepG2為細胞模型根據(jù)前述方法，制備經(jīng)葡萄糖胺誘導后產(chǎn)生胰島素抵抗的HepG2細胞，測定細胞中SIRT1蛋白的表達情況。結(jié)果見圖1D-1F。圖1D為通過前述的糖原合成測定方法，測定C2C12細胞的糖原合成情況，顯示了細胞經(jīng)葡萄糖胺誘導后產(chǎn)生胰島素抵抗(即在胰島素不存在和存在下，糖原合成變化不顯著)。圖lE顯為采用前述的WesternBlot法測定SIRTl蛋白表達情況的結(jié)果，顯示了SIRTl蛋白在胰島素抵抗的HepG2細胞中下降；圖1F為圖1E的數(shù)量化表示。因此可見，SIRTl蛋白在胰島素抵抗的HepG2細胞中表達量下降。實施例2下調(diào)SIRT1可導致胰島素抵抗根據(jù)前述方法，用前述制備的慢病毒感染H印G2細胞，對細胞內(nèi)的SIRT1進行RNA干擾，從而導致SIRT1蛋白表達下降。對H印G2細胞進行慢病毒感染72h，對照病毒和SIRT1RNA干擾病毒均可表達熒光蛋白，因此通過觀察熒光蛋白的表達情況來判斷所用慢病毒感染效率。慢病毒感染H印G2細胞后熒光照片如圖2A，結(jié)果表明慢病毒感染H印G2細胞效率很高，其中的對照病毒是LucRNA干擾。圖2B是對RNA干擾后細胞內(nèi)SIRTl蛋白的WesternBlot檢測結(jié)果。由圖2B可知，慢病毒介導RNA干擾導致SIRT1蛋白表達發(fā)生顯著下降。圖2C是對RNA干擾后細胞磷酸化胰島素受體(該過程采用的胰島素受體的抗體及磷酸化胰島素受體的抗體均購自美國CellSignaling公司)的WesternBlot檢測結(jié)果。Westera檢測結(jié)果表明，SIRT1表達下降導致胰島素受體磷酸化水平降低。由圖2D可知，SIRT1表達下降組在胰島素存在和不存在情況下糖原合成的變化不顯著。因此，SIRT1表達下降阻止了胰島素誘導的糖元合成(圖2D中，白色柱體表示沒有處理的細胞，灰色柱體表示Luc-RNAi細胞，黑色柱體表示SIRTl-RNAi細胞)。然后，使用SIRTl抑制劑Sirtino1(50MM)處理HepG2細胞12h，測定糖原合成情況。結(jié)果如圖2E，可見采用SIRTl抑制劑Sirtino柳制SIRTl后，阻止了胰島素誘導的糖元合成。上述結(jié)果均說明，SIRT1下降導致胰島素敏感性下降。實施例3上調(diào)SIRT1蛋白水平對于正常和胰島素抵抗情況下葡萄糖攝入量和胰島素激活信號的影響根據(jù)前述的方法制備病毒HSV-SIRT1，用HSV-SIRT1處理C2C12細胞，從而在C2C12細胞內(nèi)上調(diào)SIRT1蛋白水平，測定其對于正常和胰島素抵抗情況下葡萄糖攝入量和胰島素激活信號的影響。結(jié)果如圖3A-圖3C所示。由圖3A可知，在正常情況下，上調(diào)SIRT1蛋白水平對葡萄糖攝入沒有顯著的影響。圖中，白色柱體表示不加胰島素和HSV-SIRT1組，黑色柱體表示單加胰島素組，灰色柱體表示單加HSV-SIRT1組，黑點白底柱體表示加入胰島素和HSV-SIRT1組。由圖3B可知，在胰島素抵抗情況下，上調(diào)SIRT1蛋白水平可顯著促進葡萄糖的攝入。圖中，白色柱體表示不加胰島素和HSV-SIRT1組，黑色柱體表示單加胰島素組，灰色柱體表示單加HSV-SIRT1組，黑點白底柱體表示加入胰島素和HSV-SIRT1組。圖3C是釆用常規(guī)WesternBlot法檢測SIRTl蛋白水平對于一些胰島素激活信號的影響。對胰島素信號途徑蛋白進行WesternBlot檢測，結(jié)果表明過表達SIRT1蛋白可促進胰島素抵抗情況下胰島素受體、蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶3/3(Gsk3/3)及磷酸肌醇依賴蛋白激酶(PDKl)的磷酸化水平(以上胰島素受體或激酶的相應的抗體均購自美國Cellsignaling公司)。由圖3C可知，SIRT1蛋白水平上調(diào)可增強胰島素激活信號。綜上可知，上調(diào)SIRT1蛋白水平對正常情況下的葡萄糖攝入量和胰島素激活信號無影響，但可以顯著增強胰島素抵抗情況下葡萄糖攝入和胰島素激活信號實施例4白黎蘆醇處理對于葡萄糖攝入和胰島素激活信號的影響用白藜蘆醇(濃度分別為O.Ol，0.1，1.0nM)處理C2C12細胞，從而在C2C12細胞內(nèi)促進SIRT1的表達或活性，測定其對于正常和胰島素抵抗情況下葡萄糖攝入量和胰島素激活信號的影響。結(jié)果如圖4A-圖4C所示。由圖4A可見，正常情況下白藜蘆醇處理促進了葡萄糖攝入。圖中，白色柱體表示不加胰島素和白藜蘆醇組，黑色柱體表示單加胰島素組，灰色柱體表示單加白藜蘆醇組，黑點白底柱體表示加入胰島素和白藜蘆醇組。由圖4B可見，胰島素抵抗情況下白藜盧醇處理促進了葡萄糖的攝入。圖中，白色柱體表示不加胰島素和白藜蘆醇組，黑色柱體表示單加胰島素組，灰色柱體表示單加白藜蘆醇組，黑點白底柱體表示加入胰島素和白藜蘆醇組。由圖4C可見，白藜戸醇處理可增強胰島素激活信號，并且白藜^醇可顯著促進SIRT1蛋白的表達水平。對胰島素信號途徑蛋白進行WesternBlot檢測，結(jié)果表明過白黎蘆醇處理可促進正常及胰島素抵抗情況下胰島素受體、蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶3/3(Gsk3④及磷酸肌醇依賴蛋白激酶(PDKl)的磷酸化水平(以上胰島素受體及個激酶的相應的抗體均購自美國Cellsignaling公司)。綜上可知，白藜蘆醇(Resveratrol)處理在正常和胰島素抵抗情況下均可促進葡萄糖攝入，增強胰島素激活信號。實施例5白藜蘆醇與SIRT1可增強肝細胞糖原合成用前述制備的慢病毒感染(即SirtRNAi病毒)HepG2細胞，對細胞內(nèi)的SIRTl進行RNA干擾，從而導致SIRT1蛋白表達下降。對照為采用LucRNAi病毒(即對照病毒)感染HepG2細胞。分別采用胰島素和白藜蘆醇處理細胞。結(jié)果見圖5。由結(jié)果可見，白藜戸醇增強肝細胞糖原合成需要SIRT1的參與。實施例6上調(diào)SIRT1蛋白水平或白藜盧醇處理對于PTP-1B的影響根據(jù)前述的方法，采用HSV-SIRT1上調(diào)SIRT1蛋白水平，采用WesternBlot測定對于PTP-lB蛋白(PTP-lB抗體購自美國Upstate公司)的影響，以Tubulin為對照；采用前述材料和方法中第6部分所述的RT-PCR方法測定PTP-1BmRNA水平，以Actin為對照。結(jié)果如圖6A-圖6B。如圖6A所示，發(fā)現(xiàn)在胰島素抵抗情況下，SIRT1蛋白水平上調(diào)可降低PTP-1B蛋白水平，且SIRT1蛋白水平越高，PTP-1B蛋白水平越低。如圖6B所示，發(fā)現(xiàn)在胰島素抵抗情況下，SIRT1蛋白水平上調(diào)可降低PTP-1B的mRNA水平。圖6E為對圖6B各PTP-1BmRNA檢測條帶的量化。接著，本發(fā)明人還用白藜蘆醇(濃度分別是0.01,0.1和1.0pM)處理細胞，在C2C12細胞內(nèi)促進SIRT1的活性和表達水平，采用WesteraBlot測定對于PTP-lB蛋白的影響，以Tubulin為對照；采用前述材料和方法中第6部分所述RT-PCR方法測定PTP-1BmRNA7K平。結(jié)果如圖6C和圖6D所示。如圖6C所示，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇處理在正常和胰島素抵抗情況下均可顯著降低PTP-1B蛋白水平。如圖6D所示，發(fā)現(xiàn)白藜盧醇處理在正常和胰島素抵抗情況下均可顯著降低PTP-lB的mRNA水平。圖6F為對圖6D各PTP-1BmRNA檢測條帶的量化。綜上可知，上調(diào)SIRT1蛋白水平(胰島素抵抗情況下)或白藜蘆醇處理(正常或胰島素抵抗情況下)可降低PTP-lB蛋白和mRNA水平。實施例7上調(diào)PTP-1B蛋白水平對于上調(diào)SIRT1導致的胰島素敏感性升高的影響根據(jù)前述的方法，在C2C12細胞中分別采用HSV-SIRT1和HSV-PTP-1B上調(diào)SIRT1蛋白水平和PTP-1B蛋白水平。采用前述的WesternBlot方法檢測，HSV介導的PTP-1B和SIRT1蛋白水平上調(diào)情況如圖7A所示。如圖7B所示，PTP-1B蛋白水平上調(diào)逆轉(zhuǎn)了SIRT1蛋白水平上調(diào)導致的葡萄糖攝入升高。在不上調(diào)PTP-1B蛋白水平的情況下，SIRT1蛋白水平上調(diào)導致葡萄糖攝入升高，而在逐漸上調(diào)PTP-1B蛋白水平的情況下，SIRT1蛋白水平上調(diào)導致葡萄糖攝入逐漸下降。其中，白色柱體表示不加入胰島素且不上調(diào)SIRT1和PTP-1B,黑色柱體表示加入胰島素和上調(diào)SIRT1且不上調(diào)PTP-1B,灰色柱體表示加入胰島素和上調(diào)SIRT1且上調(diào)PTP-1B。因此可見，上調(diào)PTP-1B蛋白水平可以逆轉(zhuǎn)上調(diào)SIRT1導致的胰島素敏感性升高，說明本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的SIRT1提高胰島素敏感性的作用是通過抑制PTP-1B來實現(xiàn)的。實施例8白藜蘆醇對于胰島素敏感性等糖尿病相關(guān)癥狀的影響作用如前述方法，用高脂誘導C57/BL6小鼠胰島素抵抗模型，在飼喂高脂飼料的同時白藜蘆醇(Resveratrol)給藥(2.5mg/kg/d)。四周后，采用血糖儀測定小鼠糖耐量(GTT)、胰島素耐量(ITT)，采用自動生化分析儀測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)及低密度脂蛋白(LDL)水平，采用放射免疫法測定血清胰島素水平。結(jié)果如圖8A-圖8E所示。由圖8A可知，在低脂組，動物體內(nèi)的血清胰島素水平較低；在高脂組，動物體內(nèi)的血清胰島素水平很高；而在高脂組給予白藜蘆醇后，血清胰島素水平顯著低于高脂組。因此可見，白藜蘆醇可以抑制高脂誘導的高胰島素血癥。給饑餓過夜小鼠注射一定劑量的葡萄糖，然后在不同時間點測定小鼠血糖濃度(GTT)。由圖8B可知，在各個時間段中，高脂組的血糖水平明顯高于低脂組和高脂+白藜蘆醇組。因此可見，白藜蘆醇可以改善高脂誘導的葡萄糖耐受。給饑餓過夜小鼠注射一定劑量的胰島素，然后在不同時間點測定小鼠血糖濃度(ITT)。由圖8C可知，在各個時間段中，高脂組的血糖水平明顯高于低脂組和高脂+白藜蘆醇組。因此可見，白藜蘆醇可以改善高脂誘導的胰島素耐受。由圖8D可知，在低脂組，動物體內(nèi)的總膽固醇含量較低；在高脂組，動物體內(nèi)的總膽固醇含量很高；而在高脂組給予白藜戶醇后，總膽固醇含量低于高脂組。因此可見，白藜蘆醇可以降低高脂誘導的總膽固醇水平升高。由圖8E可知，在低脂組，動物體內(nèi)的低密度脂蛋白含量較低；在高脂組，動物體內(nèi)的低密度脂蛋白含量很高；而在高脂組給予白藜蘆醇后，低密度脂蛋白含量低于高脂組。因此可見，白藜蘆醇可以降低高脂誘導的低密度脂蛋白水平升高。綜上，白藜蘆醇可以改善胰島素敏感性等糖尿病相關(guān)癥狀，降低高脂飲食小鼠體內(nèi)總膽固醇及低密度脂蛋白含量。實施例9篩選提髙胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的方法方法l:以SIRT1蛋白為靶點，利用對胰島素響應的肌肉細胞(如本發(fā)明中所用的C2C12)或肝細胞(如HepG2細胞)篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。測試組在前述的胰島素響應細胞中加入候選物質(zhì)。對照組在前述的胰島素響應細胞中不加入候選物質(zhì)。檢測測試組細胞中的SIRT1蛋白活性或表達情況，并且與對照組細胞中的SIRT1蛋白活性或表達情況相比較，如果測試組中SIRT1蛋白活性或表達在統(tǒng)計學上高于(如高20%或以上)對照組，就表明該候選物是可用于提高胰島素敏感性的物質(zhì)。方法2:以PTP-1B為耙點，利用對胰島素響應的肌肉細胞(如本發(fā)明中所用的C2C12)或肝細胞(如HepG2細胞)篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。測試組在前述的胰島素響應細胞中加入候選物質(zhì)。對照組在前述的胰島素響應細胞中不加入候選物質(zhì)。檢測測試組細胞中的PTP-lB的蛋白表達情況或mRNA水平，并且與對照組細胞中的PTP-lB的蛋白表達情況或mRNA水平相比較，如果測試組中PTP-1B的蛋白表達情況或mRNA水平在統(tǒng)計學上低于(如高20o/?；蛞陨?對照組，就表明該候選物是可用于提高胰島素敏感性的物質(zhì)。實施例IO含有適量SIRT1蛋白或其激動劑或上調(diào)劑的組合物所述的食物組合物的配方如表l:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>于小鼠胰島素敏感性的影響。在服用一定時期后，對小鼠進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)這些食品對于高脂誘導的高胰島素血癥、高脂誘導的葡萄糖耐受等指標均有顯著改善。實施例ll藥物組合物所述的藥物組合物配制如表2:表2藥物組合物l每劑100mg，其中含有白藜蘆醇5mg，羅格列酮2mg藥物組合物2每劑80mg，其中含有白藜蘆醇2mg，格列本脲2.5mg，格列吡嗪2mg,格列波脲2mg藥物組合物3每劑1000mg，其中含有白藜盧醇lmg，二甲雙胍500mg，苯乙雙胍25mg藥物組合物4每劑200mg，其中含有白藜蘆醇50mg，阿卡波糖50rag，米格列醇20mg在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110〉中國科學院上海生命科學研究院<120〉增加胰島素敏感性的方法和組合物<130〉065774<160>10<170〉Patentlnversion3.3<210>1<211〉20<212>DNA<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400>1atcactgccacccagaagac20<210>2<211>17<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221>misc一feature<223>引物—<400>2atgaggccaccaccctg17<210>3<211〉20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc一feature<223〉引物<400>3ctgacacctgcctcttactg20<210〉4<211>18<212〉腿<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223〉引物<400>4cacttgactgggctctgc18<210〉5<211〉34<212>DNA<213>人工序列<220><221〉misc—feature<223>引物<400>5ggatacgcgtatggagatgg卿aggagttcgag34<210〉6<211〉33<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400〉6ggaagtcgacagtgctcccagtctgtcagtgaa33<210>7<211〉63<212〉腿<213>人工序列<220〉〈221〉misc一feature<223>寡核苷酸<400>7gatccgatgaagttgacctcctcattcaagagatgaggaggtcaacttcatcttttttgg60aaa63<210>8<211>63<212>DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉寡核吾酸<400>8agcttttccaaaaaagatgaagttgacctcctcatctcttgaatgaggaggtcaacttca60tcg63<210〉9〈211〉63<212>DNA<213>人工序列<220><221〉misc—feature<223〉寡核苷酸<400>9gatccgtagcgcggtgtattatacttcaagagagtataatacaccgcgctacttttttgg60aag63〈210〉10<211〉63<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221>raise—feature<223〉寡核有酸<400〉10tcgacttccaaaaaagtagcgcggtgtattatactctcttgaagtataatacaccgcgct60acg6權(quán)利要求1.一種SIRT1蛋白或其激動劑或上調(diào)劑的用途，其特征在于，用于制備提高胰島素敏感性的組合物。2.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的SIRT1蛋白或其激動劑或上調(diào)劑還用于制備抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1B轉(zhuǎn)錄或表達的組合物。3.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述組合物用于治療胰島素敏感性下降相關(guān)的疾病。4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的胰島素敏感性下降相關(guān)的疾病包括胰島素抵抗、2型糖尿病、高胰島素血癥、糖尿病酮癥酸中毒、高滲性非酮癥糖尿病昏迷、乳酸性酸中毒。5.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的SIRT1蛋白的激動劑或上調(diào)劑選自白藜蘆醇、紫鉚因、異甘草素、漆黃素、或四羥反式芪。6.—種篩選可用于提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的方法，其特征在于，所述的方法包括將候選物質(zhì)與表達SIRT1蛋白的體系接觸，檢測候選物質(zhì)對SIRT1蛋白的影響；若所述候選物質(zhì)可提高SIRT1蛋白的表達或促進SIRT1蛋白的活性，則表明該候選物質(zhì)是可用于提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，還包括觀察體系中蛋白酪氨酸磷酸酶-lB的表達情況或活性，若蛋白酪氨酸磷酸酶-lB的表達或活性降低，則表明該候選物質(zhì)是可用于提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的體系選自溶液體系、亞細胞體系、細胞體系、組織體系、器官體系、或動物體系。9.一種通過權(quán)利要求6所述的方法獲得的可用于提高胰島素敏感性的物質(zhì)。10.—種組合物，其特征在于，所述的組合物含有(i)有效量的SIRT1蛋白或其激動劑或上調(diào)劑；(ii)有效量的選自下組的物質(zhì)雙胍類糖尿病藥物、磺酰脲類糖尿病藥物、葡萄糖苷酶抑制劑類藥物、胰島素增敏類藥物、醛糖還原酶抑制劑類藥物、促胰島素釋放類藥物；以及(iii)藥學上或食品學上可接受的載體。全文摘要本發(fā)明公開了SIRT1蛋白或其激動劑或上調(diào)劑的用途，用于制備提高胰島素敏感性的組合物。本發(fā)明首次證明了SIRT1可用于提高胰島素敏感性，揭示了SIRT1可下調(diào)胰島素信號的負性調(diào)節(jié)因子PTP-1B，為胰島素敏感性下降相關(guān)疾病的預防或治療提供了有效的新靶點。文檔編號A61K38/43GK101176786SQ200610118038公開日2008年5月14日申請日期2006年11月8日優(yōu)先權(quán)日2006年11月8日發(fā)明者史香林,誠孫,芳張,翟琦巍申請人:中國科學院上海生命科學研究院