專利名稱：：積雪草酸在制備藥物方面的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及積雪草酸在制備藥物方面的用途，特別是涉及積雪草酸在制備抗肝纖維化藥物方面的用途。
背景技術(shù)：
：積雪草為傘形科積雪草屬植物，廣泛分布于長江流域以南各地。全草入藥。在我國積雪草外用及內(nèi)服治病已有兩千多年歷史。其具有清熱利濕，解毒消腫之功能。適用于濕熱黃疸，中暑腹瀉，砂淋血淋，癰腫瘡毒，跌撲損傷。積雪草的化學(xué)成分以三萜類為主，如積雪草苷、羥基積雪草苷等五環(huán)三萜型酯苷。積雪草還含有三萜酸類，如積雪草酸、羥基積雪草酸等。此外，積雪草中還有少量的多炔烯類、揮發(fā)油類、香草酸等。積雪草酸是一種已知物質(zhì)。購自美國SIGMA公司的積雪草酸為高效液相色譜技術(shù)提取物，黃棕色粉末，無臭，味苦。分子式為C48H78O5，分子量為488.70道爾頓(D)，熔點為325℃-330℃，不溶于水，溶于二甲亞砜。其分子結(jié)構(gòu)式如下式所示肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展過程中的一個病例過程，其主要機理是肝星狀細胞活化并轉(zhuǎn)化為成纖維細胞，產(chǎn)生大量以膠原纖維為主要成分的細胞外基質(zhì)，使肝組織結(jié)構(gòu)逐漸改變，肝功能不斷下降的病理過程。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)的信號經(jīng)過細胞內(nèi)的Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促使纖維化相關(guān)的基因的表達，TGFβ/Smad信號途徑最主要的肝纖維化信號途徑，TGFβ與肝星狀細胞(HSC-T6)TGFβ受體結(jié)合后，使Smad2/3磷酸化，并與Smad4結(jié)合進入細胞核，啟動肝肝星狀細胞(HSC-T6)纖維蛋白相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。Smad7是TGFβ信號途徑的負反饋調(diào)節(jié)因子，可以抑制Smad2/3磷酸化，進而抑制肝纖維化。在病理條件下，TGFβ信號持續(xù)使Smad2/3磷酸化，導(dǎo)致纖維蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成。本發(fā)明的過程證明積雪草酸可抑制大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)活化和轉(zhuǎn)化，使alpha肌動蛋白(alpha-SMA)表達下降。同時，本發(fā)明的過程證明積雪草酸可抑制大鼠肝星狀細胞膠原蛋白合成，從而抑制肝纖維化。本發(fā)明的過程還證明積雪草酸抑制肝膠原蛋白合成通過上調(diào)Smad7負反饋信號發(fā)揮對TGFβ/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用。肝纖維化是一個可逆的過程，在肝纖維化階段采取積極的治療措施對防止肝硬化是至關(guān)重要的。目前西藥抗肝纖維化的治療尚缺乏理想的藥物。積雪草酸是一種有顯著地抗肝纖維化作用的藥物。肝星狀細胞約占所有肝細胞總數(shù)的15％。在致肝纖維化因素的作用下，肝星狀細胞分泌大量細胞外基質(zhì)，基質(zhì)主要由纖維蛋白和由肝星狀細胞活化和轉(zhuǎn)化而來的成纖維細胞組成。大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)細胞系是研究肝纖維化的細胞模型，由美國FriedmanSL(DivisionofLiverDiseases，MountSinaiSchoolofMedicine，NewYork，USA)教授建立并惠贈。文獻資料報道，積雪草酸的公知藥物用途有用其制備愈合皮膚傷口、治療瘢痕疙瘩的藥物，以及制備防治心血管疾病、防治腦血管疾病的藥物。至今，國內(nèi)外有關(guān)積雪草酸在抗肝纖維化方面的研究均缺乏有說服力的實驗證據(jù)表明積雪草酸確實能夠抗肝纖維化。積雪草酸在制備抗肝纖維化藥物方面的用途至今未見報導(dǎo)。而我們發(fā)明積雪草酸在制備抗肝纖維化藥物方面的新用途完全是建立在充分和有說服力的實驗證據(jù)基礎(chǔ)之上的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供積雪草酸在制備抗肝纖維化藥物方面的新用途。本發(fā)明提供積雪草酸在制備抗肝纖維化藥物方面的用途。為此，通過實驗要證明1、積雪草酸抑制TGFβ誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞活化和轉(zhuǎn)化，使alpha-SMA蛋白表達減少。2、積雪草酸抑制TGFβ誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞膠原蛋白合成。3、積雪草抑制膠原蛋白合成的機理是上調(diào)TGFβ/Smad信號途徑中Smad7負反饋信號。以下為整個實驗過程材料方法1.細胞培養(yǎng)HSC-T6維持培養(yǎng)在低糖型DMEM(Invitrogen)培養(yǎng)基中，添加1％青鏈霉素(Invitrogen)和10％胎牛血清(Hyclone).每孔1×104細胞2.5ml鋪6孔培養(yǎng)板，24小時后，換含0.2％胎牛血清DMEM培養(yǎng)24小時，加AA(5μM，10μM，20μM，30μM，)達2小時，加1ng/mlTGFβ，設(shè)立各組對照，24小時后從細胞提取蛋白或mRNA。2.蛋白質(zhì)提取將各孔細胞的培養(yǎng)基棄去，用預(yù)冷的0.01MPBS沖洗2次。六孔板每孔加250uLRIPA細胞蛋白裂解液，搖晃使其充分覆蓋底部，冰上放置30min。RIPA蛋白裂解緩沖液的成分為1％NonidetP-40，0.1％SDS，1mMPMSF，0.5％sodiumdeoxycholate，1mMsodiumorthovanadate，10mMsodiumfluorideinPBS。細胞刮子刮取細胞，收集至1.5mLEppendorf管中。在冰上對樣本進行超聲粉碎，500W、3s×6次，4℃、12000rpm離心10min，取上清。儲存于-70℃?zhèn)溆谩?.信使核糖核酸(mRNA)抽提將各孔細胞的培養(yǎng)基棄去，用PBS緩沖液沖洗后在十二孔板的每個孔中加入350uL含有β2-巰基乙醇的RLT裂解液。輕輕搖晃使裂解液與細胞充分接觸后收集標本到1.5mL離心管中，按照QIAGEN公司RNeasyMiniKit(Cat74104)的說明書進行提取細胞的總RNA。4.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)取質(zhì)量為1.5ug的總RNA以O(shè)ligo(dT)為引物合成第一鏈cDNA(按試劑盒說明書進行)，反應(yīng)試劑10XPCRBuffer2.0μL，50mMMgCl22.0μL，10mMdNTPs2.0μL，Oligo(dT)12-181.0μL，RnaseInhibitor1.0μL，M-MLV0.25μL，H2O9.75μL，RNA2.0μL，TotalVolume20μL.反應(yīng)條件22℃10minutes，42℃15minutes，99℃5minutes，將cDNA-20℃保存?zhèn)溆?。實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-TimePCR)引物的序列如下RatSmad7FCGCTGTACCTTCCTCCGATRatSmad7RAGAAGATATCCAGGGAGGGCTCTTReal-TimePCR反應(yīng)試劑2×iQSYBRGreenSupermix10μL，H2O7.2μL，Primer-10.4μL，Primer-20.4μL，DNA2μL，反應(yīng)條件94℃，5min，循環(huán)條件94℃變性20s，60℃退火20s，72℃延伸42s。共擴增40個循環(huán)，最后一個循環(huán)后置72℃孵育5min。5.免疫印記(Westernblot)試劑0.5MTris-HCl，PH6.8，1.5MTris-HClPH8.8；40％Acrylamide/BisSolution；20×NuPAGEMESSDS電泳緩沖液；20×NuPAGE轉(zhuǎn)膜緩沖液；PVDF膜；X-感光膠片；ECL(supersignalwestpicostableperoxidesolution)；ECLplus(LumigenPS-3DetectionReagentSolution)；4％積層膠，10％分離膠，總蛋白20ug的樣本；非連續(xù)SDS-PAGE電泳100V，90分鐘。然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，150V，90分鐘。轉(zhuǎn)膜后TBST洗膜。以5％脫脂奶粉-TBST封閉液室溫下封閉60min；TBST洗膜。加入合適濃度的一抗(1∶1000至1∶2000)孵育4℃輕搖過夜。TBST洗膜加入合適濃度的結(jié)合HRP的二抗(1∶10000至1∶30000)及HRP-anti-biotin二抗(1∶5000)孵育室溫下輕搖60min。ECL或ECLplus顯影1分鐘后，將PVDF膜致于兩張干凈的透明薄膜之間，在暗室中進X-線膠片曝光2秒-15分鐘不等。曝光后的膠片進行顯影及定影。結(jié)果經(jīng)掃描成像系統(tǒng)成像，并用ImageJ軟件進行定量分析蛋白質(zhì)帶的含量。采用上述實驗方法所得實驗數(shù)據(jù)，經(jīng)分析可得出以下結(jié)果和結(jié)論結(jié)果1.TGFβ增加大鼠肝星狀細胞I型膠原蛋白表達2.TGFβ誘導(dǎo)大鼠肝星狀細胞I型膠原蛋白表達的劑量為1ng/ml，時間為24小時。3.積雪草酸抑制大鼠肝星狀細胞alpha-SMA蛋白表達積雪草酸可抑制TGFβ誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞alpha-SMA蛋白表達，統(tǒng)計學(xué)分析差別具有顯著性。4.積雪草酸抑制大鼠肝星狀細胞膠原蛋白合成積雪草酸抑制TGFβ誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞I型膠原蛋白合成，統(tǒng)計學(xué)分析差別具有顯著性。5.積雪草酸上調(diào)大鼠肝星狀細胞Smad7mRNA負反饋信號積雪草酸上調(diào)大鼠肝星狀細胞Smad7mRNA負反饋信號，通過Smad7阻止TGFβ誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞I型膠原蛋白合成。統(tǒng)計學(xué)分析差別具有顯著性。結(jié)論1.積雪草酸抑制TGFβ誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞活化和轉(zhuǎn)化。2.積雪草酸抑制TGFβ誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞I型膠原蛋白合成。3.積雪草酸上調(diào)Smad7mRNA負反饋信號，通過Smad7阻止TGFβ誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞I型膠原蛋白合成。達到抑制肝纖維化的藥效。從以上實驗結(jié)果可知，積雪草酸確實在抗肝纖維化方面有著良好的藥效作用，積雪草酸確實可以用于制備抗肝纖維化的藥物。具體實施例方式以下用實施例來進一步說明本發(fā)明積雪草酸在制備抗肝纖維化藥物方面的用途。實施例1積雪草酸作用于大鼠肝星狀細胞，制備蛋白標本，Westernblot1.HSC-T6細胞1×104鋪6孔板，5％CO2，37℃，24小時后加入積雪草酸(購至于美國SIGMA公司)，濃度分別為5μM，10μM，20μM，30μM，2小時后加入TGFβ1ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，常規(guī)方法提取細胞蛋白，蛋白含量測定，-70℃儲存?zhèn)溆没蛑苯幼鯳esternblot。2.Westernblot方法完全參照金冬雁，黎孟楓等翻譯的《分子克隆實驗指南》第二版。蛋白質(zhì)的丙烯酰胺凝膠電泳方法參見880-885頁，蛋白質(zhì)從SDS丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜的方法參見888-893頁。3.轉(zhuǎn)膜后TBST洗膜。以5％脫脂奶粉-TBST封閉液室溫下封閉60min；TBST洗膜。加入合適濃度(1∶1000至1∶2000)的一抗孵育4℃輕搖過夜。TBST洗膜加入合適濃度的結(jié)合HRP的二抗(1∶10000至1∶30000)及HRP-anti-biotin二抗(1∶5000)孵育室溫下輕搖60min。ECL或ECLplus顯影1分鐘后，將PVDF膜致于兩張干凈的透明薄膜之間，在暗室中進X-線膠片曝光2秒-15分鐘不等。曝光后的膠片進行顯影及定影。結(jié)果經(jīng)掃描成像系統(tǒng)成像。積雪草酸作用于大鼠肝星狀細胞，提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-TimePCR)1.信使核糖核酸(mRNA)抽提將各孔細胞的培養(yǎng)基棄去，用PBS緩沖液沖洗后在十二孔板的每個孔中加入350uL含有β2-巰基乙醇的RLT裂解液。輕輕搖晃使裂解液與細胞充分接觸后收集標本到1.5mL離心管中，按照QIAGEN公司RNeasyMiniKit(Cat74104)的說明書進行提取細胞的總RNA。2.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)取質(zhì)量為1.5ug的總RNA以O(shè)ligo(dT)為引物合成第一鏈cDNA(按試劑盒說明書進行)，反應(yīng)試劑10XPCRBuffer2.0μL，50mMMgCl22.0μL，10mMdNTPs2.0μL，Oligo(dT)12-181.0μL，RnaseInhibitor1.0μL，M-MLV0.25μL，H2O9.75μL，RNA2.0μL，TotalVolume20μL.反應(yīng)條件22℃10minutes，42℃15minutes，99℃5minutes，將cDNA-20℃保存?zhèn)溆谩?.實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-TimePCR)引物的序列如下RatSmad7FCGCTGTACCTTCCTCCGATRatSmad7RAGAAGATATCCAGGGAGGGCTCTTReal-TimePCR反應(yīng)試劑2×iQSYBRGreenSupermix10μL，H2O7.2μL，Primer-10.4μL，Primer-20.4μL，DNA2μL，反應(yīng)條件94℃，5min，循環(huán)條件94℃變性20s，60℃退火20s，72℃延伸42s。共擴增40個循環(huán)，最后一個循環(huán)后置72℃孵育5min。統(tǒng)計學(xué)分析使用SSPS統(tǒng)計軟件對所獲數(shù)據(jù)進行方差齊性分析，組間對比進行t檢驗。從以上實施例可知，積雪草酸確實在抗肝纖維化方面有著良好的藥效作用，積雪草酸確實可以用于制備抗肝纖維化的藥物。權(quán)利要求1.積雪草酸在制備抗肝纖維化藥物方面的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的積雪草酸在制備藥物方面的用途，其中所述積雪草酸的分子結(jié)構(gòu)式如下式所示全文摘要本發(fā)明公開了積雪草酸在制備藥物方面的新用途，特別是在制備抗肝纖維化藥物方面的用途。研究表明，積雪草酸確實在抗肝纖維化方面有著良好的藥效作用，積雪草酸確實可以用于制備抗肝纖維化方面的藥物。文檔編號A61P1/00GK1943579SQ20061012256公開日2007年4月11日申請日期2006年9月30日優(yōu)先權(quán)日2006年9月30日發(fā)明者譚家駒,湯麗霞,楊光,藍輝耀申請人:佛山市第一人民醫(yī)院