專利名稱：K5多糖高硫酸化衍生物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明敘述了通過異丙醇處理和消除親油物質(zhì)提純大腸桿菌K5多糖。純化的產(chǎn)物經(jīng)過N-脫乙?；饔煤罂捎脕碇苽淞蛩峄潭雀叩男滦蚇，O-硫酸化多糖。
背景技術(shù)：
眾所周知，自W.F.Vann等人在European Journal ofBiochemistry 116，359-364，1981中所述的大腸桿菌株分離出來的莢膜多糖K5(下文簡(jiǎn)稱“K5”)顯示與肝素和硫酸類肝素的生物合成前體(N-acetylheparosan)具有相同序列，該莢膜多糖K5在化學(xué)上由D-葡萄糖醛酸和連接N-乙酰基葡萄糖胺的α1-4形成的重復(fù)二糖單位組成，而該二糖單位d-葡糖醛酸基-N-乙酰基葡萄糖胺與β1-4連接。肝素前體N-acetylheparosan和多糖K5的差別對(duì)K5及其衍生物的生物活性影響不大，如下文所引用的歐洲專利EP489647和EP 544592中所述，這種差別僅是在聚合物某些鏈非還原端的位置4(5)上存在雙鍵。
自上述文章首次公開后，其他一些文章和專利申請(qǐng)敘述了分子量為數(shù)千到數(shù)十萬道爾頓的大腸桿菌株K5多糖的制備。例如，參見EP 333243、IT 1230785、EP 489647、EP 544592、WO 92/17507、WO 01/02597以及M.Manzoni等人在Journal Bioactive CompatiblePolymers(11，第301-311頁，1996)中的文章。
根據(jù)這篇文獻(xiàn)，由大腸桿菌株發(fā)酵而成的K5經(jīng)純化去除諸如核酸、內(nèi)毒素、熱原或通常以各種方法得到的蛋白質(zhì)。
所以，W.F.Vann等人(1981)對(duì)以季銨鹽沉淀之后首次分離出的K5再用80％乙醇經(jīng)過三次沉淀予以純化。EP 333243的純化過程是用季銨鹽沉淀，提取和分離K5。EP 489647和EP 544598通過用乙醇沉淀，再經(jīng)過排斥和/或離子交換層析法來提純K5根據(jù)WO 92/17507，提純時(shí)乙醇沉淀、透析，在離心透析溶液和除去固體后，凍干所得的溶液。M.Manzoni等人的文章和WO 01/02597敘述了在含有脫脂大豆、鹽類和葡萄糖的培養(yǎng)基中通過發(fā)酵制備K5的步驟，純化K5時(shí)用1M氯化鈉溶液對(duì)含有用乙醇沉淀得到的含K5的溶液進(jìn)行超濾和離子交換層析。
而且，由發(fā)酵而成的K5經(jīng)過化學(xué)修飾得到類肝素產(chǎn)物。在上述文獻(xiàn)中，WO 92/17507、EP 489647和EP 544592敘述了具有抗凝血活性和抗血栓形成活性的高低分子量N，O-硫酸化K5；IT1230785和WO 92/17507敘述了一些K5的N-脫乙?；?N，O-硫酸化衍生物，其一定數(shù)目的葡萄糖醛酸單位受到差向異構(gòu)化作用轉(zhuǎn)化為艾杜糖醛酸單位，而WO 98/09636敘述了具有抗轉(zhuǎn)移活性的N-脫乙?；?N，O-硫酸化K5。
最后，對(duì)于N-硫酸化K5的O-硫酸化作用，有一文獻(xiàn)教導(dǎo)了如何調(diào)整可導(dǎo)入二糖單位羥基基團(tuán)上的硫酸根數(shù)目。具體地說，Casu等人(Carbohydrate Research，263，271-284，1994)敘述了K5的N-脫乙?；-硫酸化以及三種O-硫酸化方法，該三種方法以B、C和AC表示。根據(jù)方法C，其中N-硫酸化K5用每個(gè)游離羥基10摩爾當(dāng)量硫酸化試劑在溫度25-55℃下進(jìn)行1至24小時(shí)硫酸化作用，經(jīng)過進(jìn)一步的N-硫酸化作用得到聚硫酸化化合物，其最高硫酸鹽/羧基之比為3.1，下文以N，O-過硫酸化K5表示。
下文所述的其他K5衍生物中N-脫乙酰化K5多糖也稱為“N-脫乙?；疜5”，N-脫乙?；疦-硫酸化K5多糖也稱為“N-硫酸化K5”，N-脫乙?；?N，O-硫酸化K5多糖也稱為“N，O-硫酸化K5”，例如按照上述Casu等人(1994)所述的方法C制成的硫酸化程度高的N-脫乙酰化-N，O-硫酸化K5多糖也稱為“N，O-過硫酸化K5”。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)方法C進(jìn)行N-硫酸化K5的O-硫酸化作用，發(fā)現(xiàn)類肝素化合物(即其具有一定百分比的糖醛酸單位是艾杜糖醛酸)和K5可以達(dá)到硫酸化程度較高，而所得的N-硫酸化K5和N，O-過硫酸化K5的硫酸化程度為每個(gè)二糖單位的硫酸根低于3.2。這一證據(jù)解釋了沒有任何文獻(xiàn)提及每個(gè)二糖單位具有超過3.2個(gè)硫酸根的N，O-過硫酸化K5，其產(chǎn)物的陰離子化程度可能較高。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在高鹽水溶液中以異丙醇處理提純發(fā)酵而成的K5，可得到實(shí)際上不含親油物質(zhì)的純K5多糖。
還發(fā)現(xiàn)，按照方法C使由此所得的不含親油物質(zhì)的K5進(jìn)行N-脫乙?；-硫酸化、O-硫酸化，以及任選地進(jìn)行另一次N-硫酸化，可以得到硫酸化程度高于3.2、一般等于或高于3.5的新型N，O-過硫酸化K5化合物。


圖1所示為由發(fā)酵而成純度為80％的K5的1H-NMR譜圖。
圖2所示為由發(fā)酵而成不合親油物質(zhì)且純度大于99％的K5的1H-NMR譜圖。
具體實(shí)施例方式
所以，本發(fā)明的其中之一在于提供一種硫酸化程度高于3.2的新型N，O-過硫酸化K5的制備方法，其包括以下步驟(a)在高鹽水溶液中以異丙醇處理由發(fā)酵而成的K5；(b)通過堿性水解使所純化的K5受到N-脫乙?；饔?，然后用N-硫酸化試劑處理使其再受到N-硫酸化作用；(c)在O-過硫酸化條件下，以O(shè)-硫酸化試劑處理所得的N-硫酸化K5銨鹽；以及(d)若需要，使所得的化合物再次受到N-硫酸化作用，并將N，O-過硫酸化K5以鈉鹽形式分離出來，可任選地將所述的鈉鹽轉(zhuǎn)化為另一種鹽。
術(shù)語“硫酸化程度”指每個(gè)二糖單位的硫酸根數(shù)目，以硫酸鹽/羧基之比表示。
術(shù)語“過硫酸化”指使例如用方法C所得的N-硫酸化K5過硫酸化。
在步驟(a)中，用作原料的K5可以是通過能夠產(chǎn)生K5的野生或克隆大腸桿菌株發(fā)酵而得到的任何一種產(chǎn)物。具體地說，可采用上述引用文獻(xiàn)所述的K5，優(yōu)選為M.Manzoni等人(JournalBioactive Compatible Polymers，1996，11，301-311)或下文制備方法I所列出的K5。
較適宜的K5原料具有較低分子量，特別是分子量分布在約1,500到約15,000范圍內(nèi)，優(yōu)選約2,000到約9,000，平均分子量約5,000，或者具有較高分子量，特別是分子量分布在約10,000到約50,000范圍內(nèi)，優(yōu)選約20,000到約40,000，平均分子量約30,000。優(yōu)選的K5原料的分子量分布在約1,500到約50,000范圍內(nèi)，平均分子量為20,000到25,000。
本文所述的K5及其衍生物的分子量采用已知分子量的肝素組分作為標(biāo)準(zhǔn)來計(jì)算，本發(fā)明的所有分子量均以道爾頓(D)表示。
原料可以是預(yù)先純化的K5，例如，該純化的K5已經(jīng)用已知的方法除去了內(nèi)毒素、熱原或其他雜質(zhì)。
同樣地，如果步驟(a)結(jié)束時(shí)所得的K5用作藥物用途或用來制備作藥物用途的N，O-硫酸化K5，它也要提純除去熱原和內(nèi)毒素。
實(shí)際上，將K5原料以0.5-10％的濃度溶于2-5M溶液，最好是氯化鈉溶液中，并在0-8℃下用1-3體積的異丙醇處理，再加入鹽最好是氯化鈉將所得的溶液配成2-4M。
保持在同樣的溫度1-18小時(shí)后，步驟(a)的產(chǎn)物完全沉淀，經(jīng)過濾或離心分離出來。若產(chǎn)物的純度未達(dá)到要求，重復(fù)步驟(a)。將所得的固體產(chǎn)物重溶于水中，用膜超濾回收。
步驟(a)結(jié)束時(shí)得到一種K5，其具有與原料相同的性質(zhì)，但基本上不含有親油物質(zhì)。
實(shí)際上，用一種方法可獲得不含親油物質(zhì)的K5，該方法包括(a 1)在4℃用1體積異丙醇處理K5，該K5由發(fā)酵而成并溶于4M氯化鈉溶液中，(a2)加入計(jì)算量的氯化鈉飽和溶液將所得的鹽溶液配成3M，(a3)該溶液在4℃放置過夜，以及(a4)離心分離產(chǎn)物，超濾除去鹽類。
用異丙醇提純可得到不含親油物質(zhì)、純度高于99％的K5。這種K5在隨后步驟(c)中可被高度硫酸化。
在步驟(b)中，按照已知的堿性水解方法進(jìn)行N-脫乙酰化作用，例如，含有硫酸肼的肼，或堿如堿性氫氧化物，象氫氧化鈉或氫氧化鉀水溶液。最好在40-80℃下在氫氧化鈉水溶液中控制反應(yīng)過程來進(jìn)行反應(yīng)。一般來說，最多30小時(shí)但實(shí)際上經(jīng)過12-24小時(shí)后就會(huì)完成N-脫乙?；?，用酸最好是鹽酸中和介質(zhì)的堿性。
然后，在堿性碳酸鹽如碳酸鈉存在下用N-硫酸化試劑處理含有K5和鹽類的溶液，例如，N-硫酸化試劑是帶有硫酐(三氧化硫)的叔有機(jī)堿加成物，象吡啶·三氧化硫(C5H5N·SO3)加成物或者三烷基胺.三氧化硫加成物，象三甲胺·三氧化硫加成物。反應(yīng)可在室溫(20-30℃)下進(jìn)行，但也可在較高的溫度(最高約65℃)下進(jìn)行以縮短反應(yīng)時(shí)間?？赏瑫r(shí)加入堿性碳酸鹽和硫酸化試劑，或者先將堿性碳酸鹽加入母液，再在5分鐘至12小時(shí)內(nèi)逐滴加入硫酸化試劑。反應(yīng)結(jié)束時(shí)在室溫下用酸最好是鹽酸將混合液調(diào)pH為7.5-8，并通過例如滲濾除去鹽類。所得到的溶液含有堿性鹽N-硫酸化K5，對(duì)該溶液實(shí)施下面的步驟(c)，或者可將它濃縮，用常規(guī)方法以鈉鹽形式分離出N-硫酸化K5。所得到的90-100％N-硫酸化K5被硫酸化。
在步驟(c)中，使步驟(b)中得到的含堿性N-硫酸化K5的溶液通過陽離子交換樹脂如IR 120H+中和至酸性pH值。所得的酸性溶液用有機(jī)叔或季堿處理，例如三烷基胺，象三甲胺，或者四烷基氫氣化銨，最好是四丁基氫氧化銨，濃縮至最小體積，凍干。所分離的N-硫酸化K5銨鹽懸于極性疏質(zhì)子溶劑如二甲基甲酰胺或二甲亞砜中，用O-硫酸化試劑如加成物C5H5N·SO3處理。該加成物C5H5N·SO3可為固態(tài)或在溶于同一種極性疏質(zhì)子溶劑中。硫酸化作用可在室溫(20-30℃)至70℃之間，最好在40至60℃之間進(jìn)行2至24小時(shí)。
反應(yīng)結(jié)束時(shí)，溶液在室溫下用氯化鈉飽和丙酮溶液處理直至完全沉淀。過濾分離沉淀物與溶劑，沉淀物溶于最小量的去離子水(例如100毫升)中，加入氯化鈉配成0.2M溶液。該溶液用2N氫氧化鈉調(diào)至pH 7.5-8，并加入丙酮直到完全沉淀。過濾后，將固體溶于100毫升去離子水中，按步驟(b)所述的方法從殘留的鹽超濾純化該固體。
對(duì)所得的產(chǎn)物的凍干樣本作13C-NMR分析，如果發(fā)現(xiàn)在過硫酸化期間有部分發(fā)生N-脫硫酸化作用，使該產(chǎn)物進(jìn)行步驟(d)。
在步驟(d)中，將步驟(c)結(jié)束時(shí)所得的產(chǎn)物在步驟(b)的條件下用N-硫酸化試劑處理，直至完成N-硫酸化作用，若N-硫酸化未完成，重復(fù)該步驟。
所得的N，O-過硫酸化K5以其鈉鹽形式分離出來，用已知的方法例如裝有適當(dāng)樹脂的離子交換、用溶劑沉淀或通過膜超濾等方法可將鈉鹽轉(zhuǎn)化為另一種鹽，如鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋁鹽、鋅鹽或復(fù)合鹽。
本發(fā)明的另一方面在于提供一種由發(fā)酵而成基本上不含親油物質(zhì)的純K5。
通過1H-NMR譜圖、紫外光譜、咔唑反應(yīng)或測(cè)定蛋白質(zhì)的試劑盒可分析測(cè)定由發(fā)酵制成的新型純K5的純度。這些分析證實(shí)了步驟(a)結(jié)束時(shí)所得到的K5的基本性質(zhì)是其1H-NMR譜圖不存在低于1.5ppm區(qū)段的信號(hào)。而且也檢測(cè)不到核酸(用標(biāo)準(zhǔn)紫外線分光光度計(jì)測(cè)得260納米處的吸光值為0)，根據(jù)BioRad試劑盒測(cè)得蛋白質(zhì)不高于0.5％，宜低于0.25％，優(yōu)選低于0.1％，最好低于0.03％。
事實(shí)上，步驟(a)結(jié)束時(shí)所得到的新型純K5不含有親油物質(zhì)和核酸。所用的“基本上”指沒有親油物質(zhì)，“檢測(cè)不到的”指核酸的含量是所使用的儀器靈敏度無法顯示上述雜質(zhì)的存在。
所以，業(yè)已確定，以此方式得到的純K5多糖的1H-NMR譜圖沒有低于1.5ppm親油物質(zhì)甲基的信號(hào)。
所得的新型純化K5化合物優(yōu)選具有較低分子量，特別是分子量分布在約1,500到約15,000范圍內(nèi)，優(yōu)選約2,000到約9,000，平均分子量約5,000，或者具有較高分子量，特別是分子量分布在約10,000到約50,000范圍內(nèi)，優(yōu)選約20,000到約40,000，平均分子量約30,000。優(yōu)選的K5原料的分子量分布在約1,500到約50,000范圍內(nèi)，平均分子量為20,000到25,000，所述的K5化合物可以制備硫酸化程度高的N，O-過硫酸化K5。
所以，本發(fā)明的另一方面在于是提供一些硫酸化程度高于3.2的新型N，O-過硫酸化K5化合物及其鹽類。該新型N，O-過硫酸化K5多糖的硫酸化程度優(yōu)選為3.2至4，更優(yōu)選為3.5至4，最好是3.7到4。該新型N，O-過硫酸化K5的鹽類最好是藥學(xué)上可接受的。
所述N，O-過硫酸化K5優(yōu)選具有較低分子量，特別是分子量分布在約2,000到約16,000范圍內(nèi)，優(yōu)選約2,500到約10,000，平均分子量約6,500，或者具有較高分子量，特別是分子量分布在約13,000到約65,000范圍內(nèi)，優(yōu)選約25,000到約50,000，平均分子量約40,000。本發(fā)明的N，O-過硫酸化K5的分子量最好分布在約2,000到約65,000范圍內(nèi)，平均分子量為25,000-30,000。此外，通過解聚而得到的具有極低平均分子量如約2,000到5,000的N，O-過硫酸化K5化合物構(gòu)成令人非常感興趣的產(chǎn)物。
在上述方法的步驟(b)-(d)之一結(jié)束時(shí)，最好在步驟(b)結(jié)束時(shí)或者對(duì)最終的N，O-過硫酸化K5進(jìn)行解聚作用，這種解聚可以制備平均分子量為2,000到5,000的N，O-過硫酸化K5。
該解聚步驟可按照公知的肝素解聚方法進(jìn)行，例如用亞硝酸，再與硼氫化鈉起還原反應(yīng)(EP 37319)、用高碘酸鈉(EP 287477)、游離基(EP 121067)或消除β位(EP 40144)。根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施例，按EP544592詳細(xì)敘述的方法用亞硝酸對(duì)步驟(b)結(jié)束時(shí)所得的N-硫酸化K5進(jìn)行解聚，再用硼氫化鈉還原。解聚和還原結(jié)束時(shí)，使所得的低分子量產(chǎn)物進(jìn)行步驟(c)，可任選地進(jìn)行步驟(d)，并分離N，O-過硫酸化K5。
另外，這種解聚和還原方法也適用于具有高分子量的N，O-過硫酸化K5，可直接得到相應(yīng)的低分子量產(chǎn)物。
在上述的N，O-過硫酸化K5化合物的鹽類中，優(yōu)選為鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋁鹽和鋅鹽。
本發(fā)明的另一方面在于提供由以下方法制成的新型N，O-過硫酸化K5多糖，其硫酸化程度高于3.2，特別是3.2到4，優(yōu)選為3.5到4，最好是3.7到4，所述的方法包括(a)在高鹽水溶液中以異丙醇處理由發(fā)酵而成的K5；(b)通過堿性水解使所得的K5受到N-脫乙?；饔?，然后用N-硫酸化試劑處理使其再受到N-硫酸化作用；(c)在O-過硫酸化條件下，用O-硫酸化試劑處理所得的N-硫酸化K5銨鹽；以及(d)若需要，使所得的產(chǎn)物受到N-硫酸化作用，并將N，O-過硫酸化K5以鈉鹽形式分離出來，若需要可轉(zhuǎn)化為另一種鹽。
由上述方法得到的N，O-過硫酸化K5的硫酸化程度為3.2到4，優(yōu)選為3.5到4，最好是3.7到4。
根據(jù)本發(fā)明方法得到的新型N，O-過硫酸化K5化合物，特別是其鹽類，是高度陰離子化產(chǎn)物，可用作化妝品工業(yè)的共同佐劑，防止頭發(fā)脫落，以及用作藥物工業(yè)上能夠捕獲游離基的產(chǎn)物。
所述的N，O-過硫酸化K5化合物在葡萄糖胺單位的位置6-O-和2-NH-上被完全硫酸化，而在葡萄糖醛酸單位中，它們?cè)谖恢?，3-O-上被硫酸氫化或者(2-O-或3-O-)被單硫酸化，葡萄糖醛酸單位中硫酸根的百分比取決于硫酸化程度。
所以，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供由混合鏈組成的新型N，O-過硫酸化K5，其中所述鏈的至少90％以下列一般式(I)表示，
式中，n是3到100，R和R’是氫或SO3-，R和R’至少之一不是氫，附帶條件是-R和R’二者均為SO3-在n單位中占60％到100％；-R和R’其中之一為氫，另一個(gè)為SO3-，在n單位中占0到40％；硫酸化程度是3.2到4，以及相應(yīng)的陽離子是化學(xué)上或藥學(xué)上可接受的陽離子。
本文的術(shù)語“化學(xué)上可接受的”指一種用于可作進(jìn)一步合成的陽離子，如銨或(C1-C4)三烷基銨離子，或者指一種用于純化產(chǎn)物的陽離子，優(yōu)選的陽離子是以上所述的鈉離子、鉀離子、鎂離子、鋁離子和鋅離子。
在所述混合鏈多達(dá)10％的剩余鏈中，為了達(dá)到一定的硫酸化程度，葡萄糖胺單位中一定量的硫酸根可自2位處分開并轉(zhuǎn)移到所述葡萄糖胺單位的3-OH基團(tuán)上。
它們的陰離子含量高導(dǎo)致本發(fā)明的N，O-過硫酸化K5多糖對(duì)游離基團(tuán)具有良好的活性。由于它們的毒性低，所以它們可用作制備藥物和化妝品組合物的活性成分。
所以，本發(fā)明還提供一些藥物組合物，其活性成分為藥學(xué)上有效量的N，O-過硫酸化K5或其藥學(xué)上可接受的鹽類之一，并摻有藥學(xué)賦形劑，所述N，O-過硫酸化K5的硫酸化程度高于3.2，優(yōu)選為3.2到4，更優(yōu)選為3.5到4，最好是3.7到4。
在供口服、皮下、靜脈、肌肉內(nèi)、經(jīng)皮或局部給藥的本發(fā)明的藥物組合物中，活性成分最好以劑量單位形式給予，并摻有常規(guī)的藥學(xué)載體或介質(zhì)。
服藥量可隨患者的年齡、體重和健康狀況而改變。這種服藥量包括經(jīng)靜脈、皮下、口服、肌肉內(nèi)、經(jīng)皮或局部途徑給藥的劑量為1到1,000毫克，優(yōu)選為10到750毫克，最好為250到500毫克，1日1次到3次。
本發(fā)明的又一方面內(nèi)容涉及一種化妝品組合物，該組合物的活性成分之一為N，O-過硫酸化K5或其藥學(xué)上可接受的鹽類之一，并摻有化妝品賦形劑，所述N，O-過硫酸化K5的硫酸化程度高于3.2，優(yōu)選為3.2到4，更優(yōu)選為3.5到4，最好是3.7到4。
選自鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋁鹽和鋅鹽的一種鹽構(gòu)成本發(fā)明組合物的有效活性成分。
最后，本發(fā)明的又一方面還在于提供一些含有本發(fā)明新型純化的K5為活性成分的藥物和化妝品組合物。
制備方法I由大腸桿菌制備K5多糖首先采用下列培養(yǎng)基在燒瓶進(jìn)行發(fā)酵脫脂大豆2克/升磷酸氫鉀9.7克/升磷酸二氫鉀 2克/升氯化鎂 0.11克/升檸檬酸鈉0.5克/升硫酸銨1克/升葡萄糖2克/升水1,000毫升pH＝7.3培養(yǎng)基在120℃滅菌20分鐘。另外準(zhǔn)備葡萄糖溶液，在120℃滅菌30分鐘，在滅菌條件下將該溶液加到培養(yǎng)基中。向燒瓶中傾倒地注入大腸桿菌細(xì)胞Bi 8337/41(O10:K5:H4)懸浮液，所述懸浮液含胰蛋白大豆瓊脂的斜面，并且在37℃恒定攪拌(160rpm，每轉(zhuǎn)6厘米)保溫24小時(shí)。測(cè)量細(xì)菌生長(zhǎng)，用顯微鏡計(jì)算細(xì)胞。在另一步驟中，把0.1％上述燒瓶培養(yǎng)基倒入含有上述同一種培養(yǎng)基的14升Chemap-Braun發(fā)酵罐中，在下列條件發(fā)酵18小時(shí)曝氣1vvm(vvm是每分鐘每液體體積的空氣體積)、攪拌速度400rpm、溫度37℃。測(cè)量發(fā)酵期間的pH值、氧氣、殘留的葡萄糖、產(chǎn)生的K5多糖及細(xì)菌生長(zhǎng)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)將溫度升到80℃，保持10分鐘。以10,000rpm的轉(zhuǎn)速離心分離細(xì)胞與培養(yǎng)基，上清液用SS 316(MST)組件超濾，體積減至1/5，所述組件配有公稱截留分子量為800到10,000D的PES濾膜。再在4℃加入4體積丙酮沉淀K5多糖，沉淀物4℃放置一晚，最后10,000rpm離心20分鐘或過濾。接著，在37℃用Aspergillus Orizae的II型蛋白酶在含0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)的0.1M氯化鈉和0.15M pH8乙二胺四乙酸(EDTA)(10毫克/升濾液)中去蛋白90分鐘。該溶液在配有公稱截留分子量為10,000D的SS 316組件上超濾，用1M氯化鈉提取2次，用水洗至超濾液的吸收消失。再次用丙酮沉淀K5多糖，發(fā)酵罐的產(chǎn)率為850毫克/升。通過測(cè)定糖醛酸(咔唑方法)、質(zhì)子和碳核磁共振、紫外線及蛋白含量來測(cè)量多糖的純度。測(cè)得的純度超過80％。由此所得的多糖由兩種不同分子量的組分組成，用75HRPharmacia層析柱通過高效液相色譜法測(cè)定它們的分子量分別是30,000和5,000D，采用兩根串聯(lián)Bio-sil SEC 250柱(BioRad)測(cè)得單一組分的停留時(shí)間約9分鐘，室溫下以硫酸鈉為流動(dòng)相，流動(dòng)速度為0.5毫升/分鐘。這種測(cè)量是對(duì)照已知分子量的肝素組分的曲線而進(jìn)行。
所得到的純化K5的質(zhì)子核磁共振1H-NMR見圖1。
應(yīng)注意，低于1.5ppm的區(qū)域中有許多由親油物質(zhì)的甲基產(chǎn)生的信號(hào)。
實(shí)施例1K5的純化將5克制備方法1結(jié)束時(shí)所得到的K5溶于100毫升含4M氯化鈉的水溶液中，4℃恒溫，然后向所得到的溶液加入1體積冷卻異丙醇。加入計(jì)算量的氯化鈉飽和溶液配成3M鹽溶液，冷卻溶液低溫(約4℃)放置過夜。以10,000rpm的轉(zhuǎn)速離心20分鐘分離所形成的沉淀，透析一晚，然后作1H-NMR分析，其低于1.5ppm的區(qū)域必須無信號(hào)，以此控制產(chǎn)物的純度。若需要，可重復(fù)溶于4M氯化鈉水溶液和用異丙醇沉淀的步驟。將沉淀物溶于水中，在截留分子量為10,000D的微型板濾膜(Millipore)上超濾直到鹽消失。得到的K5的純度至少為99％，其1H-NMR譜圖見圖2。
可以看出，低于1.5ppm的區(qū)域沒有任何親油性雜質(zhì)。
用BioRad試劑盒計(jì)算蛋白質(zhì)含量為0.02％，但檢測(cè)不到核酸(260納米處吸光值為0)。
實(shí)施例2N，O-過硫酸化K5的制備
(i)N-脫乙?；饔萌?0克實(shí)施例1制成的純K5多糖，溶于1,000毫升2N氫氧化鈉溶液中，所制成的溶液在60℃保持24小時(shí)。溶液冷卻至室溫，再用6N鹽酸中和pH值。
(ii)N-硫酸化作用40℃下將16克碳酸鈉加入含脫乙?；疜5的溶液中，然后在4小時(shí)內(nèi)加入16克吡啶.三氧化硫。經(jīng)過24小時(shí)反應(yīng)結(jié)束，溶液冷卻至室溫，再用5％鹽酸溶液調(diào)pH值為7.5-8。采用截留分子量為1,000D的螺旋膜(Prepscale Cartridge-Millipore)通過滲濾從鹽純化該產(chǎn)物。當(dāng)滲透液的導(dǎo)電率少于1,000μS優(yōu)選少于100μS時(shí)中止純化過程。用同一個(gè)濃縮透析系統(tǒng)減少內(nèi)部透析，直到多糖濃度為10％。將濃縮溶液凍干。13C-NMR分析顯示沒有N-乙酰殘基或NH2殘基。
(iii)O-過硫酸化作用將步驟(ii)結(jié)束時(shí)所得到的凍干產(chǎn)物溶于100毫升去離子水中，冷浴使該溶液冷卻至10℃，再通過陽離子交換樹脂IR120H+(100毫升)。層析柱和容器都保持在10℃。待含有該樣本的溶液通過后，用去離子水清洗樹脂直到滲透液的pH值大于6(約3體積去離子水)。酸性溶液用四丁基氫氧化銨(15％水溶液)調(diào)至中性(pH值為7)，然后濃縮至最小體積并凍干。將四丁基銨鹽溶于400毫升二甲基甲酰胺中，加入35克固體形式C5H5N·SO3。溶液在50℃保持24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束時(shí)將溶液冷卻至室溫，加入3體積氯化鈉飽和丙酮溶液，冷卻至4℃直至完全沉淀(12小時(shí))。過濾分離所得的沉淀物與溶劑，將沉淀物溶于最小量的去離子水(約100毫升)中，加入氯化鈉配成0.2M溶液。
該溶液用2N氫氧化鈉調(diào)pH為7.5-8，并用2體積丙酮處理直到完全沉淀。過濾分離沉淀物與溶劑。將所得的固體溶于100毫升去離子水中，如步驟(ii)所述那樣用1,000D的螺旋膜(Prepscale Cartridge-Millipore)從殘留的鹽中超濾純化該固體。
(iv)N-硫酸化作用按照步驟(ii)中進(jìn)行N-硫酸化作用的方法，處理所得含O-硫酸化產(chǎn)物的溶液。該產(chǎn)物的平均分子量為15,000D，硫酸鹽/羧基之比為3.84。通過13C-NMR確定硫酸根的分布如下組成性二糖的葡萄糖胺單位被全部N-硫酸化和6-O硫酸化，而葡萄糖醛酸單位有30％被單硫酸化，70％被硫酸氫化。
實(shí)施例3N，O-過硫酸化K5的制備以M.Manzoni等人(1996)所述的方法得到并作特性分析的K5為原料。該制成的K5采用實(shí)施例1所述的方法提純，得到了純K5，它不存在低于1.5ppm的信號(hào)，不含核酸，蛋白質(zhì)含量為0.5％。按實(shí)施例2所述的方法操作，得到平均分子量為13,000D且硫酸鹽/羧基之比為3.54的N，O-過硫酸化K5。
權(quán)利要求
1.一種基本上不含親油物質(zhì)的純K5多糖或其鹽。
2.如權(quán)利要求1所述的純K5多糖，所述純K5多糖在1H-NMR譜圖低于1.5ppm的區(qū)域中沒有信號(hào)。
3.如權(quán)利要求2所述的純K5多糖，其中在紫外光譜260納米處檢測(cè)不到核酸，且蛋白質(zhì)含量低于0.5％。
4.一種制備如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的純K5多糖的方法，包括在2-5M的鹽水溶液中用異丙醇處理由發(fā)酵得到的K5多糖。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述K5多糖的原料以0.5-10％的濃度溶解于所述鹽溶液中，且添加1-3體積的所述異丙醇。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述鹽溶液是2-5M的氯化鈉水溶液。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述K5多糖的原料以0.5-10％的濃度溶解于2-5M的氯化鈉溶液中，在0-8℃的溫度下用1-3體積的異丙醇處理，進(jìn)一步添加氯化鈉將所得的溶液配成2-4M，得到不含親油物質(zhì)的K5多糖，并通過過濾或離心進(jìn)行分離。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于(a1)用1體積的異丙醇處理在4℃在4M氯化鈉溶液中溶解的由發(fā)酵得到的K5多糖，(a2)加入計(jì)算量的氯化鈉將該鹽溶液配成3M，(a3)使該溶液在4℃放置過夜，以及(a4)離心分離產(chǎn)物，并超濾除去鹽。
全文摘要
本發(fā)明敘述了通過異丙醇處理和消除親油物質(zhì)提純大腸桿菌K5多糖。純化的產(chǎn)物經(jīng)過N－脫乙?；饔煤罂捎脕碇苽淞蛩峄潭雀叩男滦蚇，O－硫酸化多糖。
文檔編號(hào)A61K31/715GK1916030SQ20061012756
公開日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2002年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月27日
發(fā)明者喬治·佐派蒂, 帕斯夸·安娜·奧雷斯特 申請(qǐng)人:喬治·佐派蒂, 帕斯夸·安娜·奧雷斯特