專利名稱：抗牛、豬用抗o型、亞洲i型口蹄疫免疫球蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及采用兩種免疫原制備治療和預(yù)防抗O型、亞洲I型豬口蹄疫的免疫球蛋白，國(guó)際專利分類號(hào)為A61K39/395。
背景技術(shù)：
口蹄疫(FMD)是反芻動(dòng)物的一種急性、烈性傳染病。牛、豬等偶蹄獸易感，人類亦可感染。該病嚴(yán)重威脅偶蹄獸及其產(chǎn)品的國(guó)內(nèi)外貿(mào)易及至于人類的健康，口蹄疫一旦爆發(fā)隨時(shí)所采取的疫病檢驗(yàn)、隔離、撲滅、防疫等，將給國(guó)家?guī)碇卮蟮慕?jīng)濟(jì)損失。
口蹄疫病毒目前有O、A、亞洲I型等7個(gè)血清型。我國(guó)豬、?？谔阋叨酁镺型和亞洲I型，各型之間幾乎沒有交叉免疫力。因此，我國(guó)預(yù)防口蹄疫主要針對(duì)O型和亞洲I型。
口蹄疫病毒通常經(jīng)消化道感染，近年來證明呼吸道感染更易發(fā)生，感染動(dòng)物從唾液等分泌物和糞尿等排泄物排出，感染動(dòng)物特別是豬、牛呼出或噴出的傳染性氣溶膠是重要的散布方式。一旦爆發(fā)，在周圍10km內(nèi)進(jìn)行緊急環(huán)行預(yù)防注射是非常必要的。
牛、豬等家畜中確實(shí)存在隱性帶毒現(xiàn)象，多年來從未發(fā)生口蹄疫的地區(qū)收購肉豬，經(jīng)長(zhǎng)途集中運(yùn)輸、在到達(dá)目的地后甚至在途中，多次發(fā)生口蹄疫疫情。對(duì)這些豬緊急接種，以消除隱性帶毒和預(yù)防亦是非常重要的。
初生牛犢和仔豬，血清中沒有免疫球蛋白，吸吮免疫母體的初乳后，才能在血清中測(cè)出母源抗體。犢牛和仔豬不能及時(shí)吃到初乳以及免疫母體的初乳中的免疫球蛋白低下，都不能保護(hù)新生犢牛和仔豬免受口蹄疫病毒的攻擊。
動(dòng)物機(jī)體對(duì)沒有交叉免疫的O型和亞洲I型抗原物質(zhì)的相互作用，產(chǎn)生與O型和亞洲I型抗原決定簇發(fā)生反應(yīng)的特異性抗體，即免疫球蛋白，給動(dòng)物被動(dòng)地輸入抗體，可以使其對(duì)相應(yīng)的病毒感染呈現(xiàn)預(yù)防及治療作用。
不同種類的動(dòng)物對(duì)于同一病毒的不同的抵抗力及敏感性是人們?cè)缫颜J(rèn)識(shí)的事實(shí)。牛、豬等對(duì)口蹄疫敏感，而馬屬動(dòng)物、禽類、狗、貓不易感。許多牛、豬易感的病原，馬屬動(dòng)物同樣不易感。所以用異種動(dòng)物(如馬屬動(dòng)物)制備的給牛、豬使用的免疫球蛋白不僅量大，而且不易造成牛、豬易感病原的污染和人為傳播。
異種動(dòng)物的血清有可能發(fā)生血清病或過敏，精提的方法不僅可以避免，而且還可通過精制過程中的有關(guān)工藝條件，將可能污染的外源病毒滅活；一般地說，抗體能夠中和細(xì)胞外的病毒，不能進(jìn)入細(xì)胞中和細(xì)胞內(nèi)的病毒，因此，應(yīng)早期應(yīng)用，即在病毒宿主細(xì)胞內(nèi)的隔離部位獲得立足點(diǎn)之前；免疫球蛋白給動(dòng)物注射要有足夠的量，使其達(dá)到相應(yīng)病毒的最低抗體保護(hù)值之上，即使這樣，保護(hù)期僅為2周左右。
口蹄疫的預(yù)防重點(diǎn)是疫苗的免疫預(yù)防接種。我國(guó)已批準(zhǔn)上市的滅活疫苗有?？谔阋邅喼轎型滅活疫苗；豬、牛口蹄疫O型滅活疫苗等。由于避免母源抗體的干擾，豬30～40日齡首免，免后15天(45～55日齡)免疫合格率不超過40％；免疫后30天(60～70日齡)，免疫合格率不超過80％，免后90天(120～130日齡)，免疫合格率不超過20％；據(jù)此，必須在免后30天(60～70日齡)行二免。
在母畜不接種或接種次數(shù)少，仔畜從初乳中獲得的母源抗體少，30日齡前易感；30日齡～60日齡，首免后的仔豬、犢牛中抗體達(dá)不到保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)，也易感。在敏感期內(nèi)，如有感染病毒，則易發(fā)生口蹄疫。
對(duì)發(fā)生口蹄疫的情況下，用口蹄疫滅活疫苗采用環(huán)行包圍圈式的免疫預(yù)防，因免后30天才有可能解除封鎖，給隔離預(yù)防增加了很大的困難，在30天內(nèi)因隔離帶內(nèi)動(dòng)物的可能感染而使其逃逸到環(huán)行包圍圈外的可能也存在。

發(fā)明內(nèi)容
免疫球蛋白是最確實(shí)的口蹄疫緊急預(yù)防和治療的制劑。由于口蹄疫發(fā)病后，疫區(qū)采用隔離、撲殺的防疫措施，所以不能用于治療。那么對(duì)于環(huán)形隔離帶的豬、牛等實(shí)行緊急免疫預(yù)防，與滅活疫苗相比，注射2h后，到注射2周，就能確實(shí)起到免疫預(yù)防隔離的作用，為疫情的撲滅創(chuàng)造了最好的條件。對(duì)可能隱性感染的豬、牛等的長(zhǎng)途運(yùn)輸，實(shí)行運(yùn)輸前的緊急免疫預(yù)防，則可在運(yùn)輸途中直至到達(dá)目的地，不會(huì)遭受口蹄疫病毒的侵襲。鑒于我國(guó)牛、豬多發(fā)O型和亞洲I型口蹄疫，本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種安全、可靠，臨床效果顯著的既有抗O型，又有抗亞洲I型口蹄疫的免疫球蛋白制劑抗牛、豬用抗O型、亞洲I型口蹄疫免疫球蛋白。
鑒于需要同一匹免疫動(dòng)物生產(chǎn)既含有抗O型又含有抗亞洲I型的免疫球蛋白，鑒于用強(qiáng)毒進(jìn)行加強(qiáng)免疫的散毒危險(xiǎn)性，還鑒于吉林鯨象動(dòng)物藥業(yè)有限公司研制的新型免疫佐劑苷肽注射液的重要作用，本發(fā)明的免疫原采用云南保山疫苗廠生產(chǎn)的?？谔阋邅喼轎型滅活苗、中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠生產(chǎn)的豬、?？谔阋逴型滅活疫苗；免疫原亞洲I型滅活苗與O型滅活疫苗混合的體積比為(1～2)∶(1～2)；免疫佐劑采用弗氏完全佐劑；免疫增強(qiáng)劑采用吉林鯨象動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的苷肽注射液(發(fā)明名稱為一種提高動(dòng)物免疫功能的苷肽注射液，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?005 1 0016626.2)，5毫升/支；免疫原與弗氏完全佐劑混合的體積比為1∶1；免疫動(dòng)物選擇馬屬動(dòng)物(馬、驢、騾)等異種動(dòng)物。按國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行馬傳染性貧血和鼻疽的檢驗(yàn)，進(jìn)行健康檢查。3～8歲，營(yíng)養(yǎng)良好，體型大者。
免疫程序基礎(chǔ)免疫 注射1次基礎(chǔ)免疫原的組合劑量為亞洲I型油佐劑滅活苗(簡(jiǎn)稱抗原1)3.0ml，豬、牛O型油佐劑滅活苗(簡(jiǎn)稱抗原2)3.0ml，苷肽注射液(簡(jiǎn)稱抗原3)5.0ml.免疫途徑抗原1頸部肌肉注射，抗原2耳根部肌肉注射，抗原3臀部肌肉注射。即三種抗原同時(shí)分別免疫。
加強(qiáng)免疫 從基礎(chǔ)免疫后28天開始，間隔10天，免疫三次。加強(qiáng)免疫原的組合劑量抗原1分別為6ml、9ml、11ml，抗原2分別為6ml、9ml、11ml，抗原3均為5ml。免疫途徑抗原1頸部?jī)蓚?cè)肌肉多點(diǎn)注射；抗原2耳根部和背部?jī)蓚?cè)多點(diǎn)肌肉注射，抗原3臀部肌肉注射，免疫三次均為三種抗原同時(shí)分別免疫。
驗(yàn)血及放血標(biāo)準(zhǔn)測(cè)抗體效價(jià)的方法 抗O型口蹄疫病毒的抗體效價(jià)，用中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的O型口蹄疫抗體檢測(cè)液相阻斷LPB-ELISA診斷試劑盒測(cè)定，抗亞洲I型口蹄疫病毒的抗體效價(jià)，用亞洲I型口蹄疫抗體檢測(cè)液相阻斷LPB-ELISA診斷試劑盒測(cè)定。
基礎(chǔ)免疫后28天，采血測(cè)免疫馬血清O型和亞洲I型的IBE抗體效價(jià)，為加強(qiáng)免疫做參數(shù)；加強(qiáng)免疫第三次注射后10天，采血測(cè)免疫馬血清O型和亞洲I型的LPB-ELISA抗體效價(jià)，當(dāng)O型和亞洲I型的LPB-ELISA抗體效價(jià)≥2048時(shí)，可以放血。不夠此效價(jià)時(shí)，可再免疫1次。第一次采血，15～17ml/kg體重，頸靜脈放血，間隔3～5天進(jìn)行第二次采血，第二次采血量較第一次量減少300～400ml。第一程采血后，休息15天，即可進(jìn)行下稱高免，以此類推。
血清的精制血清的精制 在血清中加入倍量的pH4.0的0.06mol/L的醋酸鹽緩沖液，在20℃左右的室溫下充分強(qiáng)力攪拌40min，同時(shí)按上述血清和緩沖液的混合液計(jì)算，以4％的比例滴加化學(xué)純級(jí)的辛酸，4000r/min離心30min，定性濾紙濾過，取濾液裝入透析袋，在PH5.6的0.015mol/L醋酸鹽液透析48小時(shí)。取出透析袋在20％PEG中適當(dāng)透析脫水。收集袋內(nèi)血清，按總量的0.5％加入氯仿0.85％加入氯化納和0.0035％加入硫柳汞，充分搖勻，除菌濾器抽濾即得。如10000ml血清，按上述精制工藝，獲得半成品約3500ml。
半成品效檢檢測(cè) 仍由O型和亞洲I型試LPB-ELISA劑盒測(cè)定。O型和亞洲I型LPB-ELISA抗體滴度均≥4096。
產(chǎn)品的分裝 將半成品適當(dāng)稀釋，按照成品分裝時(shí)，抗體效價(jià)應(yīng)比規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)高20％的原則，將半成品O型和亞洲I型LPB-ELISA抗體滴度由實(shí)際測(cè)得的效價(jià)稀釋至≥2500，將稀釋液定量分裝，每支5ml。
LPB-ELISA抗體滴度與免疫動(dòng)物攻讀保護(hù)的關(guān)系 ?？贵w滴度≥90，90％以上保護(hù)；22-90，50％保護(hù)；豬抗體滴度≥45，90％以上保護(hù)；4-45，50％保護(hù)。
產(chǎn)品的抗體滴度標(biāo)準(zhǔn)≥2048。按每公斤體重0.8ml，給牛注射，4h后牛血清抗O型、亞洲I型LPB-ELISA抗體滴度≥90；每公斤體重0.5ml給豬注射，4h后豬血清抗O型、亞洲I型LPB-ELISA抗體滴度≥45；按此量給牛、豬注射，4h后血清抗O型、亞洲I型LPB-ELISA抗體滴度均大于攻毒90％保護(hù)值。且有效維持期在2周左右。
實(shí)際應(yīng)用中在疫區(qū)周邊環(huán)形預(yù)防帶，給豬、牛肌肉注射牛每公斤體重0.8ml；豬牛每公斤體重0.5ml。豬、牛長(zhǎng)途運(yùn)輸，給豬、牛肌肉注射，牛牛每公斤體重0.4ml；豬，牛每公斤體重0.25ml。在注射中，如發(fā)生過敏反應(yīng)，則應(yīng)及時(shí)注射1％腎上腺素1.0ml解救。
實(shí)際應(yīng)用中證明，用馬制備的給牛、豬使用的O型、亞洲I型口蹄疫免疫球蛋白，能有效預(yù)防豬、牛免受O型、亞洲I型口蹄疫病毒的侵襲。按規(guī)定的使用劑量用于緊急預(yù)防接種，在2周內(nèi)，保護(hù)效果確實(shí)。對(duì)收購豬、牛的長(zhǎng)途運(yùn)輸，按規(guī)定的劑量接種，在2周內(nèi)，豬、牛亦安全(幾萬頭長(zhǎng)途運(yùn)輸豬、牛的預(yù)防注射，未見口蹄疫的發(fā)生)。
本發(fā)明給牛、豬的使用劑量是牛按牛每公斤體重0.8ml；豬按牛每公斤體重0.5ml肌注，兩種抗體效價(jià)?！?0，豬≥45，均達(dá)到和超過90％攻毒保護(hù)的抗體保護(hù)值，保證了被動(dòng)免疫保護(hù)效果。
本發(fā)明的被動(dòng)免疫有效持續(xù)期，從4h～2周，即被動(dòng)免疫起效快，14天的有效持續(xù)期，即保護(hù)豬、牛度過了難關(guān)，又為進(jìn)一步的疫苗接種爭(zhēng)取了時(shí)間，同時(shí)2周的有效持續(xù)期，亦為豬、牛的長(zhǎng)途運(yùn)輸營(yíng)造了14天的安全(對(duì)口蹄疫)保障。
本發(fā)明消除了異源血清可能引起的豬和牛的過敏反應(yīng)，萬一引起過敏，亦有腎上腺素肌注的解救辦法。
本產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下1、安全性好 成品安全試驗(yàn)用仔豬和犢牛，仔豬按牛每公斤體重1ml肌注，犢牛按牛每公斤體重1.6ml肌注，觀察兩周，無任何不良反應(yīng)；仔豬和犢牛的群體免疫預(yù)防，亦未見不良反應(yīng)。
2、臨床試用效果好 在發(fā)生口蹄疫的周邊地區(qū)，進(jìn)行豬緊急預(yù)防接種(1萬余頭)，每豬按牛每公斤體重0.5ml注射，被動(dòng)免疫豬未見口蹄疫發(fā)病者；進(jìn)行牛緊急預(yù)防接種(3千多頭)，未見被動(dòng)免疫牛發(fā)生口蹄疫，個(gè)別牛舌面出現(xiàn)水泡等口蹄疫先兆癥狀時(shí)，亦在被動(dòng)免疫注射后，迅速消失。說明免疫球蛋白對(duì)牛、豬口蹄疫的緊急預(yù)防是有獨(dú)特的效果。特別是早期預(yù)防，效果更佳。
3、本產(chǎn)品兩種免疫球蛋白效價(jià)都比較高。LPB-ELISA抗體滴度≥2048時(shí)放血，精制后LPB-ELISA抗體滴度≥4096，按≥2500時(shí)分裝，產(chǎn)品中LPB-ELISA抗體滴度在有效期內(nèi)均≥2048。
4、用馬等異種動(dòng)物來生產(chǎn)豬、牛等應(yīng)用的免疫球蛋白，可以避免同種動(dòng)物之間某些其它病毒性傳染病的人為傳播。
5、保存運(yùn)輸方便，本品呈無色透明液體，4℃保存，一年內(nèi)檢測(cè)O型和亞洲I型的LPB-ELISA抗體效價(jià)仍≥2048。非常穩(wěn)定，運(yùn)輸方便；肌肉注射使用亦方便。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
本發(fā)明的免疫原采用云南保山疫苗廠生產(chǎn)的?？谔阋邅喼轎型滅活苗、中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠生產(chǎn)的豬、?？谔阋逴型滅活疫苗；免疫原亞洲I型滅活苗與O型滅活疫苗混合的體積比為1.5∶1；免疫佐劑采用弗氏完全佐劑；免疫增強(qiáng)劑采用吉林鯨象動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的苷肽注射液，5毫升/支；免疫原與弗氏完全佐劑混合的體積比為1∶1；免疫程序免疫動(dòng)物選擇馬屬動(dòng)物(馬、驢、騾)等異種動(dòng)物。按國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行馬傳染性貧血和鼻疽的檢驗(yàn)，進(jìn)行健康檢查。3～8歲，營(yíng)養(yǎng)良好，體型大者。
基礎(chǔ)免疫 注射1次基礎(chǔ)免疫原的組合劑量為亞洲I型油佐劑滅活苗(簡(jiǎn)稱抗原1)3.0ml，豬、牛O型油佐劑滅活苗(簡(jiǎn)稱抗原2)3.0ml，苷肽注射液(簡(jiǎn)稱抗原3)5.0ml.免疫途徑抗原1頸部肌肉注射，抗原2耳根部肌肉注射，抗原3臀部肌肉注射。即三種抗原同時(shí)分別免疫。
加強(qiáng)免疫 從基礎(chǔ)免疫后28天開始，間隔10天，免疫三次。加強(qiáng)免疫原的組合劑量抗原1分別為6ml、9ml、11ml，抗原2分別為6ml、9ml、11ml，抗原3均為5ml。免疫途徑抗原1頸部?jī)蓚?cè)肌肉多點(diǎn)注射；抗原2耳根部和背部?jī)蓚?cè)多點(diǎn)肌肉注射，抗原3臀部肌肉注射，免疫三次均為三種抗原同時(shí)分別免疫。
驗(yàn)血及放血標(biāo)準(zhǔn)測(cè)抗體效價(jià)的方法 抗O型口蹄疫病毒的抗體效價(jià)，用中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的O型口蹄疫抗體檢測(cè)液相阻斷LPB-ELISA診斷試劑盒測(cè)定，抗亞洲I型口蹄疫病毒的抗體效價(jià)，用亞洲I型口蹄疫抗體檢測(cè)液相阻斷LPB-ELISA診斷試劑盒測(cè)定。
基礎(chǔ)免疫后28天，采血測(cè)免疫馬血清O型和亞洲I型的IBE抗體效價(jià)，為加強(qiáng)免疫做參數(shù)；第三次加強(qiáng)免疫后10天，采血測(cè)血清O型和亞洲I型的LPB-ELISA抗體效價(jià)，當(dāng)O型和亞洲I型的LPB-ELISA抗體效價(jià)≥2048時(shí)，可以放血。不夠此效價(jià)時(shí)，可再免疫1次。第一次采血，15～17ml/kg體重，頸靜脈放血，間隔3～5天進(jìn)行第二次采血，第二次采血量較第一次量減少300～400ml。第一次采血后，休息15天，即可進(jìn)行下次高免，以此類推。
血清的精制在血清中加入倍量的pH4.0的0.06mol/L的醋酸鹽緩沖液，同時(shí)按上述血清和緩沖液的混合液計(jì)算，以4％的比例滴加化學(xué)純級(jí)的辛酸，4000r/min離心30min，濾過，取濾液裝入透析袋，在PH5.6的0.015mol/L醋酸鹽液透析48小時(shí)。取出透析袋在20％PEG中適當(dāng)透析脫水。收集袋內(nèi)血清，除菌濾器抽濾即得。如10000ml血清，按上述精制工藝，獲得半成品約3500ml。
半成品效檢檢測(cè) 仍由O型和亞洲I型試LPB-ELISA劑盒測(cè)定。O型和亞洲I型LPB-ELISA抗體滴度均≥4096。
產(chǎn)品分裝將半成品適當(dāng)稀釋，按照成品分裝時(shí)，抗體效價(jià)應(yīng)比規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)高20％的原則，將半成品O型和亞洲I型LPB-ELISA抗體滴度由實(shí)際測(cè)得的效價(jià)稀釋至≥2500，將稀釋液定量分裝，每支5ml。
實(shí)施例2本發(fā)明的免疫原采用云南保山疫苗廠生產(chǎn)的?？谔阋邅喼轎型滅活苗、中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠生產(chǎn)的豬、?？谔阋逴型滅活疫苗；免疫原亞洲I型滅活苗與O型滅活疫苗混合的體積比為1∶1.5；免疫增強(qiáng)劑采用吉林鯨象動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的苷肽注射液，5毫升/支；免疫原與弗氏完全佐劑混合的體積比為1∶1；本發(fā)明的制備方法與實(shí)施例1相同。
權(quán)利要求
1.抗牛、豬用抗O型、亞洲I型口蹄疫免疫球蛋白，其特征是免疫原采用亞洲I型滅活苗與O型滅活疫苗；免疫佐劑采用弗氏完全佐劑；免疫增強(qiáng)劑采用吉林鯨象動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的苷肽注射液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗牛、豬用抗O型、亞洲I型口蹄疫免疫球蛋白，其特征是所述的免疫原亞洲I型滅活苗與O型滅活疫苗混合的體積比為(1～2)∶(1～2)；免疫原與弗氏完全佐劑混合的體積比為1∶1；所述的免疫增強(qiáng)劑苷肽注射液為5毫升/支。
全文摘要
抗牛、豬用抗O型、亞洲I型口蹄疫免疫球蛋白，是將口蹄疫O型抗原與亞洲1型抗原以體積比(1～2)∶(1～2)的比例混合免疫動(dòng)物，將弗氏佐劑與免疫原以體積比1∶1混合，同時(shí)用苷肽注射液作免疫增強(qiáng)劑，以提高抗體效價(jià)。其制備方法按照中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程(2000年版)規(guī)定的方法對(duì)制備的高免免疫球蛋白進(jìn)行加工；本發(fā)明該針對(duì)目前我國(guó)發(fā)生的口蹄疫主要是由O型和亞洲Ⅰ型引起的，對(duì)于危害嚴(yán)重的口蹄疫的緊急預(yù)防和治療提供了一個(gè)有效的制劑本發(fā)明還具有特異性高，針對(duì)性強(qiáng)，療效確實(shí)、安全性好、不會(huì)產(chǎn)生藥物殘留、保存和使用方便等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1966079SQ20061013163
公開日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2006年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月15日
發(fā)明者張中洋 申請(qǐng)人:張中洋