專利名稱：白藜蘆醇Mannich堿衍生物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，涉及幾種白藜蘆醇的衍生物及其制備方法和用途。
背景技術：
白藜蘆醇廣泛存在于毛葉藜蘆、虎杖、大黃等中藥和葡萄等食物中。早在1939年，日本就從毛葉藜蘆中提取分離得到了白藜蘆醇(日本化學會志，1939，601090～1100)。上世紀八十年代末，WHO進行的流行病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，盡管法國人愛吃奶酪這種高脂肪的食物，但法國人冠心病發(fā)病率較其他西方國家低(即所謂的“法國悖論”)，究其原因便是法國人愛喝的葡萄酒中的白藜蘆醇。深入研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對腫瘤、心血管疾病、炎癥等多種疾病具有良好的預防與治療作用。
白藜蘆醇對心血管作用主要表現(xiàn)抗動脈粥樣硬化和抑制LDL氧化(Biochem Pharmacol，1997，53(9)1347～1355；Life Sci，1997，61(21)2103～2110；Biochem Mol Biol Int，1999，47(6)1089～1096；Biochem Pharmacol，1998，55(6)811～816)、抑制血小板聚集(JP 61171427；Planta Med，1992，58(3)274～276)、抗缺血后再灌注損傷(Cardiovasc Res，2000，47549～555；Free Radic Biol Med，1999，27(12)160～169；J Stud Alcohol，2001，62(6)730～735)和促進血管松弛、保護和維持內(nèi)皮完整性(Gen Pharmacol，1996，27(2)363～366；J Hypertens，2000，18(12)1833～1840)等多方面。
1997年，Jang M等(Science，1997，275218～220)報道白藜蘆醇具有很好的癌癥預防作用，對致癌的三個階段均有很強的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過抗氧化和抗突變作用抑制癌癥的始發(fā)階段，通過抗炎作用和抑制環(huán)氧化酶、過氧化酶活性來抑制癌促階段，通過誘導癌細胞分化作用抑制癌癥擴展階段。在用DMBA作為誘發(fā)劑，TPA為促癌劑的小鼠的皮膚癌試驗中，每周兩次分別給予白藜蘆醇1、5、10和25μmol，18周后，與對照組比較，腫瘤發(fā)生率分別降低50、63、63和88％，皮膚癌數(shù)分別降低68、81、76和98％，同時，未有任何毒性表現(xiàn)。因此，認為白藜蘆醇是一個優(yōu)良的癌癥化學預防劑。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對腫瘤的作用與其抗氧化(Int J Biochem Cell Biol，2001，33(8)775～783；)、抗炎(Science，1997，275218～220；J Pharm Pharmacol，2004，56(9)1185～1189)、抑制腫瘤細胞增殖(Clin Cancer Res，2001，7(5)1466～1473；Cancer Lett，2001，163(1)43～49；Carcinogenesis，1999，20(2)237～242；Exp Cell Res，1999，249109～115；Biochem BiophyRes Commun，1998，25053～58等)、誘導腫瘤細胞凋亡與分化(Blood，1998，92(3)996～1002；第四軍醫(yī)大學學報，2004，25(19)1797～1799；陜西醫(yī)學雜志，2004，33(11)1031～1033)等多方面的作用有關。
此外，白藜蘆醇還具有預防老年癡呆癥(J Neurochemistry，2000，75(1)141～150)、抑制H+-K+-ATP酶(Biochem Pharmacol，1992，44(10)1947～1951)、抗菌等多種活性。
正因為白藜蘆醇具有上述多種生物活性，引起人們對白藜蘆醇及其衍生物、類似物的研究，大多為白藜蘆醇的甲基衍生物、酯、羥基類似物等，其中白藜蘆醇3，5-雙甲基化產(chǎn)物—3，5-二甲氧基-4’-羥基二苯乙烯(Pterostilbene，紫檀茋)是受到廣泛關注的白藜蘆醇衍生物，其廣泛存在于廣西血竭(中國中藥雜志，1998，23(10)616～618)、葡萄(J AgricFood Chem，2000，48(12)6103～6105)、蜂膠(Experientia，1978，34(2)157～159)等中，具有抗氧化、抗增殖、降血脂、中等強度抑制COX-1和COX-2的活性(IC50分別為19.8μM和83.9μM)、誘導HL-60細胞凋亡(IC5070μM)、預防DMBA誘發(fā)的癌變(ED504.8μM)、降血糖作用(對streptozotocen致糖尿病的大鼠模型，其降糖作用與二甲雙胍相近)和抗真菌活性(其抗真菌活性為白藜蘆醇的五倍)(J Agric Food Chem，2002，50(12)3453～3457；J Nat Prod，1997，60(6)609～610；J Agric FoodChem，2005，53(9)3403～3407；J Org Chem，2004，69(21)7101～7107)。
紫檀茋還有強大的抗增殖作用，較白藜蘆醇作用強且選擇性強，能抑制α-和λ-DNA聚合酶，也能抑制SV40 DNA的復制，其抑制活性與α-、δ-和ξ-DNA三重聚合酶抑制劑蚜腸霉素(Aphidicolin)相近。對惡性黑色素瘤細胞B16M-F10，每天用40μM的紫檀茋處理60分鐘具有顯著的抑制作用，抑制率達56％(Neoplasia，2005，7(1)37～47)。Tolomeo M等(Int J Biochem Cell Biol，2005，37(8)1709～1726)報道紫檀能誘導耐多藥和BCR-ABL表達的白血病細胞的顯著凋亡，而對正常細胞幾乎沒有影響，研究者認為其分子結構中的3，5-二甲氧基是其活性必需結構。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以白藜蘆醇和紫檀茋為先導化合物，提供了白藜蘆醇的多種衍生物及其制備方法和用途。
本發(fā)明所述化合物，與白藜蘆醇和紫檀茋一樣，對腫瘤、心血管疾病、炎癥等多種疾病具有良好的預防與治療作用，一些化合物的活性明顯強于白藜蘆醇和紫檀茋。而且這些化合物因結構中存在取代胺基，能夠成鹽可以提高白藜蘆醇和紫檀茋的穩(wěn)定性并可改善其藥代動力學參數(shù)。
制備本發(fā)明所述化合物的起始原料3，5-二羥基(或二烷氧基)-4’-羥基二苯乙烯的制備，可以以3，5-二羥基苯甲酸為原料，在堿的作用下與鹵代烴或硫酸酯成醚同時成酯，然后經(jīng)還原、鹵代，與亞磷酸三乙酯反應后，立即與4-芐氧基苯甲醛發(fā)生Wittig-Horner反應形成3，5-二烷氧基-4’-芐氧基二苯乙烯，再在三氯化鋁/N，N-二甲基苯胺的作用下脫去芐基制得3，5-二烷氧基-4’-羥基二苯乙烯，進一步脫去烷基得到3，5-二羥基-4’-羥基二苯乙烯(即白藜蘆醇)。以3，5-二甲氧基-4’-羥基二苯乙烯為例，其合成路線如下
本發(fā)明的化合物制備方法包括以3，5-二羥基(或二烷氧基)-4’-羥基二苯乙烯與各種取代二級胺和福爾馬林溶液(或多聚甲醛)，在常見的溶劑(如甲醇、無水乙醇、95％乙醇、乙酸等)中，發(fā)生Mannich反應制得。以3，5-二甲氧基-4’-羥基二苯乙烯為例，其合成反應示意如下 分別采用如上方法制備的白藜蘆醇衍生物，其制備方法簡單，工藝穩(wěn)定，可操作性強。所述化合物，與白藜蘆醇和紫檀茋一樣，對腫瘤、心血管疾病、炎癥等多種疾病具有良好的預防與治療作用，一些化合物的活性明顯強于白藜蘆醇和紫檀茋。而且這些化合物因結構中存在取代胺基，能夠成鹽可以提高白藜蘆醇和紫檀茋的穩(wěn)定性并可改善其藥代動力學參數(shù)。
具體實施例方式實施例13，5-二甲氧基苯甲酸甲酯的合成向250ml三頸瓶中，加入7.7g(0.05mol)3，5-二羥基苯甲酸，20g(0.15mol)無水碳酸鉀，15ml(0.15mol)硫酸二甲酯和160ml丙酮，充分攪拌回流反應5小時。濾除碳酸鉀，蒸餾除去丙酮。加入160ml水和160ml乙醚，分取有機層，再依次用氨水(16ml×2)，水(32ml)，5％鹽酸(32ml×2)，水(16ml)洗，加入無水硫酸鈉干燥，蒸除乙醚，自然析晶，干燥，得9.53g產(chǎn)品，收率為93.6％，mp 42～43℃。
實施例23，5-二甲氧基苯甲醇的合成向250ml三頸瓶中加入4.0g(0.04mol)四氫鋰鋁，30ml無水乙醚。攪拌下滴加4.0g(0.02mol)3，5-二甲氧基苯甲酸甲酯的30ml無水乙醚溶液，滴完加熱回流反應4h。停止反應，滴加10ml濕乙醚和60ml水，再滴加稀硫酸(10ml濃硫酸溶于30ml水)，反應劇烈，再滴加80ml水，分取醚層，用少量乙醚萃取水層兩次，合并醚層，加入無水硫酸鈉干燥，蒸除乙醚，自然析晶，得8.3g產(chǎn)品，收率為96.8％，mp47～49℃。
實施例33，5-二甲氧基氯芐的合成16.8g(0.1mol)3，5-二甲氧基苯甲醇置于三頸瓶中，加入150ml無水乙醚，攪拌使其溶解，滴加15ml(0.2mol)二氯亞砜，滴完后，室溫反應3h，在冰水浴下往三頸瓶中滴加100ml水，分取乙醚層，醚層水洗后加入無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸出乙醚，得白色固體18.9g，收率為94.4％，mp46～47℃。
實施例4(E)3，5-二甲氧基-4’-芐氧基二苯乙烯的合成3.7g(0.02mol)3，5-二甲氧基芐氯和7ml(0.04mol)亞磷酸三乙酯置于50ml圓底燒瓶中，加熱回流反應3h，減壓蒸餾除去過量的亞磷酸三乙酯，得橘紅色油狀物，向油狀物中加入15ml DMF，然后加入到乙醇鈉(由0.54g鈉和10ml無水乙醇制得)中，攪拌5min，滴加相應的2.7g 4-芐氧基苯甲醛的10ml DMF溶液，滴加完畢室溫攪拌3h，倒入冰水中析出固體，抽濾，干燥得產(chǎn)品白色固體10.0g，mp120～122℃，收率80％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)3.83(6H，s，OCH3)，5.09(2H，s，OCH2Ph)，6.38(1H，t，J＝2.2Hz)，6.65(2H，d，J＝2.2Hz)，6.90(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，6.97(2H，d，J＝8.7Hz)，7.04(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.39(7H，m).
實施例5(E)3，5-二甲氧基-4’-羥基二苯乙烯的制備6.2g(0.018mol)(E)3，5-二甲氧基-4’-芐氧基二苯乙烯溶于50ml干燥的二氯甲烷中，加入6.9ml(0.054mol)N，N-二甲基苯胺，冰浴下分次加入9.6g(0.072mol)無水三氯化鋁，室溫反應10小時，將反應液傾入到含適量鹽酸的冰水中，分取有機層，水層用二氯甲烷萃取兩次，合并有機層，分別用5％碳酸氫鈉、水洗滌后，無水硫酸鎂干燥，過濾，蒸去二氯甲烷，柱層析分離(洗脫劑石油醚-二氯甲烷1∶1)，得到(E)-3，5-二甲氧基-4’-羥基二苯乙烯，白色固體3.0g，mp87～89℃，收率64％。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)3.83(6H，s，OCH3)，4.80(1H，brs，-OH)，6.38(1H，br)，6.64(2H，d)，6.82(2H，d，J＝8.6Hz)，6.89(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.03(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.40(2H，d，＝8.6Hz).
實施例6Mannich堿衍生物的制備(E)3，5-二甲氧基-4’-羥基二苯乙烯溶于乙醇中，加37％的甲醛水溶液和相應的胺，回流反應10至15小時后，將溶劑減壓蒸干，殘留物柱層析分離(洗脫劑為二氯甲烷或二氯甲烷-乙酸乙酯4～1∶1)，得其Mannich堿衍生物，將Mannich堿衍生物溶于干燥的乙酸乙酯中，通氯化氫，析出沉淀，過濾，得到相應的Mannich堿鹽酸鹽。
(E)-3，5-二甲氧基3’-二乙胺基甲基-4’-羥基二苯乙烯(RE9934)，白色固體0.43g，mp78～81℃，收率49％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)1.14(6H，t，-CH2CH3)，2.67(4H，q，-CH2CH3)，3.82(6H，s，OCH3)，6.35(1H，t)，6.63(2H，d)，6.82(2H，m)，6.99(1H，d，J＝16.2Hz，-CH＝CH-)，7.15(1H，s)，7.34(1H，d).
(E)-3，5-二甲氧基-3’-嗎啉基甲基-4’-羥基二苯乙烯(RE9935)，白色固體0.36g，mp86～89℃，收率53％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)2.7(4H，brs)，3.83(12H，brs)，6.37(1H，s)，6.63(2H，s)，6.85(2H，brs)，7.01(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.25(1H，brs)，7.42(1H，brs).ESI-MS356.2[M+H]+，353.9[M-H]-(E)-3，5-二甲氧基-3’-哌啶基甲基-4’-羥基二苯乙烯(RE9936)，白色固體0.47g，mp77～80℃，收率51％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)1.67(6H，brs)，2.53(4H，brs)，3.79(2H，s，-CH2-)，3.84(6H，s，OCH3)，6.38(1H，t，J＝2.1Hz)，6.52(2H，d，J＝2.2Hz)，6.82(1H，d，J＝8.4Hz)，6.87(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.01(1H，d，J＝16.2Hz，-CH＝CH-)，7.29(1H，d，J＝3.8Hz)，7.35(1H，d，J＝2.0Hz).ESI-MS354.1[M+H]+，351.9[M-H]-.
(E)-3，5-二甲氧基-3’-二甲胺基甲基-4’-羥基二苯乙烯(RE9937)，白色固體0.37g，mp73～76℃，收率48％。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm)2.73(6H，s，N(CH3)2)，3.76(6H，s，OCH3)，4.21(2H，s，PhCH2N)，6.39(1H，s)，6.69(2H，d，J＝2.0Hz)，6.98(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，6.98(1H，d，J＝8.6Hz)，7.17(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.49(1H，d，J＝8.3Hz)，7.66(1H，s)，9.71(1H，brs，ArOH)，10.55(1H，s，HCl).13C-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm)42.20，55.27，99.56，104.21，115.98，117.03，126.35，128.44，129.75，130.87，139.34，156.43，160.78.ESI-MS314.0[M+H]+，312.7[M-H]-.
(E)-3，5-二甲氧基-3’，5’-雙(二甲胺基甲基)-4’-羥基二苯乙烯(RE9938)，白色固體0.67g，mp 124～126℃，收率62％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)2.34(12H，s，N(CH3)2)，3.59(4H，s，-CH2-)，3.84(6H，s，OCH3)，6.38(1H，t，J＝2.1Hz)，6.65(2H，d，J＝2.1Hz)，6.90(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.02(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.22(2H，s).
其二鹽酸鹽1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm)2.74(12H，s，N(CH3)2)，3.76(6H，s，OCH3)，4.36(4H，s，-CH2-)，6.42(1H，s)，6.69(2H，d，J＝2.1Hz)，7.07(1H，d，J＝16.5Hz，-CH＝CH-)，7.17(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.77(2H，s)，10.23(3H，brs，HCl and OH).
(E)-3，5-二甲氧基-3’，5’-雙(哌啶基甲基)-4’-羥基二苯乙烯鹽酸鹽(RE9939)，白色固體0.78g，mp 144～148℃，收率58％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)1.58(12H，brs)，2.53(8H，brs)，3.66(4H，s，PhCH2N-)，3.83(6H，s，OCH3)，6.36(1H，t)，6.64(2H，d)，6.87(1H，d，J＝16.2Hz，CH＝CH-)，7.01(1H，d，J＝16.2Hz，-CH＝CH-)，7.24(2H，s).ESI-MS451.1[M+H]+，449.0[M-H]-.
(E)-3，5-二甲氧基-3’，5’-雙(N-嗎啉基甲基)-4’-羥基二苯乙烯鹽酸鹽(RE9940)，白色固體0.89g，mp 156～158℃，收率48％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)2.53(8H，brs)，3.66(4H，s，-CH2-N)，3.76(8H，brs)，3.83(3H，s，OCH3)，6.37(1H，brs)，6.64(2H，d)，6.87(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.00(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.24(2H，s).ESI-MS455.1[M+H]+，452.9[M-H]-.
(E)-3，5-二甲氧基-3’，5’-雙(N-四氫吡咯基甲基)-4’-羥基二苯乙烯二鹽酸鹽(RE9941)，白色固體0.96g，mp153～156℃，收率48％。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)1.95(8H，brs)，3.38(8H，brs)，3.77(6H，s，OCH3)，4.43(4H，s，PhCH2N)，6.42(1H，s)，6.69(2H，s)，7.14(2H，m，-CH＝CH-)，7.83(2H，s)，10.22(3H，brs).
(E)-3，5-二甲氧基-3’，5’-雙(N-甲基哌嗪甲基)-4’-羥基二苯乙烯四鹽酸鹽(RE9942)，白色固體1.03g，mp186～188℃，收率55％。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm)2.78(8H，brs，哌嗪環(huán))，2.79(6H，s，NCH3)，3.76(6H，s，OCH3)，3.88(4H，s，PhCH2N)，4.21(8H，brs，哌嗪環(huán))，6.40(1H，s)，6.68(2H，d，J＝2.2Hz)，7.06(1H，d，J＝16.4Hz，-CH＝CH-)，7.14(1H，d，J＝16.2Hz，-CH＝CH-)，7.72(2H，s)，9.73(1H，brs，OH)，11.76(4H，brs，HCl).ESI-MS481.1[M+H]+.
實施例7部分目標化合物誘導人急性早幼粒白血病細胞凋亡實驗1.實驗方法1.1細胞培養(yǎng)人急性早幼粒白血病細胞株(NB4)購于美國ATCC，培養(yǎng)于含有10％經(jīng)加熱滅活的胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素及1mmol/lL谷氨酰胺RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。
1.2細胞活力的測定細胞活力通過臺盼藍排斥法測定。稱取臺盼藍，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水稀釋到4％，用濾紙過濾，4℃保存。使用時，將該母液用PBS稀釋至0.4％工作濃度。取NB4細胞(1×105/ml)接種于12孔板，每孔2ml。加入不同濃度藥物孵育后制備單個細胞懸液，取50μl細胞懸液加入50μl的0.4％臺盼藍溶液，混勻，在3分鐘內(nèi)，于顯微鏡下觀察，死細胞被染成藍色，而活細胞拒染。用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細胞和死細胞(共約300個細胞)。活細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分率即為細胞存活率。
1.3細胞凋亡的形態(tài)學檢測利用吖啶橙(AO)和溴化乙啶(EB)雙染法考察凋亡細胞的形態(tài)學變化。取對數(shù)生長期的NB4細胞，以每孔1×105個/ml的細胞密度接種于12孔板中，每孔2ml。藥物處理后，取1ml細胞懸液，離心，棄取上清液，重懸于25μl PBS中，然后加入AO/EB等體積混合液3μl(100μg/ml AO，100μg/ml EB)，混勻。吸一滴混合液點于潔凈載玻片上，用蓋玻片封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。
EB拒染并出現(xiàn)核皺縮、發(fā)芽、發(fā)泡以及凋亡小體的細胞被認為是凋亡細胞。在鏡下不同區(qū)域隨機選擇300個細胞，凋亡細胞占其百分比為細胞凋亡率。


經(jīng)試驗證明，所述化合物對腫瘤、炎癥、心血管疾病均有較好的治療效果。
權利要求
1.白藜蘆醇Mannich堿衍生物，其特征在于由下列通式(I)表示的白藜蘆醇衍生物或其可藥用鹽 其中R1和R2為H、甲基、乙基或丙基；NR3R4為常見的胺，如二甲胺、二乙胺、二丙胺、二異丙胺、四氫吡咯、哌啶、嗎啉或取代的哌嗪；R5，R6，R7，R8為H或CH2NR3R4。
2.一種制備式I化合物的方法，其特征在于按如下方法制備式II化合物，與各種取代二級胺和福爾馬林溶液或多聚甲醛，在常見的溶劑中，發(fā)生Mannich反應，制得式I化合物
3.根據(jù)權利要求1所述的一種制備式I化合物的方法，其特征在于所述溶劑為甲醇、無水乙醇、95％乙醇、乙酸。
4.一種藥物組合物，其特征在于含有一種或多種可藥用載體和有效量的權利要求1的化合物(I)。
5.權利要求1化合物在制備治療腫瘤、炎癥、心血管疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，公開了白藜蘆醇Mannich堿衍生物及其制備方法和用途。以3，5－二羥基(或二烷氧基)－4’－羥基二苯乙烯與各種取代二級胺和福爾馬林溶液(或多聚甲醛)，在常見的溶劑中，發(fā)生Mannich反應制得制備了化合物(I)，工藝簡單易行。其可藥用游離堿和可藥用鹽對腫瘤、心血管疾病、炎癥等多種疾病具有良好的預防與治療作用，活性明顯強于白藜蘆醇和紫檀茋，且成鹽可以提高白藜蘆醇和紫檀茋的穩(wěn)定性并可改善其藥代動力學參數(shù)。其中R
文檔編號A61K31/445GK1948275SQ20061013400
公開日2007年4月18日 申請日期2006年10月25日 優(yōu)先權日2006年10月25日
發(fā)明者陳國良, 李 杰, 王愛萍, 黎亮, 景永奎, 吳春福 申請人:沈陽藥科大學