專利名稱：：一種糞便樣品病毒分離前的簡(jiǎn)便除菌方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及病毒樣品分離前的除菌技術(shù)，特別提供了一種操作簡(jiǎn)便，低成本的病毒分離前糞便樣品的除菌方法。
背景技術(shù)：
：病毒分離鑒定是病毒性疾病檢疫、診斷和流行病學(xué)調(diào)查的重要方法之一。眾所周知患病動(dòng)物的糞便是含病原微生物(細(xì)菌、病毒等)最多的傳染源，糞便也是感染機(jī)體排毒的主要形式，諸如SARS、禽流感、甲肝等傳染病，主要的傳播途徑是通過糞便傳染。同時(shí)從糞便中分離到病毒也可是診斷傳染病的重要依據(jù)。近年來，在禽流感爆發(fā)流行的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)過程中，都是通過對(duì)動(dòng)物(禽類，哺乳動(dòng)物類)糞便的檢測(cè)，行病毒培養(yǎng)分離，從而采取積極的防控措施的。從糞便中分離病毒，首先要對(duì)糞便樣品進(jìn)行除菌(細(xì)菌)處理，通常采集34克的糞便溶于Hank's鹽溶液中制成20%的懸液，充分混勻后6000r/min離心20min，取上清液加青霉素1000-2000U/ml，鏈霉素1000-2000ug/ml，再用微孔濾器(孔徑450nm)過濾；然后接種組織細(xì)胞，雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物，進(jìn)行病毒培養(yǎng)分離。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種糞便樣品病毒分離前的簡(jiǎn)便除菌方法，該方法操作簡(jiǎn)便，成本低廉，并且可以提高病毒的分離率。本發(fā)明具體提供了一種糞便樣品病毒分離前的簡(jiǎn)便除菌方法，其特征在于采集34克的糞便樣品于Hank's鹽溶液中制成20%的懸液，充分混勻后6000r/min離心20min，取上清液加青霉素10,000-20,000U/ml，鏈霉素20,000-20,000ug/ml，混勻后在4"C靜置4小時(shí)。本發(fā)明糞便樣品病毒分離前的簡(jiǎn)便除菌方法加大了抗菌素用量10-15倍(10,000-30,000U/ml，鏈霉素10，000-30，000ug/ml)，去除了糞便樣品中的細(xì)菌污染。本發(fā)明糞便樣品病毒分離前的簡(jiǎn)便除菌方法省去了樣品過濾除菌的操作程序。本發(fā)明糞便樣品病毒分離前的簡(jiǎn)便除菌方法減少了樣品攜毒量的丟失，保證了樣品的攜毒量，不影響病毒的分離率。因?yàn)闃悠分蓄w粒性物質(zhì)對(duì)病毒有纏裹，吸附的作用，如形皿徑大于450mn的顆粒后，不能被濾膜濾過，從而影響了病毒的分離率。本發(fā)明糞便樣品病毒分離前的簡(jiǎn)便除菌方法降低了樣本處理的成本，微孔濾器(直徑2cm,孔徑450nm)，一份樣品/個(gè)/次，價(jià)格12.00-15.00刃個(gè)(進(jìn)口)，3.00-3.50^;/個(gè)(國(guó)產(chǎn))。本發(fā)明糞便樣品病毒分離前的簡(jiǎn)便除菌方法操作簡(jiǎn)便。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1采用本發(fā)明除菌方法2005年湖北某縣疑似禽流感野鳥糞便樣品113份。具體操作方法釆集糞便34克/份，分別溶于Hank's鹽溶液中制成20%的懸液，充分混勻后6000r/min離心20min，取上清液加青霉素10,000U/ml，鏈霉素10,000ug/ml?；靹蚝笤?"C靜置4小時(shí)，然后按常規(guī)方法接種9-11日齡的雞胚尿囊腔，進(jìn)行禽流感病毒分離。接種后繼續(xù)37i:孵化，檢出24小時(shí)內(nèi)死亡雞胚，吸取尿囊液做細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)(注l);繼續(xù)孵化至96小時(shí)后吸取尿囊^a行HA效價(jià)測(cè)定，結(jié)果判斷HA效價(jià)^1:32判為分離獲得流感病毒。結(jié)果見表l。表12005年湖北某縣疑似禽流感野鳥糞便113份樣品病毒接種前的除菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品接種胚48h死胚污染率HA效價(jià)5:1:32病毒分離率青霉素10，000U/ml(n)(n，)(n0)(%)(no)(%)鏈霉素10,000ug^ml-^——-^——-----11311310.881210.61注l:細(xì)菌培養(yǎng)，操作無菌操作下，打開雞胚尿囊腔，取尿囊液100微升，加入LB液體培養(yǎng)基5毫升內(nèi)，置37t培養(yǎng)48小時(shí)，結(jié)果判斷培養(yǎng)基呈混濁狀態(tài)，判為細(xì)菌培養(yǎng)陽性，表示接種樣品的尿囊液含有污染的細(xì)菌；培養(yǎng)基顏色清亮，則判為陰性，表示接種的尿囊液無細(xì)菌污染。注2:n為待檢糞便樣品份數(shù)。n'為接種的雞胚數(shù)。^為接種后孵育48內(nèi)的死胚數(shù)，48內(nèi)的死胚判為污染。no判為分離獲得流感病毒的數(shù)量，當(dāng)HA效價(jià)21:32判為分離獲得流感病毒。比較例12005年湖北某縣疑似禽流感野鳥糞便樣品113份。具體操作方法采集糞便34克/份，分別溶于Hank，s鹽溶液中制成20Q/。的懸液充分混勻后6000r/min離心20min，取上清液加青霉素1000U/ml，鏈霉素1000ug/ml，再用113個(gè)濾器(孔徑450nm)分別過濾113份樣品，然后按常規(guī)方法接種9-11日齡的雞胚尿囊腔，進(jìn)行禽流感病毒分離。接種后繼續(xù)37'C孵化，檢出24小時(shí)內(nèi)死亡雞胚，吸取尿囊液做細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)(注1)，繼續(xù)孵化至96小時(shí)后吸取尿囊液迸行HA效價(jià)測(cè)定，結(jié)果判斷HA效價(jià)3:32判為分離獲得流感病毒。結(jié)果見表2。表22005年湖北某縣疑似禽流感野鳥糞便113份樣品病毒接種前的除菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品接種胚48h死胚污染率HA效價(jià)^1:32病毒分離率青霉素l,OOOU/ml(n)(n，)(n0)(%)(no)(%)鏈霉素l，OOOug/ml~~-------11311365.3097.96實(shí)施例2采用本發(fā)明的除菌方法2006年浙江某1似禽流感雞糞便樣品46份。具體操作方法采集糞便34克/份，分別溶于Hank's鹽溶液中制成20%的懸液，充分混勻后6000r/min離心20min，取上清液加青霉素20,000U/ml，鏈霉素20,000ug/ml?；靹蚝笤?'C靜置4小時(shí)，然后按常規(guī)方法接種9-11日齡的雞胚尿囊腔，進(jìn)行禽流感病毒分離。接種后繼續(xù)37。C孵化，檢出24小時(shí)內(nèi)死亡雞胚，吸取尿囊液做細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)(注l);繼續(xù)孵化至96小時(shí)后吸取尿囊液進(jìn)行HA效價(jià)測(cè)定，結(jié)果判斷HA效價(jià)^1:32判為分離獲得流感病毒。結(jié)果見表3。表32006年浙江某縣疑似禽流感雞糞便46份樣品病毒接種前的除菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品接種胚48h死胚污染率HA效價(jià)^1:32病毒分離率青霉素20，0O0U/ml(n)(n，)(n0)(%)(no)(%)鏈霉素20,000ug/ml---~--464600510.8比較例22006年浙江某縣疑似禽流感雞糞便樣品46份。具,作方法采集糞便34克/份，分別溶于Hank's鹽溶液中制成20%的懸液充分混勻后6謹(jǐn)r/min離心20min，取上清液加青霉素2000U/ml，鏈霉素2000ug/ml，再用孔徑450nm的微孔濾膜過濾，按常規(guī)方法接種9-11日齡的雞胚尿囊腔，進(jìn)行禽流感病毒分離。接種后繼續(xù)37。C孵化，檢出24小時(shí)內(nèi)死亡雞胚，吸取尿囊液做細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)(注l);繼續(xù)孵化至96小時(shí)后吸取尿囊液進(jìn)行HA效價(jià)測(cè)定，結(jié)果判斷HA效價(jià)^1:32判為分離獲得流感病毒。結(jié)果見表4。表42006年浙江某縣疑似禽流感雞糞便46份樣品病毒接種前的除菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例3采用本發(fā)明的除菌方法2006年湖南省某縣疑似禽流感鳥糞便樣品123份。具體操作方法采集糞便34克/份，分別溶于Hank's鹽溶液中制成20%的懸液，充分混勻后6000r/min離心20min，取上清液加青霉素30,000U/ml，鏈霉素30,000ug/ml。混勻后在4。C靜置4小時(shí)，然后按常規(guī)方法接種9-11日齡的雞胚尿囊腔，進(jìn)行禽流感病毒分離。接種后繼續(xù)37。C孵化，檢出24小時(shí)內(nèi)死亡雞胚，吸取尿囊液做細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)(注l);繼續(xù)孵化至96小時(shí)后吸取尿囊液進(jìn)行HA效價(jià)測(cè)定，結(jié)果判斷HA效價(jià)^1:32判為分離獲得流感病毒。結(jié)果見表5。表52006年湖南省某縣疑似禽流感雞糞便123份樣品病毒接種前的除菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品接種胚48h死胚污染率HA效價(jià)5:1:32病毒分離率青霉素30,000U/ml,、(n)(n')(n0)(%)(no)(%)鏈霉素30，000ug/ml~--"~~~----12312300129.75比較例32006年湖南省某縣疑似禽流感鳥糞便樣品123份。具體操作方法采集糞便34克/份，分別溶于Hank's鹽溶液中制成20M的懸液充分混勻后6000r/min離心20min，取上清液加青霉素2000U/ml，鏈霉素2000u^ml，再用孔徑450nm的微孔濾膜過濾，按常規(guī)方法接種9-11日齡的雞胚尿囊腔，進(jìn)行禽流感病毒分離。接種后繼續(xù)37'C孵化，檢出24小時(shí)內(nèi)死亡雞胚，吸取尿囊液做細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)(注l);繼續(xù)孵化至96小時(shí)后吸取>^囊行HA效價(jià)測(cè)定，結(jié)果判斷HA效價(jià)^1:32判為分離獲得流感病毒。結(jié)果見表6。表62006年湖南省某1#似禽流感雞糞便123份樣品病毒接種前的除菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表7:實(shí)施例與比較例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較青霉素(P.G)滋霉素(S.m)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1、一種糞便樣品病毒分離前的簡(jiǎn)便除菌方法，其特征在于采集3-4克的糞便樣品于Hank’s鹽溶液中制成20％的懸液，充分混勻后6000r/min離心20min，取上清液加青霉素10,000-20,000U/ml，鏈霉素20,000-20,000ug/ml，混勻后在4℃靜置4小時(shí)。全文摘要一種糞便樣品病毒分離前的簡(jiǎn)便除菌方法，其特征在于采集3-4克的糞便樣品于Hank’s鹽溶液中制成20％的懸液，充分混勻后6000r/min離心20min，取上清液加青霉素10,000-20,000U/ml，鏈霉素10,000-20,000ug/ml，混勻后在4℃靜置4小時(shí)。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，成本低廉，并且提高了病毒的分離率。文檔編號(hào)A61L11/00GK101190343SQ20061013441公開日2008年6月4日申請(qǐng)日期2006年11月29日優(yōu)先權(quán)日2006年11月29日發(fā)明者霜唐,錚寇,忠張,李天憲,李永東,范兆軍,陳繩亮申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所