專利名稱：無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域、免疫學(xué)領(lǐng)域及微生物制品及其藥物應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑的免疫調(diào)節(jié)功能驗證，及其對胃癌、膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)、高危HPV病毒、宮頸癌癌前病變、尖銳濕疣復(fù)發(fā)等粘膜免疫系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療用途。
背景技術(shù)：
機體粘膜是免疫預(yù)防接種與免疫治療給藥的重要途徑之一。粘膜上皮M細胞可將體腔中的抗原提呈于派伊爾結(jié)(集合淋巴結(jié))中的器官化淋巴組織，通過誘導(dǎo)粘膜表面形成局部免疫反應(yīng)或炎癥方式，以清除異常細胞及感染微生物，并可激活機體整體免疫系統(tǒng)。胃癌與膀胱癌患者術(shù)后，可通過粘膜組織直接接觸免疫制劑，成為預(yù)防其復(fù)發(fā)的有效方法之一。
胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，每年死于胃癌者達16萬人，胃癌療法首選手術(shù)切除。但胃癌患者手術(shù)切除后仍可能殘留癌細胞或手術(shù)操作造成癌細胞脫落，這些癌細胞有可能形成微病灶(microfocus)，而導(dǎo)致術(shù)后發(fā)生高頻率復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。即使是早期胃癌，浸潤局限于粘膜下層或淺肌層，仍有2-5％患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。如術(shù)后給予合理的化學(xué)療法能收到較好效果。但在手術(shù)之后癌細胞尚處于血流狀態(tài)，此時予以大量化學(xué)抗癌藥物反而削弱宿主免疫力。因而胃癌根治性切除術(shù)后，進行免疫療法是最好的治療方案。目前最常見的方法有以處理過腫瘤抗原主動免疫療法、注射淋巴因子被動免疫療法和注射細菌或真菌類制品生物調(diào)節(jié)療法。盡管目前有各種精制腫瘤抗原手段，但尚未找到胃癌特異性抗原。而被動免疫療法和生物調(diào)節(jié)療法多數(shù)通過提高宿主整體免疫機能方式提高療效。此外，腫瘤局部直接接觸型制品(如0K432)用于胃癌時也僅限于瘤內(nèi)注射，尚難預(yù)防通過淋巴癌細胞轉(zhuǎn)移和尚未發(fā)現(xiàn)的微病灶。
膀胱癌近年來有上升的趨勢，已居各類癌癥發(fā)病率的第十位，在泌尿科中居首位，是一種常見病，約75％以上是淺表性膀胱癌(semin Urol Oncol，1996，14(1S11)30-35)。通常淺表性膀胱癌經(jīng)手術(shù)治療后，必需用藥物或其他方法以防止復(fù)發(fā)。將卡介苗用于人類腫瘤的治療屬于人類的最新發(fā)現(xiàn)。1976年，Molares首次將卡介苗用于膀胱灌注，預(yù)防膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)并取得成功。該治療法遍及全球，得到臨床大夫的肯定(J Urol 1976；116180-3)。1977年，我國也開展了此項臨床研究工作(中華泌尿外科雜志，1990，11(6)332)。就臨床資料統(tǒng)計看來。卡介苗、噻替派及非治療組的復(fù)發(fā)率分別為15％(3/20)、41.2％(7/17)、63.6％(14/22)。1990年，張思考等進行的同類實驗，卡介苗、噻替派、絲裂霉素及對照組的復(fù)發(fā)率分別為10.0％(5/45)、16.9％(14/52)、25％(1/4)及44.5％(8/18)(臨床泌尿外科雜志.1990，5(3)129)。1991年，Lamm等對卡介苗與阿霉素對膀胱癌的防治效果進行了臨床對比實驗(N Engl J Med.，1991 Oct 24；325(17)1205-9)，得到卡介苗組與阿霉素組的臨床治療有效性分別為70％(11/64)、34％(16/67)。由此可見，采用卡介苗的治療組患者復(fù)發(fā)率可比采用噻替派、絲裂霉素及阿霉素等抗菌素治療組患者復(fù)發(fā)率低約一倍；而卡介苗的治療費用又遠遠低于上述抗菌素，促使卡介苗在泌尿外科臨床的廣泛使用。在第22屆世界泌尿外科學(xué)術(shù)會議上對卡介苗治療膀胱癌作出了肯定的結(jié)論(臨床泌尿外科雜志，1992，7(3))，認(rèn)為這一療法已被世界泌尿外科廣泛接受，對于淺表性膀胱癌，特別是膀胱原位癌的治療效果可達38～70％，對膀胱癌術(shù)后的預(yù)防復(fù)發(fā)效果更佳，可達75％。可以預(yù)見，在今后一段時間內(nèi)，卡介苗將作為淺表性膀胱癌術(shù)后治療的首選藥物。
BCG是目前最為成功的直接接觸粘膜組織，用于預(yù)防微病灶復(fù)發(fā)的免疫制劑。BCG制劑經(jīng)尿道進行膀胱灌注，以預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)。未經(jīng)灌注患者復(fù)發(fā)率均為60～70％，BCG灌注后下降至20～25％，其療效已得到公認(rèn)，并為目前預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)首選藥物(Suppl Ujrol，1991.7(5)30)。
胃與膀胱有類似組織結(jié)構(gòu)，因而直接接觸型免疫制劑能同樣適用于預(yù)防胃癌復(fù)發(fā)。此外，經(jīng)口服途徑服用免疫制劑，具有提高宿主整體免疫機能，并且可通過直接刺激胃淋巴結(jié)殺傷個別轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)癌細胞以達到預(yù)發(fā)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的效果。但是，由于卡介苗是具有較強佐劑活性的活菌苗，在膀胱癌預(yù)防性中除誘發(fā)免疫療效同時，毒副反應(yīng)發(fā)生率達70％以上(JUJro1.1986.135272.)。而且菌苗在膀胱灌注后2小時活菌隨尿液排出體外，如多次口服灌胃可能造成免疫損傷，因而研制高效，安全的粘膜接觸型免疫制劑具有重大意義。
對卡介苗為原材料的研究從發(fā)現(xiàn)之日至今從未間斷。研究結(jié)果證實BCG活菌苗具有增強免疫力作用，而且未發(fā)現(xiàn)含任何毒力因子，而其菌體各主要成分如細胞壁、多糖、蛋白、脂多糖以及菌體DNA、RNA，均有免疫調(diào)節(jié)作用。
(一)細胞壁成分卡介苗活菌經(jīng)物理方法裂解、離心而獲得全細胞壁(Whole cell wall，WCW)。將WCW進一步用蛋白酶分解，有機溶劑反復(fù)提取，以除去蛋白質(zhì)、脂肪成分(二者各占WCW全重約30％)，所留不溶性殘余物，即卡介苗細胞壁支架(Cell walskeleton，CWS)，占WCW全重30％左右。以此BCG-CWS乳劑與瘤細胞混合接種，能顯著抑制移植腫瘤的生長。對豚鼠的肝癌、小鼠的S-180、肥大細胞瘤P815-X2、EL4白血病、黑色素瘤B10等的移植瘤均有抑制作用。給正常大鼠腹腔注射BCG-CWS，然后收集其腹腔滲出細胞，證明此滲出細胞對同系纖維肉瘤(AMC-60)具有強烈抗瘤作用，對腹水型腫瘤，將BCG-CWS每5日1次注入腹腔，可以完全阻止腹水潴留，提高生存率。在小鼠中，將化學(xué)致癌物誘發(fā)之纖維肉瘤移植于胸膜腔，形成癌性胸膜炎、胸水，將BCG-CWS注入胸膜腔，則動物生存率顯著提高。BCG-CWS還能抑制化學(xué)致癌物的致癌作用，如給兔靜脈注入BCG-CWS，可阻止因吸入甲基膽葸所致肺癌的發(fā)生；給不同種系小鼠靜脈注射，均可阻止二甲基苯并葸誘發(fā)鱗癌的發(fā)生；皮下注射可以抑制甲基膽蒽引起小鼠胸膜纖維肉瘤的作用。但若進行了胸腺切除，則此預(yù)防作用就消失或削弱。同時BCG-CWS可激活巨噬細胞活化，表現(xiàn)為吞噬功能、胞內(nèi)消化殺菌能力和抗瘤作用的增強(Gann.1978 Dec；69(6)831-4)。動物腹腔注入BCG-CWS 500μg或BCG 2mg后，取其腹腔滲出細胞(PEC，絕大部分為巨噬細胞)與AMC-60纖維肉瘤細胞混合，按種于大鼠皮下，有顯著抑瘤作用。體外用上述方法活化的巨噬細胞與瘤細胞混合培養(yǎng)，可見明顯抑制3H-TdR(氚標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷)對瘤細胞的摻入、活化巨噬細胞內(nèi)的溶酪體數(shù)量、溶酶體內(nèi)水解酶的活性均增加。給癌癥患者應(yīng)用BCG或MER(BCG甲醇提取后殘留物)治療后，也見血清中乳清酸脫氫酶、溶菌酶、單核細胞數(shù)及細胞毒水平均有升高，說明巨噬細胞抗瘤活性增強。損害巨噬細胞后，MER的抗瘤作用完全消失。另外，MER激活巨噬細胞，還使集落刺激因子(CSF)和集落形成細胞(CFC)增加，從而增強機體對化療和放療的耐受性。
1、刺激淋巴細胞①使T淋巴細胞及B淋巴細胞對促有絲分裂原的反應(yīng)活性提高，業(yè)經(jīng)體外培養(yǎng)小鼠淋巴細胞試驗證實。
②體外和體內(nèi)實驗證明，能增強T細胞的殺傷效果和TK(殺傷性T細胞)殺傷癌細胞的活性。
③提高抗體依賴細胞毒性細胞(K細胞)的抗腫瘤活性。經(jīng)化療緩解的急淋白血病病人，于化療后1～3周，皮內(nèi)注射BCG3～5次，其K細胞的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒(ADCC)作用顯著增強。BCG或BCG-CWS加瘤苗注射可延長急性白血病病人的存活期，前者顯著促進K細胞的活力。
④刺激B細胞，使產(chǎn)生10S抗體(IgM)的作用增強，促進抗體產(chǎn)生的輔助性T細胞(TH)的活性也增強。
⑤使淋巴細胞從末稍血中向淋巴結(jié)內(nèi)集聚，瘤內(nèi)注射時這種作用明顯優(yōu)于靜脈注射。對移植于肌肉的腫瘤行瘤內(nèi)注射，能在腫瘤周圍形成由淋巴細胞和巨噬細胞組成的內(nèi)芽腫樣反應(yīng)。這時引流區(qū)或淋巴結(jié)內(nèi)不僅淋巴細胞密集，特別是在T細胞區(qū)域可見淋巴細胞的分裂增殖。
通過對于無菌鼠(CF-ICR)和裸鼠(BALB/Cnu/nu)的對照研究也已查明，卡介苗及其CWS誠如歷來所認(rèn)為的，系一種T細胞佐劑，且局部淋巴結(jié)的組織學(xué)反應(yīng)在反應(yīng)中居主導(dǎo)地位。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，用水包油CWS乳劑后，局部淋巴結(jié)的副皮質(zhì)區(qū)明顯擴大，嗜派若寧細胞增多，于第14天反應(yīng)達到最高峰。用放射自顯影技術(shù)見該部位3H標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷的標(biāo)記率顯著上升。電子顯微鏡下也確認(rèn)這些反應(yīng)細胞即淋巴母細胞。
2、提高瘤細胞的抗原性，有助于建立全身抗腫瘤免疫。
將肥大細胞瘤P815與BCG-CWS混合后，接種于鼠一側(cè)腹。對側(cè)接種未加BCG-CWS的瘤細胞。結(jié)果獲得了全身特異性腫瘤免疫，兩側(cè)腫瘤均不能生長。改用經(jīng)照射或絲裂霉素處理的瘤細胞也同樣有效。肥大細胞瘤P-815是眾所周知的抗原性極其微弱的瘤種，通常很難用它誘導(dǎo)出腫瘤免疫，但經(jīng)加用卡介苗活菌或BCG-CWS，就能很容易地誘導(dǎo)出全身特異性腫瘤免疫。
3、對抗荷瘤造成的免疫功能下降，使之恢復(fù)正常水平。
①給處于荷瘤狀態(tài)(同系腫瘤)的小鼠進一步使用異系(allogenic)瘤細胞免疫時，若加用BCG-CWS，則可阻止原來因荷瘤造成的脾中殺傷T細胞(Tk)活性的降低。
②注射腹水癌的不清液，可使小鼠輔助性T細胞功能下降，但應(yīng)用BCG-CWS時則可以防止。
4、BCG本身所具有的種種其它免疫活性例如局部注射引起炎癥，利于免疫活性成分向腫瘤灶集聚，能減少或防止癌細胞向局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；據(jù)報道瘤內(nèi)注射BCG或C.P(短小棒狀桿菌)可使瘤塊縮小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率由對照組的100％降至17％；誘生干擾素，后者進而活化NK細胞(自然殺傷細胞)，等等。BCG-CWS都可能同樣具備這些作用。CWS具有提高瘤苗的免疫原性，增強宿主的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)全身特異性腫瘤免疫。對實驗?zāi)[瘤有預(yù)防其發(fā)生和促使已發(fā)生的腫瘤退縮的效果。經(jīng)礦物油處理的WCW，也已證明有和卡介苗菌體相當(dāng)?shù)目沽龌钚?。CWS所具有的抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和使原發(fā)瘤退縮的效果與卡介苗不相上下。業(yè)已證明，分枝桿菌屬的其他菌種，如恥垢桿菌(M.Smegmatis)，人結(jié)核桿菌(M.tuberculosis)及M.kansasii等的CWS，都同樣有上述抑制腫瘤形成和促使腫瘤退縮的效用。
5、BCG對小鼠、豚鼠腫瘤均有使腫瘤退縮的效果。
N-CWS腹腔注射能激活腹腔巨噬細胞，使之發(fā)揮對腫瘤的細胞抑制、細胞溶解等抗癌作用。能阻止移植于肌肉內(nèi)腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移。對腹水型腫瘤，經(jīng)腹腔注入，可以阻止腹水增長，提高生存率，在一些生存動物的腹膜上雖然可見細小的腫瘤，但其周圍有劇烈的肉芽腫樣反應(yīng)，并且沒有腹水產(chǎn)生。對實驗性癌性胸膜炎，N-CWS胸膜腔注射，也使生存率大大提高。臨床上初步用于癌性胸膜炎，據(jù)報道胸水的消除。胸水中惡性細胞的消失，比使用BCG-CWS者還迅速。還有人設(shè)想將N-CWS用于發(fā)癌的高危險人群的防癌上。
(二)卡介苗脂類甲醇提取物(MER)Weiss等(Isr J Med Sci.1975 Dec；11(12)1397.)將卡介苗活菌經(jīng)酚處理，經(jīng)丙酮提取后，再將不溶性成分以甲醇提取，分為甲醇可溶性成分(MSF)和甲醇提取后殘留物(Methaanol extracted ResidueMER)。
1.免疫作用實驗顯示，MER有以下免疫作用(1)非特異性地提高宿主的抗感染能力。
(2)增強宿主對羊紅細胞的一次和二次免疫反應(yīng)。
(3)增強對同種異體細胞的細胞免疫反應(yīng)，以及對蛋白結(jié)合半抗原的遲發(fā)超敏反應(yīng)。
2.抗瘤作用以MER代替卡介苗進行抗腫瘤動物實驗發(fā)現(xiàn)(1)預(yù)先用0.25～0.5mg MER免疫動物，則許多動物腫瘤的發(fā)生和增殖被顯著地抑制。
(2)在移植腫瘤之前的某一時期應(yīng)用(如4周前)，比移植當(dāng)時或移植之后才用更為有效。
(3)MER比卡介苗活菌、酚殺死菌或其他成分(如MSF)，具有更強的腫瘤抑制效果。從許多研究結(jié)果來看，MER并不直接作用于瘤細胞，而是通過增強宿主對腫瘤特異抗原的免疫反應(yīng)而發(fā)揮效果。
3.MER的作用途徑可能有(1)使巨噬細胞數(shù)目增多，吞噬活性增強，從而改善了對腫瘤抗原的處理效能。
(2)促進淋巴細胞增殖，使參與腫瘤免疫的淋巴細胞(尤其是K細胞，即殺傷細胞)的殺傷效率提高，數(shù)量增多。
(3)對病毒性腫瘤則可能促進抗病毒性抗體和干擾素的產(chǎn)生。
(三)蠟質(zhì)D和“索狀物”將分枝桿菌菌體用乙醇-乙醚(1∶1)提取后的殘留物，再以氯仿提取，從溶于氯仿的成分中除去以溶于沸丙酮的蠟質(zhì)C后，所留的不溶性成分，即蠟質(zhì)D(WaxD)。從蠟質(zhì)D中又進一步分離出有佐劑和抗癌活性的肽糖脂(Peptido-glycolipid)。已有研究證明肽糖脂和BCG-CWS同樣是由“霉菌酸-阿半乳聚糖-粘肽”組成的復(fù)合物(Biochim Biophys Acta.1963Oct 29；78342-50)。蠟質(zhì)D的抗瘤活性和佐劑效果已被證實。
(四)細胞壁水溶性佐劑和不溶于水及有機溶劑的BCG-CWS相反，除去蛋白質(zhì)和脂肪和細胞壁(與CWS類似)，再以溶菌酶處理，就獲得收量約為10％的水溶性佐劑(Water soluble adjuvant，WSA)。其佐劑活性比福氏完全佐劑還強，與CWS相當(dāng)甚或更強。其基本化學(xué)組成為阿半乳聚糖-粘肽，而無霉菌酸。用溶菌酶直接作用于脫脂菌體，就獲得一種化學(xué)組成和WSA相同的有佐劑活性的水溶性物質(zhì)，稱為“新水溶性佐劑”(neo WSA)。將卡介苗脫脂力體以鈀作催化劑，在常壓下還原后得10％收量的水溶性物質(zhì)，稱作“分支桿菌佐劑和抗瘤組分”(Mycobacterialadjuvant and antitumor Fraction，MAAF)。以上所述的WSA、neo WSA及MAAF，均有和CWS同樣強的佐劑活性和抗癌效果。將脫脂菌體以超聲波裂解，用水提取，經(jīng)DEAE-纖維素層析，也得到一種水溶性佐劑，其化學(xué)組成和WSA、MAAF一樣， 都是無霉菌酸的阿半乳聚糖粘肽結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可能為CWS的結(jié)構(gòu)碎片或其合成前體與分解產(chǎn)物。它們的抗瘤活性和佐劑效果均經(jīng)確認(rèn)，但卻未發(fā)現(xiàn)在用CWS時經(jīng)常發(fā)生的“佐劑性關(guān)節(jié)炎”。
(五)壁氨酸二肽類(Mauramyl-dipeptides，胞壁二肽，MDP)從卡介苗中分離有佐劑效能的成分，最終得到結(jié)核菌胞壁上的壁氨酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(壁丙谷)為有效成分。在許多系統(tǒng)中，以它代替結(jié)核桿菌能夠配成完全Freund佐劑。業(yè)已合成許多衍生物，以研究其構(gòu)效關(guān)系。
1.已經(jīng)證明的生物活性(1)有佐劑作用。已證明本類藥在靈長類能促進瘧疾疫苗的免疫效果。用長鏈脂肪酸對MDP的0-6位?；?，所得衍生物親脂性強，對誘發(fā)針對同種異體細胞的細胞免疫有良好佐劑活性，對抗體生成卻影響不著。給豚鼠服用含MDP及卵蛋白的卵磷脂-膽固醇脂質(zhì)體，可引起遲發(fā)超敏反應(yīng)。若以分支桿菌酸、棒菌酸或奴卡菌酸對0-6位?；魟┬Ч鼜?，即使將之與抗原在生理鹽水中混合服用，也能誘導(dǎo)對同種異體細胞的細胞免疫，且有抑瘤作用，致熱原性也大為減弱。將MDP在生理鹽水中或在不完全Freund佐劑中與抗原同時給予機體，可使IgG2增加。用在水性介質(zhì)中的MDP，可使小鼠、大鼠和地鼠對一系列抗原的抗體生成增加，如對牛血清白蛋白、卵蛋白、TNP-卵蛋白(三硝基苯-卵白蛋白)、TNP-鑰孔戚血藍蛋白、流感病毒亞單位疫苗等的抗體生成。MDP存在下的抗體生成增加，是與加強輔助T細胞機能相關(guān)。將MDP與抗原同時給予，可獲最強的佐劑效果。但大量(10mg/kg)的MDP，則在小鼠可快速導(dǎo)致免疫耐受性。
(2)興奮非特異性免疫功能。能保護新生的、很幼年的及成年小鼠所受細菌(如肺炎桿菌)的攻擊。對顯示有保護作用的成年小鼠，可促進炭粒清除。在成年及新生小鼠，MDP顯示加快血中細菌清除作用。
(3)抗腫瘤作用。MDP本身在體內(nèi)無抗瘤作用。但MDP的6-0-位酰化的酯類則可抗瘤。?；蔀槊咕?、奴卡菌酸或分支桿菌酸。將這些化合物與纖維肉瘤細胞混合接種于小鼠，腫瘤生長受到抑制。給MDP分子上聯(lián)結(jié)上泛醌(輔酶Q)類結(jié)構(gòu)后，即有抗Meth-A腫瘤的效力。對足底接種瘤細胞的小鼠，若靜脈注射以脂質(zhì)體包裹的MDP，可使約60％的小鼠得以長期生存。在豚鼠腫瘤實驗中，將一些合成的MDP與索因子(Cord Factor，即前文的索狀物類)合用，可使部分腫瘤消退。(4)誘發(fā)大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和肉芽腫。此作用受胸腺控劑。將MDP制成乳劑(W/O)或分支長鏈脂肪酸結(jié)合，可刺激產(chǎn)生表皮樣肉芽腫(Epitheloid granuloma)。
2.作用機理(1)刺激巨噬細胞一般認(rèn)為MDP的各種生物活性均系其刺激巨噬細胞的結(jié)果。觀察葡萄糖氧化、氨基葡萄糖摻入，以及巨噬細胞的粘附和伸展能力等，均表明MDP類能刺激巨噬細胞功能，無需T細胞參與。對ICR小鼠和無胸腺小鼠，MDP均能使之具有抑制李斯特桿菌(Listeria)的能力。
MDP能刺激人的單核細胞釋放淋巴細胞活化因子。在MDP存在下，培養(yǎng)脾細胞可釋放一種水溶性介質(zhì)，以刺激其它培養(yǎng)中的脾細胞產(chǎn)生抗體。MDP還能使培養(yǎng)中的小鼠巨噬細胞產(chǎn)生集落刺激因子。對胸腺嘧啶向巨噬細胞DNA中的摻入，MDP呈顯著的抑制作用。但對胸腺嘧啶核苷對巨噬細胞DNA的摻入，卻能使其顯著增加。說明MDP對巨噬細胞DNA的嘧啶前體的合成，在不同水平上予以影響。
(2)刺激淋巴細胞從C57BL/6或BALB/C無胸腺小鼠供體來的T細胞，本來缺乏一般小鼠脾細胞所具有的免疫反應(yīng)性，但若加入MDP后，就能恢復(fù)免疫反應(yīng)。還證明，對敏感種系小鼠的B淋巴細胞，MDP尚有明顯的致有絲分裂原作用。
(六)菌體核酸多年以前，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)細菌DNA(Bdna)能調(diào)控小鼠免疫活性細胞的功能，但直到八十年代中期，DNA的免疫調(diào)節(jié)作用才引起廣泛重視。Tokunaga等(J.Natl.Cancer Inst.，1984 72，955-962.)在研究結(jié)核桿菌提取物抗腫瘤活性時，發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌的DNA可引起機體對腫瘤的排斥反應(yīng)。近年來發(fā)現(xiàn)細菌DNA本身也是一種免疫佐劑，可有效地激活多種免疫效應(yīng)細胞。介導(dǎo)這一作用是一類具有特征性的短核苷酸序列，被稱為免疫刺激DNA序列。DNA免疫或基因免疫已廣泛應(yīng)用于抗感染、抗腫瘤等方面的實驗研究。由于DNA疫苗的骨架為質(zhì)粒，其內(nèi)部含有一定數(shù)量的ISS(免疫刺激序列)，那么，ISS是否增強DNA疫苗的免疫效應(yīng)，是目前研究的熱點。進一步研究顯示此效應(yīng)主要是由DNA誘導(dǎo)的γ干擾素(IFN-γ)激活自然殺傷(NK)細胞所介導(dǎo)。在對DNA的作用的分子機制研究中分離出一些引起NK細胞活性作用的短序列，這些序列絕大部分是由胞嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸(CpG)為基元的寡聚體，其堿基排列大多遵循以下規(guī)律5’-PurPurCGPyrPyr-3’，由于這種特征性序列可激活多種免疫效應(yīng)細胞，故又被稱作免疫刺激DNA序列(Immuno-stimulatory DNA sequence，ISS)(J.Immunol.，1992 148，4072-4076.)。
CpG在細菌DNA中的含量較高，而在椎動物的DNA中的比例比預(yù)想的少得多，此現(xiàn)象稱為CpG抑制。同時，脊椎動物中80％以上的CpG被甲基化。椎動物DNA與bDNA在這兩方面上的顯著差別可能是使CpG序列成為免疫刺激信號的存在基礎(chǔ)，非甲基化CpG序列具有很強的免疫刺激作用，被脊椎動物免疫系統(tǒng)識別，主要是存在于APC細胞，如DC細胞、B細胞及巨噬細胞表面的TLR-9識別，活化核因子，IL-12及γ干擾素被活化，從而增強Th1淋巴細胞的免疫反應(yīng)(Eur.J.Immunol.1998 28.2045-2054；vaccine.Immunology Letters 2001 78.103-111；Proc Natl Acad Sci U S A.Aug 1999 3；96(16)9305-10；J Immunol 2002 Jul 15；169(2)787-94)。
Krieg(Annu.Rev.Innunol.2002，20709-760)報道，CpG DNA可誘導(dǎo)小鼠B細胞增殖并分泌IgM、白細胞介素6(IL-6)，并證實CpG DNA誘導(dǎo)IL-6產(chǎn)生是由反應(yīng)氧中間體(ROS)依賴的途徑所介導(dǎo)。CpG DNA可顯著誘導(dǎo)CD4 T細胞分泌Th1型細胞因子，如IFN-γ等。Ballas(J.Immunol.1571840，1996)觀察到非甲基化CpG DNA顯著提高NK細胞殺傷活性，但ODN對高度純化的NK細胞卻無明顯刺激作用，在ODN所誘導(dǎo)的NK細胞活化過程中，無需B、T細胞的參與，ODN激活NK細胞是通過其誘導(dǎo)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生而實現(xiàn)。巨噬細胞也是CpG DNA作用的重要細胞。Stacey(J.Immunol.1996 Sep 1；157(5)2116-22)將含CpG DNA的質(zhì)粒與巨噬細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞可攝取質(zhì)粒DNA。細胞中顯著增加，其機制可能與核因子的激活有關(guān)。細胞根據(jù)分泌的細胞因子類型及效應(yīng)細胞的功能可分兩種。Th1細胞的分化主要由IL-12和IFN-γ驅(qū)動。Th1細胞分泌的細胞因子包括IFN-γ。同時CpG DNA能促進DC細胞的成熟，從而發(fā)揮職業(yè)APC細胞的作用，加強固有免疫和獲得性免疫的聯(lián)系，調(diào)節(jié)獲得性免疫反應(yīng)的類型，主要偏向Th1型免疫反應(yīng)(J Immunol 2001 1662291-2295；EurJ Immunol.2001 Oct；31(10)3026-37)。目前很多試驗都證明CpG DNA是很好的免疫佐劑包括做粘膜佐劑和免疫治療劑(Immunol Lett.2005 Mar 15；97(2)181-8.Epub 2004 Dec7.；infect Immun.2002 Jan；70(1)147-52；Infect Immun.1999 675658-5663)。
卡介苗是歷史最悠久的免疫治療制劑，在不同的歷史階段賦予不同的新內(nèi)容，八十年代研究重點在于BCG多糖與胞壁。九十年代研究重點轉(zhuǎn)移至蛋白多肽。前者具有很強佐劑作用，后者則能誘導(dǎo)產(chǎn)生淋巴因子，但在動物整體模型中藥效不理想。上述研究的結(jié)果表明利用胞壁佐劑作用激活宿主免疫細胞。以蛋白多肽為誘導(dǎo)劑使激活細胞樣的淋巴因子，則可形成高效免疫制品。而且對粘膜免疫而言，用滅活的微生物制備疫苗有許多優(yōu)點它們是天然存在的微粒，能增強其表面與粘膜淋巴組織的相互作用；作為一種疫苗，生產(chǎn)成本低廉，具有多種重要的保護性抗原。同時粘膜免疫反應(yīng)的特點是在一個粘膜系統(tǒng)反應(yīng)，其他粘膜系統(tǒng)也發(fā)生反應(yīng)，即既能產(chǎn)生機體各粘膜系統(tǒng)的局部免疫保護反應(yīng)，又能產(chǎn)生全身的免疫反應(yīng)來預(yù)防疾病的發(fā)生。根據(jù)此理論本發(fā)明以高壓氣流切割技術(shù)制備無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑，該新型制劑其抑瘤效果均達到或超過卡介苗活菌。為進一步研究成功的可能奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
卡介菌(BCG)細菌胞壁多糖具有很好的免疫刺激作用、菌體蛋白具有較好的抗原性、細菌核酸因富含CpG片段具有優(yōu)異的免疫調(diào)節(jié)功能，綜合這三大成份的優(yōu)點，制備出無細胞卡介菌(BCG)粘膜免疫調(diào)理劑。
本發(fā)明提供的無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑是由卡介菌經(jīng)裂解制備而成，是一種卡介菌細胞壁、菌體蛋白及核酸的復(fù)合物溶菌制劑，其為液體或凍干制劑，在菌體的裂解過程中首先破碎菌體，可采用高壓破碎法或超聲破碎法，優(yōu)選高壓破碎法。高壓破碎法為離心收集卡介菌，用凍干保護液稀釋后經(jīng)高壓均質(zhì)機破碎菌體。本發(fā)明的高壓破碎法是利用高壓氣流切割技術(shù)破碎工藝，能在瞬間內(nèi)使細菌承受高壓力而發(fā)生劇烈變化，細菌胞壁徹底崩解，充分地裂解卡介菌，使其細胞壁充分裂解、釋放出菌體蛋白和核酸，并使裂解產(chǎn)物達到一種均質(zhì)、可溶狀態(tài)，制備出無細胞卡介菌勻漿制劑，同時采用低含量成型好的凍干輔劑凍干制品，使制品保持良好的穩(wěn)定性。其中凍干保護液為本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的凍干保護液，優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液。經(jīng)以上工藝制備的無細胞卡介菌制劑菌體勻漿懸液經(jīng)輻射滅菌，優(yōu)選用鈷60100-150萬拉得照射后保存于2～8℃，具有很好的安全性。這樣制備出的無細胞卡介菌勻漿制劑，在保留卡介菌良好免疫性的同時，因使菌體充分裂解，并最終獲得均質(zhì)、可溶的制劑，更能充分發(fā)揮細菌胞壁多糖、菌體蛋白及富含CpG片段核酸的免疫調(diào)節(jié)作用，同時克服了整菌體的毒副反應(yīng)。
本發(fā)明還提供了包含該無細胞卡介菌勻漿制劑的藥物組合物和粘膜免疫調(diào)理劑及其在預(yù)防胃癌、膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)，治療高危HPV病毒和預(yù)防宮頸癌癌前病變，預(yù)防尖銳濕疣復(fù)發(fā)等粘膜免疫系統(tǒng)疾病中的用途。
本發(fā)明提供的無細胞卡介菌勻漿制劑，包含該制劑的藥物組合物和粘膜免疫調(diào)理劑可增強正常機體的免疫功能、促進免疫低下機體免疫功能的恢復(fù)和抑制免疫亢進機體過強的免疫應(yīng)答，即具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用。經(jīng)對黑色素瘤B16、Lewis肺癌、肝癌H22、淋巴細胞白血病P388、瓦克癌(肉瘤)W256、人胃癌株m85抑瘤實驗結(jié)果證實，該制劑有顯著的抑瘤效果，對預(yù)防胃癌、膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)，治療高危HPV病毒感染和預(yù)防宮頸癌癌前病變，預(yù)防尖銳濕疣復(fù)發(fā)等疾病有潛在的預(yù)防或/和治療效果，是一種安全有效的粘膜免疫調(diào)節(jié)制劑。
本發(fā)明
具體實施例方式
以菌種D2PB302S11甲10株作為生產(chǎn)用卡介菌為例進行說明，但不作為對本發(fā)明的限制，任何其他卡介菌均能夠取得同樣的效果。生產(chǎn)前對卡介菌菌株作培養(yǎng)特性，毒力試驗、安全試驗、脾激活試驗、抑瘤試驗、毒性試驗等。上述6項檢查均合格的菌種，方用于生產(chǎn)。生產(chǎn)中還規(guī)定，菌種的代次不能超過12代。制備的原液應(yīng)為120mg/ml，按0.5ml分裝于2ml安瓶，即每支濕重60mg，隨后冷凍干燥，制成成品。對確定濃度后的原液，需作純菌試驗，以保證制品不被污染；同時作濃度測定，以復(fù)核原液原測濃度有無錯誤。
本發(fā)明以高壓氣流切割技術(shù)制備無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑，通過對黑色素瘤B16、Lewis肺癌、肝癌H22、淋巴細胞白血病P388、瓦克癌(肉瘤)W256、人胃癌株m85抑瘤實驗結(jié)果證實，新型制劑其抑瘤效果均達到或超過卡介苗活菌。本發(fā)明具有以下特點與實用性；1.以膀胱癌粘膜免疫刺激療法應(yīng)用于胃癌研究尚未見到報道。
2.以膀胱癌粘膜免疫刺激療法應(yīng)用生殖系統(tǒng)的疾病，均屬體外灌注，如治療高危HPV病毒和預(yù)防宮頸癌癌前病變，預(yù)防尖銳濕疣復(fù)發(fā)等疾病，該制劑理論上都有潛在的預(yù)防和/或治療效果。
3.以該制品應(yīng)用于膀胱癌治療將極大減少由于活菌對人體所產(chǎn)生的毒副作用。而且其作用機制與化療藥物不同。為進一步進行二者聯(lián)合使用增加療效奠定基礎(chǔ)。
4.該菌苗制作成本遠低于目前國內(nèi)其它免疫調(diào)節(jié)制品，對我國農(nóng)業(yè)人口占80％尚不富裕國家，有重大的社會效益，同時大量應(yīng)用也可產(chǎn)生巨大經(jīng)濟效益。


圖1.無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑OD測定值正態(tài)分布2.無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對黑色素瘤B16的抑瘤作用A.瘤周注射荷瘤對照；B.瘤周注射陽性藥CDDP；C.瘤周注射BCG低劑量；D.瘤周注射BCG高劑量；E.瘤周注射無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑低劑量；F.瘤周注射無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑高劑量。
圖3.無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對肝癌H22的抑瘤作用A.瘤周注射荷瘤對照；B.瘤周注射陽性藥CDDP；C.瘤周注射BCG低劑量；D.瘤周注射BCG高劑量；E.瘤周注射無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑低劑量；F.瘤周注射無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑高劑量。
具體實施方式
試驗例1.調(diào)理劑濃度確定以分光光度法測定六次制備的24個含10mg/ml濕重菌體樣品，每個樣品設(shè)三個平行樣，整個實驗重復(fù)三次，共計216個測定值，測定波長為405nm，數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理表明216個測定值呈正態(tài)分布，含10mg/ml濕重菌體調(diào)理劑0D值為1.318±0.088，實驗結(jié)果見表1和圖1.在原液制備過程中菌膜壓干稱重所得數(shù)據(jù)為菌體半干重，不能真實體現(xiàn)制品濃度，因此，含10mg/ml濕重菌體調(diào)理劑標(biāo)準(zhǔn)OD值為1.318，規(guī)定為10個濁度單位，以10U/ml來表示，則原液樣品含量為OD值/1.318×10×12±10％(U/ml)；成品含量為0D值/1.318×10×6±20％(U/支)。
表1無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑OD值測定結(jié)果

總均值1.318±0.0882.成品檢測重復(fù)性測定取按上法制備的三批成品，每批成品重復(fù)測定六次，每次測定三個平行樣，每次實驗均值結(jié)果見表2，誤差值結(jié)果見表3。
表2.無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑成品濃度重復(fù)測定均值結(jié)果(U/支)

表3.無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑成品濃度重復(fù)測定與均值誤差結(jié)果

根據(jù)上述結(jié)果，分光光度計法具有較好的重復(fù)性與可靠性；該法測定結(jié)果與菌體重量顯著相關(guān)，適用于調(diào)理劑原液濃度檢測半成品濃度調(diào)整，目前分光光度計法納入試行規(guī)程草案。
實施例1無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑的制備可采用不同的物理裂解方法制備無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑，如采用超聲破碎法或高壓破碎法，最優(yōu)選高壓破碎法。
生產(chǎn)用卡介菌菌種為D2PB302S11甲10株(上海生物制品研究所保藏)，生產(chǎn)前對其作培養(yǎng)特性，毒力試驗、安全試驗、脾激活試驗、抑瘤試驗、毒性試驗等。上述6項檢查均合格的菌種，方用于生產(chǎn)。生產(chǎn)中規(guī)定，菌種的代次不能超過12代。
制造卡介苗的菌種，嚴(yán)禁使用通過動物的菌種制造卡介苗。
高壓破碎法制備無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑1.1菌種傳代與培養(yǎng)凍干卡介菌菌種在蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基、膽汁馬鈴薯培養(yǎng)基以及液體蘇通培養(yǎng)基上每傳一次為一代。在馬鈴薯培養(yǎng)基上培育的菌種放冰箱保存不超過2個月。用于生產(chǎn)菌苗的培養(yǎng)物的總代數(shù)不超過12代。
1.2原液制造1.2.1原液制備培養(yǎng)瓶應(yīng)逐瓶檢查，若有污染、濕膜、混濁等情況應(yīng)廢棄。收集菌膜壓干，精確稱重，加入滅菌無致敏原凍干保護液，優(yōu)選用磷酸鹽緩沖液，先用高速研磨機制備菌體勻漿，使?jié)舛葹?20mg/ml，經(jīng)高壓均質(zhì)機(丹麥APV公司生產(chǎn)的Homogenizer，Model-2000)的高壓氣流剪切技術(shù)勻漿破碎菌體，條件為1200bar、經(jīng)12次循環(huán)破碎菌體。
其中，磷酸鹽緩沖液的組成和配比如下A液Nacl 17克NaH2PO4.2H2O 2.608克B液Nacl 17克
Na2HPO410克3)凍干保護液取相同體積的A、B液混合，使混合液的pH為6.0-8.0，優(yōu)選7.0-7.4，最優(yōu)選7.2，混合液通過G3漏斗過濾后110℃～135℃蒸汽處理10～40分鐘，優(yōu)選115℃蒸汽滅菌30分鐘即為磷酸鹽緩沖液。
該方法除了使用高壓勻漿機的高壓氣流剪切技術(shù)，其他類似的高壓破碎技術(shù)均可。
1.2.2原液滅活取菌體勻漿懸液經(jīng)鈷60100～150萬拉得照后保存于2～8℃。
1.2.3濃度測定以分光光度法測定原液濃度，根據(jù)原液濃度用保護液將原液稀釋成120U/ml，分裝成品濃度應(yīng)為60±20％U/ml，分裝過程中務(wù)使制品混合均勻，每支安瓶分裝0.5ml。
上述高壓破碎法或超聲破碎法制備的無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑用于預(yù)防胃癌、膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)，治療高危HPV病毒感染和預(yù)防宮頸癌癌前病變，預(yù)防尖銳濕疣復(fù)發(fā)等粘膜免疫系統(tǒng)的疾病。優(yōu)選劑量為60U/ml無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑。所述60U/ml無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑以及下面實施例中提及的60U/ml無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑是指由相應(yīng)濕菌重量的卡介菌經(jīng)上述方法裂解后的裂解產(chǎn)物得到的制劑。
實施例2無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對荷瘤鼠免疫功能的影響本例主要觀察無細胞卡介菌BCG粘膜免疫調(diào)理劑經(jīng)灌胃給藥對荷瘤鼠血清溶菌酶含量的影響及遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)(PTH)來說明無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對荷瘤鼠免疫功能的影響。
2.1無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對黑色素瘤B16荷瘤小鼠血清溶菌酶含量的影響按1∶3黑色素瘤B16細胞濃度，0.2ml給小鼠皮下或腹腔接種后，24小時開始灌胃給藥。無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑設(shè)三個劑量組，選用25.00U/kg為高劑量組，12.50U/kg為中劑量組，6.25U/kg為低劑量組。灌胃給藥隔天一次，共四次。同時與治療用卡介菌等劑量(25.00mg/kg)進行比較。設(shè)順氨氯鉑(CDDP)為陽性對照藥和溶劑荷瘤對照組。攻瘤后14天，采血分離血清測血清中溶菌酶含量。
兩次結(jié)果均表明(結(jié)果見表4)，無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對黑色素瘤B16荷瘤鼠有活化單核巨嗜細胞功能，增加荷瘤鼠血清中溶菌酶含量。6.25U/kg組二次結(jié)果分別為36.3ug/ml和36.9ug/ml，12.50U/kg組為32.0ug/ml和39.1ug/ml，25.00U/kg組為43.0ug/ml和39.6ug/ml，與同等劑量的卡介菌(25.00mg/kg)比較未見明顯差別。
表4.無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對黑色素瘤B16荷瘤小鼠血清溶菌酶含量的影響

t測驗各給藥組與對照組比較；*P＜0.05，**P＜0.012.2無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對肝癌H22荷瘤鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)(PTH)的影響按1∶3小鼠肝癌H22實體瘤細胞濃度，0.2ml給小鼠皮下接種后，隨機分為溶媒對照組，CDDP陽性對照組和無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑低、中、高三個劑量組，共5組另設(shè)正常鼠脾指數(shù)對照。劑量同上。灌胃給藥的同一天除正常鼠組以外，將各組小鼠用1％二硝基氯苯(DNEB)10ul于腹部皮下致敏，在術(shù)次給藥后24小時再用1％二硝基氯苯(DNEB)10ul于每只小鼠左趾部皮下攻擊，右趾部用溶媒10ul作對照，24小時后取左、右趾稱重，以足腫脹度表示反應(yīng)強弱，同時解剖荷瘤鼠，取脾稱重，計算脾指數(shù)。以足重差、脾激活指數(shù)為指標(biāo)觀察無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對致敏性T淋巴細胞的影響，試驗重復(fù)2次(結(jié)果見表5)。
表5.無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對肝癌H22荷瘤鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)(PTH)的影響

t測驗△△荷瘤各組與正常各組比較P＜0.01**給藥各組與荷瘤對照比較P＜0.01；*給藥各組與荷瘤對照比較P＜0.05
血清溶菌酶含量結(jié)果表明無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對荷瘤鼠非特異性免疫功能，具有活化單核巨噬細胞功能、增加荷瘤鼠血清溶菌酶含量的作用。能增強荷瘤動物的抗腫瘤免疫作用。
遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)結(jié)果表明無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對T細胞介導(dǎo)的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)具有免疫增強作用。無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑各給藥組的脾激活指數(shù)與正常鼠組比較明顯增高，足重差加大，遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)性增強，能明顯抑制腫瘤生長。
實施例3無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對免疫功能低下機體的免疫功能的影響本例說明無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠免疫功能的影響。
將70只Balb/c小鼠隨機分成5組，分別為無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑低、中、高劑量組、陰性對照組和正常對照組，每組14只，雌雄各半。
免疫功能正常對照組不給任何藥物；其余實驗各組a.陽性對照組隔日灌服阿膠原液0.2ml/只，共灌服10次。
b.陰性對照組隔日灌服生理鹽水0.2ml/只，共灌服10次。
c.高劑量組隔日灌服無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑20U/0.2ml/只，共灌服10次。
d.中劑量組隔日灌服無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑5U/0.2ml/只，共灌服10次。
e.低劑量組隔日灌服無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑1U/0.2ml/只，共灌服10次。
實驗各組實驗前6天(服藥第14日)，實驗小鼠皮下注射環(huán)磷酰胺100mg/kg，造成免疫功能低下模型。
分別對免疫功能低下模型小鼠單核巨噬細胞系統(tǒng)吞噬功能、特異性抗體血清溶血素水平、小鼠脾臟T淋巴細胞增殖功能進行檢測。分別免疫功能正常對照組各指標(biāo)與陰性對照組比較，結(jié)果若有顯著性差異(P＜0.01)，則提示免疫功能低下模型成功。
用碳粒廓清法研究了無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對實驗性免疫功能低下小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響。實驗結(jié)果顯示(見表6)，與陰性對照組比較，調(diào)理劑低、中、高劑量組吞噬指數(shù)值均明顯增高，結(jié)果有極顯著性差異(P＜0.01)。提示無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對實驗性免疫功能低下小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能明顯的促進作用。
表6無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對實驗性免疫功能低下小鼠吞噬指數(shù)的影響

用血清溶血素測定法研究了無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對實驗性免疫功能低下小鼠特異性體液免疫功能的影響。實驗結(jié)果顯示(見表7)，與陰性對照組比較，低、中、高劑量組半數(shù)溶血值HC50均明顯增高，有極顯著性差異(P＜0.01)。提示無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對實驗性免疫功能低下小鼠特異性抗體血清溶血素生成有明顯的促進作用。
表7無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對實驗性免疫功能低下小鼠半數(shù)溶血值的影響

用3H-TdR摻入法研究了無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對PHA誘導(dǎo)實驗性免疫功能低下小鼠脾臟T淋巴細胞增殖作用的影響。實驗結(jié)果顯示(見表8)無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對實驗性免疫功能低下小鼠T淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能呈雙向性調(diào)節(jié)作用，高、中劑量組表現(xiàn)為抑制作用，低劑量表現(xiàn)為促進作用。
表8無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對PHA誘導(dǎo)免疫功能低下小鼠

上述結(jié)果陽性對照組和陰性對照比較都有顯著性差異(P＜0.01)。說明免疫功能低下模型建立成功。無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑有促進免疫功能低下機體免疫功能的恢復(fù)作用。
實施例4無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對免疫正常機體的免疫功能的影響4.1無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠脾臟單個核細胞Th1類細胞因子表達的影響Th細胞是免疫系統(tǒng)重要的調(diào)節(jié)細胞和效應(yīng)細胞，根據(jù)分泌的細胞因子不同，Th細胞被分為Th1和Th2兩大類，前者主要分泌IFN-γ和IL-2等，后者主要分泌IL-4、IL-5和IL-10等。Th1/Th2的動態(tài)平衡受多因素調(diào)節(jié)，其中IL-12被認(rèn)為是Th1應(yīng)答的啟動因子，促進Th0細胞向Th1細胞分化。Th1/Th2應(yīng)答維持一個動態(tài)平衡，對機體的免疫狀態(tài)至關(guān)重要。
本例通過研究無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對Th1類細胞因子表達的影響，說明無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對機體Th1/Th2應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用。
本例分為調(diào)理劑實驗組(低、中、高劑量組)、陰性對照組和陽性對照組，每組10只小鼠。調(diào)理劑低劑量組隔日灌服無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑1U/0.2ml，中劑量組隔日灌服無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑5U/0.2ml，高劑量組隔日灌服無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑20U/0.2ml，陽性對照組隔日灌服阿膠液20U/0.2ml，陰性對照組隔日灌服鹽水0.2ml，共灌服10次。
常規(guī)取小鼠脾臟，無菌制備單細胞懸液，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈擴增(RT-PCR)結(jié)合激光密度掃描，研究了無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠脾臟單個核細胞IFNγmRNA、IL-2 mRNA表達的影響。
實驗結(jié)果顯示(見表9)粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠脾臟單個核細胞IFNγmRNA表達有明顯的增強作用。與陰性對照組比較，無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑中劑量組和高劑量組結(jié)果均有極顯著性差異(P＜0.01)；同時對小鼠脾臟單個核細胞IL-2 mRNA表達有增強作用。與陰性對照組比較，無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑高劑量組結(jié)果有顯著性差異(P＜0.05)。
表9無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠脾臟單個核細胞IFNγmRNA表達的影響

表10.無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠脾臟單個核細胞IL-2 mRNA表達的影響

本例(結(jié)果見表10)說明無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑能促進Th1類細胞因子TFN-γ和IL-2在脾臟單個核細胞的表達。由此可推斷無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑可上調(diào)Th1類應(yīng)答，對粘膜免疫系統(tǒng)的疾病有預(yù)防及治療的作用。
4.2無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠體內(nèi)一氧化氮產(chǎn)生的影響NO在體內(nèi)是一種重要的信號分子和有力的效應(yīng)分子，其水平提高有利于機體對寄生在細胞內(nèi)細菌、病毒的殺傷和清除作用。巨噬細胞體外培養(yǎng)經(jīng)適當(dāng)?shù)拇碳ぴ烧T導(dǎo)產(chǎn)生NO，產(chǎn)生的NO快速氧化成NO-2，通過檢測NO-2可反映NO的產(chǎn)生水平。此例說明BCG-CW粘膜免疫調(diào)理劑免疫小鼠后對小鼠脾臟單個核細胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表達，以此說明對巨噬細胞NO產(chǎn)生情況的影響。本實驗給藥途徑，劑量、動物分組方式同4.1。實驗結(jié)果顯示(見表11)無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠脾臟單個核細胞iNOS mRNA表達有明顯的增強作用。與陰性對照組比較，無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑低劑量組結(jié)果有顯著性差異(P＜0.05)。
表11.無細響卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠脾臟單個核細胞iNOS mRNA表達的影響

此例顯示無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑可促進NO的產(chǎn)生，這將有利于機體對的微生物發(fā)揮殺傷和清除作用。
4.3無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠NK細胞殺傷活性的影響用乳酸脫氫酶(LDH)法研究了無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠自然殺傷(NK)細胞殺傷活性的影響。本實驗給藥途徑，劑量、動物分組方式同4.1。
實驗結(jié)果(見表12)顯示無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠NK細胞殺傷活性有明顯的增強作用。與陰性對照組比較，無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑低劑量組、中劑量組和高劑量組結(jié)果均有極顯著性差異(P＜0.01)表12.無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠NK細胞殺傷活性的影響

4.4無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠脾臟CD3、CD4和CD8 T淋巴細胞亞群的影響用特異性抗體熒光標(biāo)記-流式細胞儀檢測技術(shù)研究了無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠脾臟CD3、CD4和CD8 T淋巴細胞亞群的影響。本實驗給藥途徑、劑量、動物分組方式同4.1。實驗結(jié)果顯示(見表13)無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑高、中、低劑量組對小鼠脾臟CD3、CD8 T淋巴細胞分化亞群均有明顯的增強作用(P＜0.01)，高劑量組對小鼠脾臟CD4 T淋巴細胞分化亞群有明顯的增強作用(P＜0.01)。
表13.無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠脾臟T淋巴細胞分化亞群的影響

實施例5無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對粘膜組織局部作用的研究本例通過口服和膀胱灌注的方式，觀察無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑滯留于粘膜組織的動態(tài)變化、粘膜組織的免疫刺激作用，及對局部粘膜組織的毒副作用。
試驗結(jié)果表明無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑經(jīng)口服5小時后在胃粘膜仍可檢出，在胃部停留至少2小時以上。
無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑多次經(jīng)口服給藥觀察調(diào)理劑對家兔胃局部的毒副反應(yīng)。結(jié)果顯示，調(diào)理劑高劑量組對家兔胃局部有輕度刺激作用，肉眼可見胃粘膜局部輕度充血，鏡下出現(xiàn)粘膜細胞溶解與脫落及胃小凹變淺；低劑量組及對照組胃粘膜未見異常組織病理學(xué)改變。
無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑多次灌胃給藥對家兔胃粘膜的刺激作用。結(jié)果顯示，高劑量組的家兔胃粘膜固有層及粘膜下層出現(xiàn)淋巴細胞浸潤及灶性淋巴細胞增生；低劑量組的家兔胃粘膜固有層內(nèi)可見淋巴細胞浸潤，而對照組胃粘膜未見異常組織學(xué)改變。
無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑經(jīng)多次經(jīng)尿道給藥，觀察對豚鼠膀胱局部的毒副反應(yīng)。結(jié)果顯示，調(diào)理劑高對豚鼠膀胱局部有輕度刺激作用，膀胱粘膜基底細胞排列不整，膀胱粘膜移行上批細胞輕度水樣變性，低劑量組與對照組膀胱粘膜及膀胱壁未見組織病理學(xué)改變。
無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑經(jīng)多次膀胱灌注給藥對豚鼠膀胱粘膜的刺激作用。結(jié)果顯示，高、低劑量組的豚鼠膀胱粘膜未見明顯淋巴細胞及巨噬細胞浸潤及其他組織學(xué)改變。
實施例6無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對腫瘤的防治效果本例主要觀察了25.00U/kg、12.50U/kg、6.25U/kg三個劑量組無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑經(jīng)灌胃給藥對動物移植性黑色素瘤B16、Lewis肺癌、肝癌H22、淋巴細胞白血病P388、瓦克癌(肉瘤)W256、人胃癌株m85腫瘤的抑瘤作用。實體瘤觀察14天，腹水型觀察60天，試驗到期后，解剖瘤體稱重，按平均瘤重計算瘤重抑制率，按平均存活天數(shù)計算生命延長期。試驗結(jié)果證實無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對實體黑色素瘤B16、Lewis肺癌、瓦克癌(肉瘤)W256、人胃癌株m85腫瘤的抑瘤作用；對肝癌H22、淋巴細胞白血病P388攻擊小鼠有延長生命存活期的作用趨勢。
試驗還觀察了25.00U/kg、6.25U/kg兩個劑量組無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑經(jīng)瘤周給藥對動物移植性黑色素瘤B16、肝癌H22的抑瘤作用，結(jié)果與口服途徑給藥結(jié)果基本一致，結(jié)果見表14和表15。
表14.瘤周注射無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對小鼠黑色素瘤B16的抑瘤作用

**P＜0.01*P＜0.05
表15.瘤周注射無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤作用

**P＜0.01*P＜0.05
實施例7無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑急性毒性試驗本例經(jīng)口服和腹腔給藥兩種途徑，分別一次給予無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑，觀察無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)對小鼠所產(chǎn)生的毒反應(yīng)和死亡情況，及小鼠對無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑的最大耐量。給藥后連續(xù)七天觀察小鼠死亡數(shù)目與異常病變。試驗結(jié)果表明，在給藥劑量達到相當(dāng)于擬臨床人用量的5333倍時，(根據(jù)人用劑量120U/50kg計算，小鼠使用最高劑量是人用劑量5333倍)未發(fā)現(xiàn)對小鼠明顯的毒性反應(yīng)。經(jīng)口服和腹腔給藥結(jié)果一致，均未引起小鼠死亡及異常癥狀。結(jié)果分別見表16和表17。
表16.無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑急性毒性試驗(口服途徑)

表17.無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑急性毒性試驗(腹腔注射)

實施例8無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期毒性試驗本例經(jīng)口服給予無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑，觀察無細胞卡介菌對Beagle犬長期毒性以及Wistar大鼠長期毒性反應(yīng)及嚴(yán)重程度。每天灌胃給藥一次，連續(xù)給藥45天。在給藥期間，每天觀察各組動物的外觀體征、行為活動、進食量、糞便性狀。每周測定體重一次，并按每只動物的體重調(diào)整給藥劑量。給藥結(jié)束后，禁食14小時左右，觀測如下指標(biāo)血液學(xué)指標(biāo)；血液生化指標(biāo)；系統(tǒng)器官的病理學(xué)檢查。
試驗結(jié)果(見表18-表35)表明，在給藥劑量達到相當(dāng)于擬臨床人用量的100倍時，未發(fā)現(xiàn)Beagle犬與Wistar大鼠在一般行為、血液學(xué)、生化學(xué)和病理學(xué)等指標(biāo)方面出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，說明無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑毒性較低。
表18無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期口服對大鼠體重的影響(P＞0.05)

表19無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期口服對大鼠各主要臟器系數(shù)的影響(X±SD)(給藥期)

注n＝12與對照組比較*P＜0.05表20無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期口服對大鼠各主要臟器系數(shù)的影響(X±SD)(恢復(fù)期)

注n＝6與對照組比較P＞0.05
表21.無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期口服對大鼠外周血相的影響(X±SD)

注與對照組比較*P＜0.05**P＜0.01表22無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期口服對大鼠白細胞分類及凝血時間的影響(X±SD)

注與對照組比較P＞0.05
表23無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期口服對大鼠外周血相的影響(恢復(fù)期)(X±SD)

注與對照組比較P＞0.05表24無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期口服對大鼠白細胞分類及凝血時間的影響(恢復(fù)期)(X±SD)

注與對照組比較P＞0.05
表25無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對大鼠血清各生化指標(biāo)的影響

注n＝12與對照組比較*P＜0.05表26無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑對大鼠血清各生化指標(biāo)的影響(恢復(fù)期)

注n＝6與對照組比較P＞0.05
表27無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期口服對Beagle犬體重的影響

注與對照組比較P＞0.05表28無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期口服對Beagle犬各主要臟器系數(shù)的影響(X±sD)(給藥期)

注n＝3與對照組比較P＜0.05
表29無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期口服對Beagle犬各主要臟器系數(shù)的影響(X±SD)(恢復(fù)期)

表30無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期口服對Beagle犬外周血相及凝血時間的影響(X±SD)

注與對照糾比較*P＜0.05
表31無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期口服對Beagle犬白細胞分類的影響(X±SD)

注與對照組比較P＞0.05
表32無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期口服對Beagle犬血清各生化指標(biāo)的影響(X±SD)

注*與對照組比較P＜0.05
表33無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期口服對Beagle犬血清各生化指標(biāo)的影響(X±SD)

注*與對照組比較P＜0.05
表34無細胞卡介菌粘膜免疫調(diào)理劑長期口服對Beagle犬心電圖的影響(X±SD)

注與對照組比較P＞0.05
表35無細胞卡介菌免疫調(diào)理劑長期口服對Beagle犬尿常規(guī)的影響

權(quán)利要求
1.一種無細胞卡介菌勻漿制劑，其是一種細胞壁、菌體蛋白和細菌核酸復(fù)合物的勻漿溶菌制劑，其特征在于所述制劑由卡介菌經(jīng)裂解制備而成，裂解過程中首先破碎菌體。
2.包含權(quán)利要求1所述的無細胞卡介菌勻漿制劑的藥物組合物或粘膜免疫調(diào)理劑。
3.權(quán)利要求1所述的無細胞卡介菌勻漿制劑，權(quán)利要求2所述的藥物組合物或粘膜免疫調(diào)理劑在制備用于粘膜免疫調(diào)節(jié)的藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述免疫調(diào)節(jié)為提高正常機體的免疫功能或為促進免疫低下機體免疫功能的恢復(fù)或抑制免疫亢進機體過強的免疫應(yīng)答。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中所述免疫調(diào)節(jié)為促進遲發(fā)型超敏反應(yīng)、促進T淋巴細胞的增值、加強抗原遞呈細胞對抗原的吞噬和處理能力或促進機體對進入細胞內(nèi)的微生物殺傷和清除能力。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述制劑，藥物組合物或粘膜免疫調(diào)理劑用于促進NO的產(chǎn)生或增強NK細胞的殺傷能力。
7.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中所述制劑，藥物組合物或粘膜免疫調(diào)理劑用于促進脾臟CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群含量。
8.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中所述制劑，藥物組合物或粘膜免疫調(diào)理劑用于提高IL-2、IFN-γ的表達量，或降低IL-4的表達量。
9.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述制劑，藥物組合物或粘膜免疫調(diào)理劑用于調(diào)節(jié)Th1類免疫應(yīng)答和Th2類免疫應(yīng)答或用于預(yù)防胃癌、膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)，治療高危HPV病毒和預(yù)防宮頸癌癌前病變，預(yù)防尖銳濕疣復(fù)發(fā)。
10.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述制劑，藥物組合物或調(diào)理劑的有效劑量為60U/支。
全文摘要
本發(fā)明提供一種無細胞卡介菌勻漿制劑，包括該制劑的藥物組合物或粘膜免疫調(diào)理劑，所述的制劑由卡介菌經(jīng)破碎裂解制備而成，如高壓勻漿破碎法或超聲破碎法。該制劑可增強正常機體的免疫功能、促進免疫低下機體免疫功能的恢復(fù)和抑制免疫亢進機體過強的免疫應(yīng)答，即具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用。該制劑有顯著的抑瘤效果，對預(yù)防胃癌、膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)，治療高危HPV病毒感染和預(yù)防宮頸癌癌前病變，預(yù)防尖銳濕疣復(fù)發(fā)等疾病有潛在的預(yù)防或/和治療效果，是一種安全有效的粘膜免疫調(diào)理制劑。
文檔編號A61P31/00GK1985853SQ20061014080
公開日2007年6月27日 申請日期2006年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月11日
發(fā)明者王國治, 鄒宇玲, 賈淑珍, 寇麗杰, 喬來艷, 趙愛華 申請人:中國藥品生物制品檢定所