專利名稱：神經調節(jié)蛋白用于心血管疾病治療的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及預防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類各種心血管疾病、心血管紊亂的組合物和方法。更具體說，本發(fā)明提供了神經調節(jié)蛋白或其功能片段、或編碼該神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，或提高所述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質在預防、治療或延緩哺乳動物各種心血管疾病及紊亂的組合物和方法。
背景技術：
病毒性心肌炎(Viral Myocarditis)是因多種病毒侵犯心臟，引起局灶性或彌漫性心肌間質炎性滲出和心肌纖維變性、壞死或溶解，伴有心包或心內膜炎癥，導致心肌損傷，心功能障礙，心律失常和周身癥狀。病毒性心肌炎可發(fā)生于任何年齡，近年來發(fā)生率有增多的趨勢。其后遺癥為心律失常，心力衰竭，心源性休克，甚至猝死。若病程遷延不愈，導致心臟肥大，導致心肌永久性損害，并因免疫反應逐漸發(fā)展為心肌病。病毒性心肌炎的臨床治療原則主要是改善心肌功能，修復損傷心肌，控制心力衰竭。病毒性心肌炎的臨床治療用藥包括抗生素、心肌保護劑、抗氧化劑如大劑量維生素C、維生素E、輔酶Q10等以及營養(yǎng)心肌的藥物如能量合劑以加強心肌營養(yǎng)。但上述療效并不十分理想，尤其是針對心肌炎導致的心肌結構及功能改變尚無療效肯定的治療措施。
擴張性(充血性)心肌病〔Dilated(congestive)Cardiomyopathy，DCM〕是原因不明的各種心肌疾病的最后結局，它是非風濕性、非高血壓性、非冠狀動脈性的心肌結構和功能的病理改變。擴張性心肌病主要表現為心室高度擴張和心肌收縮期泵功能障礙或充血性心力衰竭為特征。擴張性心肌病的心肌輕度損傷常表現為細胞核及細胞器的肥大，重度損傷表現為細胞結構的改變、細胞壞死，由此導致的纖維化。DCM的發(fā)病原因及機制均尚未闡明且因無有效的防治方法而預后極差。多數患者常因心力衰竭進行性加重死亡或因心律失常而發(fā)生猝死。常規(guī)治療DCM除使用強心劑、利尿劑、ACEI等治療外，第三代鈣離子拮抗劑阿羅地平和第三代β-受體阻滯劑如卡維地洛亦用于DCM的臨床治療。由于缺乏隨機、雙盲臨床試驗證實，甲狀腺素和生長激素的療效有爭議。目前，仍無特效治療DCM藥物。左室減容手術雖能減小左心室內徑，心功能暫時得以改善，而減容手術后因心衰加重，心律失常的死亡率較高，限制了左室減容手術在臨床上的應用。動態(tài)心肌成形術雖然能改善患者心功能，但手術創(chuàng)傷大，病人不易耐受，僅作為心臟移植禁忌時的替代方法。心臟移植作為DCM的根本治療手段因缺乏供體心臟，費用昂貴，術后感染以及移植后產生排異反應而影響治療。因此，提供DCM特效治療的藥物是臨床所急需解決的問題。
阿霉素(Doxorubicin or Adriamycin，ADM)屬蒽環(huán)類抗腫瘤藥，具有抗瘤譜廣、作用強等特點。在臨床上廣泛應用于肺癌、乳腺癌、膀胱癌、睪丸癌、甲狀腺癌、軟組織腫瘤、骨肉瘤、神經母細胞癌、急性白血病和惡性淋巴瘤以及胃癌、肝癌、食管癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤的治療。其作用機制主要是ADM分子嵌入DNA而抑制核酸的合成。ADM為細胞周期非特異性藥，對S期作用最強，M、G1和G2期也有作用。有許多病例揭示無論是對轉移乳腺癌還是對術后乳腺癌的輔助化療，在單位時間內，用較大劑量化療藥物方案能產生較好的有效率和較長的生存期。隨后，又有一些研究證實了高劑量和劑量強度的重要性，肯定了劑量和劑量強度與療效的關系。
但ADM的毒性副作用，限制了其應用。ADM的毒性包括骨髓抑制，約有60～80％的患者在用藥后10～15天，白細胞及血小板降低至最低水平，約21天恢復到正常水平。而消化道反應主要有惡心、嘔吐、厭食、胃炎甚至潰瘍、口腔粘膜炎癥。同時，幾乎所有用藥者都發(fā)生不同程度的脫發(fā)，但停藥后，該反應停止。
限制高劑量ADM等蒽環(huán)類藥物在臨床應用的主要原因是心臟毒性，ADM心臟毒性的作用機制主要是產生的氧自由基，由于ADM分子結構中的半醌基發(fā)生氧化還原反應引起膜脂質過氧化，引起細胞損傷。氧自由基引起脂質過氧化反應增強，損傷細胞膜及細胞器膜，改變膜上蛋白質的功能及酶的活性，導致細胞內鈣超載，核酸、蛋白質合成受抑制，能量代謝障礙，嚴重影響心肌的收縮和舒張功能。
ADM在體內積聚量過多時，由于ADM與心肌組織的親和力明顯高于其他組織，使心肌組織更容易受ADM的損害，產生心臟毒性。心臟毒性表現為急性及慢性毒性反應兩種。急性反應表現為心臟的各種功能性變化，如竇性心動過速、心律不齊、傳導阻滯及ST-T段的改變等。在ADM用藥早期易出現心律失常，急性心臟毒性還表現為左心室射血分數(LVEF)的減低，心搏量(SV)、心排出量(CO)、心排指數(CI)相應減低，說明ADM對患者左心收縮功能以及左心泵功能均有抑制效應。ADM導致慢性反應表現為不可逆的充血性心力衰竭。一旦出現充血性心力衰竭，其病死率可達30％～50％。這在一定程度上限制了ADM的大劑量、長期應用，迫使癌癥患者中斷治療。
如何在臨床使用ADM時不影響其化療效果同時減少其心臟毒性已有廣泛的研究。如適當減少ADM的總量，并增加營養(yǎng)心肌如大量維生素C配合使用，經常輸血、使用鐵離子螯合劑ICRF-187等保護心肌。然而，這些藥物在保護心肌的同時，對減少ADM的心臟毒性作用甚微。因此，需要預防、治療或延緩因使用ADM導致的心臟毒性作用，同時不影響其療效的藥物。
許多病因可引起心力衰竭如冠狀動脈硬化、高血壓、炎癥引起心肌損傷導致難治愈的心臟疾病。這些因素導致心肌細胞結構、功能的改變，最終使心室射血功能下降導致心力衰竭。心力衰竭是嚴重影響人類健康的疾病，其發(fā)病率及死亡率在全球都很高。在美國，心力衰竭每年住院率為30-40％，確診的心力衰竭患者5年死亡率，男性為60％，女性為45％；平均生存時間，男性為3.2.年，女性為5.4年，終末期的心力衰竭患者的生存率只有20％。
神經調節(jié)蛋白-1(neuregulin-1，NRG-1)又稱Neu DifferentiationFactor(NDF)或glial growth factors(GGF)，是ErbB3、ErbB4的配體。用神經調節(jié)蛋白基因嚴重缺陷的小鼠胚胎的研究證明神經調節(jié)蛋白對于心臟和神經發(fā)育是必需的。然而，關于神經調節(jié)蛋白控制細胞分化和控制下游信號途徑的信息是有限的。在心臟發(fā)育的早期，神經調節(jié)蛋白和ErbB受體分別在心內膜內層和心肌層表達。這二層分開很寬，神經調節(jié)蛋白必須穿過二層細胞中的空間，再激活ErbB受體。激活心肌細胞中的這些受體促進心肌細胞生長或遷移到心內膜。WO00/37095發(fā)現神經調節(jié)蛋白增強心肌細胞的分化，肌原纖維節(jié)和細胞骨架的組合與細胞間的粘合。WO00/37095發(fā)現神經調節(jié)蛋白與它的細胞作用可能適用于探測，診斷與處理心臟疾病。WO00/37095提出神經調節(jié)蛋白及其類似物在體外促進心肌細胞分化，誘導心肌細胞內肌原纖維節(jié)和細胞骨架結構重建或細胞間粘合，識別能抑制神經調節(jié)蛋白刺激心肌細胞分化的多肽或化合物，可應用于治療心臟病和心力衰竭中。
因此，需要更有效和(或)性價比更好有關NRG治療病毒性心肌炎、DCM、預防或治療藥物導致的心臟毒性如ADM，不影響其療效和心肌梗死的方案。本發(fā)明提供了上述需求的方法及應用。
發(fā)明內容
治療病毒性心肌炎或擴張性(充血性)心肌病一方面，本發(fā)明提供了一種預防、治療或延緩哺乳動物病毒性心肌炎或DCM方法，該方法包括對需要或希望預防、治療或延緩的哺乳動物施用有效量的神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質，從而預防、治療或延緩病毒性心肌炎或DCM。優(yōu)選地，在體內施用神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質。
另一方面，本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包括有效量的神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質以及有效量的預防或治療病毒性心肌炎或DCM的藥物組成。
另一方面，本發(fā)明還提供了預防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類病毒性心肌炎或DCM的藥物有效成分，該藥物有效成分包括有效量的神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質，從而預防、治療或延緩病毒性心肌炎或DCM。
治療藥源性心臟毒性本發(fā)明提供了預防、治療或延緩因藥源性導致的心臟毒性的方法。具體說，本發(fā)明提供了預防、治療或降低藥源性心肌病心臟毒性的方法。
本發(fā)明提供了一種預防、治療或延緩哺乳動物心臟毒性的方法，該方法包括對需要或希望預防、治療或延緩的哺乳動物在體內施用有效量的預防、治療藥物和有效量的(i)神經調節(jié)蛋白、或其功能片段；(ii)編碼該蛋白或功能片段的核酸；(iii)提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質，從而預防、治療或延緩藥源性心臟毒性的方法。
本發(fā)明可預防、治療或延緩本領域普通技術人員所知心臟毒性明顯的臨床癥狀，包括但不限于急性或慢性心臟毒性。例如，本發(fā)明可預防、治療或延緩心動過速、心律失常、心力衰竭。在具體實施例中，急性心臟毒性的臨床癥狀，例如，竇性心動過速、心律不齊、傳導阻滯及ST-T段的改變，以及左室射血分數(LVEF)的減低，心搏量(SV)、心排出量(CO)、心排指數(CI)減低可以得到預防、治療或延緩。本發(fā)明可預防、治療或延緩心臟毒性導致左心室收縮及泵出功能下降。
本發(fā)明提供了預防、治療或延緩藥源性心臟毒性的方法。在具體實施例中，治療或預防性藥物產生的氧自由基導致心臟毒性。在另一具體實施例中，治療或預防性藥物增強脂質過氧化反應導致心臟毒性。
本發(fā)明提供了預防、治療或延緩抗腫瘤藥物導致心臟毒性的方法?？鼓[瘤藥物是蒽環(huán)類抗腫瘤藥。更具體說，抗腫瘤藥物是具有下列通式的化合物
R1為甲氧基或氫，R2，R3和R4為羥基或氫。蒽環(huán)類抗腫瘤藥包括但不限于下列如ADM、柔紅霉素、表阿霉素、去甲氧柔紅霉素、米托蒽醌、絲裂霉素、博萊霉素、環(huán)磷酰胺、氟脲嘧啶、放線菌素D、長春新堿。本發(fā)明提供了神經調節(jié)蛋白作為抗心臟毒性藥物可以預防、治療或延緩化療藥物如ADM單獨或與其它藥物聯合使用導致心臟中毒。
本發(fā)明提供了預防、治療或延緩抗精神病藥物導致心臟毒性的方法?？咕癫∷幬锟梢允锹缺骸^乃靜、三氟拉嗪。
本發(fā)明提供了預防、治療或延緩三環(huán)類抗抑郁病藥物導致心臟毒性的方法。三環(huán)類抗抑郁病藥物可以是氯丙咪嗪，阿米替林，多慮平。
本發(fā)明提供了預防、治療或延緩干擾素如干擾素-α或白細胞介素如白細胞介素-2導致心臟毒性的方法。
本發(fā)明提供了預防、治療或延緩抗感染藥物如吐根堿導致心臟毒性的方法。
在本發(fā)明中使用神經調節(jié)蛋白可以是神經調節(jié)蛋白1、神經調節(jié)蛋白2、神經調節(jié)蛋白3或神經調節(jié)蛋白4。在一些實施例中，本發(fā)明方法使用神經調節(jié)蛋白可以是神經調節(jié)蛋白是神經調節(jié)蛋白α2或神經調節(jié)蛋白β2。在另一些實施例中，神經調節(jié)蛋白片段是包含有SEQID4的氨基酸序列的神經調節(jié)蛋白β2片段。
本發(fā)明使用的神經調節(jié)蛋白可以是神經調節(jié)蛋白或其功能片段。本發(fā)明方法可使用編碼該蛋白或功能片段的核酸，可使用任何可提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質。神經調節(jié)蛋白可單獨使用或與藥學上可接受的載體或賦形劑使用。神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質可在使用預防、治療性藥物之前、同時或之后使用。
在一些實施例中，在神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質存在的情況下，預防、治療性藥物的用量可高于其最大允許用量。
在另一些實施例中，本發(fā)明提供了對需要或希望預防、治療或延緩的人類心臟毒性方法。優(yōu)選地，使用在患有惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、睪丸癌、甲狀腺癌、軟組織腫瘤、骨肉瘤、神經母細胞癌、急性白血病和惡性淋巴瘤以及胃癌、肝癌、食管癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤的人類。
治療心肌梗死本發(fā)明還提供了預防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類心肌梗死的組合物，該組合物包括有效量的神經調節(jié)蛋白、或其功能片段、或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質以及有效量的預防或治療心肌梗死的藥物。
本發(fā)明提供了一種試劑盒，該試劑盒包括放置在容器的上述組合物和使用上述組合物預防、治療或延緩心肌梗死說明書。
本發(fā)明提供了一種預防、治療或延緩哺乳動物心肌梗死方法，該方法包括對需要或希望預防、治療或延緩的哺乳動物尤其是人類施用有效量的神經調節(jié)蛋白、或其功能片段、或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質，從而預防、治療或延緩心肌梗死。
藥物組合物安全劑量范圍一方面，本發(fā)明提供了一種預防、治療或延緩哺乳動物疾病的藥物組合物，該藥物組合物包括神經調節(jié)蛋白或其功能片段其a)安全劑量小于170U/kg，或b)有效療程總劑量小于3600U/kg。
圖1.神經調節(jié)蛋白工程菌株構建的技術路線。
圖2.神經調節(jié)蛋白基因的擴增。泳道1是通過RT-PCR擴增大小為183bp的目的片段，泳道2、3為DNA Markers。
圖3.PET22b質粒物理圖譜。
圖4.重組神經調節(jié)蛋白表達質粒的構建。泳道1、3為DNA Markers，泳道2是酶切后神經調節(jié)蛋白片段。
圖5.高效表達工程菌鑒定。泳道1 Marker；泳道2未誘導工程菌；泳道3誘導后1h；泳道4誘導后2h；泳道5誘導后3h；泳道6誘導后4h；泳道7-9不同工程菌誘導后圖6.大鼠假手術組心肌組織病理切片，心肌組織無特殊病理學改變(I)(10×10)。
圖7.模型組可見大面積紅染區(qū)(10×10)。
圖8.重組人神經調節(jié)蛋白高劑量組(I)(20μg/kg)可見散在分布紅染心肌細胞(10×10)。
圖9.重組人神經調節(jié)蛋白中劑量組(I)(10μg/kg)可見片狀分布的紅染心肌細胞及纖維組織(10×10)。
圖10.重組人神經調節(jié)蛋白低劑量組(I)(5μg/kg)可見片狀分布的紅染心肌細胞及纖維組織(10×10)。
圖11.大鼠假手術組心肌組織病理切片，心肌組織無特殊病理學改變(II)(10×10)。
圖12.模型組(II)(10×10)可見大面積紅染區(qū)。
圖13.重組人神經調節(jié)蛋白高劑量組(20μg/kg)可見散在分布紅染心肌細胞(10×10)。
圖14.重組人神經調節(jié)蛋白中劑量組(II)(10μg/kg)可見片狀分布的紅染心肌細胞及纖維組織(10×10)。
圖15.重組人神經調節(jié)蛋白低劑量組(II)(5μg/kg)(10×10)可見片狀分布的紅染心肌細胞及纖維組織。
圖16.rhNRG-1β對模型動物心臟纖維化區(qū)域毛細血管增生的影響(I)(HE染色，50x)A假手術組正常心肌結構，無纖維化改變；B模型組心肌纖維化明顯，可見少量毛細血管增生；CrhNRG-1β(20μg/kg)組心肌呈片狀纖維化，毛細血管增生明顯；DrhNRG-1β(10μg/kg)組纖維化明顯，內有較多毛細血管增生；ErhNRG-1β(5μg/kg)組片狀纖維化，可見毛細血管增生。
圖17.rhNRG-1β對模型動物心臟纖維化區(qū)域毛細血管增生的影響(II)(HE染色，50倍x)A假手術組正常心肌結構，無纖維化改變；B模型組心肌纖維化明顯，可見少量毛細血管增生；CrhNRG-1β(20μg/kg)組心肌呈片狀纖維化，毛細血管增生明顯；DrhNRG-1β(10μg/kg)組纖維化明顯，內有較多毛細血管增生；ErhNRG-1β(5μg/kg)組片狀纖維化，可見毛細血管增生。
圖18.ADM導致SD大鼠中毒性心肌炎心肌病理切片。A.對照組心肌病理評分0分，心肌細胞無萎縮及肥大，無空泡，橫紋清晰，心肌排列整齊，心內膜、心外膜均無異常，血管和間質無變化。B.模型組心肌病理評分3分，心肌大面積壞死溶解。
圖19.rhNRG-1β對模型組動物存活率的影響。
圖20.rhNRG-1β對模型組動物心肌結構的影響。
圖21.rhNRG-1β對病毒感染導致小鼠心肌損傷治療作用的病理切片。A.正常組；B.模型組；C.安慰劑；D.高劑量組；E.中劑量組；F.低劑量組。
圖22.rhNRG-1β對病毒感染導致小鼠心肌損傷治療作用的病理切片。A.正常組；B.模型組；C.安慰劑；D.高劑量組；E.中劑量組；F.低劑量組。
圖23.rhNRG-1β不同用藥天數對病毒感染導致小鼠心肌損傷治療作用的病理切片。A.正常組；B.模型組；C.用藥3天；D.用藥5天；E.用藥7天。
圖24.rhNRG-1β不同用藥天數對病毒感染導致小鼠心肌損傷治療作用的病理切片。A.正常組；B.模型組；C.用藥3天；D.用藥5天；E.用藥7天。
具體實施例方式
為清楚公開發(fā)明內容而不是限制發(fā)明，分以下小節(jié)詳細說明。
A.釋義除另有定義，這里使用的所有科技術語與本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員理解含義相同。所有專利文獻、專利申請文獻、公開的專利文獻和其它出版物均作為參考。如本節(jié)闡述的定義與上述參考文獻所述的定義不一致或相反時，以本節(jié)闡述的定義為準。
在此所用“一個”的意思是“至少一個”或“一個或多于一個”。
在此所用“神經調節(jié)蛋白”(neuregulin)是包括可以激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3異源二聚體蛋白激酶的蛋白或多肽，例如神經調節(jié)蛋白異構體，神經調節(jié)蛋白EGF結構域，神經調節(jié)蛋白突變體以及可以激活上述受體的任何神經調節(jié)蛋白樣基因產物。典型的神經調節(jié)蛋白的片段是具有和受體結合部位如包括EGF結構域的人神經調節(jié)蛋白β2片斷，它能激活EGF受體家族的ErB受體，并調控多種生物反應如刺激乳腺癌細胞分化和乳蛋白分泌；誘導神經脊細胞分化為Schwann細胞；刺激骨胳肌細胞內乙酰膽堿受體的合成；以及促進心肌細胞存活和DNA合成。神經調節(jié)蛋白也包括替代保守氨基酸，但對抗病毒性心肌炎、抗DCM、抗心臟毒性或抗心肌梗死的作用不變的神經調節(jié)蛋白變異體。合適的替代保守氨基酸是本領域的普通技術，在多肽的非功能區(qū)域的個別氨基酸的改變對其功能無影響在本領域已是共識(see，e.g.，Watson等.Molecular Biology of the Gene，4thEdition，1987，The Bejacmin/Cummings Pub.co.，p.224)。常見神經調節(jié)蛋白包括神經調節(jié)蛋白和多肽，神經調節(jié)蛋白核酸包括神經調節(jié)蛋白核酸和多聚核酸。
在此所用“上皮生長因子樣結構域”或“EGF樣結構域”是指由神經調節(jié)蛋白基因編碼的結構域多肽，結合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或由它們組成的二聚體。具有與EGF受體結合區(qū)域相同結構域參見WO 00/64400，Holmes等，Science，2561205-1210(1992)；U.S.PatentNos.5,530,109 and 5,716,930；Hijazi等，Int.J.Oncol.，131061-1067(1998)；Chang等，Nature，387509-512(1997)；Carraway等，Nature，387512-516(1997)；Higashiyama等，J.Biochern.，122675-680(1997)；及WO97/09425。
在此所用神經調節(jié)蛋白“功能衍生物或功能片段”是指神經調節(jié)蛋白的衍生物或功能片段或編碼這些衍生物或功能片段核酸，這些衍生物或功能片段對抗病毒性心肌炎、抗DCM、抗心臟毒性或抗心肌梗死的作用不變。通常，這些衍生物或功能片段至少保留50％預防、治療或延緩抗病毒性心肌炎、抗DCM、抗心臟毒性或抗心肌梗死的作用。更好的情況下，這些衍生物或功能片段至少保留60％，70％，80％，90％，95％，99％或100％抗病毒性心肌炎、抗DCM、抗心臟毒性或抗心肌梗死的作用。
在此所用“提高神經調節(jié)蛋白產量的物質”是指可以提高神經調節(jié)蛋白基因的轉錄、翻譯作用的物質，或提高神經調節(jié)蛋白基因翻譯后修飾作用的物質和(或)提高NRG前體細胞通訊的物質，或提高神經調節(jié)蛋白半衰期的物質。
在此所用“提高神經調節(jié)蛋白功能的物質”是指可以或提高神經調節(jié)蛋白在抗病毒性心肌炎、抗DCM、抗心臟毒性或抗心肌梗死的作用，或提高神經調節(jié)蛋白在抗病毒性心肌炎、抗DCM、抗心臟毒性或抗心肌梗死的作用的信號傳導途徑中配體靈敏度的物質，或降低神經調節(jié)蛋白拮抗劑作用的物質，但不包括神經調節(jié)蛋白及其編碼神經調節(jié)蛋白的核酸。
在此所用“混合物”是指兩種或兩種以上物質。
在此所用“組合物”是指兩種或兩種以上的物質或化合物組成?？梢允侨芤?、懸浮劑、液體、粉劑、藥膏、水溶劑、非水溶劑或它們的混合在此所用“erb”指兩種癌基因，erb A和erb B，與骨髓成紅血細胞增多癥病毒相關(一種急性的轉化性逆轉錄病毒)。
在此所用“用于治療特定疾病的化合物有效用量”是指足以改善或以某種方式減少與該疾病相關癥狀的用量。該用量可為單一劑量或根據療程確定的有效劑量。該用量可以治愈疾病，但通常是減輕病情。為減輕病情，可能需要連續(xù)服用。
在此所用“心力衰竭”是指心功能異常，表現為心臟不能以組織代謝所需的速度供血。心力衰竭包括范圍廣泛的疾病狀態(tài)如充血性心力衰竭、心肌梗死、快速心律不齊、家族性肥大心肌病、缺血性心臟病、自發(fā)擴張型心肌病、心肌炎。許多因素可導致心力衰竭包括缺血性、先天性、風濕性或自發(fā)性。慢性心肌肥大是充血性心力衰竭和心臟停止跳動前的明顯的疾病狀態(tài)。
在此所用“重組方法生產”是指用重組核酸方法的生產方法。本方法是以眾所周知的克隆核酸表達其所編碼蛋白質的分子生物學方法。
在此所用“互補的”當是指兩個核酸分子的核苷酸序列能雜交，優(yōu)選是低于25％，更優(yōu)選是低于15％，更加優(yōu)選是低于5％，最優(yōu)選是在相對核苷酸處不存在錯誤配對。優(yōu)選在嚴格條件下，這兩個分子雜交。
在此所用決定錯誤配對百分率的“雜交的嚴格性”規(guī)定如下1)高嚴格性0.1×SSPE，0.1％SDS，65℃；2)中等嚴格性0.2×SSPE，0.1％SDS，50℃；(也指適度嚴格性)3)低嚴格性1.0×SSPE，0.1％SDS，50℃；應理解為使用對等的緩沖液、鹽和溫度，可以獲得相當的嚴格性。
在此所用“載體(或質粒)”是指用于將外源DNA導入細胞進行表達或復制的不連續(xù)元件。本領域技術人員熟知選擇及使用這些載體的技術。表達載體包括DNA表達載體，該載體有效與調控序列，例如啟動子區(qū)域連接在一起調控該DNA片段的表達。所以，一個表達載體是指重組DNA或RNA構建物，例如質粒、噬菌體、重組病毒或其它載體，當它們導入適當的宿主細胞中，可使克隆的DNA表達。本領域技術人員清楚適當的表達載體、能在真核細胞和(或)原核細胞中復制的載體以及保持游離態(tài)或整合進宿主細胞基因組的載體。
在此所用“啟動子區(qū)域或啟動子元件”是指調控DNA或RNA轉錄并與其有效連接的DNA片段或RNA片段。啟動子區(qū)域是RNA聚合酶識別、結合和轉錄起始的特定序列，這部分啟動子區(qū)域特指啟動子。同時，啟動子區(qū)域還包括調控RNA聚合酶識別、結合和轉錄起始活動的序列。這些序列可以對順式作用因子或對反式作用因子作出響應。根據調控性質，啟動子可以是組成型或調控型。用于原核生物典型的啟動子包括噬菌體T7和T3啟動子和類似的啟動子。
在此所用“有效連接和有效結合”是具有調控和效應功能的DNA，如啟動子、增強子、轉錄和翻譯終止位點及其它信號序列的核苷酸序列與功能的關系。例如，DNA和啟動子的有效連接是指DNA和啟動子間結構和功能的關系，RNA聚合酶能專一識別啟動子、結合和轉錄該段DNA，并從啟動子開始該段DNA轉錄。為優(yōu)化表達和(或)體外轉錄，有必要去掉、增加或改變克隆的5′不翻譯部分，以消除多余、潛在不適當的替代性翻譯(如起始)密碼子或其它不論是在轉錄或翻譯水平上干擾或減少表達的序列。而其它方法包括將核糖體結合位點共有序列緊接起始密碼子的5′插入，可增強表達(參見，Kozak.生物化學雜志(J.Biol.Chem.)1991；26619867-19870)。這一糾正的愿望(或需要)可由經驗來決定。
在此，通過服用特定的藥物組合物治療達到特定不適的癥狀“改善”是指任何的減輕，不管是永久還是暫時，持續(xù)還是短暫，可歸于或與服用藥物組合物有關系。
在此所用“治療藥物”的意思是使任何傳統的藥物或本領域技術人員所知的治療藥物，包括但不限于預防性或化療藥物。
在此所用“治療有效用量”是指足以改善或以某種方式減少與疾病相關癥狀的用量。該用量可為單一劑量或根據療程確定的有效劑量。為減輕病情，可能需要連續(xù)服用。
在此所用“使用”是指對治療目標以任何方式使用藥物。
在此所用“治療”的意思是使任何臨床癥狀、不適或疾病的癥狀得到改善或有益改變的方法。治療也包括任何藥物組合物的應用。改善特定不適的癥狀是指任何的減輕，不管是永久還是暫時，可歸于或與服用藥物組合物有關系在此所用“腫瘤”是指不正常的新生長，包括良性和惡性腫瘤。不同于增生，在沒有原有刺激后，腫瘤仍會繼續(xù)增殖。
在此所用“抗腫瘤藥劑”是指任何可用于用于預防腫瘤、癌癥發(fā)生或減輕腫瘤、癌癥嚴重程度的任何藥劑?？鼓[瘤藥劑包括，如抗血管生成劑、烷化劑、抗代謝劑、天然產品、鉑配位絡合物、蒽二酮、取代尿素、甲肼衍生物、腎上腺皮質抑制劑、激素和拮抗劑、癌基因抑制劑、腫瘤抑制基因或蛋白、抗腫瘤基因抗體、抗腫瘤基因反義寡聚核苷酸。
在此所用“抗精神病藥物”是指治療精神病的藥物?？咕癫∷幬锟梢允堑幌抻谌h(huán)吩噻嗪、噻噸、二苯西平、苯丁酮類、雜環(huán)族化合物、實驗用苯甲酰胺。
在此所用“三環(huán)類抗抑郁病藥物”是指治療抗抑郁病的藥物。三環(huán)類抗抑郁病藥物可以是但不限于抑制神經末梢吸收去甲腎上腺素及5-羥色胺、在大腦促進產生去甲腎上腺素功能。
在此所用“抗感染藥物”是指治療感染的藥物?？垢腥舅幬锟梢允堑幌抻诳辜纳x感染、細菌性感染、微生物的感染。
在此所用“安全劑量”是用于足以預防、治療或延緩哺乳動物疾病，但不引起副作用發(fā)生及不良反應的藥物劑量。
在此所用“心肌梗死”是冠狀動脈閉塞，血流中斷，使部分心肌因嚴重的持久性缺血而發(fā)生局部壞死。
B.預防、治療或延緩病毒性心肌炎、擴張性(充血性)心肌病方法本發(fā)明提供了一種預防、治療或延緩哺乳動物病毒性心肌炎、擴張型心肌病方法，該方法包括對需要或希望預防、治療或延緩的哺乳動物尤其是人類施用有效量的神經調節(jié)蛋白或其功能片段、或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質，從而預防、治療或延緩病毒性心肌炎、擴張型心肌病。
本發(fā)明的方法能用于任何哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔子、貓、狗、豬、奶牛、牛、綿羊、山羊、馬、猴子和其它非人靈長類動物預防、治療或延緩哺乳動物病毒性心肌炎、擴張型心肌病。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于人類預防、治療或延緩哺乳動物病毒性心肌炎、擴張型心肌病。
任何適當的神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸能用于本方法中。在特定的實施方案中，神經調節(jié)蛋白通過與ErbB2-ErbB4受體結合，產生抗病毒性心肌炎、擴張型心肌病的作用。在另一特定的實施方案中，其中神經調節(jié)蛋白可以選自神經調節(jié)蛋白1、神經調節(jié)蛋白2、神經調節(jié)蛋白3或神經調節(jié)蛋白4。神經調節(jié)蛋白1的同義詞包括heregulin，GGF2及p185erbB2的配體，參見WO 00/64400、U.S.Patent Nos.5,530,109、5,716,930。神經調節(jié)蛋白α2或神經調節(jié)蛋白β2均可用于本方法。優(yōu)選地，包含有SEQID4的氨基酸序列神經調節(jié)蛋白β2片段，用于本方法。
在其他的實例方案中，在下述專利、專利申請和GenBank中的神經調節(jié)蛋白或其功能片段可用于本方法中。如，美國專利6,252,051、6,121,415(NRG3)；6,087,323(神經調節(jié)蛋白與p185erbB2，p185erbB3或p185erbB4結合活性)；6,033,906(神經調節(jié)蛋白作為選自p185erbB2和p180erbB4受體的配體)；US2002002276(嵌合型ErbB異源多聚體作為神經調節(jié)蛋白競爭性拮抗劑或拮抗劑)；WO01/81540(NRG-4)；WO01/64877(NRG1)；WO01/64876(NRG1AG1)；WO01/58948(神經調節(jié)蛋白-β)；WO01/26607(SMDF和GGF神經調節(jié)蛋白拼接變異體)；WO00/70322(CRD-神經調節(jié)蛋白)；WO00/64400；WO99/18976；WO98/02540(嵌合型ErbB異源多聚體作為神經調節(jié)蛋白競爭性拮抗劑或拮抗劑)；WO96/30403；WO96/15812；BC017568(人，類似神經調節(jié)蛋白-4)；BC007675(人，神經調節(jié)蛋白-1)；AF142632(Xenopus laevis，富含半胱氨酸結構域的神經調節(jié)蛋白-1)；AF194439(Rattus norvegicus SMDF神經調節(jié)蛋白α2a(Nrg1))；AF194438(Rattusnorvegicus SMDF神經調節(jié)蛋白-β1a(Nrg1))；HS2NRG12(Homosapiens可選擇拼接神經調節(jié)蛋2(NRG2))；HS2NRG08(Homo sapiens可選擇拼接神經調節(jié)蛋2(NRG2))；HS2NRG07(Homo sapiens可選擇拼接神經調節(jié)蛋2(NRG2))；AF083067(Mus musculus神經調節(jié)蛋-4短同源體(Nrg4))；AF076618(Xenopus laevis神經調節(jié)蛋白α-1)；AF045656(Gallus gallus神經調節(jié)蛋白-β-2b)；AF045655(Gallus gallus神經調節(jié)蛋白-β-2a)；AF045654(Gallus gallus神經調節(jié)蛋白-β-1a)；MAU96612(Mesocricetus auratus神經調節(jié)蛋白)；AF010130(Mus musculus神經調節(jié)蛋白-3(NRG3)).公開的神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，用于本方法中。優(yōu)選地，GenBankAccession No.NT_007995(gi18570363)公開神經調節(jié)蛋白，用于本方法中。
本發(fā)明提供了預防、治療或延緩任何病毒性心肌炎的方法。例如，柯薩奇A及B組病毒，?？虏《?，脊髓灰質炎病毒等。優(yōu)選，本發(fā)明的方法用于預防、治療或延緩柯薩奇B組(Coxsackie)病毒。
本發(fā)明提供了預防、治療或延緩病毒性心肌炎的臨床癥狀的方法。例如，心包或心內膜炎癥可以得到預防、治療或延緩。還包括如心肌損傷、心功能障礙、心律失常、周身癥狀、心肌病等臨床癥狀可得到預防、治療或延緩。本發(fā)明提供了預防、治療或延緩急性或慢性病毒性心肌炎的方法。優(yōu)選，本發(fā)明提供了預防、治療或延緩急性病毒性心肌炎導致心律失常、心力衰竭、心源性休克的方法。本發(fā)明提供了預防、治療或延緩病毒性心肌炎導致心臟肥大，永久性心肌損害的方法。
本發(fā)明提供了預防、治療或延緩DCM的各種臨床癥狀的方法。例如，心室肥大、心肌泵功能障礙或充血性心力衰竭等臨床癥狀可得到預防、治療或延緩。
神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可單獨使用，可選擇神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸與其它藥劑、載體或賦形劑聯合使用。
神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可在哺乳動物體內直接使用，可選擇神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可在哺乳動物體外使用，如可針對細胞、組織、器官或在細胞、組織、器官使用神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸后轉染哺乳動物。
在一些實例方案中，可使用神經調節(jié)蛋白或其功能片段。在另一些實例方案中，可使用編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸。
神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可單獨使用，可選擇神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸與其它預防、治療病毒性心肌炎、擴張型心肌病的藥物聯合使用。神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可在其它預防、治療病毒性心肌炎、擴張型心肌病的藥物之前、同時、之后用。
任何合適的預防、治療病毒性心肌炎藥物可用于本方法中。如預防、治療病毒性心肌炎、藥物包括抗生素如青霉素、心肌保護劑如?；撬?、抗氧化劑如維生素C、維生素E、輔酶Q10以及營養(yǎng)心肌的藥物如能量合劑。
任何合適的預防、治療DCM藥物可用于本方法中。如預防、治療DCM的藥物強心劑如地戈辛、西地蘭，利尿劑(Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Basis of Therapeutics(9th Ed.)，McGraw-Hill(1996)pp683-713)，如碳酸酐酶抑制劑、袢利尿劑、排鉀利尿劑、保鉀利尿劑、噻嗪類鹽皮質激素受體的拮抗劑等治療外，ACEI、鈣離子拮抗劑如阿羅地平和β-受體阻滯劑如卡維地洛可用于本方法中。
C.預防、治療或延緩病毒性心肌炎、擴張性(充血性)心肌病的藥物有效成分、試劑盒和組合物。
一方面，本發(fā)明涉及預防、治療或延緩哺乳動物病毒性心肌炎、擴張性(充血性)心肌病的組合物，該組合物包括有效量的神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質。
在B小節(jié)中所述的任何合適的神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可用于本發(fā)明的藥物組合物中。在特定的實施方案中，神經調節(jié)蛋白通過與ErbB2-ErbB4受體結合，產生抗病毒性心肌炎、擴張型心肌病的作用。在另一特定的實施方案中，其中神經調節(jié)蛋白可以選自神經調節(jié)蛋白1、神經調節(jié)蛋白2、神經調節(jié)蛋白3或神經調節(jié)蛋白4。神經調節(jié)蛋白1包括heregulin，GGF2及p185erbB2的配體，參見.WO 00/64400、U.S.Patent Nos.5,530,109、5,716,930.神經調節(jié)蛋白α2或神經調節(jié)蛋白β2均可用于本方法。優(yōu)選，包含有SEQ ID4的氨基酸序列神經調節(jié)蛋白β2片段，用于本組合物中。
神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸可以任何合適的劑量。例如，神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸劑量可以從25μg到2500μg。
另一方面，本發(fā)明還提供一種試劑盒。該試劑盒包括置于容器中上述的藥物組合物及用于預防、治療或延緩病毒性心肌炎、擴張性(充血性)心肌病的該組合物使用說明書。
另一方面，本發(fā)明包括一種組合物，該組合物包括神經調節(jié)蛋白或其功能片段、或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質以及有效量的預防或治療病毒性心肌炎或DCM的藥物組成。
在B小節(jié)中所述的任何合適的神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可用于本發(fā)明的藥物組合物中。在特定的實施方案中，神經調節(jié)蛋白通過與ErbB2-ErbB4受體結合，產生抗病毒性心肌炎、擴張型心肌病的作用。在另一特定的實施方案中，其中神經調節(jié)蛋白可以選自神經調節(jié)蛋白1、神經調節(jié)蛋白2、神經調節(jié)蛋白3或神經調節(jié)蛋白4。神經調節(jié)蛋白1同義詞包括heregulin，GGF2及p185erbB2的配體，參見.WO 00/64400、U.S.PatentNos.5,530,109、5,716,930.神經調節(jié)蛋白α2或神經調節(jié)蛋白β2均可用于本方法。優(yōu)選，神經調節(jié)蛋白β2片段，包含有SEQ ID4的氨基酸序列用于本組合物中。
任何合適的預防、治療病毒性心肌炎藥物可用于本方法中。如預防、治療病毒性心肌炎、藥物包括抗生素如青霉素、心肌保護劑如牛磺酸、抗氧化劑如維生素C、維生素E、輔酶Q10等以及營養(yǎng)心肌的藥物如能量合劑。
任何合適的預防、治療DCM藥物可用于本方法中。如預防、治療DCM的藥物強心劑如地戈辛、西地蘭，利尿劑(Goodman和Gilman’sThe Pharmacological Basis of Therapeutics(9th Ed.)，McGraw-Hill(1996)pp683-713)，如碳酸酐酶抑制劑、袢利尿劑、排鉀利尿劑、保鉀利尿劑、噻嗪類、鹽皮質激素受體的拮抗劑，ACEI、鈣離子拮抗劑如阿羅地平和β-受體阻滯劑如卡維地洛可用于本方法中。
本發(fā)明提供了一種試劑盒，該試劑盒包括放置在容器的上述組合物和使用上述組合物預防、治療或延緩病毒性心肌炎、擴張性(充血性)心肌病說明書。
D.預防、治療或延緩心臟毒性的方法神經調節(jié)蛋白可以促進心肌細胞的分化，增強肌原纖維節(jié)和細胞骨架的組合與細胞間的粘合(WO00/37095)。神經調節(jié)蛋白可適用于探測，診斷與治療心臟病。在本發(fā)明提供的方法中，神經調節(jié)蛋白可用作為心肌保護劑預防、治療或延緩因治療或預防性藥物導致心臟毒性的方法。
本發(fā)明提供了一種預防、治療或延緩哺乳動物心臟毒性方法，該方法包括對需要或希望預防、治療或延緩的哺乳動物在體內施用有效量的預防、治療的藥物和有效量的(i)神經調節(jié)蛋白、或其功能片段；(ii)編碼該蛋白或功能片段的核酸；(iii)提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質，心臟毒性是使用預防或治療性藥物導致的。本發(fā)明的方法能用于任何哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔子、貓、狗、豬、奶牛、牛、綿羊、山羊、馬、猴子和其它非人的靈長類動物預防、治療或延緩哺乳動物心臟毒性。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于人類預防、治療或延緩哺乳動物的心臟毒性。
1.神經調節(jié)蛋白任何合適的神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可用于本發(fā)明的方法中。在一些的實施例中，本發(fā)明使用神經調節(jié)蛋白的片段是具有和受體結合部位如包括EGF結構域的人神經調節(jié)蛋白β2片斷，它能激活EGF受體家族的ErB受體，并調控多種生物反應(如刺激乳腺癌細胞分化和乳蛋白分泌；誘導神經脊細胞分化為Schwann細胞；刺激骨胳肌細胞內乙酰膽堿受體的合成；以及促進心肌細胞存活和DNA合成)。神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可以本領域技術人員已知的合適的方式產生，包括但不限于重組技術、化學合成或兩者結合產生。優(yōu)選，神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸通過重組技術產生(see e.g.，Watson et al.Molecular Biology of the Gene，4th Edition，page 224，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.，1987)。
替代保守氨基酸的神經調節(jié)蛋白，但對抗心臟毒性的作用不變的神經調節(jié)蛋白變異體可用于本發(fā)明的方法中。在本領域已是共識，在多肽的非功能區(qū)域的個別氨基酸的改變對其功能無影響(see，e.g.，Watson等.Molecular Biology of the Gene，4th Edition，1987，TheBejacmin/Cummings Pub.co.，p.224)。
編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸能以裸露DNA、復合DNA、cDNA、質粒DNA、RNA或其它混合物形式作為基因轉移系統的成分使用。在另一實施方案中，編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸包含于病毒載體中。任何適合于基因治療的病毒載體能聯合使用。例如，腺病毒載體(美國專利No.5,869,305)、猴病毒載體(美國專利No.5,962,274)、條件復制型人免疫缺陷型病毒載體(美國專利No.5,888,767)、反轉錄病毒、猿猴病毒-40、單純性皰疹病毒擴增子載體和牛痘病毒載體。而且，這些基因能轉入非病毒載體系統，例如脂質體，脂質在凝聚過程中保護DNA或其它生物物質不受氧化。
在實施方案中，神經調節(jié)蛋白通過與ErbB2-ErbB4受體結合，產生抗心臟毒性的作用。在另一特定的實施方案中，其中神經調節(jié)蛋白可以選自神經調節(jié)蛋白1、神經調節(jié)蛋白2、神經調節(jié)蛋白3或神經調節(jié)蛋白4。神經調節(jié)蛋白1包括heregulin，GGF2及p185erbB2的配體，參見WO 00/64400、U.S.Patent Nos.5,530,109、5,716,930.神經調節(jié)蛋白α2或神經調節(jié)蛋白β2均可用于本方法。優(yōu)選，包含有SEQ ID4的氨基酸序列神經調節(jié)蛋白β2片段，用于本方法中。
在其他的實例方案中，在下述專利、專利申請和GenBank中的神經調節(jié)蛋白或其功能片段可用于本方法中。如，美國專利6,252,051、6,121,415(NRG3)；6,087,323(神經調節(jié)蛋白與p185erbB2，p185erbB3或p185erbB4結合活性)；6,033,906(神經調節(jié)蛋白作為選自p185erbB2和p180erbB4受體的配體)；US2002002276(嵌合型ErbB異源多聚體作為神經調節(jié)蛋白競爭性拮抗劑或拮抗劑)；WO01/81540(NRG-4)；WO01/64877(NRG1)；WO01/64876(NRG1AG1)；WO01/58948(神經調節(jié)蛋白-β)；WO01/26607(SMDF和GGF神經調節(jié)蛋白拼接變異體)；WO00/70322(CRD-神經調節(jié)蛋白)；WO00/64400；WO99/18976；WO98/02540(嵌合型ErbB異源多聚體作為神經調節(jié)蛋白競爭性拮抗劑或拮抗劑)；WO96/30403；WO96/15812；BC017568(人，類似神經調節(jié)蛋白-4)；BC007675(人，神經調節(jié)蛋白-1)；AF142632(Xenopus laevis，富含半胱氨酸結構域的神經調節(jié)蛋白-1)；AF194439(Rattus norvegicus SMDF神經調節(jié)蛋白α2a(Nrg1))；AF194438(Rattusnorvegicus SMDF神經調節(jié)蛋白-β1a(Nrg1))；HS2NRG12(Homosapiens可選擇拼接神經調節(jié)蛋2(NRG2))；HS2NRG08(Homo sapiens可選擇拼接神經調節(jié)蛋2(NRG2))；HS2NRG07(Homo sapiens可選擇拼接神經調節(jié)蛋2(NRG2))；AF083067(Mus musculus神經調節(jié)蛋-4短同源體(Nrg4))；AF076618(Xenopus laevis神經調節(jié)蛋白α-1)；AF045656(Gallus gallus神經調節(jié)蛋白-β-2b)；AF045655(Gallus gallus神經調節(jié)蛋白-β-2a)；AF045654(Gallus gallu神經調節(jié)蛋白-β-1a)；MAU96612(Mesocricetus auratus神經調節(jié)蛋白)；AF010130(Mus musculus神經調節(jié)蛋白-3(NRG3)).公開的神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，用于本方法中。優(yōu)選地，GenBankAccession No.NT_007995(gi18570363)公開神經調節(jié)蛋白，用于本方法中。
2.預防或治療藥物本發(fā)明提供了預防、治療或延緩因藥源性導致的心臟毒性的方法。神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質可在使用預防、治療性藥物之前、同時或之后使用。本發(fā)明提供了預防、治療或延緩預防或治療藥物導致心臟毒性的方法。預防或治療藥物包括但不限于下列如抗精神病藥物、三環(huán)類抗抑郁病、干擾素、白細胞介素、抗感染藥物導致心臟毒性的方法。任何抗腫瘤藥物可用于本發(fā)明的方法中。優(yōu)選，抗腫瘤藥物具有下列通式的化合物 R1為甲氧基或氫，R2，R3和R4為羥基或氫。
蒽環(huán)類抗腫瘤藥包括但不限于下列如ADM、柔紅霉素、表阿霉素、去甲氧柔紅霉素、米托蒽醌、絲裂霉素、博萊霉素、環(huán)磷酰胺、氟脲嘧啶、放線菌素D、長春新堿及其衍生物(參見Goodman & Gilman’s，The Pharmacological Basis of Therapeutics，Ninth Edition，pp.1264-1269，McGraw-Hill 1996)。本發(fā)明方法中使用的另一些抗腫瘤藥包括包括在美國專利申請?zhí)?002/044919描述。抗腫瘤藥包括但不限于下列如胞啶、阿糖腺苷、柔紅霉素、氨甲蝶呤(MTX)，氟嘧啶如5-氟尿嘧啶(5-FU)，羥基脲、6-巰基嘌呤、植物堿如長春新堿(VCR)，VP-16和長春堿(VLB)，烷基化物、順珀、氮芥、三胺、甲基芐肼、博萊霉素、絲裂霉素C、放線菌素D或酶如L-天(門)冬酰胺酶(參見Goodman &Gilman’s，The Pharmacological Basis of Therapeutics，Ninth Edition，pp.1227-1229)。
任何抗精神病藥物可用于本發(fā)明。抗精神病藥物可以是但不限于氯丙嗪、奮乃靜、三氟拉嗪。其它抗精神病藥物可參見Goodman &Gilman’s，The Pharmacological Basis of Therapeutics，Ninth Edition，pp.400-420。
任何三環(huán)類抗抑郁病藥物可用于本發(fā)明。三環(huán)類抗抑郁病藥物可以是但不限于氯丙咪嗪，阿米替林，多慮平。其它三環(huán)類抗抑郁病藥物可參見Goodman & Gilman’s，The Pharmacological Basis ofTherapeutics，Ninth Edition，pp.431-434。
任何干擾素優(yōu)選干擾素-α可用于本發(fā)明。在一些實施例中，干擾素是人干擾素-α。生產干擾素-α的方法可參見美國專利號6,005,075；5,834,235；5,503,828；和4,820,638。
任何白細胞介素可用于本發(fā)明。優(yōu)選，如白細胞介素-2用于本發(fā)明。在一些實施例中，白細胞介素是白細胞介素-2。生產白細胞介素-2的方法可參見美國專利號5,834,441；5,795,777；5,419,899；and5,399,699。
任何抗感染藥物可用于本發(fā)明。優(yōu)選，抗感染藥物是吐根堿。其它抗感染藥物可參見Goodman & Gilman’s，The Pharmacological Basisof Therapeutics，Ninth Edition，pp.965-1008。
神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可在哺乳動物體內直接使用，可選擇神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可在哺乳動物體外使用，如可針對細胞、組織、器官或在細胞、組織、器官使用神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸后轉染哺乳動物。
E.治療心肌梗死一方面，本發(fā)明一種組合物，該組合物包括有效量的神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質以及有效量的預防或治療心肌梗死的藥物。優(yōu)選，該組合物還包括藥物學上可接受的載體或賦形劑。
任何適當的神經調節(jié)蛋白能用于本組合物。在特定的實施方案中，神經調節(jié)蛋白通過與ErbB2-ErbB4受體結合，產生抗心肌梗死的作用。在另一特定的實施方案中，神經調節(jié)蛋白可以選自神經調節(jié)蛋白1、神經調節(jié)蛋白2、神經調節(jié)蛋白3或神經調節(jié)蛋白4。優(yōu)選，神經調節(jié)蛋白α2或神經調節(jié)蛋白β2均可用于本組合物。在另一實施例中，包含有SEQ ID4的氨基酸序列的神經調節(jié)蛋白β2片段，用于本組合物。上述小節(jié)描述的神經調節(jié)蛋白可用于本組合物。
任何適當的預防、治療心肌梗死藥物能用于該組合物中。例如，預防、治療心肌梗死的藥物可以是ACEI、鈣離子拮抗劑、β阻滯劑、阿斯匹林、阿托品、硝化甘油、東莨菪堿及溶血栓藥。
可以用任何適當的ACEI，如卡托普利、雷米普利、福辛普利、賴諾普利、依那普利或喹那普利等?？梢杂萌魏芜m當的鈣離子拮抗劑如地爾硫。可以用任何適當β阻滯劑如阿替洛爾、美托洛爾、普萘洛爾或塞嗎洛爾等?？梢杂萌魏芜m當的溶血栓藥如鏈激酶、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、阿尼鏈菌酶。
另一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，該試劑盒包括置于容器中的所述的藥物組合物及其該組合物用于預防、治療和延緩心肌梗死使用說明。
另一方面，本發(fā)明提供了一種預防、治療或延緩哺乳動物心肌梗死方法，該方法包括對需要或希望預防、治療或延緩的哺乳動物尤其是人類施用有效量的神經調節(jié)蛋白、或其功能片段、或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質，從而預防、治療或延緩心肌梗死。
可以用任何適當的神經調節(jié)蛋白。例如，神經調節(jié)蛋白通過與ErbB2-ErbB4受體結合，產生抗心肌梗死的作用。在另一特定的實施方案中，其中神經調節(jié)蛋白可以選自神經調節(jié)蛋白1、神經調節(jié)蛋白2、神經調節(jié)蛋白3或神經調節(jié)蛋白4。優(yōu)選，神經調節(jié)蛋白α2或神經調節(jié)蛋白β2均可用于本方法。優(yōu)選，包含有SEQ ID4的氨基酸序列的神經調節(jié)蛋白β2片段用于本方法中。前述小節(jié)描述的神經調節(jié)蛋白可用于本方法。
在另一實施方案中，神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質可拮抗心肌梗死的左心室舒張期最大內徑(LVEDD)左心室收縮期最小內徑(LVESD)的增加。在另一特定的實施方案中，神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質可拮抗心肌梗死的心室射血分數(EF)降低。
本發(fā)明的方法能用于任何哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔子、貓、狗、豬、奶牛、牛、綿羊、山羊、馬、猴子和其它非人的靈長類動物預防、治療或延緩哺乳動物心肌梗死。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于人類預防、治療或延緩哺乳動物心肌梗死。
在本發(fā)明中，心肌梗死的臨床癥狀及并發(fā)癥可以得到預防、治療或延緩。例如，左心室擴張、收縮功能下降、充盈壓增加可以得到預防、治療或延緩。
神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質可單獨使用。優(yōu)選，神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質與藥學上可接受的載體或賦形劑使用。在另一實施方案中，使用神經調節(jié)蛋白或其功能片段。在另一實施方案中，使用編碼該蛋白或功能片段的核酸。任何給藥途徑可以使用，優(yōu)選以靜脈途徑給藥。
任何適當的可以預防、治療或延緩心肌梗死藥物能用于本發(fā)明的方法中。例如，預防、治療心肌梗死的藥物可以是ACEI、鈣離子拮抗劑、β阻滯劑、阿斯匹林、阿托品、硝化甘油、東莨菪堿及溶血栓藥。
可以用任何適當的ACEI，如卡托普利、雷米普利、福辛普利、賴諾普利、依那普利或喹那普利等。可以用任何適當的鈣離子拮抗劑如地爾硫?？梢杂萌魏芜m當β阻滯劑如阿替洛爾、美托洛爾、普萘洛爾或塞嗎洛爾等?？梢杂萌魏芜m當的溶血栓藥如鏈激酶、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、阿尼鏈菌酶。
在優(yōu)選的實施例中，神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質在體內使用。
F.安全劑量范圍一方面，本發(fā)明提供了一種預防、治療或延緩哺乳動物疾病的藥物組合物，該藥物組合物包括神經調節(jié)蛋白或其功能片段其a)安全劑量小于170U/kg，或b)有效療程總劑量小于3600U/kg。
本發(fā)明的藥物組合物可以合適的療程和(或)給藥方案。在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物的用藥時間小于21天。在另一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以連續(xù)或非連續(xù)。
本發(fā)明的藥物組合物可單獨使用。優(yōu)選，本發(fā)明的藥物組合物與藥學上可接受的載體或賦形劑使用。
可以用任何適當的藥物組合物。例如，神經調節(jié)蛋白通過與ErbB2-ErbB4受體結合，產生抗疾病的作用。在另一特定的實施方案中，其中本發(fā)明的藥物組合物可以選自神經調節(jié)蛋白1、神經調節(jié)蛋白2、神經調節(jié)蛋白3或神經調節(jié)蛋白4。優(yōu)選，神經調節(jié)蛋白α2或神經調節(jié)蛋白β2。在另一特定的實施方案中，包含有SEQ ID4的氨基酸序列的神經調節(jié)蛋白β2片段用于本發(fā)明的藥物組合物中。可用前述小節(jié)描述的神經調節(jié)蛋白。
本發(fā)明的方法能用于任何哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔子、貓、狗、豬、奶牛、牛、綿羊、山羊、馬、猴子和其它非人的靈長類動物預防、治療或延緩哺乳動物心肌梗死。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于人類預防、治療或延緩哺乳動物疾病。
本發(fā)明的藥物組合物可預防、治療或延緩哺乳動物疾病。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物可預防、治療或延緩心血管疾病如病毒性心肌炎、DCM、心臟毒性、心肌梗死等。
在一優(yōu)選方案中，本的藥物組合物以靜脈途徑給藥。
以下為典型的、快速、靈敏、高通量、定量測定NRG-1體外生物學活性的方法，采用利用神經調節(jié)蛋白與細胞表面ErbB3/ErbB4分子結合、間接介導ErbB2蛋白磷酸化的特性(參見Michael D.Sadick et al.Alalytical Biochemistry，1996，235，207-214)。根據實施例8.NRG-1體外活性測定方法，可以確定不同來源的神經調節(jié)蛋白的生物學活性大小。
通過酶聯免疫吸附試驗確定激酶受體活化。該方法包括兩獨立的96孔細胞培養(yǎng)板及Costar96孔酶標檢測板。其一進行細胞培養(yǎng)，配體激活、細胞裂解/受體溶液，另一進行受體破獲及磷酸化。本檢測以乳腺癌MCF-7細胞，分析heregulin誘導ErbB2活性。膜蛋白溶解在Triton-X 100細胞裂解液，受體用與ErbB3和ErbB4無交叉反應的抗ErbB2抗體包被在ELISA孔。ELISA抗磷酸化水平確定受體磷酸化。HER2/neu基因編碼一具有酪氨酸蛋白激酶活性的穿膜蛋白p185，常與ErbB3或ErbB4形成異源二聚體，通過ErbB3或ErbB4與相應配體(Neuregulin-1)的結合，激活HER2編碼的酪氨酸蛋白激酶，介導功能信號的傳遞。利用神經調節(jié)蛋白能與細胞表面ErbB3/ErbB4分子結合、間接介導ErbB2蛋白磷酸化的特性，建立快速、靈敏、高通量、定量測定重組人神經調節(jié)蛋白體外生物學活性的方法。
由于基因工程藥物多為蛋白質、多肽，其活性由產品的氨基酸序列或空間結構所形成的活性中心所決定。蛋白質、多肽的活性效價和其絕對質量不一致，所以不能按化學藥品用重量單位決定。而基因工程藥物生物學活性與藥效學基本一致，用特定的生物學活性建立特定的測定效價體系，定出其效價單位，因此，生物學活性測定是測量生物活性物質效價的過程，是基因工程產品質量控制的重要組成部分，也是保證產品藥效的重要手段。為了準確控制基因工程產品質量標準，保證臨床用藥，制定生物學活性標準至為重要。
本發(fā)明中能誘導50％最大反應的標準品的量在這里定義為一個活力單位(1U)，這樣，使不同批次的制品用統一的標準校正。
G.劑型、劑量以及給藥途徑神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸使用配方、劑量和給藥途徑，尤其作為藥物組合物時，可根據本技術領域所知的方法加以確定。可根據本技術領域普通技術人員所知的方法確定(參見Alfonso R.Gennaro，雷明頓藥劑學科學與實踐(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)，Mack出版社，1997年4月；Banga，治療用多肽和蛋白的配方、加工和傳遞系統(Therapeutic Peptides and ProteinsFormulation，Processing，andDelivery Systems)，1999；Hovgaard和Frkjr，肽和蛋白制藥配方的發(fā)展(Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins)，Taylor & Francis公司，2000；Lasic和Papahadjopoulos，脂質體的醫(yī)學應用(Medical Applications of Liposomes)，Elsevier Science，1998；Jain，基因治療教程(Textbook of Gene Therapy)，Hogrefe & Huber出版社，1998；Seth，腺病毒基因治療的基本生物學(AdenovirusesBasicBiology to Gene Therapy)，15卷，Landes Bioscience，1999；Wu-Pong和Rojanasakul，生物制藥的藥物設計和發(fā)展(Biopharmaceutical DrugDesign and Development)，Humana出版社，1999；治療學上的血管發(fā)生Dole等，從基礎科學到臨床(Therapeutic AngiogenesisFrom BasicScience to the Clinic)，28卷，Springer-Verlag New York，1999)。神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可配制成用于口服，直腸給藥，局部用藥，吸入用藥，口腔用藥(例如舌下)，注射用藥(例如，皮下、肌內、皮內、靜脈用藥)，經皮或其他適合的給藥途徑。在任何給定的情況下，最合適的給藥途徑取決于要治療性質和嚴重程度以及所用的特定神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸的性質。
神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，可單獨使用，選擇和優(yōu)選方式，神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸與藥物治療上可接受的載體或者賦形劑共同使用。任何合適的藥物治療可以接受的載體或者賦形劑能用于本方法中(參見，Alfonso R.Gennaro，雷明頓藥劑學科學與實踐(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)，Mack出版社，1997年4月)。
編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸能以裸露DNA、復合DNA、cDNA、質粒DNA、RNA或其它混合物形式作為基因轉移系統的成分使用。在另一實施方案中，編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸包含于病毒載體中。任何適合于基因治療的病毒載體能聯合使用。例如，腺病毒載體(美國專利No.5,869,305)、猴病毒載體(美國專利No.5,962,274)、條件復制型人免疫缺陷型病毒載體(美國專利No.5,888,767)、反轉錄病毒、猿猴病毒-40、單純性皰疹病毒擴增子載體和牛痘病毒載體。而且，這些基因能轉入非病毒載體系統，例如脂質體，脂質在凝聚過程中保護DNA或其它生物物質不受氧化。
根據本發(fā)明，神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，無論單獨或與其它藥劑、載體或賦形劑聯合使用可以任何給藥途徑，諸如海綿體內注射、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、皮內注射、口服或局部用藥。本方法可以單位劑量、一次用量針劑或備有防腐劑容器的多劑量使用。該配方可以采用懸濁液，溶液或油質或水質賦形劑的乳濁液形式，并且可包含懸浮劑、穩(wěn)定劑和(或)分散劑。例如，活性成分也可是粉狀，在使用前與適合的載體、無菌不含熱源的水或其他溶劑混合。本發(fā)明的局部用藥可以采用泡沫狀物、凝膠體、霜、藥膏、透皮藥膏或軟膏。
用于本發(fā)明的藥物學上可接受的組合物和方法包括但不限于美國專利Nos.5,736,154、6,197,801 B1、5,741,511、5,886,039、5,941,868、6,258,374 B1和5,686,102中。
用于治療、預防的藥物劑量大小將隨治療疾病的嚴重程度和給藥途徑變化。劑量和劑量頻率也將根據病人年齡、體重、狀況和反應相適應。
主治醫(yī)生應當知道怎樣和何時由于藥物毒性或副作用終止、中斷或將治療調整到低劑量。相反，醫(yī)生應當知道怎樣和何時由于臨床作用不足(排除毒性副效應)將治療調整到高水平。
任何適合的給藥途徑可以使用。劑型包括片劑、錠劑、扁囊劑、分散劑、懸濁液、溶液、膠囊、藥膏和類似形態(tài)(參考，雷明頓藥物治療科學)。
在實際應用時，神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可單獨使用或作為活性成分，根據傳統藥物混合技術形成緊密混合物與其它藥劑聯合使用，如β-環(huán)糊精和2-羥基-丙基-β-環(huán)糊精的藥物治療載體或賦形劑。載體根據可能的使用方式，局部或注射用藥，采取多種配制形式。在制備用于注射劑的組合物時，例如靜脈注射或靜脈輸液，制藥介質可使用水、乙二醇、油、緩沖液、糖、防腐劑、脂質體和其他本領域技術人員所知的介質。注射組合物的實例包括但不限于，5％w/v的葡萄糖、生理鹽溶液或其他溶液。無論單獨或是與其它藥劑聯合使用，待給藥的神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸的總劑量可以在瓶含有體積從1mL到2000mL的靜脈注射液中使用。根據所用總劑量，稀釋液體積有所變化。
本發(fā)明還提供了進行本發(fā)明治療方案的試劑盒。該試劑盒包括置于一個或多個容器中的單獨或與其它藥劑聯合使用的藥物學上可接受形式的有效量的神經調節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸。優(yōu)選的藥物形式是與無菌生理鹽水，葡萄糖溶液、緩沖液溶液或制藥上可以接受的其它無菌液聯合使用?？蛇x擇方式，該藥物組合物可用凍干或干燥方法產生；試劑盒可包括存于一個容器中的藥學上可接受的溶液、優(yōu)選無菌液，以形成復合物注射溶液。典型的藥學上可接受的溶液是生理鹽水和葡萄糖溶液。
在另一實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含用于注射組合物的無菌包裝的注射針或注射器和(或)包裝的酒精襯墊。適合于醫(yī)生或病人使用本組合物的指示性說明包含在試劑盒中。
H.實施例本發(fā)明的研究者發(fā)現重組人神經調節(jié)蛋白(rhNRG-1βS177-Q237)可以修復損傷的心肌細胞的結構，加強心肌細胞之間的連接，改善心肌功能，加強心肌生物學功能。以下研究揭示了發(fā)現重組人神經調節(jié)蛋白(rhNRG-1βS177-Q237)在體內可有效治療各種心血管疾病如病毒性心肌炎或DCM、藥源性心臟毒性、心肌梗死，同時不影響正常動物血液動力學。
實施例1.重組神經調節(jié)蛋白的制備圖1.人神經調節(jié)蛋白工程菌株的構建設計方案的技術路線。
人神經調節(jié)蛋白基因定位于染色體8P12，有13個外顯子結構。神經調節(jié)蛋白β2片段由61個氨基酸組成，理論分子量為7055D，SDS-PAGE電泳表觀分子量為6500-7000D，等電點在6.5左右，無糖基化位點，含三個二硫鍵，適合用大腸桿菌系統進行表達。
選用PET22b作為表達質粒，導入人神經調節(jié)蛋白基因后轉化大腸桿菌BL21，經過篩選得到高表達重組人神經調節(jié)蛋白的工程菌株。
圖2.神經調節(jié)蛋白基因的擴增。
從人5個月胚胎腦組織提取總RNA和mRNA，逆轉錄成cDNA，以此為模板，進行RT-PCR獲得目的基因。引物為P1，TCG AAC ATATGA GCC ATC TTG TAA AAT GTG CGG(SEQ ID NO1)and P2，TCGAAG GGC CCT CAC TGG TAC AGC TCC TCC(SEQ ID NO2)，取PCR擴增產物經1.5％瓊脂糖電泳，可見特異的183bp大小擴增片段，與設計片段長度相符。泳道1是擴增大小為183bp的目的片段，泳道2、3為DNAMarkers。
圖3.PET22b質粒物理圖譜圖4.重組人神經調節(jié)蛋白表達質粒的構建。
用氯化鈣沉淀法將人神經調節(jié)蛋白基因克隆至PET22b表達質粒中，構建成重組人神經調節(jié)蛋白表達質粒(PET22b-人神經調節(jié)蛋白)，此蛋白在T7啟動子的驅動下，高效表達。表達基因N端從NdeI位點插入，C端有終止子緊接在最后一個氨基酸處，所得蛋白不與任何氨基酸形成融合蛋白。經酶切切出約183bp的正確片段。轉化子經酶切鑒定后，提取雙鏈DNA進行核甘酸序列測定。結果證實，表達載體上的人神經調節(jié)蛋白序列完全正確。
神經調節(jié)蛋白cDNA的順序為AGC CAT CTT GTA AAA TGT GCG GAG AAG GAG AAA ACT TTCTGT GTG AAT GGA GGG GAG TGC TTC ATG GTG AAA GAC CTTTCA AAC CCC TCG AGA TAC TTG TGC AAG TGC CCA AAT GAGTTT ACT GGT GAT CGC TGC CAA AAC TAC GTA ATG GCC AGCTTC TAC AAG GCG GAG GAG CTG TAC CAG(SEQ ID NO3)根據上述cDNA順序編碼的氨基酸順序為SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ(SEQ ID NO4)圖5.高效表達工程菌鑒定。
取經PCR和酶切鑒定的工程菌克隆(BL21-PET22b-人神經調節(jié)蛋白)，隨機挑選一系列單菌落接種于2mlLB-Amp液體培養(yǎng)基，置37℃、250rpm培養(yǎng)過夜，然后按一定比例接種于20ml LB-Amp培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至OD600達1.0時加入IPTG誘導4h，收集菌體。破菌后收集包涵體，15％SDS-PAGE電泳、薄層掃描分析、Western-blotting鑒定，經反復篩選獲得一株穩(wěn)定高表達目的蛋白神經調節(jié)蛋白的工程菌(BL21-PET22b-人神經調節(jié)蛋白)。該菌株表達的目的蛋白占菌體總蛋白的10％左右。經高壓勻漿破菌后，目的蛋白以包涵體形式存在。工程菌在IPTG誘導4h后，菌體經SDS-PAGE電泳，包涵體占菌體總蛋白20％左右；純化后的重組神經調節(jié)蛋白比活性＞5×103EU/mg，表明神經調節(jié)蛋白工程菌株構建成功。在篩選工程菌時進行的SDS-PAGE、Western Blot、生物學活性測定的基礎上，進行人神經調節(jié)蛋白氨基酸組成分析、N-末端序列分析，表明所表達的重組人神經調節(jié)蛋白氨基酸序列與設計相符。
實施例2.重組人神經調節(jié)蛋白對冠狀動脈結扎所致大鼠心力衰竭的治療作用1摘要目的研究重組人神經調節(jié)蛋白(rhNRG-1βS177-Q237)對冠狀動脈結扎所致大鼠心力衰竭的治療作用。方法大鼠開胸，用醫(yī)用無損傷縫合線，在左心耳和肺動脈圓錐之間結扎冠狀動脈前降支，建立大鼠心臟亞急性心力衰竭模型。通常在結扎后6天左右，大鼠左心室射血分數下降50％左右時，將模型動物隨機分組，設置模型組、受試藥組和假手術組即只開胸，不結扎冠狀動脈組。每組10～13只，受試藥組設置3個劑量，分別為5、10、20μg/kg，尾靜脈注射，每天一次，連續(xù)10天。第6天給藥前進行心功能(超聲)檢測，用藥結束后再次進行心功能檢測，并解剖試驗動物，稱心重、測心室壁厚度，進行心臟病理學檢查以及血漿腎素-血管緊張素-醛固酮水平檢測等。結果較之模型組動物的射血分數(50.2±8.4％)和縮短分數值(22.4±4.6％)，重組人神經調節(jié)蛋白3個劑量，連續(xù)用藥5天，均能升高模型動物的射血分數(71.1±12.0％、64.4±12.9％、62.9±8.4％)和縮短分數(36.9±9.7％、32.0±9.5％、30.3±6.1％)，20μg/kg、10μg/kg與模型組比較，差異有顯著性(p＜0.01)，并且20μg/kg用藥組模型動物射血分數的改變可維持用藥后35天左右(p＜0.05)；20μg/kg重組人神經調節(jié)蛋白能明顯減小心肌缺血缺氧面積，增加纖維化病灶區(qū)毛細血管數(p＜0.05)；20μg/kg、10μg/kg重組人神經調節(jié)蛋白能降低模型動物外周血中血管緊張素I(AI)、血管緊張素II(AII)、腎素(PRA)、醛固酮(ALD)的水平，與模型組相比，差別有顯著性(p＜0.01，p＜0.05)；連續(xù)用藥10天，以上各參數與連續(xù)用藥5天相比，無明顯變化(p＞0.05)。結論一定劑量的重組人神經調節(jié)蛋白，連續(xù)靜脈注射5天，能有效治療冠狀動脈結扎所致大鼠的心力衰竭。
2試驗目的觀察重組人神經調節(jié)蛋白對冠狀動脈結扎所致大鼠心力衰竭的治療作用。
3受試藥物重組人神經調節(jié)蛋白，上海澤生科技開發(fā)有限公司研制，批號200110006-2；濃度500μg/支；效價測定5000u/支；純度＞95％(HPLC-C8)。
4實驗動物4.1品系、來源、合格證號SD大鼠，由中國科學院上海實驗動物中心提供，合格證號中科院動管會003號；4.2體重、性別200～220g，雄性。
5試劑、儀器5.1心臟超聲心動檢測儀，Hewlett Packard sonos 5500，探頭型號S12；5.2六導電生理記錄儀，SMUP-C-6型，上海醫(yī)科大學生理教研室研制；5.3精密電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；5.4動靜脈留置針，20G，中美合資溫州華利醫(yī)療器械有限公司生產；5.5微型游標卡尺，哈爾濱量具刃具廠；
5.6γ放射免疫計數器，GC-1200，中國科學技術大學科技實業(yè)總公司，中佳光電儀器分公司；5.7腎素、血管緊張素檢測試劑盒，AI北京北方生物技術研究所，批號0210；AII北京北方生物技術研究所，批號0208；ALD北京北方生物技術研究所，批號0208；5.8脫毛劑，8％硫化鈉，廣東西隴化工廠，批號010622；5.9鹽酸氯胺酮注射液，上海中西藥業(yè)股份有限公司，批號20010401。
6實驗方法6.1實驗組別實驗設置假手術組、模型組、受試藥組。
假手術組(n＝10)，即開胸，但不結扎冠脈；模型組(陰性對照組)(n＝12)即注射制劑配方賦形劑(10mM PB，0.2％人血清白蛋白，5％甘露醇)；受試藥組(n＝13)重組人神經調節(jié)蛋白組，3個劑量，每個劑量分設2組，一組作為用藥后長期觀察。
6.2受試藥物劑量設置及藥物配制、給藥途徑、給藥次數、給藥濃度和容積參考受試藥預實驗結果，設置高、中、低三個劑量組，分別為20μg/kg、10μg/kg、5μg/kg。用制劑配方緩沖液(10mMPB，0.2％人血白蛋白，5％甘露醇)稀釋受試藥物至所需濃度；受試藥組和模型組給藥途徑均為大鼠尾靜脈注射，每天一次(qd)，連續(xù)給藥5天。第6天給藥前行心功能(超聲)檢測后，再連續(xù)給藥5天。每次給藥容積為0.4ml/100g體重。
6.3試驗方法6.3.1大鼠冠狀動脈前降支結扎致心力衰竭動物模型的建立大鼠腹腔注射氯胺酮100mg/kg麻醉后，仰臥固定于鼠板，頸部及胸部去毛后用新潔爾滅消毒。頸部做正中切口，鈍性分離頸前肌肉找到氣管，用18G動靜脈留置針于第3-5氣管軟骨間穿入氣管后，退出針芯，將塑料套管推入氣管內1-2cm，固定后以備接小動物呼吸機(潮氣量約20ml，頻率80次/分鐘)。胸部左前皮膚切開后，鈍性分離胸部肌肉，暴露第4、5肋骨，用彎頭紋式止血鉗從肋間穿透胸壁，分離肋骨下組織后剪斷第4肋，接通開啟呼吸機，暴露心臟，觀察肺充氣及心跳情況，撕開心包，將上部脂肪墊上翻，充分暴露左心耳和肺動脈圓錐，于二者之間用6/0醫(yī)用無損傷縫合線結扎左冠狀動脈前降支，可看到結扎后病毒性心肌炎、擴張型心肌病區(qū)(約8mm×8mm)局部呈現紫色，膨突，活動明顯減弱，然后縫合胸壁，堵住呼吸機回氣口使肺充盈后，用力擠壓胸部以排氣，再縫合胸部肌肉和皮膚。觀察呼吸情況，看到有自主呼吸后去除呼吸機，放回籠內飼養(yǎng)。假手術組開胸后撕開心包，不結扎冠狀動脈。
術后6天左右，對手術大鼠進行心超檢測，選用EF值下降到50％左右的大鼠，按EF值重新隨機分組，使每組EF值均為50％左右，開始給藥。
6.3.2藥效試驗將EF值為50％左右的模型動物隨機分組，分別為模型組(陰性對照組)，3個劑量的受試藥組，每組12～13只。受試藥組和模型組給藥途徑均為尾靜脈注射，每天一次(qd)，連續(xù)給藥5天。第6天給藥前行心臟超聲檢測后，再連續(xù)給藥5天。每次給藥容積為0.4ml/100g體重。
用藥結束后再次進行心超檢測，并解剖試驗動物，稱心重，測心室壁厚度，進行心臟病理檢查，收集外周血，分離血漿，進行腎素-血管緊張素-醛固酮含量測定。
另留存不同組別的受試動物，進行長期觀測。
6.3.3觀測指標6.3.3.1心功能檢測分別于大鼠結扎后用藥前、用藥第6天、11天(共3次)，氯胺酮麻醉狀態(tài)下，進行心臟超聲心動圖檢測，主要指標包括
EF心室射血分數，反應心室射血功能；FS心室短軸縮短率，反應心室收縮功能；LVDd左心室舒張期最大內徑(cm)；LVDs左心室收縮期最小內徑(cm)。
6.3.3.2血漿腎素-血管緊張素-醛固酮含量檢測委托復旦大學附屬中山醫(yī)院同位素室進行。
大鼠頸動脈放血，按試劑盒要求留取血漿，-20℃凍存。用放免法檢測腎素活性(PRA)、血管緊張素I(AI)、血管緊張素II(AII)、醛固酮(ALD)含量。
6.3.3.3心肌病理組織切片委托上海市疑難病理會診中心王炳森教授進行。
大鼠心臟經10％福爾馬林液固定后，沿心臟長軸3等分切取心肌，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，對各組動物心臟纖維化區(qū)域面積進行圖像分析，并計數纖維化病灶內毛細血管數(計量單位個/mm2)；Nagar-oslen染色，觀察各組心肌缺血缺氧區(qū)域大小。
7數據處理所得實驗數據進行t檢驗。
8實驗結果8.1重組人神經調節(jié)蛋白對大鼠缺血心臟功能的影響用藥5天進行心超檢測的結果顯示，模型組EF值(50.2±8.4％)和FS值(22.4±4.6％)明顯低于假手術組EF(91.1±2.4％)和FS(57.3±3.9％)，兩者比較具有顯著性差異(P＜0.01)。用藥組(20、10、5μg/kg)的EF值(71.1±12.0％、64.3±12.8％、62.9±8.4％)及FS值(36.9±9.7％、32.0±9.5％、30.3±6.1％)均明顯回升，與模型組比較具有顯著性差異(P＜0.01)。
用藥10天后再次心超檢測的結果顯示，模型組EF值(42.7±6.4％)和FS值(18.3±3.2％)仍明顯低于假手術組EF(95.0±2.8％)和FS(65.3±6.8％)，具有顯著性差異(P＜0.01)。而用藥組(20、10、5μg/kg)EF值(75.7±10.8％、61.4±15.0％、59.2±12.4％)和FS值(41.3±11.0％、30.3±10.4％、28.4±8.6％、)仍保持較高水平，與模型組比較具有顯著性差異(P＜0.01)，但與用藥5天相比無顯著性差異(p＞0.05)。兩次實驗結果詳見表1～6。
用藥5天，停藥后35天觀察模型動物和受試藥組大鼠心臟EF值變化，結果顯示，20μg/kg的重組人神經調節(jié)蛋白用藥組大鼠心臟EF值持續(xù)穩(wěn)定在較高水平，與模型組比較，差別有顯著性(p＜0.05)(表7)。
表1大鼠冠狀動脈前降支結扎致心力衰竭模型動物用藥前心功能測量參數
與模型組相比，*p＜0.05，**p＜0.01表2大鼠冠狀動脈前降支結扎致心力衰竭模型動物用藥5天后心功能測量參數
與模型組相比，*p＜0.05，**p＜0.01表3大鼠冠狀動脈前降支結扎致心力衰竭模型動物用藥10天后心功能測量參數
與模型組相比，*p＜0.05，**p＜0.01表4大鼠冠狀動脈前降支結扎致心力衰竭模型動物用藥前心功能測量參數
與模型組相比，*p＜0.05，**p＜0.01表5.大鼠冠狀動脈前降支結扎致心力衰竭模型動物用藥5天后心功能測量參數
與模型組相比，*p＜0.05，**p＜0.01表6大鼠冠狀動脈前降支結扎致心力衰竭模型動物用藥10天后心功能測量參數
與模型組相比，*p＜0.05，**p＜0.01表7模型動物用藥5天，停藥35天后的心功能EF值變化
*與模型組比較，p＜0.05；**與模型組比較，p＜0.018.2重組人神經調節(jié)蛋白對模型大鼠心肌病理組織學的影響8.2.1重組人神經調節(jié)蛋白對模型大鼠缺血心肌缺血缺氧程度的影響Nagar-oslen染色，正常心肌著色淺，呈黃色，缺血缺氧區(qū)域著色深，呈紅色。用該方法可以分析心肌缺血缺氧的變化并進行定性或半定量比較。
各試驗組動物病理組織學改變詳見圖1～10。模型組心肌組織著色深，大片心肌染成紅色，而假手術組呈均一的黃色，沒有紅染區(qū)；重組人神經調節(jié)蛋白20μg/kg組，紅染心肌細胞僅呈點狀分布；10μg/kg、5μg/kg組，紅染組織呈片狀分布，表明重組人神經調節(jié)蛋白能減輕心肌缺血、缺氧程度。
8.2.2重組人神經調節(jié)蛋白對模型大鼠缺血心肌纖維化區(qū)域毛細血管再生的影響應用Leica圖像分析系統檢測各實驗組心肌組織毛細血管數量的變化。結果發(fā)現，重組人神經調節(jié)蛋白用藥組模型動物的心肌纖維化病灶區(qū)毛細血管數增加，20μg/kg組與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)，10μg/kg、5μg/kg組與模型組無統計學差異。表明高劑量(20μg/kg)的重組人神經調節(jié)蛋白能促進冠脈結扎后大鼠心肌纖維化病灶區(qū)毛細血管增生(詳見表8，圖11，12)。
表8重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物心肌纖維化區(qū)域毛細血管再生的影響
**與模型組相比，P＜0.018.3重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物血漿腎素-血管緊張素-醛固酮水平的影響用放射免疫法測定不同試驗組動物血漿腎素(PRA)、血管緊張素I(AI)、血管緊張素II(AII)、醛固酮(ALD)水平。結果顯示模型組PRA、AI、AII、ALD分別為3.506±1.78ng/ml.h、10.655±1.18ng/ml、1366.38±577.33pg/ml、1.738±0.34ng/ml，與假手術組(分別為1.315±0.96ng/ml.h、8.125±1.57ng/ml、564.37±273.56pg/ml、1.113±0.45ng/ml)相比，含量顯著升高，差別具有顯著性(P＜0.05)。
重組人神經調節(jié)蛋白20、10μg/kg組模型動物血漿AI(7.40±12.15、7.65±1.40ng/ml)、AII(641.47±283.86、468.58±165.10pg/ml)水平顯著降低，與模型組比較，差別有顯著性(P＜0.01)；PRA(1.337±1.09、1.075±1.50ng/ml.h)、ALD(1.02±0.27、1.26±0.38ng/ml)水平亦顯著下降，與模型組比較差異具有顯著性(P＜0.05)。但與假手術組相比，無統計學意義(P＞0.05)。表明一定劑量的重組人神經調節(jié)蛋白(20、10μg/kg)能降低冠狀動脈結扎大鼠血液中PRA、AI、AII、ALD含量(詳見表9)。
表9不同實驗組模型動物血漿腎素(PRA)、血管緊張素I(AI)、血管緊張素II(AII)、醛固酮(ALD)水平
與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.019結論較之模型對照動物的射血分數(50.2±8.4％)和縮短分數值(22.4±4.6％)，重組人神經調節(jié)蛋白3個劑量，連續(xù)用藥5天，均能升高模型動物的射血分數(71.1±12.0％、64.4±12.9％、62.9±8.4％)和縮短分數(36.9±9.7％、32.0±9.5％、30.3±6.1％)，20μg/kg、10μg/kg與模型組比較，差異有顯著性(p＜0.01)，并且20μg/kg用藥組模型動物射血分數的改變可維持用藥后35天左右(p＜0.05)；20μg/kg重組人神經調節(jié)蛋白能明顯減小心肌缺血缺氧面積，增加纖維化病灶區(qū)毛細血管數(p＜0.05)；20μg/kg、10μg/kg重組人神經調節(jié)蛋白能降低模型動物外周血中血管緊張素I(AI)、血管緊張素II(AII)、腎素(PRA)、醛固酮(ALD)的水平，與模型組相比，差別有顯著性(p＜0.01，p＜0.05)。連續(xù)用藥10天，以上各參數與連續(xù)用藥5天相比，無明顯變化(p＞0.05)。試驗結果表明，一定劑量的重組人神經調節(jié)蛋白，連續(xù)靜脈注射5天，能有效治療冠狀動脈結扎所致的大鼠心力衰竭。
實施例3.重組人神經調節(jié)蛋白對阿霉素致SD大鼠心力衰竭的治療作用1摘要目的觀察重組人神經調節(jié)蛋白對阿霉素致大鼠中毒性心肌炎的治療作用。方法選用SD大鼠，3.3mg/kg阿霉素尾靜脈注射，每周一次，連續(xù)4次，建立阿霉素致SD大鼠中毒性心肌炎模型。受試藥重組人神經調節(jié)蛋白設置3個劑量組，分別為10、20、40μg/kg，靜脈注射，每天一次(qd)，連續(xù)10天。試驗期間觀測模型動物的存活率；試驗結束時，監(jiān)測模型動物的血流動力學指標，測心重/體重比，心肌組織進行病理學檢查并進行血清肌鈣蛋白T(cTnT)水平測定。結果較之模型組15％的動物存活率，40、20、10μg/kg3個劑量的重組人神經調節(jié)蛋白均顯著提高模型動物的存活率，分別達到85％，90％和60％；高、中、低3個劑量受試藥模型動物的dp/dt、-dp/dt、LVPmax值明顯提高，dp/dt分別為5954±689，6107±418，4875±636，-dp/dt分別為-4794±954，-4323±457，-3672±884，LVPmax分別為165.7±22.7，156.1±17.7，145±15.2，與模型組相比，差異均具有顯著性(p＜0.001)，而且40，20μg/kg用藥組dp/dt、-dp/dt、LVPmax值與10μg/kg組相比，差別亦有顯著性(p＜0.05)，并表現出一定的劑量效應依賴性；40、20、10μg/kg 3個劑量的重組人神經調節(jié)蛋白均能有效減輕模型動物心肌損傷程度，降低血清中肌鈣蛋白T(cTnT)含量，分別為0.025±0.011，0.031±0.006，0.074±0.024，與模型組0.205±0.072相比，差別有顯著性(p＜0.01)。結論重組人神經調節(jié)蛋白能有效治療阿霉素致大鼠的中毒性心肌損害。
2試驗目的觀察重組人神經調節(jié)蛋白對阿霉素致大鼠中毒性心肌炎的治療作用。
3受試藥物重組人神經調節(jié)蛋白，上海澤生科技開發(fā)有限公司提供。批號200110006-2，規(guī)格500μg/支。效價測定5000u/支；純度＞95％(HPLC-C8)。
4實驗動物SD大鼠復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證號為醫(yī)動字第02-22-11。體重為250±30g，雄性。動物隨機分組，每組20只，分籠飼養(yǎng)。動物室溫度18～22℃，相對濕度50～70％。
5試劑、儀器六導生理記錄儀(復旦大學醫(yī)學院生理教研室研制，型號SMUP-C-6)換能器(日本光電工業(yè)株式會社，NIHON KOHDEN，型號TP-400T)電化學發(fā)光全自動免疫分析儀(2010型)羅氏診斷有限公司，批號158468)電子精密天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，Max610gd＝0.01g)微型四用游標卡尺(0-70mm)(哈爾濱量具刃具廠，0.05mm)動靜脈留置針(中美合資溫州華麗醫(yī)療器械有限公司)血清肌鈣蛋白檢測試劑盒(Behring Dignostic Inc.)6實驗方法6.1實驗組別實驗設正常對照組，模型組及受試藥組。
模型組(陰性對照組)阿霉素，汕頭經濟特區(qū)明治醫(yī)藥有限公司生產(批號000201，有效期2003.2)。
受試藥組重組人神經調節(jié)蛋白組。
6.2受試藥物劑量設置及藥物配制、給藥途徑、給藥次數、給藥濃度和容積受試藥設3個劑量組，分別為10、20、40μg/kg劑量組。用1ml注射用水溶解后，再用賦形劑調整到所需濃度。賦形劑主成分5％注射用甘露醇，0.2％注射人血白蛋白，10mM磷酸鹽緩沖液，由上海澤生科技開發(fā)有限公司提供。試驗用藥臨用前配制。
第一次注射阿霉素24h內，尾靜脈注射重組人神經調節(jié)蛋白，qd×10。根據體重調整劑量，給藥容積0.2ml/100g。
6.3試驗方法
6.3.1動物心衰模型制作方法參照《新藥臨床前研究指導原則》，3.3mg/kg阿霉素尾靜脈注射，每周一次，連續(xù)注射4次，建立阿霉素致大鼠中毒性心肌炎模型。
6.3.2藥效試驗第一次注射阿霉素24h內，尾靜脈注射重組人神經調節(jié)蛋白，qd×10。試驗期間，動態(tài)檢測動物的存活率，至第五周，監(jiān)測心功能指標(左室內壓最大上升速率，dt/dpmax，左室內壓最大下降速率，-dp/dt，左室收縮末壓LVPmax，左室舒張末壓LVPmin)。取心臟組織，切片觀察心肌組織的病理變化。
6.3.3觀察指標6.3.3.1存活率每周記錄動物的存活情況，并計算各實驗組存活率。存活率(％)＝存活動物數/實驗動物數×100％。
6.3.3.2心重/體重比，心臟組織病理切片開胸剪取心臟(注意保留心房)，吸紙吸干后稱重，計算心重/體重比；在心臟垂直位1/2處測量外周直徑；將左心室中部橫向切開，測量左室游離壁的最大厚度；用10％福爾馬林固定心臟，常規(guī)石蠟包埋切片后HE染色，光鏡下觀察心肌組織結構，給出病理評分。
病理評分標準0級正常心肌結構，心肌細胞無萎縮與肥大，無空泡，橫紋清晰；心肌排列整齊；心內、外膜均無異常；血管和間質無變化。
1級散在的單個心肌細胞表現為局部肌漿溶解和空泡，而鄰近的心肌細胞仍正常。
2級小至中等范圍的成簇心肌細胞表現有萎縮、肌漿溶解和空泡，可見小灶性心肌細胞壞死。
3級大范圍彌漫性心肌細胞萎縮、肌漿溶解或空泡，有較明顯的壞死。
根據情況，可在1至2級，2至3級之間評分，如1.5、2.5等。
6.3.3.3血流動力學指標測定動物麻醉狀態(tài)下，用六導生理記錄儀記錄頸動脈壓、室內壓、dp/dt等血流動力學指標。主要步驟分離右側頸總動脈，結扎其遠心端，用動脈夾阻斷其近心端，在兩端之間用20G動靜脈留置針穿入頸總動脈，取出金屬針芯，放掉動脈夾，將留置針塑料套管向心推入適當深度，留置10分鐘，觀察生理記錄儀顯示的波形，待穩(wěn)定后記錄頸動脈壓，再將套管進一步插入左心室，留置15分鐘，待其穩(wěn)定后記錄dp/dt，-dp/dt，LVPmax，LVPmin等數值。
6.3.3.4血清肌鈣蛋白T(cTnT)水平檢測采集動脈血2ml，收取血清，-20℃凍存。委托中山醫(yī)院檢驗科用電化學發(fā)光法檢測血清cTnT含量。
7數據處理數據資料以X±SD表示。組間差異用單因素方差分析。
8試驗結果8.1阿霉素可誘導大鼠發(fā)生中毒性心肌炎并心力衰竭見表10，圖13。阿霉素3.3mg/kg，每周一次，連續(xù)4次靜脈給藥，五周后，SD動物存活率為15％，存活大鼠心功能明顯受損，其dp/dt、-dp/dt、LVPmax、LVPmin分別為正常的43％，47％，58％，37％，心肌組織病理評分為2.33±0.26，相對病變率為100％，血清cTnT值明顯升高，達0.2ng/ml。表明成功建立了阿霉素致大鼠中毒性心肌炎并致心力衰竭模型。
表10阿霉素誘導SD大鼠中毒性心肌炎模型各項檢測指標
n＝20，X±SD，與正常組比較，方差分析，*P＜0.05**P＜0.0018.2重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物存活率的影響結果表明，隨著實驗時間的延長，重組人神經調節(jié)蛋白3個劑量，都明顯降低模型動物的死亡率，20μg/kg劑量組模型動物存活率高達90％(p＜0.01)(圖14)。
8.3重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物心功能的影響用藥后，各受試藥組動物的dp/dt、LVPmax均有升高。用SPSS軟件，經單因素方差分析，組間比較，受試藥組(40、20、10μg/kg)動物的dp/dt、-dp/dt明顯高于模型組(P＜0.001)，與對照組比較差別無顯著性(P＞0.05)。40、20μg/kg受試組明顯高于10μg/kg組(P＜0.01)；受試藥組(40、20、10μg/kg)動物的LVPmax也明顯高于模型組(P＜0.001)，而且各用藥組之間的差異亦有顯著性(P＜0.05)。表明重組人神經調節(jié)蛋白能有效改善模型動物的心功能且具有劑量效應關系。二次試驗結果一致，詳見表11，12。
表11重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物心功能參數的影響(I)
與模型組相比，*p＜0.05；**p＜0.001表12重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物心功能參數的影響(II)
與模型組相比，*p＜0.05；**p＜0.0018.4重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物心肌組織結構的影響重組人神經調節(jié)蛋白明顯降低模型動物心肌細胞損害程度，病理評分明顯降低，與模型組相比，差別有顯著性(p＜0.01，p＜0.05)。二次實驗結果詳見表13，14，圖15。
表13重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物心肌組織病理變化的影響
與模型組相比，*p＜0.05；**p＜0.0114重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物心肌組織病理變化的影響
與模型組相比，*p＜0.05；**p＜0.018.5重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物血清cTnT的影響用藥后，各組動物血清中cTnT含量明顯降低，高、中、低受試藥組動物血清中cTnT明顯低于模型組(P＜0.001)。二次試驗結果一致，見表15，16。
表15重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物血清cTnT的影響(I)
與模型組相比，**p＜0.001表16重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物血清cTnT的影響(II)
與模型組相比，**p＜0.0018.6重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物心臟大小的影響試驗結果詳見表17，18。受試藥組模型動物心臟的物理參數沒有明顯改變，各組間均無統計學差異(P＞0.05)。
表17重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物心臟大小的影響(I)
與模型組相比，**p＜0.01表18重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物心臟大小的影響(II)
與模型組相比，**p＜0.019結論較之模型組15％的動物存活率，40、20、10μg/kg3個劑量的重組人神經調節(jié)蛋白均顯著提高模型動物的存活率，分別達到85％，90％和60％；高、中、低3個劑量受試藥模型動物的dp/dt、-dp/dt、LVPmax值明顯提高，dp/dt分別為5954±689，6107±418，4875±636，-dp/dt分別為-4794±954，-4323±457，-3672±884，LVPmax分別為165.7±22.7，156.1±17.7，145±15.2，與模型組相比，差異均具有顯著性(p＜0.001)，而且40，20μg/kg用藥組dp/dt、-dp/dt、LVPmax值與10μg/kgd組相比，差別亦有顯著性(p＜0.05)，表現為一定的劑量效應依賴性；40、20、10μg/kg 3的重組人神經調節(jié)蛋白均能有效減輕模型動物心肌損傷程度，降低血清中肌鈣蛋白(cTnT)含量，分別為0.025±0.011，0.031±0.006，0.074±0.024，與模型組0.205±0.072相比，差別有顯著性(p＜0.01)。
試驗結果表明重組人神經調節(jié)蛋白通過改善受損的心肌組織，減少cTnT的血清釋放及心肌纖維的壞死，增強心臟收縮功能，減少動物死亡率，有效治療阿霉素所致大鼠的中毒性心肌損傷。
實施例4.重組人神經調節(jié)蛋白對病毒感染致小鼠急性心肌損傷的治療作用本實驗旨在研究重組人神經調節(jié)蛋白(rhNRG-1βS1Q237)對病毒感染致小鼠急性心肌損傷的治療作用。實驗包括二部分。第一部分旨在觀測重組人神經調節(jié)蛋白對病毒性心肌炎小鼠模型動物存活率、心臟功能和心肌組織病理變化、血清肌鈣蛋白(CTnI)水平等影響，確定最佳有效劑量；第二部分為重組人神經調節(jié)蛋白不同用藥時間對上述指標的具體影響，旨在確定最佳用藥時間。結果表明，重組人神經調節(jié)蛋白30μg/kg，連續(xù)靜脈注射5天，可減輕心臟組織的病理變化，降低血清中cTnI的濃度，改善心臟功能，提高模型動物的存活率，有效治療病毒感染所致小鼠的急性心肌損傷。
重組人神經調節(jié)蛋白對病毒感染致小鼠急性心肌損傷的治療作用
1摘要目的觀察重組人神經調節(jié)蛋白對病毒(Coxsackie B3)感染致小鼠急性心肌損傷的治療作用。方法小鼠腹腔注射柯薩奇B3病毒(CVB3)建立病毒感染致急性小鼠急性心肌炎模型。模型動物隨機分組，設置正常對照、模型組、受試藥組。每組20只。重組人神經調節(jié)蛋白設置3個濃度，分別為30、15、7.5μg/kg，同一天開始尾靜脈注射，連續(xù)5天。試驗期間，觀察模型動物存活率。第七天進行心功能(心超)檢測，第八天處死小鼠，取血清進行肌鈣蛋白I(cTnI)水平檢測，心臟病理組織學檢查等。結果重組人神經調節(jié)蛋白30μg/kg，15μg/kg組EF值(90.2±2.5％，86.0±2.9％)，FS值(55.7±2.1％，50.7±4.3％)均明顯升高，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)，LVDd值(0.187±0.006，0.189±0.008)和LVDs值(0.085±0.009，0.099±0.027)均顯著低于模型組(0.208±0.015，0.142±0.020)，P＜0.05；重組人神經調節(jié)蛋白能減輕模型動物心肌病理損害程度，有效降低模型動物血清中肌鈣蛋白(cTnI)水平，30μg/kg劑量組(7.98±6.07ng/ml)、15μg/kg劑量組cTnI(19.43±10.76ng/ml)明顯低于模型組(44.44±12.39ng/ml)，兩者相比，差別有顯著性(P＜0.001，P＜0.05)；與模型組動物50％的存活率相比，重組人神經調節(jié)蛋白30μg/kg組可顯著提高模型動物的存活率，達80％，p＜0.05。結論一定劑量的重組人神經調節(jié)蛋白，能有效治療病毒感染致小鼠的急性心肌損傷。
2試驗目的觀察重組人神經調節(jié)蛋白對病毒感染致小鼠急性心肌損傷的治療作用，確定最佳有效劑量。
3受試藥物重組人神經調節(jié)蛋白，上海澤生科技開發(fā)有限公司研制，批號200110006-2；濃度500μg/支；效價5000u；純度＞95％(HPLC-C8)。
4實驗動物4.1品系、來源、合格證號4周齡純種BALB/C小鼠，由復旦大學實驗動物部提供，合格證號醫(yī)動字第22-9號。
4.2體重、性別10～12g，雄性。
4.3每組動物數實驗組每組20只，正常對照組為10只。
5病毒柯薩奇B3病毒(Coxsackie Virus B3，CVB3)，Nancy株，由衛(wèi)生部病毒性心臟病重點實驗室(上海市心血管研究所)提供。
6材料、儀器6.1心臟超聲檢測儀，Hewlett Packard sonos 5500；探頭型號S12；6.2Immuno-Assay System Opus Plus，購自Behring Diagnostic Inc.用于檢測血清中心肌鈣蛋白I(cTnI)，批號CTE8；6.3精密電子天平，KERN 822；6.4注射用水，湛江安度斯生物有限公司，10×5ml，批號0112180；6.5脫毛劑，8％硫化鈉，廣東西隴化工廠，批號010622。
7實驗方法7.1實驗組別實驗設置正常小鼠對照組、模型組、受試藥組、空白對照組。正常小鼠對照組(n＝10)；模型組即陰性對照組(n＝20)給予制劑配方緩沖液(10mM PB，0.2％人血白蛋白，5％甘露醇)；受試藥組(n＝20)重組人神經調節(jié)蛋白高、中、低3個劑量組；空白對照組(n＝20)小鼠腹腔接種無CVB3的凍融細胞上清液，0.2ml/只；7.2受試藥物劑量設置及藥物配制、給藥途徑、給藥次數、給藥濃度和容積參考預實驗結果，重組人神經調節(jié)蛋白設置高、中、低三個劑量組，分別為30μg/kg、15μg/kg、7.5μg/kg。用制劑配方緩沖液(10mMPB，0.2％人血白蛋白，5％甘露醇)稀釋受試藥物至所需濃度；受試藥組和模型組給藥均為小鼠尾靜脈注射，每天一次(qd)，連續(xù)給藥5天。每次給藥容積為0.2ml/只。
7.3試驗方法7.3.1小鼠急性病毒性心肌炎動物模型的建立由復旦大學附屬中山醫(yī)院提供100xTCID50的CVB3病毒，腹腔注射0.2ml/只，造成心肌炎模型。小鼠將于隨后的一周內逐步出現豎毛、脫毛、消瘦、呆滯、死亡等表現，到第8天時死亡將近一半。
7.3.2藥效試驗于小鼠腹腔感染病毒當天開始尾靜脈給藥，連續(xù)5天。試驗期間，觀察動物的存活率，試驗結束后，進行心臟超聲，心肌病理組織學檢查，血清肌鈣蛋白檢測。
7.3.3觀測指標7.3.3.1小鼠心功能檢測于注射病毒后第7天，將小鼠胸部脫毛，用優(yōu)力舒膠帶固定小鼠于特制的固定架上，用S12高頻探頭進行心臟超聲心動圖檢測，主要指標包括EF左室射血分數，反應左心室射血功能的主要指標；FS左室縮短分數，反應左心室收縮功能的指標；LVDd左心室舒張期最大內徑(cm)；LVDs左心室收縮期最小內徑(cm)；7.3.3.2小鼠血清中肌鈣蛋白I(cTnI)的檢測通過檢測血清中cTnI的釋放量來判斷心肌細胞損傷程度，比傳統的CK、LDH、AST等指標具有高特異性、高敏感性等優(yōu)點。因此，本實驗采用檢測血清中cTnI的含量，作為反映心肌細胞損傷程度的客觀指標。
注射病毒后第8天，小鼠稱重后，眼眶取血，分離血清，-20℃冰箱凍存，用發(fā)光法測定血清cTnI。
7.3.3.3小鼠心肌病理檢查委托復旦大學上海醫(yī)學院病理教研室進行。
將存活小鼠頸椎脫臼致死，無菌開胸摘出心臟，稱重后，將心肌浸入福爾馬林液固定，石蠟包埋、連續(xù)切片，進行病理學組織學檢查，觀察心肌細胞炎癥細胞浸潤、變性、壞死等病理改變。參考新藥評審指導原則，病理評分標準如下0分病變面積為0％；1分病變面積為25％；2分病變面積為50％；3分病變面積為75％；4分病變面積為100％；介于兩者之間的可根據病變面積給予相應的評分，如病變面積為80％評為3.2分。
7.3.3.4小鼠存活率觀察試驗期間，觀測不同用藥組模型動物的死亡情況。
8數據處理所得實驗數據進行相關資料配對t檢驗。
9結果9.1重組人神經調節(jié)蛋白對病毒感染小鼠心功能的影響結果顯示，模型組EF值(67.1±9.9％)和FS值(32.0±7.2％)均顯著低于正常值(EF，92.5±2.3％/FS，59.2±3.1％)，p＜0.05。重組人神經調節(jié)蛋白30μg/kg、15μg/kg組EF值(90.2±2.5％，86.0±2.9％)，FS值(55.7±2.1％，50.7±4.3％)有明顯升高，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)。7.5μg/kg組EF/FS與模型組比較無顯著性差異(P＞0.05)。模型組LVDd值(0.208±0.015cm)和LVDs值(0.142±0.020cm)均顯著高于正常對照組(LVDd，0.179±0.007cm/LVDs，0.073±0.006cm)，兩者比較均有顯著性差異(P＜0.01)。重組人神經調節(jié)蛋白30μg/kg、15μg/kg組LVDd值和LVDs值均顯著低于模型組(P＜0.05)，7.5μg/kg組與模型組相比則無顯著性差異(P＞0.05)。2次重復試驗的結果詳見表19，20。
表19病毒感染小鼠用藥5天后心功能測量參數
以上數據每組n＝6，經SPSS one-way anova分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.01表20病毒感染小鼠用藥5天后心功能測量參數
n＝6，SPSS one-way anova分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.019.2重組人神經調節(jié)蛋白對病毒感染小鼠血清cTnI的影響結果顯示，模型組cTnI均值(44.44±12.39ng/ml)顯著高于正常對照組(3.28±4.55ng/ml)，重組人神經調節(jié)蛋白30μg/kg劑量組(7.98±6.07ng/ml)明顯低于模型組(P＜0.001)，15μg/kg劑量組(19.43±10.76ng/ml)與模型組相比，差異亦有顯著性(P＜0.05)，7.5μg/kg劑量組(29.05±17.06ng/ml)與模型組相比，差異無統計學意義。2次試驗結果詳見表21，22。
表21重組人神經調節(jié)蛋白對病毒感染小鼠血清cTnI(ng/ml)含量的影響
n＝10，SPSS軟件Nonparametric tests(Independent samples tests)分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.01表22重組人神經調節(jié)蛋白對病毒感染小鼠血清cTnI(ng/ml)含量的影響(II)
n＝10，經SPSS軟件Nonparametric tests(Independent samples tests)分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.019.3重組人神經調節(jié)蛋白對病毒感染小鼠心肌病理損傷的影響實驗結果顯示，正常組心肌病理評分為0.0±0.00，模型組心肌病理評分(2.22±0.97)，兩者比較具有顯著性差異(P＜0.01)。重組人神經調節(jié)蛋白高劑量組與中劑量組病理評分均顯著下降(分別為0.56±0.47，0.73±0.58)，與模型組比較具有顯著性差異(P＜0.01)，低劑量組與模型組相比無顯著性差異(P＞0.05)。2次試驗結果詳見表23，24和圖16，17。
表23重組人神經調節(jié)蛋白對病毒感染小鼠心肌病理變化的影響(I)
以上數據經SPSS軟件Nonparametric tests(Independent samples tests)分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.01表24重組人神經調節(jié)蛋白對病毒感染小鼠心肌病理變化的影響
以上數據經SPSS軟件Nonparametric tests(Independent samples tests)分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.019.4重組人神經調節(jié)蛋白對病毒感染小鼠存活率的影響2次實驗結果見表25，26。注射病毒后一周，模型組小鼠存活率為50％和55％，使用重組人神經調節(jié)蛋白后分別上升為85％及80％(30μg/kg)和70％、65％(15μg/kg)。
表25重組人神經調節(jié)蛋白對病毒感染小鼠存活率的影響
SPSS軟件，Survival Life Tables分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.01表26重組人神經調節(jié)蛋白對病毒感染小鼠存活率的影響
SPSS軟件，Survival Life Tables分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.019結論重組人神經調節(jié)蛋白30μg/kg、15μg/kg組EF值(90.2±2.5％，86.0±2.9％)，FS值(55.7±2.1％，50.7±4.3％)均明顯升高，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)，LVDd值(0.187±0.006，0.189±0.008)和LVDs值(0.085±0.009，0.099±0.027)均顯著低于模型組(0.208±0.015，0.142±0.020)，P＜0.05；重組人神經調節(jié)蛋白能減輕模型動物心肌病理損害程度，有效降低模型動物血清中肌鈣蛋白I(cTnI)水平，30μg/kg劑量組(7.98±6.07ng/ml)、15μg/kg劑量組cTnI(19.43±10.76ng/ml)明顯低于模型組(44.44±12.39 ng/ml)，兩者相比，差別有顯著性(P＜0.001，P＜0.05)；與模型組動物50％的存活率相比，重組人神經調節(jié)蛋白30μg/kg組可顯著提高模型動物的存活率，達80％，p＜0.05。
試驗結果表明重組人神經調節(jié)蛋白能在30μg/kg的劑量水平，能有效治療病毒感染致小鼠的急性心肌損傷。
實施例5.重組人神經調節(jié)蛋白對病毒感染致小鼠急性心肌損傷的療效觀察1摘要目的明確重組人神經調節(jié)蛋白治療病毒感染致小鼠急性心肌損傷的有效用藥時間。方法小鼠腹腔注射柯薩奇B3病毒(CVB3)建立病毒感染致動物急性心肌損傷模型。模型動物隨機分組，設置正常對照、模型組、受試藥組。每組20只。重組人神經調節(jié)蛋白30μg/kg，同一天開始尾靜脈注射，分別連續(xù)3、5和7天。試驗期間，觀察模型動物存活率，第七天心超檢測，第八天處死小鼠，取血清檢測cTnI水平，心臟病理組織學檢查等。結果重組人神經調節(jié)蛋白30μg/kg，連續(xù)靜脈注射3天、5天和7天，均能提高模型動物的EF/FS值，5天與7天用藥組EF/FS值(86.8±4.4％/51.9±5.8％，87.0±3.3％/51.8±5.1％)與模型組EF/FS值(66.5±5.6/31.8±3.7)相比，均有顯著性差異(P＜0.01)，5天與7天用藥組LVDs值均顯著下降(分別為0.090±0.011，0.092±0.012cm)，與模型組比較(0.133±0.012)均有顯著性差異(P＜0.01)；重組人神經調節(jié)蛋白能減輕模型動物心肌病理損害程度，有效降低模型動物血清中肌鈣蛋白I(cTnI)水平，5天用藥組(1.06±1.32ng/ml)、7天用藥組cTnI(1.05±1.2ng/ml)明顯低于模型組(23.54±16.96ng/ml)，P＜0.01；與模型組動物50％的存活率相比，重組人神經調節(jié)蛋白連續(xù)靜脈注射5天和7天，可顯著提高模型動物的存活率，達85％，p＜0.05。結論重組人神經調節(jié)蛋白30μg/kg連續(xù)給藥5天，可有效治療病毒感染致小鼠急性心肌損傷。
2目的明確重組人神經調節(jié)蛋白治療病毒感染致小鼠急性心肌損傷的有效用藥時間。
3受試藥物重組人神經調節(jié)蛋白，上海澤生科技開發(fā)有限公司研制，批號200110006-2；濃度500μg/支；效價測定5000u；純度＞95％(HPLC-C8)。
4實驗動物4.1品系、來源、合格證號4周齡純種BALB/C小鼠，由復旦大學實驗部提供，合格證號醫(yī)動字第22-9號。
4.2體重、性別每鼠13～15g，雄性。
4.3每組動物數模型組20只，正常組10只。
5病毒同前部分。
6材料、儀器同前部分。
7實驗方法7.1實驗組別實驗設置正常小鼠對照組、模型組、受試藥組。
正常小鼠對照組(n＝10)；模型組(n＝20)注射制劑配方緩沖液；受試藥組重組人神經調節(jié)蛋白30μg/kg，分連續(xù)3、5、7天三個不同療程的給藥組，每組20只動物；7.2受試藥物劑量設置及藥物配制、給藥途徑、給藥次數、給藥濃度和容積重組人神經調節(jié)蛋白30μg/kg，用制劑配方緩沖液(10mM PB，0.2％HAS，5％甘露醇)稀釋受試藥物至所需濃度；受試藥分成3個給藥組，分別為每天連續(xù)靜脈注射3天、5天和7天，每次給藥容積為0.2ml/只；模型組給藥為小鼠尾靜脈注射制劑配方緩沖液，每天一次(qd)，連續(xù)給藥7天。每次給藥容積為0.2ml/只；7.3試驗方法7.3.1小鼠急性病毒性心肌炎動物模型的建立由復旦大學附屬中山醫(yī)院提供100xTCID50的CVB3病毒，腹腔注射0.2ml/只，造成急性心肌炎模型。小鼠將于隨后的一周內逐步出現豎毛、脫毛、消瘦、呆滯、死亡等表現，到第8天時死亡將近一半。
7.3.2藥效試驗同前部分。
7.3.3觀測指標同前部分。
8數據處理所得數據進行相關t檢驗或方差分析。
9結果9.1重組人神經調節(jié)蛋白用藥3、5、7天對病毒感染小鼠心功能的影響結果顯示，模型組EF/FS值(66.5±5.6％/31.8±3.7％)明顯低于正常組(93.5±0.9％/68.1±1.3％)，兩者比較具有顯著性差異(P＜0.01)。重組人神經調節(jié)蛋白5天組與7天組EF/FS值(86.8±4.4％/51.9±5.8％，87.0±3.3％/51.8±5.1％)，與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。重組人神經調節(jié)蛋白用藥3天組EF值也有回升(73.1±6.6％)，但與模型組相比，差異無顯著性(P＞0.05)。
模型組LVDs值(0.133±0.012cm)高于正常組(0.059±0.006cm)，兩者比較有顯著性差異(P＜0.01)。重組人神經調節(jié)蛋白5天組、7天組LVDs值均顯著下降(分別為0.090±0.011，0.092±0.012cm)，與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。神經調節(jié)蛋白3天組LVDs值(0.123±0.012cm)與模型組比較則無顯著性差異(P＞0.05)。2次實驗結果詳見表27，28。
表27重組人神經調節(jié)蛋白不同用藥天數對病毒感染小鼠心功能參數的影響
以上每組數據n＝6，經SPSS one-way anova分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.01表28重組人神經調節(jié)蛋白不同用藥天數對病毒感染小鼠心功能參數的影響(II)
以上每組數據n＝6，經SPSS one-way anova分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.019.2重組人神經調節(jié)蛋白對病毒感染小鼠血清cTnI的影響結果顯示，正常組cTnI均值為0.12±0.03ng/ml，模型組cTnI均值明顯增高為23.54±16.96ng/ml，二者比較具有顯著性差異(P＜0.01)。重組人神經調節(jié)蛋白5天組與7天組cTnI值均顯著下降(分別為1.06±1.32ng/ml，1.05±1.20ng/ml)，與模型組比較均具有顯著性差異(P＜0.01)，用藥3天組與模型組比較無顯著性差異(P＞0.05)。二次實驗結果分別詳見表29，30。
表29重組人神經調節(jié)蛋白不同用藥天數對病毒感染小鼠血清cTnI(ng/ml)的影響
SPSS軟件Nonparametric tests(Independent samples tests)分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.01表30重組人神經調節(jié)蛋白不同用藥天數對病毒感染小鼠血清cTnI(ng/ml)的影響
SPSS，Nonparametric tests(Independent samples tests)分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.019.3重組人神經調節(jié)蛋白不同用藥天數對病毒感染小鼠心肌病理損傷的影響實驗結果顯示，正常組病理評分為0.0±0.00，模型組病理評分升高(1.44±1.19)，二者比較有顯著性差異(P＜0.01)。重組人神經調節(jié)蛋白5天組與7天組病理評分明顯下降(分別為0.11±0.14，0.13±0.13)，與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。用藥3天組心肌細胞損傷亦有改善(0.33±0.155)，與模型組比較有顯著性差異，但與用藥5天組比較，5天組心肌細胞改善明顯好于3天組，二者比較具有顯著性差異(P＜0.01)。而5天組與7天組病理評分無顯著性差異(P＞0.05)。二批實驗結果相似(詳見表31，32，圖18，19)。
表31重組人神經調節(jié)蛋白不同用藥天數對病毒感染小鼠心肌病理變化的影響
n＝10，SPSS，Nonparametric tests(Independent samples tests)分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.01表32重組人神經調節(jié)蛋白不同用藥天數對病毒感染小鼠心肌病理變化的影響
n＝10，經SPSS軟件Nonparametric tests(Independent samples tests)分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.019.4重組人神經調節(jié)蛋白不同用藥天數對病毒感染小鼠存活率的影響結果見表33，34。2次實驗，模型組小鼠存活率分別為50％和60％，重組人神經調節(jié)蛋白5天組與7天組均上升為85％和90％，與模型組相比差別有顯著性，p＜0.05。3天組存活率上升為65％和75％，但與模型組相比，差別無顯著性(p＞0.05)。
表33重組人神經調節(jié)蛋白不同用藥天數對病毒感染小鼠存活率的影響(I)
SPSS軟件，Survival Life Tables分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.01表34重組人神經調節(jié)蛋白不同用藥天數對病毒感染小鼠存活率的影響(II)
SPSS，Survival Life Tables分析，與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.0110結論重組人神經調節(jié)蛋白30μg/kg，連續(xù)靜脈注射3天、5天和7天，均能提高模型動物的EF/FS值，5天與7天用藥組EF/FS值(86.8±4.4％/51.9±5.8％，87.0±3.3％/51.8±5.1％)，與模型組EF/FS值(66.5±5.6/31.8±3.7)相比，均有顯著性差異(P＜0.01)，5天與7天用藥組LVDs值均顯著下降(分別為0.090±0.011，0.092±0.012cm)，與模型組比較(0.133±0.012)均有顯著性差異(P＜0.01)；重組人神經調節(jié)蛋白能減輕模型動物心肌病理損害程度，有效降低模型動物血清中肌鈣蛋白(cTnI)水平，5天用藥組(1.06±1.32ng/ml)、7天用藥組cTnI(1.05±1.2ng/ml)明顯低于模型組(23.54±16.96ng/ml)，P＜0.01；與模型組動物50％的存活率相比，重組人神經調節(jié)蛋白連續(xù)靜脈注射5天和7天，可顯著提高模型動物的存活率，達85％，p＜0.05。
試驗結果表明重組人神經調節(jié)蛋白30μg/kg連續(xù)給藥5天可有效治療病毒感染致小鼠急性心肌損傷。
實施例6.重組人神經調節(jié)蛋白對下腔靜脈縮窄致犬充血性心力衰竭的治療作用1摘要目的觀察重組人神經調節(jié)蛋白對下腔靜脈縮窄(TIVCC)所致犬充血性心力衰竭的治療效果。方法經胸縮窄犬下腔靜脈約50％后1周左右，心超檢測EF值下降約20％或心書出；輸出量減少20％，表明已建立了穩(wěn)定的低心排、充血性心衰動物模型。隨后動物隨機分組，每組6條犬，每天靜脈注射重組人神經調節(jié)蛋白，設置3個劑量組，分別為1、3、10μg/kg，連續(xù)5天。給藥結束后進行心功能(心臟超聲)檢測，并分別經頸靜脈和頸動脈插管分析模型動物血流動力學各項參數的改變。結果3個劑量的重組人神經調節(jié)蛋白(1、3、10μg/kg)，連續(xù)用藥5天，均能升高模型動物的EF/FS值和心輸出量(CO)，用藥前后以及與模型組相比，差別均有顯著性(p＜0.05，p＜0.01)；1、3、10μg/kg重組人神經調節(jié)蛋白能有效提高動物左心dp/dt，與模型組相比差別均具有顯著性(p＜0.01)，能有效提高模型動物的LVPmax，降低LVPmin值，與模型組相比，p＜0.05，而對右心室的作用不很明顯。結論重組人神經調節(jié)蛋白能有效治療下腔靜脈縮窄致犬的充血性心力衰竭。
2目的明確重組人神經調節(jié)蛋白對下腔靜脈縮窄所致犬充血性心衰的治療效果。
3受試樣品重組人神經調節(jié)蛋白成品，上海澤生科技開發(fā)有限公司研制，批號200110006-2，濃度500μg/支；效價5000u/支，純度＞95％(HPLC-C8)。
4實驗動物4.1品系、來源、合格證號雜種犬，由復旦大學中山醫(yī)院提供，經復旦大學實驗動物部檢疫合格。
4.2體重、性別13～18kg，雄性。
4.3動物數每組6條。
5材料、儀器5.1心臟超聲心動儀，Hewlett Packard sonos 5500；探頭型號S4；5.2注射用水，購自湛江安度斯生物有限公司，10×5ml，批號0112180；5.3高頻電刀，上海滬通電子儀器廠，GD350-D；5.4心電圖記錄儀，Nihon Kohden ECG-6511；5.5監(jiān)護電極，加拿大Ludlow公司，型號MT-200；5.6生理記錄儀，上醫(yī)大醫(yī)療器械研究中心，SMUP-B；
5.7電動呼吸器，上海醫(yī)療器械四廠，SC-3；5.8三腔球囊漂浮導管，Edwards 114F7。
6實驗方法6.1實驗組別實驗設置假手術組、模型組和受試藥組。
假手術組(n＝6)僅開胸不縮窄下腔靜脈。
模型組(n＝6)建立心衰模型后，注射制劑緩沖液。
受試藥組建立心衰模型后，注射重組人神經調節(jié)蛋白。
6.2受試藥物劑量設置、配制方法及給藥方案受試藥重組人神經調節(jié)蛋白高、中、低3個劑量組，分別為1、3、10μg/kg，用制劑緩沖液(賦形劑)稀釋至所需濃度，靜脈注射，每天一次，連續(xù)5天。模型組靜脈注射制劑緩沖液，每天一次，連續(xù)5天。給藥容積均為0.8ml/kg體重。
6.3試驗方法6.3.1犬下腔靜脈縮窄致心衰動物模型的建立經外周靜脈推注3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)，使犬麻醉后氣管插管。無菌條件下經右胸4～5肋間打開胸腔，測量距右心房3cm處的下腔靜脈周長。選擇周長相當于其1/3～1/2的硬質短管，用7號絲線將短管與下腔靜脈一同結扎，抽出短管，充分止血后關閉胸腔。飼養(yǎng)約1周后，根據腹水形成多少等情況，進行心超檢測，當發(fā)現EF下降約20％或左心擴大約20％，確定已建立了穩(wěn)定的低排充血性心衰動物模型。隨后每天靜脈給藥，連續(xù)5天。假手術組僅開胸，不進行下腔靜脈縮窄。
6.3.2藥效試驗確認動物模型建立后，按照動物分組和給藥方案進行試驗。
6.3.3觀測指標6.3.3.1心功能檢測分別于手術前、用藥前和用藥5天后，在犬麻醉狀態(tài)下進行心臟功能指標檢測。主要指標包括EF(Ejective Fraction)心室射血分數，系指心室舒張末期(EDV)和收縮末期容積(ESV)之差與心室舒張末期(EDV)的比值，是反應心泵功能尤其收縮功能的常用指標；
FS心室縮短分數，是反應心室收縮功能的指標；CO心輸出量，每分鐘射出的血液量。
6.3.3.2血流動力學指標檢測分別于手術前、用藥前以及給藥5天后，在犬麻醉狀態(tài)下，經右側頸靜脈插入7F三腔球囊漂浮導管，記錄右房壓、右室壓、肺動脈壓及肺動脈楔壓。
再經左側頸動脈插入6F三腔球囊漂浮導管，用生理記錄儀記錄主動脈壓，左室壓等指標，主要指標包括LVPmax、LVPmin、+dp/dt、-dp/dt。
7數據處理所得數據用SPSS軟件進行配對資料t檢驗或非參數檢驗。
8結果8.1重組人神經調節(jié)蛋白對TIVCC犬心功能的影響8.1.1重組人神經調節(jié)蛋白對TIVCC犬左心EF/FS值的影響通過超聲檢測顯示，模型組動物縮窄前EF和FS值分別為82.3±1.6％和49.2±2.6％，手術后分別降到59.1±7.3％和29.3±3.9％，縮窄前后相比差異有顯著性(P＜0.01、P＜0.05)，5天后EF和FS值繼續(xù)維持在55.5±10.9％和28.5±6.6％水平，表明我們建立的下腔靜脈縮窄致犬充血性心力衰竭模型成立而且比較穩(wěn)定。
重組人神經調節(jié)蛋白用藥后，3個劑量組模型動物左心室的EF和FS值均被明顯提高，低劑量組(1μg/kg)的EF和FS值分別由57.7±10.9和30.6±8.0提高至70.4±8.4和39.7±5.7，用藥前后比較差異有顯著性(P＜0.05)，同時與模型組比較差別也有顯著性(P＜0.05)。同樣，中、高劑量組模型動物左心室EF/FS值也被明顯提高，給藥前后以及與模型組比較，差別均具有顯著性(p＜0.01)，結果詳見表35。
表35重組人神經調節(jié)蛋白對TIVCC犬左室EF/FS的影響
n=6，*與模型組相比P＜0.05；**與模型組相比P＜0.01；▲用藥前后相比P＜0.05▲▲用藥前后相比P＜0.018.1.2重組人神經調節(jié)蛋白對TIVCC犬心輸出量(CO)的影響表36結果顯示，重組人神經調節(jié)蛋白能明顯提高模型動物的心輸出量，1μg/kg用藥組動物心輸出量由2.4±0.5增加至3.7±0.8，用藥前后相比差別有顯著性(p＜0.05)，同時與模型組動物相比，差別也有顯著性(p＜0.05)。3、10μg/kg劑量組的CO變化則更加明顯(p＜0.01)。對心率變化的檢測結果顯示，重組人神經調節(jié)蛋白對模型動物的心率影響不大(結果未顯示)。
表36重組人神經調節(jié)蛋白對TIVCC犬心輸出量的影響(Lmin)
n=6*與模型組相比P＜0.05；**與模型組相比P＜0.01；▲與用藥前相比P＜0.05▲▲與用藥前相比P＜0.018.2重組人神經調節(jié)蛋白對TIVCC犬血流動力學的影響采用漂浮導管技術檢測模型動物左右心室dp/dt和收縮/舒張末壓變化。結果顯示，l、3、10μg/kg重組人神經調節(jié)蛋白能有效提高動物左心dp/dt，與模型組相比差別均具有顯著性(p＜0.05)；有效提高模型動物的LVPmax，降低LVPmin值，與模型組相比，p＜0.05；重組人神經調節(jié)蛋白對左心-dp/dt和右心室±dp/dt及心室末壓影響不大，結果詳見表37，38。
表38重組人神經調節(jié)蛋白對TIVCC犬左室dp/dt的影響
n＝6，*與模型組相比P＜0.05；**與模型組相比P＜0.01表39重組人神經調節(jié)蛋白對TIVCC犬左室LVPmax/LVPmin的影響
n＝6，*與模型組相比P＜0.05；**與模型組相比P＜0.0110結論3個劑量的重組人神經調節(jié)蛋白(1、3、10μg/kg)，連續(xù)用藥5天，均能升高模型動物的EF/FS值和心輸出量(CO)，用藥前后以及與模型組相比，差別均有顯著性(p＜0.05，p＜0.01)；1、3、10μg/kg重組人神經調節(jié)蛋白能有效提高動物左心dp/dt，與模型組相比差別均具有顯著性(p＜0.05)，能有效提高模型動物的LVPmax，降低LVPmin值，與模型組相比，p＜0.05，而對右心室的作用不很明顯。
結果表明重組人神經調節(jié)蛋白能有效治療下腔靜脈縮窄致犬的充血性心力衰竭。
實施例7.NRG-1長期毒性試驗1.試驗目的觀察恒河猴靜脈注射重組人神經調節(jié)蛋白三周，停藥后繼續(xù)觀察三周，了解對機體產生的毒性反應及嚴重程度，毒性反應的靶器官及其損害的可逆性，確定無毒性反應劑量，為臨床擬定人用安全劑量提供參考。
2.受試藥物2.1名稱重組人神經調節(jié)蛋白2.2批號200210024
2.3提供單位上海澤生科技開發(fā)有限公司2.4含量3.75mg/ml。
2.5比活性1.12×104u/mg。
2.6性狀無色透明溶液。
2.7保存條件4℃保存。
2.8賦形劑0.15M NaCl，10mM磷酸鈉鹽，pH6.0。
2.9配制方法用生理鹽水稀釋至所需濃度。
3.動物3.1動物品系恒河猴3.2動物來源安徽省利辛縣大李集獼猴養(yǎng)殖場，合格證號皖發(fā)馴繁2002-6號。
3.3動物接收時間2002年3.4體重給藥開始時2.6-5.9kg。
3.5性別雌雄各半。
3.6動物數共24只。
3.7動物標識采用胸牌標記。
3.8飼養(yǎng)條件單籠飼養(yǎng)，用市售猴用顆粒飼料(上海仕林科學技術有限公司提供)喂養(yǎng)。每日喂二次，每次100克，每日喂水果100克左右。動物房溫度20～25℃，相對濕度50～70％，每天光照12hr。
3.9適應環(huán)境時間給藥前適應環(huán)境飼養(yǎng)25天。
4.劑量4.1劑量設置對照組0U/kg/d(注射等容量的賦形劑)低劑量組84U/kg/d(相當于猴等效劑量2倍)中劑量組168U/kg/d(相當于猴等效劑量4倍)高劑量組840U/kg/d(相當于猴等效劑量20倍)4.2劑量設置依據重組人神經調節(jié)蛋白臨床擬用適應癥為心力衰竭的治療。小鼠藥效模型為嗜心性柯薩奇B3病毒致心肌炎模型，劑量為84，168，840U/kg(相當于猴21，42，84U/kg)，連續(xù)靜脈注射給藥5天，病理評分分別為1.5，0.7，0.56(病理評分標準為0分病變面積為0％，1分病變面積為25％，2分病變面積為50％，3分病變面積為75％，4分病變面積為100％)。故小鼠168，840U/kg劑量可明顯減輕心臟的損傷。臨床擬給藥途徑為靜脈注射，臨床擬用方案為每天給藥一次，連續(xù)給藥3-5天。以猴等效劑量42U/kg為明顯有效劑量，擬定猴長期毒性劑量為動物有效劑量的2，4，20倍。
5.給藥期限每天給藥一次，連續(xù)給藥3周。
6.恢復期限3周。
7.給藥容量1.0ml/kg體重。
8.給藥途徑緩慢靜脈注射，與臨床擬用途徑一致。
9.試驗方法試驗動物購入前經腸蟲清驅腸寄生蟲，進行結核菌素試驗，經適應環(huán)境并進行血液學、血清生化、尿液及心電圖等檢查二次，確定為健康動物(雌性須未孕)作為受試動物。按體重和性別隨機分為4組，每組6只，雌雄各半。給藥容量1.0ml/kg體重，每周給藥前稱一次體重，根據體重調整給藥容量，給藥三周后24小時和恢復期3周結束時各組分別處死2/3和1/3動物(雌、雄猴各2只和1只)，進行系統尸解、臟器稱重，計算臟器系數并進行病理組織學檢查。給藥10天及解剖前采血進行各項血液及生化等指標檢查，并采骨髓作涂片檢查。
9.1試劑9.1.1血清生化試劑Trace進口生化試劑9.1.2血液學測定試劑9.1.3抗體檢測主要試劑①包被液NaHCO30.293g，Na2CO30.159g，溶于100ml水中。
②底物緩沖液pH5.0，檸檬酸1.02g，Na2HPO4·12H2O 3.68g溶于水中。
③洗液0.01M PBS加1∶2000 Tween-20④封閉液脫脂奶粉5g，溶于100ml，pH7.4的0.01M PBS中。
⑤HRP標記兔抗猴二抗美國Sigma公司產品，批號A-2054。
⑥Tween-20進口分裝，上海實生細胞生物技術有限公司提供。
⑦四甲基鄰苯胺(TMB)進口分裝，上海華美生物工程公司提供。
⑧H2SO4分析純，上海凌峰化學試劑有限公司。
9.2儀器Hitachi-7060型自動生化分析儀Roche Haematology Vet型血球計數儀550型酶標儀美國BIO-RAD產品Heraeus低溫離心機，德國Heraeus公司Hewlett Packard sonos 5500型心臟超聲儀，S4探頭。
9.3血液學和生化檢測方法見下表血液學試驗方法
血清生化試驗方法
9.4抗體檢測方法包被抗原用包被緩沖液稀釋重組人神經調節(jié)蛋白至6μg/ml，以100μl/孔加至96孔酶標板內，37℃，1hr。
封閉洗板5次，用洗滌液配5％脫脂奶粉，以200μl/孔加至板內，置37℃，2hr。
稀釋待檢血清用樣品稀釋液稀釋樣品，濃度為1∶100。
加樣將封閉好的酶標板洗板3次，加入待檢血清，100μl/孔，37℃，1hr。
加酶標抗體洗板5次，加入1∶1000稀釋HRP標記的兔抗猴免疫球蛋白，100μl/孔，37℃，1hr。
底物洗板5次。加入新鮮配制的底物工作液，100μl/孔，37℃，10min。
終止加入2N H2SO4，50μl/孔，終止反應。
OD值檢測用酶標儀檢測，測定波長450nm。
結果判斷檢測樣品OD值大于陰性對照2.1倍以上(1∶1000稀釋)作為陽性結果。
10.觀察指標和測定指標的時間10.1死亡情況每天觀察1～2次，如有動物死亡，記錄死亡時間。
10.2一般征狀
包括外觀、體征、行為活動，籠子表面粘血或滲出物，皮毛光澤度等一般征狀。每天觀察1～2次。
10.3體重每周給藥前稱一次體重。
10.4體溫給藥第1、3和5天測給藥前和給藥后1小時的體溫。
10.5攝食量每天每只猴加顆粒飼料200g，另給水果100g，計算每天每只猴的食物消耗量。
10.6心電圖檢查分別在給藥前測二次，給藥開始后第10天、給藥結束時及停藥恢復期末測定各導聯心電圖，計算P-R、QRS、QT、HR、ST值。
10.7心臟B超檢查給藥結束及恢復期結束解剖前1天，擬解剖動物用3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)靜脈注射麻醉后，用心臟B超測定動物室間隔厚度(IVS)，左室后壁厚度(PW)，左室舒張末容積(LVDd)，左室收縮末容積(LVDs)，射血分數(EF)，縮短分數(Fs)，二尖瓣血流峰值(MV)，主動脈瓣血流峰值(AV)，心率(HR)。
10.8血液學指標給藥前測二次，給藥開始后第10天、給藥結束時及停藥3周恢復期末解剖前一天，經隱靜脈采血0.5ml，用3.8％EDTA抗凝，測定以下指標紅細胞數(RBC)，網織紅細胞數(Ret)，血紅蛋白(Hb)，白細胞總數(WBC)與分類(DC)包括中性(N)、嗜酸(E)、淋巴(L)與單核(M)，血小板數(PLT)，凝血時間(CT)、紅細胞壓積(Ht)、紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白(MCH)、紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)。
10.9血清生化指標給藥前測二次，給藥開始后第10天、給藥結束時及恢復期3周解剖前一天，由隱靜脈采血5ml，離心后取血清，測定天冬氨酸轉氨酶(AST)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CPK)、尿素氮(BUN)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、血清總膽紅素(T-Bil)、肌酐(CRE)、總膽固醇(T-CHO)、鈉(Na+)、鉀(K+)、氯(Cl-)、鈣(Ca++)、鎂(Mg++)、磷(P+++)。
10.10尿常規(guī)檢查給藥前測二次，給藥開始后第10天、給藥結束時及恢復期3周解剖前，取尿樣，檢測白細胞、亞硝酸鹽、酸堿度(pH值)、尿蛋白、尿糖、酮體、尿膽原、尿膽紅素及血紅蛋白。
10.11糞便檢查給藥前檢查糞便蟲卵及隱血。給藥開始后第10天、給藥結束時及恢復期3周各進行一次糞隱血檢查。
10.12眼底檢查于解剖前將動物麻醉用檢眼鏡檢查眼底。
10.13臟器系數給藥3周后24小時和停藥恢復期結束時各組分別處死2/3和1/3動物(雌、雄猴各2只和1只)，進行尸解。解剖時取心、腦、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、淋巴結、甲狀腺、睪丸或子宮、卵巢或前列腺稱重并計算各自的臟器系數。
10.14病理組織學檢查取心(左心室前壁、右心室、室間隔、左心房、右心房)、肝、脾、肺、腦、胃、十二指腸、回腸、結腸、腎、膀胱、腎上腺、垂體、甲狀腺、胸腺、胰、睪丸、前列腺、卵巢、子宮、淋巴結(頸、腸系膜)和注射局部的血管和皮下組織進行病理組織學檢查。
10.15骨髓檢查解剖前，動物麻醉后從股骨采取骨髓，涂片、染色，光鏡下鏡檢巨系、粒系、紅系、淋巴和漿細胞以及其它類型細胞，每只動物以四象限及中央部共5×100個有核細胞進行計數分類，計算GE比值，并進行攝片。
10.16血清抗神經調節(jié)蛋白抗體的檢測給藥開始后第1、2、3周及恢復期結束時檢測血清中抗神經調節(jié)蛋白抗體，一旦抗體呈陽性且為中和抗體即停止給藥。
10.17數據處理及統計分析方法各劑量給藥組與對照組的數據用方差分析進行統計檢驗。
11.試驗結果
11.1死亡情況試驗期間未出現與給受試物有關的動物死亡。給藥3周結束時，動物麻醉后進行心臟B超檢查，對照組8#雄猴因麻醉過度，于計劃解剖前夜死亡；恢復期3周結束時，動物麻醉后進行心臟B超檢查前，發(fā)現對照及低劑量組各有1只動物(5#，6#)心率明顯減慢(20-30次/min)，系麻醉過度表現，故提前1天解剖。
11.2一般征狀給藥第2天高劑量組1只雄猴于靜脈注射后30min出現嘔吐。給藥第2-7天期間中、高劑量組各有1只動物于靜脈注射后20-30min內出現嘔吐。給藥一周后各給藥組均有部分動物出現流涎，其中高劑量組出現的例數明顯多于其它給藥組；低劑量組僅1只動物于給藥第9天出現1次流涎。高劑量組動物給藥2周后出現豎毛、皮毛無光澤、活動減少、厭食。給藥第3天開始給藥局部皮膚及血管出現輕度蒼白，變硬，進行性加重，呈明顯劑量依賴關系。高劑量組21#動物給藥第3周開始出現稀便，呈淡黃色，無明顯規(guī)律。對照組動物給藥期間及停藥恢復期無任何異常表現。
11.3體重變化給藥期間各組動物體重與對照組相比無顯著性差異(p＞0.05，)；各組動物給藥前后自身對照，高劑量組動物體重明顯下降(p＜0.01)。
11.4體溫給藥第1、3和5天測給藥前和給藥后1小時的體溫，給藥前后均無明顯差異。
11.5攝食量中、高劑量組動物給藥1周后，陸續(xù)有明顯剩食，攝食量為50～150g不等。對照組及低劑量組動物試驗期間未出現剩食?；謴推谒袆游锞鶡o剩食。
11.6心電圖檢查結果給藥3周各給藥組心率明顯減慢，與對照組相比p＜0.05，p＜0.01，同時P-R、QRS、QT間期也相應延長，以低、中劑量組較為明顯；中、高劑量組RV1電壓較高，低、中劑量組SV1加深，各給藥組RV3電壓較高。(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)。其它個別參數于不同檢測時間的數值略有波動，但均在正常范圍內。
11.7心臟B超檢查結果給藥3周及恢復3周結束時，心臟B超檢查，對照組及各給藥組各參數均無明顯差異(p＞0.05)11.8血液學檢查結果整個試驗期間除個別參數在正常范圍內波動外，未見明顯異常變化。
11.9血清生化檢查結果整個試驗期間除個別參數在正常范圍內波動外，未見明顯異常變化(見表14～17)。
11.10尿常規(guī)檢查結果給藥前、給藥開始后第10天、第3周及恢復期3周解剖前進行尿液檢查，對照組及各給藥組均有個別動物尿蛋白含量增加，酮體呈陽性，無規(guī)律性。對照組及各給藥組均有個別動物有一過性紅細胞增加。未見其它明顯異常。
11.11糞便檢查結果所有動物給藥前、給藥開始后第10天、第3周及恢復期3周解剖前進行糞便潛血試驗均為陰性，無蟲卵或寄生蟲。
11.12眼底檢查結果給藥3周及恢復期3周解剖前，各組動物眼底檢查未發(fā)現明顯異常。
11.13系統解剖給藥3周，中劑量組2#雄猴及23#、24#雌猴心包內見少量積液；高劑量組1#、11#雄猴及21#雌猴心包內見積液，各抽出約2-3ml，澄清，色微黃；高劑量組1#及21#動物腦內蛛網膜下腔見腦積水，各抽出約1-2ml，澄清，色微黃；21#動物腹腔內有積液，大腸粘膜面見出血點，并見小灶性潰瘍。高劑量組22#雌猴，肺葉見充血、出血灶。8#猴解剖時已死亡，尸檢肺部呈明顯充血和片狀出血，其余未見明顯異常。
恢復期3周結束時，高劑量組雌雄各1只動物(10#，14#)腦內蛛網膜下腔見腦積水，分別抽出0.5ml和3ml；因麻醉過度提前解剖動物未見明顯異常。
其余臟器未見明顯異常。
上述積液進行體液常規(guī)檢查均為漏出液。
11.14臟器重量及其系數解剖時，主要臟器稱重并計算臟器系數。各臟器重量未見與給受試物有關的異常變化。
11.15病理組織學檢查結果給藥3周，高劑量組1#、11#雄猴及21#雌猴心臟心房和心室心肌纖維見彌漫性空泡樣變性，心內膜及外膜則未見明顯異常。另外，11#及21#猴軟腦膜下見血管充血、輕度水腫；21#動物結腸部分粘膜壞死、粘膜及漿膜明顯水腫、并有炎癥細胞浸潤。對照組8#解剖時已死亡動物肺臟肺泡隔增厚、充血，片狀出血，部分肺泡內充滿水腫液，腎臟、胃、大腸、小腸及胰腺組織部分自溶。其余未見異常。
恢復期3周結束時，高劑量組14#雌猴心肌纖維見輕度空泡樣變性，軟腦膜下見血管充血。因麻醉過度提前解剖動物未見明顯異常。
各給藥組注射部位血管除出血性改變外，未見明顯的刺激反應。
結論給藥組部分動物心臟心包積液和腦積液的大體改變及其組織學檢查結果與給受試物相關。其余一些動物臟器見散在、偶發(fā)的病變，如肺臟及胃腸道炎性反應等，多系動物的自發(fā)性病變。
11.16骨髓檢查結果給藥3周及恢復期3周猴麻醉后，解剖前，從右側髖骨采取骨髓、涂片、染色，光鏡下鏡檢巨系、粒系、紅系、淋巴和漿細胞以及其它類型細胞，每只動物以四象限及中央部共5×100個有核細胞進行計數分類，計算GE比值，并進行顯微攝影。
結果各組動物粒、紅、巨三系細胞均正常增生，粒紅比值正常，未見異常病理細胞，未引起骨髓毒性病理損害。)。
11.17血清抗神經調節(jié)蛋白抗體檢查結果給藥開始后第1、2、3周及恢復期3周結束時檢測血清中抗人神經調節(jié)蛋白抗體，各給藥組均為陰性。
12.討論以84，168，840U/kg劑量給恒河猴連續(xù)靜脈注射重組人神經調節(jié)蛋白3周(相當于猴等效劑量2，4，20倍)，以賦形劑作對照，停藥后繼續(xù)觀察3周。
試驗結果表明試驗期間未出現與給受試物有關的動物死亡。給藥1周后各給藥組均有部分動物出現嘔吐、惡心、流涎。高劑量組動物給藥2周后出現豎毛、皮毛無光澤、活動減少、厭食；給藥局部皮膚及血管出現輕度蒼白，變硬。對照組動物給藥期間及停藥恢復期無任何異常表現。
高劑量組動物給藥3周時體重明顯降低。攝食量明顯減少。所有動物給藥前后體溫無明顯變化。
血液學檢查、血清生化檢查及尿、糞常規(guī)檢查均未見明顯的毒理學變化。
心電圖檢查在給藥3周時，各給藥組心率明顯減慢，可能與該受試物的藥理作用有關。此外，V1，V3的心電圖R波和S波的改變可能與動物胸導聯差異有關。心臟超聲檢查未見明顯異常，病理學檢查也未發(fā)現心肌肥厚性變化。
眼底檢查未發(fā)現異常變化。
骨髓涂片檢查未見明顯毒性病理改變。
給藥3周后大體解剖，發(fā)現中、高劑量組各有3只動物有明顯心包積液，各可抽取2-3ml漏出液不等；高劑量組還發(fā)現2只動物蛛網膜下腔有腦積水，抽得漏出性積液1-2ml。停藥3周解剖時，高劑量組2只動物蛛網膜下腔有腦積水，分別抽得漏出性積液約0.5及3ml。
病理組織學檢查上述高劑量組有心包積液動物的心肌纖維呈彌漫性空泡樣變性，有腦積液動物軟腦膜下見血管充血、輕度水腫，均與給受試物有關。
抗體檢測為陰性。
動物出現的上述嘔吐、惡心、厭食等胃腸道癥狀，進而可導致高劑量組體重下降，可能與受試物在動物胃腸道的分布與消除有關。動物出現的流涎，給藥局部皮膚蒼白、變硬及心包積液、腦積液等征狀，表明中、高劑量組重組人神經調節(jié)蛋白可使恒河猴出現毛細血管滲漏綜合征，進而導致軟腦膜下充血水腫。3周恢復期未完全恢復。此外，動物出現的心率減慢、高劑量組動物心肌纖維空泡樣變性均與給藥物有關。
實施例8.NRG-1體外活性測定(激酶受體活化的酶聯免疫吸附試驗)1實驗原理HER2/neu基因編碼一具有酪氨酸蛋白激酶活性的穿膜蛋白p185，常與ErbB3或ErbB4形成異源二聚體，通過ErbB3或ErbB4與相應配體(Neuregulin-1)的結合，激活HER2編碼的酪氨酸蛋白激酶，介導功能信號的傳遞。我們利用神經調節(jié)蛋白能與細胞表面ErbB3/ErbB4分子結合、間接介導ErbB2蛋白磷酸化的特性，建立快速、靈敏、高通量、定量測定重組人神經調節(jié)蛋白體外生物學活性的方法。
2試驗材料2.1 96孔細胞培養(yǎng)板(Corning公司)；Costar 96孔酶標檢測板。
2.2 人乳腺癌細胞株(MCF-7)，引自美國ATCC，用基礎培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。
2.3 DMEM培養(yǎng)基稱取一定量的DMEM，定量至相應的體積，加入3.7g/L NaHCO2，0.1g/L谷氨酰胺，5.5g/L HEPES。
2.4 基礎培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基添加10％胎牛血清，胰島素9mg/L，4℃保存。
2.5 無菌PBS(0.01M，pH7.4)2.6 0.5％胰酶用無Ca2+、Mg2+離子的PBS配制。
2.7 抗ErbB2單克隆抗體，包被緩沖液，洗液選用澤生公司研制的鼠抗人ErbB2細胞外功能域H4單克隆抗體，與ErbB3和ErbB4無交叉反應。
包被緩沖液pH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液洗液0.01M PBS+0.05％Tween-202.8 辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗人磷酸化蛋白酶單抗(anti-P-tyr-HRP)2.9 底物、底物緩沖液底物(TMB)2mg/ml TMB(用無水乙醇配制)
底物緩沖液0.2M檸檬酸+0.1M Na2HPO4(pH5.0)工作用底物底物緩沖液9ml+TMB 1ml+3％H2O210ul(即配即用)2.10終止液2N H2SO4。
2.11細胞裂解液150mM NaCl+50mM Hepes+1％Triton-X 100+2mM釩酸鈉(sodium orthovanadate)+0.01％硫柳汞(thimerosol)。臨用前每25ml加一片混合蛋白酶抑制劑(Tabletten，Proteasen-Inhibitoren-Cocktail)2.12標準品和待測樣品3試驗步驟第1天進行3.1項，第2天進行3.2～3.3項，第3天進行3.4～3.12項；其中3.1和3.2項各步驟應于無菌條件下進行。
3.1接種細胞擴增至一定數量的MCF-7細胞，用無菌PBS液清洗后，用0.25％胰蛋白酶消化，計數后用基礎培養(yǎng)基調整細胞濃度，加至96孔細胞培養(yǎng)板，5×104/孔，100μl/孔，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
3.2細胞饑餓吸凈96孔板中的培養(yǎng)基，用37℃溫育后的PBS清洗每個孔，然后加入100μl DMEM培養(yǎng)基(不含牛血清和胰島素)，再置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。
3.3包被用包被緩沖液稀釋抗ErbB2細胞外功能域H4抗體至6μg/ml，以50μl/孔加至96孔酶標板內，置4℃過夜(16～18小時)。
3.4稀釋工作參考品和待測樣品溶液取工作參考品、待測樣品分別用DMEM培養(yǎng)基(不含小牛血清和胰島素)稀釋至2μg/ml，再作3倍梯度稀釋，共做9個稀釋度。
3.5細胞磷酸化將饑餓后的96孔板細胞培養(yǎng)基吸凈，分別加入標準品和測試樣品，100μl/孔，每種濃度設置2個復孔。同時設置陰性對照(即DMEM培養(yǎng)基空白對照)。37℃作用20min。
3.6細胞裂解迅速吸去樣品并用PBS洗滌一遍，每孔加入100μl細胞裂解液，置4℃冰箱裂解30min。冰浴條件下水平搖動至貼壁細胞完全脫落，4℃，15000rpm離心15min。
3.7封閉酶標檢測板洗板5次。用洗滌液配5％脫脂奶粉，以200μl/孔加至板內，置37℃ 2h。
3.8加樣將封閉好的酶標板洗板3次后，加入標準和待檢樣品的細胞裂解液，90μl/孔。同時設置陰性對照。置37℃，1h。
3.9加酶標抗體洗板5次，用洗液1∶500(根據產品使用說明和使用時間決定)稀釋HRP酶聯鼠抗磷酸化酪氨酸蛋白抗體，以100μl/孔加至板內，置37℃ 1h。
3.10底物顯色洗板5次。以100μl/孔加入臨時配制的底物工作液，置37℃，10min。
3.11終止以50μl/孔加入2N H2SO4終止反應。
3.12讀OD值酶標儀上比色，測定波長450nm，參比波長655nm，記錄測定結果。
4結果計算用重組人神經調節(jié)蛋白蛋白濃度對相應的OD值作圖，用直線回歸法進行分析，分別計算各待檢樣品的半效劑量。
5所需試劑配方1.DMEM基礎培養(yǎng)基胎牛血清100ml胰島素 9.2mg加于1L的DMEM培養(yǎng)基中混勻即可。
2.細胞裂解液NaCl 4.38gHEPES5.96g
釩酸鈉0.368g硫柳汞0.05gTriton-X100 5 mL溶于500mL H2O中3.包被液(pH9.6)NaHCO30.293gNa2CO30.159g溶于100mL H2O中。
4.100mL底物緩沖液(pH5.0)檸檬酸1.02gNa2HPO4.12H2O 3.68g溶于H2O中。
5.封閉液(5％脫脂奶粉)脫脂奶粉 5g溶于100mL pH7.4的0.01M PBS中。
6.0.01M PBS(pH7.4)Na2HPO4.12H2O2.9014gNaH2PO4.4H2O 0.2964gNaCl 8.5g溶于1000mL H2O中。
7.0.01M PBS-T(PH7.4)在2000ML 0.01M PBS加1ml Tween 20混勻。
8.2mg/ml四甲基鄰苯胺(TMB)TMB 20mg溶于10mL無水乙醇中。
9.20×PBS(1000ML)Na2HPO4.12H2O 58gNaH2PO4.4H2O5.9gNaCl170g溶于1000mL H2O中。
序列表<110>上海澤生科技開發(fā)有限公司<120>神經調節(jié)蛋白用于心血管疾病治療的方法和組合物<130>CPCNZ42655D1<140>
<141>2003-5-15<150>PCT/CN02/00349<151>2002-5-24<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>183<212>DNA<213>人類(homo sapiens)<400>1agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggag aaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc60ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgt gcaagtgccc aaatgagttt120actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaaggcgga ggagctgtac180cag 183<210>2<211>61<212>PRT<213>人類(homo sapiens)<400>2Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val1 5 10 15Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser20 25 30Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys35 40 45Gln Asn Tyr Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr50 55 60Gln
權利要求
1.一種組合物，該組合物包括有效量的NRG蛋白或其功能片段，或編碼該NRG蛋白或其功能片段的核酸，或提高NRG蛋白或其功能片段產量和(或)功能的物質以及有效量的預防、治療或延緩哺乳動物心臟疾病的藥物。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中NRG蛋白通過與結合ErbB2-ErbB4受體起作用。
3.根據權利要求1所述的組合物，其中NRG蛋白選自NRG-1、NRG-2、NRG-3、NRG-4。
4.根據權利要求3所述的組合物，其中NRG-1為NRG-α2或NRG-β2。
5.根據權利要求1所述的組合物，其中NRG-1片段是NRG-β2片段包括SEQ ID NO4的氨基酸序列。
6.根據權利要求1所述的組合物，其中心臟疾病包括心肌梗死、心臟毒性、病毒性心肌炎或擴張型心肌病。
7.根據權利要求1所述的組合物，其中預防、治療心肌梗死藥物可以選自ACEI、鈣離子拮抗劑、β-受體阻滯劑、阿斯匹林、阿托品、硝化甘油、東莨菪堿及溶血栓藥。
8.根據權利要求7所述的組合物，其中ACEI藥物可以選自卡托普利、雷米普利、福辛普利、賴諾普利、依那普利或喹那普利。
9.根據權利要求7所述的組合物，其中鈣離子拮抗劑是地爾硫卓。
10.根據權利要求7所述的組合物，其中β-受體阻滯劑選自阿替洛爾、美托洛爾、普萘洛爾或塞嗎洛爾等。
11.根據權利要求7所述的組合物，其中溶血栓藥選自鏈激酶、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、阿尼鏈菌酶。
12.根據權利要求1所述的組合物，其中預防或治療病毒性心肌炎的藥物選自抗生素、心肌保護劑、抗氧化劑、營養(yǎng)心肌的藥物。
13.根據權利要求12所述的組合物，其中抗生素是青霉素。
14.根據權利要求12所述的組合物，其中心肌保護劑為牛黃酸。
15.根據權利要求12所述的組合物，其中抗氧化劑選自維生素C、維生素E、輔酶Q10。
16.根據權利要求12所述的組合物，其中營養(yǎng)心肌為能量合劑。
17.根據權利要求1所述的組合物，其中預防或治療擴張型心肌病的藥物選自強心劑、利尿劑、ACEI、鈣離子拮抗劑、β-受體阻滯劑。
18.根據權利要求17所述的組合物，其中強心劑為地高辛、西地蘭。
19.根據權利要求17所述的組合物，其中利尿劑選自碳酸酐酶抑制劑、袢利尿劑、排鉀利尿劑、保鉀利尿劑、鹽皮質激素受體的拮抗劑。
20.根據權利要求17所述的組合物，其中鈣離子拮抗劑為阿羅地平。
21.根據權利要求17所述的組合物，其中β-受體阻滯劑為卡維地洛。
22.根據權利要求1所述的組合物，進一步包括藥學上可接受的載體或賦形劑。
23.一種試劑盒，該試劑盒包括權利要求1所述的組合物和該組合物預防、治療或延緩哺乳動物心肌梗死、心臟毒性、病毒性心肌炎或擴張型心肌病等心臟疾病的使用說明書放置在一容器中。
全文摘要
本發(fā)明涉及預防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類各種心血管疾病、心血管紊亂的組合物和方法。更具體說，本發(fā)明提供了神經調節(jié)蛋白或其功能片段、或編碼該神經調節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，或提高所述神經調節(jié)蛋白產量和(或)功能的物質在預防、治療或延緩哺乳動物各種心血管疾病及紊亂的組合物和方法。
文檔編號A61K31/5415GK1935254SQ20061015435
公開日2007年3月28日 申請日期2003年5月15日 優(yōu)先權日2002年5月24日
發(fā)明者周明東 申請人:上海澤生科技開發(fā)有限公司