專(zhuān)利名稱：預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的基因重組口服疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染而引起的胃炎和消化道潰瘍等相關(guān)性疾病的預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的基因重組口服疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
胃炎和消化道是發(fā)病率很高的消化系統(tǒng)疾病，其中胃癌是最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。幽門(mén)螺桿菌寄生于人胃或十二指腸黏膜，是引起胃炎和消化道潰瘍病原菌，也與胃癌、胃粘膜組織相關(guān)淋巴瘤發(fā)病密切相關(guān)。因此，預(yù)防或清除幽門(mén)螺桿菌感染，可顯著減少上述疾病的發(fā)病率。
目前治療幽門(mén)螺桿菌感染相關(guān)性疾病通常采用5’-硝基咪唑類(lèi)和青霉素類(lèi)抗生素，它雖有較好的療效，但還存在著誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥、反復(fù)感染及醫(yī)藥費(fèi)用高昂等問(wèn)題。
眾所周知的疫苗接種是預(yù)防傳染性疾病最為簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)、長(zhǎng)期有效的措施，但傳統(tǒng)的細(xì)菌性疫苗還不能用于幽門(mén)螺桿菌感染相關(guān)性疾病的預(yù)防，其原因是傳統(tǒng)的細(xì)菌性疫苗通常采用甲醛殺滅的全菌制備而成，然而幽門(mén)螺桿菌是一種微需氧菌，它不但要求較高的營(yíng)養(yǎng)，而且培養(yǎng)周期較長(zhǎng)、產(chǎn)量較低；除此之外，該菌大量液體培養(yǎng)技術(shù)尚未過(guò)關(guān)，故研制幽門(mén)螺桿菌全菌疫苗受到很大限制。
綜上所述，尋求一種能有效預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染而引起的胃炎和消化道潰瘍等相關(guān)性疾病，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的重要課題之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要填補(bǔ)上述現(xiàn)有技術(shù)中還存在的空缺，提供一種能有效預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染引起的胃炎和消化道潰瘍等相關(guān)性疾病，且制造成本較低的預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的基因重組口服疫苗及其制備方法。
本發(fā)明預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的基因重組口服疫苗是一種內(nèi)置LTB佐劑UreB-HpaA基因重組口服疫苗，它以大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位LTB為免疫增強(qiáng)佐劑、幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位UreB和幽門(mén)螺桿菌黏附素HpaA為抗原，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建ltB、ureB和hpaA基因人工融合基因ltB-ureB-hpaA及其原核表達(dá)系統(tǒng)，采用提純的重組表達(dá)產(chǎn)物的幽門(mén)螺桿菌基因工程疫苗。通過(guò)基因工程技術(shù)制備的兩種細(xì)菌三個(gè)基因構(gòu)成的融合基因原核表達(dá)系統(tǒng)及其產(chǎn)物，使該疫苗具有表達(dá)產(chǎn)物中同時(shí)含有重組佐劑rLTB及rUreB和rHpaA兩種重組蛋白抗原，從而能對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染引起的胃炎和消化道潰瘍等相關(guān)性疾病具有免疫預(yù)防效果，且還具有制備方法簡(jiǎn)便可靠、生產(chǎn)成本較為低廉等特點(diǎn)。
本發(fā)明預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的基因重組口服疫苗的制備方法及其效果鑒定步驟1)大腸桿菌ltB基因、幽門(mén)螺桿菌ureB和hpaA基因的克隆和測(cè)序及其原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建；2)ltB-ureB-hpaA人工融合基因及其原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建和測(cè)序；3)含IPTG的LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)目的重組蛋白rLTB-UreB-HpaA表達(dá)，SDS-PAGE和BioRad凝膠圖象分析系統(tǒng)確定表達(dá)情況和產(chǎn)量；4)Ni-NTA親和層析法提純r(jià)LTB-UreB-HpaA；rLTB-UreB-HpaA水溶液即可直接制備成口服滴丸。
上述的rLTB-UreB-HpaA還可經(jīng)冷凍干燥與藥用賦形劑磷酸鈣混合后制備成口服膠囊。
此后還采用GM1-ELISA對(duì)rLTB-UreB-HpaA分子中的rLTB佐劑活性進(jìn)行鑒定，采用幽門(mén)螺桿菌小鼠感染模型、小鼠胃黏膜標(biāo)本中幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)與鑒定、小鼠胃黏液中特異性S-IgA測(cè)定等方法，測(cè)定和確定口服免疫的幽門(mén)螺桿菌基因工程疫苗rLTB-UreB-HpaA的免疫保護(hù)作用及其局部特異性抗體產(chǎn)生情況。
本發(fā)明的有益效果是1)本發(fā)明通過(guò)人工融合基因及其原核表達(dá)的目的重組蛋白rLTB-UreB-HpaA提供一種預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染及其相關(guān)消化道疾病的多價(jià)口服基因工程疫苗，并采用GM1-ELISA、小鼠感染模型、特異性S-IgA測(cè)定等方法，證實(shí)該基因工程疫苗中rLTB仍保持有佐劑活性、口服免疫后可使90.9％小鼠不感染幽門(mén)螺桿菌、72.7～82.8％免疫小鼠產(chǎn)生特異性S-IgA；從而能有效預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染而引起的胃炎和消化道潰瘍等相關(guān)性疾病，從而解決了當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中尚無(wú)幽門(mén)螺桿菌疫苗產(chǎn)品、填補(bǔ)該疫苗產(chǎn)品的空缺；2)本發(fā)明方法制備的重組蛋白rLTB-UreB-HpaA是一種無(wú)害人體的細(xì)菌融合蛋白，制備方法安全可靠、成本較低，故易于推廣應(yīng)用；3)本發(fā)明預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的基因重組口服疫苗，是以口服滴丸或口服膠囊供人們服用故使用方便，而且還因制造成本低而價(jià)格較低，以利于推廣應(yīng)用。


圖1大腸桿菌44815株(E.coli strain 44815)ltB基因核苷酸和氨基酸序列(其中產(chǎn)不耐熱腸毒素的大腸桿菌44815株購(gòu)自北京中國(guó)藥品生物制品檢定所；下劃?rùn)M線區(qū)為引物序列；每排上一行為核苷酸序列，下一行為氨基酸序列；符號(hào)“*”代表終止密碼)；圖2.幽門(mén)螺桿菌Y06株(Helicobacter pylori strain Y06)ureB基因核苷酸和氨基酸序列(其中幽門(mén)螺桿菌Y06株分離自慢性胃炎患者胃黏膜活檢標(biāo)本；下劃?rùn)M線區(qū)為引物序列；每排上一行為核苷酸序列，下一行為氨基酸序列；符號(hào)“*”代表終止密碼)；圖3.幽門(mén)螺桿菌Y06株(Helicobacter pylori strain Y06)hpaA基因核苷酸和氨基酸序列(其中幽門(mén)螺桿菌Y06株分離自慢性胃炎患者胃黏膜活檢標(biāo)本，下劃?rùn)M線區(qū)為引物序列；每排上一行為核苷酸序列、下一行為氨基酸序列，符號(hào)“*”代表終止密碼)；圖4.大腸桿菌44815株(E.coli strain 44815)ltB基因及幽門(mén)螺桿菌Y06株(Helicobacterpylori strain Y06)ureB和hpaA基因的ltB-ureB-hpaA融合基因核苷酸和氨基酸序列(其中下劃?rùn)M線區(qū)為上、下游引物序列及連接引物位置，每排上一行為核苷酸序列、下一行為氨基酸序列，符號(hào)“*”代表終止密碼，大腸桿菌44815株ltB基因去除其終止密碼TAG，幽門(mén)螺桿菌Y06株ureB和hpaA基因均分別去除其啟動(dòng)密碼ATG及終止密碼TAG和TAA，表達(dá)載體pET42a的CTCGAG序列是用于亞克隆構(gòu)建表達(dá)載體的限制性核酸內(nèi)切酶XhoI位點(diǎn)，CACCACCACCACCACCACCACCAC序列是利用其編碼的8×His以用于Ni-NTA親和層析法提純目的表達(dá)產(chǎn)物，TAA為終止密碼以終止表達(dá))；
圖5感染小鼠胃黏膜標(biāo)本中位于胃小凹中的幽門(mén)螺桿菌(鍍銀染色，×1000倍)；圖6小鼠胃粘膜活檢標(biāo)本中分離培養(yǎng)的幽門(mén)螺桿菌(革蘭染色，×1000倍)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、本實(shí)施例預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的基因重組口服疫苗是采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建包括大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)B亞單位(LTB)及幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)和幽門(mén)螺桿菌尿黏附素(HpaA)基因的人工融合基因ltB-ureB-hpaA及其原核表達(dá)系統(tǒng)pET42a-ltB-ureB-hpaA-E.coli BL21DE3，以重組表達(dá)并獲取目的產(chǎn)物rLTB-UreB-HpaA作為疫苗佐劑和抗原，成為一種預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的內(nèi)置LTB佐劑UreB-HpaA基因重組口服疫苗；其中大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位LTB為免疫增強(qiáng)佐劑、幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位UreB和幽門(mén)螺桿菌黏附素HpaA為抗原，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建ltB、ureB和hpaA基因人工融合基因ltB-ureB-hpaA及其原核表達(dá)系統(tǒng)，采用提純的重組表達(dá)產(chǎn)物的幽門(mén)螺桿菌基因工程疫苗。
本發(fā)明研制基因工程疫苗對(duì)抗原及其基因的選擇所有幽門(mén)螺桿菌菌株均有編碼尿素酶基因并表達(dá)尿素酶，其中尿素酶B亞單位(UreB)具有序列保守、表達(dá)量高、表面分布、大分子量和顆粒狀結(jié)構(gòu)、抗原性強(qiáng)等特點(diǎn)，故將UreB作為幽門(mén)螺桿菌基因工程疫苗首選抗原；所有幽門(mén)螺桿菌菌株均有編碼幽門(mén)螺桿菌黏附素(HpaA)基因并表達(dá)HpaA，HpaA位于該菌表面的鞘膜蛋白，序列保守、表達(dá)量高、抗原性較強(qiáng)且與細(xì)菌黏附有關(guān)；因此將HpaA作為另一幽門(mén)螺桿菌基因工程疫苗抗原。
本發(fā)明基因工程疫苗采用口服疫苗的理由是注射免疫通常是誘生血清抗體；但從幽門(mén)螺桿菌侵入人體后只寄居在胃或十二指腸黏膜淺表部位、從未發(fā)現(xiàn)該菌侵入血流，由此可見(jiàn)血清抗體等抗感染免疫成分無(wú)預(yù)防或阻斷幽門(mén)螺桿菌感染的作用；而口服免疫主要誘導(dǎo)黏膜局部免疫應(yīng)答，且根據(jù)幽門(mén)螺桿菌感染及機(jī)體免疫應(yīng)答特點(diǎn)。因此，采用幽門(mén)螺桿菌口服疫苗才有可能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)作用。
基因工程疫苗雖具有抗原成分明確、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，但單一蛋白抗原構(gòu)成的疫苗免疫效果往往較差。近年有不少研究資料證明，大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)有很強(qiáng)的黏膜免疫佐劑活性。LT由兩種亞單位A(LTA)和B(LTB)組成，其中LTA是LT的毒性部位，LTB功能是黏附細(xì)胞而無(wú)毒性。已有不少文獻(xiàn)報(bào)道，LTB有很強(qiáng)的誘導(dǎo)黏膜免疫的活性，是良好的黏膜免疫佐劑。
若采用基因工程技術(shù)，將大腸桿菌LTB、幽門(mén)螺桿菌UreB和HpaA分別重組表達(dá)，必然增加生產(chǎn)成本。因此，本實(shí)施例采用不同基因人工融合技術(shù)，將ltB、ureB和hpaA三個(gè)基因串聯(lián)成為ltB-ureB-hpaA一個(gè)融合基因，然后構(gòu)建ltB-ureB-hpaA原核表達(dá)系統(tǒng)。ltB-ureB-hpaA原核表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)產(chǎn)物為rLTB-UreB-HpaA，其分子中同時(shí)含有黏膜免疫佐劑LTB、幽門(mén)螺桿菌抗原UreB和HpaA，不僅可因分子量增大而提高抗原性，并可有效地降低生產(chǎn)成本而有利于產(chǎn)業(yè)化。此外，還對(duì)rLTB-UreB-HpaA抗原性和免疫反應(yīng)性、表達(dá)產(chǎn)量和提純方法、佐劑活性、口服免疫小鼠后預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的效果等進(jìn)行了驗(yàn)證，rLTB-UreB-HpaA產(chǎn)量可達(dá)細(xì)菌總蛋白的35.5％，其中rLTB仍保持有佐劑活性，口服免疫后可使100％小鼠不感染幽門(mén)螺桿菌、91.7～100％小鼠產(chǎn)生特異性S-IgA，其結(jié)果表明，rLTB-UreB-HpaA可用于預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的基因重組口服疫苗。
本實(shí)施例預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的基因重組口服疫苗的制備方法包含以下的步驟1)大腸桿菌ltB基因、幽門(mén)螺桿菌ureB和hpaA基因的克隆和測(cè)序及其原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建；2)ltB-ureB-hpaA人工融合基因及其原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建和測(cè)序；3)含IPTG的LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)目的重組蛋白rLTB-UreB-HpaA表達(dá)，SDS-PAGE和BioRad凝膠圖象分析系統(tǒng)確定表達(dá)情況和產(chǎn)量；4)Ni-NTA親和層析法提純r(jià)LTB-UreB-HpaA。此外還采用GM1-ELISA對(duì)rLTB-UreB-HpaA分子中的rLTB佐劑活性進(jìn)行鑒定；采用幽門(mén)螺桿菌小鼠感染模型、小鼠胃黏膜標(biāo)本中幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)與鑒定、小鼠胃黏液中特異性S-IgA測(cè)定等方法，測(cè)定和確定口服免疫的幽門(mén)螺桿菌基因工程疫苗rLTB-UreB-HpaA的免疫保護(hù)作用及其局部特異性抗體產(chǎn)生情況。
本實(shí)施例中的產(chǎn)不耐熱腸毒素LT的大腸桿菌菌株分別可從我國(guó)法定菌種保藏單位或美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)、英國(guó)菌種保藏中心(NCTC)等國(guó)內(nèi)外菌種保藏單位購(gòu)得；產(chǎn)不耐熱腸毒素LT大腸桿菌44815株(E.coli strain 44815)購(gòu)自北京中國(guó)藥品生物制品檢定所；所有幽門(mén)螺桿菌均有ureB和hpaA基因，幽門(mén)螺桿菌菌株如ATCC26695、NCTC11637及國(guó)內(nèi)菌株，可分別從我國(guó)法定菌種保藏單位或美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)、英國(guó)菌種保藏中心(NCTC)購(gòu)得；本實(shí)施例中所用的幽門(mén)螺桿菌Y06株系從北京中國(guó)藥品生物制品檢定所購(gòu)得；本實(shí)施例中所用的一切實(shí)驗(yàn)用材料和試劑及相關(guān)設(shè)備均可從各自國(guó)內(nèi)外相關(guān)產(chǎn)業(yè)公司或國(guó)外公司國(guó)內(nèi)銷(xiāo)售代理公司購(gòu)得，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可從多個(gè)國(guó)內(nèi)大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心、各省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心等單位購(gòu)得。在微生物學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員，均可重復(fù)本實(shí)施例中的制備方法并進(jìn)行試用。
上述人工融合基因ltB-ureB-hpaA的制備方法是1)取用購(gòu)自北京中國(guó)藥品生物制品檢定所的產(chǎn)LT大腸桿菌44815株和幽門(mén)螺桿菌Y06株，大腸桿菌拉丁文名是Escherichia coli(E.coli)；幽門(mén)螺桿菌拉丁文名是Helicobacter pylori(H.pylori)；大腸桿菌44815株接種于LB瓊脂平板上，普通大氣中37℃培養(yǎng)24小時(shí)；幽門(mén)螺桿菌Y06株接種于加有5％脫纖維羊血的哥倫比亞瓊脂平板上，85％氮?dú)狻?0％二氧化碳、5％氧氣條件下37℃培養(yǎng)72小時(shí)；用滅菌生理鹽水收集細(xì)菌并反復(fù)離心、懸浮3次；2)分別取離心沉淀的大腸桿菌44815株和幽門(mén)螺桿菌Y06株菌體，用苯酚(pH7.8-8.0)-氯仿(1∶1，V∶V)提取、0.1倍3mol乙酸鈉和2倍體積無(wú)水乙醇沉淀獲得DNA；3)分別以大腸桿菌44815株和幽門(mén)螺桿菌Y06株DNA為模板，采用PCR分別擴(kuò)增全長(zhǎng)大腸桿菌ltB基因及全長(zhǎng)幽門(mén)螺桿菌ureB和hpaA基因，T-A克隆法插入克隆質(zhì)粒pUC-M-T中，然后3個(gè)重組克隆質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α株內(nèi)，用雙末端脫氧法測(cè)定目的基因核苷酸序列(如圖1～圖3所示)；3)采用連接引物PCR，將序列正確的ltB、ureB、hpaA連接成人工融合基因ltB-ureB-hpaA，T-A克隆法插入克隆質(zhì)粒pUC-M-T中，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α株內(nèi)，用雙末端脫氧法測(cè)定核苷酸序列(如圖4所示)。
上述原核表達(dá)系統(tǒng)pET42a-ltB-ureB-hpaA-E.coli BL21DE3的制備方法是1)在LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增含pET42a質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α株，采用小量堿變性法提取pET42a質(zhì)粒，限制性核酸內(nèi)切酶NdeI和XhoI酶切，使pET42a線性化；2)在LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增重組質(zhì)粒pUC-M-T-ltB-ureB-hpaA，采用小量堿變性法提取該質(zhì)粒，限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和XhoI酶切，1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離酶切目的片段ltB-ureB-hpaA；3)將線性化pET42a和酶切目的片段ltB-ureB-hpaA等比混合，T4連接酶37℃連接12小時(shí)，獲得目的重組表達(dá)質(zhì)粒pET42a-ltB-ureB-hpaA；3)在LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增大腸桿菌BL21DE3株，將目的重組表達(dá)質(zhì)粒pET42a-ltB-ureB-hpaA轉(zhuǎn)入該菌中，獲得原核表達(dá)系統(tǒng)pET42a-ltB-ureB-hpaA-E.coliBL21DE3，用雙末端脫氧法測(cè)定核苷酸序列，確保在E.coli BL21DE3中含有序列正確的表達(dá)質(zhì)粒pET42a-ltB-ureB-hpaA。
上述目的重組表達(dá)產(chǎn)物rLTB-UreB-HpaA的表達(dá)和提純方法是1)在LB液體培養(yǎng)基中接種pET42a-ltB-ureB-hpaA-E.coli BL21DE3，30℃或37℃、300轉(zhuǎn)/分鐘旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)4小時(shí)，加入0.5mol/L的IPTG，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)4～6小時(shí)；2)超聲破碎離心收集的細(xì)菌，過(guò)Ni-NTA親和層析柱，利用重組表達(dá)目的產(chǎn)物rLTB-UreB-HpaA的C端6×His標(biāo)簽，分離、洗脫、收集目的重組表達(dá)產(chǎn)物rLTB-UreB-HpaA。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下1)pET42a-ltB-ureB-hpaA-E.coli BL21DE3可有效表達(dá)rLTB-UreB-HpaA，產(chǎn)量可達(dá)細(xì)菌總蛋白的35.5％；2)Ni-NTA親和層析后rLTB-UreB-HpaA可達(dá)到電泳純。
為證實(shí)目的重組表達(dá)產(chǎn)物rLTB-UreB-HpaA的抗原性、免疫反應(yīng)性和佐劑活性，分別以rLTB-UreB-HpaA為抗原免疫家兔觀察特異性抗體產(chǎn)生情況、以rLTB-UreB-HpaA為抗原檢測(cè)其與幽門(mén)螺桿菌全菌抗體(購(gòu)自DAKO公司)的免疫結(jié)合反應(yīng)、以rLTB-UreB-HpaA為包被分子檢測(cè)其與牛神經(jīng)節(jié)苷酯GM1的結(jié)合能力。
目的重組表達(dá)產(chǎn)物rLTB-UreB-HpaA的抗原性、免疫反應(yīng)性和佐劑活性實(shí)驗(yàn)分別描述如下1)抗原性檢測(cè)體重2.5～3.0kg家兔皮內(nèi)多點(diǎn)注射rLTB-UreB-HpaA，每次劑量1mg，間隔一周注射一次，共4次；末次注射后第10天，抽取免疫家兔心血、分離血清，以rLTB-UreB-HpaA為抗原，用瓊脂雙擴(kuò)散法或Western雜交法鑒定血清中有無(wú)rLTB-UreB-HpaA特異性抗體及其效價(jià)；2)免疫反應(yīng)性檢測(cè)以rLTB-UreB-HpaA為抗原，用Western雜交法檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌全菌抗體能否識(shí)別rLTB-UreB-HpaA并與之結(jié)合；3)佐劑活性檢測(cè)由于LTB佐劑活性主要取決于其與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷酯GM1的結(jié)合能力，故以牛神經(jīng)節(jié)苷酯GM1為包被分子，采用免疫酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)rLTB-UreB-HpaA抗血清與牛神經(jīng)節(jié)苷酯GM1的結(jié)合能力。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下1)rLTB-UreB-HpaA免疫家兔后可產(chǎn)生特異性抗體，其瓊脂雙擴(kuò)散法效價(jià)為1∶8、Western雜交法效價(jià)1∶1000；2)稀釋度高達(dá)1∶3000的幽門(mén)螺桿菌全菌抗體能識(shí)別rLTB-UreB-HpaA并與之結(jié)合，形成明顯的特異性黑褐色雜交條帶；3)佐劑活性檢測(cè)rLTB-UreB-HpaA抗血清能與牛神經(jīng)節(jié)苷酯GM1結(jié)合，其OD490均值±SD為0.52±0.11，高于陰性對(duì)照的0.05±0.02的3倍以上，故判為有較強(qiáng)的牛神經(jīng)節(jié)苷酯GM1結(jié)合能力。
為證實(shí)目的重組表達(dá)產(chǎn)物rLTB-UreB-HpaA動(dòng)物免疫保護(hù)效果，首先建立了幽門(mén)螺桿菌SS1株BALB/c小鼠感染模型，并采用感染小鼠胃黏膜活檢標(biāo)本鍍銀染色、胃黏膜活檢標(biāo)本中幽門(mén)螺桿菌分離培養(yǎng)、分離菌株染色鏡檢和生化反應(yīng)，對(duì)小鼠感染模型進(jìn)行鑒定。BALB/c小鼠分別口服免疫rUreB、rHpaA、rLTB+rUreB、rLTB+rHpaA、rLTB-UreB-HpaA后，按建立小鼠感染模型中所用幽門(mén)螺桿菌SS1株感染劑量和次數(shù)進(jìn)行攻擊，然后采用小鼠胃黏膜活檢標(biāo)本中幽門(mén)螺桿菌分離培養(yǎng)、分離菌株染色鏡檢和生化反應(yīng)，對(duì)不同疫苗抗原組合對(duì)小鼠的免疫保護(hù)作用進(jìn)行驗(yàn)證，并檢測(cè)小鼠血清IgA和胃液S-IgA。
幽門(mén)螺桿菌SS1株BALB/c小鼠感染模型、不同疫苗抗原組合對(duì)小鼠的免疫保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)分別描述如下1)幽門(mén)螺桿菌感染小鼠模型的建立用pH7.4、0.01mol/L的PBS收集幽門(mén)螺桿菌SS1株新鮮培養(yǎng)物，采用麥?zhǔn)媳葷岱ù_定濃度后，用布氏肉湯分別配制成濃度為5×1010CFU/ml菌液；BALB/c小鼠由上海復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)雌性6～8周齡體重18±1g的BALB/c小鼠感染前12小時(shí)禁食不禁水、前0.5小時(shí)灌胃0.1mol/L NaHCO30.2ml中和胃酸，將小鼠分成免疫組、感染組和對(duì)照組，每組12只，試驗(yàn)組和感染組小鼠每只灌胃5×1010CFU/ml菌液0.2ml(1×1010CFU)，對(duì)照組小鼠每只灌胃無(wú)菌布氏肉湯0.2ml，共灌喂3次，每次間隔1d，每次感染后4小時(shí)內(nèi)禁食禁水；2)幽門(mén)螺桿菌分離與鑒定小鼠末次感染后4周斷頸處死，每只小鼠取胃竇部組織標(biāo)本2塊，1塊組織勻漿后接種于用于8％脫纖維羊血哥倫比亞瓊脂平板上，以分離培養(yǎng)幽門(mén)螺桿菌，殘留勻漿用于快速尿素酶試驗(yàn)，另1塊組織用10％甲醛溶液固定、包埋、切片后用Warthin-Starry鍍銀染色法檢查；將瓊脂平板上生長(zhǎng)的疑似菌落增菌后，進(jìn)行革蘭染色鏡檢、快速尿素酶和氧化酶試驗(yàn)，若菌體為革蘭陰性弧狀或海鷗狀、尿素酶和氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性者鑒定為幽門(mén)螺桿菌；3)免疫保護(hù)試驗(yàn)分別將rLTB、rUreB、rHpaA、rLTB-UreB-HpaA溶于pH7.4、0.01mol/L PBS中；將BALB/c小鼠分成5個(gè)試驗(yàn)組和2個(gè)對(duì)照組，每組12只；5個(gè)試驗(yàn)組小鼠分別用rUreB、rHpaA、rLTB+rUreB、rLTB+rHpaA、rLTB-UreB-HpaA進(jìn)行免疫，末次免疫后第28、30、32d灌胃5×1010CFU/ml的幽門(mén)螺桿菌SS1株懸液0.2ml(1×1010CFU)，對(duì)照組分為感染但不免疫的感染對(duì)照組和不免疫、不感染的正常對(duì)照組，感染前后的處理與幽門(mén)螺桿菌感染小鼠模型中相同；小鼠末次感染后第4周，眼眶后竇采血并分離血清，小鼠斷頸處死后取小鼠胃體部分，用3ml終濃度為50mmol/L EDTA、20nmol/L蛋白酶抑制劑亮肽素和胃酶抑素的0.01mol/L PBS(pH7.4)中反復(fù)漂洗，1000r/min離心10分鐘后取上清，加入20μl 100mmol/L PMSF，再15000r/min4℃離心20分鐘，取上清加入0.1ml小牛血清，以上采集的血清和胃液標(biāo)本用于檢測(cè)抗體；小鼠胃竇組織標(biāo)本采集及檢查均與幽門(mén)螺桿菌感染小鼠模型中相同；4)血清IgA和胃漂洗液S-IgA檢測(cè)以0.1ml包被緩沖液配制的20μg/ml rUreB或rHpaA為包被抗原、胃漂洗液或1∶200稀釋的血清為一抗、兔抗鼠lgA為二抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為三抗，鄰苯二胺為底物，用ELISA檢測(cè)各標(biāo)本中S-IgA或血清IgA，若受檢標(biāo)本OD490值≥正常對(duì)照組小鼠OD490均值+3SD為陽(yáng)性。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下1)模型小鼠幽門(mén)螺桿菌感染率小鼠胃組織標(biāo)本用Warthin-Starry鍍銀染色法檢查均可查見(jiàn)黑色的幽門(mén)螺桿菌(圖5)，胃組織標(biāo)本中幽門(mén)螺桿菌分離陽(yáng)性率可達(dá)100％并有典型形態(tài)，如圖6所示；2)免疫保護(hù)率rUreB或rHpaA為疫苗抗原時(shí)免疫保護(hù)率均為66.7％，rLTB+rUreB或rLTB+rHpaA為疫苗抗原時(shí)免疫保護(hù)率均為83.3％，rLTB+rUreB+rHpaA為疫苗抗原時(shí)免疫保護(hù)率為90.9％，rLTB-rUreB-rHpaA為疫苗抗原時(shí)免疫保護(hù)率可達(dá)100％(參見(jiàn)下列的表1)；3)血清IgA和胃漂洗液S-IgA陽(yáng)性率rUreB或rHpaA為疫苗抗原時(shí)，IgA和S-IgA均為陰性；rLTB+rUreB或rLTB+rHpaA為疫苗抗原時(shí)，rUreB和rHpaA的IgA陽(yáng)性率均為25.0％、rUreB和rHpaA的S-IgA陽(yáng)性率分別為63.6％和50.0％，rLTB+rUreB+rHpaA為疫苗抗原時(shí)，rUreB和rHpaA的IgA陽(yáng)性率分別為33.3％和25.0％，rUreB和rHpaA的S-IgA陽(yáng)性率分別為81.8％和72.7％；rLTB-UreB-HpaA為疫苗抗原時(shí)，rUreB和rHpaA的IgA陽(yáng)性率均75.0％，rUreB和rHpaA的S-IgA陽(yáng)性率分別為100％和91.7％(參見(jiàn)下列的表2)。
綜上所述，rLTB-UreB-HpaA能形成一種口服幽門(mén)螺桿菌基因工程疫苗產(chǎn)品而用于預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的相關(guān)疾病。
表1免疫小鼠胃粘膜標(biāo)本中幽門(mén)螺桿菌SS1株分離陽(yáng)性率和免疫保護(hù)率(n＝12)

注“+”表示將不同的單一成分混合；“-”表示一個(gè)融合基因表達(dá)蛋白分子中所包含的不同基因產(chǎn)物。
表2免疫小鼠特異性血清IgA和胃液S-IgA檢測(cè)結(jié)果(n＝12)


注“+”表示將不同的單一成分混合；“-”表示一個(gè)融合基因表達(dá)蛋白分子中所包含的不同基因產(chǎn)物實(shí)施例2、本實(shí)施例預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的基因重組口服疫苗是將疫苗抗原rLTB-UreB-HpaA水溶液直接制備成口服滴丸，其水溶液的濃度可為1mg/ml；還可將rLTB-UreB-HpaA冷凍干燥后與藥用賦形劑磷酸鈣混合后制備成口服膠囊，其中的磷酸鈣也有較弱的佐劑活性。每?？诜z囊內(nèi)含100～500μg，該量的大小可視不同的對(duì)象進(jìn)行選擇，不同的性別、不同的年齡段的人，其用量不同；甚至還可在不同的動(dòng)物中以不同劑量進(jìn)行喂給。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的基因重組口服疫苗其是一種內(nèi)置LTB佐劑UreB-HpaA基因重組口服疫苗，它以大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位LTB為免疫增強(qiáng)佐劑、幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位UreB和幽門(mén)螺桿菌黏附素HpaA為抗原，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建ltB、ureB和hpaA基因人工融合基因ltB-ureB-hpaA及其原核表達(dá)系統(tǒng)，采用提純的重組表達(dá)產(chǎn)物的幽門(mén)螺桿菌基因工程疫苗。
2.一種制備權(quán)利要求1所述預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的基因重組口服疫苗的方法，它包含以下的步驟1)大腸桿菌ltB基因、幽門(mén)螺桿菌ureB和hpaA基因的克隆和測(cè)序及其原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建；2)ltB-ureB-hpaA人工融合基因及其原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建和測(cè)序；3)含IPTG的LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)目的重組蛋白rLTB-UreB-HpaA表達(dá)，SDS-PAGE和BioRad凝膠圖象分析系統(tǒng)確定表達(dá)情況和產(chǎn)量；4)Ni-NTA親和層析法提純r(jià)LTB-UreB-HpaA；5)采用GM1-ELISA對(duì)rLTB-UreB-HpaA分子中的rLTB佐劑活性進(jìn)行鑒定；6)采用幽門(mén)螺桿菌小鼠感染模型、小鼠胃黏膜標(biāo)本中幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)與鑒定、小鼠胃黏液中特異性S-IgA測(cè)定等方法，測(cè)定和確定口服免疫的幽門(mén)螺桿菌基因工程疫苗rLTB-UreB-HpaA的免疫保護(hù)作用及其局部特異性抗體產(chǎn)生情況。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的基因重組口服疫苗的方法，其特征是所說(shuō)的rLTB-UreB-HpaA水溶液直接制備成口服滴丸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的基因重組口服疫苗的方法，其特征是所說(shuō)的rLTB-UreB-HpaA經(jīng)冷凍干燥后與藥用賦形劑磷酸鈣混合后制備成口服膠囊。
全文摘要
用于預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染而引起的胃炎和消化道潰瘍等相關(guān)性疾病的預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的基因重組口服疫苗及其制備方法。它是一種以大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位LTB為免疫增強(qiáng)佐劑、幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位UreB和幽門(mén)螺桿菌黏附素HpaA為抗原，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建ltB、ureB和hpaA基因人工融合基因ltB－ureB－h(huán)paA及其原核表達(dá)系統(tǒng)，采用提純的重組表達(dá)產(chǎn)物的內(nèi)置LTB佐劑UreB－HpaA基因重組口服疫苗。在以GM1－ELISA、小鼠感染模型、特異性S－IgA測(cè)定等方法證實(shí)rLTB－UreB－HpaA無(wú)害人體，且能以口服滴丸或口服膠囊供人們服用、防病，并且制造成本較低、以利于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K47/02GK1973903SQ20061015504
公開(kāi)日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2006年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月4日
發(fā)明者嚴(yán)杰, 毛亞飛 申請(qǐng)人:嚴(yán)杰, 毛亞飛