專利名稱：硫酸化多糖在制備抗凝血活性藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，是一種用于治療和預(yù)防血栓疾病的藥物，具體 地說(shuō)是硫酸化多糖在制備抗凝血活性藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)背景血栓形成或栓塞是導(dǎo)致心、腦和外周血管事件的最后關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是致 死和致殘的直接原因。動(dòng)脈和靜脈系統(tǒng)發(fā)生機(jī)制略有區(qū)別，動(dòng)脈系統(tǒng)以血 小板的激活為主，靜脈血栓以凝血系統(tǒng)的激活為主。血栓疾病是最常見的心腦血管疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)WHO 報(bào)道，每年心腦血管疾病所致死亡大約1700萬(wàn)例，占各種原因死亡中的1/3。 2001年美國(guó)因心腦血管疾病所致死亡931108例，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于第二位死因的腫 瘤。我國(guó)1997年資料顯示，城市心臟病為第4位死亡原因，腦血管病為第 一大死因。自1958年以來(lái)，我國(guó)心腦血管病發(fā)病率上升了4倍，占全年死 亡人口的1/3，而目前的發(fā)病趨勢(shì)升高更快，每15秒就有一位中國(guó)人被心 腦血管病奪取生命，每22秒就有一位中國(guó)人因此喪失工作能力，預(yù)計(jì)到2020 年，心腦血管疾病將成為致殘和致死的首位因素。因此，血栓疾病患者已 日益成為現(xiàn)代都市人的一大健康殺手，應(yīng)引起我們足夠的重視。目前血栓 性疾病的治療主要是抗血小板治療(阿司匹林、ADP受體拮抗劑、GPlIb/IIIa 拮抗劑)和抗凝治療(普通肝素、低分子肝素)?？鼓幨且活惛蓴_凝血因子藥物，可以阻止血液凝固。主要用于血 栓栓塞性疾病的預(yù)防與治療，臨床應(yīng)用主要以肝素類產(chǎn)品為主。肝素具有 起效迅速，在體內(nèi)外均有抗凝的作用。但肝素亦有一些副效應(yīng)，如l.肝素 具有耐藥性；2.有一定的降壓作用；3.肝素可誘發(fā)血小板減少，使得骨髓 巨核細(xì)胞增生，周圍血小板崩解，免疫試驗(yàn)異常。此外，以肝素鈉形式出 售的肝素類抗凝劑價(jià)格昂貴，國(guó)際上肝素鈉的銷售價(jià)為900美元/億單位。 所以，尋找一種既具有抗凝血又無(wú)其他副作用且價(jià)格比較便宜的新藥已成 為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)硫酸化多糖具有同肝素一樣的 抗凝血活性，但卻沒(méi)有肝素的抗血小板副作用。如Martinichen-Herrero等對(duì) 半乳葡萄甘露聚糖(GGM)進(jìn)行了硫酸化，PreeyanatVongchan等制備的三 種不同分子量的硫酸化殼聚糖，Han等制備的硫酸化海藻多糖YCP，得到 三種硫酸化衍生物YCP-SL， YCP-SM禾QYCP-SH，并對(duì)其抗凝血活性進(jìn) 行了探索，發(fā)現(xiàn)該硫酸化的多糖具有很強(qiáng)的抗凝血活性，所以，硫酸化多 糖有望成為肝素在治療凝血方面的替代品?；诖耍景l(fā)明對(duì)資源豐富， 價(jià)格便宜的菊粉進(jìn)行了硫酸化修飾，并對(duì)其抗凝血活性進(jìn)行了研究。菊粉(Inuin)又名菊糖，是由D-呋喃果糖分子以P-2， 1-糖卄鍵連接
而成的果聚糖，每個(gè)菊粉分子末端以ot-l， 2-糖苷鍵連接1個(gè)葡萄糖殘基， 聚合度(DP)通常為2 60。是一種蔬菜膳食纖維，來(lái)源于菊芋、菊苣等植 物的一種功能性多糖——果聚糖，也是目前發(fā)現(xiàn)的最易溶解的膳食纖維， 具有增殖人體內(nèi)雙歧桿菌，促進(jìn)腸胃功能等作用。由于菊粉資源非常豐富， 可以經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾進(jìn)行改性，譬如硫酸化、磷酸化、酯化等反應(yīng)，尋找具有新活性的衍生物。文獻(xiàn)l:主要闡述了硫酸化多糖的化學(xué)制備方法(文獻(xiàn)l.Gengyuan T， Shoutong L， Maili S, Mingshi Z， Wen L. Synthesis of Jc/zjraw^zes Z)/^w/^" polysaccharide sulfate and its antivirus activity. Acta Pharmaceutica Sinica 1995,30(2): 107-111))。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種具有顯著抗凝血活性作用的硫酸化多糖的 制備及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為 硫酸化多糖在制備抗凝血活性藥物中的應(yīng)用 所述硫酸化菊粉具體制備過(guò)程為，1) 將附有冷凝管和攪拌裝置的容器置冰鹽浴中，加入吡啶，攪拌，使 之充分冷卻，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸，氯磺酸與吡啶的體積比例為 1:5 1:8;2) 滴加完畢，待瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體后，加入菊粉，氯磺酸與菊 粉的體積質(zhì)量比例為2:1 5:1，于(MO(TC恒溫?cái)嚢瑁磻?yīng)時(shí)間為0.5 1.5h;3 )將反應(yīng)液傾入冰水中，NaOH調(diào)pH值至7，加入3-5倍體積的95% 的乙醇，4。C靜置過(guò)夜，析出沉淀，離心，收集沉淀，并將沉淀溶于少量水 中；醇沉水溶重復(fù)3次；產(chǎn)物在6(TC減壓濃縮得硫酸化菊粉；經(jīng)過(guò)抗凝血 實(shí)驗(yàn)證明，具有顯著的抗凝血活性。所述反應(yīng)溫度最好為0~60°C 。所述治療和預(yù)防血栓疾病的藥物可制備成為治療血栓疾病的丸劑、散 齊U、片劑、膏劑、粉劑、針劑、水劑、顆粒劑、注射劑等各種劑型的藥物; 保健食品形態(tài)可以是液體的比如像清涼飲料，乳酸飲料，調(diào)味品，作為添 加劑，比如加入到面食類，果凍，冰淇淋，腌制品，火腿，點(diǎn)心等。 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn) l.效果顯著。本發(fā)明利用氯磺酸-吡啶法，對(duì)菊粉進(jìn)行化學(xué)修飾。通過(guò) 改變反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、氯磺酸與吡啶的比例以及氯磺酸與菊粉的比例， 得到了不同取代度的硫酸化的菊粉(sulfatedInulin)。對(duì)硫酸化菊粉進(jìn)行抗凝 血活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同取代度的硫酸化菊粉都能明顯的延長(zhǎng)凝血酶原時(shí)間 (prothrombin time, PT)、凝血酶時(shí)間(thrombin time, TT)、活化部分凝血酶 原激酶時(shí)間(Activated partial thrombinplastin time, APTT)，具有顯著的抗凝 血活性，這為研究開發(fā)抗血栓藥物、保健食品或食品添加劑奠定了基礎(chǔ)。2.原料來(lái)源廣泛，制備方法簡(jiǎn)便。菊科植物--菊芋塊莖中含有15-17%的 菊粉，為菊粉含量最高的植物，目前菊粉的市場(chǎng)價(jià)格為2.8萬(wàn)元/噸左右。 另外，硫酸化菊粉制備所用的試劑均為常見試劑，反應(yīng)容易操作，可適合 大規(guī)模生產(chǎn)。3. 發(fā)展前景廣闊。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究不同取代度的硫酸化菊粉抗凝血 活性，為新的治療和防治血栓疾病藥物的研究與開發(fā)提供一定的理論依據(jù)， 可在此基礎(chǔ)之上，對(duì)其抗凝血機(jī)理進(jìn)一步研究，以期設(shè)計(jì)開發(fā)出更高效的 治療和防治血栓疾病的藥物。4. 意義深遠(yuǎn)。本發(fā)明中的硫酸化菊粉抗凝血活性，不僅對(duì)于血栓疾病的 治療和保健，對(duì)于其它心血管疾病，如充血性心臟病，心肌梗塞，糖尿病 腎病及腎功能障礙等疾病的治療中均能具有一定的作用。菊粉來(lái)源豐富， 硫酸化菊粉衍生物的制備條件容易操作，可適合大規(guī)模生產(chǎn)；抗凝血效果 顯著，發(fā)展前景廣闊，意義深遠(yuǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1將附有冷凝管和攪拌裝置的100ml的三頸燒瓶置于冰鹽浴中，加入 16ml吡啶，攪拌，使之充分冷卻，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸2ml。滴加 完畢，待瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體后，加入菊粉1.0g，迅速將三頸瓶移入 6(TC水浴中，恒溫?cái)嚢鑜h左右，冷至室溫，將反應(yīng)液傾入冰水中，用NaOH 調(diào)pH值至7.05，加入四倍體積的95%的乙醇，4。C靜置過(guò)夜，析出沉淀， 離心，收集沉淀，并將沉淀溶于少量水中。反復(fù)醇沉水溶3次。產(chǎn)物在60°C 減壓干燥得硫酸化菊粉(S^)。實(shí)施例2將附有冷凝管和攪拌裝置的100ml的三頸燒瓶置于冰鹽浴中，加入 30ml吡啶，攪拌，使之充分冷卻，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸6ml。滴加 完畢，待瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體后，加入菊粉1.0g，迅速將三頸瓶移入 IO(TC水浴中，恒溫?cái)嚢?.5h左右，冷至室溫，將反應(yīng)液傾入冰水中，用 NaOH調(diào)pH值至7.08，加入四倍體積的95%的乙醇，4。C靜置過(guò)夜，析出 沉淀，離心，收集沉淀，并將沉淀溶于少量水中。反復(fù)醇沉水溶3次。產(chǎn) 物在6(TC減壓干燥得硫酸化的菊粉(SI2)。實(shí)施例39(Hil抗凝血漿分別和l(Hil終濃度為1.6mg/ml的SI，、Sl2混合后于37。C 下孵育lmin，然后將預(yù)先在37。C下孵育10min的PT試劑200^1加入上述 溶液，記錄凝固時(shí)間。按照經(jīng)典的抗凝血試驗(yàn)測(cè)定方法，SIp Sl2在濃度 為1.6mg/ml時(shí)所測(cè)的PT時(shí)間分別為大于600秒和31.4 ±4.53，均明顯的 高于空白對(duì)照組PT時(shí)間10.6±0.52，因而具有顯著的抗凝血活性。實(shí)施例4卯^il抗凝血漿分別和10nl終濃度為0.4mg/ml的SI,、Sl2混合后于37。C 下孵育lmin，然后將預(yù)先在37。C下孵育10min的PT試劑20(^1加入上述 溶液，記錄凝固時(shí)間。按照經(jīng)典的抗凝血試驗(yàn)測(cè)定方法，SI,、 Sl2在濃度 為0.4mg/ml時(shí)，所測(cè)的PT時(shí)間分別31.1±1.57和13.9±1.91，均明顯的高 于空白對(duì)照組PT時(shí)間10.6士0.52，因而具有顯著的抗凝血活性。 實(shí)施例590^1抗凝血漿分別和10^1終濃度為40嗎/ml的SI,、Sl2混合后于37°C 下孵育lmin，將IO(VIAPTT試劑加入上述混合物，37。C下孵育6min，然 后加10(^1濃度為25mmol/LCaCl2溶液，記錄凝固時(shí)間。按照經(jīng)典的抗凝 血試驗(yàn)測(cè)定方法，SI,和Sl2在濃度為40pg/ml時(shí)，測(cè)定的APPT時(shí)間分別 為122.2±7.25和38.6±1.91，均明顯高于空白對(duì)照組APPT時(shí)間25.8±0.46， 因而具有顯著的抗凝血活性。實(shí)施例690^1抗凝血漿分別和10nl終濃度為10ng/ml的SI,、Sl2混合后于37°C 下孵育lmin，將100jAlAPTT試劑加入上述混合物，37。C下孵育6min，然 后加10(Vl濃度為25mmol/LCaCl2溶液，記錄凝固時(shí)間。按照經(jīng)典的抗凝 血試驗(yàn)測(cè)定方法，SI,和Sl2在濃度為10ng/ml時(shí)，測(cè)定的APPT時(shí)間分別 為41.3±1.33和28.4士0.35，均明顯高于空白對(duì)照組APPT時(shí)間25.8±0.46， 因而具有顯著的抗凝血活性。實(shí)施例790H1抗凝血漿分別和10|il終濃度為40|ig/ml的SI"Sl2混合后于37°C 下孵育2min，提前溫育5min的20(^1 TT試劑加入上述混合物，記錄凝固 時(shí)間。按照經(jīng)典的抗凝血試驗(yàn)測(cè)定方法，S^和Sl2在濃度為40iig/ml時(shí)， 測(cè)定的TT時(shí)間分別為36±5.23和20.4±2.71 ，均明顯的高于空白對(duì)照組TT 時(shí)間16.3±0，因而具有顯著的抗凝血活性。實(shí)施例8抗凝血漿分別和10nl終濃度為10嗎/ml的SI,、Sl2混合后于37°C 下孵育2min，提前溫育5min的20(^1 TT試劑加入上述混合物，記錄凝固 時(shí)間。按照經(jīng)典的抗凝血試驗(yàn)測(cè)定方法，SI,和Sl2在濃度為10ng/ml時(shí)， 測(cè)定的TT時(shí)間分別為21.9±1.70和20.8土2.77，均明顯的高于空白對(duì)照組 TT時(shí)間16.3士0，因而具有顯著的抗凝血活性。附文字說(shuō)明實(shí)施例中抗凝血活性的測(cè)試過(guò)程(參照文獻(xiàn)(2)、 (3)、 (4)、主要闡述了硫酸化多糖的抗凝血活性及其抗凝血活性機(jī)理的研究，文獻(xiàn)2:(文獻(xiàn)2Matsubara K， Matsuura Y, Bacic A, 'Ming-Long,L, Hori，K， Miyazawa K. Anticoagulant properties of a sulfated galactan preparation from a marine green alga, Codium cylindric亂Biological Macromolecules 2001,28:395-399);文獻(xiàn)3:(文獻(xiàn)3. Martinichen-Herrero J.C, Carbonero E.R， Sassaki G.L. Anticoagulant and antithrombotic activities of a chemically sulfated galactoglucomannan obtained from the lichen Oac/固'a 飾》固e. Biological Macromolecules 2005，35:97-102);文獻(xiàn)4:(文獻(xiàn)4. Fang H， Wenbing Y, Xiaobing Y, Xiaoni L， Xiangdong G.. Experimental study on anticoagulant and antiplatelet aggregation activity of a chemically sulfated marine polysaccharide YCP.Biological Macromolecules 2005，36:201陽(yáng)207.)，并調(diào)整實(shí)驗(yàn)試齊U/i量進(jìn)行抗凝血活 性測(cè)試)
從DADEBEHRING公司(USA)購(gòu)買試劑PT、 APTT、 TT。凝血儀器 從日本Sysmex公司購(gòu)買，型號(hào)為CA-6000。按照經(jīng)典的測(cè)定凝血的方法(文獻(xiàn)(2)、 (3)、 (4))，測(cè)定不同取代度 和不同濃度的硫酸化菊粉對(duì)凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血酶原激酶時(shí) 間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)的影響(PT為外源性凝血系統(tǒng)較理想和常 用的實(shí)驗(yàn)；APTT和TT為內(nèi)源性凝血系統(tǒng)較敏感和常用的篩選實(shí)驗(yàn))?？?凝血實(shí)驗(yàn)以肝素為陽(yáng)性對(duì)照。發(fā)現(xiàn)，兩種不同取代度的硫酸化菊粉在所試 驗(yàn)的不同濃度中都明顯的延長(zhǎng)了PT、 APTT、 TT，具有顯著的抗凝血活性， 其作用效果略弱于肝素；由上述實(shí)施例說(shuō)明根據(jù)經(jīng)典的抗凝血活性測(cè)試結(jié)果表明，硫酸化菊粉 具有顯著抗凝血活性。氯磺酸與菊粉的比例為2:1 5:1，氯磺酸與吡啶的比 例為1:5 1:8，反應(yīng)時(shí)間為0.5 1.5h，反應(yīng)溫度為0 6(TC時(shí)制備的硫酸化菊 粉衍生物的抗凝血效果與氯磺酸與菊粉的比例為5:1 10:1，氯磺酸與吡啶的 比例為1:1 1:5，反應(yīng)時(shí)間為L(zhǎng)5 3.0h，反應(yīng)溫度為60 100。C時(shí)制備的硫酸 化菊粉均具有顯著的抗凝血效果，且前者效果略強(qiáng)于后者。上述衍生物可 以作為治療和預(yù)防血栓疾病的藥物、保健食品或食品添加劑。
權(quán)利要求
1. 硫酸化多糖在制備抗凝血活性藥物中的應(yīng)用。
2. 按照權(quán)利要求1所述硫酸化多糖在制備抗凝血活性藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述硫酸化菊粉具體制備過(guò)程為，1) 將附有冷凝管和攪拌裝置的容器置冰鹽浴中，加入吡啶，攪拌，使 之充分冷卻，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸，氯磺酸與吡啶的體積比例為1:5 —1:8;2) 滴加完畢，待瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體后，加入菊粉，氯磺酸與菊 粉的體積質(zhì)量比例為2:1—5:1，于0—10(TC恒溫?cái)嚢瑁磻?yīng)時(shí)間為0.5— 1. 5h;3) 將反應(yīng)液傾入冰水中，NaOH調(diào)pH值至7，加入3-5倍體積的95% 的乙醇，4。C靜置過(guò)夜，析出沉淀，離心，收集沉淀，并將沉淀溶于少量水 中；醇沉水溶重復(fù)3次；產(chǎn)物在6(TC減壓濃縮得硫酸化菊粉；經(jīng)過(guò)抗凝血 實(shí)驗(yàn)證明，具有顯著的抗凝血活性。
3. 按照權(quán)利要求2所述硫酸化多糖在制備抗凝血活性藥物中的應(yīng)用， 其特征在于所述反應(yīng)溫度為0—60°C。
4. 按照權(quán)利要求1所述硫酸化多糖在制備抗凝血活性藥物中的應(yīng)用， 其特征在于所述硫酸化菊粉可以用于制備治療和預(yù)防血栓疾病的藥物或 保健食品，其能與輔料混合形成的丸劑、散劑、片劑、膏劑，粉劑，針劑、 水劑，顆粒劑、膠囊或注射劑。
5. 按照權(quán)利要求1所述硫酸化多糖在制備抗凝血活性藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物在使用時(shí)可以采取經(jīng)口腔或非經(jīng)口腔的給藥方式； 非經(jīng)口腔的方式可以采取皮下、靜脈注射或肛腸給藥；注射液的使用可以 任意選用生理鹽水，葡萄糖，穩(wěn)定劑，防腐劑，懸浮劑或乳化劑。
6. 按照權(quán)利要求4所述硫酸化多糖在制備抗凝血活性藥物中的應(yīng)用， 其特征在于所述保健食品形態(tài)可以是液體的清涼飲料、乳酸飲料或調(diào)味 品；或固體面食類、果凍、冰淇淋、腌制品、火腿或點(diǎn)心。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，是一種用于治療和預(yù)防血栓疾病的藥物，具體地說(shuō)是硫酸化多糖在制備抗凝血活性藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)為菊粉來(lái)源豐富，硫酸化菊粉衍生物的制備條件容易操作，可適合大規(guī)模生產(chǎn)；抗凝血效果顯著，發(fā)展前景廣闊，意義深遠(yuǎn)。
文檔編號(hào)A61K31/737GK101209260SQ20061015581
公開日2008年7月2日 申請(qǐng)日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者杜昱光, 栗衍華, 白雪芳, 胡建恩, 譚成玉, 趙靜玫 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所