專利名稱：修飾的5t4抗原的制作方法
本申請是以下申請的分案申請申請日1999年11月18日；申請?zhí)?9815632.9(PCT/GB99/03859)；發(fā)明名稱“多肽”。
本發(fā)明提供用于腫瘤免疫療法的5T4腫瘤相關抗原(TAA)。本發(fā)明還涉及其中缺失至少一個免疫逃避基因的重組痘病毒載體及其在抗腫瘤疫苗接種和腫瘤治療中的用途，所述重組痘病毒載體包含編碼5T4TAA的核酸序列。
發(fā)明領域 本發(fā)明涉及可用于激發(fā)接受者抗腫瘤免疫應答的腫瘤相關抗原(TAA)。具體來說，本發(fā)明涉及5T4抗原及其在免疫治療中的用途。

背景技術：
已經(jīng)鑒定并表征了人類和動物腫瘤中的多種癌胚抗原或腫瘤相關抗原(TAA)。一般來說，TAA是在胎兒發(fā)育過程中表達、在成人細胞中向下調(diào)節(jié)的抗原，因此通常成人缺乏TAA或其存在水平非常低。觀測到腫瘤細胞恢復表達TAA，所以提出將TAA用于腫瘤診斷、尋靶和免疫治療。
具體來說，最近克隆的T細胞識別的腫瘤抗原在開發(fā)抗原特異性癌癥疫苗中引起極大的興趣。然而，許多腫瘤相關抗原是非突變的免疫原性低的組織分化抗原。其免疫原性弱的可能原因是自身耐受。因此，它們幾乎不能成為適合增強免疫應答的抗原肽。
盡管如此，發(fā)現(xiàn)部分腫瘤相關抗原規(guī)律性與大多數(shù)個體的腫瘤有關。這類抗原是特別引人注目的疫苗候選物。包括T淋巴細胞識別的黑素瘤分化抗原(MDA)、黑素瘤抗原以及數(shù)種MAGE家族的蛋白。但是，迄今的臨床試驗獲得的結果證實，對這些抗原誘導治療性T細胞是極其困難的。人體免疫系統(tǒng)對許多腫瘤抗原的明顯的低反應性的一個原因可能是它們是正常的、非突變的自身抗原。因此，將非突變自身細胞抗原用于腫瘤免疫療法的主要障礙在打破對這種抗原的耐受。例如鼠類痘病毒重組體表達的鼠類透明帶抗原能夠使小鼠喪失生殖能力。這些資料表明盡管可用表達自身抗原的重組痘病毒打破自身耐受，仍然需要優(yōu)化其效力，以便有效治療確診腫瘤成為可能。
已經(jīng)充分表征了TAA 5T4(參見WO89/07947)。它是廣泛表達于各種癌癥的72kDa糖蛋白，而在正常成熟組織的表達分布卻非常有限(見表1)。似乎它與結腸癌和胃癌轉(zhuǎn)移密切相關。已知人5T4的完整核酸序列(Myers等，1994J Biol Chem1699319-24)。
表1 (Starzynska等，Eur J Gastroenterol Hepatol 1998 Jun；10(6)479-84；Starzynska等，Br J Cancer1994May；69(5)899-902；Starzynska等，Br J Cancer 1992 Nov；66(5)867-9) 盡管因為可能涉及的機制，已經(jīng)提出5T4用作腫瘤進展和轉(zhuǎn)移潛力的標記(Carsberg等，(1996)Int J Cancer 1996 Sep 27；68(1)84-92)，但是沒有提出5T4用作免疫治療藥物。打破本身以有限方式在成熟組織表達的5T4的免疫耐受還沒有得到證實。因此，不能預測5T4能否成為抗癌免疫療法的有效抗原。
發(fā)明概述 如果獲得成功的治療結果，癌癥治療的免疫療法取決于多種因素。包括激發(fā)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答的能力、激發(fā)抗體應答的能力，而重要的是打破接受者免疫耐受的能力。目前已經(jīng)證實，用5T4免疫接種接受者獲得成功的如上所判斷的免疫治療反應。具體來說，已經(jīng)證實用5T4免疫接種可激發(fā)抗體應答。
因此，本發(fā)明提供表達編碼5T4抗原的核酸的病毒載體。
5T4抗原在接受者的表達可有效激發(fā)免疫治療性抗腫瘤應答。所述病毒載體最好有助于對表達抗原的CTL應答，而且最好是痘病毒載體如痘苗病毒載體。以下描述適合傳遞5T4抗原的其它病毒和非病毒載體。
本文使用的“載體”可以是任何能夠傳遞或?qū)⒑怂岜３衷谒拗骷毎械囊蜃?，包括病毒載體、質(zhì)粒、裸核酸、與多肽或其它分子復合的核酸以及固定在固相顆粒上的核酸。以下詳細描述這類載體。當然本發(fā)明在其最廣義上不限于傳遞5T4編碼核酸的任何具體載體。
本文所指的“核酸”可以是天然或合成DNA或RNA或其任何組合物。按照本發(fā)明的核酸僅限于它們具有編碼5T4抗原的作用，這樣宿主生物體的細胞器可翻譯所述核酸。因此，例如可以修飾天然核酸以增加其穩(wěn)定性?？尚揎桪NA和/或RNA、尤其是RNA以提高其成分對核酸酶的抗性。例如已知對核糖核苷酸的修飾包括2’-O-甲基、2’-氟基、2’-氨基和2’-O-烯丙基。按照本發(fā)明修飾的核酸可包括化學修飾，進行化學修飾以增加所述核酸的體內(nèi)穩(wěn)定性、增強或協(xié)調(diào)其傳遞或降低機體的清除率。這類修飾的實例包括核糖和/或磷酸和/或特定RNA序列的各堿基位置上的化學取代。參見例如WO92/03568；U.S.5,118,672；Hobbs等，(1973)Biochemistry 125138；Guschlbauer等，(1977)Nucleic Acids Res.41933；Schibaharu等，(1987)Nucleic AcidsRes.154403；Pieken等，(1991)Science253314，其中每個文獻均具體通過引用結合到本文中。
按照本發(fā)明“表達”5T4抗原是指宿主生物體細胞通過翻譯(任選轉(zhuǎn)錄)編碼5T4的核酸產(chǎn)生5T4抗原。因此，5T4在所述細胞中原位產(chǎn)生。因為5T4是跨膜蛋白，所以其胞外部分呈現(xiàn)在其產(chǎn)生細胞的表面上。因而必要時，術語“表達”包括提供必要的信號以確保正確加工5T4，使其呈現(xiàn)在細胞表面而且能夠與宿主免疫系統(tǒng)相互作用。
本文使用的術語“多肽”是指其中單體為氨基酸而且通過肽鍵或二硫鍵連接在一起的聚合物?！岸嚯摹笔侵溉L天然氨基酸鏈或其片段如選定的結合作用中的目的多肽區(qū)、合成氨基酸鏈或其組合物。因此“其片段”是指全長多肽中的一部分的約8-約500個氨基酸長度、更優(yōu)選約8-約200個氨基酸甚至更優(yōu)選約10-約50或100個氨基酸長度的氨基酸序列。另外，可包含非天然氨基酸，例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。在本發(fā)明中也使用非基因編碼的常見氨基酸。
5T4抗原是稱為5T4的多肽，并例如在WO89/07947中對其進行了表征。在一個優(yōu)選方面，5T4是如Myers等(同上)表征的人5T4，其序列見GenBank登錄號Z29083，本文稱為SEQ.ID.No.1。然而，本發(fā)明包括各種5T4和5T4等位基因變異體，包括本文SEQ ID NO 3所示的犬5T4和本文SEQ ID NO 2所示的小鼠5T4(GenBank登錄號AJ012160)以及片段(優(yōu)選明顯不同的表位)和其保留5T4抗原性的包含氨基酸插入、缺失或取代的變異體。這樣的片段在下文進行更詳細的描述。
第二方面，本發(fā)明涉及修飾的5T4抗原。本文使用的“修飾的抗原”是不同于天然5T4的截短、延長或用其它方法突變的5T4多肽。發(fā)現(xiàn)5T4產(chǎn)生的肽片段能夠用作5T4特異性抗原決定簇。這樣的肽能夠在接受者體內(nèi)結合HLA分子并誘導針對野生型5T4的CTL應答，通常比全長5T4更有效。此外，可通過氨基酸插入、缺失或取代使5T4肽突變；突變肽最好在接受者體內(nèi)更有效地結合HLA，誘導更強的CTL應答。肽可以是任何長度，但是最好5-25個氨基酸，優(yōu)選6-15個氨基酸，優(yōu)選約9個氨基酸長度。
修飾肽最好是5T4的HLA CTL表位。根據(jù)利用K.Parker(NIH)設計的程序“肽結合預測”獲得的更有效CTL應答的預測結果，可對這類表位進行修飾，所述程序可在下面的網(wǎng)址找到http://www-bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molhio/ken parker comboform(也可參閱ParkerK.C等1994.J.Immunol.152163)。
在一個優(yōu)選方面，“修飾的”5T4包括與轉(zhuǎn)運肽或佐劑結合或以其它方式連接的肽以便增強其激發(fā)免疫應答的能力。例如可將肽與不依賴TAP的轉(zhuǎn)運肽融合以有效轉(zhuǎn)運給HLA并與HLA分子相互作用以增強CTL表位(綜述參閱Yewdell等，1998 J Immunother 21127-31；Fu等，(1998)J Virol 721469-81)。
第三方面，本發(fā)明提供在接受者激發(fā)免疫應答的方法，包括用編碼5T4抗原的核酸免疫接受者和在接受者表達5T4抗原的步驟。
如上所述用表達5T4的核酸免疫接種激發(fā)免疫應答。通過給予包含抗原的“引發(fā)(priming)”劑，然后在用引發(fā)劑有效引發(fā)后給予所述免疫系統(tǒng)包括追加抗原的第二劑或“加強”劑，從而可激發(fā)免疫。
用于免疫接種的載體可以是任何病毒或非病毒載體。所用的5T4抗原，無論是全長5T4還是其肽，均可以是修飾的5T4抗原，5T4抗原可以在來源上是同源(即來源于與接受者相同的物種)或異源的。
最好是激發(fā)的免疫應答是參與活化5T4特異性細胞毒性T淋巴細胞的CTL應答。
最好是所述應答是有效抑制、阻止或逆轉(zhuǎn)接受者腫瘤發(fā)展的抗腫瘤免疫治療性應答。
第四方面，本發(fā)明提供應用5T4抗原制備用于免疫治療接受者腫瘤的組合物。
利用5T4抗原的免疫接種最好能夠在接受者體內(nèi)打破對5T4的免疫耐受。
按照第五方面，本發(fā)明提供包含5T4抗原的疫苗組合物。疫苗組合物可包含同源5T4抗原、異源5T4抗原或突變5T4抗原。
含5T4抗原的疫苗可以類似于相同目的的應用5T4編碼核酸的方式用于腫瘤免疫或腫瘤治療。所述疫苗組合物最好包含一種或多種佐劑。
第六方面，本發(fā)明包括編碼5T4抗原的表達載體，該載體可用于表達5T4并生產(chǎn)適用于疫苗組合物的5T4抗原。所述載體可以是原核載體或真核載體，而且最好是能夠在哺乳動物細胞中表達5T4的載體。
5T4抗原可以是任何來源的5T4抗原，而且可以是修飾的5T4抗原，例如本文所述的5T4抗原。
第七方面，本發(fā)明提供應用5T4抗原制備用于免疫接受者的組合物。利用5T4的免疫接種包括給予所述接受者免疫有效量的按照本發(fā)明第五方面的疫苗組合物。
第八方面，本發(fā)明提供應用5T4抗原制備用于使接受者絕育(sterilisation)的組合物。給予5T4抗原可以有效地使接受者絕育。所述接受者優(yōu)選為女性接受者(female subject)。
本發(fā)明還涉及應用5T4尋靶分子，如抗5T4抗體如抗5T4scFvs。這些抗體可以用于(i)原位靶向天然或外源5T4和/或(ii)原位將免疫增強分子如B7.1傳遞至天然或外源5T4(Carroll等(1998)J Natl CancerInst90(24)1881-7)。這可增強5T4在所述接受者體內(nèi)的免疫原性。本發(fā)明還涉及序貫使用編碼5T4抗原和抗5T4抗體如抗5T4 svFvs的載體。抗5T4svFvs抗體可以作為編碼所述抗體的裸DNA(例如在包含編碼DNA和控制其產(chǎn)生的短啟動子區(qū)的質(zhì)粒中)、包含所述編碼序列的表達載體(可以是病毒或非病毒載體)或蛋白形式給予。因此，本發(fā)明提供編碼5T4抗原的載體和任選與免疫刺激分子融合的能夠結合5T4的因子，它們獨立用于治療腫瘤，例如序貫使用。
在再一實施方案中，本發(fā)明包括包含酶治療/前體藥物治療和利用5T4的免疫治療的聯(lián)合治療。例如酶治療/前體藥物治療可包括腫瘤內(nèi)或系統(tǒng)傳遞P450(任選用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體傳遞)和環(huán)磷酰胺(CPA)，然后用5T4進行系統(tǒng)免疫治療性誘導。
因此，本發(fā)明還涉及編碼5T4抗原的載體、前體藥物/酶的聯(lián)合應用，它們分別、同時分別或聯(lián)合用于治療腫瘤。
在再一實施方案中，可將5T4或5T4肽與乙型肝炎核心抗原融合以增強T輔助細胞和抗體應答(Schodel等，1996Intervirology 39104-10)。
所以，按照本發(fā)明的第九方面，提供其中至少缺失一個免疫逃避基因的重組痘病毒載體，它包含編碼腫瘤相關抗原(TAA)的核酸序列。
TAA抗原性弱，免疫系統(tǒng)將其識別為“自身”組分，因此其耐受程度非常大。盡管應用痘病毒載體能夠使所述抗原被提呈，使得至少部分可服這種耐受，但是用多數(shù)痘病毒載體觀測到的免疫原性效應是有限的。人們認為缺失天然存在于痘病毒的免疫逃避基因可能對用TAA免疫接種具有有益的作用。缺失免疫逃避基因的痘病毒載體可能能夠打破對編碼的自身抗原包括TAA的免疫耐受，因此能夠使宿主增強對弱免疫原性自身抗原或其它自身抗原的免疫應答。
第十方面，本發(fā)明提供在哺乳動物激發(fā)免疫應答的方法，包括給予所述哺乳動物按照本發(fā)明第九方面的重組痘病毒載體，由此激發(fā)所述哺乳動物對TAA的免疫應答。
已知抗原如TAA依賴于產(chǎn)生CTL應答，以在接受者體內(nèi)提供保護性效應或治療作用，CTL應答依賴于通過MHCI途徑加工抗原。據(jù)認為，長期抗原表達使高水平CTL的保持時間延長。本發(fā)明的第十一方面提供裂解活性降低的痘病毒，以增強接受者對抗原的CTL反應。
第十二方面，本發(fā)明提供應用按照本發(fā)明第九、第十一方面的重組痘病毒載體在哺乳動物激發(fā)針對TAA的免疫應答。
第十三方面，本發(fā)明提供在免疫治療中用作腫瘤相關靶的5T4抗原。
第十四方面，本發(fā)明提供應用重組痘病毒載體打破哺乳動物對弱免疫原的免疫耐受并激發(fā)對其的免疫應答，所述重組痘病毒載體中至少一個免疫逃避基因缺失或突變并且包含編碼弱免疫原的核酸序列。
在附后的權利要求書和以下的描述和討論中提供本發(fā)明的其它方面。這些方面在單獨的小節(jié)標題下給出。然而，應該指出的是，每個小節(jié)標題下的內(nèi)容不一定限于其具體小節(jié)標題。
發(fā)明詳述 傳遞或表達5T4抗原的載體 可用病毒或非病毒技術傳遞按照本發(fā)明的5T4多肽。
非病毒傳遞系統(tǒng)包括但不限于DNA轉(zhuǎn)染方法。在此轉(zhuǎn)染包括利用非病毒載體將5T4基因傳遞給目標哺乳動物的方法。
常規(guī)的轉(zhuǎn)染方法包括電穿孔、核酸生物發(fā)射(nucleic acidbiolistics)、脂質(zhì)介導的轉(zhuǎn)染、緊結核酸介導的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(lipofectin)、陽離子劑介導的轉(zhuǎn)染、陽離子面或兩親物(CFA)(Nature Biiotechnology 1996 14；556)、多價陽離子如精胺、陽離子脂質(zhì)或聚賴氨酸、1，2-二(油酰氧基)-3-(三甲基氨基(ammonio))丙烷(DOTAP)-膽固醇復合物(Wolff和Trubetskoy 1998 Nature Biotechnology16421)和其組合物。
病毒傳遞系統(tǒng)包括但不限于腺病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體或桿狀病毒載體、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)、痘病毒如金絲雀痘病毒(Taylor等1995Vaccine 13539-549)、昆蟲痘病毒(LiY等1998第十三界國際痘病毒專題會議第144頁，摘要)、企鵝痘病毒(penguine pox)(Standerd等J GenVirol.1998 791637-46)甲病毒屬和基于甲病毒屬的DNA載體。
逆轉(zhuǎn)錄病毒實例包括但不限于鼠類白血病病毒(MLV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、馬傳染性貧血病病毒(EIAV)、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、Rous肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠類白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠類骨肉瘤病毒(FBRMSV)、莫洛尼鼠類肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠類白血病病毒(A-MLV)、禽髓細胞瘤病病毒-29(MC29)和鳥類成紅細胞增生病毒(AEV)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒詳細一覽表見Coffin等(“Retroviruses”1997 ColdSpring Harbour Laboratory Press EdsJM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第758-763頁)。
慢病毒分為靈長類和非靈長類組。靈長類慢病毒實例包括但不限于人類免疫缺陷病毒(HIV)，即人類自身免疫性缺陷綜合征(AIDS)的致病原，以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非靈長類慢病毒組包括原型“慢病毒”維斯那/梅迪病毒(VMV)以及相關的山羊關節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病病毒(EIAV)和最近描述的貓免疫缺陷病毒(FIV)以及牛免疫缺陷病毒(BIV)。
慢病毒科與其它類型逆轉(zhuǎn)錄病毒一個明顯的不同在于慢病毒既能感染分裂細胞又能感染非分裂細胞(Lewis等1992 EMBO.J 113053-3058；Lewis和Emerman1994 J.Virol.68510-516)。相反，其它逆轉(zhuǎn)錄病毒如MLV不能感染非分裂細胞，如構成例如肌肉、大腦、肺和肝臟組織的細胞。
本發(fā)明的載體可以裝配成內(nèi)含子間斷(split-intron)的載體。PCT專利申請WO99/15683和WO99/15684描述了內(nèi)含子間斷的載體。
如果腺病毒的特征與逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒的遺傳穩(wěn)定性結合，則基本上所述腺病毒可用于轉(zhuǎn)導靶細胞，使其成為能夠穩(wěn)定感染鄰近細胞的瞬時逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)生細胞?？蓪⑦@樣的工程表達5T4抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)生細胞植入生物體如動物或人類，用于治療血管生成和/或癌癥。
痘病毒載體 在本發(fā)明中優(yōu)選使用痘病毒載體。工程改造痘病毒用于重組基因表達和用作重組活疫苗。需要應用重組技術將編碼外源抗原的核酸導入痘病毒基因組中。如果所述核酸整合在所述病毒生活周期非必需病毒DNA位點，則新產(chǎn)生的重組痘病毒可能是傳染性的，也就是說，感染外源細胞，由此表達所整合的DNA序列。以這種方式制備的重組痘病毒可用作活疫苗，用于預防和/或治療疾病和傳染性疾病。
5T4在重組痘病毒如痘苗病毒中表達需要將痘苗啟動子與編碼5T4的核酸連接。構建質(zhì)粒載體(也稱為插入載體)，用于通過供體質(zhì)粒的所述核酸側翼的病毒序列和存在于親代病毒的同源序列之間的同源重組將核酸插入痘苗病毒中(Mackett等1982 PNAS 797415-7419)。一種類型的插入載體組成如下(a)包含轉(zhuǎn)錄起始位點的痘苗病毒啟動子；(b)位于轉(zhuǎn)錄起始位點下游用于插入核酸的幾個獨特的限制性內(nèi)切核酸酶克隆位點；(c)啟動子側翼的非必需痘苗病毒序列(如胸苷激酶(TK)基因)和指導所述核酸插入病毒基因組非必需同源區(qū)的克隆位點；和(d)在大腸桿菌中復制和選擇的細菌復制起點和抗生素抗性標記。Mackett描述了這類載體實例(Mackett等1984，J.Virol.49857-864)。
使包含需要插入的核酸的分離質(zhì)粒與親代病毒如痘病毒一起轉(zhuǎn)染入細胞培養(yǎng)物如雞胚成纖維細胞中。質(zhì)粒中的同源痘DNA和病毒基因組之間的重組相應地產(chǎn)生因為在其不影響病毒活力的基因組位點存在啟動子-基因構建物而修飾的重組痘病毒。
如上所述，在不影響產(chǎn)生的重組病毒的病毒存活力的病毒區(qū)(插入?yún)^(qū))插入所述核酸。例如通過隨機測試允許形成重組而不嚴重影響重組體病毒存活力的區(qū)的病毒DNA區(qū)段，可以容易地在一種病毒中鑒定這樣的區(qū)。易于使用而且存在于許多病毒的一個區(qū)是胸苷激酶(TK)基因。例如TK基因見于所檢測的所有痘病毒基因組[野兔痘病毒Upton等J.Virology 60920(1986)(兔纖維瘤病毒)；山羊痘病毒Gershon等J.Gen.Virol.70525(1989)(Kenya sheep-1)；正痘病毒W(wǎng)eir等J.Virol46530(1983)(痘苗病毒)；Esposito等Virology 135561(1984)(猴痘病毒和天花病毒)；Hruby等PNAS，803411(1983)(痘苗病毒)；Kilpatrick等Virology 143399(1985)(亞巴猴腫瘤病毒)；禽痘病毒Binns等J.Gen.Virol 691275(1988)(雞痘病毒)；Boyle等Virology 156355(1987)(雞痘病毒)；Schnitzlein等J.Virological Method 20341(1988)(雞痘病毒，鵪鶉痘病毒)；昆蟲痘病毒(Lytvyn等J.Gen.Virol 733235-3240(1992)]。
在痘苗病毒中，除了TK區(qū)之外，其它插入?yún)^(qū)包括例如HindIII M。
在雞痘病毒中，除了TK區(qū)之外，其它插入?yún)^(qū)包括例如EPO申請第0 308 220 A1所述的BamHI J[Jenkins等AIDS Research and HumanRetroviruses 7991-998(1991)]、EcoRI-HindIII片段、BamHI片段、EcoRV-HindIII片段、BamHI片段和HindIII片段。[Calvert等J.of Virol673069-3076(1993)；Taylor等Vaccine6497-503(1988)；Spehner等(1990)和Boursnell等J.of Gen.Virol 71621-628(1990)]。
在豬痘病毒中，優(yōu)選的插入位點包括胸苷激酶基因區(qū)。
根據(jù)宿主和靶細胞類型可容易地選擇啟動子。例如在痘病毒時，應該使用痘病毒啟動子，例如痘苗病毒7.5K或40K或雞痘病毒C1。也可使用含有合適痘病毒序列的人工構建物。也可聯(lián)合使用增強子元件以提高表達水平。此外，在部分實施方案中優(yōu)選使用誘導型啟動子，誘導型啟動子也是本領域周知的。
用酶測定法或免疫測定法(例如免疫沉淀、放射免疫測定法或免疫印跡分析)可檢測外源基因表達。重組痘苗病毒感染細胞產(chǎn)生的天然存在的膜糖蛋白被糖基化，并轉(zhuǎn)運到細胞表面。通過應用強啟動子可獲得高表達水平。
用于疫苗的病毒載體的其它要求包括良好的免疫原性和安全性。MVA是復制缺陷型痘苗病毒株，具有良好的安全記錄。MVA不能在大多數(shù)細胞類型和正常人體組織中復制。在少數(shù)的轉(zhuǎn)化細胞類型如BHK21細胞觀測到MVA復制。Carroll等(1997)證實，重組MVA在產(chǎn)生保護性CD8+T細胞應答方面與常規(guī)重組痘苗病毒載體同樣好，是更常見使用的復制感受態(tài)痘苗病毒的有效替代物。由MVA產(chǎn)生的痘苗病毒株或獨立開發(fā)的、具有使得MVA特別適用于疫苗的MVA特征的病毒株，也適用于本發(fā)明。
所述載體最好是痘苗病毒載體如MVA或NYVAC。最優(yōu)選痘苗病毒株改良的病毒ankara(MVA)或由其產(chǎn)生的病毒株。痘苗病毒載體的替代載體包括禽痘病毒載體如雞痘病毒或稱為ALVAC的金絲雀痘病毒和由其產(chǎn)生的病毒株，它們可以感染并在人類細胞中表達重組蛋白，但是不能復制。
在本發(fā)明的一個方面，所述痘病毒載體缺失至少一個免疫逃避基因。
病毒尤其是具有大編碼容量，而因此能夠編碼多種基因的大病毒如痘病毒，發(fā)展了多種逃避其宿主免疫系統(tǒng)的技術。例如它們能夠逃避非特異性防御，例如補體、干擾素和炎癥反應，而且它們能夠干擾或阻斷細胞因子的作用。從MVA缺失多種這樣的免疫逃避多肽，僅留下在左側末端區(qū)具有干擾素抗性的蛋白。
痘病毒一般為大DNA病毒，引起急性感染而不是潛伏性感染。它們編碼許多抗原性蛋白，使得難以改變抗原性，因此依賴于主動免疫逃避，以保護其自身逃避哺乳動物免疫系統(tǒng)。它們具有編碼多肽的多種基因，所述多肽對免疫系統(tǒng)的多個方面產(chǎn)生干擾它們破壞干擾素的作用、干擾補體、細胞因子活性、炎癥反應和CTL識別作用(綜述，Smith等，(1997)Immunol Rev 159137-154)。去除這些蛋白有助于增強痘病毒載體編碼的弱免疫原激發(fā)接受者免疫應答的能力。
免疫逃避基因或多肽是有助于所述病毒逃避哺乳動物免疫系統(tǒng)的基因或其產(chǎn)物。所述基因或基因產(chǎn)物最好干擾免疫系統(tǒng)的作用，至少是在一個水平上干擾免疫系統(tǒng)的作用。許多方法可達到此目的，例如通過提供可溶性細胞因子受體的模擬物等提供信號分子的競爭物干擾信號途徑。
免疫逃避基因包括但不限于以下基因 干擾素逃避基因痘苗病毒具有至少3個干擾IFN作用的基因。E3L基因表達一個25Kd多肽，該多肽與P1蛋白激酶競爭結合dsRNA，此過程使P1活化、eIF2α磷酸化，而且導致不能裝配翻譯起始復合物。此途徑一般對IFN活化起作用，但是阻止E3L表達因此使翻譯起始不受阻，可以阻礙該途徑。
K3L基因表達的10.5Kd多肽也干擾P1活性，因為它是有效的eIF2α模擬物，而作為P1蛋白激酶競爭物發(fā)揮作用。所以其作用模式類似于E3L。
預測A18R基因編碼解旋酶，它似乎干擾2’，5’-寡腺苷酸途徑，而該途徑是IFN反應性的。2’，5’-A激活RNAse L，其作用是阻止病毒翻譯?？磥碓诟腥炯毎蠥18R表達降低了2’，5’-A水平。
補體已知痘苗病毒的B5R基因產(chǎn)物與因子H高度相關，因子H是替代補體途徑的調(diào)節(jié)物。與經(jīng)典途徑不同，抗原單獨就可以激活該途徑。因此B5R基因產(chǎn)物可干擾替代補體途徑。
C21L基因又與人類C4b結合蛋白有關，而且作用于其表面帶有C4b的細胞，以阻止與CR1補體受體結合。
可溶性細胞因子受體痘苗病毒W(wǎng)R B15R基因(在痘苗病毒Copenhagen病毒株的B16R)產(chǎn)物與IL-1β受體IL-1R有關。
痘苗病毒Copenhagen病毒株的A53R，即WR基因ORF SalF19R編碼TNF受體。然而，據(jù)認為野生型病毒的這兩個基因均因為ORF斷裂而失活。
據(jù)信B8R基因編碼可溶性IFN-γ受體，又為所述病毒提供另一個IFN逃避機制。
炎癥據(jù)信許多基因參與阻止對病毒感染的炎癥反應。這些基因包括A44L、K2L、B13R和B22R。
本發(fā)明的一個方面，重組痘病毒載體缺失大多數(shù)免疫逃避基因。最好缺失所有免疫逃避基因。因此，本發(fā)明的一個方面，所述痘病毒載體是其中K3L干擾素抗性蛋白基因被破壞或缺失的重組MVA載體。
優(yōu)選對預定接受者沒有危險的痘病毒。因此例如優(yōu)選用于人類的病毒為或者宿主范圍有限的痘病毒如禽痘病毒，或者減毒的痘病毒如痘苗病毒的減毒株(包括NYVAC和MVA)。雖然非痘苗病毒株用于先前存在天花免疫的接受者有效，但最優(yōu)選痘苗病毒減毒株。
將一種構建物導入感染MVA的細胞中，使其同源重組，所述構建物至少包含一種編碼5T4的核酸，此核酸側翼為鄰接MVA基因組中的一個天然缺失如缺失II的MVA DNA序列。
一旦所述構建物導入所述真核細胞而且5T4DNA與病毒DNA重組后，優(yōu)選借助于標記可分離所需要的重組痘苗病毒(Nakano等Proc.Natl.Acad.Sci.USA79，1593-1596[1982]，F(xiàn)ranke等Mol.Cell.Biol.1918-1924[1985]，Chakrabarti等Mol.Cell.Biol.3403-3409[1985]，F(xiàn)athi等Virology 97-105[1986]。
需要插入的構建物可以是線性的或環(huán)形的。優(yōu)選環(huán)形DNA，尤其是質(zhì)粒。所述構建物包含在MVA基因組天然缺失例如缺失II的左側和右側側翼的序列(Altenburger，W.，Suter，C.P.和Altenburger J.(1989)Arch.Virol.105，15-27)。在天然缺失的側翼序列之間插入外源DNA序列。
為了表達至少一種核酸，有必要使所述核酸轉(zhuǎn)錄所需的調(diào)節(jié)序列存在于所述核酸上游。本領域技術人員了解這類調(diào)節(jié)序列，包括例如EP-A-198，328描述的痘苗病毒11kDa基因的調(diào)節(jié)序列和7.5kDa基因的調(diào)節(jié)序列(EP-A-110，385)。
所述構建物可通過轉(zhuǎn)染導入MVA感染細胞，所述轉(zhuǎn)染方法包括例如磷酸鈣沉淀(Graham等Virol.52，456-467[1973；Wigler等Cell777-785[1979]電穿孔(Neumann等EMBO J.1，841-845[1982])、微量注射(Graessmann等Meth.Enzymology101，482-492(1983))、脂質(zhì)體(Straubinger等Methods in Enzymology101，512-527(1983))原生質(zhì)球(Schaffner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77，2163-2167(1980))或本領域技術人員已知的其它方法。優(yōu)選脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明重組引發(fā)載體和加強載體可對哺乳動物特定細胞類型具有趨向性。例如，可工程改造本發(fā)明重組載體以感染專職(professional)APC如樹突細胞和巨噬細胞。已知樹突細胞是成功免疫應答的最佳協(xié)調(diào)者(orchestrator)，尤其是細胞介導的應答的最佳協(xié)調(diào)者。已經(jīng)證實用抗原或包含這種靶抗原的病毒載體體外處理樹突細胞當輸入同系基因動物或人體時可誘導有效的免疫應答(參見Nestle FO等，用肽-或腫瘤裂解物-脈沖處理的樹突細胞免疫接種黑素瘤患者，Nat Med.1998Mar；4(3)328-32和Kim CJ等，用編碼MART-1/Melan A的痘病毒感染的樹突細胞體外致敏T淋巴細胞，J Immunother.1997 Jul；20(4)276-86。所述重組載體也可以感染腫瘤細胞?；蛘?，所述重組載體能夠感染任何哺乳動物細胞。
載體的其它實例包括體外傳遞系統(tǒng)，體外傳遞系統(tǒng)包括但不限于DNA轉(zhuǎn)染方法如電穿孔、DNA生物發(fā)射、脂質(zhì)介導的轉(zhuǎn)染和緊結DNA介導的轉(zhuǎn)染。
所述載體可以是一種質(zhì)粒DNA載體。本文使用的“質(zhì)粒”是指用于將異源DNA導入細胞中以表達或復制異源DNA的獨立元件。選擇和應用這類元件完全在技術人員技術水平內(nèi)。可利用許多質(zhì)粒，而選擇合適質(zhì)粒取決于質(zhì)粒的預期用途，即是用于擴增DNA還是表達DNA、需要插入質(zhì)粒的DNA大小和將用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細胞。每種質(zhì)粒根據(jù)其作用(擴增DNA還是表達DNA)和與其匹配的宿主細胞而含有不同的組分。質(zhì)粒組分一般包括但不限于一種或多種以下組分復制起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子、轉(zhuǎn)錄終止序列和信號序列。
表達質(zhì)粒和克隆質(zhì)粒一般均包含使所述質(zhì)粒能夠在一種或多種選定宿主細胞中復制的核酸序列。通常在克隆質(zhì)粒中這種序列是使所述質(zhì)粒獨立于宿主染色體DNA復制的序列，包括復制起點或自主復制序列。對各種細菌、酵母和病毒的這種序列是周知的。質(zhì)粒pBR322的復制起點適用于大多數(shù)革蘭氏陰性細菌，2m質(zhì)粒復制起點適用于酵母，而各種病毒復制起點(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒)可用于哺乳動物細胞的克隆質(zhì)粒。一般來說，哺乳動物表達質(zhì)粒不需要復制起點組分，除非這些表達質(zhì)粒用于高水平DNA復制感受態(tài)哺乳動物細胞如COS細胞。
大多數(shù)表達質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒，即它們能夠在至少一類生物體中復制，但是能夠轉(zhuǎn)染入另一類生物體表達。例如在大腸桿菌中克隆一種質(zhì)粒，然后將相同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入酵母或哺乳動物細胞，盡管它不能夠獨立于宿主細胞染色體進行復制。
最好是表達和克隆質(zhì)?？珊羞x擇基因，也稱為選擇標記。這種基因編碼生長于選擇培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化宿主細胞存活或生長所必需的蛋白。未被包含選擇基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細胞將不能在培養(yǎng)基中存活。通常選擇基因編碼的蛋白賦予對抗生素和其它毒素(例如氨芐青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四環(huán)素)的抗性、互補營養(yǎng)缺陷或提供不能從復合培養(yǎng)基獲得的重要營養(yǎng)素。
關于適合酵母的選擇基因標記，可使用因為標記基因表型表達而有助于轉(zhuǎn)化體選擇的任何標記基因。適合酵母的標記例如為賦予對抗生素G418、潮霉素或博萊霉素的抗性的基因，或提供營養(yǎng)缺陷酵母突變體原養(yǎng)的基因如URA3、LEU2、LYS2、TRP1或HIS3基因。
因為可以在大腸桿菌中方便地進行質(zhì)粒復制，因此最好包括大腸桿菌遺傳標記和大腸桿菌復制起點。這些組分可從大腸桿菌質(zhì)粒pBR322、Bluescript質(zhì)?；騪UC質(zhì)粒如pUC18或pUC19獲得，它們既包含大腸桿菌復制起點又包含賦予對抗生素如氨芐青霉素抗性的大腸桿菌遺傳標記。
適合哺乳動物細胞的選擇標記是使得能夠鑒定攝入5T4核酸的細胞的選擇標記，例如二氫葉酸還原酶(DHFR，氨甲蝶呤抗性)、胸苷激酶或賦予G418或潮霉素抗性的基因。使所述哺乳動物細胞轉(zhuǎn)化體處于選擇壓力下，只有攝入并表達所述標記的轉(zhuǎn)化體才能夠存活。如果是DHFR或谷氨酰胺合酶(GS)標記，選擇壓力的施加可以是在所述壓力不斷遞增的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體，由此使選擇基因和連接的編碼5T4的DNA均擴增(在其染色體整合位點)。擴增是在重組細胞染色體中以串聯(lián)形式重復產(chǎn)生制備生長重要蛋白大量需要的基因和與其緊密連接的可編碼需要蛋白的基因的過程。通常由此擴增的DNA用于合成需要量增加的需要蛋白。
表達和克隆質(zhì)粒通常含有宿主生物體識別并與5T4核酸有效連接的啟動子。這種啟動子可以是誘導型或組成型。通過限制性酶消化去除來源DNA的啟動子，并將分離的啟動子序列插入所述質(zhì)粒，從而可使所述啟動子與編碼5T4的DNA有效連接。天然5T4啟動子序列和許多異源啟動子均可用于控制5T4DNA的擴增和/或表達。術語“有效連接”是指其中所述組分的位置關系使得它們能夠以其預定方式起作用的連接。與編碼序列“有效連接的”控制序列的連接方式使得在適合所述控制序列的條件下表達所述編碼序列。
適用于原核宿主的啟動子包括例如β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)和雜合啟動子如tac啟動子。已經(jīng)公開了其核苷酸序列，由此使得熟練技術人員利用接頭或連接物能夠?qū)⑵渑c編碼5T4的DNA有效連接以提供任何需要的限制位點。用于細菌系統(tǒng)的啟動子一般也包含與編碼5T4的DNA有效連接的Shine-Delgarno序列。
優(yōu)選的表達質(zhì)粒為包含能夠在細菌中起作用的噬菌體(如phagex或T7)啟動子的細菌表達質(zhì)粒。在一個最廣泛使用的表達系統(tǒng)中，可通過T7RNA聚合酶從所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄編碼所述融合蛋白的核酸(Studier等，Methods in Enzymol.185；60-89，1990)。在結合使用pET質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌株中，在所述宿主細菌中由λ溶原體DE3產(chǎn)生T7RNA聚合酶，而且其表達處于IPTG誘導型lac UV5啟動子控制之下。已經(jīng)成功應用此系統(tǒng)超量產(chǎn)生許多蛋白?；蛘呖赏ㄟ^感染int-噬菌體如可市售獲得的CE6噬菌體(Novagen，Madison，USA)由λ噬菌體導入所述聚合酶基因。其它質(zhì)粒包括包含λPL啟動子的質(zhì)粒如PLEX(Invitrogen，NL)、包含trc啟動子的質(zhì)粒如pTrcHisXpressTm(Invitrogen)或pTrc99(Pharmacia Biotech，SE)或包含tac啟動子的質(zhì)粒如pKK223-3(Pharmacia Biotech)或PMAL(new England Biolabs.MA，USA)。
此外，按照本發(fā)明的5T4基因最好包括分泌序列，以有助于所述多肽從細菌宿主分泌，使其以可溶性天然肽而不是包涵體產(chǎn)生?？蓮乃黾毦苜|(zhì)間隙或者適當?shù)脑拸呐囵B(yǎng)基回收所述肽。
用于酵母宿主的合適啟動序列可以是調(diào)節(jié)型或組成型的，而且優(yōu)選由高表達酵母基因、尤其是釀酒酵母基因得到。因此可使用以下啟動子TRP1基因、ADHI或ADHII基因、酸性磷酸酶(PH05)基因的啟動子；酵母接合的編碼a-或α-因子的信息素基因的啟動子或編碼糖酵解酶的基因衍生的啟動子，例如以下糖酵解酶基因的啟動子烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構酶、磷酸葡萄糖異構酶或葡萄糖激酶基因、釀酒酵母GAL4基因、S.pombe nmt1基因；或TATA結合蛋白(TBP)基因的啟動子。此外，可應用雜合啟動子，雜合啟動子包含一個酵母基因的上游激活序列(UAS)和包含另一個酵母基因的功能TATA盒的下游啟動子元件，例如包含酵母PH05基因的UAS和含酵母GAP基因的功能TATA盒的下游啟動子元件的雜合啟動子(PH05-GAP雜合啟動子)。合適的組成型PH05啟動子例如為去除上游調(diào)節(jié)元件(UAS)的縮短的酸性磷酸酶PH05啟動子，如起始于核苷酸-173而終止于PH05基因的核苷酸-9的PH05(-173)啟動子元件。
質(zhì)粒在哺乳動物宿主細胞中轉(zhuǎn)錄5T4基因可受控于衍生自病毒基因組的啟動子、異源哺乳動物啟動子(肌動蛋白啟動子或非常強的啟動子如核糖體蛋白啟動子)和與5T4序列天然連接的啟動子，只要這類啟動子與所述宿主細胞系統(tǒng)匹配，所述病毒例如為多瘤病毒、腺病毒、雞痘病毒、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒(CMV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒和猿猴病毒40(SV40)。
在所述質(zhì)粒中插入增強子序列可增強高等真核生物轉(zhuǎn)錄編碼5T4的DNA。增強子相對獨立于取向和位置。已知哺乳動物基因(例如彈性蛋白酶和球蛋白)的許多增強子序列。然而，人們通常愿意使用真核細胞病毒增強子。實例包括復制起點后側(bp100-270)的SV40增強子和CMV早期啟動子增強子?？捎?T4DNA的5’或3’位置將增強子剪切入所述質(zhì)粒中，但是優(yōu)選位于所述啟動子的5’位置。
編碼5T4的真核表達質(zhì)粒最好包含基因座控制區(qū)(LCR)。LCR能夠指導整合入宿主細胞染色質(zhì)的轉(zhuǎn)基因的高水平不依賴于整合位點的表達，在設計用于基因治療用途質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)基因動物時，當需要在所述質(zhì)粒已經(jīng)整合入染色體的永久轉(zhuǎn)染真核細胞系環(huán)境中表達5T4基因時LCR特別重要。
真核表達質(zhì)粒也將含有終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA必需的序列。這類序列通?？蓮恼婧松锛毎虿《綝NA或cDNA的5’和3’非翻譯區(qū)獲得。這些區(qū)包含轉(zhuǎn)錄為編碼5T4的mRNA的非翻譯部分的聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。
表達質(zhì)粒包括任何能夠表達與調(diào)節(jié)序列如啟動子區(qū)有效連接的5T4核酸的質(zhì)粒，所述調(diào)節(jié)序列能夠表達這類DNA。因此，表達質(zhì)粒是指當導入合適宿主細胞時表達所述克隆DNA的重組DNA或RNA構建物，例如質(zhì)粒、噬菌體、重組病毒或其它質(zhì)粒。合適的表達載體是本領域一般技術人員周知的，包括可在真核和/或原核細胞中復制的質(zhì)粒和保持游離的質(zhì)?；蛘先胨拗骷毎蚪M的質(zhì)粒。例如編碼5T4的DNA可插入適合在哺乳動物細胞中表達cDNA的質(zhì)粒中，例如CMV增強子基質(zhì)粒如pEVRF(Matthias等，(1989)NAR17，6418)。
實施本發(fā)明特別有用的是在哺乳動物細胞中提供瞬時表達編碼5T4的DNA的表達質(zhì)粒。瞬時表達通常涉及應用能夠在宿主細胞中有效復制的表達質(zhì)粒，使得所述宿主細胞累積許多拷貝的表達質(zhì)粒，再合成高水平的5T4。對于本發(fā)明的目的，瞬時表達系統(tǒng)可用于例如鑒定5T4突變體，以鑒定潛在的磷酸化位點或特征鑒定所述蛋白的功能域。
構建按照本發(fā)明的質(zhì)粒使用常規(guī)連接技術。使分離的質(zhì)?；駾NA片段切割、加尾，并再以產(chǎn)生需要質(zhì)粒的需要方式連接。需要的話，以已知方式進行分析以證實所構建質(zhì)粒中的準確序列。構建表達質(zhì)粒、體外制備轉(zhuǎn)錄物、DNA導入宿主細胞和進行分析以評價5T4的表達和功能的合適方法是本領域技術人員已知的。例如利用基于本文提供的序列的合適標記探針直接通過常規(guī)DNA印跡分析、定量轉(zhuǎn)錄的mRNA的RNA印跡分析、點印跡(DNA或RNA分析)或原位雜交可測定樣品中的基因存在、擴增和/或表達。如果需要的話，本領域技術人員可容易地設計如何改良這些方法。
5T4抗原、片段和變異體 本文所指的5T4抗原包括保留至少一個常見5T4抗原決定族的5T4肽和5T4其它片段。
“常見抗原決定族”意味著所述衍生物具有至少一個5T4抗原功能?？乖δ馨ň哂幸粋€能夠與針對天然5T4多肽或變性5T4多肽或其片段產(chǎn)生的抗體交叉反應的表位或抗原位點，或能夠結合HLA分子并誘導5T4特異性免疫應答的能力。因此，本發(fā)明提供的5T4包括可變剪切初級轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生的mRNA編碼的剪切變異體、氨基酸變異體、糖基化變異體和保持5T4生理和/或物理特性的其它共價5T4衍生物。典型衍生物包括其中通過取代、化學方法、酶方法或利用非天然氨基酸的一個部分的其它合適方法共價修飾本發(fā)明蛋白的分子。這樣的一個部分可以是一個可檢測的部分，例如酶或放射性同位素。此外，包括見于特定物種、優(yōu)選哺乳動物的天然5T4變異體。通過相同基因家族的有關基因、特定基因的等位基因變異體可編碼這種變異體，或這種變異體為5T4基因的可變剪切變異體。
保持常見抗原決定族的衍生物可以是5T4片段。5T4片段包括其各個結構域以及衍生自所述結構域的較小的多肽。衍生自按照本發(fā)明的5T4的小多肽最好定義一個單一的5T4特征表位。在理論上片段幾乎可以是任何大小，前提是它們保持一個5T4特征。片段最好是5-400個氨基酸長度。認為較長的片段是截短的全長5T4，而且一般包括在術語“5T4”定義內(nèi)。片段最好是約5-25個氨基酸長度的較小的肽。優(yōu)選約9個氨基酸長度的肽。
5T4衍生物還包括其可含有氨基酸缺失、添加或取代的突變體，前提條件是保有至少一個5T4特征性特性。因此，可進行基本上不改變5T4性質(zhì)的保守氨基酸取代，同樣可從5’或3’末端截短5T4。此外可對本發(fā)明包括的5T4片段進行缺失和取代。使編碼5T4的DNA進行體外誘變，導致例如添加、交換和/或缺失一個或多個氨基酸，從而由編碼5T4的DNA制備5T4突變體。例如可通過重組方法制備5T4的取代、缺失或插入變異體，并根據(jù)其與天然形式5T4的免疫交叉反應性進行篩選。
此外，利用國立衛(wèi)生研究院K.Parker設計的程序“肽結合預測”可根據(jù)變異體肽的良好HLA結合能力進行篩選(參見Parker，K.C等1994，J.Immunol.152163)。
5T4的片段、突變體和其它衍生物最好與5T4保持明顯同源性。本文使用的“同源性”是指所述兩個實體共有本領域技術人員確定它們的來源和功能相似的足夠特征。同源性最好用于指序列同一性。所以，5T4衍生物最好與SEQ ID NO2序列具有明顯同一性。
當同源性是指序列同一性時，“顯著同源性”意味著根據(jù)直接序列排列和對比判斷，序列同一性高于40％，優(yōu)選序列同一性高于45％，最優(yōu)選序列同一性50％或更高。
此外可用合適的同源性算法、例如用默認參數(shù)可確定序列同源性(或同一性)。最好使用參數(shù)設定為默認參數(shù)的BLAST算法。BLAST算法在http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html網(wǎng)址有詳細描述，將其通過引用結合到本文中。檢索參數(shù)定義如下，而且優(yōu)選設定為定義的默認參數(shù)。
當BLAST評價時，“顯著同源性”最好就是匹配EXPECT值至少約7、優(yōu)選至少約9、最優(yōu)選10或更高的序列。BLAST檢索的EXPECT默認閾值通常為10。
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx程序使用的探試檢索算法；這些程序利用在幾個方面增強的Karlin和Altschul的統(tǒng)計方法(參見http://wwW.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html)將顯著性賦予其發(fā)現(xiàn)。BLAST程序適用于序列相似性檢索，例如鑒定查詢序列的同系物。此程序一般不用于基序型檢索。關于對序列數(shù)據(jù)庫相似性檢索的基本問題的討論，參見Altschul等(1994)Nature Genetics 6119-129。
在http://www.ncbi.nlm.nih.gov可獲得的5個BLAST程序可完成以下工作 blastp比較氨基酸查詢序列與蛋白序列數(shù)據(jù)庫； blastn比較核苷酸查詢序列與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫； blastx比較核苷酸查詢序列(雙鏈)的6框概念的翻譯產(chǎn)物與蛋白序列數(shù)據(jù)庫； tblastn比較蛋白查詢序列與全部6讀框動態(tài)翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(雙鏈)； tblastx比較核苷酸查詢序列的6框翻譯與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫的6框翻譯。
BLAST應用以下檢索參數(shù) HISTOGRAM顯示每個檢索的記分方框圖；默認yes。(參見BLAST手冊的參數(shù)H)。
DESCRIPTIONS將報告的匹配序列短描述的數(shù)目限定為規(guī)定的數(shù)目；默認限制為100條描述。(參見所述手冊的參數(shù)V)。此外參閱EXPECT和CUTOFF。
ALIGNMENTS將數(shù)據(jù)庫序列限定為報告高記分區(qū)段對(HSP)規(guī)定的數(shù)目；默認極限為50。如果高于此數(shù)目的數(shù)據(jù)庫序列滿足報告的統(tǒng)計學顯著性閾值(參見以下的EXPECT和CUTOFF)，則只報告最大統(tǒng)計學顯著性的匹配。(參見BLAST手冊的參數(shù)B)。
EXPECT報告與數(shù)據(jù)庫序列匹配的統(tǒng)計學顯著性閾值；默認值10，這樣按照Karlin和Altschul的隨機模型(1990)，預期僅能偶然發(fā)現(xiàn)10個匹配物。如果一個匹配的統(tǒng)計學顯著性大于EXPECT閾值，則不能報告該匹配。較低的EXPECT閾值更為嚴格，使得報告匹配的機會更低。分數(shù)值是可接受的。(參見BLAST手冊的參數(shù)E)。
CUTOFF報告高記分區(qū)段對的截止記分。根據(jù)EXPECT值(見上文)計算默認值。只有當歸為數(shù)據(jù)庫序列的區(qū)段的統(tǒng)計學顯著性至少高達歸為記分等于CUTOFF值的單一HSP的統(tǒng)計學顯著性時，才能報告數(shù)據(jù)庫序列的HSP。較高的CUTOFF值更為嚴格，使得報告匹配的機會更小。(參見BLAST手冊的參數(shù)S)。通?？梢杂肊XPECT更直觀地處理顯著性閾值。
MATRIX規(guī)定BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX的交替記分矩陣。默認矩陣為BLOSUM62(Henikoff & Henikoff，1992)。有效替換選擇包括PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY。BLASTN沒有可用的替換記分矩陣；在BLASTN查詢時指定MATRIX指示會返回出錯答復。
STRAND將TBLASTN檢索剛好限制于所述數(shù)據(jù)庫的上鏈或下鏈；或者將BLATN、BLASTX或TBLASTX檢索限制于查詢序列的上鏈或下鏈的讀框。
FILTER屏蔽按照Wootton & Federhen((1993)Computers andChemistry 17149-163)的SEG程序確定的組成復雜性低的查詢序列區(qū)段，或者按照Claverie & States((1993)Computers and Chemistry 17191-201)的XNU程序確定或者如果為BLASN則按照Tatusov和Lipman的DUST程序(參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov)確定的由短周期性內(nèi)重復序列組成的區(qū)段。過濾可從blast輸出消除具有統(tǒng)計學意義而沒有生物學意義的報告(例如命中常見的酸性氨基酸豐富區(qū)、堿性氨基酸豐富區(qū)或脯氨酸豐富區(qū))，留下可利用的與數(shù)據(jù)庫序列特異性匹配的查詢序列的更有生物學意義的區(qū)。
在核苷酸序列中用字母“N”(例如“NNNNNNNNNNNNN”)以及在蛋白序列中用字母“X”(例如“XXXXXXXXX”)代替過濾程序發(fā)現(xiàn)的復雜性低的序列。
過濾僅適用于查詢序列(或其翻譯產(chǎn)物)，不適用于數(shù)據(jù)庫序列。默認過濾對于BLASTN是DUST，其它程序是SEG。
當用于SWISS-PROT中的序列時，用SEQ、XNU或二者未屏蔽任何區(qū)段不是異常情況，因此不能預期過濾總能產(chǎn)生作用。此外，在某些情況下，整個序列受到屏蔽，說明對未過濾查詢序列報告的任何匹配的統(tǒng)計學顯著性值得懷疑。
NCBI-gi使得在輸出顯示NCBI gi標識符，登錄名和/或位置名(locus name)。
最優(yōu)選用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST提供的簡單BLAST檢索算法進行序列比較。
另一方面，用在http://biology.ncsa.uiuc.edu/BW30/BW.cgi可獲得的算法如FastA可確定序列同源性。人們認為FastA對于排列對比短序列優(yōu)于BLAST。最好用http://biology.ncsa.uiuc.edu/BW30/BW.cgi的默認參數(shù)使用FastA算法。
最好以分離形式提供本發(fā)明的蛋白或其衍生物?！胺蛛x的”是指已經(jīng)鑒定所述蛋白或衍生物，而且不含其天然環(huán)境的一種或多種組分。分離的5T4包括重組細胞培養(yǎng)物的5T4。存在于表達重組5T4基因的生物體的5T4，無論是否分離的5T4蛋白，均包括在本發(fā)明范疇內(nèi)。
在人類抗腫瘤免疫接種中，優(yōu)選使用非人類TAA。因此本發(fā)明提供犬5T4。最好提供用作人類疫苗組分的犬5T4，以在人類接受者激發(fā)針對人5T4的免疫應答。
犬5T4的序列見SEQ ID NO.3。本領域技術人員例如利用衍生自SEQ ID NO.3的核酸探針進行雜交可獲得其它犬來源的序列。
因此，例舉核酸可表征為編碼犬5T4蛋白并與SEQ ID NO.3所示DNA序列或所述DNA序列的選定片段雜交的核苷酸序列。優(yōu)選在高嚴格條件下與SEQ ID NO3序列雜交的編碼犬5T4的這類序列。
嚴格雜交是指多核酸雜交分子是穩(wěn)定的雜交條件。這類條件對本領域技術人員而言是顯而易見的。本領域技術人員已知，雜交分子的解鏈溫度(Tm)反映雜交分子的穩(wěn)定性，序列同源性每降低1％解鏈溫度就降低約1-1.5℃。一般來說，雜交分子的穩(wěn)定性是鈉離子濃度和溫度的函數(shù)。通常在高嚴格條件下進行雜交反應，然后進行不同嚴格性的洗滌。
本文使用的高嚴格性是指只允許在65-68℃的1M Na+中形成穩(wěn)定雜交分子的核酸序列雜交的條件。例如通過在含6×SSC、5×Denhardt、1％SDS(十二烷基硫酸鈉)、0.1Na+焦磷酸鹽和0.1mg/ml變性鮭精DNA作為非特異性競爭物的水溶液中雜交，可提供高嚴格條件。雜交后，可以幾個步驟進行高嚴格性洗滌，最后一次洗滌在0.2-0.1×SSC、0.1％SDS中于雜交溫度下進行(約30分鐘)。
中等嚴格性是指相當于在上述溶液中但是于約60-62℃雜交的條件。在此情況下，最后一次洗滌在1×SSC、0.1％SDS中于雜交溫度下進行。
低嚴格性是指相當于在上述溶液中于約50-52℃雜交的條件。在此情況下，最后一次洗滌在2×SSC、0.1％SDS中于雜交溫度下進行。
當然可以修改并用多種緩沖液例如甲酰胺為基礎的緩沖液和溫度重復進行這些條件。Denhardt溶液和SSC是本領域技術人員周知的，其它合適雜交緩沖液亦如此(參見例如Sambrook等編輯(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York或Ausubel等編輯(1990)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.)。因為探針的長度和GC含量也具有影響，所以不得不根據(jù)經(jīng)驗確定最佳最佳雜交條件。
此外，本發(fā)明優(yōu)選提供能夠在嚴格條件下與SEQ ID NO3片段雜交的核酸序列。所述片段優(yōu)選為15-50個堿基長度。優(yōu)選約25個堿基長度。
根據(jù)本文提供的指導，按照本領域周知的方法可獲得本發(fā)明核酸。例如利用聚合酶鏈反應(PCR)通過化學合成或篩選由認為具有犬5T4并以可檢測水平表達的來源制備的基因組文庫或合適cDNA文庫，可獲得本發(fā)明DNA。
合成目的核酸的化學方法是本領域已知的，包括三酯法、亞磷酸酯法、亞磷酰胺法和H-磷酸酯法、PCR和其它自動引物(autoprimer)法以及固相支持物上寡核苷酸合成。如果已知所述核酸的完整核酸序列或可獲得與所述編碼鏈互補的核酸序列，可使用這些方法。另一方面，如果已知所述目標氨基酸序列，人們可以利用每個氨基酸殘基的已知和優(yōu)選編碼殘基推斷出可能的核酸序列。
分離編碼犬5T4的基因的一個替代方法是按照Sambrook等1989的第14小節(jié)所述使用PCR技術。此方法需要使用與犬5T4核酸雜交的寡核苷酸探針。以下描述選擇寡核苷酸的策略。
用設計用以鑒定目的基因或其編碼的蛋白的探針或分析工具篩選文庫。對于cDNA表達文庫，合適的工具包括識別而且特異性結合犬5T4的單克隆抗體或多克隆抗體；編碼相同物種或不同物種的已知或不確定犬5T4 cDNA的約20-80個堿基長度的寡核苷酸；和/或編碼相同基因或雜交基因的互補或同源cDNA或其片段。篩選基因組DNA文庫的合適探針包括但不限于編碼相同或雜交DNA的寡核苷酸、cDNA或其片段；和/或同源基因組DNA或其片段。
用探針即包括衍生自SEQ ID NO3所示序列的寡核苷酸的本文公開的核酸，在合適雜交條件下篩選合適cDNA或基因組文庫，可分離獲得編碼犬5T4的核酸。合適文庫可市售獲得或可由例如細胞系、組織樣品等制得。
本文使用的探針例如為具有包括10-50、優(yōu)選15-30而最優(yōu)選至少約20連續(xù)堿基的核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，所述連續(xù)堿基與SEQ ID NO3所示相同數(shù)目或更多數(shù)目的連續(xù)堿基相同(或是其互補物)。選擇作探針的核酸序列應該具有足夠長度和足夠明確，這樣使假陽性結果降低到最少。所述核苷酸序列通常基于犬5T4的保守或高度同源的核苷酸序列或區(qū)。用作探針的核酸可在一個或多個位置是簡并性的。當從物種的優(yōu)選密碼子使用未知的物種篩選文庫時，使用簡并寡核苷酸可能特別重要。
由其構建探針的優(yōu)選區(qū)包括5’和/或3’編碼序列、預期編碼配體結合位點的序列等。例如本文公開的全長cDNA克隆或其片段可用作探針。最好用合適的標記方法標記本發(fā)明的核酸探針，以便雜交后隨時進行檢測。例如，一種合適的標記方法是放射性標記。標記DNA片段的優(yōu)選方法為利用隨機引發(fā)反應中的DNA聚合酶的Klenow片段摻入α32P dATP，這是本領域周知的。通常用γ32P-標記的ATP和多核苷酸激酶對寡核苷酸進行末端標記。然而，其它方法(例如非放射性方法)也可用于標記所述片段或寡核苷酸，包括例如酶標記、利用合適熒光團的熒光標記和生物素?；?br> 例如用基本上包含所述完整犬5T4編碼序列或基于一部分所述DNA的合適寡核苷酸篩選所述文庫后，通過檢測雜交信號鑒定陽性克??；以限制性酶作圖和/或DNA序列分析表征所鑒定的克隆，然后例如與本文給出序列比較進行檢測，以確定它們是否包含編碼完整犬5T4的DNA(即它們包括翻譯起始密碼子和終止密碼子)。如果選定的克隆不是完整的，它們可用于再篩選相同文庫或不同文庫以獲得重疊克隆。如果所述文庫是基因組文庫，則所述重疊克隆可包括外顯子和內(nèi)含子。如果所述文庫是cDNA文庫，則所述重疊克隆將包括一個可讀框。在這兩種情況下，通過與所述DNA和本文提供的推定氨基酸序列進行比較，可鑒定完整克隆。
設想通過核苷酸取代、核苷酸缺失、核苷酸插入或核苷酸段的倒位以及它們的組合能夠容易地修飾本發(fā)明核酸。這類突變體可用于例如產(chǎn)生具有與天然存在的犬5T4序列不同的氨基酸序列的犬5T4突變體。誘變可以是預期的(定點誘變)或隨機的。非沉默突變的突變不能將序列置于讀框外而且優(yōu)選不產(chǎn)生能夠雜交產(chǎn)生mRNA二級結構如環(huán)或發(fā)夾的互補區(qū)。
上述考慮也適用于分離替代的鼠類(SEQ.ID.NO.2)或人(SEQ.ID.NO.1)5T4抗原。
編碼5T4的載體的給予 按照本發(fā)明的藥用組合物是包括所述編碼5T4抗原的載體作為活性成分的物質(zhì)組合物。設想包括按照本發(fā)明的所述活性成分的藥用組合物的活性成分當以根據(jù)特定病例確定的劑量給予時，例如在治療和/或預防腫瘤或其它與細胞增殖有關的疾病、感染和炎癥性病癥中具有優(yōu)良的治療和/或預防活性?？烧{(diào)整劑量方案以獲得最佳治療反應。例如可每日給予幾個分劑量或根據(jù)治療情況的緊迫性可按比例降低所述劑量。
所述活性化合物可以常規(guī)方式給予，例如口服、靜脈內(nèi)(當為水溶性的情況下)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或栓劑途徑或植入(例如用緩釋分子)。根據(jù)給藥途徑，可能需要用保護所述成分免于酶、酸和可能使所述成分失活的其它天然條件的物質(zhì)對所述活性成分進行包衣。
為了通過非胃腸外給藥給予所述活性化合物，將用防止其失活的物質(zhì)進行包衣，或利用防止其失活的物質(zhì)給予所述活性化合物。例如可用輔助劑給予所述活性化合物，或與酶抑制劑共同給予，或以脂質(zhì)體給予所述活性化合物。在其最廣義上應用輔助劑，包括任何免疫刺激化合物如干擾素。本文設計的輔助劑包括間苯二酚、非離子表面活性劑如聚氧化乙烯油醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制劑包括胰腺胰蛋白酶。
脂質(zhì)體包括水-包-油-包-水CGF乳劑以及常規(guī)脂質(zhì)體。
所述活性化合物也可以胃腸外或腹膜內(nèi)給予。還可用甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油制備分散劑。在常規(guī)貯藏和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物生長。
適合注射用的藥物形式包括無菌水溶液(當為水溶性時)或分散劑和用于臨時配制的無菌注射溶液或分散劑的無菌粉。在所有情況下，所述藥物形式必須是無菌的而且流體程度必須易于注射。在生產(chǎn)和貯藏條件下必須是穩(wěn)定的，而且必須對微生物污染如細菌和真菌是防腐的。所述載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、它們的合適混合物以及植物油。例如應用包衣如卵磷脂、在分散劑時通過保持需要的顆粒粒度以及通過使用表面活性劑可保持合適流動性。
可應用各種抗菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thirmerosal)等可防止微生物的作用。在多數(shù)情況下，最好包含等滲劑，例如糖或氯化鈉。在所述組合物中使用延遲吸收劑例如單硬脂酸鋁和明膠可延長注射組合物的吸收。
無菌注射溶液的制備為在含有各種其它以上列舉的成分(根據(jù)需要)的合適溶劑中加入需要的量的所述活性化合物，然后過濾除菌。一般來說分散劑的制備是將所述無菌活性成分加入無菌溶媒中，所述溶媒含有基本分散介質(zhì)和所需要的以上列舉的其它成分。如果為用于制備無菌注射溶液的無菌粉時，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和凍干技術，此技術可獲得其上述無菌過濾溶液的所述活性成分和任何其它需要成分的粉末。
當如上所述適當保護所述活性化合物時，例如可用惰性稀釋劑或可食可同化載體口服給予，或者可將其包封在硬明膠膠囊或軟明膠膠囊內(nèi)，或者可將其壓成片，或者可將其直接加入膳食食品中。對于治療性口服給藥，所述活性成分可與賦形劑混合，并以可攝食片劑、口頰片、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸浮劑、糖漿劑、糯米紙囊劑等形式使用。在這類治療性應用的組合物中的活性化合物量使得可獲得適當?shù)膭┝俊?br> 所述片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑等還可以含有以下成分黏合劑如西黃蓍膠、金合歡膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑如磷酸二鈣；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸等；潤滑劑如硬脂酸鎂；以及可加入甜味劑如蔗糖、乳糖或糖精或調(diào)味劑如薄荷、冬青油或櫻桃調(diào)味劑。當所述劑型為膠囊劑時，除了上述類型物質(zhì)，它還可含有液體載體。
各種其它物質(zhì)可以為包衣或改善所述劑型的物理形式。例如可用蟲膠、糖或二者對片劑、丸劑或膠囊劑進行包衣。糖漿劑或酏劑可含有所述活性成分、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、顏料和調(diào)味劑如櫻桃或橙調(diào)味劑。當然，用于制備任何單位劑型的任何物質(zhì)應該為藥物純而且在所述使用量基本上無毒。此外，所述活性化合物可加入緩釋制劑和配方中。
本文使用的“藥學上可接受的載體和/或稀釋劑”包括任何溶劑和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等。使用適用于藥物活性物質(zhì)的這類介質(zhì)和物質(zhì)是本領域周知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或物質(zhì)與所述活性成分不匹配，否則設計其在所述治療性組合物中的使用。其它活性成分也可加入所述組合物中。
特別優(yōu)選配制易于給藥和劑量均一的單位劑型的胃腸外組合物。本文使用的單位劑型是指適用作待治療的哺乳動物受治療者的單位劑量的物理性獨立單位；每個單位含有經(jīng)計算可與需要的藥用載體一起產(chǎn)生需要治療效應的預定量的活性物質(zhì)。本發(fā)明新型單位劑型的規(guī)格表示為而且直接取決于(a)所述活性物質(zhì)的獨特特征和需要達到的具體治療效應，以及(b)調(diào)劑技術固有的限制，例如用于治療活的受治療者疾病的活性物質(zhì)的固有限制，所述受治療者其疾病狀態(tài)使機體健康受損。
對于適合有效的給藥，將有效量的主要活性成分與合適的藥學上可接受的載體調(diào)劑成單位劑型。如果組合物含有其它活性成分，則參考所述成分的常規(guī)劑量和給藥方式確定其劑量。
利用常規(guī)的效力測試試驗決定按照本發(fā)明的5T4表達載體的給藥方案。然而特別優(yōu)選包括連續(xù)的激發(fā)和加強步驟的方案。人們觀測到，這類方案可成功地較好消除免疫耐受并誘導CTL應答。在一個優(yōu)選實施方案中，應用非病毒載體如編碼5T4的質(zhì)粒進行激發(fā)步驟，同時應用編碼5T4的病毒載體如痘病毒載體進行加強免疫(參見Schneider等，1998 Nat Med4397-402)。
給予5T4抗原的方法 一般來說，可用以上概述的關于給予5T4編碼核酸的方法給予作為常規(guī)疫苗制劑的5T4抗原，用以治療和/或預防腫瘤。
通?？芍苽?T4抗原的疫苗。本領域技術人員已知包含5T4活性成分的疫苗的制備。這類疫苗一般為可注射的液體溶液或懸浮液；也可以制備注射前可用液體配制為溶液或懸浮液的固體形式。也可以制備乳化劑，或?qū)⑺龅鞍装z囊于脂質(zhì)體中。通常將所述活性免疫原成分與藥學上可接受的而且與所述活性成分匹配的賦形劑混合。合適的賦形劑例如為水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合物。
此外，如果需要的話，所述疫苗可包含微量增強所述疫苗作用的輔助物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑和/或佐劑。可能有效的佐劑實例包括但不限于氫氧化鋁、N-乙酰基-胞壁?；?L-蘇氨?；?D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?nor-胞壁酰基-L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺(CGP 11637，稱為nor-MDP)、N-乙?；邗；?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，稱為MTP-PE)和RIBI，RIBI含有用2％角鯊烯/吐溫80乳液從細菌提取的3個組分(即單磷酰脂質(zhì)A、海藻糖二霉菌酸酯和細胞壁骨架(MPC+TDM+CWS))。
佐劑和其它物質(zhì)的其它實例包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁鉀(明礬)、硫酸鈹、二氧化硅、高嶺土、碳、油包水乳液、水包油乳液、胞壁酰二肽、細菌內(nèi)毒素、脂質(zhì)X、小棒桿菌(Corynebacterium parvum)(Propionobacterium acnes)、百日咳桿菌(Bordetella pertussis)、多核糖核苷酸、海藻酸鈉、羊毛脂、溶血卵磷脂、維生素A、皂甙、脂質(zhì)體、左旋咪唑、DEAE-葡聚糖、嵌段共聚物或其它合成佐劑。這類佐劑可從各種來源市售獲得，例如Merck佐劑65(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)或弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑(Difco Laboratories，Detroit，Michigan)。
通常使用的佐劑例如有Amphigen(水包油)、Alhydrogel(氫氧化鋁)或Amphigen和Alhydrogel的混合物。只有氫氧化鋁批準用于人類。
免疫原和佐劑的比例范圍可以變化很大，前提是兩者的含量均為有效量。例如氫氧化鋁的含量可以為所述疫苗混合物(Al2O3為主)的0.5％左右。通常配制疫苗的免疫原終濃度為0.2-200μg/ml、優(yōu)選5-50μg/ml、最優(yōu)選15μg/ml。
配制后，將疫苗裝入無菌容器，然后密封容器，保藏于低溫，例如4℃，或者可以將其凍干。凍干使得可以穩(wěn)定形式長期保藏。
通常通過胃腸外例如注射(例如皮下或肌內(nèi)注射)給予疫苗。適合其它給予模式的其它制劑包括栓劑以及某些情況下的口服制劑。對于栓劑，傳統(tǒng)的黏合劑和載體包括例如聚亞烷基二醇或甘油三酯；用所述活性成分含量為0.5％-10％、優(yōu)選1％-2％的混合物可制成這樣的栓劑?？诜苿┌Ｒ?guī)使用的賦形劑，例如藥用級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物的形式可以為溶液劑、懸浮劑、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋制劑或散劑，而且活性成分的含量為10％-95％、優(yōu)選25％-70％。當凍干所述疫苗組合物時，給予前可以復制所凍干的物質(zhì)，例如復制為懸浮液。復制優(yōu)選用緩沖液進行。
利用腸溶包衣可制備口服給予患者的膠囊劑、片劑和丸劑，所述腸溶包衣包括例如Eudragit“S”、Eudragit“L”、乙酸纖維素、鄰苯二甲酸乙酸纖維素或羥丙基甲基纖維素。
可將5T4配制為中性或鹽形式的疫苗。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(與所述肽的游離氨基形成)，與無機酸(如鹽酸或磷酸)或有機酸(例如乙酸、草酸、酒石酸和馬來酸)形成酸加成鹽。與游離羧基形成的鹽也可衍生自無機堿如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵以及諸如異丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸和普魯卡因的無機堿。
對給予5T4的效力的測量 可按照本領域已知的任何技術評價5T4作為免疫治療性分子的活性，包括對抗體產(chǎn)生、誘導CTL應答和腫瘤抑制模式的測定。在以下實施例中描述典型的技術。
進一步用以下實施例描述本發(fā)明，其目的僅僅是為了說明本發(fā)明，其中參考以下附圖。


圖1a圖示一個基因構建物； 圖1b圖示一個基因構建物； 圖2a為一個照片圖； 圖2b為一個照片圖； 圖3a為一個坐標圖； 圖3b為一個坐標圖； 圖4a為一個坐標圖； 圖4b為一個坐標圖； 圖4c為一個坐標圖； 圖5為一個坐標圖； 圖6為一個坐標圖； 圖7為一個坐標圖； 圖8為一個坐標圖；和 圖9為一個坐標圖。
以下略為詳細地描述上述圖 圖1a為重組痘苗病毒MVA的圖譜。轉(zhuǎn)基因處于合成的痘苗病毒早期/晚期啟動子控制之下。Lac Z基因處于痘苗病毒7.5k早期/晚期啟動子控制之下。這些基因側翼的DNA區(qū)衍生自MVA的缺失區(qū)2，因此使得同源重組到此位點。
圖1b為重組痘苗病毒W(wǎng)R的圖譜。轉(zhuǎn)基因處于合成的痘苗病毒早期/晚期啟動子控制之下。LacZ基因處于痘苗病毒7.5k早期/晚期啟動子控制之下。所述基因側翼的DNA區(qū)衍生自Wyeth病毒株VV的胸苷激酶(tk)基因，因此使得同源重組到此位點。
圖2圖示表達人5T4的重組痘苗病毒的蛋白質(zhì)印跡分析。使樣品在12％SDS PAGE上走電泳，并將其轉(zhuǎn)運到硝酸纖維素膜上。
圖2a用1∶500稀釋度的MAb 5T4(抗人5T4)探測印跡。用抗小鼠HRP綴合抗體和ECL顯示結合抗體。泳道1表達人5T4的重組WR克隆1；泳道2表達人5T4的重組WR克隆2；泳道3用WR感染的BS-C-1細胞；泳道4未感染的BS-C-1細胞；泳道5B16黑素瘤細胞；泳道6表達人5T4的B16細胞系。
圖2b用1∶500稀釋度的兔抗小鼠5T4探測印跡。泳道1表達LacZ的重組WR；泳道2表達小鼠5T4的重組WR；泳道3表達人5T4的重組WR；泳道4表達小鼠5T4的重組MVA。
圖3a和3b為顯示用MVA-h5T4接種小鼠對用表達h5T4的CT26攻擊的保護作用的兩幅圖。
圖4a為顯示用MVA-h5T4接種誘導的對表達h5T4的B16腫瘤的抗腫瘤活性的圖。
圖4b和4c為顯示用MVA-m5T4接種誘導的對表達m5T4的B16腫瘤的抗腫瘤活性的兩幅圖。
圖5為顯示MVA-h5T4在預先建立了肺腫瘤的小鼠中誘導的腫瘤治療作用的圖。
圖6為顯示用MVA-m5T4接種免疫小鼠的腫瘤發(fā)育速率低于接受對照疫苗的小鼠的圖。
圖7為顯示用MVA-m5T4免疫接種小鼠的腫瘤負荷低于接受MVA-LacZ處理的小鼠的圖。
實施例 實施例1 重組痘苗病毒載體的構建 痘苗病毒的繁殖 高度減毒的病毒株MVA衍生自復制型病毒株Ankara，而且已經(jīng)在原代雞胚成纖維細胞中傳代了570代以上。起初人們認為MVA復制僅限于CEF細胞，因為據(jù)報道在哺乳動物細胞中的復制能力最小。然而，進一步分析證明，幼倉鼠腎細胞(BHK-21)能夠支持產(chǎn)生高滴度的MVA。因此也可在BHK-21或原代CEF細胞上培養(yǎng)MVA(Carroll&Moss(1997)Virology 238198-211)。
為了制備CEF細胞，將10天齡雞胚去內(nèi)臟，并去除肢體和頭，然后剪碎，在0.25％胰蛋白酶溶液中進行胰酶消化并于37℃溫育。使細胞懸浮液通過過濾器孔，洗滌細胞，用Sorvall RC-3B以2000rpm離心濃縮5分鐘(concentrated by centrifugation at 2000 rpm in a SorvallRC-3B at1500 rpm for 5 mins)。將細胞懸浮在含10％FCS的MEM中，將其等份在175cm培養(yǎng)瓶并于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當單層細胞融合95％時，用胰蛋白酶消化，將其接種到另外的培養(yǎng)瓶或6孔培養(yǎng)板。或者就原代培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到31℃培養(yǎng)箱備用(Sutter和Moss(1992)Proc Natl Acad Sci USA 8910847-10851)。
制備粗制、半純化和純化病毒母液 制備病毒母液用于初步的重組病毒分析或用作隨后的高滴度病毒制劑的病毒母液。離心去除細胞膜和細胞核或者或者通過包括蔗糖離心的其它步驟以防止預表達重組蛋白產(chǎn)物和細胞器污染，從而可半純化痘苗病毒制劑。所用的方法為以下文獻方法的改良方法Earl等，載于Ausubel等(編輯)，(1991)Current Protocols in MolecularBiology，第16.16.1-16.16.17頁，紐約Greene Publishing Associates andWilev Interscience；Earl和Moss，同上，第16.17.1-16.17.16頁；Earl和DMoss，同上，第16.18.1-16.18.10頁；Bronte等，(1997)Proc Natl AcadSci USA94(7)3183-3188。
粗制病毒 在175平方厘米組織培養(yǎng)瓶中，以CEF或BHK-21(得自ATCC)培養(yǎng)MVA，以HeLa或BS-C-1(ATCC)培養(yǎng)WR。簡單地說，用MVA或WR以感染復數(shù)(moi)約1pfu感染融合單層細胞。用含2％FCS的10mlMEM懸浮病毒，并加入包含融合單層細胞的175平方厘米培養(yǎng)瓶中。于37℃溫育1小時后，再加入20ml含2％FCS的MEM。48-72小時后，將感染細胞刮入培養(yǎng)基中，以1500g離心沉淀5分鐘。對于粗制病毒制劑，每個175平方厘米培養(yǎng)瓶用2ml MEM(2％)懸浮細胞。凍融細胞3次，超聲處理并等份裝入1ml凍藏管中。凍融一個代表等份，并滴定確定病毒濃度。病毒母液保藏于-20℃以下。
半純化制劑 按以前所述(Earl等；Earl和Moss；1991)收獲感染細胞。離心后，用PBS(2ml/175cm2培養(yǎng)瓶)重懸浮細胞，在冰上，用緊密玻璃塞勻漿器(tight fitting glass dounce homogeniser)來回勻漿30-40次。顯微鏡下檢查細胞破碎情況。以300g離心5分鐘(4℃)，以去除細胞核、細胞器和細胞膜，保留上清液。以1ml/175cm2培養(yǎng)瓶重懸浮細胞沉淀物，并重復離心。合并上清液，分為等份并保藏。
純化制劑 按以前所述(Earl等；Earl和Moss；1991)收獲感染細胞，并用10mM Tris.CI，pH9.0(2ml/培養(yǎng)瓶)重懸浮細胞，該程序此后將樣品保持在冰上。用10mM Tris如上所述勻漿。用XL2016超聲杯(Misonics，USA)以最大輸出功率(500W)超聲處理細胞裂解液1分鐘。將樣品置于冰上1分鐘，重復超聲多達3次。一次超聲最多5ml，而且在超聲過程中不斷補充冰。將細胞裂解液輕輕地加到SW-27離心管中的17ml36％蔗糖(10mM Tris.Cl，pH9.0)的層上形成分層。用SW-27轉(zhuǎn)子在4℃下以13500rpm(32,900x g)離心細胞裂解液80分鐘。棄上清液，病毒沉淀物重懸浮在無菌PBS中，并用杯式超聲儀超聲處理1分鐘(在冰上)。等份濃縮病毒，保藏于-20℃以下。
實施例2 構建和特征鑒定表達5T4的重組病毒載體 將鼠5T4基因和人5T4基因克隆入WR(pSC65)(Chakrabarti等，(1997)Biotechniques 231094-7)和MVA(pLW22)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中，以允許同源重組入相應病毒基因組的靶區(qū)。
表達人5T4和鼠5T4的重組MVA和WR 通過Eco RI和BamHI限制性消化分別從pBSII-m5T4(含5T4cDNA的pBluescript(Stratagene))和pBSII-h5T4(Myers等，(1994)JBC2699319-9324)切除14kb鼠5T4和1.4kb人5T4(P.Stern PatersonInstitute Manchester提供)基因。用dNTP和DNA聚合酶“補平”使片段的末端平端化。使平端末端片段克隆入pLW22(MVA轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，由MCS上游的早晚期啟動子(Chakrabarti等，1997)組成，鄰近為用于檢測重組病毒的VV7.5Kb LacZ盒；參見圖1a)的PmeI位點和pSC65的Sma I位點(b)(Chakrabarti等，1997)中。pLW22和pSC65分別控制同源重組進入缺失區(qū)II和tk基因。
在預定用于免疫接種人類接受者的構建物時，去除處于7.5k啟動子控制下的LacZ基因。如以前的文獻所述(Wyatt等，(1996)Vaccine141451-1458)，利用抗5T4單克隆抗體經(jīng)活體免疫染色鑒定重組噬菌斑。
用噬菌斑純化克隆的CEF細胞培養(yǎng)B.Moss(NIH，Bethesda，USA)提供的野生型MVA，而且它是用于制備以前描述的重組病毒的相同分離株(Sutter和Moss(1992)Proc Natl Acad Sci USA 8910847-10851，Sutter等(1994)Vaccine 121032-1040，Hirsch等(1996)J Virol 703741-3752，Carroll和Moss(1995)Biotechniques 19352-355，Wyatt等(1995)Virology 210202-205，Sutter等，(1995)FEBS Lett.3719-12，Wyatt等(1996)Vaccine14，1451-1458，Carroll等(1997)Vaccine，15387-394，Carroll和Moss(1997)Virology238198-211)。B.Moss(NIH)提供WR母液，得自ATCC分離株(參見例如Earl和Moss，1991)。以HeLa S3細胞(ATCC)制備WR母液。
用于制備重組MVA病毒的方法類似于以前所述的方法(Carroll&Moss(1997)Virology 238198-211)。簡單地說用MVA母液以0.1感染復數(shù)感染BHK-21或CEF細胞。用100μl d.H2O將質(zhì)粒DNA稀釋為2μg，將其與用無菌d.H2O稀釋為100μl的30μg脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(BRL)混合。在室溫下溫育10分鐘后，在覆蓋于Opti MEM上的感染細胞上加入脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑/DNA溶液。于37℃溫育后5小時，吸出細胞培養(yǎng)基，重新加入含2％FCS的MEM。溫育36小時后收獲細胞，在5-溴-3-吲哚基-D-半乳糖苷酶的存在下測定CEF或BH k-21細胞上β-gal的表達。分離的噬菌斑為至少另外純化3次的噬菌斑。噬菌斑純化后用CEF或BHK-21細胞制備少量病毒母液。
構建重組WR的方案類似于以前文獻描述的方案(Carroll和Moss(1995)Biotechniques 19352-355；Earl和Moss，1991)。簡單地說與MVA一樣進行重組。但是使用BS-C-1細胞，而且使用含有LacZ基因5-溴-3-吲哚基-D-半乳糖苷酶的底物的上層瓊脂，在存在BrdU下，以143B tk-細胞分析重組噬菌斑。使用中性紅檢測LAC Z陰性自發(fā)tk病毒以評價病毒均一性， 使用類似于以前文獻描述的方法(Carroll & Moss(1997)Virology238198-211)，采用h5T4和m5T4特異性抗體通過直接噬菌斑免疫染色初步分析重組蛋白的表達。簡單地說重組病毒在單層BS-C-1細胞上形成噬菌斑，用丙酮/甲醇固定，用MAb 5T4處理(Hole N和Stern PL，(1990)Int J Cancer 45(1)179-184)。用抗小鼠HRP綴合抗體和鄰聯(lián)茴香胺底物顯示重組5T4蛋白表達。因為MAb識別構象表位，所以在非還原條件下通過蛋白質(zhì)印跡分析進一步特征鑒定5T4表達蛋白。由圖2可見，重組病毒高水平表達合適大小的72kDa蛋白。按Carroll&Moss(1997)Virology 238198-211所述用雙重免疫染色檢測母液的均一性。
實施例3 闡明人5T4與小鼠5T4的免疫交叉保護的動物模型 為了確定一種物種的5T4基因產(chǎn)物是否能夠在另一物種體內(nèi)誘導對5T4的免疫，以鼠腫瘤模型測試重組痘病毒。小鼠模型基于BALB/c來源的化學誘導腺癌CT26(Brittain等，(1980)Cancer Res.40179-184)和衍生自C57 B6小鼠的黑素瘤系B16。CT26系和B16均穩(wěn)定轉(zhuǎn)化表達人5T4和鼠5T4。小鼠靜脈注射(產(chǎn)生肺結節(jié)，CT26)或皮下注射(CT26和B16)以產(chǎn)生皮下單一腫瘤塊。
在第0、21和42天，對各組(每組7只)BALB/c小鼠以1×107pfuIV或IM接種MVA-h5T4(在此5T4抗原稱為OBA1)構建物。然后用5×105人5T4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞靜脈內(nèi)攻擊小鼠。攻擊后14天，取出小鼠肺臟，并計數(shù)肺結節(jié)。
結果3 圖3a和3b所示結果證實，用MVA-h5T4免疫的小鼠當用表達h5T4蛋白的同基因腫瘤系CT26攻擊時呈現(xiàn)抗腫瘤活性。Mann-Whitney統(tǒng)計分析顯示，與接種MVA-LacZ或PBS的小鼠相比，接種MVA-h5T4后的保護是顯著的(p<0.05)。
實施例4 用107pfuMVA-h5T4(IV或IM)或MVA-Lac Z(IV)接種各組C57BL6小鼠，每組5只小鼠，間隔3周，接種2次。用5×105B16-h5T4細胞攻擊小鼠。腫瘤攻擊后每間隔2天記錄腫瘤大小。計算各個腫瘤面積。
用107pfuMVA-m5T4(IV或IM)或MVA-Lac Z(IV)接種各組C57BL6小鼠，每組5只和7只小鼠，間隔3周，接種2次。用5×105B16-m5T4細胞攻擊小鼠。腫瘤攻擊后每間隔2天記錄腫瘤大小。計算各個腫瘤面積。
結果4 圖4a顯示，當B16-h5T4攻擊小鼠時接種MVA-h5T4的小鼠具有明顯的抗腫瘤效應。圖4a數(shù)據(jù)的Mann-Whitney統(tǒng)計分析證實，與接種MVA-LacZ相比，接種MVA-h5T4后的腫瘤抑制是明顯的(p<0.05)。
圖4b和4c顯示，當用B16-m5T4攻擊小鼠時，接種MVA-m5T4具有明顯的抗腫瘤效應。圖4c數(shù)據(jù)的Mann-Whitney統(tǒng)計分析證實，與接種MVA-LacZ相比，接種MVA-m5T4后的腫瘤阻滯是顯著的(p<0.05)。
實施例5 用5×105CT26-h5T4細胞IV注射雌性BALB/c小鼠。3天后建立巨型肺腫瘤。在接種腫瘤后第3和10天以107pfu MVA-Lac Z、MVA-h5T4(每組10只小鼠)或PBS(一組5只小鼠)處理小鼠。在接種腫瘤后14天將肺臟染色并計數(shù)腫瘤。
結果5 由圖5可知，MVA-h5T4處理對建立的表達h5T4的CT26肺結節(jié)具有顯著治療作用。統(tǒng)計學分析(Mann-Whitney)表明，與MVZ-Lac Z或PBS相比，MVA-h5T4治療具有顯著性(p<0.05)。
實施例6 CT26-m5T4和B16-m5T4自身抗原模型 用1×107pfuMVA-LacZ(n＝3)或MVA-m5T4(n＝6)IV接種C57BL6小鼠，間隔3周接種2次。最后一次免疫后3周，用5×105表達m5T4的B16皮下攻擊小鼠。監(jiān)測皮下(S.C.)腫瘤的發(fā)生情況。
圖6表明接種MVA-m5T4小鼠的腫瘤發(fā)展速率低于接受對照疫苗的小鼠。另外，與接受MVA-LacZ處理的小鼠相比，m5T4免疫小鼠的腫瘤體積平均小5倍(第13天時小10倍)。這種保護特性與這些小鼠產(chǎn)生的m5T4抗體應答平行。
實施例7 用1×107pfuMVA-LacZ(n＝5)或MVA-m5T4(n＝6)IV接種BALB/c小鼠，間隔3周接種2次。最后一次免疫后3周，用5×105表達m5T4的CT26攻擊小鼠。攻擊小鼠后12天取出小鼠肺臟，以盲法方式計數(shù)腫瘤結節(jié)。
結果7 圖7表明MVA-m5T4免疫小鼠的腫瘤負荷比接受MVA-LacZ處理的小鼠低。這種保護特性與這些小鼠產(chǎn)生的m5T4抗體應答平行。
實施例8 在C57和BALB/c小鼠誘導的5T4抗體應答 如上所述，用MVA-m5T4和MVA-h5T4免疫小鼠，每次免疫接種后10天取血檢測。
結果8 兩次接種后，MVA-m5T4能夠在BALB/c和C57 B16小鼠均克服免疫耐受。此外，用DNA、接著用MVA激發(fā)小鼠沒有針對m5T4的抗體應答的表現(xiàn)。
因此，在兩種鼠的腫瘤模型證實，免疫接種表達鼠5T4的MVA對表達m5T4的同基因腫瘤細胞具有保護特性。這些抗腫瘤特性與抗m5T4免疫應答(用ELISA測定)平行。此外，證實這種免疫應答的產(chǎn)生不會在這些動物引起自身免疫性毒性。
實施例9 利用激活物(primer)增強免疫得到的針對5T4的免疫應答 為了評價MVA和裸DNA載體在BALB/c和C57 BL6小鼠誘導對5T4的免疫的效力，既用編碼小鼠5T4和人5T4的裸DNA又用MVA載體連續(xù)激發(fā)和加強接種小鼠。更具體地說，在第0天將1×107pfuMVA-5T4靜脈內(nèi)、50gpCl-h5T4(25g/后肢)或25g pCl-m5T4(12.5g/后肢)i接種小鼠，在第21天第二次(加強)接種MVA-5T4。在第29天從小鼠取血，以ELISA測定抗體滴度。
結果9 觀測到的滴度(定義為OD高于MVA-LacZ背景OD2倍的稀釋度)見下表2和3。
表2接種表達人5T4和鼠5T4的MVA和DNA載體的小鼠的鼠5T4抗體滴度 表3接種表達人5T4和鼠5T4的MVA和DNA載體的小鼠的人5T4抗體滴度 結果表明應用DNA:MVA激發(fā)異源5T4抗原(h5T4)加強或MVA:MVA激發(fā)異源或同源5T4(H5T4或m5T4)加強有效產(chǎn)生高滴度抗體。
實施例10 用于癌癥免疫治療的修飾型5T4 可以修飾人5T4以增強其免疫原性，因而可誘導更有效的免疫治療反應。為此，應用國立衛(wèi)生研究院的K.Parker設計的程序“肽結合預測”(http://www-bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parder_comboform)(參見Parker，K.C.等1994J.Immunol.152163)鑒定HLA CTL表位并修飾這類表位，以增強與HLA分子的結合，因而產(chǎn)生更有效的CTL誘導。以下結果得自人5T4 9mer(表4)和鼠(表5)5T4 9mer 表4結合HLA A0201的人5T4 9mer 表5結合人HLA A 0201的鼠5T4 實施例11 誘變H5T4以增強結合HLA A0201 得自Parker的肽結合預測程序的上述數(shù)據(jù)表明，當人AA序列從位置301開始由YMADMVAWL突變?yōu)镠MADMVTWL時，產(chǎn)生與HLA A0201解離的半衰期增加10倍的9mer。這種結合親和力增加明顯增強5T4多肽的CTL誘導特性(此外參閱Overwijk等，1998J ExpMed 188277-86)。
結果11 此外，h5T4 9mer從81開始由NLTEVPTDL突變?yōu)镹LLEVPADL導致h5T4 9mer與HLA A0201的解離半衰期升高4倍。
實施例12 毒性研究 沒有自身免疫毒性 本研究的目的是研究在鼠類模型誘導針對5T4的自身免疫毒性的可能效應。
實驗設計 用107pfu表達人5T4(MVA-h5T4)和鼠5T4(MVA-m5T4)的重組痘苗病毒MVA靜脈內(nèi)接種各組BALB/c和C57 BL6小鼠(每組5只小鼠)。作為陰性對照，用表達大腸桿菌LacZ(MVA-LacZ)的MVA或PBS接種小鼠。
在14個月內(nèi)對雌性BALB/c小鼠接種共計4次。在14個月內(nèi)對C57 BL6小鼠接種3次。接種后取血樣品，以ELISA評價5T4特異性抗體。
結果12a 抗體應答接種2次后，接種MVA-m5T4和MVA-h5T4小鼠血清分別含有高水平的抗m5T4和抗h5T4(見表2和表3)。
毒性每日觀測小鼠的疾病健康體征。在過去的14個月的任何時間，接種MVA-m5T4或MVA-h5T4動物的物理外觀與接種MVA-Lac Z或PBS的動物的確沒有不同。準備了由合格獸醫(yī)準備的關于動物健康的兩個報告，這兩個報告均表明全部動物均表現(xiàn)健康。
總結 在14個月內(nèi)對各組BALB/c和C57 BL6小鼠接種表達m5T4抗原的MVA(MVA-m5T4)或表達h5T4抗原的MVA(MVA-h5T4)高達4次，并檢測毒性體征。盡管表明小鼠具有高滴度的抗m5T4的抗體，但是在14個月內(nèi)沒有患病體征。合格的獸醫(yī)鑒定了這些動物，發(fā)現(xiàn)它們沒有疾病體征，說明沒有自身免疫毒性。
因此，用MVA-h5T4或MVA-m5T4接種BALB/c或C57BL6小鼠可分別誘導針對h5T4和m5T4的抗體應答。這種應答對小鼠健康沒有有害的作用。
實施例12b 5T4自身免疫對生殖能力的影響 在人體和鼠的胎盤發(fā)現(xiàn)了5T4。因此，抗小鼠5T4的免疫應答可能妨礙小鼠懷孕或者影響胎兒健康。我們進行了深入的研究以闡明這些問題。本研究的目的是同時在BALB/c和C57 BL6雌性小鼠評價針對m5T4的免疫應答對妊娠的影響。
實驗設計 用107pfu MVA-m5T4、MVA-LacZ或PBS對各組雌性BALB/c和C57 BL6小鼠(每組5只)靜脈內(nèi)接種3次。在最后一次接種后的特定時間(第10、30和60天)使小鼠交配，并評價其妊娠以及生產(chǎn)健康幼鼠的能力。
結果12b (i)C57 BL6小鼠的研究 表610天的研究 表730天的研究 表860天的研究 (ii)BALB/c小鼠的研究 表910天的研究 表745天的研究 總結 用表達m5T4的MVA重組病毒注射BALB/c和C57BL6小鼠，并誘導抗m5T4抗體應答。讓這些小鼠交配，證實這些小鼠的妊娠率和產(chǎn)仔率與用對照病毒免疫的小鼠相同(見表6-10)。此外，對斷奶前幼鼠的健康沒有影響。因此，接種MVA-m5T4并誘導m5T4抗體應答確實不會在以下方面對小鼠產(chǎn)生有害影響(i)BALB/c和C57 BL6小鼠的生殖能力；(ii)活胎生產(chǎn)數(shù)和(iii)斷奶前幼鼠的體重和存活率。
實施例12c 5T4在正常人組織中的分布 本研究的目的是對5T4在正常人體組織中的分布進行獨立評價。部分過去的研究表明，即使發(fā)現(xiàn)小血管相關正常組織中的5T4表達水平低于胎盤有關組織1000倍以上，但是表達5T4的正常組織也可能成為針對此腫瘤抗原誘導的免疫應答的靶。不知道所述染色是特異性的還是反映所述MAb的部分交叉反應性。
實驗設計 在GLP條件下由合格病理學者評價來自3個不同供體的32個不同組織類型的組織切片。用3個不同濃度5T4特異性Mab染色每個組織標本的冷凍切片。
結果12c 總結表11的表明，包括腦、CNS、肝臟和腎臟的所有重要器官的組織切片的5T4表達為陰性。在一個或多個供體組織的某些弱染色見于幾種非重要組織。值得注意的是，在死于癌癥個體的組織中觀測到部分陽性染色。
盡管過去采用免疫組化分析的研究表明，在某些非癌器官的“部分小血管”中觀測到一定的5T4染色，所述非癌器官“表現(xiàn)為弱染色”而且包括腎臟(腎小球)、膀胱(上皮)、小腸(絨毛上皮)、子宮(子宮內(nèi)膜腺體)、子宮頸(子宮頸腺)和皮膚(基底上皮)，本獨立研究表明，重要器官細胞上沒有5T4表達，而且某些正常組織的表達水平低并且分散，因為在所有3個供體的標本中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)5T4表達。因此，該數(shù)據(jù)表明，與在腫瘤免疫治療試驗中使用的部分其它腫瘤抗原相比，5T4的組織表達更加嚴格有限。所以，這些發(fā)現(xiàn)再次證實了這樣的觀點5T4是癌癥免疫治療的良好候選抗原。
表115T4組織分布的總結 1通過相對于胎盤滋養(yǎng)層(+++)和陰性對照染色(-)的肉眼分析確定5T4染色強度。
2獲自癌癥患者的組織。
實施例13 ScFv融合蛋白的體內(nèi)抗腫瘤效力數(shù)據(jù) 本研究的目的是測試一系列單鏈抗體融合蛋白的效力。
實驗設計 表達人5T4的CT26細胞(CT26-h5T4)和CT26-neo 用PBS、LscFv-1、LscFv-2、B7-scFv、ScFv-Ig預溫育細胞。
在BHK細胞系中表達LscFv-1和2。在鎳柱上通過其組氨酸標記純化LscFv-1，采用過濾系統(tǒng)純化scFv-2。通過His標記從BHK細胞系純化B7-scFv，通過過濾柱純化scFv-Ig。以在FACS測定中飽和結合CT26-h5T4細胞需要的蛋白量定義在實驗中使用的每種scFv的濃度。
使CT26-h5T4和CT26-neo細胞與飽和量的每種scFv預溫育，并溫育1小時。洗滌細胞后，在同基因BALB/c小鼠的脅腹皮下注射5×105細胞。
每隔1天測量一次腫瘤大小并計算腫瘤體積。
結果13 圖8CT26-neo 如果為LscFv-1，各接受組之間沒有顯著性差異，所述接受組在腫瘤接種后36天，與PBS對照相比，其腫瘤大小降低3倍。
圖9CT26-h5T4 用所有scFv構建物處理腫瘤對腫瘤生長具有顯著的作用。用scFv-1處理的5只小鼠中的4只在第36天腫瘤消失。在第36天，scFv-1處理腫瘤比用PBS處理的腫瘤小60倍以上。
用工程表達h5T4的小鼠黑素瘤細胞系(B16)進行相似的實驗時，沒有抗腫瘤作用。
總結 總之，B7或IgG與5T4特異性scFv融合在CT26和B16鼠類模型中似乎沒有有利的作用。因為其結合親和力高，單獨的scFv可能更有效(如BIACORE所示，與B7-scFV相比)。所以，該數(shù)據(jù)表明，單獨的scFv對阻滯腫瘤具有顯著的作用，而在5T4模式中不需要與scFv融合的免疫增強分子來實現(xiàn)對阻滯腫瘤的作用。
CPCH0664821D 核苷酸和氨基酸序列表
<110>Oxford Biomedica(UK)Limited
<120>多肽
<130>p5020WO
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<400>
atgcctgggg ggtgctcccg gggccccgcc gccggggacg ggcgtctgcg gctggcgcga 60
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cacttccttt acctgccgcg ggatgtgctg gcccaactgc ccagcctcag gcacctggac 720
ttaagtaata attcgctggt gagcctgacc tacgtgtcct tccgcaacct gacacatcta 780
gaaagcctcc acctggagga caatgccctc aaggtccttc acaatggcac cctggctgag 840
ttgcaaggtc taccccacat tagggttttc ctggacaaca atccctgggt ctgcgactgc 900
cacatggcag acatggtgac ctggctcaag gaaacagagg tagtgcaggg caaagaccgg 960
ctcacctgtg catatccgga aaaaatgagg aatcgggtcc tcttggaact caacagtgct 1020
gacctggact gtgacccgat tcttccccca tccctgcaaa cctcttatgt cttcctgggt 1080
attgttttag ccctgatagg cgctattttc ctcctggttt tgtatttgaa ccgcaagggg 1140
ataaaaaagt ggatgcataa catcagagat gcctgcaggg atcacatgga agggtatcat 1200
tacagatatg aaatcaatgc ggaccccaga ttaacaaacc tcagttctaa ctcggatgtc 1260
tga1263
<210>2
<211>1281
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>2
atgcctgggg cgggctcccg gggcccctcc gccggggacg gacggctgag gttggcaagg 60
ctggcgctag tgctgctggg ttgggtctcc gcgtcggccc ccagctcttc ggtaccctcg 120
tcttccacct ccccggcaga cttcctggcc tcggggtctg cgcagcctcc gccagccgag 180
agatgccccg cggcgtgcga gtgctccgag gcggcgcgca cggttaagtg cgtgaaccgc 240
aacctgctgg aggtgccggc ggatctaccg ccttacgtgc gcaacctttt ccttaccggc 300
aaccagatga ccgtgctccc cgcgggcgcc ttcgcccgcc agccgccgct cgccgacctg 360
gaggcgctca acctcagcgg caaccacctg aaggaggtgt gtgcaggtgc cttcgagcat 420
ctgccgggtc tgcgccggct tgacctcagc cacaaccctc tcaccaacct cagcgccttc 480
gtctttgcgg gcagcaacgc cagcgtctcg gcccccagcc ccctggagga gctgatcctg 540
aatcacatcg tgccccctga ggatcagagg cagaacggga gcttcgaggg tatggtggcc 600
ttcgaaggca tggtggcagc agctctgcgc tcaggccttg cactccgagg tcttacacgc 660
ctggagctag ccagcaatca ctttcttttc ctgcctcggg acttactagc ccaactgccg 720
agtctcagat acctggacct caggaacaat tccctggtga gcctgaccta cgcatccttc 780
cgcaacctga cacacctcga aagcctccac ttggaggaca atgccctcaa ggtccttcac 840
aactccacct tggctgagtg gcaaggcctg gctcatgtca aggtgttcct ggacaacaat 900
ccctgggttt gcgactgcta catggctgac atggtggctt ggcttaaaga gacagaggtg 960
gtgccagata aagccaggct tacctgcgca ttcccggaga agatgaggaa tcgtggcctc 1020
ttagacctca acagctctga cctggactgt gacgctgtcc ttccccaatc cctgcagact 1080
tcctatgtct tcctaggtat tgttttagct ctgataggcg ctattttcct cctcgttttg 1140
tatttgaacc gtaaaggcat aaaaaagtgg atgcataaca tcagagatgc ctgcagggat 1200
cacatggaag ggtatcatta cagatacgaa atcaatgcgg accccagatt aacaaatctt 1260
agttccaact cggatgtctg a1281
<210>3
<211>901
<212>DNA
<213>犬(Canis sp.)
<220>
<221>n
<222>(66)..(66)
<223>a或c或g或t
<220>
<221>n
<222>(145)..(145)
<223>a或c或g或t
<220>
<221>n
<222>(277)..(278)
<223>a或c或g或t
<220>
<221>n
<222>(287)..(287)
<223>a或c或g或t
<220>
<221>n
<222>(353)..(353)
<223>a或c或g或t
<220>
<221>n
<222>(358)..(358)
<223>a或c或g或t
<220>
<221>n
<222>(428)..(429)
<223>a或c或g或t
<220>
<221>n
<222>(577)..(577)
<223>a或c或g或t
<220>
<221>n
<222>(580)..(580)
<223>a或c或g或t
<220>
<221>n
<222>(719)..(719)
<223>a或c或g或t
<220>
<221>n
<222>(788)..(788)
<223>a或c或g或t
<220>
<221>n
<222>(863)..(863)
<223>a或c或g或t
<220>
<221>n
<222>(868)..(868)
<223>a或c或g或t
<220>
<221>n
<222>(871)..(871)
<223>a或c或g或t
<400>3
atcgtgcccc ccgacgaccg gcggcagaac cggagcttcg aggtcatggt ggcggctgcc 60
vddrrnrsvm vaaactccga gcgggccgcg cgcttcgcgg gctgcagtgc ctggagctgg 120
ccggcaaccg cttcragrar gcagnrctct acttgcctcg cgacgtcctg gcccagctac 180
ccggcctccg gcacctggac ctgcgcyrdv agrhdraaca attccctggt gagcctcacc 240
tacgtgtcct tccgcaacct gacgcacttg gagagcnnsv styvsrnths ctccacctgg 300
aggacaacgc cctcaaggtc cttcacaacg ccaccctggc ggagctgcag hdnakvhnat 360
aagcctgccc cacgtccggg tcttcctgga caacaacccc tgggtctgcg attgtcacat 420
gshvrvdnnw vcdchmgcag acatggtggc ctggctcaag gagacagagg tggtgccggg 480
caaagccggg ctcaccadmv awktvvgkag ttgtgcattc ccggagaaaa tgaggaatcg 540
ggccctcttg gaactcaaca gctcccacct gcakmrnran sshgactgtg accctatcct 600
ccctccatcc ctgcagactt cttatgtctt cctaggtatt gtcdcdstsy vgvttagccc 660
tgataggcgc catcttccta ctggttttgt atttgaaccg caaggggata aagagavynr 720
kgkaagtgga tgcataacat cagagatgcc tgcagggatc acatggaagg gtatcactac 780
agakwmhnrd acrdhmgyhy rtacgaaatc aatgcagacc ccaggttaac aaacctcagt 840
tccaattcgg atgtctgaga aynadrtnss nsdvacagtc ggggacagac caaggacaac 900
t 901
<210>4
<211>238
<212>PRT
<213>犬(Canis sp.)
<400>4
Ile Val Pro Pro Asp Asp Arg Arg Gln Asn Arg Ser Phe Glu Val Met
1 5 10 15
Val Ala Ala Ala Leu Arg Ala Gly Arg Ala Leu Arg Gly Leu Gln Cys
20 25 30
Leu Glu Leu Ala Gly Asn Arg Phe Leu Tyr Leu Pro Arg Asp Val Leu
35 40 45
Ala Gln Leu Pro Gly Leu Arg His Leu Asp Leu Arg Asn Asn Ser Leu
50 55 60
Val Ser Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg Asn Leu Thr His Leu Glu Ser
65 70 75 80
Leu His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val Leu His Asn Ala Thr Leu
85 90 95
Ala Glu Leu Gln Ser Leu ProHis Val Arg Val Phe Leu Asp Asn Asn
100105 110
Pro Trp Val Cys Asp Cys His Met Ala Asp Met Val Ala Trp Leu Lys
115 120 125
Glu Thr Glu Val Val Pro Gly Lys Ala Gly Leu Thr Cys Ala Phe Pro
130 135 140
Glu Lys Met Arg Asn Arg Ala Leu Leu Glu Leu Asn Ser Ser His Leu
145 150 155 160
Asp Cys Asp Pro Ile Leu Pro Pro Ser Leu Gln Thr Ser Tyr Val Phe
165 170 175
Leu Gly Ile Val Leu Ala Leu Ile Gly Ala Ile Phe Leu Leu Val Leu
180 185 190
Tyr Leu Asn Arg Lys Gly Ile Lys Lys Trp Met His Asn Ile Arg Asp
195 200 205
Ala Cys Arg Asp His Met Glu Gly Tyr His Tyr Arg Tyr Glu Ile Asn
210 215 220
Ala Asp Pro Arg Leu Thr Asn Leu Ser Ser Asn Ser Asp Val
225 230 235
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>5
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val
1 5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>6
Ala Leu Ile Gly Ala Ile Phe Leu Leu
1 5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>7
Ser Leu Gln Thr Ser Tyr Val Phe Leu
1 5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>8
Ala Ile Phe Leu Leu Val Leu Tyr Leu
1 5
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>9
Gly Leu Pro His Ile Arg Val Phe Leu
1 5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>10
Phe Leu Gly Ile Val Leu Ala Leu Ile
1 5
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>11
Asn Leu Thr Glu Val Pro Thr Asp Leu
1 5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>12
Asn Leu Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu
1 5
<210>13
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>13
Phe Leu Tyr Leu Pro Arg Asp Val Leu
1 5
<210>14
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>14
Val Leu Tyr Leu Asn Arg Lys Gly Ile
1 5
<210>15
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>15
Leu Ile Gly Ala Ile Phe Leu Leu Val
1 5
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>16
Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys
1 5
<210>17
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>17
His Met Ala Asp Met Val Thr Trp Leu
1 5
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>5T4 9 Mer
<400>18
Tyr Met Ala Asp Met Val AlaTrp Leu
1 5
<210>19
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>19
Asn Leu Leu Glu Val Pro Ala Asp Leu
1 5
<210>20
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>20
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Met Thr Val
1 5
<210>21
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>21
Ala Leu Ile Gly Ala Ile Phe Leu Leu
1 5
<210>22
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>22
Phe Leu Phe Leu Pro Arg Asp Leu Leu
1 5
<210>23
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>23
Ser Leu Gln Thr Ser Tyr Val Phe Leu
1 5
<210>24
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>24
Ala Ile Phe Leu Leu Val Leu Tyr Leu
1 5
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>25
Gly Leu Ala His Val Lys Val Phe Leu
1 5
<210>26
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>26
Phe Leu Gly Ile Val Leu Ala Leu Ile
1 5
<210>27
<211>8
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>27
Val Leu Tyr Leu Asn Arg Lys Gly
1 權利要求
1.一種修飾的5T4抗原，它能夠在接受者體內(nèi)結合HLA分子并誘導針對野生型5T4的CTL應答。
2.權利要求1的修飾5T4抗原，它能夠較其未修飾表位更有效地結合HLA分子，因此能夠誘導更有效的CTL應答。
3.權利要求1或2的修飾5T4抗原，其中所述修飾5T4抗原包含選自以下的肽序列
(a)FLTGNQLAV；
(b)ALIGAIFLL；
(c)SLQTSYVFL；
(d)AIFLLVLYL；
(e)GLPHIRVFL；
(f)FLGIVLALI；
(g)NLTEVPTDL；
(h)NLFLTGNQL；
(i)FLYLPRDVL；
(j)VLYLNRKGI；
(k)LIGAIFLLV；
(l)FLDNNPWVC；
(m)HMADMVTWL。
4.權利要求1或2的修飾5T4抗原，其中所述修飾5T4抗原包含選自以下的肽序列
(a) YMADMVAWL；
(b) NLLEVPADL；
(c) FLTGNQMTV；
(d) ALIGAIFLL；
(e) FLFLPRDLL；
(f) SLQTSYVFL；
(g) AIFLLVLYL；
(h) GLAHVKVFL；
(i) FLGIVLALI；
(j) VLYLNRKG。
5.權利要求2的修飾5T4抗原，其包含選自HMADMVTWL和NLLEVPADL的肽序列。
6.權利要求1-5任一項要求保護的修飾5T4抗原，其與不依賴TAP的轉(zhuǎn)運肽融合。
7.一種疫苗組合物，它包含作為免疫劑的權利要求1-6任一項要求保護的修飾5T4抗原。
8.權利要求7的疫苗組合物，它還包含一種或多種佐劑。
9.權利要求1-6任一項要求保護的修飾5T4抗原在制備用于在接受者體內(nèi)引發(fā)免疫應答的藥物中的應用。
10.權利要求1-6任一項要求保護的修飾5T4抗原在制備用于在接受者體內(nèi)引發(fā)免疫治療性應答的藥物中的應用。
11.權利要求9或10的應用，其中所述免疫應答或免疫治療性應答為CTL應答或抗體應答。
12.權利要求1-6任一項要求保護的修飾5T4抗原在制備用于免疫治療接受者腫瘤的組合物中的應用。
13.權利要求9-12任一項的應用，其中所述5T4抗原利用病毒載體傳遞。
14.包含編碼并表達權利要求1-6任一項要求保護的修飾5T4抗原的表達載體以及編碼并表達5T4抗原的病毒載體的組合物在制備單獨使用、同一時間單獨使用、序貫使用或混合使用以在接受者體內(nèi)引發(fā)免疫應答的藥物中的應用。
15.權利要求14的應用，其中所述病毒載體是痘病毒載體，優(yōu)選MVA載體。
16.一種編碼權利要求1-6任一項的修飾5T4抗原的載體。
17.一種編碼權利要求1-6任一項的修飾5T4抗原和能夠結合與免疫刺激分子融合的5T4的因子的載體，它們單獨使用、同一時間單獨使用或混合使用用于治療腫瘤。
18.一種編碼權利要求1-6任一項的修飾5T4抗原的載體和前體藥物/酶的聯(lián)合藥物，它們單獨使用、同一時間單獨使用或混合使用用于治療腫瘤。
19.一種包含編碼并表達權利要求1-6任一項的修飾5T4抗原的表達載體和編碼并表達5T4抗原的病毒載體的疫苗組合物，它們單獨使用、同一時間單獨使用或混合使用以在接受者體內(nèi)引發(fā)免疫應答。
20.權利要求19的組合物，其中所述表達載體為DNA質(zhì)粒。
21.權利要求19或20的組合物，其中所述病毒載體為痘病毒載體，優(yōu)選MVA載體。
22.一種感染權利要求16-18任一項要求保護的包含修飾5T4抗原的病毒載體的專職抗原提呈細胞(APC)在制備用于增強對5T4抗原的免疫的藥物中的應用。
23.一種感染權利要求16-18任一項要求保護的包含修飾5T4抗原的病毒載體的APC。
全文摘要
本發(fā)明提供用于腫瘤免疫治療法的5T4腫瘤相關抗原(TAA)。本發(fā)明還涉及其中缺失至少一個免疫逃避基因、包含編碼5T4 TAA的核酸序列的重組痘病毒載體以及用于針對其的免疫和治療腫瘤的用途。
文檔編號A61K38/17GK101134101SQ20061016897
公開日2008年3月5日 申請日期1999年11月18日 優(yōu)先權日1998年11月18日
發(fā)明者M·W·卡洛爾, K·A·邁爾斯 申請人:牛津生物醫(yī)學(英國)有限公司