專(zhuān)利名稱(chēng)：透明質(zhì)酸－幾丁聚糖生物膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及一種生物膜的制備方法，具體涉及一種用于青光眼術(shù)后防止濾過(guò)通道瘢痕化的透明質(zhì)酸-幾丁聚糖生物膜的制備方法。
背景技術(shù)：
青光眼是我國(guó)首位的不可逆性致盲眼病，手術(shù)仍是我國(guó)抗青光眼治療的首選策略。但是，由于生物固有的創(chuàng)傷愈合機(jī)制，青光眼術(shù)后濾過(guò)通道的瘢痕化是青光眼手術(shù)治療成功的最大障礙。近幾年來(lái)針對(duì)原發(fā)性開(kāi)角型青光眼所設(shè)計(jì)的新的手術(shù)--非穿透小梁切除術(shù)聯(lián)合SK膠植入在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，其中SK膠的植入起到了機(jī)械支撐濾過(guò)通道的作用，SK膠成分為交鍵透明質(zhì)酸鈉，在濾過(guò)手術(shù)后的早期，維持了濾過(guò)通道，由于房水的持續(xù)流動(dòng)，在一定程度上也延緩和抑制了成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，提高了手術(shù)成功率。但是由于目前非穿透小梁手術(shù)術(shù)中植入的材料均來(lái)自國(guó)外，費(fèi)用成本高。我們?yōu)榇诉M(jìn)行了成本效益分析，通過(guò)非穿透手術(shù)來(lái)降低一例不良事件需多花費(fèi)人民幣11萬(wàn)元，降低一例嚴(yán)重不良事件需多花費(fèi)人民幣19萬(wàn)元。并通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，植入材料是該手術(shù)選擇費(fèi)用增加的主要來(lái)源。只有進(jìn)一步降低植入材料的成本，該手術(shù)方式才能在我國(guó)進(jìn)行進(jìn)一步的推廣。透明質(zhì)酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖以糖苷鏈交替連接而成的一種線形多聚糖，廣泛存在于高等動(dòng)物和低等動(dòng)物的細(xì)胞外間質(zhì)中。大量研究表明透明質(zhì)酸具有優(yōu)異的生物相容性和無(wú)免疫原性，同時(shí)具有高粘彈性。幾丁聚糖是生物界僅次于纖維素的第二大類(lèi)多糖，國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)證實(shí)幾丁聚糖具有生物黏附性和多種生物活性，包括幾丁聚糖能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制成纖維細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)菌等微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)組織創(chuàng)面的修復(fù)等多種作用。因此，幾丁聚糖及其衍生物已經(jīng)廣泛的應(yīng)用到臨床工作中，用于防止術(shù)后粘連，制作成人工皮膚，促進(jìn)創(chuàng)傷的皮膚修復(fù)等方面。
本發(fā)明利用了透明質(zhì)酸和幾丁聚糖的生物特性，成功合成了透明質(zhì)酸-幾丁聚糖生物膜，該生物膜既具有國(guó)外產(chǎn)品SK膠在濾過(guò)手術(shù)通道的機(jī)械支撐作用，同時(shí)又具有抑制成纖維細(xì)胞增殖的作用，并且原材料價(jià)格低廉，產(chǎn)品成本大大低于國(guó)外進(jìn)口產(chǎn)品，將會(huì)有利于青光眼濾過(guò)手術(shù)成功率的提高和非穿透小梁手術(shù)的廣泛推廣開(kāi)展，并且會(huì)降低患者的醫(yī)療費(fèi)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以透明質(zhì)酸、羧甲基殼聚糖、聚乙烯醇、丁二醇雙縮水甘油醚等為原料通過(guò)如下步驟制備透明質(zhì)酸-幾丁聚糖生物膜。
1取純化好的無(wú)菌無(wú)熱原的透明質(zhì)酸、羧甲基殼聚糖、聚乙烯醇，三者質(zhì)量比為8∶1∶1，溶于水中。
2按計(jì)算好的量加入交聯(lián)劑丁二醇雙縮水甘油醚溶液，攪拌均勻。
固形物與丁二醇雙縮水甘油醚的摩爾質(zhì)量比為40∶1。此處的固形物是指將丁二醇雙縮水甘油醚加入步驟1的溶液中所形成的凝膠樣物質(zhì)。
3流涎法制膜。
4真空干燥器中干燥。
5膜干后，無(wú)菌刀片切成小塊。
6無(wú)菌pH7.4的PBS中浸泡備用。
本產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)用本方法研制的生物膜生物相容性好，具有一定的抑制結(jié)膜下成纖維細(xì)胞增殖的作用，降解過(guò)程緩慢，不會(huì)引起明顯的炎癥反應(yīng)和免疫排斥反應(yīng)，成本低廉。為眼科青光眼濾過(guò)手術(shù)后抑制濾過(guò)通道的瘢痕化，提高手術(shù)成功率提供了一種新的材料。


圖1實(shí)驗(yàn)眼手術(shù)區(qū)掃描電鏡結(jié)果圖。
圖2對(duì)照眼手術(shù)區(qū)掃描電鏡結(jié)果圖。
圖3實(shí)驗(yàn)眼手術(shù)區(qū)掃描電鏡結(jié)果圖。
圖4對(duì)照眼手術(shù)區(qū)掃描電鏡結(jié)果圖。
圖5實(shí)驗(yàn)眼手術(shù)區(qū)掃描電鏡結(jié)果圖，放大6萬(wàn)倍。
圖6對(duì)照眼手術(shù)區(qū)掃描電鏡結(jié)果圖，放大3萬(wàn)倍。
圖7實(shí)驗(yàn)眼手術(shù)區(qū)掃描電鏡結(jié)果圖，放大2萬(wàn)倍。
圖8實(shí)驗(yàn)眼手術(shù)區(qū)掃描電鏡結(jié)果圖，放大10萬(wàn)倍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1透明質(zhì)酸-幾丁聚糖生物膜的制備1取純化好的無(wú)菌無(wú)熱原透明質(zhì)酸0.4g，羧甲基殼聚糖0.05g，聚乙烯醇0.05g，溶于20ml無(wú)菌水中，攪拌2小時(shí)。
2加入交聯(lián)劑1％丁二醇雙縮水甘油醚1.3ml，攪拌20min。
3流涎法將攪拌均勻的膠體溶液鋪至8×8cm2的平板上。
4放入40℃真空干燥器中干燥1天。
5膜干后，無(wú)菌刀片切成5×5cm2大小。
6無(wú)菌pH7.4的PBS洗滌浸泡2天。
7小瓶分裝。
實(shí)施例2透明質(zhì)酸-幾丁聚糖生物膜對(duì)成纖維細(xì)胞體外增殖的抑制作用。
體外培養(yǎng)兔眼結(jié)膜下成纖維細(xì)胞，使用直徑為6mm環(huán)鉆制作圓形實(shí)施例1生物膜片。96孔板的第一列8個(gè)培養(yǎng)孔中放置預(yù)制的環(huán)形膜片作為實(shí)驗(yàn)組，第二列8個(gè)培養(yǎng)孔不放置環(huán)形膜作為對(duì)照組，將培養(yǎng)第4代的細(xì)胞以5×103個(gè)/ml濃度接種在96孔板中，選擇接種后24h、48h、72h的細(xì)胞行MTT比色，共重復(fù)3次。MTT比色方法結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組24h、48h和72h的光密度值分別是0.2071±8.264×10-2，0.1736±7.963×10-2和0.1814±4.749×10-2，而對(duì)照組為0.2837±0.1095-2，0.2721±8.332×10-2和0.3070±5.556×10-2，兩者差距均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，證明在體外合成的透明質(zhì)酸-幾丁聚糖生物膜具有抑制成纖維細(xì)胞增殖的作用。
實(shí)施例3透明質(zhì)酸-幾丁聚糖生物膜對(duì)兔眼濾過(guò)手術(shù)濾過(guò)通道的作用將實(shí)施例1制備的生物膜植入在兔眼濾過(guò)手術(shù)的鞏膜瓣下，掃描電鏡(見(jiàn)圖1-8)發(fā)現(xiàn)幾丁聚糖共混膜植入?yún)^(qū)鞏膜床表面光滑，可見(jiàn)排列整齊的鞏膜板層膠原，表面有少量的增殖膠原纖維；未植入生物膜的對(duì)照眼的鞏膜床表面粗糙，表面有大量的增殖膠原纖維。透射電鏡顯示幾丁聚糖共混膜植入眼在植入膜周?chē)梢?jiàn)炎癥細(xì)胞及細(xì)胞碎片，同時(shí)可見(jiàn)在植入膜旁的成纖維細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，部分脫顆粒，顯示細(xì)胞的合成蛋白和分泌蛋白的功能受到影響，部分成纖維細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴，顯示細(xì)胞功能受損蛻變；對(duì)照眼在兩層鞏膜瓣交界處可見(jiàn)大量含有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的成纖維細(xì)胞，周?chē)谐墒斓哪z原纖維。說(shuō)明幾丁聚糖生物膜具有抑制成纖維細(xì)胞合成膠原的作用。
權(quán)利要求
1.一種制備透明質(zhì)酸-幾丁聚糖生物膜的方法，該方法包括如下步驟(1)取純化好的無(wú)菌無(wú)熱原的透明質(zhì)酸、羧甲基殼聚糖、聚乙烯醇，三者質(zhì)量比為8∶1∶1，溶于水中，(2)按計(jì)算好的量加入交聯(lián)劑丁二醇雙縮水甘油醚溶液，攪拌均勻，固形物與丁二醇雙縮水甘油醚的摩爾質(zhì)量比為40∶1。此處的固形物是指將丁二醇雙縮水甘油醚加入步驟(1)的溶液中所形成的凝膠樣物質(zhì)，(3)流涎法制膜，(4)真空干燥器中干燥，(5)膜干后，無(wú)菌刀片切成小塊，(6)無(wú)菌pH7.4的PBS中浸泡備用。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及一種生物膜的制備方法，具體涉及一種用于青光眼術(shù)后防止濾過(guò)通道瘢痕化的透明質(zhì)酸－幾丁聚糖生物膜的制備方法。該方法以透明質(zhì)酸、羧甲基殼聚糖、聚乙烯醇、丁二醇雙縮水甘油醚等為原料制備生物膜。該生物膜生物相容性好，具有一定的抑制結(jié)膜下成纖維細(xì)胞增殖的作用，降解過(guò)程緩慢，不會(huì)引起明顯的炎癥反應(yīng)和免疫排斥反應(yīng)，成本低廉。為眼科青光眼濾過(guò)手術(shù)后抑制濾過(guò)通道的瘢痕化，提高手術(shù)成功率提供了一種新的材料。
文檔編號(hào)A61L31/06GK1970094SQ20061017026
公開(kāi)日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2006年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日
發(fā)明者王寧利, 李樹(shù)寧, 劉萬(wàn)順 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院