專(zhuān)利名稱(chēng)：抗腫瘤制備物和抗腫瘤制備物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的目的是抗腫瘤制備物和抗腫瘤制備物的用途。
背景技術(shù)：
盡管在過(guò)去的幾年中化療、放療和免疫療法有顯著進(jìn)展，但有效的 抗腫瘤療法的問(wèn)題仍然是目前醫(yī)學(xué)的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。流行病學(xué)研究顯示在高
度發(fā)達(dá)國(guó)家中三分之一的人口患有不同的腫瘤性疾病(neoplastic diseases),在此群體中每四個(gè)病例中有一個(gè)是致死性的。治療中實(shí)際應(yīng) 用的細(xì)胞抑制劑(cytostatics)具有發(fā)生副作用的風(fēng)險(xiǎn)，限制了其有效 性并降低了患者的生活質(zhì)量。
因此開(kāi)發(fā)特異性作用于腫瘤細(xì)胞同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞具有保護(hù)作用的 新藥是尤其迫切的挑戰(zhàn)。此抗腫瘤制備物的區(qū)別之處在于，其含有a-酮戊二酸 (alpha-ketoglutarate， AKG)或/和谷胺酰胺或/和谷氨酸或/和鳥(niǎo)氨酸的 a-酮戊二酸或/和谷胺酰胺與其它氨基酸的二肽或/和谷胺酰胺與其它氨 基酸的三肽或/和谷氨酸與其它氨基酸的二肽和三肽或/和ot-酮戊二酸或
/和谷胺酰胺或/和谷氨酸的單價(jià)和二價(jià)金屬鹽及其它或/和ot-酮戊二酸 的鳥(niǎo)氨酸。
抗腫瘤制備物的用途在于其用于預(yù)防腫瘤性疾病，其中該制備物含 有a-酮戊二酸(AKG)或/和谷胺酰胺或/和谷氨酸或/和鳥(niǎo)氨酸的a-酮戊 二酸或/和谷胺酰胺與其它氨基酸的二肽或/和谷胺酰胺與其它氨基酸的 三肽或/和谷氨酸與其它氨基酸的二肽和三肽或/和a-酮戊二酸或/和谷 胺酰胺或/和谷氨酸的單價(jià)和二價(jià)金屬鹽及其它或/和a-酮戊二酸的鳥(niǎo)氨
抗腫瘤制備物的其它用途在于其用于抑制轉(zhuǎn)移，其中該制備物含有 a-酮戊二酸(AKG)或/和谷胺酰胺或/和谷氨酸或/和鳥(niǎo)氨酸的a-酮戊二 酸或/和谷胺酰胺與其它氨基酸的二肽或/和谷胺酰胺與其它氨基酸的三 肽或/和谷氨酸與其它氨基酸的二肽和三肽或/和a-酮戊二酸或/和谷胺
酰胺或/和谷氨酸的單價(jià)和二價(jià)金屬鹽及其它或/和鳥(niǎo)氨酸的a-酮戊二 酸。
所述制備物及其用于抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，反映了 AKG在轉(zhuǎn)移抑 制中的潛在作用。添加到膳食中的所述制備物起到支持用于肺瘤治療的 現(xiàn)有方法的腫瘤輔助治療(neo-adiuvant)的作用。它可通過(guò)與抗肺瘤 藥物的協(xié)同作用以及同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的保護(hù)作用來(lái)改善患者生活質(zhì)量。
所述制備物的作用及其用途的實(shí)例以實(shí)施發(fā)明的方式給出圖l-表明用AKG刺激A549細(xì)胞增殖的曲線，圖2 - AKG對(duì)C6細(xì)胞的增 殖和圖3-AKG刺激對(duì)HT-29細(xì)胞的增殖，而圖4表示在環(huán)磷酰胺存 在下AKG對(duì)人腫瘤細(xì)胞A549的增殖，而圖5 -表示在異環(huán)磷酰胺存在 下AKG對(duì)人腫瘤細(xì)胞A549的增殖，圖6 -在嚷替派存在下AKG對(duì)人 腫瘤細(xì)胞A549的增殖，圖7-由AKG對(duì)C6細(xì)胞遷移的抑制。
腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)
A549 - AJ^癌腫瘤細(xì)胞，從the Institute of the Immunology and the Experimental Therapy of Polish Academy of Science in Wroclaw得到的連 續(xù)細(xì)胞系
HT-29-人大腸癌腫瘤細(xì)胞，從the Institute of the Immunology and the Experimental Therapy of Polish Academy of Science in Wroclaw得到 的連續(xù)細(xì)胞系
C6-大鼠腦癌(神經(jīng)膠質(zhì)瘤)腫瘤細(xì)胞，從the Department of Neonatology, Humboldt University ， Berlin ， Germany得到的連續(xù)細(xì)胞系
培養(yǎng)基
A549細(xì)胞系培養(yǎng)在培養(yǎng)基DMEM:F-12 HAM (2:1)中，HT-29和 C6細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基DMEM中。向培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清(FBS )、 青霉素100 i.u./ml和鏈霉素100 ng/ml。培養(yǎng)基DMEM:F-12 HAM、 DMEM由Sigma Company生產(chǎn)(Sigma, St. Louis， MO， U.S.A.)。胎牛 血清(FBS )由Life Technologies Company( Life Technologies, Karlsruhe, Germany )生產(chǎn)。其它試劑由Sigma Company生產(chǎn)。
細(xì)胞培養(yǎng)物的制備
在37'C解凍保存在組織庫(kù)液氮中的細(xì)胞，然后將細(xì)胞倒入含有適當(dāng)培 養(yǎng)基的塑料瓶中。將它們?cè)跍囟?7。C、 5。/。C02流的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞 繁殖后將液體倒出，用PBS (不含釣離子和鎂離子)洗細(xì)胞并用0.25%胰 蛋白酶溶液+EDTA處理，以得到試驗(yàn)所需的細(xì)胞懸液。
在細(xì)胞培養(yǎng)中評(píng)價(jià)AKG的抗增殖活性
將早前制備的密度為lx104個(gè)細(xì)胞/ml ( A549)、 4xl04個(gè)細(xì)胞/ml (HT-29)和0.5xl0"個(gè)細(xì)胞/ml ( C6 )的細(xì)胞在培養(yǎng)基中的懸液以體積 為100^1/孔倒入平底96-孔微板(NUNC company, Roskilde， Denmark ) 中。細(xì)胞粘附后(24小時(shí))小心地將液體倒掉，然后添加不同濃度AKG 和受檢細(xì)胞抑制劑(環(huán)砩酰胺、異環(huán)磷酰胺、嚷替派)的含10%FBS 的液體(100ilU/孔)。板中的培養(yǎng)物在37'C、 95%空氣和5%<:02的氣氛 中培養(yǎng)96小時(shí)。采用MTT法評(píng)價(jià)受檢物質(zhì)的抗增殖活性。
MTT法(根據(jù)試劑盒"細(xì)胞增殖試劑盒III"， Boehringer Manheim )
該方法用于在細(xì)胞毒性和抗增殖物質(zhì)的研究中測(cè)定細(xì)胞的增殖和活 力。在代謝活性細(xì)胞中四氮唑黃色鹽MTT在線粒體脫水酶作用下被還原 成曱臜藍(lán)。不溶于水的甲臜結(jié)晶在細(xì)胞中累積，并且為了其溶解，需要采 用有機(jī)去污劑，破壞膜并同時(shí)溶解染料。為此目的，采用pH7.4的緩沖液 SDS-HC1。在96-孔板酶標(biāo)儀中在波長(zhǎng)570nm處定量評(píng)價(jià)所釋放染料的濃 度。顏色強(qiáng)度與活細(xì)胞的量成正比。
將濃度5 mg/ml的MTT的PBS溶液添加到塑料板的每個(gè)孔中，劑量 為在溫度37。C下培養(yǎng)該板3小時(shí)。然后添加劑量為10(Hil/孔的緩 沖液SDS-HC1并將板于37。C放置過(guò)夜。次日用E-max讀出儀(Molecular Devices Corporation, Menlo Park, CA, U.S.A.)評(píng)價(jià)結(jié)果。
用"劃痕試驗(yàn)"法(wound assay)評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移度
該方法用于評(píng)價(jià)體外影響細(xì)胞活動(dòng)性的物質(zhì)的活性。其用于研究創(chuàng)傷 愈合、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移。
將懸在添加10%血清(FBS )的培養(yǎng)基中的C6細(xì)胞(lxlO6)倒入 直徑4cm的培養(yǎng)板中(NUNC, Roskilde， Denmark).次日在相同細(xì)胞 層中，用自動(dòng)吸液器的末端制造缺陷(劃痕)并用PBS溶液漂洗板兩
次以除去未粘附細(xì)胞。然后將溶解在培養(yǎng)基中的AKG (10和20mM) 添加到制備好的培養(yǎng)物中。在37卩和95%空氣及5% C02的潮濕氣氛中 將板子培養(yǎng)24小時(shí)。隨后采用May-Grtinwald-Giemza法將培養(yǎng)物顯色。 然后采用Olympus BX51顯微鏡(Olympus Optical CO.， LTD, Tokyo, Japan),并4吏用軟件analySIS (Soft Imaging System GmbH, Mtinster, Germany)進(jìn)行顯微分析。細(xì)胞遷移度在細(xì)胞計(jì)數(shù)法中作為在細(xì)胞層中早 前所作劃痕周?chē)杭募?xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)8張照片上至少50個(gè)所選視野。
結(jié)果評(píng)價(jià)AKG的抗增殖活性
在不同種類(lèi)的腫瘤細(xì)胞中評(píng)價(jià)培養(yǎng)物中AKG的抗增殖活性肺癌 細(xì)胞(A549)、大腸癌細(xì)胞(HT-29)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6)。以0.5、
1、 2.5、 5、 10和20mM濃度的AKG處理細(xì)胞96小時(shí)。
受檢物質(zhì)相對(duì)于所有腫瘤細(xì)胞類(lèi)型具有抗增殖活性(圖-

圖1、圖
2、 圖3)。與對(duì)照組相比，在A549細(xì)胞系中AKG在濃度2.5mM時(shí)觀 察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(4.5%)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。該作用與AKG的劑量相關(guān) 并且當(dāng)AKG劑量為5mM、 10mM和20mM時(shí)抑制作用分別為7.8%、 12.4%、 17.5% (圖1中的圖)。AKG劑量為2,5mM、 5mM、 10mM和 20mM時(shí)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6)的生長(zhǎng)抑制分別為12.6%、 7.9%、 16%和19.8%。 AKG濃度在1至10mM之間時(shí)，其對(duì)大腸癌細(xì)胞(HT-29 ) 的生長(zhǎng)抑制不具有線性特征。劑量lmM對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制為11.8%。 劑量5mM (11.8% )和10mM (11.5% )得到相似的結(jié)果。僅20mM劑 量引起了這些細(xì)胞生長(zhǎng)的顯著抑制(25%)(圖-圖3)。
評(píng)價(jià)AKG和抗腫瘤藥物之間的相互作用
在肺癌細(xì)胞(A549)培養(yǎng)中對(duì)AKG與用于癌癥化療的常用細(xì)胞抑 制劑之間的相互作用進(jìn)行研究。為此目的，用下述細(xì)胞抑制劑處理細(xì)胞 環(huán)磷酰胺(1.5mM)、異環(huán)磷酰胺(1.5mM)和噢替派(5nM)，單獨(dú)以 及與AKG (5、 10和20mM)組合使用。觀察到AKG對(duì)所用化療劑的 細(xì)胞抑制活性的加和作用(結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5和圖6)。濃度1.5mM的 環(huán)磷耽胺對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制為21.4%。 AKG的加入使其細(xì)胞抑制 活性分別增加6.4%、 9.8%和14.4% (圖4)。異環(huán)砩酰胺(1.5mM )對(duì) 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制為7.3%。添加AKG (5、 10和20mM)后其作用分別 增加5%、 5.3%和8.8% (圖5 )。 AKG還增強(qiáng)了噻替派(5jiM - 25.9% )
的細(xì)胞抑制活性，分別為4.2%(5mM)、 8。/。(10mM)和11.2%(20mM) (結(jié)果如圖6所示)。
AKG對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響
在"劃痕試驗(yàn)"模型中研究腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性。照片1中呈現(xiàn)C6細(xì) 胞層中的劃痕(A)、無(wú)AKG培養(yǎng)24小時(shí)后劃痕處細(xì)胞群體(B)和在 20mM AKG存在下對(duì)細(xì)胞遷移的顯著抑制(C )。在圖7中顯示在均勻 細(xì)胞層中遷移至一個(gè)已有缺陷視野的平均細(xì)胞數(shù)。在10mM和20mM AKG存在下顯示出對(duì)細(xì)胞遷移的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的抑制。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用t畫(huà)student檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001。
權(quán)利要求
1.抗腫瘤制備物，其特征在于，其含有α-酮戊二酸(AKG)或/和谷胺酰胺或/和谷氨酸或/和鳥(niǎo)氨酸的α-酮戊二酸或/和谷胺酰胺與其它氨基酸的二肽或/和谷胺酰胺與其它氨基酸的三肽或/和谷氨酸與其它氨基酸的二肽和三肽或/和α-酮戊二酸或/和谷胺酰胺或/和谷氨酸的單價(jià)和二價(jià)金屬鹽及其它或/和α-酮戊二酸的鳥(niǎo)氨酸。
2. 抗肺瘤制備物用于預(yù)防腫瘤性疾病的用途，其特征在于，所述 制備物含有a-酮戊二酸(AKG)或/和谷胺酰胺或/和谷氨酸或/和鳥(niǎo)氨酸 的a-酮戊二酸或/和谷胺酰胺與其它氨基酸的二肽或/和谷胺酰胺與其它 氨基酸的三肽或/和谷氨酸與其它氨基酸的二肽和三肽或/和a-酮戊二酸 或/和谷胺酰胺或/和谷氨酸的單價(jià)和二價(jià)金屬鹽及其它或/和a-酮戊二 酸的鳥(niǎo)氨酸。
3. 抗腫瘤制備物用于抑制癌癥轉(zhuǎn)移的用途，其特征在于，所述制 備物含有a-酮戊二酸(AKG)或/和谷胺酰胺或/和谷氨酸或/和鳥(niǎo)氨酸的 a-酮戊二酸或/和谷胺酰胺與其它氨基酸的二肽或/和谷胺酰胺與其它氨 基酸的三肽或/和谷氨酸與其它氨基酸的二肽和三肽或/和a-酮戊二酸或/和谷胺酰胺或/和谷氨酸的單價(jià)和二價(jià)金屬鹽及其它或/和a-酮戊二酸 的鳥(niǎo)氨酸。
全文摘要
本發(fā)明解決了抗腫瘤制備物的問(wèn)題。該解決方案的關(guān)鍵在于所述制備物含有α-酮戊二酸(AKG)或/和谷胺酰胺或/和谷氨酸或/和鳥(niǎo)氨酸的α-酮戊二酸或/和谷胺酰胺與其它氨基酸的二肽或/和谷胺酰胺與其它氨基酸的三肽或/和谷氨酸與其它氨基酸的二肽和三肽或/和α-酮戊二酸或/和谷胺酰胺或/和谷氨酸的單價(jià)和二價(jià)金屬鹽及其它或/和鳥(niǎo)氨酸的α-酮戊二酸。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101111241SQ200680001967
公開(kāi)日2008年1月23日 申請(qǐng)日期2006年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月11日
發(fā)明者斯特凡·彼任諾夫斯基, 沃伊切赫·熱斯基, 馬蒂納·坎德費(fèi)爾-塞爾森 申請(qǐng)人:Sgp父子公司;馬蒂納·坎德費(fèi)爾-塞爾森;沃伊切赫·熱斯基;斯特凡·彼任諾夫斯基