專利名稱：：代謝綜合癥改善劑以及含有該改善劑的藥品、補(bǔ)充劑、功能性食品和食品添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及代謝綜合癥改善劑以及含有該改善劑的藥品、補(bǔ)充劑、功能性食品和食品添加劑。
背景技術(shù)：
：從數(shù)年前開始，以WHO(世界衛(wèi)生組織)為代表、在美國國家膽固醇教育計(jì)劃(NCEP)中就開始提到代謝綜合癥的概念。代謝綜合癥是集合了成為例如內(nèi)臟脂肪型肥胖、胰島素抵抗性、糖尿病、高血脂癥、高血壓癥等動(dòng)脈硬化原因的各種疾病，處于易于發(fā)生心絞痛或心肌梗塞等的狀態(tài)，且被認(rèn)為是由內(nèi)臟脂肪的蓄積和脂肪細(xì)胞的肥大化所引起的。內(nèi)臟脂肪的蓄積作為與糖尿病、高血脂癥、高血壓癥等發(fā)病有關(guān)的機(jī)理，已知有以下2種機(jī)理。一個(gè)機(jī)理為蓄積在內(nèi)臟脂肪中的甘油酯在空腹時(shí)大量地分解，從而大量地釋放作為其分解產(chǎn)物的游離脂肪酸和甘油，它們過量地流入肝臟，結(jié)果引起高血脂癥、高血糖以及高胰島素血癥。另一個(gè)機(jī)理為由于內(nèi)臟脂肪的蓄積，脂肪細(xì)胞因子(adipocytokine)的分泌異常，結(jié)果，例如脂聯(lián)素(adiponectin)的分泌降低，發(fā)生糖尿病、動(dòng)脈硬化等(例如參照非專利文獻(xiàn)O。已知，脂聯(lián)素通過活化過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)a和AMP激酶、促進(jìn)脂肪酸燃燒等、降低組織內(nèi)中性脂肪含量，由此改善例如胰島素抵抗性等。據(jù)報(bào)道，脂聯(lián)素除此之外還具有抗糖尿病、抗動(dòng)脈硬化、抗高血壓、抗炎癥的作用。另一方面，據(jù)說作為核內(nèi)受體的PPAR與胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、以及肥胖、高血壓、高血脂癥和動(dòng)脈硬化的改善有關(guān)。已知，在PPAR中有ouS、Y的3種類型的數(shù)個(gè)亞型。PPARa主要在肝臟細(xì)胞中表達(dá)，另外在心肌細(xì)胞和消化管細(xì)胞中也有所表達(dá)，且與脂肪酸氧化、酮體生成、載脂蛋白的生成等有關(guān)。PPAR5沒有組織特異性，在整個(gè)身體中都有所表達(dá)，但在大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著。PPARy可以分為yl型和Y2型這兩種亞型，yl型在脂肪組織、免疫系統(tǒng)組織、腎上腺、小腸中表達(dá)，型在脂肪細(xì)胞中特異性地表達(dá)，對于脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)或脂肪合成起著重要的作用。代謝綜合癥患者以發(fā)達(dá)國家為中心有增加的趨勢，急需安全性優(yōu)異、能夠長期攝取的代謝綜合癥改善劑。非專利文獻(xiàn)l:松澤祐次、"代謝綜合癥的概念和分子機(jī)理"、治療、2004年11月、第86巻、第11號、p011-01
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于提供沒有副作用的問題、能夠長期攝取的代謝綜合癥改善劑。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑的特征在于含有橙皮油素(aurapten)。上述代謝綜合癥例如包括胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血脂癥、動(dòng)脈硬化、高血壓癥、肥胖和內(nèi)臟脂肪型肥胖等疾病。本發(fā)明人從副作用和長期攝取的觀點(diǎn)出發(fā)，以食品中所含的物質(zhì)為中心進(jìn)行了一系列的研究。在該過程中，發(fā)現(xiàn)柑橘類中所含的橙皮油素具有活化PPARa和PPARY的作用、促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素分泌的作用以及抑制肝臟細(xì)胞中超低密度脂蛋白(VLDL)生成的作用，進(jìn)而完成了本發(fā)明。即，根據(jù)本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑，通過活化PPAR,促進(jìn)了脂肪的燃燒，抑制了TNF(i和游離脂肪酸的分泌，因此可以使脂肪細(xì)胞的狀態(tài)恢復(fù)到正常，可以對例如胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、肥胖、內(nèi)臟脂肪型肥胖、高血壓、高血脂癥和動(dòng)脈硬化等疾病進(jìn)行預(yù)防或治療等。另外，根據(jù)本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑，通過促迸脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素的分泌，可以促進(jìn)脂肪酸的燃燒和PPARa的活化，使脂肪細(xì)胞的狀態(tài)恢復(fù)正常，另外可以抑制血管內(nèi)膜的炎癥等，阻止例如LDL攝取到血管內(nèi)等，因此也可以對例如胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、肥胖、內(nèi)臟脂肪型肥胖、高血壓、高血脂癥和動(dòng)脈硬化等疾病進(jìn)行預(yù)防或治療等。進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑，通過抑制肝臟細(xì)胞中的VLDL的生成，可以抑制中性脂肪的增加，因此可以對例如高血脂癥等疾病進(jìn)行預(yù)防或治療等。這樣，本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑通過對人和除人以外的哺乳動(dòng)物投予，可以對例如上述疾病進(jìn)行預(yù)防或治療等，因此可以說具有代謝綜合癥的優(yōu)異改善效果。此外，大量含有橙皮油素的例如八朔、甘夏、夏橙、葡萄柚等柑橘類已被長年食用，其安全性被確認(rèn)。另外，橙皮油素的卡路里低，因?yàn)檫@一點(diǎn)，即便糖尿病患者和肥胖患者等長期攝取也沒有問題。而且，由于橙皮油素?zé)o味無臭，因此即便添加到食品等中，也不會(huì)損害該食品的獨(dú)特風(fēng)味，因此還可以添加到例如食品中長期地日常攝取。圖1為表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的橙皮油素的PPARy配體活性的曲線圖。圖2為表示本發(fā)明的其它實(shí)施例中的橙皮油素的PPARcx配體活性的曲線圖。圖3為表示本發(fā)明的另一其它實(shí)施例中的由橙皮油素所導(dǎo)致的脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量的曲線圖。圖4為表示本發(fā)明的上述實(shí)施例中的由橙皮油素所導(dǎo)致的脂聯(lián)素分泌促進(jìn)效果的曲線圖。圖5為表示本發(fā)明的另一其它實(shí)施例中的由橙皮油素所導(dǎo)致的VLDL分泌抑制效果的曲線圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑例如具有PPAR的活化作用、促進(jìn)脂肪細(xì)胞中的脂聯(lián)素分泌的作用、抑制肝臟細(xì)胞中的VLDL生成的作用、抑制脂肪細(xì)胞中的TNFa和游離脂肪酸分泌的作用、促進(jìn)肝臟細(xì)胞中的脂肪的卩氧化的作用等。被活化的PPAR例如為PPARa和PPARy中的至少一個(gè)，優(yōu)選為兩個(gè)。另外，本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑例如誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的凋亡、分化和小型化中的至少一個(gè)。另外，本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑除了含有橙皮油素以外，還可以含有各種添加劑，還可以含有例如其它的具有PPAR活化作用的成分等。對于本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑而言，所使用的橙皮油素沒有特別限定，例如可以列舉出來自于柑橘類的橙皮油素。特別優(yōu)選為來自于果汁的橙皮油素、來自于果實(shí)的橙皮油素和來自于果皮的橙皮油素，可以僅使用其中的l種，還可以并用2種以上。作為上述柑橘類，例如可以列舉出甘夏、八朔、夏橙、葡萄柚等。上述橙皮油素例如可以使用從上述柑橘類中分離精制的橙皮油素，還可以使用市售品。本發(fā)明的藥品為用于預(yù)防或治療代謝綜合癥的藥品，其含有上述本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑。本發(fā)明的藥品通過對人以及除人以外的哺乳動(dòng)物投予，可以預(yù)防或治療例如胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血脂癥、動(dòng)脈硬化、高血壓癥、肥胖和內(nèi)臟脂肪型肥胖等疾病。本發(fā)明的藥品除了含有上述本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑之外，還可以含有例如其它的具有PPAR活化作用的成分、藥學(xué)上可容許的添加物等。對于本發(fā)明的藥品而言，作為具體的劑型，例如可以列舉出片劑、顆粒劑(包括散劑)、膠囊劑、液體制劑(包括糖漿劑)等，可以適當(dāng)使用適于各劑型的添加劑或基材等，根據(jù)日本藥典等所記載的通常方法來制造。另外，作為給藥途徑，沒有特別限定，例如可以列舉出口服給藥和非口服給藥。作為上述非口服給藥，例如可以列舉出口腔內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥、直腸內(nèi)給藥、皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥和靜脈內(nèi)給藥等。本發(fā)明的補(bǔ)充劑為用于預(yù)防或改善代謝綜合癥的補(bǔ)充劑，其含有上述本發(fā)明的代謝綜合癥改善齊U。本發(fā)明的補(bǔ)充劑通過對人以及除人以外的哺乳動(dòng)物投予，可以預(yù)防或改善例如胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血脂癥、動(dòng)脈硬化、高血壓癥、肥胖和內(nèi)臟脂肪型肥胖等疾病。本發(fā)明的補(bǔ)充劑除了含有上述本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑之外，還可以含有各種添加劑、其它的補(bǔ)充劑等，例如可以含有其它的具有PPAR活化作用的成分，維生素C等各種維生素類，氨基酸，寡糖等。本發(fā)明的補(bǔ)充劑的形態(tài)沒有特別限定，例如可以列舉出片劑、顆粒劑(包括散劑)、膠囊劑、液體制劑(包括糖漿劑)等。本發(fā)明的功能性食品為用于預(yù)防或改善代謝綜合癥的功能性食品，其含有上述本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑。人以及除人以外的哺乳動(dòng)物通過攝取本發(fā)明的功能性食品，可以預(yù)防或改善例如胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血脂癥、動(dòng)脈硬化、高血壓癥、月巴胖和內(nèi)臟脂肪型肥胖等疾病。本發(fā)明的功能性食品除了含有上述本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑之外，還可以含有各種添加劑等，例如可以含有其它的具有PPAR活化作用的成分等。另外，本發(fā)明的功能性食品的形態(tài)沒有特別限定，例如可以列舉出面類、點(diǎn)心類和功能性飲料等。本發(fā)明的食品添加劑為用于預(yù)防或改善代謝綜合癥的食品添加劑，其含有上述本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑。人以及除人以外的哺乳動(dòng)物通過攝取本發(fā)明的食品添加劑，可以預(yù)防或改善例如胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血脂癥、動(dòng)脈硬化、高血壓癥、B巴胖和內(nèi)臟脂肪型肥胖等疾病。本發(fā)明的食品添加劑除了含有上述本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑之外，還可以含有各種添加劑等，例如可以含有其它的具有PPAR活化作用的成分等。本發(fā)明的食品添加劑的形態(tài)沒有特別限定，例如可以列舉出液體狀、糊狀、粉末狀、薄片狀和顆粒狀等。另外，本發(fā)明的食品添加劑還包括例如飲料用食品添加劑。本發(fā)明的PPAR活化劑的特征在于含有橙皮油素。本發(fā)明的PPAR活化劑還可以含有橙皮油素以外的其它成分。作為上述其它成分，例如有各種添加劑、其它的PPAR活化劑等。能夠在本發(fā)明的PPAR活化劑中使用的橙皮油素與上述本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑相同。本發(fā)明的PPAR活化劑可以用于例如上述代謝綜合癥的改善、皮膚疾病等的治療中。作為上述皮膚疾病，例如可以列舉出懷孕時(shí)間為33周以下的早產(chǎn)兒的皮膚；特異反應(yīng)性皮炎、脂漏性皮炎；口唇炎、干裂唇、鼻子的刺激和外陰陰道炎等粘膜的炎癥；過敏和刺激物接觸等所引起的濕疹皮炎、冬季濕疹、放射線皮炎、淤血性皮炎；包括化學(xué)藥品、燒傷、水皰性障礙、靜脈、動(dòng)脈、栓塞性或糖尿病的潰瘍的血管損傷或缺血導(dǎo)致的潰瘍或糜爛；伴隨或不伴隨皮膚障壁的異常的魚鱗癬；表皮水皰癥；干癬；肥大的瘢痕；瘢痕瘤、內(nèi)因性老化和dermatoheliosus;機(jī)械性摩擦導(dǎo)致的起皰；類固醇萎縮癥；包括木質(zhì)素(lignin)黑色素瘤、基底細(xì)胞癌、扁平上皮癌、日光性角化癥和病毒誘發(fā)異常增殖(疣和尖銳濕疣)的黑色素瘤和非黑色素瘤的皮膚癌等。將本發(fā)明的PPAR活化劑用在皮膚疾病的治療中時(shí)，其形態(tài)沒有特別限定，例如可以列舉出乳液劑、液體劑、凝膠劑、膏劑、皮膚軟化膏劑、軟膏、噴劑或進(jìn)行局部涂抹的其它形態(tài)等。本發(fā)明的脂聯(lián)素分泌促進(jìn)劑的特征在于含有橙皮油素。本發(fā)明的脂聯(lián)素分泌促進(jìn)劑還可以含有除了橙皮油素以外的其它成分?？梢栽诒景l(fā)明的脂聯(lián)素分泌促進(jìn)劑中使用的橙皮油素與上述本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑相同。本發(fā)明的脂聯(lián)素分泌促進(jìn)劑可以用于例如改善上述代謝綜合癥或者治療慢性肝炎等慢性肝臟疾病等。這是由于，根據(jù)本發(fā)明的脂聯(lián)素分泌促進(jìn)劑，例如可以抑制慢性肝炎等慢性肝臟疾病的肝纖維化。本發(fā)明的脂聯(lián)素分泌促進(jìn)劑的形態(tài)沒有特別限定，例如可以列舉出藥品、補(bǔ)充劑、功能性食品和食品添加劑等。本發(fā)明的用途為橙皮油素的用于制造代謝綜合癥改善劑的用途。另外，本發(fā)明的其它用途為橙皮油素用于改善代謝綜合癥的用途，其包括對人及除人以外的哺乳動(dòng)物投予橙皮油素。本發(fā)明的又一其它用途為橙皮油素的用于制造PPAR活化劑的用途。上述橙皮油素可以使用與上述本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑相同的橙皮油素。作為上述哺乳動(dòng)物，例如可以列舉出小鼠、大鼠、兔子、狗、貓、牛、馬、豬、猴子等。本發(fā)明的改善代謝綜合癥的方法包括對人和除人以外的哺乳動(dòng)物投予橙皮油素。能夠在本發(fā)明的改善方法中使用的橙皮油素與上述本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑相同。本發(fā)明的改善方法中，投予的橙皮油素的形態(tài)沒有特別限定，例如可以列舉出片劑、顆粒劑(包括散劑)、膠囊劑、液體制劑(包括糖漿劑)等。另外，給藥方法也沒有特別限制，例如可以列舉出口服給藥、非口服給藥，作為上述非口服給藥，例如可以列舉出口腔內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥、直腸內(nèi)給藥、皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥和靜脈內(nèi)給藥等。本發(fā)明的PPAR活化方法為通過橙皮油素來活化PPAR的方法。在本發(fā)明的PPAR活化方法中，更優(yōu)選通過使上述橙皮油素與例如脂肪細(xì)胞等接觸來活化PPAR。能夠在本發(fā)明的活化方法中使用的橙皮油素與上述本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑相同。本發(fā)明的橙皮油素優(yōu)選如上所述以柑橘類為原料進(jìn)行制造。以下示出該制造方法的一個(gè)例子(日本特開平11-29565號公報(bào))。首先，在常溫下將柑橘類的果皮浸漬在水中后，離心分離得到果皮油。也可以使用果實(shí)、果肉、果汁來代替上述果皮，但由于橙皮油素的含量多，因此優(yōu)選使用果皮。接著，使上述果皮油吸附在吸附劑上。作為上述吸附劑，優(yōu)選使用電中性、且比表面積大的多孔性吸附劑，例如可以列舉出含有苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物的樹脂等。另外，從增多吸附量、高效地精制橙皮油素的觀點(diǎn)出發(fā)，作為上述吸附劑使用的樹脂優(yōu)選以干燥狀態(tài)使用。使用醇水溶液洗滌吸附有上述果皮油的吸附劑，從而將吸附在吸附劑上的雜質(zhì)除去。上述醇水溶液的醇濃度例如小于50%(體積比)、優(yōu)選為10%~45%、更優(yōu)選為35°/。~45%。作為上述醇，例如可以列舉出乙醇、異丙醇等，當(dāng)將精制了的橙皮油素用在食品添加劑中時(shí)，優(yōu)選乙醇;當(dāng)用在藥品中時(shí)，優(yōu)選異丙醇。另外，上述醇水溶液的量沒有特別限定，例如優(yōu)選為吸附在吸附劑上的橙皮油素含有液的約14倍(體積比)。然后，使用醇水溶液從上述吸附劑中洗脫橙皮油素。由于該洗脫液含有橙皮油素，因此可以直接使用，也可以濃縮或干燥后使用。這樣獲得的橙皮油素為基本白色的無臭無味物質(zhì)。上述醇水溶液的醇濃度例如為50%~95%、優(yōu)選為60%~卯％、更優(yōu)選為75°/。~85%。上述醇水溶液及其添加量與上述相同。下面說明本發(fā)明的實(shí)施例。但本發(fā)明并不限定于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1如下所述，本實(shí)施例為確認(rèn)由橙皮油素帶來的PPARy活化的例子。在24孔培養(yǎng)板中接種CV-1細(xì)胞(來自于雄性非洲綠猴腎臟的培養(yǎng)細(xì)胞)達(dá)到0.2pg/孔，在37'C、5。/。c02條件下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)基使用含有10%FBS(胎牛血清)、10mg/mL青霉素-鏈霉素溶液的DMEM(杜氏改良細(xì)胞培養(yǎng)基，Dulbecco，sModifiedEagleMedium:GIBCO公司)。使用Lipofectamine系統(tǒng)(商品名，Invitrogen公司)將pM-hPPARy和p4xUASg-tk-luc進(jìn)行轉(zhuǎn)染。另外，上述pM-hPPARY是結(jié)合了GAL4基因(氨基酸序列1~147)和人PPARy配體結(jié)合部位基因(氨基酸序列204~505)的融合蛋白質(zhì)表達(dá)用質(zhì)粒，p4xUASg-tk-luc是在熒光素酶基因上游插入4次GAL4的響應(yīng)序列(UAS)而得到的報(bào)告質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染約24小時(shí)后，將各種濃度(0.1、1.0、10、50和100^M)的橙皮油素的樣品加入到上述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時(shí)。上述樣品通過將橙皮油素溶解在二甲基亞砜(DMSO)中而制備。無處理對照中添加DMSO來代替上述橙皮油素。培養(yǎng)后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)(Dual-LuciferaseReporterGeneAssaysystem)(商品名，Promega公司)進(jìn)行測定。與測定組相同地，作為對照組，使用pM(除去了PPARy配體結(jié)合部位基因的質(zhì)粒)來代替pM-hPPARp進(jìn)行測定。對于各樣品，求出測定組和對照組的發(fā)光強(qiáng)度平均值(n=4)之比(測定組/對照組)，將相對于無處理對照的相對活性作為樣品的PPARy配體活性。其結(jié)果示于下述表l和圖l的曲線圖中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(平均值i標(biāo)準(zhǔn)偏差)如上述表1和圖1可知，通過橙皮油素，PPARy的活性提高，其活性隨著橙皮油素濃度的增高而增強(qiáng)。實(shí)施例2如下所述，本實(shí)施例為確認(rèn)由橙皮油素帶來的PPARa活化的例子。使用pM-hPPARa來代替pM-hPPARy，將橙皮油素的濃度設(shè)定為0.1、1.0、10、50和80iiM，除此之外，與實(shí)施例1同樣地操作，測定橙皮油素的PPAR(x配體活性。其結(jié)果示于下述表2和圖2的曲線圖中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(平均值i標(biāo)準(zhǔn)偏差)如上述表2和圖2可知，通過橙皮油素，PPARa的活性提高，其活性隨著橙皮油素濃度的增高而增強(qiáng)。實(shí)施例3如下所述，本實(shí)施例為確認(rèn)由橙皮油素帶來的脂聯(lián)素的分泌促進(jìn)的例子。(前體脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo))首先，準(zhǔn)備以下2種培養(yǎng)基。分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(0.25pM:DEX、0.5mM:MIX、10ue/mL:胰島素/100/0FBS/DMEM)在500mL的DMEM(SIGMA生產(chǎn))中加入55rnL的FBS(胎牛血清(GIBCO生產(chǎn)))，制備10%FBS/DMEM。在其中加入D8.75pL的lmMDEX(地塞米松)/DMSO(NacalaiTesque生產(chǎn))、555pL的10mg/mL胰島素/PBS(SIGMA生產(chǎn))。另外，胰島素/PBS是在PBS中預(yù)先加入1NHC1，使其達(dá)到胰島素可溶程度的酸性后，使胰島素溶解。在要使用前將MIX(3-異丁基-l-甲基黃嘌呤)(NacalaiTesque生產(chǎn))加入到必要量的上述培養(yǎng)基中，使其達(dá)到0.5mM,從而制備分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。由于MIX非常難溶，因此首先溶解在少量的99.5°/。乙醇中后，再加入到10%FBS/DMEM中。此時(shí)，使得99.5%乙醇的最終濃度不超過1%。分化促進(jìn)培養(yǎng)基(5ue/mL:胰島素/10Q/。FBS/DMEM)在555mL的10%FBS/DMEM中加入277.5pL的10mg/mL胰島素/PBS，制備分化促進(jìn)培養(yǎng)基。接著，解凍培養(yǎng)的前體脂肪細(xì)胞3T3-L1，接種在100mm的培養(yǎng)皿中，將3T3-L1培養(yǎng)至約80%融合。將達(dá)到約80°/。融合的1個(gè)培養(yǎng)皿的10T1/2傳代至1個(gè)6孔板中，在6孔板中將3T3-L1進(jìn)一步培養(yǎng)至達(dá)到融合后，更換為分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使其分化誘導(dǎo)。48小時(shí)后，更換為分化促進(jìn)培養(yǎng)基，之后每2天更換一次分化促進(jìn)培養(yǎng)基。開始分化誘導(dǎo)7天后，使用SepasolRNAIsuper(NacalaiTesque生產(chǎn))提取mRNA，使用LightCycler(TM)測定作為脂肪細(xì)胞分化初期指標(biāo)的36B4、aP2和脂聯(lián)素的mRNA表達(dá)量。另外，從各孔中分別取出lmL分化誘導(dǎo)7天后的培養(yǎng)基，使用小鼠/大鼠脂聯(lián)素ELISA試劑盒(商品名)(大塚制藥生產(chǎn))，測定培養(yǎng)上清中的脂聯(lián)素量。(利用LightCycler(TM)定量mRNA)總RNA的提取和定量從上述6孔板中除去培養(yǎng)基，在各孔中各加入lmL的SepasolRNAIsuper(NacalaiTesque生產(chǎn))、通過多次反復(fù)吹吸使細(xì)胞分散。將該液體移至1.5mL的管中，在室溫下放置5分鐘后，加入20(HiL氯仿，利用渦流充分地?cái)嚢?，在室溫下放?分鐘。冷卻至4"C，在12000xg下離心15分鐘。注意不要打亂苯酚層(下層、黃色)和水層(上層、無色)的界面，同時(shí)僅將水層移至其它的管(容量為L5mL)中。此時(shí)，注意不要取出浮在中間的蛋白質(zhì)。在上述管中加入500nL異丙醇并混合，在室溫下放置10分鐘。冷卻至4"C,在12000xg下離心10分鐘，除去約lmL的上清。在該沉淀加入lmL的75%乙醇并進(jìn)行攪拌，將沉淀充分地混懸后，冷卻至4'C，在12000xg下離心10分鐘，除去上清。將所得沉淀(總RNA)干燥后，溶解在2(HiL的無核酸酶水中，通過NanoDrop(SCRUM生產(chǎn))測定mRNA的濃度。逆轉(zhuǎn)錄將提取后測定過的mRNA溶液調(diào)制成mRNA濃度達(dá)到1嗎小L。在8聯(lián)管(容量為0.2mL)中添加lpL的OligodT引物和lO^L的上述RNA溶液。在熱循環(huán)儀中，在7(TC下培養(yǎng)上述混合液10分鐘，破壞RNA的高級結(jié)構(gòu)，移到冰上，放置1分鐘以上。接著，依次加入llpL的RNA樣品/引物混合液、5pL的5x逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、lpL的RNase抑制劑、5pL的2.5mMdNTPMix、以及2pL的無核酸酶的水(總計(jì)24pL)。在熱循環(huán)儀中，在42'C下培養(yǎng)5分鐘后，加入lnL逆轉(zhuǎn)錄酶，吹吸管中的內(nèi)容物以充分地混合。在熱循環(huán)儀中，在42'C下培養(yǎng)50分鐘后，再在7(TC下培養(yǎng)15分鐘，之后放在冰上進(jìn)行冷卻，輕輕離心使反應(yīng)液集中在管的底部，在-2(TC下冷凍保存。另外，在用于LightCycler(TM)測定時(shí)，每次稀釋10倍使用。LightCvcler(TM)測定以下的操作均在超凈工作臺中進(jìn)行。將5mL的加入有測定表達(dá)量的基因的片斷的質(zhì)粒溶液添加到0.65mL管中，用45mL在LightCycler(TM)DNAMasterSYBRGreen(商品名)中所附帶的水將其稀釋至10倍。反復(fù)該操作，制作102、103、104、105、106、107和108倍的各稀釋溶液。使用小鑷子在LightCycler(TM)CentrifUgeAdapter(商品名)上安裝專用毛細(xì)管，在其中分別注入18pL各上述試劑。進(jìn)而，分別添加2pL的水(陰性對照)或7級稀釋溶液(標(biāo)準(zhǔn)液)以及測定用樣品的cDNA的IO倍稀釋液后，使用小鑷子蓋上蓋子。在5000rpm、4°C下離心10秒鐘后，將毛細(xì)管裝填到轉(zhuǎn)盤中后放置到容器中，進(jìn)行測定。(利用ELISA測定脂聯(lián)素的分泌量)上述小鼠/大鼠脂聯(lián)素ELISA試劑盒的構(gòu)成如下所述。洗滌用原液檢體稀釋用原液抗體板(抗小鼠脂聯(lián)素多克隆抗體(兔)固相板)標(biāo)準(zhǔn)品8.0ng/mL(重組小鼠脂聯(lián)素)生物素標(biāo)記抗體液(生物素標(biāo)記抗小鼠脂聯(lián)素多克隆抗體(兔))酶標(biāo)記鏈霉卵白素原液(HRP標(biāo)記鏈霉卵白素)酶標(biāo)記鏈霉卵白素稀釋液基質(zhì)液A(3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺)基質(zhì)液B(過氧化氫)反應(yīng)停止液首先，調(diào)制以下試劑和檢體液。洗滌液相對于40mL上述洗滌用原液，以960mL的比例混合精制水，并在2.8。C下保存。檢體稀釋液相對于50rnL上述檢體稀釋用原液，以200rnL的比例混合精制水，并在2.8'C下保存。標(biāo)準(zhǔn)液用上述檢體稀釋液將8.0ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品倍半稀釋，調(diào)制4.0ng/mL、2.0ng/mL、1.0ng/mL、0.5ng/mL和0.25ng/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。酶標(biāo)記鏈霉卵白素液相對于12mL上述酶標(biāo)記鏈霉卵白素稀釋液，以60nL的比例混合上述酶標(biāo)記鏈霉卵白素原液?；|(zhì)液相對于6mL上述基質(zhì)液B，以6mL的比例混合上述基質(zhì)液A。檢體液使用上述檢體稀釋液，將對照和配體候補(bǔ)物質(zhì)添加培養(yǎng)上清稀釋至25倍，將作為陽性對照的匹格列酮(pioglitazone)添加培養(yǎng)上清稀釋到50倍。僅取出檢査所必需的抗體板的條帶。在抗體板的各孔中各加入約200pL上述洗滌液后，利用洗板機(jī)將孔中的液體完全地吸引除去。再次進(jìn)行該洗滌和吸引。在各孔中分別添加各lOO^L的各濃度標(biāo)準(zhǔn)液和稀釋過的檢體，連續(xù)測定2次。另外，標(biāo)準(zhǔn)液在每次測定和每板中都必須測定。利用封板條覆蓋抗體，在室溫下放置60分鐘使其反應(yīng)后，從抗體板上取下封板條，利用洗板機(jī)將孔中的液體完全地吸引除去。接著，在各孔中分別各加入約200pL的洗滌液，并迅速地吸引除去。再次反復(fù)操作上述洗滌和吸引4次。在抗體板的各孔中分別各加入100pL生物素標(biāo)記抗體液后，利用封板條覆蓋抗體，在室溫下放置60分鐘使其反應(yīng)。與上述同樣地反復(fù)操作孔的洗滌和吸引5次。在抗體板的各孔中分別各加入100nL酶標(biāo)記鏈霉卵白素液后，利用封板條覆蓋抗體，在室溫下放置60分鐘使其反應(yīng)。與上述同樣地反復(fù)操作孔的洗滌和吸引5次。在抗體板的各孔中分別各加入lOOpL基質(zhì)液，在室溫下靜置15分鐘使其反應(yīng)后，在抗體板的各孔中分別各加入100nL反應(yīng)停止液，利用板讀取器測定各孔在450nrn下的吸光度。使用LightCycler(TM)的定量結(jié)果，求出各樣品的36B4的mRNA分別與aP2和脂聯(lián)素的mRNA表達(dá)量的比，其結(jié)果示于下述表3和圖3的曲線圖中。另外，將通過ELISA獲得的脂聯(lián)素分泌量的測定結(jié)果示于下述表4和圖3的曲線圖中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)對使用添加有橙皮油素的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行了培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞和使用無處理對照的培養(yǎng)基進(jìn)行了培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果，通過添加橙皮油素，脂肪細(xì)胞中的脂聯(lián)素的分泌有所促進(jìn)。實(shí)施例4如下所述，本實(shí)施例為確認(rèn)由橙皮油素帶來的VLDL分泌抑制的例子。(細(xì)胞的培養(yǎng))在MEM培養(yǎng)基(SIGMA生產(chǎn))中按照FCS終濃度為10%、非必須氨基酸為1%、丙酮酸鈉為lmM、谷氨酰胺液為2mM的方式混合上述成分。另外，混合是在超凈臺中無菌進(jìn)行的。使用吸管將在100mm/Collagen-CoatedDish(商品名、IWAKI生產(chǎn))中培養(yǎng)至80~90%融合的HepG2(人肝細(xì)胞)的培養(yǎng)基除去，并用2mL的lxPBS洗滌。加入2mL的胰蛋白酶-EDTA，緩慢地使上述培養(yǎng)皿旋轉(zhuǎn)以使遍布所有細(xì)胞，之后通過吸管將其除去。將上述培養(yǎng)皿放在C02培養(yǎng)箱G7。C、5%)中靜置15分鐘后，加入4mL增殖培養(yǎng)基，吹吸混合。將其加入到預(yù)先添加有3mL增殖培養(yǎng)基的2個(gè)培養(yǎng)皿中，每皿2mL。將上述培養(yǎng)皿蓋上蓋，十字形地移動(dòng)以混合內(nèi)容物。利用顯微鏡(OLYMPUS生產(chǎn))確認(rèn)細(xì)胞后，在C02培養(yǎng)箱G7'C、5%)中培養(yǎng)。3、4天后，使用顯微鏡確認(rèn)達(dá)到80%~90%融合后，利用同樣的方法進(jìn)行傳代，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。1.時(shí)程實(shí)驗(yàn)將HepG2培養(yǎng)至80。/。90。/。融合，利用吸管除去其培養(yǎng)基，用2mL的lxPBS洗滌，并加入5mL的增殖培養(yǎng)基。每10小時(shí)采集200pL培養(yǎng)基到管(容量為L5mL)中，使用該樣品進(jìn)行apoB100的免疫印跡法和ELISA的測定。(免疫印跡法)(1)SDS-PAGE在1.5mL的管中加入20pL的培養(yǎng)基和含有62.5mM的Tris-HCl(pH為6.8)、2%SDS、10°/。甘油、5%(w/v)2-巰基乙醇和0.0005%BPB溶液的緩沖液，使總量達(dá)到30nL，并充分?jǐn)嚢琛Ｔ跓崴≈?、IO(TC下煮沸5分鐘，進(jìn)行SDS化。將含有7.5%SDS的丙烯酰胺凝膠安裝在MiniPROTEAN3Ce11(商品名、BioRadLaboratories生產(chǎn))中，按照凝膠完全浸入的方式注入300pL的電泳緩沖液。另外，上述電泳緩沖液是用270mL的dH20稀釋30ml的10xTris/甘氨酸/SDS緩沖液(BioRadLaboratories生產(chǎn))而制作的。在凝膠中小心地分別注入30pL的樣品和5mL的RainbowMarker(商品名、Promega生產(chǎn))，進(jìn)行電泳。電泳條件為200V恒定電壓下進(jìn)行40~45分鐘。電源使用Model3000xiComputerControlledElectrophoresisPowerSupply(商品名、BioRadLaboratories生產(chǎn))。(2)印跡將SDS-PAGE完成后的凝膠與PVDF膜(HybondTM-PPVDF轉(zhuǎn)膜、AmarshamBiosciences生產(chǎn))一起浸漬在轉(zhuǎn)印緩沖液(2.42mg/mLTrisbase、11.55mg/mL甘氨酸、20%甲醇)中15分鐘，將其平衡化。使用半干平板轉(zhuǎn)印裝置(日本EIDO生產(chǎn))，利用半干法轉(zhuǎn)印在PVDF膜上(40mA/膜、90分鐘)。利用5%脫脂乳使該膜進(jìn)行印跡(室溫、1小時(shí))。印跡后，在上述膜中分注5mL用5°/。脫脂乳稀釋了1000倍的MsxHuApolipoproteinB(CHEMICON生產(chǎn))，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。用PBST洗滌3次(10分鐘、20分鐘、30分鐘)，在上述膜中均勻地注入5mL用5%脫脂乳稀釋了5000倍的抗小鼠IgG-HRP(Promega生產(chǎn))，在室溫下反應(yīng)l小時(shí)。用PBST洗滌3次(10分鐘、50分鐘、10分鐘)，通過使用了ECL+PlusWesternBlottingDetectionSystem(商品名、AmarshamBiosciences生產(chǎn))的化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。(ELISA)首先配制VLDL標(biāo)準(zhǔn)液。VLDL標(biāo)準(zhǔn)液是使用增殖培養(yǎng)基將1.169mg/mL的人VLDL標(biāo)準(zhǔn)品(商品名、CHEMICON生產(chǎn))稀釋后使用。稀釋率為100倍、1000倍、10000倍、100000倍和1000000倍。使用將VLDL中的人apoB100作為抗原識別的夾心ELISA進(jìn)行。首先，在ELISA板的每個(gè)孔中分別注入lOOpL的MoabxLDLApolipoprotein、ApoB(MONOSAN生產(chǎn))，使用滅菌封條密封板后，在4"C下靜置1晚。之后，所有的分別注入指的是l個(gè)孔中的注入。第二天，分別注入200juL的ZeptoBlock(商品名、ZeptoMetrixCorporation生產(chǎn))后，密封上述板，在室溫下靜置2小時(shí)以進(jìn)行封閉。接著，分別注入lOOiaL的培養(yǎng)基和VLDL標(biāo)準(zhǔn)液后，密封上述板，在室溫下靜置1小時(shí)。用200pL的PBST進(jìn)行洗滌并用吸引器進(jìn)行吸引，這兩項(xiàng)操作共進(jìn)行5次。分別注入lOOpL用PBS稀釋了1000倍的AffinityPurifiedAnti-ApolipoproteinB(ROCKLAND生產(chǎn))，在室溫下靜置1小時(shí)。與上述同樣地洗滌，并分別注入lOO^L用PBS稀釋了5000倍的DonkeyAnti-goatlgGHRP(Promega生產(chǎn))，在室溫下靜置1小時(shí)。與上述同樣地洗滌，并混合TMBMicrowellPeroxidasesubstrate(商品名、Funakoshi生產(chǎn))的A液和B液，在室溫下靜置5分鐘后，分別注入100pL的該混合液，在室溫下靜置5分鐘。在上述混合液中加入100pL的IM磷酸溶液，利用wallacARVOsx(商品名、PerkinElmerlifesciences生產(chǎn))測定450nm的光度。測定模式為光度測定(Photometry)(450nm、l.OS)。通過人apoB100的免疫印跡法的結(jié)果，在20小時(shí)以后可以明顯地確認(rèn)到條帶。另外，通過ELISA的結(jié)果，從開始培養(yǎng)到50小時(shí)左右都可以確認(rèn)到直線性的VLDL分泌量的增加。通過這些結(jié)果，將后述VLDL分泌抑制實(shí)驗(yàn)中的培養(yǎng)基回收時(shí)間設(shè)定為30小時(shí)。2.VLDL分泌抑制實(shí)驗(yàn)(配制含有橙皮油素的培養(yǎng)基)在15mL的離心管中加入3mL的培養(yǎng)基，再按照終濃度達(dá)到10pM、2(HiM和50nM的方式加入橙皮油素，通過顛倒攪拌來充分地混合，配制含有橙皮油素的培養(yǎng)基。另外，作為對照，配制等量加入DMSO來代替橙皮油素而得到的培養(yǎng)基。將HepG2在100mm/Collagen-CoatedDish(商品名、IWAKA生產(chǎn))中培養(yǎng)至80~90°/。融合。利用吸管從上述皿中除去培養(yǎng)基后，用2mL的lxPBS洗滌。加入2mL的胰蛋白酶-EDTA，緩慢使上述培養(yǎng)皿旋轉(zhuǎn)以使遍布所有細(xì)胞，然后利用吸管將上述胰蛋白酶-EDTA除去，將上述培養(yǎng)皿在C02培養(yǎng)箱(37'C、5%)中靜置15分鐘。之后，加入12mL的增殖培養(yǎng)基，通過吹吸來混合，將該混合液分注到Collagen-CoatedMicroplates12Well/FlatBottom(商品名、IWAKI生產(chǎn))中，每孔各lmL。利用顯微鏡確認(rèn)細(xì)胞后，將上述孔在C02培養(yǎng)箱(37'C、5%)中培養(yǎng)1~2天。利用顯微鏡確認(rèn)達(dá)到80~90%融合后，除去培養(yǎng)基，加入800nL含有橙皮油素的培養(yǎng)基以更換培養(yǎng)基。30小時(shí)后，從各孔中采集800nL培養(yǎng)基。使用該采集的800;iL培養(yǎng)基來測定活細(xì)胞數(shù)，同時(shí)與上述同樣地進(jìn)行免疫印跡法和ELISA的測定。使用ELISA的結(jié)果，對各個(gè)樣品計(jì)算測定組和無處理對照組的VLDL分泌量之比(測定組/對照組)。(活細(xì)胞數(shù)的測定)使用CellTiter96AqueousOneSolutionCellProliferationAssay(商品名、Promega生產(chǎn))進(jìn)行測定。首先，在離心管(容量為15mL)中加入1.6mLCellTiter96AqueousOneSolutionReagent和6.4mL的增殖培養(yǎng)基，并充分?jǐn)嚢?。在剛剛攪拌上述培養(yǎng)基后的孔中加入上述混合液，每孔各600pL，在C02培養(yǎng)箱(37°C、5%)中培養(yǎng)40分鐘。將該混合液分別注入到ELISAPLATE96well(商品名、IWAKI生產(chǎn))中，每3個(gè)孔100nL，測定490nm的吸光度。測定使用wallacARVOsx(商品名、PerkinElmerlifesciences生產(chǎn))，測定模式為吸光度(490nm、l.OS)。對于各樣品，計(jì)算測定組和無處理對照的活細(xì)胞數(shù)之比(測定組/對照組)。以上結(jié)果示于下述表5和圖5的曲線圖中。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>(平均值i標(biāo)準(zhǔn)偏差)通過以上結(jié)果，通過橙皮油素，VLDL的分泌被抑制，其比例隨著橙皮油素濃度的增高而大大增大。如上所述，本發(fā)明的代謝綜合癥改善劑由于具有優(yōu)異的PPARa活性和PPARY活性、脂聯(lián)素分泌促進(jìn)作用等，因此對于代謝綜合癥的改善極為有效，可以用作用于對例如胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動(dòng)脈硬化、肥胖和內(nèi)臟脂肪型肥胖等疾病進(jìn)行預(yù)防和治療等的藥品、補(bǔ)充劑、功能性食品和食品添加劑。另外，這些不僅對人有效，對于其它動(dòng)物也是有效的。權(quán)利要求1.一種代謝綜合癥改善劑，其特征在于，含有橙皮油素。2.權(quán)利要求1所述的代謝綜合癥改善劑，其中，所述代謝綜合癥包括選自胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血脂癥、動(dòng)脈硬化、高血壓癥、肥胖和內(nèi)臟脂肪型肥胖中的至少一種疾病。3.權(quán)利要求1所述的代謝綜合癥改善劑，其中，其將過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)活化。4.權(quán)利要求1所述的代謝綜合癥改善劑，其中，所述過氧化物酶體增殖物激活受體為PPARa和PPARy中的至少一種。5.權(quán)利要求1所述的代謝綜合癥改善劑，其中，所述橙皮油素來自于選自柑橘類果實(shí)、柑橘類果汁和柑橘類果皮中的至少一種。6.權(quán)利要求5所述的代謝綜合癥改善劑，其中，所述柑橘類選自甘夏、八朔、夏橙和葡萄柚。7.—種用于預(yù)防或治療代謝綜合癥的藥品，其中，含有權(quán)利要求l所述的代謝綜合癥改善劑。8.—種用于預(yù)防或改善代謝綜合癥的補(bǔ)充劑，其中，含有權(quán)利要求l所述的代謝綜合癥改善劑。9.一種用于預(yù)防或改善代謝綜合癥的功能性食品，其中，含有權(quán)利要求1所述的代謝綜合癥改善劑。10.—種用于預(yù)防或改善代謝綜合癥的食品添加劑，其中，含有權(quán)利要求1所述的代謝綜合癥改善劑。11.一種過氧化物酶體增殖物激活受體活化劑，其特征在于，含有橙皮油素。12.—種脂聯(lián)素分泌促進(jìn)劑，其特征在于，含有橙皮油素。13.橙皮油素的用于制造代謝綜合癥改善劑的用途。14.橙皮油素的用于制造過氧化物酶體增殖物激活受體活化劑的用途。15.橙皮油素的用于改善代謝綜合癥的用途，其包括對哺乳動(dòng)物投予橙皮油素。16.改善代謝綜合癥的方法，其包括對哺乳動(dòng)物投予橙皮油素。17.過氧化物酶體增殖物激活受體活化方法，其通過橙皮油素活化過氧化物酶體增殖物激活受體。全文摘要本發(fā)明提供一種沒有副作用問題、能夠長時(shí)間攝取的代謝綜合癥改善劑。使用橙皮油素作為代謝綜合癥的改善劑。由于橙皮油素具有活化PPARα和γ的作用、促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素分泌的作用、抑制肝臟細(xì)胞的VLDL生成的作用，因此可以對胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、肥胖、內(nèi)臟脂肪型肥胖、高血壓、高血脂癥和動(dòng)脈硬化等疾病進(jìn)行預(yù)防或治療等，可以對代謝綜合癥進(jìn)行預(yù)防或治療等。另外，由于含有橙皮油素的八朔、甘夏等柑橘類已被長年食用，因此安全性沒有問題，而且由于卡路里低，因而可以長時(shí)間地?cái)z取。另外，由于橙皮油素?zé)o味無臭，因此即便添加在食品中，也不會(huì)損害該食品特有的風(fēng)味，因而可以添加在食品中進(jìn)行攝取。文檔編號A61P43/00GK101106987SQ200680002808公開日2008年1月16日申請日期2006年1月20日優(yōu)先權(quán)日2005年1月21日發(fā)明者佐佐木貴生申請人:愛科來株式會(huì)社