專利名稱：：三七、熟地黃和五加皮的草本植物混合物提取物以及用于關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療的包含其...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及三七(7Votog7.ragMgra)、熟地黃(e/wza""/aera血jarato)和五加皮04cawa"accortec)的草本植物混合物提取物，并且涉及包含其作為有效成分的用于關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療的組合物。
背景技術(shù)：
：關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疾病是代表性的變性難治疾病，其為總地球人群的12%帶來疼痛。并且在韓國超過2百萬人遭受這樣的疾病。關(guān)節(jié)炎是用于由肌骨胳和結(jié)締組織中的炎性變化所引起的全部肌骨胳系統(tǒng)上癥狀的一般術(shù)語。所述疾病的特征在于引起組織中永久性損傷，關(guān)節(jié)、骨、軟骨和脊髓中的畸形、退化及其它痛苦的慢性炎癥。[Hofbause，L.C.，Heufelder,A.E.:TheroleofosteoprotegerinandreceptoractivatorofnuclearfactorkappaBligandinthepathogenesisandtreatmentofrheumatoidarthritis,JW/zn'toa"Ji^eww"fem44:253-259,2001]。將關(guān)節(jié)炎分類成變性關(guān)節(jié)炎(骨關(guān)節(jié)炎)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、非關(guān)節(jié)風(fēng)濕病和膠原病。變性關(guān)節(jié)炎，作為全部關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病中最常見的，是通過由關(guān)節(jié)軟骨磨損的局部退化發(fā)展的。所述疾病的原因仍然不清楚，但是衰老或超重可能是原因。主要地，退行性病變出現(xiàn)在關(guān)節(jié)軟骨中。退化首先在關(guān)節(jié)軟骨中開始，并且殺死軟骨細(xì)胞，然后由組織蛋白酶B、組織蛋白酶D、膠原酶等破壞軟骨基質(zhì)。所述破壞超過蛋白聚糖和膠原的產(chǎn)生的速度，并且軟骨對于外力的適應(yīng)性變得更弱，導(dǎo)致軟骨下的骨組織中的微裂紋。隨著所述疾病發(fā)展，觀察到軟骨下骨的硬化、關(guān)節(jié)周圍的過度骨化、關(guān)節(jié)變形等。然后，軟骨表面變粗糙，并且由關(guān)節(jié)囊包住的關(guān)節(jié)腔中的炎癥重復(fù)發(fā)作，導(dǎo)致關(guān)節(jié)中的持續(xù)疼痛、關(guān)節(jié)強(qiáng)直和漸進(jìn)的運(yùn)動(dòng)障礙。一種關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是全身上的慢性炎性疾病并且它的癥狀對稱地發(fā)生在可活動(dòng)的關(guān)節(jié)。所述疾病亦稱為由免疫系統(tǒng)功能障礙所引起的自身免疫性疾病。然而，病因仍然在討論中。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的特征在于引起軟骨破壞和骨糜爛的持續(xù)炎性滑膜炎，導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的畸形。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀是關(guān)節(jié)浮腫、關(guān)節(jié)壓痛、炎癥。骨關(guān)節(jié)炎的癥狀是晨僵以及隨著關(guān)節(jié)彎曲的劇痛。隨著所述疾病發(fā)展，可以發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞諸如骨糜爛以及關(guān)節(jié)破壞[Firestein,G.S.:Evolvingconceptofrheumatoidarthritis,Atowe423:356-361,2003]。另外，患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者可能遭受其它通過另外的器官損害的癥狀，例如皮膚、腎、心臟、肺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和眼的損害，其起因于與自身免疫過程有關(guān)的脈管炎。關(guān)節(jié)炎相關(guān)的其它癥狀包括紅血球沉降速度的加速和血清C-反應(yīng)蛋白(CRP)或可溶的IL-2受體(IL-2r)濃度的增加。幾乎在每一活躍的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中檢測到紅血球沉降速度的加速。血清C-反應(yīng)蛋白的濃度也在那些患者中增加。它涉及疾病的激活和進(jìn)行性關(guān)節(jié)損害的可能性?？扇躀L-2r，T-細(xì)胞激活的產(chǎn)物的濃度也在活躍的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血清和滑液中增加[Udagawa，N.,Kotake,S.，Kamatani,N.，Takahashi，N.，禾口Suda，T:Themolecularmechanismofosteoclastogenesisinrheumatoidarthritis.ArthritisResearch4:281-289,2002]。一般相信，Thl類型CD4+T細(xì)胞在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展和持續(xù)中起重要作用。即，CD4+T淋巴細(xì)胞刺激巨噬細(xì)胞和滑膜細(xì)胞以分泌炎性細(xì)胞因子(TNF-a、IFN-Y、GM-CSF、IL-2、IL-6)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，為此由可溶物質(zhì)諸如干擾素-Y(IFN-Y)和IL-17并且通過細(xì)胞表面成分諸如CD69傳輸信號(hào)。分泌的細(xì)胞因子刺激滑膜的增生以形成血管翳并破壞軟骨與基質(zhì)金屬蛋白酶的協(xié)同。激活的CD4+T細(xì)胞通過與它們在細(xì)胞表面上接觸由CD40L、CD28、和alb2整聯(lián)蛋白誘導(dǎo)B細(xì)胞的激活，導(dǎo)致含有類風(fēng)濕因子的抗體的產(chǎn)生。當(dāng)CD4+T細(xì)胞激活時(shí)，護(hù)骨蛋白配體(OPGL)在表面上表達(dá)，其刺激破骨細(xì)胞發(fā)生，一種骨組織破壞的重要因素[KongY.Y.，F(xiàn)eigeU.,SarosiI.，等ActivatedTcellsregulatebonelossandjointdestructioninadjuvantarthritisthroughosteprotegerinligand.Atowe402:304-309,1999]。激活的巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞通過分泌VEGF、FGF等促進(jìn)血管發(fā)生?；ぶ屑せ畹难軆?nèi)皮細(xì)胞通過分泌趨化因子諸如IL-8產(chǎn)生放大的炎癥循環(huán)，誘導(dǎo)粘附分子的表達(dá)并加速炎性細(xì)胞的浸潤。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也被認(rèn)為是T-細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，其涉及T-淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞之間的非抗原特異的細(xì)胞內(nèi)相互作用。由T-細(xì)胞表面分子和它的配體之間相互作用誘導(dǎo)的同時(shí)剌激而確定T-細(xì)胞的反應(yīng)尺寸。主要的同時(shí)剌激信號(hào)是由T-細(xì)胞表面受體CD28與CTLA4和它們的配體之間的相互作用給予的，所述配體諸如抗原呈遞細(xì)胞上的B7-相關(guān)的分子即CD80(B7-1)與CD86(B7-2)[Linsley，P.和Ledbetter,J.:TheroleoftheCD28receptorduringTcellresponsestoantigen.」肌iev.imwimo/.11:191-212,1993]。無同時(shí)刺激的T-細(xì)胞激活導(dǎo)致無變應(yīng)性的T-細(xì)胞響應(yīng)，表明免疫系統(tǒng)不響應(yīng)刺激[Schwartz,R.H.:CostimulationofTlymphocytes:theroleofCD28,C丁LA-4，andB7/BB1ininterleukin-2productionandimmunotherapy.Ce〃71:1065-1068,1992]。使用中的變性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療方法如下。對于最初護(hù)理，已經(jīng)使用了非甾體類的抗炎藥物(NSAID)，其改善患者的病癥但是不能預(yù)防所述疾病的發(fā)展和關(guān)節(jié)軟骨的損傷。另外，這樣的藥物被認(rèn)為是長時(shí)間施用，但是長期施用新述藥物引起胃腸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、造血組織、腎、肝等中的副作用。所以，用NSAID治療的患者的一半應(yīng)當(dāng)在一年之內(nèi)放棄所述治療[Langenegger,T.，Michel,B.A.:Drugtreatmentforrheumatoidarthritis"C7/"OAop.366:22-30,1999]。對于下一個(gè)治療步驟，已經(jīng)使用了疾病改性的抗風(fēng)濕藥物(DMARDs)諸如作為含金化合物像硫代蘋果酸金鈉、硫代硫酸金鈉等的金藥物，青霉胺和抗瘧藥。雖然這些藥物將關(guān)節(jié)炎的發(fā)展減少至一定程度，但是它們也帶有嚴(yán)重的副作用。由此，僅515%的患者在首次施用DMARDs5年以后連續(xù)用這些藥物保持治療。如果從那些藥物不再預(yù)期更多的治療效果，則發(fā)展關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)不得不通過外科手術(shù)用人造關(guān)節(jié)替換[SimonL.S.，/脫/C//".54:243-249,2000]。因此，急需開發(fā)有效用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病的新物質(zhì)，其具有新的結(jié)構(gòu)和功能以使常規(guī)治療劑的副作用與毒性、局限性最小化。由此，本發(fā)明人研究了三七、熟地黃和五加皮的多種生理活性，并且結(jié)果本發(fā)明人通過證實(shí)三七、熟地黃和五加皮的草本植物混合物提取物沒有毒性、抑制炎性物質(zhì)的釋放和基質(zhì)破壞因子的合成并且抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)展而完成了本發(fā)明，使它作為無副作用的有希望的候選物用于關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病的預(yù)防和治療劑以及保健食品。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的一個(gè)目的是提供三七、熟地黃和五加皮的草本植物混合物提取物，所述草本植物混合物提取物具有抑制炎性物質(zhì)釋放和基質(zhì)破壞由子合成的活性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于關(guān)節(jié)炎預(yù)防和治療的組合物，所述組合物含有以上提取物作為有效成分。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供三七、熟地黃和五加皮的草本植物混合物提取物，所述草本植物混合物提取物具有抑制炎性物質(zhì)釋放和基質(zhì)破壞因子合成的活性。本發(fā)明還提供用于關(guān)節(jié)炎預(yù)防和治療的組合物，所述組合物含有以上提取物作為有效成分。有益效果與各自的單獨(dú)提取物相比較，本發(fā)明的三七、熟地黃和五加皮的草本植物混合物提取物具有抑制炎性物質(zhì)釋放和抑制基質(zhì)破壞物質(zhì)(MMP-13)合成的優(yōu)異活性，所述炎性物質(zhì)是關(guān)節(jié)炎關(guān)鍵原因之一，所述基質(zhì)破壞物質(zhì)是軟骨破壞因子。而且，動(dòng)物模型中的關(guān)節(jié)炎發(fā)展的抑制在本發(fā)明的草本植物混合物提取物施用時(shí)比分別施用各自的單一提取物時(shí)更大。因此，可以有效使用三七、熟地黃和五加皮的草本植物混合物提取物，不僅用于關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療，而且用于改善健康狀況。附圖簡述參考附圖將最好地理解本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的應(yīng)用，其中圖1是顯示本發(fā)明草本植物混合物提取物對于炎性物質(zhì)TNF-a釋放的抑制效果的曲線圖，圖2是顯示本發(fā)明草本植物混合物提取物對于另一種炎性物質(zhì)氧化氮(NO)釋放的抑制效果的曲線圖，圖3是顯示本發(fā)明草本植物混合物提取物對于軟骨基質(zhì)破壞物質(zhì)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-13)合成的抑制效果的照片，圖4是顯示本發(fā)明草本植物混合物提取物對于2型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中的關(guān)節(jié)炎發(fā)展的抑制效果的曲線圖。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式在下文中，詳細(xì)地描述本發(fā)明。三七(假人參(尸a"ox"otogz'raewg(Burk.)F.H.Chen))是屬于五加科(Araliaceae)的多年生草本植物的根。它小于人參并且具有7片葉。它的根是小的線鼓形狀，并且它廣泛地在中國南方的云南和四川種植。因?yàn)樗鲋参镌谌齻€(gè)枝上具有7個(gè)葉子，所以將它稱為'Samchil(三-七)，并且經(jīng)常稱為'Samchil，人參，由于它的類似于高麗參(Koreanginseng)的外觀。所述根具有3~8%的皂苷，并且它的主要組分是人參皂苷Rbi、Rgi和Re，和三七皂苷R4、R2、Fa和Fc，但是也包括少量的人參皂苷R2、b2、d、e、c。不包含Ro或如果包含它，則它必須是最少的。三七中的精油組成比人參中的少。三七另外包括齊墩果酸(oleanolieacid)。它的根具有止血和強(qiáng)心活性。從動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，所述根具有增加冠狀動(dòng)脈血流、減少氧消耗和降低血液中脂質(zhì)與膽固醇水平的功效。三七也具有抗炎、鎮(zhèn)痛和止血的功能，以致不僅對于炎性疾病包括肝炎的治療，而且對于損傷、割傷等的出血以及內(nèi)出血的治療是非常有用的。施用至傷口或口服產(chǎn)生同樣的效果。熟地黃是屬于玄參科(Scrophulariaceae)的藥用植物的根，在蒸煮并干燥以后己經(jīng)將其用作傳統(tǒng)的東方藥物。生的熟地黃被稱作ie/2m朋m'^ra血crw血sLibosch，并且干燥的熟地黃被禾爾作ieAma""/<3￡r"(iixLibosch。特別是，已經(jīng)在浸于酒精飲料9次之后通過蒸汽干燥過程的一種被稱作"Gnjiwhang"，其藥物作用已知是最好的。它同時(shí)具有甘苦味道并且具有使東西溫暖的性質(zhì)，通過所述性質(zhì)它可以補(bǔ)充血液和能量(生命和生命活動(dòng)所需的基本物質(zhì))，以便除了使頭發(fā)黑和健康之外，它還幫助治療膝蓋和腰部下背的寒冷以及月經(jīng)不調(diào)。熟地黃是Samultang的主要組分之一，并且已經(jīng)施用于減緩發(fā)燒、干燥的喉嚨和善渴，虛弱的癥狀。此外，在民間驗(yàn)方中已知，熟地黃，當(dāng)其與豬肉湯一起施用時(shí)，對于便秘顯示治療作用。五加皮是屬于五加科的灌木，僅在北半球的亞洲遠(yuǎn)東發(fā)現(xiàn)。特別是，五加皮在韓國分類為受保護(hù)的野生植物，處于滅絕的邊緣。將五加皮分成朿U五力口(^(ca"^zop""acz'j1se"Wcas^)、五力口屬(/1(^"http://0/7""<3^)禾口韓國五力口G4ca",/2opa"ox^^am/w)。已經(jīng)將五加皮的根和皮用作頂級藥物，因?yàn)樗鼈兤裎达@示任何毒性或副作用。五加皮的葉含有具有藥理學(xué)效果的chiisanoside。五加皮的根不僅含有五加皮糖苷而且含有丁香苷和香豆素糖苷。五加皮含有作為五加皮糖苷的無梗五加苷B和D，以及增強(qiáng)免疫性的水溶性多糖。它的味道是苦和辣的，并且它具有加熱東西的性質(zhì)。已知除去肝和神經(jīng)系統(tǒng)中的痛風(fēng)，滋補(bǔ)身體并增長元?dú)?。其已?jīng)藥用于這樣的疾病諸如Oro(由五臟器官虛弱所引起的疲勞)、Chilsang(由身體虛弱所引起的男子中顯示的七種典型癥狀)和難以移動(dòng)腿。五加皮的長期給藥增加能量，保護(hù)胃，使精力充沛，凈化心靈，增加意志力，防止衰老，幫助具有輕松的心臟并且清潔身體中的血液。所以，五加皮已經(jīng)用于治療這樣的癥狀如脊椎疼痛、男性陽痿、陰囊濕疹、女性閉經(jīng)等。通過利用水、C廣C4醇或所述兩種的混合物提取本發(fā)明的三七、熟地黃和五加皮的草本植物混合物提取物，并且提取方法如下。用水清洗三七、熟地黃和五加皮并在陰暗處干燥。將它們放在提取器中，向其添加蒸餾水，接著是熱水提取。在室溫下冷卻混合物，接著用濾紙過濾。然后，通過利用真空旋轉(zhuǎn)式汽化器將提取物在減壓下濃縮，接著冷凍干燥，得到草本植物混合物粉末提取物。更確切地說，所述草本植物混合物由30-70重量份的三七、2060重量份的熟地黃和0.520重量份的五加皮組成，更優(yōu)選由4060重量份的三七，3050重量份的熟地黃和515重量份的五加皮組成，并且最優(yōu)選由50重量份的三七、40重量份的熟地黃和10重量份的五加皮組成。與各自的三七、熟地黃和五加皮的單獨(dú)提取物相比較，本發(fā)明的三種的草本植物混合物提取物對于炎性物質(zhì)諸如TNF-a和氧化氮(NO)的釋放比各自單獨(dú)的提取物具有28倍的優(yōu)異抑制作用。另外，與單一提取物在相同濃度治療時(shí)相比較，本發(fā)明的混合物提取物徹底抑制基質(zhì)破壞物質(zhì)例如軟骨破壞劑或者基質(zhì)金屬蛋白酶-13的合成。與各自的三七、熟地黃和五加皮的單一提取物治療時(shí)相比較，本發(fā)明的草本植物混合物提取物也顯著抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。因此，本發(fā)明的草本植物混合物提取物具有抑制炎性物質(zhì)諸如TNF-a或氧化氮合成，并且抑制動(dòng)物模型中的關(guān)節(jié)炎發(fā)展的優(yōu)異活性，認(rèn)為它可以有效用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎。將本發(fā)明的草本植物混合物經(jīng)口施用至小鼠以研究毒性。結(jié)果，評價(jià)其為安全物質(zhì)，因?yàn)樗墓烙?jì)LD5o值(50。/。的致死量)在小鼠中遠(yuǎn)大于5,000mg/kg。本發(fā)明還提供用于關(guān)節(jié)炎預(yù)防和治療的組合物，所述組合物含有以上提取物作為有效成分。除所述草本植物混合物提取物之外，本發(fā)明的組合物可以另外包括具有與本發(fā)明的提取物相同或類似功能的一種或多種有效成分。本發(fā)明的草本植物混合物提取物可以經(jīng)口或胃腸外施用并且以藥物劑型的一般形式使用。本發(fā)明的草本植物混合物提取物可以通過與通常使用的填充劑、補(bǔ)充劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、諸如表面活性劑的稀釋劑、或賦形劑而制備，用于口服或胃腸外給藥。口服用的固態(tài)劑型是片劑、丸劑、撲粉、顆粒劑和膠囊。通過混合一種或多種適合的賦形劑諸如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等制備這些固態(tài)劑型。除了簡單的賦形劑，可以使用潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石等。用于口服的液體劑型是混懸液、溶液、乳劑和糖漿劑，并且上述劑型除一般使用的簡單稀釋劑諸如水和液體石蠟之外還可以含有多種賦形劑諸如潤濕劑、甜味劑、芳香劑和防腐劑。用于腸胃外給藥的劑型是滅菌的水溶液，水不溶的賦形劑，混懸液，乳劑和栓劑。除一種或多種活性化合物之外，水不溶性賦形劑和混懸液可以含有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、可注射的酯如油酸乙酉旨(ethylolate)等。除所述一種或多種活性化合物之外，栓劑可以含有witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐溫61、可可脂(cacaobutter)、月桂精脂(laurinbutter)、甘油明膠等。另外，可以包括鈣或維生素D3以增強(qiáng)對關(guān)節(jié)炎的預(yù)防或治療作用。可以根據(jù)重量、年齡、性別、健康狀況、飲食、給藥頻率、給藥方法、排泄和疾病嚴(yán)重性確定所述組合物的有效劑量。所述組合物的劑量是每天0.1100mg/kg，并且優(yōu)選每天3086mg/kg。更優(yōu)選地，所述劑量是每天5060mg/kg。給藥頻率是一天1~6次。本發(fā)明的組合物可以單獨(dú)施用或連同外科手術(shù)、激素治療、化學(xué)治療和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑一起治療，以預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎。可以將本發(fā)明的組合物包括在為了改善關(guān)節(jié)炎的保健食品中。這時(shí)，根據(jù)常規(guī)方法，可以按照原樣或在與其它食品或組分混合以后添加本發(fā)明的草本植物混合物提取物。由使用目的(預(yù)防、保健或治療學(xué)治療)確定有效成分的混合比。然而，當(dāng)長期施用其以改善健康狀況時(shí)，所述提取物的含量可能小于上述，但是有效劑量可以含有超過以上的量，因?yàn)楸景l(fā)明的提取物是很安全的。在可應(yīng)用的食品中不存在限制，可以例舉肉類、香腸類、面包、巧克力、糖果、小吃、餅干、比薩餅、mmyim、面條、包括冰激凌的奶制產(chǎn)品、湯、飲料、茶、飲料、酒精飲料和維生素復(fù)合物等，并且事實(shí)上全部包括通常生產(chǎn)的每種保健食品。類似其它飲料，含有本發(fā)明組合物的保健飲料可以另外包括多種調(diào)味劑或天然糖類等。上面的天然糖類可以是單糖諸如葡萄糖和果糖，二糖諸如麥芽糖和蔗糖，多糖諸如糊精和環(huán)糊精，和糖醇諸如木糖醇、山梨糖醇和赤藻糖醇的一種。作為甜味劑，可以使用天然甜味劑諸如奇甜蛋白和甜菊(stevia)提取物或人造甜味劑諸如糖精和阿司帕坦。天然糖類對本發(fā)明組合物的比率優(yōu)選是0.01~0.04g比100ml，更優(yōu)選0.02~0.03g比100ml。除上述組分之外，本發(fā)明的組合物可以包括多種營養(yǎng)素、維生素類、電解質(zhì)類、增香劑、著色劑、果膠酸及其鹽、藻酸(arginicacid)及其鹽、有機(jī)酸、保護(hù)性膠體增粘劑、pH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、醇類、用于加入到碳酸水的碳酸化劑(carbonators)等。本發(fā)明的組合物還可以包括天然果汁、果汁飲料和/或可加入到蔬菜飲料的果肉。全部提到的組分可以單獨(dú)或一起添加。事實(shí)上那些組分的混合比無關(guān)緊要，但是通常，各自可以添加0.01~0.1重量份/100重量份本發(fā)明組合物。發(fā)明實(shí)施方式如下列實(shí)施例所示說明本發(fā)明的實(shí)際的和目前優(yōu)選的實(shí)施方案。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮本公開內(nèi)容上應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍之內(nèi)可以進(jìn)行修改和改進(jìn)。<實(shí)施例1>草本植物提取物的制備栽植的三七、熟地黃和五加皮是從批發(fā)干草藥店購買的。<1-1>三七提取物的制備用清水清洗三七并在陰暗處干燥。將100g的干燥三七放在3升的提取器中，向其添加l升的蒸餾水，接著在10(TC熱水提取4小時(shí)。將所述過程重復(fù)三次，并且將得到的溶液在室溫下冷卻，接著用濾紙過濾。通過利用真空旋轉(zhuǎn)式汽化器在4(TC下在減壓下濃縮提取的溶液，接著冷凍干燥。結(jié)果，獲得三七的粉末提取物(產(chǎn)率15%)。<1-2>熟地黃提取物的制備用清水清洗熟地黃并在陰暗處干燥。將100g的干燥熟地黃放在3升的提取器中，向其添加l升的蒸餾水，接著在10(TC熱水提取4小時(shí)。將所述過程重復(fù)三次，并且將得到的溶液在室溫下冷卻，接著用濾紙過濾。通過利用真空旋轉(zhuǎn)式汽化器在4(TC下在減壓下濃縮提取的溶液。結(jié)果，獲得熟地黃提取物(產(chǎn)率42%)。<1-3>五加皮提取物的制備將五加皮用清水洗滌并在陰暗處干燥。將IOOg的干燥五加皮放在3升的提取器中，向其添加l升的蒸餾水，接著在100。C熱水提取4小時(shí)。將所述過程重復(fù)三次，并且將得到的溶液在室溫下冷卻，接著用濾紙過濾。通過利用真空旋轉(zhuǎn)式汽化器在4(TC下在減壓下濃縮提取的溶液，接著冷凍干燥。結(jié)果，獲得五加皮的粉末提取物(產(chǎn)率10%)。<1-4>三七/熟地黃/五加皮的草本植物混合物提取物的制備將每種草藥用清水洗滌，并在陰暗處干燥。將50g三七磨碎，熟地黃(40g)和五加皮(10g)也是如此。將所述草藥放在3升提取器中，向其添加20倍的水，接著在95。C熱水提取8小時(shí)。將熱提取物在室溫下冷卻并過濾。通過利用真空旋轉(zhuǎn)式汽化器在4(TC下在減壓下濃縮得到的溶液，接著冷凍干燥。結(jié)果，獲得28.7g粉末草本植物混合物提取物。將粉末提取物溶解在120ml蒸餾水中以用于下列實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1:草本植物混合物提取物對于TNF-a釋放的抑制作用進(jìn)行下列試驗(yàn)以研究本發(fā)明的草本植物混合物提取物對于從作為人單核細(xì)胞系的THP-1細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子TNF-a的抑制作用。<1-1>細(xì)胞的選擇和培養(yǎng)為了評價(jià)本發(fā)明的草本植物混合物提取物對于TNF-a釋放的影響，從ATCC(USA)供應(yīng)人來源的細(xì)胞系THP-1(ATCC號(hào)TIB-202)。在37'C的C02培養(yǎng)箱中，將所述細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充有10。/。FBS(胎牛血清)和0.05mM的2-巰基乙醇的RPMI1640(Gibco，BRL,美國)培養(yǎng)基中?！磍-2〉釋放的TNF-a的定量為了研究本發(fā)明的草本植物混合物提取物對于TNF-a釋放的影響，利用實(shí)驗(yàn)實(shí)施例<1-1>中制備的細(xì)胞通過ELISA測量釋放的TKF-a的量。特別地，將所述細(xì)胞以5Xl()S細(xì)胞/孔分配到96-孔板中，并且添加脂多糖(LPS)以便激活細(xì)胞用于TNF-a的釋放。連同LPS，用以上制備的草本植物混合物提取物以不同濃度將實(shí)驗(yàn)組處理24小時(shí)。在處理以后，通過ELISA定量培養(yǎng)液中釋放的TNF-a。通過利用DynatechMR-7000(DynatechLaboratorieCo.)測量OD45()。將釋放的TNF-a的量計(jì)算為對于對照(僅用LPS處理)釋放的TNF-a的量的百分比。關(guān)于草本植物混合物提取物濃度的TNF-a釋放的抑制作用顯示圖1中。如圖1所示，用本發(fā)明草本植物混合物提取物以2mg/ml的濃度處理的細(xì)胞中釋放的TNF-a是10.6%，與三七、熟地黃和五加皮的各自提取物處理的細(xì)胞(分別是39.9%、38.1%和80.9%)相比較，其對于TKF-a的釋放的抑制作用高48倍。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2:草本植物混合物提取物對于NO產(chǎn)生的抑制作用在小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7中進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)以研究本發(fā)明的草本植物混合物提取物對于NO(—種炎癥介體)產(chǎn)生的抑制作用。<2-1>細(xì)胞的選擇和培養(yǎng)為了評價(jià)本發(fā)明的草本植物混合物提取物對于氧化氮產(chǎn)生的影響，小鼠來源的細(xì)胞系RAW264.7(ATCC號(hào)TIB-71)供應(yīng)自ATCC(美國)。在37。C的C02培養(yǎng)箱中，將細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充有10。/。FBS(胎牛血清)的DMEM(Gibco,BRL,USA)中。<2-2>NO產(chǎn)生的定量為了研究本發(fā)明的草本植物混合物提取物對于NO產(chǎn)生的影響，測量實(shí)驗(yàn)實(shí)施例〈-l〉中制備的細(xì)胞中產(chǎn)生的NO量。特別地，將所述細(xì)胞以5乂105細(xì)胞/孔分配到96-孔板中，并且添加脂多糖(LPS)以便激活細(xì)胞用于NO的釋放。用不同濃度的實(shí)施例1中制備的草本植物混合物提取物連同LPS將實(shí)驗(yàn)組處理12小時(shí)。在處理以后，通過格里斯反應(yīng)(Griessreaction)定量培養(yǎng)液中產(chǎn)生的NO。關(guān)于本發(fā)明草本植物混合物提取物濃度的NO產(chǎn)生的定量顯示在圖2中。'如圖2所示，與分別用三七、熟地黃、和五加皮的各自提取物處理的細(xì)胞中相比較，在用本發(fā)明草本植物混合物提取物處理的細(xì)胞中大大抑制了NO的產(chǎn)生。特別是，在草本植物混合物提取物濃度為6mg/ml時(shí)對NO產(chǎn)生的抑制作用大約比各自單獨(dú)的提取物的抑制作用高26倍。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3:草本植物混合物提取物對于MMP合成的抑制作用進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)以研究草本植物混合物提取物對于產(chǎn)生在人軟骨肉瘤細(xì)胞系SW1353中的基質(zhì)破壞因子基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)的影響。<3-1>細(xì)胞的選擇和培養(yǎng)為了評價(jià)本發(fā)明草本植物混合物提取物對于MMP-13合成的影響，從ATCC(US)供應(yīng)人來源的細(xì)胞系SW1353(ATCC號(hào)HTB-94)。在37。C的C02培養(yǎng)箱中，將細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充有10%FBS(胎牛血清)的DMEM(Gibco,BRL，USA)中。<3-2>MMP-13合成的定量為了研究本發(fā)明的草本植物混合物提取物對于MMP-13合成的影響，測量實(shí)驗(yàn)實(shí)施例<3-1>制備的細(xì)胞中MMP-13的表達(dá)。特別地，將所述細(xì)胞以5X105細(xì)胞/孔分布在96-孔板中。24小時(shí)后，將所述細(xì)胞用PBS(NaCl8g,KC10.2g,Na2HP041.44g，KH2P040.24g/U蒸餾水，pH7.4)清洗并在無FBS的DMEM中再次培養(yǎng)24小時(shí)。用實(shí)施例1中制備的草本植物混合物提取物將實(shí)驗(yàn)組處理一小時(shí)。然后，都用TNF-a處理實(shí)驗(yàn)組和對照組。24小時(shí)后，通過蛋白質(zhì)印跡測量兩種細(xì)胞培養(yǎng)溶液中的MMP-13的量。目卩，將所述細(xì)胞培養(yǎng)溶液放在SDS-聚酰胺凝膠上，接著電泳，并且然后通過利用半-干的印跡裝置(TRANS-BLOTSD系統(tǒng)，Biorad)將所述凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。用TBS-T(IOmM的Tris-緩沖鹽水，0.1%吐溫-20，pH7.2)清洗所述膜，將其在封閉溶液(3%脫脂乳)中保留一小時(shí)。一小時(shí)以后，將所述膜用TBS-T清洗兩次，將其與1:3，000~5，000稀釋的針對人MMP-13的單克隆抗體(Chemicon)反應(yīng)2小時(shí)。在所述反應(yīng)完成時(shí)，將所述膜用TBS-T清洗三次，并且與稀釋的辣根過氧化物酶綴合的山羊抗-小鼠IgG(Promega)反應(yīng)一小時(shí)。在那以后，將所述膜再清洗3~4次，接著用ECL(增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光)蛋白質(zhì)印跡分析系統(tǒng)(Amersham)證實(shí)。本發(fā)明的草本植物混合物提取物對于MMP-13表達(dá)的影響表示在圖3中。如圖3所示，將三七、熟地黃和五加皮的各自的單獨(dú)提取物和本發(fā)明三種的草本植物混合物提取物以相同濃度(每種6mg/ml)處理細(xì)胞。結(jié)果，與各自提取物單獨(dú)處理相比較，當(dāng)處理所述草本植物混合物提取物時(shí)，條帶顯著減少，表明本發(fā)明的草本植物混合物提取物具有對于MMP-13合成的優(yōu)異抑制作用。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4:用本發(fā)明草本植物混合物提取物進(jìn)行的急性毒性試驗(yàn)本發(fā)明的草本植物混合物提取物是安全的，因?yàn)橛糜诒景l(fā)明的草藥分類為食物原料。但是，對于作為治療藥物的用途，必須如下進(jìn)行提取物的急性毒性研究。將6-周齡的SPF小鼠用于急性毒性的測試。將本發(fā)明的草本植物混合物提取物懸浮在0.9%的NaCl中并且以2和5g/kg的劑量經(jīng)口一次施用至每一組的IO個(gè)小鼠。觀察小鼠中的死亡、臨床癥狀、和重量變化，進(jìn)行血液的血液學(xué)測試和生物化學(xué)測試，并且在尸體解剖期間用眼檢驗(yàn)胸部和腹部的胃腸器官中的任何失常跡象。結(jié)果顯示，本發(fā)明的草本植物混合物提取物在鼠中不引起任何特定的臨床癥狀、重量變化、或死亡。在血液的血液學(xué)測試、生物化學(xué)測試和尸體解剖中沒有觀察到變化。因此，將用于該實(shí)驗(yàn)的草本植物混合物提取物評價(jià)成是安全物質(zhì)，因?yàn)樗谛∈笾懈哌_(dá)5g/kg的水平而不引起任何毒性變化，并且它在小鼠中的估計(jì)LD5。值遠(yuǎn)大于5g/kg。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5:用本發(fā)明的草本植物混合物提取物抑制具有2型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的試驗(yàn)用動(dòng)物中的關(guān)節(jié)炎發(fā)展為了研究本發(fā)明的草本植物混合物提取物是否可以抑制具有2型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的試驗(yàn)用動(dòng)物中的關(guān)節(jié)炎發(fā)展，進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)。<5-1>試驗(yàn)用動(dòng)物中的關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)為了制備具有2型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的試驗(yàn)用動(dòng)物，從SCICo.,日本購買56周齡的雄性DBA1小鼠，并且將所述小鼠在2rC，40%濕度培養(yǎng)。將牛的2型膠原(CondrexCo.,日本)溶解在0.05%乙酸中，產(chǎn)生2mg/ml的濃度。然后將2型膠原與相同量的完全佐劑(CondrexCo.，日本)混合。當(dāng)用冰冷卻時(shí)，通過利用連接到3ml注射器的T-連接器，所述混合物變成均勻混懸液。在證實(shí)正確制備混懸液以后，將小鼠的尾根用酒精棉滅菌并將100^tl膠原混懸液注射在尾根的皮膚下。<5-2>本發(fā)明草本植物混合物提取物的口服將實(shí)施例1中制備的本發(fā)明草本植物混合物提取物溶解在水中，接著用0.25iiM的過濾器過濾。將濾過的溶液通過連接到1ml注射器的探頭施用至小鼠的口，一天一次并且以276mg/kg/天施用3周。<5-3>關(guān)節(jié)炎的發(fā)展肉眼觀察和診斷已經(jīng)知道，在膠原混懸液的首次注射以后大約30天形成關(guān)節(jié)炎。通過利用下列基于引用的參考文獻(xiàn)的分?jǐn)?shù)進(jìn)行關(guān)于關(guān)節(jié)炎損害的肉眼觀察。0:無腫脹或鑒別，1:關(guān)節(jié)中的輕微腫脹和肉眼可觀察到的變化(flair)，2:關(guān)節(jié)中清楚的腫脹和肉眼可觀察到的變化，3:包括肘關(guān)節(jié)(knucklejoint)的關(guān)節(jié)中的嚴(yán)重腫脹和肉眼可觀察到的變化，4:關(guān)節(jié)中到處嚴(yán)重腫脹。因此，每一小鼠的關(guān)節(jié)炎損害的最高分?jǐn)?shù)是16，其總計(jì)前腿和后腿的分?jǐn)?shù)，并且每條腿的最高分?jǐn)?shù)是4[CourtenayJ.S.,DallmanM.J.，DayanAD，等:ImmunizationagainstheterologoustypeIIcollageninducesarthritisinmice.胸廳283:666-668.1980]。<5-4>用本發(fā)明的草本植物混合物提取物抑制具有2型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的試驗(yàn)用動(dòng)物中的關(guān)節(jié)炎發(fā)展將本發(fā)明草本植物混合物提取物經(jīng)口施用至具有2型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的試驗(yàn)用動(dòng)物。并且對于關(guān)節(jié)炎發(fā)展的抑制作用顯示在圖4和表1中。如圖4和表1中說明，本發(fā)明的草本植物混合物提取物對于關(guān)節(jié)炎發(fā)展的抑制作用大于三七、熟地黃和五加皮的各自單獨(dú)提取物的抑制作用。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>用于本發(fā)明的組合物的劑型實(shí)施例描述在下文中。制劑實(shí)施例1:藥物制劑的制備<1-1>散劑的制備草本植物混合物提取物2g乳糖'lg通過混合全部以上組分而制備散劑并且用它們填充氣密袋。<1-2>片劑的制備草本植物混合物提取物100mg玉米淀粉100mg乳糖100mg硬脂酸鎂2mg通過用制備片劑的常規(guī)方法混合全部以上組分而制備片劑。<1-3>膠囊的制備草本植物混合物提取物100mg玉米淀粉100mg乳糖100mg硬脂酸鎂2mg根據(jù)用于膠囊的常規(guī)方法，通過混合以上組分而制備膠囊并用它們填充明膠膠囊。制劑實(shí)施例2:食品的制備含有本發(fā)明草本植物混合物提取物的食品制備如下。<2-1>面粉食品的制備通過將本發(fā)明的草本植物混合物提取物以0.55.0重量％添加到小麥粉，然后將所述面粉制成面包、蛋糕、餅干、薄脆餅干和面條而制備改善健康的面粉食品。<2-2>乳制品的制備將本發(fā)明的草本植物混合物提取物以5~10重量％添加到乳以制備改善健康的乳制品諸如黃油、冰淇淋等?！?3〉混合谷類(sereaD食品的制備通過常規(guī)方法將糙米、大麥、糯米和薏苡(coix)(job'stear)膠質(zhì)化，接著干燥。將干燥的混合物分散并磨碎，得到60-篩目尺寸的顆粒粉末。通過常規(guī)方法蒸煮并干燥黑豆、黑芝麻和紫蘇。將干燥的混合物分散并磨碎，得到60-篩目尺寸的顆粒粉末。利用真空濃縮器在減壓下將本發(fā)明的草本植物混合物提取物真空濃縮，然后將其用熱風(fēng)干燥器噴霧干燥。用研磨器將干燥物料磨碎，產(chǎn)生60-篩目尺寸的顆粒粉末。將制備的谷物、種子、和干燥的草本植物混合物提取物散劑全部以下列比率混合。谷物(糙米30重量％，薏苡15重量％，大麥20重量％)，種子(紫蘇7重量％，黑豆8重量％，黑芝麻7重量％)，草本植物混合物提取物的干燥粉末(3重量％)，靈芝(Ganodermalucidum)(0.5重量%)，地黃(ie/z膨"w'ag/w">7asa)(0'5重量%)制劑實(shí)施例3:飲料的制備<3-1>充碳酸氣飲料的制備將糖(5~10%)，檸檬酸(0.050.3%)，焦糖(0.005~0.02%)和維生素C(0.1l。/cO混合，向其添加純化水(7994%)以制造糖漿。將制備的糖漿在85~98°。滅菌20180秒，然后用冷卻水以1:4的比率混合。然后，將二氧化碳?xì)?0.50.82%)提供給所述混合物以制備含有本發(fā)明草本植物混合物提取物的充碳酸氣飲料。<3-2>保健飲料的制備將酸性果糖(0.5%)，寡糖(2%)，糖(2%)，鹽(0,5%)和水(75%)與所述草本植物混合物提取物全部均勻混合，接著滅菌。將所述混合物放在小容器諸如玻璃瓶或小瓶(patbottle)中，產(chǎn)生保健飲料。<3-3>蔬菜汁的制備將5g本發(fā)明的草本植物混合物提取物添加到l，OOOml的番茄或胡蘿卜汁以制備保健蔬菜汁。<3-4〉果汁的制備將1g本發(fā)明的草本植物混合物提取物添加到1,000ml的蘋果或葡萄汁以產(chǎn)生保健果汁。工業(yè)實(shí)用性如上所說明，與各自的單獨(dú)提取物相比較，本發(fā)明的三七、熟地黃和五加皮的草本植物混合物提取物具有抑制炎性物質(zhì)釋放和抑制基質(zhì)破壞物質(zhì)(MMP-13)合成的優(yōu)異活性，所述炎性物質(zhì)是關(guān)節(jié)炎關(guān)鍵原因之一，所述基質(zhì)破壞物質(zhì)是軟骨破壞因子。而且，對動(dòng)物模型中的關(guān)節(jié)炎發(fā)展的抑制在本發(fā)明的草本植物混合物提取物施用時(shí)比分別施用各自的單一提取物時(shí)更大。因此，可以有效使用三七、熟地黃和五加皮的草本植物混合物提取物，不僅用于關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療，而且用于改善健康狀況。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以將上述說明中公開的概念和具體實(shí)施方案容易地用作修改或設(shè)計(jì)其它用于實(shí)施本發(fā)明相同用途的實(shí)施方案的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將理解，這樣的等效實(shí)施方案不背離如后附權(quán)利要求中陳述的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。權(quán)利要求1.一種三七(Notoginsengradix)、熟地黃(Rehmanniaeradixpreparata)和五加皮(Acanthopanaciscortex)的草本植物混合物提取物。2.如權(quán)利要求l中所述的草本植物混合物提取物，所述草本植物混合物提取物由3070重量份的三七、20~60重量份的熟地黃和0.520重量份的五加皮組成。3.如權(quán)利要求2中所述的草本植物混合物提取物，所述草本植物混合物提取物由4060重量份的三七、3050重量份的熟地黃和5~15重量份的五加皮組成。4.如權(quán)利要求3中所述的草本植物混合物提取物，所述草本植物混合物提取物由50重量份的三七、40重量份的熟地黃和10重量份的五加皮組成。.5.如權(quán)利要求1中所述的草本植物混合物提取物，其中用水、C廣Q醇或它們的混合物提取所述提取物。6.—種用于關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療的組合物，所述組合物含有權(quán)利要求1至權(quán)利要求4任何一項(xiàng)作為有效成分。7.如權(quán)利要求6中所述的用于關(guān)節(jié)炎預(yù)防和治療的組合物，其中所述關(guān)節(jié)炎是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。8.如權(quán)利要求6中所述的用于關(guān)節(jié)炎預(yù)防和治療的組合物，其中所述關(guān)節(jié)炎是變性關(guān)節(jié)炎。9.一種用于抑制TNF-a釋放的組合物，所述組合物含有權(quán)利要求1至權(quán)利要求4的任何一項(xiàng)作為有效成分。10.—種用于抑制氧化氮(NO)產(chǎn)生的組合物，所述組合物含有權(quán)利要求1至權(quán)利要求4任何一項(xiàng)作為有效成分。11.一種用于抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)合成的組合物，所述組合物含有權(quán)利要求1至權(quán)利要求4任何一項(xiàng)作為有效成分。全文摘要本發(fā)明涉及三七、熟地黃和五加皮的草本植物混合物提取物，并且涉及包含其作為有效成分的用于關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療的組合物。本發(fā)明的草本植物混合物提取物可以有效用于關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療，因?yàn)樗种蒲仔晕镔|(zhì)的釋放和軟骨破壞物質(zhì)的合成以及關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。文檔編號(hào)A61K36/804GK101119738SQ200680004856公開日2008年2月6日申請日期2006年1月18日優(yōu)先權(quán)日2005年1月20日發(fā)明者張純花,白東憲,金世源,金正根,金炯建,高鮮一申請人:奧斯考泰克公司