專利名稱：用于治療或預(yù)防涉及肥胖、糖尿病、代謝綜合癥、神經(jīng)變性疾病和線粒體功能障礙疾病的 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防涉及肥胖、糖尿病、代謝綜合癥、變性疾病和與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病的多種疾病的藥物組合物。

背景技術(shù)：
肥胖癥，一種其中體脂肪的量比標準體重不正常更高的狀況，指當攝取的熱量比消耗的熱量更大時，由過剩的熱量在身體的脂肪組織中蓄積導(dǎo)致的疾病。由肥胖癥引起的并發(fā)癥包括，例如高血壓、心肌梗塞、靜脈曲張病、肺栓塞、冠心病、大腦出血、老年性癡呆、帕金森病、2型糖尿病、高脂血癥、大腦卒中、多種癌癥(例如子宮癌、乳癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等)、心臟病、膽囊病、睡眠呼吸暫停綜合癥、關(guān)節(jié)炎、不育癥、靜脈曲張性潰瘍、猝死、脂肪肝、肥大性心肌病(HCM)、血栓栓塞、食管炎、腹壁疝氣(膀胱疝)、尿失禁、心血管病、內(nèi)分泌病等(Obesity Research第12卷(8)，2004，1197-1211)。
糖尿病是由多種環(huán)境和遺傳因素導(dǎo)致的全身性代謝紊亂，并涉及特征為由在體內(nèi)的胰島素的絕對或相對缺乏導(dǎo)致的不正常升高的血糖水平的狀況。糖尿病的并發(fā)癥包括，例如低血糖癥、酮酸中毒、高滲性昏迷、糖尿病大血管并發(fā)癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性神經(jīng)病、糖尿病性腎病等。
代謝綜合癥涉及伴隨健康危險因素的綜合癥，例如高甘油三酯血、高血壓、糖代謝病、血液凝固障礙和肥胖癥。根據(jù)2001年發(fā)表的NationalCholesterol Education Program(NCEP)的ATP III標準，個體由表現(xiàn)出3個或更多個如下狀態(tài)而被診斷為患有代謝綜合癥1)腰圍對于男性為40英寸(102cm)或更大和對于女性為35英寸(88cm)或更大(由腰圍測定的中心性肥胖)，2)甘油三酸酯水平高于150mg/dl，3)高密度脂蛋白水平(HDL)低于40mg/dl(男性)或低于50mg/dl(女性)，4)血壓為130/85mmHg或更高，和5)空腹血糖水平大于110mg/dl。
胰島素耐性涉及其中即使胰島素在體內(nèi)正常分泌，由胰島素進行的“將葡萄糖提供到細胞中”仍不正常的現(xiàn)象。因此，血液中的葡萄糖不能進入細胞，從而導(dǎo)致高血糖癥，和進一步地，細胞自身由于缺乏葡萄糖而不能起到其正常功能，這導(dǎo)致表現(xiàn)出代謝綜合癥。
變性疾病為源于病理檢查所見的術(shù)語，因此指伴隨“氧消耗降低”的狀況，并涉及其中作為在細胞中利用氧產(chǎn)生能量的細胞器的線粒體的功能障礙涉及衰老的變性疾病。作為所述變性疾病的例子，可以提及神經(jīng)變性疾病，例如阿茲海默病、帕金森病和亨廷頓病(KoreanSociety of Medical Biochemistry and Molecular Biology News，2004，11(2)，16-22)。
由線粒體功能障礙引起的疾病可包括例如由于線粒體膜電勢機能障礙導(dǎo)致的線粒體腫脹，由氧化應(yīng)激，例如通過活性氧物質(zhì)或自由基的作用導(dǎo)致的功能紊亂，由遺傳因素導(dǎo)致的功能紊亂，和由用于線粒體能量產(chǎn)生的氧化磷酸化機制的功能缺乏導(dǎo)致的疾病。由上述病理原因發(fā)展而來的疾病的明確例子，可包括多發(fā)性硬化、腦脊髓炎、大腦脊神經(jīng)根炎、周圍神經(jīng)病、雷爾氏綜合癥、弗里德利希共濟失調(diào)、阿爾珀斯氏綜合征、MELAS、偏頭痛、精神病、抑郁癥、癲癇和癡呆、麻痹發(fā)作(paralytic episode)、視神經(jīng)萎縮、視神經(jīng)病變、色素性視網(wǎng)膜炎、白內(nèi)障、高醛固酮血癥、甲狀旁腺機能減退、肌病、肌萎縮、肌紅蛋白尿、張力減退、肌痛、運動耐量降低、腎小管病變、腎衰竭、肝臟衰竭、肝功能衰竭、肝腫大、紅細胞性貧血(缺鐵性貧血)、中性白細胞減少癥、血小板減少癥、腹瀉、腸道絨毛萎縮、多次嘔吐、吞咽困難、便秘、神經(jīng)性聽力損失(SNHL)、癲癇癥、精神發(fā)育遲緩、阿茲海默病、帕金森病和亨廷頓病(參見，例如美國專利6,183,948，韓國公開申請2004-7005109，Journal of clinical investigation 111，303-312，2003，Mitochondria 74，1188-1199，2003，Biochimica etBiophysica acta 1658(2004)80-88)。
上述肥胖癥、糖尿病、代謝綜合癥、變性疾病和與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病在下文中總稱為“疾病綜合癥”。
最近，改善或?qū)古c這些疾病綜合癥相關(guān)的狀況的最有效的途徑已知為進行更多的鍛煉和減輕體重，以及飲食控制。對抗所述疾病綜合癥的所有當前有效的途徑一般具有如下事實，它們促進能量代謝，因此導(dǎo)致最大程度地消耗在體內(nèi)的過剩能量，這導(dǎo)致防止能量蓄積。這些過剩能量的有效消耗被認為是用于治療所述疾病綜合癥的方法。促進能量代謝對于過剩能量的有效消耗是最重要的。為了這個目的，重要的是獲得抑制脂肪生成、抑制糖異生、促進葡萄糖消耗、促進脂肪氧化、促進作為能量代謝的重要裝置的線粒體的生物合成和總體激活涉及代謝活性的因素。
現(xiàn)在幾乎還不知道關(guān)于治療所述疾病綜合癥的靶點，而多種靶點蛋白或基因已知僅用于治療單獨疾病，并且因此有人提出一些通過使用上述相對應(yīng)的靶點蛋白或基因而用于預(yù)防或治療這些疾病的方法。然而，仍存在進一步顯著改進的空間，甚至在治療單獨疾病方面，例如包括肥胖癥、糖尿病等的代謝綜合癥方面。盡管關(guān)于疾病的治療已經(jīng)進行了大量的研究，但仍沒有可用于治療由攝取過多能量和衰老導(dǎo)致的多種疾病。
包括肥胖癥、糖尿病、代謝綜合癥、變性疾病和與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病的大部分疾病，即，包括疾病綜合癥的大量疾病起源于能量代謝和氧化還原態(tài)的不平衡。為此，本發(fā)明已經(jīng)采用確定對AMP活化的蛋白激酶(AMPK)是否存在活化作用的方法作為最基礎(chǔ)的主要試驗以確定目標化合物對疾病綜合癥的生物學(xué)功效。
其間，一旦AMPK被激活，多種生理學(xué)事件因此在其機制的下游中受到影響。關(guān)于這一點，待被調(diào)節(jié)的因素和表達現(xiàn)象提供如下。
1.糖代謝 在肌肉組織和心肌組織中，AMPK促進肌肉收縮并從而促進葡萄糖的吸收。即，AMPK活化了GLUT 1，或者促使GLUT 4遷移到質(zhì)膜上，無論胰島素的影響，這導(dǎo)致攝取到細胞中的葡萄糖增加(Arch.Biochem.Biophys.380，347-352，2000，J.Appl.Physiol.91，1073-1083，2001)。在增加攝取到細胞中的葡萄糖后，AMPK活化了己糖激酶，從而增加了糖代謝過程的通量并同時抑制了糖原的合成。已知在心肌組織中在缺血狀況下，AMPK活化了6-磷酸果糖-2-激酶(PFK-2)的磷酸化過程，結(jié)果活化了導(dǎo)致增加糖代謝通量的代謝級聯(lián)(Curr.Biol.10，1247-1255，2000)。另外，據(jù)證實，在肝臟中AMPK的活化抑制了葡萄糖從肝細胞中的釋放，并且AMPK抑制了作為糖異生酶的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶的活性(Diabetes 49，896-903，2000)。這是因為AMPK通過抑制葡萄糖從肝臟的釋放而獨立地參與血糖水平的調(diào)節(jié)，而與胰島素無關(guān)。
2.線粒體的生物合成 線粒體的一個重要的功能是進行氧化磷酸化過程，其將由養(yǎng)料代謝物，例如葡萄糖和脂肪酸產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)化成ATP。已知在線粒體功能中的紊亂的發(fā)生率涉及多種變性疾病的致病機制，所述變性疾病關(guān)聯(lián)于衰老，例如糖尿病、心血管病、帕金森病和老年性癡呆(Curr.Opin.Cell Biol.15，706-716，2003)。Peterson等人(Science 300，1140-1142，2003)已經(jīng)提出惡化的線粒體功能作為胰島素抗性綜合癥的可能致病原因的可能性，報道稱線粒體的氧化磷酸化功能在中老年中減弱了約40％。Lee等人(Diabetes Res.Clin.Pract.42，161-167，1998)已經(jīng)確證在周圍血中線粒體DNA含量的降低是從糖尿病發(fā)生前被引發(fā)的。在肌肉中的線粒體的生物合成已知通過適合的反應(yīng)被促進，在所述適合的反應(yīng)中，肌肉細胞的氧化磷酸化的代謝活性通過慢性能量消耗和運動增加。Zong等人(Proc Natl.Acad.Sci.USA 9915983-15987，2002)已經(jīng)公開了利用其中AMPK被遺傳性滅活的轉(zhuǎn)基因小鼠，在骨骼肌中在其中誘導(dǎo)慢性能量喪失的狀況下，線粒體的生物合成需要AMPK。另外，Putman等人(J.Physiol.551，169-178，2003)已經(jīng)證明了如下假說與連續(xù)運動相關(guān)的AMPK涉及線粒體體積的增加。
其間，據(jù)證實，AMPK增加了已知在線粒體的生物合成中起重要作用的過氧化酶活化增生受體γ共活化劑1α(PGC-1α)的基因表達(Endocr.Rev.24，78-90，2003)。Raynald等人(Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.281，1340，2001)已經(jīng)提出核呼吸因子-1(NRF-1)，其為對于與線粒體呼吸系統(tǒng)以及線粒體轉(zhuǎn)錄和復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄必須的基因，它起到了響應(yīng)于慢性能量應(yīng)激(chronic energy stress)的在肌肉細胞中增加氧化能力的重要作用。因此，NRF-1從而參與線粒體生物合成的增加。另外，已知被認為是與增加量的UCP-3蛋白和其mRNA和增加的線粒體體積一起被增加的檸檬酸合酶和3-羥基?；?CoA脫氫酶的酶活性通過AMPK的活化而增加(J.Physiol.551，169-178，2003)。
3.脂肪代謝調(diào)節(jié)和AMPK 當回顧AMPK參與脂肪代謝的機制時，AMPK誘導(dǎo)了乙酰-CoA羧化酶的磷酸化，從而導(dǎo)致對脂肪酸合成的抑制。因此，已知AMPK通過減少作為脂肪酸合成的中間體的和肉堿棕櫚酰-CoA轉(zhuǎn)移酶I(CPT I)的抑制劑的丙二酰-CoA的細胞內(nèi)濃度促進了脂肪酸的氧化。CPT I是對于其中脂肪酸進入線粒體和被氧化的脂肪酸氧化過程必須的酶，并已知受丙二酰-CoA的控制。另外，AMPK已知通過磷酸化抑制涉及膽固醇和甘油三酯的合成的HMG-CoA還原酶和甘油磷酸酯?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)的活性(J.Biol.Chem.277，32571-32577，2002，J.Appl.Physiol.92，2475-2482，2002)。
其間，據(jù)發(fā)現(xiàn)，在肝臟中AMPK的活化通過碳水化合物應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)的磷酸化抑制了丙酮酸激酶、脂肪酸合酶和ACC的活性(J.Biol.Chem.277，3829-3835，2002)。另外，在脂細胞的分化中起重要作用的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(SREBP-1)的活性也被AMPK的作用抑制，這隨后導(dǎo)致脂細胞分化的抑制。
4.蛋白合成調(diào)節(jié)和AMPK 在蛋白合成過程中，AMPK通過活化TSC經(jīng)過mTOR和p70S6K的抑制而抑制了蛋白合成，或者AMPK經(jīng)過延伸因子-2(eEF2)激酶的活化和eEF2通過其磷酸化的失活抑制了翻譯延伸。據(jù)發(fā)現(xiàn)eEF2激酶是AMPK的直接底物(J.Biol.Chem.278，41970-41976，2003)。
如上所討論的，AMPK已知在葡萄糖、蛋白質(zhì)和脂肪在體外和體內(nèi)的能量代謝中起到重要作用。Neil等人(Nature drug discovery，3(四月)，340，2004)已經(jīng)宣稱AMPK和丙二酰-CoA是用于治療代謝綜合癥的可能靶點，并且它們還已經(jīng)陳述了患有代謝綜合癥的患者的特點是胰島素抗性、肥胖、高血壓、血脂異常和胰腺β細胞的功能障礙，II型糖尿病和動脈硬化的表現(xiàn)。據(jù)假定，連接這些多重異常的共同特征為AMPK/丙二酰-CoA能量水平敏感和信號網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)。有人提出這種失調(diào)導(dǎo)致在細胞的脂肪酸代謝中的改變，這隨后又導(dǎo)致不正常的脂肪蓄積、細胞的功能障礙和最終的疾病。還有人提出證據(jù)，活化AMPK和/或降低丙二酰-CoA的水平的因素可能反轉(zhuǎn)這些異常和綜合癥或防止這些疾病的發(fā)生。
Roger等人(Cell，117，145-151，2004)已經(jīng)提出AMPK可能是通過降低下丘腦的AMPK的活性、從而增加丙二酰-CoA的含量和然后調(diào)節(jié)食物攝取的食欲而控制肥胖癥的可能靶點。
Lee等人(Nature medicine，13(六月)，2004)已經(jīng)提出α-硫辛酸可通過抑制下丘腦的AMPK活性從而控制食欲而發(fā)揮抗肥胖癥的作用。它們還報道了α-硫辛酸通過活化在肌肉組織中而不是下丘腦中的AMPK而促進了脂肪代謝，并且α-硫辛酸由于其通過活化特別是在脂細胞中的UCP-1而促進能量消耗，所以對于治療肥胖癥是治療有效的。
Diraison等人(Diabetes 53，S84-91，2004)已經(jīng)報道活化在胰腺細胞中的AMPK導(dǎo)致對食欲控制起作用的胃腸激素蛋白YY的表達增長4倍，并從而可通過在不是下丘腦的其它組織中的AMPK的作用調(diào)節(jié)食欲。
Nandakumar等人(Progress in lipid research 42，238-256，2003)已經(jīng)提出在缺血性心臟病中，AMPK將是通過脂肪和葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)治療缺血性再灌注損傷的靶點。
Min等人(Am.J.Physiol.Gastrointest Liver Physiol 287，G1-6，2004)已經(jīng)報道了AMPK對于調(diào)節(jié)酒精性脂肪肝是有效的。
Genevieve等人(J.Biol.Chem.279，20767-74，2004)已經(jīng)報道AMPK的活化抑制了iNOS酶的活性，所述iNOS酶為在慢性炎性狀況或內(nèi)毒素休克，包括與肥胖癥相關(guān)的糖尿病中的炎性介質(zhì)，并且因此AMPK將對開發(fā)具有能夠增強胰島素敏感性的機制的新藥是有效的。另外，它們已經(jīng)報道了iNOS活性的抑制通過活化AMPK而進行，并且因此該發(fā)現(xiàn)在臨床上可應(yīng)用于例如敗血病、多發(fā)性硬化、心肌梗塞、炎性腸疾病和胰腺β細胞功能障礙的疾病。
Zing-ping等人(FEBS Letters 443，285-289，1999)已經(jīng)報道了在鼠肌肉細胞和心肌細胞中的Ca-鈣調(diào)蛋白的存在下，AMPK通過磷酸化活化了內(nèi)皮NO合酶。這說明AMPK涉及包括心絞痛的心臟病中。
Javier等人(Genes & Develop.2004)已經(jīng)報道了通過限制能量的利用可延長壽命，并且這種延長的壽命以如下方式獲得將在體內(nèi)AMP/ATP的比例增加，并且因此AMPK的α2亞單元被AMP活化。因此，它們已經(jīng)提出AMPK可起到檢測壽命延長和能量水平和胰島素樣信號信息之間的關(guān)系的感受器的功能。
其間，丹參(Salvia miltiorrhiza)自遠古時代就已經(jīng)在東北亞地區(qū)被廣泛用作重要的草藥，并公知具有對預(yù)防和治療多種心血管疾病的優(yōu)異作用。當本發(fā)明的發(fā)明人將注意集中到丹參的這種治療功效時，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)提出丹參的主要成分是能夠治療多種疾病極好的醫(yī)藥物質(zhì)，所述疾病例如肥胖癥、糖尿病和代謝綜合癥。例如參見受讓給本申請人的韓國專利2003-0099556、2003-0099557、2003-0099657、2003-0099658、2004-0036195、2004-0036197和2004-0050200。特別地，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)揭示了丹參的主要成分可治療代謝綜合癥疾病，所述成分包括隱丹參酮、15，16-二氫丹參酮、丹參酮II-A、和丹參酮I。

隱丹參酮 二氫丹參酮 丹參酮II-A 丹參酮I

發(fā)明內(nèi)容
作為多方面廣泛和深入的研究和基于上述事實的實驗的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人最近證實基于萘醌的化合物，例如β-拉帕科恩(β-lapachone){7，8-二氫-2，2-二甲基-2H-萘并(2，3-b)二氫吡喃-7，8-二酮}，董尼酮{2，3，3-三甲基-2，3，4，5-四氫-萘并(2，3-b)二氫呋喃-6，7-二酮}，α-董尼酮{2，3，3-三甲基-2，3，4，5-四氫-萘并(2，3-b)二氫呋喃-6，7-二酮}，nocardinone A，nocardinone B，lantalucratin A，lantalucratin B和lantalucratin C，也可用于預(yù)防或治療例如肥胖癥、糖尿病、代謝綜合癥、變性疾病和與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病的多種疾病。
β-拉帕科恩是源自黃鐘花醌(一種萘醌)的天然存在的植物產(chǎn)品，所述黃鐘花醌得自南美出產(chǎn)的拉帕樹(lapacho tree)(Tabebuiaavellanedae)。董尼酮和α-董尼酮同樣得自南美出產(chǎn)的Streptocarpusdunnii的葉子。因為在遠古時代在南美，這些天然三環(huán)萘醌衍生物就已經(jīng)廣泛被作為抗癌藥，并用于治療在南美典型地方性的查格斯病，并且還已知發(fā)揮優(yōu)異的治療效果。特別地，因為它們作為抗癌藥物的藥理作用為西方國家所公知，這些三環(huán)萘醌衍生物后來吸引了人們相當大的關(guān)注。事實上，如在美國專利5,969,163中所公開的，這些三環(huán)萘醌衍生物化合物目前被許多研究組和研究所開發(fā)為多種抗癌藥物。

β·β-蘭帕科恩 董尼酮 α-董尼酮nocardinone B 然而，盡管經(jīng)過多方面的調(diào)查和研究，仍存在未知的事實，即這些萘醌化合物具有用于治療或預(yù)防肥胖癥、糖尿病、代謝綜合癥、變性疾病和與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病的治療功效。
基于如下事實，即上述萘醌化合物，例如β-拉帕科恩、董尼酮、α-董尼酮、nocardinone A、nocardinone B、lantalucratin A、lantalucratin B和lantalucratin C具有類似于從丹參中提取的丹參酮衍生物的結(jié)構(gòu)的化學(xué)基礎(chǔ)機構(gòu)，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)研究了它們作為代謝綜合癥用治療和預(yù)防劑的藥理作用。就是說，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)嘗試檢驗在本發(fā)明中公開的萘醌化合物是否活化在細胞和組織中的AMPK。然后，基于如此獲得的結(jié)果，為了深入檢驗所述化合物用于“疾病綜合癥”，包括肥胖癥、糖尿病、代謝綜合癥、變性疾病和與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病的治療效果，本發(fā)明的發(fā)明人利用ob/ob小鼠，一種通過降低瘦素的分泌導(dǎo)致的肥胖癥的動物模型，通過多種實驗已經(jīng)檢驗了對于治療和/或預(yù)防疾病綜合癥，包括肥胖癥、糖尿病和代謝綜合癥的治療效果。因此，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)證實，根據(jù)本發(fā)明的萘醌化合物具有對治療和/或預(yù)防疾病綜合癥的優(yōu)異作用。本發(fā)明基于這些發(fā)現(xiàn)而完成。
因此，本發(fā)明的目的是提供藥物組合物，該藥物組合物包含作為活性成分的萘醌化合物，其對于治療和預(yù)防疾病綜合癥，例如肥胖癥、糖尿病、代謝綜合癥、變性疾病和與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病是治療有效的


本發(fā)明的上述和其它目的、特點和其它優(yōu)點將從如下結(jié)合附圖的詳細說明中更清楚地理解，其中 圖1至3為說明根據(jù)用本發(fā)明的藥物組合物給藥的C57BL/6JL Lepob/Lep ob小鼠的每個器官的數(shù)值的脂肪分布的圖； 圖4為說明β-拉帕科恩調(diào)節(jié)對細胞中AMPK和ACC的磷酸化的作用的照片； 圖5為說明β-拉帕科恩對內(nèi)皮源性一氧化氮合酶(eNOS)的磷酸化的作用的照片； 圖6A至6C為說明β-拉帕科恩對在C57BL/6小鼠中AMPK的活化的作用的圖； 圖7為說明β-拉帕科恩對在C57BL/6小鼠中AMPK & ACC的磷酸化的作用的照片； 圖8A至8F為說明β-拉帕科恩對涉及C57BL/6小鼠的類脂物代謝作用的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄表達的作用的圖； 圖9A至9C為說明β-拉帕科恩對涉及C57BL/6小鼠的葡萄糖代謝作用的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄表達的作用的圖； 圖10A至10E為說明β-拉帕科恩對涉及C57BL/6小鼠的線粒體生物合成的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄表達的作用的圖； 圖11A至11F為說明β-拉帕科恩對涉及C57BL/6小鼠的能量代謝作用的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄表達的作用的圖； 圖12A至12F為說明β-拉帕科恩對在C57BL/6小鼠中與SIRT相關(guān)的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄表達的作用的圖； 圖13為說明β-拉帕科恩對在C57BL/6小鼠中UCP1和UCP2基因的轉(zhuǎn)錄表達的作用的圖； 圖14A和14B為說明在DIO C57BL/6小鼠中給藥β-拉帕科恩后，體重和飲食關(guān)于時間的變化的圖； 圖15為在對DIO C57BL/6小鼠給藥β-拉帕科恩后，在治療組和對照組之間，在多種器官中重量變化的比較圖； 圖16A至16C為說明在對DIO C57BL/6小鼠給藥β-拉帕科恩后，動物的整個剖腹的狀態(tài)，和在肝組織中在脂肪蓄積上的油紅O染色和EM檢測的照片； 圖17為說明在對DIO C57BL/6小鼠給藥β-拉帕科恩后，在生殖腺脂肪組織中的脂細胞大小的比較結(jié)果的照片； 圖18為說明在對DIO C57BL/6小鼠給藥β-拉帕科恩后，血脂、葡萄糖和激素的濃度關(guān)于時間的變化的圖； 圖19為說明在對DIO C57BL/6小鼠給藥β-拉帕科恩后，褐色脂肪組織的H&E染色的比較結(jié)果的圖； 圖20為說明在對DIO C57BL/6小鼠給藥β-拉帕科恩后，褐色脂肪組織的EM檢驗的比較結(jié)果的圖； 圖21A至21E為說明在對瘦素受體缺乏(ob/ob)的小鼠給藥β-拉帕科恩后，攝取飲食/g體重、體重和脂肪的蓄積量、和組織的EM檢驗結(jié)果的變化的圖和照片； 圖22為說明在對DIO C57BL/6小鼠給藥β-拉帕科恩后，β-拉帕科恩對自發(fā)性活動力的作用的圖； 圖23為說明在對DIO C57BL/6小鼠給藥β-拉帕科恩后，β-拉帕科 恩對體能持力增強作用的作用的圖； 圖24為說明在對DIO C57BL/6小鼠給藥β-拉帕科恩后，β-拉帕科恩對呼吸商(RQ)的作用的圖；
具體實施例方式 根據(jù)本發(fā)明的方面，上述的和其它的目的可通過提供用于治療和/或預(yù)防疾病綜合癥的藥物組合物完成，所述疾病綜合癥例如為肥胖癥、糖尿病、代謝綜合癥、變性疾病和與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病，所述藥物組合物包含(a)治療有效量的由下式I表示的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、前藥、溶劑合物或異構(gòu)體
其中 R1和R2各自獨立地為氫、鹵素、烷氧基、羥基或具有1至6個碳原子的低級烷基； R3、R4、R5、R6、R7和R8各自獨立地為氫、羥基、C1-C20烷基、烯或烷氧基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基，或者R3至R8中的兩個取代基可以連接在一起形成可以是飽和或者部分或完全不飽和的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；和 n為0或1，附加條件是當n為0時，與n鄰近的碳原子通過直接的鍵形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；和 (b)藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，或其任何組合。
為了證實式I化合物對疾病綜合癥的治療和預(yù)防作用，本發(fā)明的發(fā)明人，如將在下文中實驗例中說明的那樣，測量了式I化合物對在成肌細胞(C2C12)中AMPK的活性，和在前脂細胞(3T3-L1和F442A細胞)中的細胞分化的抑制作用，結(jié)果證實了這樣的化合物顯示出優(yōu)異的AMPK活化作用和脂細胞分化的抑制作用。
另外，本發(fā)明的發(fā)明人進一步證實，式I化合物對疾病綜合癥的治療和預(yù)防作用通過利用肥胖癥模型的ob/ob小鼠、肥胖癥/糖尿病模型的db/db小鼠、由高脂肪飲食條件導(dǎo)致的DIO(飲食誘導(dǎo)的肥胖癥)小鼠、和肥胖癥/糖尿病模型的Zucker fa/fa大鼠的體內(nèi)實驗進行檢驗，結(jié)果式I化合物是高度治療有效的。
因此，預(yù)計包含作為活性成分的式I化合物的本發(fā)明的藥物組合物，通過AMPK的活化可治療和預(yù)防多種如在本發(fā)明中定義的疾病綜合癥。
如在本文中所用的，術(shù)語“藥學(xué)可接受的鹽”指化合物的制劑，其對被給藥的生物體不產(chǎn)生顯著刺激并且不喪失所述的化合物的生物活性和性質(zhì)。所述藥學(xué)可接受的鹽的例子包括化合物(I)與可形成無毒的含有藥學(xué)可接受的陰離子的酸加成鹽的酸形成的酸加成鹽，所述酸例如為無機酸，例如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、氫溴酸和氫碘酸；有機碳酸，例如酒石酸、甲酸、檸檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡糖酸、苯甲酸、乳酸、富馬酸、馬來酸和水楊酸；或磺酸，例如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸和對甲苯磺酸。明確地，藥學(xué)可接受的羧酸鹽的例子包括與堿金屬和堿土金屬，例如鋰、鈉、鉀、鈣和鎂形成的鹽，與氨基酸，例如精氨酸、賴氨酸和胍形成的鹽，與有機堿，例如二環(huán)己基胺、N-甲基-D-葡糖胺、三(羥甲基)甲胺、二乙醇胺、膽堿和三乙胺形成的鹽。根據(jù)本發(fā)明的式I化合物可通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法轉(zhuǎn)化成其鹽。
如本文中所用的，術(shù)語“前藥”指在體內(nèi)可被轉(zhuǎn)化為母體藥物的試劑。前藥經(jīng)常是有用的，因為在一些情況下，它們可能比所述母體藥物更易于給藥。例如它們可能是通過口服給藥而生物可利用的，然而所述母體藥物可能不是。所述前藥還可能具有超過所述母體藥物的在藥物組合物中的溶解度。前藥的非限制性例子為作為酯(所述“前藥”)被給藥以促進轉(zhuǎn)運穿過細胞膜的本發(fā)明的化合物，其中在所述細胞膜處水溶性對遷移率是不利的，但其然后一旦進入到所述細胞中就被代謝水解成作為活性實體的羧酸，其中在所述細胞中水溶性是有利的。所述前藥的另一個例子可以是結(jié)合于酸性基團的短鏈肽(聚氨基酸)，其中所述肽被代謝以暴露出活性部分。
如本文中作用的，術(shù)語“溶劑合物”指本發(fā)明的化合物或其鹽，其還包括通過非共價分子間力結(jié)合于其的化學(xué)計量或非化學(xué)計量的量的溶劑。優(yōu)選的溶劑是揮發(fā)性的、無毒的、和/或?qū)τ谙蛉私o藥可接受的。如果所述溶劑為水，則所述溶劑合物指水合物。
如本文中所用的，術(shù)語“異構(gòu)體”指本發(fā)明的化合物或其鹽，其具有相同的化學(xué)式或分子式，但彼此是光學(xué)或空間不同的 除非另外說明，術(shù)語“式I化合物”預(yù)計包括化合物自身，及其藥學(xué)可接受的鹽、前藥、溶劑合物和異構(gòu)體。
如本文中所用的，術(shù)語“烷基”指脂肪族烴基團。所述烷基部分可以是“飽和的烷基”基團，其意思是它不包含任何烯和炔部分?；蛘撸鐾榛糠诌€可以是“不飽和烷基”部分，其意思是它包含至少一個烯或炔部分。術(shù)語“烯”部分指其中至少兩個碳原子形成至少一個碳碳雙鍵的基團，和“炔”部分指其中至少兩個碳原子形成至少一個碳碳三鍵的基團。所述烷基部分，無論其是否被取代或未取代，都可以是支鏈的、直鏈的或環(huán)狀的。
如本文中所用的，術(shù)語“雜環(huán)烷基”指碳環(huán)基團，其中一個或多個環(huán)碳原子用氧、氮、或硫取代，并且其包括但不限于例如，呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、吡咯烷、噁唑、噻唑、咪唑、咪唑啉、咪唑烷、吡唑、吡唑啉、吡唑烷、異噻唑、三唑、噻二唑、吡喃、吡啶、哌啶、嗎啉、硫代嗎啉、噠嗪、嘧啶、吡嗪、哌嗪和三嗪。
如本文中所用的，術(shù)語“芳基”指具有至少一個具有共軛π電子體系的環(huán)的芳香族取代基基團，并包括碳環(huán)芳基(例如苯基)和雜環(huán)芳基(例如吡啶)基團。該術(shù)語包括單環(huán)和稠環(huán)的多環(huán)(即，共享相鄰碳原子對的環(huán))基團。
如本文中所用的，術(shù)語“雜芳基”指包含至少一個雜環(huán)的環(huán)的芳香族基團。
芳基和雜芳基的例子包括但不限于，苯基、呋喃、吡喃、吡啶基、嘧啶基和三唑基(triazyl)。
本發(fā)明式I中的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8可以被任選取代。當被取代時，所述一個或多個取代基為單獨和獨立地選自如下基團的一個或多個基團環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜脂環(huán)族、羥基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷基硫代、芳基硫代、氰基、鹵素、羰基、硫代羰基、O-氨基甲?；-氨基甲?；?、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-氨基、N-氨基、S-亞磺酰氨基、N-亞磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、異氰酸根合、硫氰酸根合、異硫氰酸根合、硝基、甲硅烷基、三鹵代甲烷磺?；⒑桶▎稳〈投〈被陌被?，及其被保護的衍生物。
在式I的化合物中，優(yōu)選如下式II至IV的化合物。
式II的化合物為其中n為0和鄰近碳原子通過它們之間直接的鍵形成環(huán)結(jié)構(gòu)(呋喃環(huán))的化合物，并在下文中經(jīng)常被稱為“呋喃化合物”或“呋喃并-o-萘醌衍生物”。

式III的化合物為其中n為1的化合物，并在下文中經(jīng)常被稱為“吡喃化合物”或“吡喃并-o-萘醌”。

在式I中，每個R1和R2特別優(yōu)選為氫。
在式II的呋喃化合物中，特別優(yōu)選其中R1、R2和R4獨立地為氫的式IIa的化合物，或者其中R1、R2和R6獨立地為氫的式IIb的化合物。


另外，在式III的吡喃化合物中，特別優(yōu)選其中R1、R2、R5、R6、R7和R8獨立地為氫的式IIIa的化合物。

如本文中使用的術(shù)語“藥物組合物”指式I化合物與例如稀釋劑或載體的其它化學(xué)成分的混合物。所述藥物組合物方便了所述化合物對生物體的給藥。給藥一種化合物的多種技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括但不限于口服、注射、氣霧、非腸道和局部給藥。藥物組合物還可以通過將目標化合物與酸，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等反應(yīng)而獲得。
術(shù)語“治療有效量”指當將所述化合物給藥時，有效緩解或降低需要治療的疾病的一個或多個癥狀到一定程度，或者延遲需要預(yù)防的疾病的臨床指標或癥狀的開始的活性成分的量。因此，治療有效量指顯示出如下效果的活性成分的量(i)使疾病發(fā)展的速度反轉(zhuǎn)；(ii)將所述疾病的進一步發(fā)展抑制到一定程度；和/或(iii)將與所述疾病相關(guān)的一個或多個癥狀緩解到一定程度(或者優(yōu)選消除)。所述治療有效量可通過用所關(guān)心化合物在已知的用于需要治療的疾病的體內(nèi)和體外模型體系中進行實驗而經(jīng)驗性地確定。
術(shù)語“載體”指促進化合物并入到細胞或組織中的化合物。例如，二甲基亞砜(DMSO)是常用的載體，因為它促進許多有機化合物攝取到生物體的細胞或組織中。
術(shù)語“稀釋劑”指將溶解目標化合物以及穩(wěn)定所述化合物的生物活性形式的在水中稀釋的化合物。溶解于緩沖溶液中的鹽在本領(lǐng)域中被用作稀釋劑。一種常用的緩沖溶液為磷酸鹽緩沖鹽(PBS)，因為它模擬人體液的離子強度狀況。由于緩沖鹽可控制低濃度溶液的pH，所以緩沖鹽稀釋劑幾乎不改變化合物的生物活性。
本文中描述的化合物可以其自身，或以藥物組合物的形式給藥到人類患者，在所述藥物組合物中，它們與其它活性成分混合，如在組合治療中，或與適當?shù)妮d體或一種或多種賦形劑混合。用于將所述化合物配成制劑和給藥的技術(shù)可在“Remington’s PharmaceuticalSciences”，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第18版，1990中找到。
在本發(fā)明的藥物組合物中，式I化合物，如將在下文中說明的那樣，可通過本領(lǐng)域中已知的常規(guī)方法和/或基于在有機化學(xué)合成領(lǐng)域中普通技術(shù)和實踐的多種方法進行制備。下文描述的制備方法僅是示例性的并且還可以采用其它方法。同樣，本發(fā)明的范圍并不限制于如下方法。
制備方法1黃鐘花醌衍生物的合成和酸催化環(huán)化 β-拉帕科恩從拉帕樹中以相對少的量獲得，而用作用于合成β-拉帕科恩的原料的黃鐘花醌從拉帕樹中以顯著大的量獲得。因此，利用黃鐘花醌合成β-拉帕科恩的方法很久以前就已經(jīng)被開發(fā)了。就是說，如由L.F.Fieser在J.Am.Chem.Scoc.49(1927)，857中教導(dǎo)的，通過將黃鐘花醌和硫酸混合和將形成的混合物在室溫下劇烈攪拌而以相對高的收率獲得β-拉帕科恩。同樣，具有相對簡單化學(xué)結(jié)構(gòu)的三環(huán)萘醌(吡喃并-o-萘醌和呋喃并-o-萘醌)衍生物通常利用硫酸作為催化劑經(jīng)過環(huán)化作用以相對高的收率而被合成，如下面的反應(yīng)示意圖所示。基于該方法，可以合成多種式I化合物。

黃鐘花醌β-拉帕科恩 更明確地，上述合成方法可總結(jié)如下。

即，當將2-羥基-1，4-萘醌與多種烯丙基溴或其等價物在堿的存在下反應(yīng)時，同時獲得C-烷基化產(chǎn)物和O-烷基化產(chǎn)物。還可能根據(jù)反應(yīng)條件僅合成兩種衍生物的任一種。由于通過利用如甲苯或二甲苯的溶劑回流所述O-烷基化衍生物可將O-烷基化衍生物經(jīng)克萊森重排轉(zhuǎn)化為另一種類型的C-烷基化衍生物，所以可能獲得多種類型的3-取代的-2-羥基-1，4-萘醌衍生物。如此獲得的多種類型的C-烷基化衍生物可利用硫酸作為催化劑而經(jīng)歷環(huán)化作用，從而能夠合成在式I化合物中的吡喃并-o-萘醌或呋喃并-o-萘醌衍生物。
制備方法2利用3-亞甲基-1，2，4-[3H]萘三酮的狄爾斯-阿爾德反應(yīng) 如由V.Nair等人，Tetrahedron Lett.42(2001)，4549-4551教導(dǎo)的，據(jù)報道通過將2-羥基-1，4-萘醌和甲醛一起加熱而獲得的3-亞甲基-1，2，4-[3H]萘三酮經(jīng)歷與多種烯烴化合物的狄爾斯-阿爾德反應(yīng)而可相對容易地合成多種吡喃并-o-萘醌衍生物。該方法的優(yōu)點在于與利用硫酸作為催化劑的黃鐘花醌衍生物的環(huán)化引入相比，多種形式的吡喃并-o-萘醌衍生物可以以相對簡化的方式合成。

制備方法3通過自由基反應(yīng)的鹵代烷基化和環(huán)化 用于合成隱丹參酮和15，16-二氫-丹參酮的相同方法也可被方便地用于合成呋喃并-o-萘醌衍生物。即，如由A.C.Baillie等人(J.Chem.Soc.(C)1968，48-52)教導(dǎo)的，衍生自3-鹵代丙酸或4-鹵代丁酸衍生的2-鹵代乙基或3-鹵代乙基自由基化學(xué)物質(zhì)，可與2-羥基-1，4-萘醌反應(yīng)以從而合成3-(2-鹵代乙基或3-鹵代丙基)-2-羥基-1，4-萘醌，其然后在適當?shù)乃嵝源呋瘎l件下經(jīng)歷環(huán)化作用以合成多種吡喃并-o-萘醌或呋喃并-o-萘醌衍生物。

制備方法4通過狄爾斯-阿爾德反應(yīng)的4，5-苯并呋喃二酮的環(huán)化 用于合成隱丹參酮和15，16-二氫-丹參酮的另一個方法可以是由J.K.Snyder等人(Tetrahedron Letters 28(1987)，3427-3430)教導(dǎo)的方法。根據(jù)該方法，可通過經(jīng)4，5-苯并呋喃二酮衍生物和多種二烯衍生物之間的狄爾斯-阿爾德反應(yīng)的環(huán)加成而合成呋喃并-o-萘醌衍生物
另外，基于上述制備方法，可根據(jù)取代基的種類利用相關(guān)的合成方法合成多種衍生物。如此合成的衍生物和方法的確定的例子例舉于下表1中。確定的制備方法將在下文的實施例中描述。
表1




本發(fā)明的藥物組合物可以自身已知的方式，例如借助于常規(guī)的混合、溶解、?；?、糖衣丸形成、磨細、乳化、包封、包埋或凍干方法而被生產(chǎn)。
用于本發(fā)明的藥物組合物因此可以常規(guī)方式利用一種或多種包括賦形劑和助劑的藥學(xué)可接受的載體配成制劑，所述賦形劑和助劑促進活性化合物進入到可藥用的制劑中的過程。適當?shù)闹苿┤Q于所選擇的給藥途徑。任何公知的技術(shù)、載體和賦形劑可如在本領(lǐng)域中，例如在上述Remington’s Pharmaceutical Sciences中的適當?shù)暮捅焕斫饽菢邮褂?，在本發(fā)明中，式I化合物根據(jù)應(yīng)用目的可被配制成可注射制劑和非腸道制劑。
為了注射，本發(fā)明的試劑可被配制到水溶液中，優(yōu)選配制到生理相容性緩沖液中，例如Hanks溶液、Ringer溶液或生理鹽水中。為了經(jīng)粘膜給藥，對于待被穿過的障礙，在所述制劑中使用適當?shù)臐B透劑。這樣的滲透劑在本領(lǐng)域中通常是已知的。
為了口服給藥，可通過將所述活性化合物與本領(lǐng)域公知的藥學(xué)可接受的載體組合而容易地配成制劑。這樣的載體使得本發(fā)明的化合物能夠被配制成用于由患者經(jīng)口攝食的片劑、丸劑、粉末、顆粒、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、淤漿、懸浮液等。優(yōu)選膠囊、片劑、丸劑、粉末和顆粒，并且特別有用的是膠囊和片劑。片劑和丸劑優(yōu)選在腸衣中制備。用于經(jīng)口使用的藥物制品可通過將一種或多種賦形劑與一種或多種本發(fā)明的化合物混合、任選研磨所形成的混合物、和在隨需要加入適當?shù)闹鷦┖蠹庸ゎw粒的混合物，以獲得片劑或糖衣丸的核而獲得。適當?shù)馁x形劑可以是填充劑，例如糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；和纖維素物質(zhì)，例如玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉、土豆淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、或褐藻酸或其鹽，例如褐藻酸鈉，潤滑劑，例如硬脂酸鎂，和載體，例如粘合劑。
可用于口服的藥物制劑可包括由明膠制成的推入配合膠囊，以及由明膠和增塑劑，例如甘油或山梨醇制成的軟密封膠囊。所述推入配合膠囊可包含與填充劑，例如乳糖，粘合劑，例如淀粉，和/或潤滑劑，例如滑石或硬脂酸鎂混合的活性成分。在軟膠囊中，所述活性化合物可被溶解或分散于適當?shù)娜軇┲?，例如脂肪酸、液體石蠟或液態(tài)聚乙二醇中。另外，還可以加入穩(wěn)定劑。所有用于口服給藥的制劑應(yīng)當是適用于如此給藥的劑型。
所述化合物可以被配制成用于通過注射，例如推注或連續(xù)灌注的非腸道給藥的劑型。用于注射的制劑可以以單位劑型，例如以安瓿瓶的形式或以添加有防腐劑的多劑量容器的形式存在。所述組合物可以采取例如在油或水性媒介物中的懸浮液、溶液或乳液的形式，并且可以包含配方劑(formulatory agent)，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。
或者，所述活性成分可以是在使用前的粉末形式，其用于與適當例如無菌無熱源水的媒介物進行構(gòu)造。
適用于本發(fā)明的藥物組合物包括其中包含有效獲得其預(yù)計目的的量的所述活性成分的組合物，更明確地，治療有效量指有效預(yù)防、減輕或改善疾病癥狀，或延長被治療對象的生存時間的化合物的量。治療有效量的確定是很好地在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)的，尤其根據(jù)本文中提供的詳細公開內(nèi)容。
當將本發(fā)明的藥物組合物配制成單位劑型時，在單位劑量中優(yōu)選包含約0.1至1,000mg的作為活性成分的式I化合物。式I化合物的給藥量將由主治醫(yī)師根據(jù)被治療患者的體重和年齡、疾病的特征性質(zhì)和嚴重性確定。然而，對于成人患者，對該患者給藥的活性成分的劑量取決于給藥的頻率和強度典型地在約1至1,000mg/kg口服/天范圍內(nèi)。為了肌內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥到成人患者中，總量約1至500mg/天作為單獨劑量將是足夠的，但對于一些患者，可優(yōu)選使用更高的每日劑量。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供式I化合物在制備用于治療或預(yù)防疾病綜合癥的藥物中的用途。所述疾病綜合癥指肥胖癥、糖尿病、代謝綜合癥、變性疾病和與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病。術(shù)語所述疾病綜合癥的“治療”指當將所述藥物用于顯示出發(fā)作疾病的癥狀的對象中時，停止或延緩所述疾病的發(fā)展。術(shù)語“預(yù)防”指當將所述藥物用于未顯示出發(fā)作疾病的癥狀但具有發(fā)作疾病的高風險的對象中時，停止或延緩發(fā)作疾病的癥狀。
實施例 現(xiàn)在將參照下面的實施例和實驗例更詳細地說明本發(fā)明。提供的這些實施例僅用于舉例說明本發(fā)明，而不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍和主旨。
實施例1β-拉帕科恩(化合物1)的合成 將17.4g(0.10M)的2-羥基-1，4-萘醌溶解于120ml的DMSO中，并將0.88g(0.11M)的LiH逐漸加入其中。這里要小心操作，因為放出氫氣。將該反應(yīng)溶液攪拌，并在確定不再產(chǎn)生氫氣后，繼續(xù)攪拌另外30分鐘。然后，將15.9g(0.10M)的異戊烯基溴(1-溴-3-甲基-2-丁烯)和3.35g(0.025M)的LiI逐漸加入其中。將反應(yīng)溶液加熱至45℃并然后在該溫度下劇烈攪拌12小時。將該反應(yīng)溶液冷卻至低于10℃并首先加入76g冰和隨后加入250ml水。之后，將25ml濃鹽酸逐漸加入以保持所形成的溶液在酸性pH＞1。向該反應(yīng)混合物中加入200ml EtOAc，然后劇烈攪拌，從而生成不溶于EtOAc的白色固體。將這些固體過濾并分離EtOAc層。將水層再一次用100ml EtOAc萃取，并與先前萃取的有機層合并。該有機層用150ml的5％NaHCO3洗滌，并濃縮。將形成的濃縮物溶解在200ml CH2Cl2中，并劇烈振搖，加入70ml 2N的NaOH水溶液分成兩層。將CH2Cl2層用2N的NaOH水溶液處理(70ml×2)進一步分離兩次。將如此分離的水溶液合并在一起并調(diào)節(jié)至酸性pH＞2，從而形成固體。將經(jīng)形成的固體過濾并分離以得到黃鐘花醌。將如此獲得的黃鐘花醌從75％EtOH中重結(jié)晶。將形成的黃鐘花醌與80ml硫酸混合，并將該混合物在室溫下劇烈攪拌10分鐘，并將200g冰加入其中以完成該反應(yīng)。將60ml CH2Cl2加入到該反應(yīng)物質(zhì)中，然后劇烈振搖。之后分離CH2Cl2層并用5％NaHCO3洗滌。將水層用30ml CH2Cl2再一次萃取，用5％NaHCO3洗滌，并與先前的萃取有機相合并。將有機層經(jīng)MgSO4干燥，并濃縮給出不純的β-拉帕科恩。將如此獲得的β-拉帕科恩從異丙醇中重結(jié)晶，從而獲得8.37g純的β-拉帕科恩。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.05(1H，dd，J＝1，8Hz)，7.82(1H，dd，J＝1，8Hz)，7.64(1H，dt，J＝1，8Hz)，7.50(1H，dt，J＝1，8Hz)，2.57(2H，t，J＝6.5Hz)，1.86(2H，t，J＝6.5Hz)1.47(6H，s) 實施例2董尼酮(化合物2)的合成 在實施例1中獲得黃鐘花醌的過程中，分離的不溶解于EtOAc的固體為2-異戊氧基-1，4-萘醌，一種O-烷基化產(chǎn)物，其與作為C烷基化產(chǎn)物的黃鐘花醌不同。首先將分離的2-異戊氧基-1，4-萘醌再一次從EtOAc中重結(jié)晶。將3.65g(0.015M)如此純化的固體溶解于甲苯中并將甲苯回流5小時以進行克萊森重排。通過減壓蒸餾濃縮甲苯并然后不用進一步純化與15ml硫酸混合。將形成的混合物在室溫下劇烈攪拌10分鐘，并將100g冰加入其中以完成該反應(yīng)。將50ml CH2Cl2加入到該反應(yīng)材料中，然后劇烈振搖。之后分離CH2Cl2層并用5％NaHCO3洗滌。將水層用20ml CH2Cl2再一次萃取，用5％NaHCO3洗滌，并與先前的萃取有機相合并。將有機層經(jīng)MgSO4干燥，濃縮并通過在硅膠上進行色譜分離進行純化給出2.32g純的董尼酮。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.05(1H，d，J＝8Hz)，7.64(2H，d，J＝8Hz)，7.56(1H，m)，4.67(1H，q，J＝7Hz)，1.47(3H，d，J＝7Hz)，1.45(3H，s)1.27(3H，s) 實施例3α-董尼酮(化合物3)的合成 將4.8g(0.020M)在實施例2中純化的2-異戊氧基-1，4-萘醌溶解于二甲苯中，并將二甲苯回流15小時，從而在與實施例2相比顯著更高的溫度條件下和延長的反應(yīng)條件下進行克萊森重排。根據(jù)該反應(yīng)過程，已經(jīng)進行環(huán)化的α-董尼酮與已經(jīng)經(jīng)歷克萊森重排的黃鐘花醌衍生物一起獲得，并且其中兩個甲基中的一個已經(jīng)位移。將二甲苯通過減壓蒸餾濃縮并通過在硅膠上進行色譜分離而純化，得到1.65g的純α-董尼酮。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.06(1H，d，J＝8Hz)，7.64(2H，m)，7.57(1H，m)，3.21(1H，q，J＝7Hz)，1.53(3H，s)，1.51(3H，s)1.28(3H，d，J＝7Hz) 實施例4化合物4的合成 將17.4g(0.10M)的2-羥基-1，4-萘醌溶解于120ml的DMSO中，并將0.88g(0.11M)的LiH逐漸加入其中。這里要小心操作，因為放出氫氣。將該反應(yīng)溶液攪拌，并在確定不再產(chǎn)生氫氣后，繼續(xù)攪拌另外30分鐘。然后，將14.8g(0.11M)的甲代烯丙基溴(1-溴-2-甲基丙烯)和3.35g(0.025M)的LiI逐漸加入其中。將反應(yīng)溶液加熱至45℃并然后在該溫度下劇烈攪拌12小時。將該反應(yīng)溶液冷卻至低于10℃并首先加入80g冰和隨后加入250ml水。之后，將25ml濃鹽酸逐漸加入以保持所形成的溶液在酸性pH＞1。向該反應(yīng)混合物中加入200ml CH2Cl2，然后劇烈振搖以分成兩相。將水層再一次用加入70mlCH2Cl2進行萃取，并與先前萃取的有機層合并。通過TLC確定新形成兩種物質(zhì)，并且它們不用任何特別的分離過程而隨后使用。將有機層通過減壓蒸餾濃縮，再次溶解于二甲苯中并然后回流8小時。在該過程中，兩種物質(zhì)在TLC上合并成一個，從而獲得相對純的黃鐘花醌衍生物。將如此獲得的黃鐘花醌衍生物與80ml硫酸混合并在室溫下劇烈攪拌10分鐘，并向其中加入200g冰以完成該反應(yīng)。將80ml CH2Cl2加入到該反應(yīng)物質(zhì)中，隨后劇烈振搖。之后，分離CH2Cl2層并用5％NaHCO3洗滌。將水層用50ml CH2Cl2再一次萃取，用5％NaHCO3洗滌，并與先前的萃取有機相合并。將有機層經(jīng)MgSO4干燥，濃縮給出不純的β-拉帕科恩衍生物(化合物4)。將如此獲得的β-拉帕科恩衍生物從異丙醇中重結(jié)晶，從而獲得12.21g純的化合物4。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.08(1H，d，J＝8Hz)，7.64(2H，m)，7.57(1H，m)，2.95(2H，s)，1.61(6H，s) 實施例5化合物5的合成 以如實施例4中相同的方式獲得化合物5，除了使用烯丙基溴代替甲代烯丙基溴。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.07(1H，d，J＝7Hz)，7.65(2H，m)，7.58(1H，m)，5.27(1H，m)，3.29(1H，dd，J＝10，15Hz)，2.75(1H，dd，J＝7，15Hz)，1.59(3H，d，J＝6Hz) 實施例6化合物6的合成 將5.08g(40mM)的3-氯丙酰氯溶解于20ml乙醚中并冷卻至-78℃。將1.95g(25mM)過氧化鈉(Na2O2)逐漸加入到形成的溶液中，同時在該溫度下劇烈攪拌，隨后繼續(xù)劇烈攪拌30分鐘。將該反應(yīng)溶液加熱至0℃并將7g冰加入其中，隨后另外攪拌10分鐘。分離有機相，用10ml 0℃下的冰水，然后用0℃下的NaHCO3水溶液再一次洗滌。分離有機層，經(jīng)MgSO4干燥，0℃以下減壓蒸餾濃縮，從而制備3-氯代過丙酸。
將1.74g(10mM)2-羥基-1，4-萘醌溶解于20ml乙酸中，并在室溫下向其中逐漸加入先前制備的3-氯代過丙酸。將該反應(yīng)混合物在攪拌下回流2小時，并然后減壓蒸餾除去乙酸。將得到的濃縮物溶解于20ml CH2Cl2中，并用20ml 5％NaHCO3洗滌。用20ml CH2Cl2再一次萃取有機層，并與以前的萃取有機層合并。該有機層經(jīng)MgSO4干燥并濃縮給出與2-(2-氯乙基)-3-羥基-1，4-萘醌混合的化合物6。通過在硅膠上進行的色譜分離法純化形成的混合物給出0.172g純拉帕科恩衍生物(化合物6)。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.07(1H，d，J＝7.6Hz)，7.56-7.68(3H，m)，4.89(2H，t，J＝9.2Hz)，3.17(2H，t，J＝9.2Hz) 實施例7化合物7的合成 將17.4g(0.10M)的2-羥基-1，4-萘醌溶解于120ml的DMSO中，并將0.88g(0.11M)的LiH逐漸加入其中。這里要小心操作，因為放出氫氣。將該反應(yīng)溶液攪拌，并在確定不再產(chǎn)生氫氣后，繼續(xù)攪拌另外30分鐘。然后，將19.7g(0.10M)的肉桂基溴(3-苯基烯丙基溴)和3.35g(0.025M)的LiI逐漸加入其中。將反應(yīng)溶液加熱至45℃并然后在該溫度下劇烈攪拌12小時。將該反應(yīng)溶液冷卻至低于10℃并首先加入80g冰和隨后加入250ml水。之后，將25ml濃鹽酸逐漸加入以保持所形成的溶液在酸性pH＞1。向該反應(yīng)混合物中加入200ml CH2Cl2以溶解反應(yīng)混合物，然后劇烈振搖以分成兩相。將水層棄去，并將CH2Cl2層用2N NaOH水溶液處理(100ml×2)以分離水層2次。這時，將用2N NaOH水溶液萃取后的剩余的CH2Cl2層再次用于實施例8。將如此分離的水溶液合并，并用濃鹽酸調(diào)節(jié)至酸性pH＞2，從而形成固體。將形成的固體過濾和分離給出黃鐘花醌衍生物。將如此獲得的黃鐘花醌衍生物從75％EtOH中重結(jié)晶。將形成的黃鐘花醌衍生物與50ml硫酸混合，并將該混合物在室溫下劇烈攪拌10分鐘并向其中加入150g冰以完成該反應(yīng)。向該反應(yīng)物質(zhì)中加入60ml CH2Cl2，隨后劇烈振搖。之后，分離CH2Cl2層并用5％NaHCO3洗滌。再一次將水層用30ml CH2Cl2萃取，用5％NaHCO3洗滌，并與先前萃取的有機層合并。將該有機層濃縮并通過在硅膠上進行色譜分離純化給出2.31g純的化合物7。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.09(1H，dd，J＝1.2，7.6Hz)，7.83(1H，d，J＝7.6Hz)，7.64(1H，dt，J＝1.2，7.6Hz)，7.52(1H，dt，J＝1.2，7.6Hz)，7.41(5H，m)，5.27(1H，dd，J＝2.5，6.0Hz)，2.77(1H，m)2.61(1H，m)，2.34(1H，m)，2.08(1H，m)，0.87(1H，m) 實施例8化合物8的合成 將在實施例7中用2N NaOH水溶液萃取后剩余的CH2Cl2層通過減壓蒸餾濃縮。將得到的濃縮物溶解于30ml二甲苯中。隨后回流10小時以進行克萊森重排。通過減壓蒸餾濃縮二甲苯并然后不用進一步純化與15ml硫酸混合。將形成的混合物在室溫下劇烈攪拌10分鐘并向其中加入100g冰以完成該反應(yīng)。將50ml CH2Cl2加入到該劇烈振搖的反應(yīng)物質(zhì)中。之后將CH2Cl2層分離并用5％NaHCO3洗滌。再一次將水層用20ml CH2Cl2萃取，用5％NaHCO3洗滌，并與先前萃取的有機層合并。將該有機層經(jīng)MgSO4干燥，濃縮并通過在硅膠上進行色譜分離而純化給出1.26g純的化合物8。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.12(1H，dd，J＝0.8，8.0Hz)，7.74(1H，dd，J＝1.2，7.6Hz)，7.70(1H，dt，J＝1.2，7.6Hz)，7.62(1H，dt，J＝1.6，7.6Hz)，7.27(3H，m)，7.10(2H，td，J＝1.2，6.4Hz)，5.38(1H，qd，J＝6.4，9.2Hz)，4.61(1H，d，J＝9.2Hz)，1.17(3H，d，J＝6.4Hz) 實施例9化合物9的合成 將3.4g(22mM)1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一-7-烯和1.26g(15mM)的2-甲基-3-丁炔-2-醇溶解于10ml丙烯腈中，并將獲得的溶液冷卻至0℃。將3.2g(15mM)三氟乙酸酐在攪拌下逐漸加入到該溶液中，然后在0℃下繼續(xù)攪拌。將1.74g(10mM)2-羥基-1，4-萘醌和135mg(1.0mM)二氯化銅(CuCl2)在另一燒瓶中溶解于10ml乙腈中，并攪拌。將先前純化的溶液逐漸加入到該反應(yīng)溶液中，然后回流20小時。將該反應(yīng)溶液通過減壓蒸餾濃縮，并然后通過在硅膠上進行色譜分離純化給出0.22g純的化合物9。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.11(1H，dd，J＝1.2，7.6Hz)，7.73(1H，dd，J＝1.2，7.6Hz)，7.69(1H，dt，J＝1.2，7.6Hz)，7.60(1H，dt，J＝1.6，7.6Hz)，4.95(1H，d，J＝3.2Hz)，4.52(1H，d，J＝3.2Hz)，1.56(6H，s) 實施例10化合物10的合成 將0.12g化合物9溶解于5ml MeOH中，向其中加入10mg 5％Pd/C，隨后在室溫下劇烈攪拌3小時。將該反應(yīng)溶液通過硅膠過濾以除去5％Pd/C并通過減壓蒸餾濃縮以給出化合物10。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.05(1H，td，J＝1.2，7.6Hz)，7.64(2H，m)，7.54(1H，m)，3.48(3H，s)，1.64(3H，s)，1.42(3H，s)，1.29(3H，s) 實施例11化合物11的合成 將1.21g(50mM)的β-拉帕科恩(化合物1)和1.14g(50mM)DDQ(2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌)溶解于50ml四氯化碳中并回流72小時。將該反應(yīng)溶液通過減壓蒸餾濃縮并然后通過在硅膠上進行色譜分離純化給出1.18g純的化合物11。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.08(1H，dd，J＝1.2，7.6Hz)，7.85(1H，dd，J＝0.8，7.6Hz)，7.68(1H，dt，J＝1.2，7.6Hz)，7.55(1H，dt，J＝1.2，7.6Hz)，6.63(1H，d，J＝10.0Hz)，5.56(1H，d，J＝10.0Hz)，1.57(6H，s) 實施例12化合物12的合成 將1.74g(10mM)2-羥基-1，4-萘醌、3.4g(50mM)2-甲基-1，3-丁二烯(異戊二烯)、3.0g(100mM)多聚甲醛和20ml的1，4-二噁烷放置于壓力容器中，并在100℃下在攪拌下加熱48小時。將該反應(yīng)容器冷卻至室溫，并過濾其中的內(nèi)含物。將濾液通過減壓蒸餾濃縮并然后通過在硅膠上進行色譜分離給出238mg作為β-拉帕科恩的2-乙烯基衍生物的化合物12。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.07(1H，dd，J＝1.2，7.6Hz)，7.88(1H，dd，J＝0.8，7.6Hz)，7.66(1H，dt，J＝1.2，7.6Hz)，7.52(1H，dt，J＝0.8，7.6Hz)，5.87(1H，dd，J＝10.8，17.2Hz)，5.18(1H，d，J＝10.8Hz)，5.17(1H，17.2Hz)，2.62(1H，m)，2.38(1H，m)，2.17(3H，s)，2.00(1H，m)，1.84(1H，m) 實施例13化合物13的合成 將1.74g(10mM)2-羥基-1，4-萘醌、4.8g(50mM)2，4-二甲基-1，3-戊二烯和3.0g(100mM)多聚甲醛溶解于20ml的1，4-二噁烷中，并將形成的混合物在劇烈攪拌下回流10小時。將反應(yīng)容器冷卻至室溫，并過濾其中的內(nèi)含物以從固體中除去多聚甲醛。將濾液通過減壓蒸餾濃縮并然后通過在硅膠上進行色譜分離給出428mg作為β-拉帕科恩衍生物的化合物13。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.06(1H，dd，J＝1.2，7.6Hz)，7.83(1H，dd，J＝0.8，7.6Hz)，7.65(1H，dt，J＝1.2，7.6Hz)，7.50(1H，dt，J＝0.8，7.6Hz)，5.22(1H，bs)，2.61(1H，m)，2.48(1H，m)，2.04(1H，m)，1.80(3H，d，J＝1.0Hz)，1.75(1H，m)，1.72(1H，d，J＝1.0Hz)，1.64(3H，s) 實施例14化合物14的合成 將5.3g(30mM)2-羥基-1，4-萘醌、20.4g(150mM)2，6-二甲基-2，4，6-辛三烯和9.0g(300mM)多聚甲醛溶解于50ml的1，4-二噁烷中，并將形成的混合物在劇烈攪拌下回流10小時。將反應(yīng)容器冷卻至室溫，并過濾其中的內(nèi)含物以從固體中除去多聚甲醛。將濾液通過減壓蒸餾濃縮并然后通過在硅膠上進行色譜分離給出1.18g作為β-拉帕科恩衍生物的化合物14。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.07(1H，dd，J＝1.2，7.6Hz)，7.87(1H，dd，J＝0.8，7.6Hz)，7.66(1H，dt，J＝1.2，7.6Hz)，7.51(1H，dt，J＝0.8，7.6Hz)，6.37(1H，dd，J＝11.2，15.2Hz)，5.80(1H，寬d，J＝11.2Hz)，5.59(1H，d，J＝15.2Hz)，2.67(1H，dd，J＝4.8，17.2Hz)，2.10(1H，dd，J＝6.0，17.2Hz)，1.97(1H，m)，1.75(3H，bs)，1.64(3H，bs)，1.63(3H，s)，1.08(3H，d，J＝6.8Hz) 實施例15化合物15的合成 將5.3g(30mM)2-羥基-1，4-萘醌、20.4g(50mM)萜烯和9.0g(300mM)多聚甲醛溶解于50ml的1，4-二噁烷中，并將形成的混合物在劇烈攪拌下回流10小時。將反應(yīng)容器冷卻至室溫，并過濾其中的內(nèi)含物以從固體中除去多聚甲醛。將濾液通過減壓蒸餾濃縮并然后通過在硅膠上進行色譜分離給出1.12g作為四環(huán)鄰醌衍生物的化合物15。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.06(1H，d，J＝7.6Hz)，7.85(1H，d，J＝7.6Hz)，7.65(1H，t，J＝7.6Hz)，7.51(1H，t，J＝7.6Hz)，5.48(1H，寬s)，4.60(1H，寬s)，2.45(1H，d，J＝16.8Hz)，2.21(1H，m)，2.20(1H，d，J＝16.8Hz)，2.09(1H，m)，1.77(1H，m)，1.57(1H，m)，1.07(3H，s)，1.03(3H，d，J＝0.8Hz)，1.01(3H，d，J＝0.8Hz)，0.96(1H，m) 實施例16化合物16和17的合成 將17.4g(0.10M)2-羥基-1，4-萘醌溶解于120ml DMSO中，并向其中逐漸加入0.88g(0.11M)LiH。這里要小心操作，因為放出氫氣。將該反應(yīng)溶液攪拌，并在確定不再產(chǎn)生氫氣后，繼續(xù)攪拌另外30分鐘。然后，將16.3g(0.12M)的巴豆基溴和3.35g(0.025M)的LiI逐漸加入其中。將該反應(yīng)溶液加熱至45℃并然后在該溫度下劇烈攪拌12小時。將該反應(yīng)溶液冷卻至低于10℃并首先加入80g冰和隨后加入250ml水。之后，將25ml濃鹽酸逐漸加入以保持所形成的溶液在酸性pH＞1。向該反應(yīng)混合物中加入200ml CH2Cl2，然后劇烈振搖以分成兩相。將水層棄去，并將CH2Cl2層用2N NaOH水溶液處理(100ml×2)以分離水層2次。這時，將用2N NaOH水溶液萃取后的剩余的CH2Cl2層用于實施例17。將如此分離的水溶液合并，并用濃鹽酸調(diào)節(jié)至酸性pH＞2，從而形成固體。將形成的固體過濾和分離給出黃鐘花醌衍生物。將如此獲得的黃鐘花醌衍生物從75％EtOH中重結(jié)晶。將形成的黃鐘花醌衍生物與50ml硫酸混合，并將該混合物在室溫下劇烈攪拌10分鐘并向其中加入150g冰以完成該反應(yīng)。向該反應(yīng)物質(zhì)中加入60mlCH2Cl2，隨后劇烈振搖。之后，分離CH2Cl2層并用5％NaHCO3洗滌。再一次將水層用30ml CH2Cl2萃取，用5％NaHCO3洗滌，并與先前萃取的有機層合并。將該有機層濃縮并通過在硅膠上進行色譜分離純化以分別給出1.78g和0.43g純的化合物16和17。
化合物16的1H-NMR(CDCl3，δ)δ8.07(1H，dd，J＝0.8，6.8Hz)，7.64(2H，寬d，J＝3.6Hz)，7.57(1H，m)，5.17(1H，qd，J＝6.0，8.8Hz)，3.53(1H，qd，J＝6.8，8.8Hz)，1.54(3H，d，6.8Hz)，1.23(3H，d，6.8Hz) 化合物17的1H-NMR(CDCl3，δ)δ8.06(1H，d，J＝0.8，7.2Hz)，7.65(2H，寬d，J＝3.6Hz)，7.57(1H，m)，4.71(1H，五重峰，J＝6.4Hz)，3.16(1H，五重峰，J＝6.4Hz)，1.54(3H，d，6.4Hz)，1.38(3H，d，6.4Hz) 實施例17化合物18和19的合成 將在實施例16中用2N NaOH水溶液萃取后剩余的CH2Cl2層通過減壓蒸餾濃縮。將得到的濃縮物溶解于30ml二甲苯中。隨后回流10小時以導(dǎo)致克萊森重排。通過減壓蒸餾濃縮二甲苯并然后不用進一步純化與15ml硫酸混合。將形成的混合物在室溫下劇烈攪拌10分鐘并向其中加入100g冰以完成該反應(yīng)。將50ml CH2Cl2加入到該劇烈振搖的反應(yīng)物質(zhì)中。之后將CH2Cl2層分離并用5％NaHCO3洗滌。再一次將水層用20ml CH2Cl2萃取，用5％NaHCO3洗滌，并與先前萃取的有機層合并。將該有機層經(jīng)MgSO4干燥，濃縮并通過在硅膠上進行色譜分離而純化以分別給出0.62和0.43g純的化合物18和19。
化合物18的1H-NMR(CDCl3，δ)8.06(1H，dd，J＝0.8，7.2Hz)，7.81(1H，dd，J＝0.8，7.6Hz)，7.65(1H，dt，J＝0.8，7.6Hz)，7.51(1H，dt，J＝0.8，7.2Hz)，4.40(1H，m)，2.71(1H，m)，2.46(1H，m)，2.11(1H，m)，1.71(1H，m)，1.54(3H，d，6.4Hz)，1.52(1H，m) 化合物19的1H-NMR(CDCl3，δ)of Compound 198.08(1H，d，J＝0.8，7.2Hz)，7.66(2H，寬d，J＝4.0Hz)，7.58(1H，m)，5.08(1H，m)，3.23(1H，dd，J＝9.6，15.2Hz)，2.80(1H，dd，J＝7.2，15.2Hz)，1.92(1H，m)，1.82(1H，m)，1.09(3H，t，7.6Hz) 實施例18化合物20的合成 將17.4g(0.10M)的2-羥基-1，4-萘醌溶解于120ml的DMSO中，并將0.88g(0.11M)的LiH逐漸加入其中。這里要小心操作，因為放出氫氣。將該反應(yīng)溶液攪拌，并在確定不再產(chǎn)生氫氣后，繼續(xù)攪拌另外30分鐘。然后，將21.8g(0.10M)的香葉基溴和3.35g(0.025M)的LiI逐漸加入其中。將反應(yīng)溶液加熱至45℃并然后在該溫度下劇烈攪拌12小時。將該反應(yīng)溶液冷卻至低于10℃并首先加入80g冰和隨后加入250ml水。之后，將25ml濃鹽酸逐漸加入以保持所形成的溶液在酸性pH＞1。向該反應(yīng)混合物中加入200ml CH2Cl2，然后劇烈振搖以分成兩相。將水層棄去，并將CH2Cl2層用2N NaOH水溶液處理(100ml×2)以分離水層2次。將如此分離的水溶液合并，并用濃鹽酸調(diào)節(jié)至酸性pH＞2，從而形成固體。將形成的固體過濾和分離給出2-香葉基-3-羥基-1，4-萘醌。將如此獲得的產(chǎn)物不用進一步純化與50ml硫酸混合，并將該混合物在室溫下劇烈攪拌10分鐘，隨后加入150g冰以完成該反應(yīng)。向該反應(yīng)物質(zhì)中加入60ml CH2Cl2，隨后劇烈振搖。之后，分離CH2Cl2層并用5％NaHCO3洗滌。再一次將水層用30ml CH2Cl2萃取，用5％NaHCO3洗滌，并與先前萃取的有機層合并。將該有機層濃縮并通過在硅膠上進行色譜分離純化給出3.62g純的化合物20。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.05(1H，d，J＝7.6Hz)，7.77(1H，d，J＝7.6Hz)，7.63(1H，t，J＝7.6Hz)，7.49(1H，t，J＝7.6Hz)，2.71(1H，dd，J＝6.0，17.2Hz)，2.19(1H，dd，J＝12.8，17.2Hz)，2.13(1H，m)，1.73(2H，m)，1.63(1H，dd，J＝6.0，12.8Hz)，1.59(1H，m)，1.57(1H，m)，1.52(1H，m)，1.33(3H，s)，1.04(3H，s)，0.93(3H，s) 實施例19化合物21的合成 以與在實施例1中相同的方式獲得化合物21，除了用6-氯-2-羥基-1，4-萘醌替代2-羥基-1，4-萘醌。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.02(1H，d，J＝8Hz)，7.77(1H，d，J＝2Hz)，7.50(1H，dd，J＝2，8Hz)，2.60(2H，t，J＝7Hz)，1.87(2H，t，J＝7Hz)1.53(6H，s) 實施例20化合物22的合成 以與在實施例1中相同的方式獲得化合物22，除了用2-羥基-6-甲基-1，4-萘醌替代2-羥基-1，4-萘醌。
1H-NMR(CDCl3，δ)7.98(1H，d，J＝8Hz)，7.61(1H，d，J＝2Hz)，7.31(1H，dd，J＝2，8Hz)，2.58(2H，t，J＝7Hz)，1.84(2H，t，J＝7Hz)1.48(6H，s) 實施例21化合物23的合成 以與在實施例1中相同的方式獲得化合物23，除了用6，7-二甲氧基-2-羥基-1，4-萘醌替代2-羥基-1，4-萘醌。
1H-NMR(CDCl3，δ)7.56(1H，s)，7.25(1H，s)，3.98(6H，s)，2.53(2H，t，J＝7Hz)，1.83(2H，t，J＝7Hz)1.48(6H，s) 實施例22化合物24的合成 以與在實施例1中相同的方式獲得化合物24，除了使用1-溴-3-甲基-2-戊烯替代1-溴-3-甲基-2-丁烯。
1H-NMR(CDCl3，δ)7.30-8.15(4H，m)，2.55(2H，t，J＝7Hz)，1.83(2H，t，J＝7Hz)，1.80(2H，q，7Hz)1.40(3H，s)，1.03(3H，t，J＝7Hz) 實施例23化合物25的合成 以與在實施例1中相同的方式獲得化合物25，除了使用1-溴-3-乙基-2-戊烯替代1-溴-3-甲基-2-丁烯。
1H-NMR(CDCl3，δ)7.30-8.15(4H，m)，2.53(2H，t，J＝7Hz)，1.83(2H，t，J＝7Hz)，1.80(4H，q，7Hz)0.97(6H，t，J＝7Hz) 實施例24化合物26的合成 以與在實施例1中相同的方式獲得化合物26，除了使用1-溴-3-苯基-2-丁烯替代1-溴-3-甲基-2-丁烯。
1H-NMR(CDCl3，δ)7.15-8.15(9H，m)，1.90-2.75(4H，m)，1.77(3H，s) 實施例25化合物27的合成 以與在實施例1中相同的方式獲得化合物27，除了使用2-溴-亞乙基環(huán)己烷替代1-溴-3-甲基-2-丁烯。
1H-NMR(CDCl3，δ)7.30-8.25(4H，m)，2.59(2H，t，J＝7Hz)，1.35-2.15(12H，m) 實施例26化合物28的合成 以與在實施例1中相同的方式獲得化合物28，除了使用2-溴-亞乙基環(huán)戊烷替代1-溴-3-甲基-2-丁烯。
1H-NMR(CDCl3，δ)7.28-8.20(4H，m)，2.59(2H，t，J＝7Hz)，1.40-2.20(10H，m) 實施例27化合物29的合成 將8.58g(20mM)在實施例5中合成的化合物5溶解于1000ml四氯化碳中，隨后加入11.4g(50mM)2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌，并將形成的混合物回流96小時。通過減壓蒸餾濃縮該反應(yīng)溶液并然后將得到的紅色固體從異丙醇中重結(jié)晶，從而獲得7.18g純的化合物29。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.05(1H，dd，J＝1.2，7.6Hz)，7.66(1H，dd，J＝1.2，7.6Hz)，7.62(1H，dt，J＝1.2，7.6Hz)，7.42(1H，dt，J＝1.2，7.6Hz)，6.45(1H，q，J＝1.2Hz)，2.43(3H，d，J＝1.2Hz) 實施例28化合物30的合成 類似于如在J.Org.Chem.，55(1990)4995-5008中教導(dǎo)的合成方法，利用對苯醌和1-(N-嗎啉)丙烯合成4，5-二氫-3-甲基苯并[1，2-b]呋喃-4，5-二酮{苯并呋喃-4，5-二酮}。將1.5g(9.3mM)如此制備的苯并呋喃-4，5-二酮和3.15g(28.2mM)1-乙酸基-1，3-丁二烯溶解于200ml苯中，并將形成的混合物回流12小時。將該反應(yīng)溶液冷卻至室溫并通過減壓蒸餾濃縮。其隨后通過在硅膠上進行色譜分離給出1.13g純的化合物30。
1H-NMR(CDCl3，δ)8.05(1H，dd，J＝1.2，7.6Hz)，7.68(1H，dd，J＝1.2，7.6Hz)，7.64(1H，td，J＝1.2，7.6Hz)，7.43(1H，td，J＝1.2，7.6Hz)，7.26(1H，q，J＝1.2Hz)，2.28(3H，d，J＝1.2Hz) 實施例29化合物31和32的合成 將1.5g(9.3mM)4，5-二氫-3-甲基苯并[1，2-b]呋喃-4，5-二酮{苯并呋喃-4，5-二酮}和45g(0.6M)2-甲基-1，3-丁二烯溶解于200ml苯中，并將得到的混合物回流5小時。將該反應(yīng)溶液冷卻至室溫并通過減壓蒸餾完全濃縮。將如此獲得的濃縮物再次溶解于150ml四氯化碳中，隨后加入2.3g(10mM)2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌，并將形成的混合物進一步回流15小時。將該反應(yīng)溶液冷卻并通過減壓蒸餾濃縮。將形成的濃縮物通過在硅膠上進行色譜分離純化分別給出0.13g和0.11g純的化合物31和32。
化合物31的1H-NMR(CDCl3，δ)7.86(1H，s)，7.57(1H，d，J＝8.1Hz)，7.42(1H，d，J＝8.1Hz)，7.21(1H，q，J＝1.2Hz)，2.40(3H，s)，2.28(1H，d，J＝1.2Hz) 化合物32的1H-NMR(CDCl3，δ)δ7.96(1H，d，J＝8.0Hz)，7.48(1H，s)，7.23(2H，m)，2.46(3H，s)，2.28(1H，d，J＝1.2Hz) 實驗例1AMPK活化作用的測定 將成肌細胞C2C12培養(yǎng)在包含10％小牛血清的DMEM中。當細胞密度達到約85％至90％時，將培養(yǎng)介質(zhì)替換為包含1％小牛血清的介質(zhì)以誘導(dǎo)細胞的分化。將如此分化的成肌細胞用在濃度為5μg/ml的在實施例1至29中合成的樣品進行處理，并與對照組比較。AMPK的酶活性如下測定。首先，將C2C12細胞溶解以獲得蛋白質(zhì)提取物，并然后加入硫酸銨至終濃度為30％，從而使蛋白質(zhì)沉淀。將蛋白質(zhì)沉淀溶解于緩沖液中(62.5mM Hepes，pH7.2，62.5mM NaCl，62.5mM NaF，1.25mM焦磷酸鈉，1.25mM EDTA，1mM DTT，0.1mM PMSF，和200μM AMP)。之后將200μM SAMS肽(HMRSAMSGLHLVKRR加了下劃線的絲氨酸殘基為磷酸化的位點，作為乙酰-CoA羧化酶的AMPK磷酸化的位點)和[γ-32P]ATP加入其中并將反應(yīng)物在30℃下反應(yīng)10分鐘。隨后通過在p81磷酸纖維素紙上染上所形成的反應(yīng)溶液的斑點。所述p81紙用3％磷酸溶液洗滌并測量其放射性。對于每個反應(yīng)條件，不涉及SAMS肽的反應(yīng)同樣進行并將基礎(chǔ)值從如此觀察到的值中減去。
如此獲得的結(jié)果示于表2中。
表2 如從表2中可見，當將本發(fā)明的化合物在成肌細胞C2C12上處理時，這種處理導(dǎo)致AMPK的酶活性增加。
實驗例2在肥胖小鼠(ob/ob)中減重的效果 10周齡的具有肥胖癥特征和易患病的體質(zhì)的C57BL/6JL Lepob/Lep ob雄性小鼠購自Daehan Biolink Co.，Ltd.(Chungchongbuk-do，Korea)。在溫度保持在23℃、濕度為55％、光照為300至500lux、12小時明暗(L/D)循環(huán)、和每小時通風10至18次的飼養(yǎng)室中飼養(yǎng)動物。動物被隨意喂養(yǎng)Purina Rodent Laboratory Chow 5001的飼料(購自Purina Mills Inc.，St.Louis，MO，USA)作為用于實驗動物的固體飼料，和自來水作為飲用水。使小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)室的新環(huán)境2周，然后給藥一些根據(jù)本發(fā)明合成的吡喃并-o-萘醌和呋喃并-o-萘醌衍生物，劑量為100mg/kg，持續(xù)26天。觀察關(guān)于給藥的時間過程的體重、血糖和攝取飲食的變化。在給藥完成后，進行計算機控制斷層掃描術(shù)(CT)以確定動物的脂肪組織分布的變化，在多種器官中組織的脂肪分布變化，在脂細胞大小方面的變化，和在血液和肝臟中的葡萄糖、脂質(zhì)和酶水平方面的變化。
下表3顯示了給藥本發(fā)明的一些化合物的C57BL/6JL Lep ob/Lepob小鼠的體重經(jīng)過一段時間體重變化的結(jié)果 表3 如從上表3可見的那樣，當與對照組比較時，本發(fā)明化合物的給藥導(dǎo)致體重顯著下降。
圖1至3說明根據(jù)將如在表3中闡明的化合物給藥的C57BL/6JLLep ob/Lep ob小鼠的各個器官的數(shù)值的脂肪分布。如在圖1至3中給出的圖可見，給藥本發(fā)明的化合物的實驗組，與對照組相比，對于所有器官顯示出組織的脂肪含量的顯著下降，并還顯示出褐色脂肪含量增加，這說明脂肪代謝顯著增加。
下表4說明給藥本發(fā)明化合物的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠的血脂和血糖水平的變化。
表4 如從上表4中可見，與對照組相比，給藥本發(fā)明化合物的組顯示出在血中甘油三酯、膽固醇和葡萄糖水平顯著降低。
實驗例3通過β-拉帕科恩調(diào)節(jié)AMPK和ACC的磷酸化 實施本實施例以確定是否β-拉帕科恩(化合物1)具有對作為細胞內(nèi)能量調(diào)節(jié)蛋白的AMPK和ACC的磷酸化的作用。為了檢驗通過β-拉帕科恩的AMP激酶和ACC的磷酸化，將HepG2細胞(人的肝細胞的肝癌細胞系)播種到6孔培養(yǎng)板上，密度為每孔1×105個細胞，并在RPMI+10％FBS介質(zhì)中培養(yǎng)。在所述細胞生長24小時后，將培養(yǎng)介質(zhì)用無血清RPMI介質(zhì)替代，并且將細胞用β-拉帕科恩(10μM)分別處理30分鐘、1小時、2小時、4小時和6小時，與對照(DMSO)組合。分別使用抗-ACC和抗-pS79-ACC以觀察磷酸化的ACC，而使用抗-AMPK和抗-pT172-AMPK以觀察磷酸化的AMP激酶。如圖4中所示的，通過β-拉帕科恩的AMP激酶的磷酸化可從初始時間(30分鐘)觀察到，并且可確證這些磷酸化可持續(xù)高至6小時。另外，可確證被稱為AMP激酶的靶點蛋白的ACC也被磷酸化。這些結(jié)果說明通過β-拉帕科恩的作用活化的AMPK可抑制作為脂肪生成關(guān)鍵的調(diào)節(jié)酶的乙酰-CoA羧化酶的活性。
實驗例4β-拉帕科恩對內(nèi)皮源性一氧化氮合酶(eNOS)的磷酸化的作用 公知的是AMPK的活化使NRF-1活化并促進線粒體的生物合成。另外，NO/cGMP活化了PGC-1a和NRF-1以促進線粒體的生物合成。為了確定是否活化了AMPK的β-拉帕科恩涉及一氧化氮(NO)的生成，測定對增加內(nèi)皮源性一氧化氮合酶(eNOS)的活性的磷酸化的程度。為了檢驗通過β-拉帕科恩的作用的eNOS的磷酸化，將人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)播種到60-mm培養(yǎng)板上，密度為1×105個細胞，并在EBM2+5％FBS介質(zhì)中培養(yǎng)24小時。將該培養(yǎng)介質(zhì)用無血清的EBM2介質(zhì)替代，并將細胞用β-拉帕科恩(10μM)處理預(yù)定的時間。利用抗-pS1177eNOS觀察磷酸化的eNOS。
如圖5中所示的，eNOS的磷酸化在β-拉帕科恩的處理后30分鐘達到最大增加，并然后逐漸減少，從而在2小時后觀察不到。通過β-拉帕科恩的eNOS的磷酸化方面的增加說明β-拉帕科恩可被治療性用于如下疾病的可能性，缺血性心臟病和線粒體肌病，以及與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病(例如變性腦疾病、糖尿病、心肌病、與衰老有關(guān)的疾病)。
實驗例5在C57BL/6小鼠中β-拉帕科恩對AMPK的活化的作用 圖6說明在C57BL/6小鼠中β-拉帕科恩活化AMPK。將媒介物和5mg/kg的β-拉帕科恩經(jīng)尾靜脈給藥到C57BL/6小鼠分別2小時和4小時。將肝臟和生殖腺脂肪組織除去并分析AMPK激酶的活性。將活化的程度表達為放射性同位素的CPM值。利用同樣的方式，將源自人肝臟的細胞系，HepG2細胞用10μMβ-拉帕科恩處理30分鐘，然后進行AMPK激酶的活性的分析。如從圖12中的結(jié)果可見，β-拉帕科恩的給藥導(dǎo)致在肝臟和生殖腺脂肪組織和肝細胞中AMPK的活性增加。
實驗例6在C57BL/6小鼠中β-拉帕科恩對AMPK & ACC的磷酸化的作用。
為了研究β-拉帕科恩的抗肥胖癥作用，將β-拉帕科恩每天給藥到飲食引起的肥胖癥(DIO)小鼠，經(jīng)口服途徑劑量為50mg/kg，并檢驗β-拉帕科恩對在肝臟和生殖腺脂肪組織中的能量代謝和脂肪生成起重要作用的AMPK和ACC的磷酸化的作用。如在圖13中所示的，通過蛋白質(zhì)印記分析確定，在C57BL/6小鼠的生殖腺和肝臟組織中，β-拉帕科恩具有對AMPK和ACC的磷酸化的作用。磷酸化的AMPK據(jù)信活化了與能量相關(guān)的代謝。然而，據(jù)信由AMPK的活化影響的ACC被磷酸化并且然后其脂肪生成活性被抑制了，這將然后對脂質(zhì)代謝，包括肥胖癥的抑制，發(fā)揮一些作用。
實驗例7β-拉帕科恩對涉及C57BL/6小鼠的脂質(zhì)代謝的基因的表達的作用 為了研究β-拉帕科恩的抗肥胖癥作用，將β-拉帕科恩每天給藥到飲食引起的肥胖癥(DIO)小鼠，經(jīng)口服途徑劑量為50mg/kg，并通過實時定量PCR嘗試確定參與在肝臟和生殖腺脂肪組織中的脂質(zhì)代謝的乙酰CoA羧化酶(ACC)1(7，8)、ACC2(9)、脂肪酸合酶(FAS)(10，11)、脂蛋白脂肪酶(LPL)(12-15)、和硬脂酰-CoA去飽和酶(SCD1)(16，17)的mRNA水平。這些酶對于脂質(zhì)代謝是非常重要的，已知ACC催化從乙酰CoA形成丙二酰CoA，F(xiàn)AS催化從丙二酰CoA形成棕櫚酸鹽，和SCD1催化單不飽和脂肪的形成，從而在作為主要能量儲備的三酰甘油的形成中起到關(guān)鍵作用。同樣地，這些酶緊密關(guān)聯(lián)于肥胖癥、糖尿病、和與脂質(zhì)代謝相關(guān)的疾病。如圖8中所示，與對照組比較，ACC1和2、FAS、LPL、和SCD1的mRNA的表達水平在給藥β-拉帕科恩的實驗組中顯著降低，并且與對照組比較，在實驗組中LPL mRNA的水平增加2倍。因此，從對于上述酶的基因的增加或降低的表達的結(jié)果可推斷，β-拉帕科恩將是用于代謝綜合癥的治療的治療有效的物質(zhì)。
實驗例8β-拉帕科恩對涉及C57BL/6小鼠的葡萄糖代謝的蛋白質(zhì)的基因表達的作用 將β-拉帕科恩每天給藥到飲食引起的肥胖癥(DIO)小鼠，經(jīng)口服途徑劑量為50mg/kg，并通過實時定量PCR確定在肝臟和生殖腺脂肪組織中對于己糖激酶2(HK2)(21，22)、葡萄糖載體(GLUT)2和GLUT4(18，19，20)的mRNA的水平。GLUT是公知為在例如肝的器官、脂細胞和成肌細胞中介導(dǎo)細胞內(nèi)攝取和血糖的消耗的蛋白質(zhì)，而屬于葡萄糖激酶類的酶，HK2，使蛋白質(zhì)磷酸化，使其因此進入糖解途徑。如從圖9的結(jié)果可見的，與對照組相比，HK2 mRNA水平降低，而涉及葡萄糖遷移的兩種酶，GLUT2和GLUT4的mRNA顯示出在它們表達方面顯著的增加。GLUT2和GLUT4的增加的水平促進了血糖的細胞內(nèi)攝取，從而表現(xiàn)出β-拉帕科恩作為抗糖尿病藥物的可能性。
實驗例9β-拉帕科恩對涉及C57BL/6小鼠的線粒體生物合成的蛋白質(zhì)的基因表達的作用 將β-拉帕科恩每天給藥到飲食引起的肥胖癥(DIO)小鼠，經(jīng)口服途徑劑量為50mg/kg，并通過實時定量PCR確定在肝臟和生殖腺脂肪組織中過氧化酶活化增生受體的共活化體α1(PGC1α)(23，24)、核呼吸因子1(NRF1)(25-27)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子(mtTFA)(25-27)、和細胞色素氧化酶(COX)4和7(28，29)的mRNA水平。示于圖10中的蛋白質(zhì)為導(dǎo)致在細胞中對于能量合成起重要作用的線粒體的生物合成調(diào)節(jié)的典型的酶，并還已知涉及多種生理事件的調(diào)節(jié)。盡管在這些酶之間mRNA的量稍有不同，但β-拉帕科恩給藥組顯示出與對照組相比，對于所有酶，增加水平的mRNA。由于在多種代謝綜合癥中報道了線粒體的不正?；钚裕@些結(jié)果說明β-拉帕科恩通過這些現(xiàn)象的改進而可作為用于治療代謝綜合癥、與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病和與能量代謝相關(guān)的疾病的治療劑的可能性。
實驗例10β-拉帕科恩對C57BL/6小鼠的涉及能量代謝的基因表達的作用 將β-拉帕科恩每天給藥到飲食引起的肥胖癥(DIO)小鼠，經(jīng)口服途徑劑量為50mg/kg，并通過實時定量PCR確定在肝臟和生殖腺脂肪組織中涉及能量代謝的基因的轉(zhuǎn)錄水平。參見示于圖11中的酶，PPARα和γ為導(dǎo)致涉及能量消耗的酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的酶(30，31)，AMPK在通過感覺分子內(nèi)AMP/ATP比例而保持細胞能量內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起到重要作用，和AOX通過乙酰CoA的氧化而催化激活氧化磷酸化，這導(dǎo)致某些脂質(zhì)代謝過程的步驟(32，33)。另外，CPT1也是涉及能量代謝的酶，并公知為能夠使長鏈乙酰CoA通過進入線粒體的酶，而不采取朝向三酰甘油(34，35)的合成的途徑。在β-拉帕科恩給藥組中，過氧化酶活化增生受體(PPAR)α的mRNA水平?jīng)]有變化，然而PPARγ顯示出在其mRNA水平方面約2倍的增長。另外，即使在乙酰CoA氧化酶(AOX)、AMP活化的蛋白激酶(AMPK)α1和2、和肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1之間mRNA水平存在一定程度的差異，但與對照組相比，β-拉帕科恩給藥組仍顯示出這些酶的mRNA水平增加。這些基因的增加的表達水平說明β-拉帕科恩可作為用于治療與能量代謝相關(guān)的疾病的治療劑的可能性。
實驗例11β-拉帕科恩在C57BL/6小鼠中對SIRT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄的作用 將β-拉帕科恩每天給藥到飲食引起的肥胖癥(DIO)小鼠，經(jīng)口服途徑劑量為50mg/kg，并通過實時定量PCR在給藥第7、28和56天分別測量在生殖腺脂肪組織中Sirtuin(SIRT)(36，37)基因的轉(zhuǎn)錄水平。參見示于圖12中的SIRT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物，在人體中存在已知7種轉(zhuǎn)錄物。具體而言，SIRT1公知作為涉及長壽的酶，并且還報道當熱量被有限吸收時，SIRT1是顯著增加的(37)。如從圖18可見的，SITR1、SIRT3和SIRT6是顯著增加的，而SIRT2、SIRT5和SIRT7未顯示出在實驗組和對照組之間任何顯著的不同。
實驗例12β-拉帕科恩在C57BL/6小鼠中對UCP1和UCP2基因的轉(zhuǎn)錄的表達的作用 將β-拉帕科恩每天給藥到飲食引起的肥胖癥(DIO)小鼠，經(jīng)口服途徑劑量為50mg/kg，并利用實時定量PCR測量在肝臟和生殖腺脂肪組織中未結(jié)合蛋白1&2(UCP1&2)基因的轉(zhuǎn)錄水平。UCP1&2為通過產(chǎn)生熱實施能量消耗的酶，并且據(jù)報道這些酶的功能是消耗能量而不涉及反應(yīng)性氧物質(zhì)(ROS)的產(chǎn)生并還緊密相關(guān)于肥胖癥的發(fā)病率(38，39)。如在圖13中所示的，β-拉帕科恩的給藥已經(jīng)導(dǎo)致UCP1&2的mRNA水平顯著增加。這些結(jié)果說明β-拉帕科恩通過降低由在能量產(chǎn)生過程中另外產(chǎn)生的ROS導(dǎo)致的應(yīng)激而可作為用于治療代謝綜合癥的安全治療劑的可能性。
實驗例13β-拉帕科恩給藥對在飲食誘導(dǎo)的肥胖癥(DIO)C57BL/6小鼠中體重和飲食攝取隨時間變化的作用 圖14說明在對飲食誘導(dǎo)的肥胖癥(DIO)C57BL/6小鼠每日經(jīng)口服給藥劑量為50mg/kg的β-拉帕科恩后，56天的飲食攝取/體重的變化和重量變化。β-拉帕科恩給藥組顯示出頭兩周飲食攝取降低，并且之后飲食攝取水平恢復(fù)到類似于對照組的水平。這些結(jié)果據(jù)信是由于脂肪的分解被促進并因此產(chǎn)生足夠量的能量。另外，即使小鼠被喂養(yǎng)高脂肪食物，與對照組相比，動物仍顯示出連續(xù)的重量降低，持續(xù)56天。
圖15為比較治療組和對照組之間在對DIO C57BL/6小鼠給藥56天后，在多種器官中重量變化的圖，如圖15所示，存在由在給藥β-拉帕科恩后在器官組織中脂肪含量降低導(dǎo)致的組織重量方面顯著變化。
圖16A至16C顯示在對DIO C57BL/6小鼠給藥β-拉帕科恩56天后動物的全剖腹狀態(tài)，和在肝組織中在脂肪蓄積上油紅O染色和EM檢驗的結(jié)果。如從圖16中可見的，β-拉帕科恩給藥56天的C57BL/6小鼠顯示出在內(nèi)臟脂肪和體重方面的顯著降低，和轉(zhuǎn)變成紅色的肝組織的大小降低。為了證實在圖16中在脂肪肝的狀況中的改進，將在肝臟中的蓄積的脂肪用紅油O染色法染色，結(jié)果證實，與對照組相比，脂肪消失90％或更多。另外，在肝組織上的EM檢驗的結(jié)果顯示與對照組相比顯著降低的脂肪液泡和肝糖儲藏，正常線粒體形狀的恢復(fù)，線粒體數(shù)量顯著增加，和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)改進的形狀。
參見圖17，在每天向DIO C57BL/6小鼠經(jīng)口服途徑給藥50mg/kg劑量的β-拉帕科恩后，在給藥β-拉帕科恩的第56天將動物剖腹，并在生殖腺脂肪組織上實施圍脂滴蛋白染色法。如從圖17可見的，脂細胞的大小顯著降低。
圖18說明在每天向DIO C57BL/6小鼠經(jīng)口服途徑給藥50mg/kg劑量的β-拉帕科恩后，分別在第3、7、14、28和56天采集的血液中，甘油三酸酯、游離脂肪酸、葡萄糖、胰島素、TNFα、抵抗素和瘦素水平的變化。如從其中可見的，血脂和血糖水平顯著改進，并且另外，胰島素抗性和瘦素抗性也改進了。另外，導(dǎo)致胰島素抗性的抵抗素的血液水平也被顯著改進了。從這些結(jié)果預(yù)計β-拉帕科恩對于治療脂肪肝、高脂血癥、2型糖尿病和胰島素抗性將是高度有效的。
參見圖19，在每天向DIO C57BL/6小鼠經(jīng)口服途徑給藥50mg/kg劑量的β-拉帕科恩后，在給藥的第56天進行褐色脂肪組織的H&E染色法。如從圖19可見的，脂細胞的大小顯著降低。
圖20說明在每天向DIO C57BL/6小鼠經(jīng)口服途徑給藥50mg/kg劑量的β-拉帕科恩后，在給藥的第56天取得的褐色脂肪組織的EM檢驗的結(jié)果。如從其中可見的，脂細胞的大小顯著降低。
實驗例14通過給藥β-拉帕科恩的瘦素受體缺乏(ob/ob)小鼠中的變化 圖21說明根據(jù)每天向瘦素受體缺乏(ob/ob)小鼠經(jīng)口服途徑給藥150或200mg/kg劑量的β-拉帕科恩，在飲食攝取/體重(圖21A)的變化和體重(圖21B)的變化。飲食攝取/體重在給藥10天附近顯著降低，并且之后飲食攝取水平恢復(fù)到類似于對照組的水平。這是因為盡管攝取類似的飲食，脂肪降解被促進并因此產(chǎn)生足夠量的能量。另外，即使小鼠被喂養(yǎng)高脂肪食物，與對照組相比，動物仍顯示連續(xù)體重降低持續(xù)56天。這些結(jié)果說明給藥β-拉帕科恩在瘦素受體缺乏(ob/ob)小鼠中以及在肥胖小鼠中有效降低體重。為了檢驗在肝臟組織中的脂肪蓄積，在給藥β-拉帕科恩后56天將動物剖腹，并實施H&E染色(圖21C)和EM檢驗(圖21D)。圖21C說明通過在肝組織上的H&E染色結(jié)果，與對照組相比幾乎所有的脂肪液泡消失。這些結(jié)果說明預(yù)計給藥β-拉帕科恩對于治療在瘦素受體缺乏(ob/ob)小鼠中治療脂肪肝將也是高度有效的。從圖21D可知，在肝組織上的EM檢測的結(jié)果說明，與對照組比較，顯著降低了脂肪液泡和肝糖儲藏，正常線粒體形狀的恢復(fù)，線粒體數(shù)量顯著增加，和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)改進的形狀。從圖21E中可知，在動物四肢的肌肉組織上的EM檢驗的結(jié)果說明，與在對照組中顯示的線粒體的奇特形態(tài)相比，在治療組中正常線粒體形狀恢復(fù)，并且線粒體的數(shù)量顯著增加。
實驗例15β-拉帕科恩對自發(fā)性活動力的作用 將β-拉帕科恩向DIO C57BL/6小鼠給藥，并在3小時后，利用Versa MAX Activity Monitors & Analyzer(AccuSan Instruments，Columbus，OH)測量自發(fā)性活動力。用于測量動物運動的監(jiān)控器為41cm×41cm的在分別沿著x和y軸2.5cm間隔下裝備有紅外射線Plexiglas腔(高30cm)，從而16條掃描線分別安排在所述腔的前/后和右/左側(cè)。為了區(qū)別自發(fā)性活動和刻板/理毛行為，通過采用由小鼠導(dǎo)致的兩種不同掃描線的連續(xù)干擾作為有效測定標準來測量動物的行為。將β-拉帕科恩給藥組、媒介物給藥組和對照組分別放置在每個測量設(shè)備內(nèi)，并測量動物的行動和運動7小時，為了使動物適應(yīng)新環(huán)境，將小鼠在測量前放置在所述設(shè)備中2小時。如在圖22中所示，媒介物給藥組和對照組顯示出它們之間基本沒有差異，但β-拉帕科恩給藥組顯示出在動物的動作和運動行為方面顯著不同。
實驗例16β-拉帕科恩對體能持力的增強的作用 本實施例意于通過游泳測試測量小鼠的體能持力的不同。為此，將水放在具有直徑為9.5cm和高為25cm的圓柱槽中，并將β-拉帕科恩向DIO C57BL/6小鼠給藥。3小時后，將樣品給藥組和對照組同時放入每個圓柱槽中用于測量，并比較每組的體能持力。如圖23所示，據(jù)證實β-拉帕科恩給藥組顯示出與對照相比，通過單獨給藥β-拉帕科恩，游泳持續(xù)時間長2倍。
實驗例17β-拉帕科恩對呼吸商(RQ)的作用 本實施例意于通過測量呼吸商(RQ)檢驗β-拉帕科恩對脂肪代謝的作用。利用氧基掃描開路鍵接量熱儀(AccuScan Instruments，Columbus，OH)測量氧的消耗和二氧化碳的生成。該裝置由封閉的丙烯酸腔(21×21×21cm)組成。將新鮮空氣在1500ml/min的速率下吸入到每個腔中，然后使O2和CO2通過檢測器。以ml/kg體重/分鐘記錄所述空氣的濃度。以產(chǎn)生的CO2的體積(VCO2)除以消耗的O2的體積(VO2)的值計算RQ。將β-拉帕科恩給藥組、媒介物給藥組和對照組放在每個設(shè)備中，并測量RQ 7小時。為了使動物適應(yīng)新環(huán)境，將小鼠在測量前放置在所述設(shè)備中2小時。如圖24所示，如此測量的結(jié)果證實β-拉帕科恩給藥組顯示出在與媒介物給藥組和對照組相比RQ值方面的顯著性差異。
實驗例18急性毒性測試 1.口服給藥 將重量為250±7g(Jung-Ang Lab Animal Inc.，Seoul，Korea)的Sprague-Dawley大鼠分成4組，每組10只動物，并分別在50、100和200mg/kg的劑量口服給藥本發(fā)明的化合物1、2、3、4、12、13、14、16、17、24、25和26。口服給藥后，觀察是否顯示毒性2星期，在所有四組中沒有動物死亡，并且沒有癥狀可被目測出，除了與對照組相比觀察到重量降低。
2.腹腔給藥 將重量為255±6g(Jung-Ang Lab Animal Inc.，Seoul，Korea)的Sprague-Dawley大鼠分成4組，每組10只動物，并分別在50、100和200mg/kg的劑量腹腔給藥本發(fā)明的化合物1、2、3、4、12、13、14、16、17、24、25和26。腹腔給藥后，觀察是否顯示毒性2星期，在所有四組中沒有動物死亡，并且沒有癥狀可被目測出，除了與對照組相比觀察到重量降低。
從上述結(jié)果可證實，本發(fā)明的化合物沒有急性毒性。
下文中，將描述本發(fā)明的藥物組合物的制劑實施例及其對化妝品的應(yīng)用實施例。這些提供的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍和主旨。
制劑實施例1片劑制劑 化合物1-------------------------------20g 乳清蛋白------------------------------820g 結(jié)晶纖維素----------------------------140g 硬脂酸鎂------------------------------10g 羥丙基甲基纖維素----------------------10g 制劑實施例2粉末制劑 化合物1-------------------------------2g 大豆蛋白------------------------------58g 羧基纖維素----------------------------40g 總計----------------------------------100g 制劑實施例3本發(fā)明化合物對化妝品洗劑的應(yīng)用 1，3-丁二醇---------------------------5％ 甘油----------------------------------5％ EDTA-2Na-----------------------------0.02％ 三甲基甘氨酸-------------------------2.0％ 鯨蠟醇-------------------------------1.0％ 甘油基單硬脂酸酯乳化劑---------------1.0％ 聚山梨醇酯60-------------------------1.2％ 倍半油酸山梨坦-----------------------0.3％ 2-乙基-己酸鯨蠟酯--------------------4.0％ 角鯊?fù)?------------------------------5.0％ 二甲聚硅氧烷-------------------------0.3％ 硬脂酸甘油酯-------------------------0.5％ 卡波姆-------------------------------0.15％ 三乙醇胺-----------------------------0.5％ 咪唑烷基脲---------------------------0.2％ 化合物1------------------------------0.2％ 純水---------------------------------73.6％ 制劑實施例4本發(fā)明化合物對化妝品皮膚護理的應(yīng)用 1，3-丁二醇--------------------------4.0％ 二丙二醇-----------------------------5.0％ EDTA-2Na-----------------------------0.02％ 辛基十二烷醇聚醚-16------------------0.3％ PEG60氫化蓖麻油----------------------0.25％ 化合物1------------------------------0.03％ 純水---------------------------------90％ 工業(yè)實用型 從上述內(nèi)容可知，預(yù)計本發(fā)明的化合物為調(diào)節(jié)多種基因和蛋白質(zhì)活性的化合物，并因此對于通過在體內(nèi)調(diào)節(jié)能量水平治療多種疾病和紊亂將是治療有效的。利用上述化合物作為活性成分的藥物顯示出在治療和/或預(yù)防多種疾病，例如肥胖癥、糖尿病、代謝綜合癥、變性疾病和與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病方面的優(yōu)異作用。
盡管本發(fā)明的優(yōu)選實施方式已經(jīng)公開用于說明的目的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚的是多種修改、添加和取代是可能的，而不會背離如公開在所附權(quán)利要求中的本發(fā)明的范圍和主旨。
權(quán)利要求
1.用于治療和預(yù)防疾病綜合癥的藥物組合物，其包含
(a)治療有效量的由式I表示的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、前藥、溶劑合物或異構(gòu)體
其中
R1和R2各自獨立地為氫、鹵素、烷氧基、羥基或具有1至6個碳原子的低級烷基；
R3、R4、R5、R6、R7和R8各自獨立地為氫、羥基、C1-C20烷基、烯或烷氧基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基，或者R3至R8中的兩個取代基可以連接在一起形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；和
n為0或1，附加條件是當n為0時，與n鄰近的碳原子通過直接的鍵形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；和
(b)藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，或其任何組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中式I的化合物選自式II和III的化合物
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8為如在式I中所定義的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中每個R1和R2為氫。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中式II的化合物為其中R1、R2和R4獨立地為氫的式IIa的化合物，或其中R1、R2和R6獨立地為氫的式IIb的化合物
5.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中式III的化合物為其中R1、R2、R5、R6、R7和R8獨立地為氫的式IIIa的化合物
6.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述的疾病綜合癥包括肥胖、糖尿病、代謝綜合癥、變性疾病和與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中所述的代謝綜合癥為肥胖、肥胖并發(fā)癥、肝病、動脈硬化、大腦卒中、心肌梗塞、心血管病、缺血性疾病、糖尿病、與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥或炎性疾病。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所述的與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥為高脂血癥、高血壓、視網(wǎng)膜病或腎衰竭。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的式I的化合物在制備用于治療或預(yù)防疾病綜合癥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療和預(yù)防肥胖、糖尿病、代謝綜合癥、變性疾病和與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病的藥物組合物，其包含治療有效量的由下式I表示的化合物，或其藥學(xué)可接受的鹽、前藥、溶劑合物或異構(gòu)體，和藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，或其任意組合。
文檔編號A61P3/04GK101119726SQ200680004859
公開日2008年2月6日 申請日期2006年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月16日
發(fā)明者柳相國, 樸明奎, 趙仁根, 郭泰煥 申請人:Md白奧阿爾法有限公司, 韓國煙草人參公事