專利名稱：：腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及針對腦膜炎奈瑟球菌(A^^eWame"/"g"/^y)的疫苗。具體地說，本發(fā)明涉及基于偶聯(lián)的(conjugated)多種腦膜炎球菌血清群的莢膜糖的疫苗。
背景技術(shù)：
：基于生物的莢膜多糖，已經(jīng)鑒定到12種腦膜炎奈瑟球菌(Wme"/"g/^fo)血清群(A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。血清群A是非洲薩哈拉以南地區(qū)流行性疾病最常見的病原體。血清群B和C引起美國和大多數(shù)發(fā)達國家的大多數(shù)病例。血清群W135和Y引起美國和發(fā)達國家的其它病例。多年前就已經(jīng)知道由血清群A、C、Y和W135的莢膜多糖制成的四價疫苗[1，2]。盡管這種疫苗對于青少年和承認有效，但由于多糖是不依賴于T細胞的抗原，其誘導(dǎo)的弱免疫應(yīng)答不能加強，因此它誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答弱、保護時間短，不能用于嬰兒[例如參考文獻3]。這種疫苗中的多糖不是偶聯(lián)的[4]。血清群C的偶聯(lián)疫苗已批準用于人類，其中包括Menjugate[5]、Meningitec和NeisVac-CTM。血清群A+C的偶聯(lián)物(conjugate)的混合物是已知的[6-8]，且血清群A+C+W135+Y的偶聯(lián)物的混合物也已經(jīng)報道[9-13]。盡管腦膜炎球菌偶聯(lián)物是熟知的，但它們還不適用于兒科免疫接種計劃，發(fā)達國家的兒科免疫接種計劃通常包括出生時接種乙肝疫苗；從2個月時開始接種白喉/破傷風(fēng)/百日咳(D-T-P)疫苗、b型流感嗜血桿菌(/Z./My7"enzaetypeb)(Hib)偶聯(lián)物、滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒和肺炎球菌偶聯(lián)物。然而，當(dāng)將偶聯(lián)的疫苗加入現(xiàn)有免疫接種計劃時，必需解決載體誘導(dǎo)的表位抑制(或者通常稱為"載體抑制")，尤其是載體初免(priming)造成的抑制。"載體抑制"是一種由于用載體蛋白預(yù)先免疫動物從而阻止隨后引起針對該載體上呈遞的新抗原表位的免疫應(yīng)答而造成的現(xiàn)象[M]。如參考文獻15所述，一些疫苗抗原含有相同的蛋白質(zhì)組分(用作免疫原和/或用作偶聯(lián)物中的載體蛋白)，因此那些抗原之間可能會發(fā)生干擾。在參考文獻15中，報道了對偶聯(lián)破傷風(fēng)類毒素(Tt)載體的某抗原的免疫應(yīng)答受到先前存在的對Tt的免疫力的抑制。參考文獻16報道了D-T-P疫苗與Hib偶聯(lián)疫苗的組合有何不利影響，因為Hib偶聯(lián)物的載體與D-T-P疫苗的破傷風(fēng)抗原是相同的。作者總結(jié)出，當(dāng)引入包含多種偶聯(lián)物的疫苗時應(yīng)考慮這種由于通用蛋白質(zhì)載體的干擾而造成的"載體抑制"現(xiàn)象。與參考文獻15和16不同，參考文獻17報道了用破傷風(fēng)類毒素初免不會對針對隨后給予的Hib-Tt偶聯(lián)物的免疫應(yīng)答造成負面影響，但在帶有從母體獲得的抗-Tt抗體的患者中觀察到抑制現(xiàn)象。然而在參考文獻18中報道了由于接種破傷風(fēng)疫苗而已經(jīng)具有抗-Tt抗體的患者中的基于Tt的肽偶聯(lián)物的"表位抑制"效應(yīng)。在參考文獻19中提到，以CRM197(白喉毒素的一種解毒突變體)作為載體的偶聯(lián)物對于之前未接受白喉毒素作為疫苗一部分(例如作為D-T-P或D-T疫苗的一部分)的兒童可能無效。參考文獻20繼續(xù)了該工作，在隨后用Hib偶聯(lián)物免疫時繼續(xù)觀察到D-T免疫接種造成的載體初免效應(yīng)。在參考文獻21中，作者發(fā)現(xiàn)用白喉或破傷風(fēng)類毒素載體蛋白預(yù)先免疫降低了隨后用與那些載體偶聯(lián)的Hib莢膜糖免疫接種后抗-Hib抗體水平的升高，但對IgGl和IgG2的影響照舊。對偶聯(lián)物載體部分的反應(yīng)也被抑制。此外，觀察到更加常見的非表位特異性抑制，即用一種偶聯(lián)物預(yù)先免疫似乎會影響針對4周后給予的第二種偶聯(lián)物的載體和糖部分的免疫應(yīng)答。參考文獻22報道了在一種多價肺炎球菌偶聯(lián)疫苗中采用不同載體蛋白，其中采用多種載體是為了避免載體抑制。作者預(yù)測，多價偶聯(lián)疫苗中的最大載體蛋白負荷可使機體產(chǎn)生耐受而不會引起負面干擾。參考文獻23報道，含有混合載體蛋白的肺炎球菌偶聯(lián)疫苗在引起抗-肺炎球菌應(yīng)答反應(yīng)的同時也不經(jīng)意地增強了對載體的應(yīng)答反應(yīng)。參考文獻24研究了是否可與單價腦膜炎球菌血清群C偶聯(lián)物一起給予白喉和破傷風(fēng)(類毒素)加強免疫，發(fā)現(xiàn)當(dāng)載體是破傷風(fēng)類毒素載體且患者之前已用含破傷風(fēng)類毒素的疫苗免疫過時，產(chǎn)生的對腦膜炎球菌偶聯(lián)物的效價降低。最后，參考文獻25報道稱，"之前接觸載體蛋白能增強或抑制抗體對以糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物形式給予的多糖的反應(yīng)"。參考文獻25所用的偶聯(lián)物采用破傷風(fēng)類毒素或CRM197突變體作為載體蛋白。與載體初免和/或抑制有關(guān)的情況使人非常困惑，還不清楚任何具體的偶聯(lián)物是否將受到載體抑制的影響或?qū)⑹芤嬗谳d體初免而增強。除非這一問題得到解決，否則腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗將不會被納入或加入現(xiàn)有兒童免疫計劃中。此外，由于給予的腦膜炎球菌偶聯(lián)物為四價混合物(即四種不同偶聯(lián)物)，因此載體抑制的可能性更加危險。除了載體初免對糖類偶聯(lián)物的免疫應(yīng)答有負面影響問題外，也可能發(fā)生相反的情況，即用偶聯(lián)物免疫接種可能會對載體的免疫應(yīng)答產(chǎn)生負面影響[26]。
發(fā)明內(nèi)容參考文獻27提到，用一種以上類型的載體蛋白應(yīng)該可以解決腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗的載體抑制問題。具體地說，參考文獻27提到，流感嗜血桿菌蛋白D應(yīng)用作腦膜炎球菌偶聯(lián)物的載體蛋白，同時也可使用破傷風(fēng)類毒素(Tt)。為避免表位抑制，蛋白D也是參考文獻28的備選載體。類似地，參考文獻29提到，百日咳桿菌(^^^&/&pw化^的的菌毛應(yīng)用作載體以避免多價偶聯(lián)疫苗的載體抑制。相反，本發(fā)明采用破傷風(fēng)類毒素(Tt)作為混合的腦膜炎球菌糖類偶聯(lián)物的載體。此外，參考文獻27還建議應(yīng)與D-T-P-Hib疫苗同時給予腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗(例如見實施例3)，從而就沒有先接觸腦膜炎球菌偶聯(lián)物的載體蛋白的問題。相反，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，即便患者已經(jīng)接受載體蛋白，其形式為之前的免疫原(例如在D-T-P或D-T免疫接種中)或之前的載體蛋白(例如在Hib偶聯(lián)物或肺炎球菌偶聯(lián)疫苗中)，仍舊可以給予該患者腦膜炎球菌偶聯(lián)物。之前對單價血清群C偶聯(lián)疫苗進行的載體誘導(dǎo)的表位抑制研究[24]不關(guān)心任何之前給予的偶聯(lián)物的影響。如同與參考文獻27相反的那樣，即使患者已接受了不同的偶聯(lián)物，仍能產(chǎn)生對腦膜炎球菌偶聯(lián)物的免疫應(yīng)答，這與參考文獻21相反。因此，本發(fā)明提供了一種免疫患者以抵抗腦膜炎奈瑟球菌造成的疾病的方法，該方法包括給予所述患者一種含有(a)、(b)、(c)和(d)中至少兩種物質(zhì)的組合物的步驟(a)(i)血清群A腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖和(ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物;(b)(i)血清群C腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖和(ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物；(c)(i)血清群W135腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖和(ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物；以及(d)(i)血清群Y腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖和(ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物，其中，所述患者己經(jīng)用(a)和/或(b)預(yù)先免疫過(a)破傷風(fēng)類毒素；(b)(i)除腦膜炎奈瑟球菌外的生物的莢膜糖和(ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了(a)、(b)、(c)和(d)中至少兩種物質(zhì)在制造用于免疫人類患者以抵抗腦膜炎奈瑟球菌造成的疾病的藥物中的的應(yīng)用(a)(i)血清群A腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖和(ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物；(b)(i)血清群C腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖和(ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物；(c)(i)血清群W135腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖和(ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物；以及(d)(i)血清群Y腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖和(ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物，其中，所述患者已經(jīng)用(a)和/或(b)預(yù)先免疫過(a)破傷風(fēng)類毒素；(b)(i)除腦膜炎奈瑟球菌外的生物的莢膜糖和(ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物。腦膜炎球菌引起的疾病通常是腦膜炎，更通常是細菌性腦膜炎，最通常是腦膜炎球菌性腦膜炎。因此，本發(fā)明可用于保護抵抗造成腦膜炎的腦膜炎球菌感染?？v^度艦薪孝要免疫的患者已經(jīng)用(a)和/或(b)預(yù)先免疫過(a)破傷風(fēng)類毒素；(b)(i)除腦膜炎奈瑟球菌外的生物的莢膜糖和(ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物。典型的預(yù)先免疫將通常包括破傷風(fēng)類毒素抗原；采用破傷風(fēng)類毒素載體的Hib莢膜糖偶聯(lián)物；和/或采用破傷風(fēng)類毒素載體的肺炎球菌莢膜糖偶聯(lián)物?；颊邔⒁呀?jīng)接受至少1次(例如1、2、3次或更多次)劑量的預(yù)先免疫抗原，且該劑量(或多次劑量中最早的一次)已在用本發(fā)明的腦膜炎球菌偶聯(lián)物免疫前至少6(例如6、9、12、15、18、21、24、36、48、60、120、180、240、300或更多)個月時給予。在優(yōu)選的患者組中，預(yù)先免疫在出生后3年內(nèi)進行，例如在出生后2年內(nèi)、出生后1年內(nèi)、出生后6個月內(nèi)、或者甚至出生后3個月內(nèi)、2個月內(nèi)或1個月內(nèi)。要用本發(fā)明免疫的患者通常是人。人的年齡通常為至少1個月，例如至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少6個月、至少2歲、至少5歲、至少11歲、至少17歲、至少40歲、至少55歲，等等，患者宜為至少6個月大。另一組優(yōu)選的患者年齡為2-55歲，另一組優(yōu)選的患者年齡為11-55歲。再一組優(yōu)選的患者年齡為小于11歲，例如2-ll歲。然而在所有情況中，無論年齡如何，患者將已經(jīng)如上所述預(yù)先免疫過?；颊邔⑼ǔＲ呀?jīng)接受過破傷風(fēng)類毒素，如D-T-P或D-T預(yù)先免疫接種中的'T，抗原。這種免疫接種通常被給予2、3和4個月的新生兒。當(dāng)免疫接種包括百日咳疫苗時，該疫苗可以是全細胞或細胞百日咳疫苗("Pw")，但優(yōu)選非細胞百日咳疫苗("Pa")。預(yù)先免疫接種Pa疫苗將通常包括l、2或3種以下熟知并充分表征的百曰咳桿菌(5./7eWw^W抗原(1)百日咳類毒素('PT')，通過化學(xué)方法或通過定點誘變解毒，如'9K/129G，突變體[30];(2)絲狀血凝素('FHA，);(3)黏附素(pertactin)(也稱為'69kDa外膜蛋白')。非細胞百日咳疫苗也可包含凝集原2和/或凝集原3。D-T-P預(yù)先免疫接種中的'D'抗原通常是白喉類毒素。患者也可接受或者已經(jīng)接受破傷風(fēng)類毒素作為蛋白質(zhì)-糖類偶聯(lián)物的載體蛋白。這種偶聯(lián)物包括'PRP-T，Hib偶聯(lián)物[見參考文獻31的表14-7]，例如ActHffiTM、OmniHIBTM和HIBERIXTM產(chǎn)品?；颊咭部杉航?jīng)用血清群C腦膜炎球菌('MenC，)偶聯(lián)物預(yù)先免疫過。采用破傷風(fēng)類毒素載體的MenC偶聯(lián)物包括NeisVac-CTM產(chǎn)品。然而優(yōu)選用Hib和/或肺炎球菌偶聯(lián)物而不用MenC偶聯(lián)物預(yù)先免疫患者。如果已用MenC偶聯(lián)物預(yù)先免疫患者，則根據(jù)本發(fā)明給予的疫苗可以包含或不含血清群C偶聯(lián)物。當(dāng)用偶聯(lián)的抗原預(yù)先免疫時，由于偶聯(lián)物有低水平污染(例如偶聯(lián)物在儲藏期間發(fā)生水解)，患者將不可避免地也接受少量游離的破傷風(fēng)類毒素，當(dāng)這種較小的量通常不足以提供顯著的免疫應(yīng)答。破傷風(fēng)類毒素是一種熟知并充分表征的蛋白質(zhì)[例如見參考文獻31的第13章]，可通過將破傷風(fēng)梭菌(C/o^W騰Wam')產(chǎn)生的內(nèi)肽酶('破傷風(fēng)毒素，)滅活得到?？蓪@種毒素進行處理以得到不再具有毒性但保留了抗原性因此能夠在注射后刺激產(chǎn)生特定的抗-毒素抗體的類毒素。優(yōu)選的破傷風(fēng)類毒素是通過甲醛處理制得的。可使破傷風(fēng)梭菌(Cfe似m')在生長培養(yǎng)基(例如衍生自牛酪蛋白的Latham培養(yǎng)基)中生長，然后通過甲醛處理、超濾和沉淀以獲得破傷風(fēng)類毒素。然后用包括無菌過濾和/或透析的方法處理該材料。術(shù)語'破傷風(fēng)類毒素'在文中包括保留了與破傷風(fēng)毒素的免疫交叉反應(yīng)性的破傷風(fēng)類毒素的衍生物。預(yù)先免疫的結(jié)果為，患者的免疫系統(tǒng)已經(jīng)接觸過預(yù)先免疫抗原。這通常意味著患者的抗-Tt抗體反應(yīng)將升高(抗-Tt效價通常將大于0.01IU/ml)并將產(chǎn)生特異于Tt的記憶B細胞和/或T淋巴細胞，即預(yù)先免疫通常足以在患者中引起記憶性抗-Tt免疫應(yīng)答。當(dāng)用Tt作為偶聯(lián)物中糖類的載體進行預(yù)先免疫時，預(yù)先免疫將提高抗-糖類反應(yīng)，同時患者將產(chǎn)生特異于糖類的記憶B細胞和/或T淋巴細胞，即預(yù)先免疫通常足以在患者中引起記憶性抗-糖類免疫應(yīng)答。預(yù)先免疫宜足以在患者中引起例如分別針對破傷風(fēng)或針對含有糖類的生物的保護性免疫力。因此，要按照本發(fā)明免疫的患者將不同于普通患者，他們屬于一小類免疫系統(tǒng)中已產(chǎn)生對預(yù)先免疫抗原的免疫應(yīng)答的普通人群中的一元，因此，按照本發(fā)明用含有破傷風(fēng)類毒素載體的腦膜炎球菌偶聯(lián)物免疫接種將在這一小類人群中產(chǎn)生與之前未產(chǎn)生對預(yù)先免疫抗原的免疫應(yīng)答的患者不同的免疫應(yīng)答。優(yōu)選用Tt作為偶聯(lián)物(尤其是Hib偶聯(lián)物)的載體預(yù)先免疫患者。特別優(yōu)選用Tt作為偶聯(lián)物的載體同時以Tt作為未偶聯(lián)的免疫原預(yù)先免疫患者。除了可以用偶聯(lián)或非偶聯(lián)形式的破傷風(fēng)類毒素預(yù)先免疫，患者也可用其它抗原預(yù)先免疫。這種抗原包括但不限于百日咳抗原一見上文；白喉類毒素一見上文；B型流感嗜血桿菌(//aemo;7/^//M/"y7Me"zaetypeB)—見上文；乙肝表面抗原(HBsAg);脊髓灰質(zhì)炎病毒，如滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(IPV);肺炎鏈球菌(5^印tococc^;"ewmom'fle)—見上文；流感病毒；BCG;甲肝病毒抗原；麻疹病毒；腮腺炎病毒；風(fēng)疹病毒；水痘病毒；等等?；颊呖梢杂没虿挥靡环N或多種腦膜炎球菌偶聯(lián)物預(yù)先免疫。在一些優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)患者第一次接受腦膜炎球菌偶聯(lián)物時，他們已經(jīng)用Tt預(yù)先免疫過。在其它實施方案中，腦膜炎球菌偶聯(lián)物被給予已經(jīng)用(i)Tt和(ii)腦膜炎球菌偶聯(lián)物預(yù)先免疫過的患者。錄微本發(fā)明用偶聯(lián)的糖類免疫患者。偶聯(lián)被用來增強糖類的免疫原性，因為偶聯(lián)可以將不依賴于T細胞的抗原轉(zhuǎn)變成依賴于T細胞的抗原，從而使初免后產(chǎn)生免疫記憶力。偶聯(lián)尤其適用于兒科疫苗[例如參考文獻32]并且是一種熟知的技術(shù)[例如見參考文獻33-41]。用于本發(fā)明的組合物含有至少兩種腦膜炎球菌偶聯(lián)物，其中所述各偶聯(lián)物含有破傷風(fēng)類毒素(或其衍生物)載體蛋白以及莢膜糖。所述莢膜糖選自腦膜炎球菌血清群A、C、W135和Y，從而該組合物包含2種、3種或所有4種血清群的糖類。具體的組合物包含來自以下血清群的糖類血清群A和C;血清群A和W135;血清群A和Y;血清群C和W135;血清群C和Y;血清群W135和Y;血清群A和C和W135;血清群A和C和Y;血清群A和W135和Y;血清群C和W135和Y;血清群A和C和W135和Y。最優(yōu)選含有所有4種血清群的糖類的組合物。這4種血清群中每一種的莢膜糖已經(jīng)充分表征。血清群A腦膜炎球菌的莢膜糖是(al—6)-連接的N-乙酰-D-甘露糖胺-l-磷酸的均聚物，在C3和C4位有部分被O-乙?；Ｒ阴；捎梅忾]基團取代以防止水解[42]，且這種修飾的糖類仍舊是本發(fā)明意義內(nèi)的血清群A糖類。血清群C莢膜糖是(a2—9)-連接的唾液酸(N-乙酰神經(jīng)氨酸或'NeuNAc')的均聚物。大多數(shù)血清群C菌株在唾液酸殘基的C-7和/或C-8上有a乙?；?，但約15%的臨床分離物缺乏這些0-乙?；鵞43,44]。這種糖的結(jié)構(gòu)被寫成—9)-NeupNAc7/8OAc-(a2—。血清群W135糖類是唾液酸-半乳糖二糖單元的聚合物。與血清群C糖類一樣，它具有可變的O-乙酰化作用，但乙酰化出現(xiàn)在唾液酸的7和9位上[45]。其結(jié)構(gòu)可寫成一4)-D-Neup5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Gal-a-(l—。血清群Y的糖類似于血清群W135的糖，但二糖重復(fù)單元含有葡萄糖而不是半乳糖。與血清群W135—樣，它在唾液酸的7和9位具有可變的0-乙酰化作用[45]。血清群Y糖類的結(jié)構(gòu)可寫成一4)-D-Neu;5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Glc-a-(l—。用于本發(fā)明的糖類可以是上述O-乙酰化的糖(例如與天然莢膜糖具有相同的O-乙?；Ｊ?，或者它們可以在糖環(huán)的一個或多個位置被部分或完全脫-O-乙酰化，或者它們可以相對于天然莢膜糖被超-O-乙?；Ｓ糜诒景l(fā)明的糖類優(yōu)選短于在細菌中發(fā)現(xiàn)的天然莢膜糖。因此糖類優(yōu)選被解聚，且解聚發(fā)生在純化之后偶聯(lián)之前。解聚降低了糖類的鏈長。優(yōu)選的解聚方法包括使用過氧化氫[9]。將過氧化氫加入糖中(例如使H202的最終濃度為1%)，然后孵育混合物(例如在約55"C)直到鏈長度達到所需的縮短。另一種解聚方法涉及酸水解[IO]。其它解聚方法是精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。用來制備用于本發(fā)明的偶聯(lián)物的糖類可用這些解聚方法中的任何一種獲得。解聚可用來提供最佳鏈長以得到最佳免疫原性和/或用來縮短鏈長以在物理上便于處理糖類。用于偶聯(lián)物的典型的載體蛋白是細菌毒素或類毒素，如白喉毒素(或其CRM197突變體)和破傷風(fēng)毒素。其它載體多肽包括腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白、合成肽、熱激蛋白、百日咳蛋白、細胞因子、淋巴因子、激素、生長因子、含有各種病原體衍生抗原的多種人CD4+T細胞表位的人工蛋白、流感嗜血桿菌的D蛋白、肺炎球菌表面蛋白PspA、鐵攝取蛋白、艱難梭菌(C.^^c&)的毒素A或B等。然而根據(jù)本發(fā)明，腦膜炎球菌偶聯(lián)物包含破傷風(fēng)類毒素載體蛋白。優(yōu)選共價偶聯(lián)。組合物中可采用一種以上的載體蛋白。因此不同的載體蛋白可用于不同的血清群，例如血清群A的糖類可偶聯(lián)到Tt，而血清群C的糖類可偶聯(lián)到Dt。特定的糖類抗原也可采用一種以上的載體蛋白，例如血清群A的糖類可采用兩種，其中一些偶聯(lián)到Tt而其余的偶聯(lián)到Dt。然而通常，組合物中的所有腦膜炎球菌糖類優(yōu)選采用相同的載體蛋白，更優(yōu)選所有的糖類(即包括可能存在的任何非-腦膜炎球菌偶聯(lián)物)都采用相同的載體蛋白。優(yōu)選本發(fā)明的組合物不含任何白喉類毒素載體蛋白。一個載體蛋白可攜帶一種以上的糖類抗原[46]。例如，一個載體蛋白可偶聯(lián)到來自血清群A和C的糖類。為實現(xiàn)該目的，在偶聯(lián)反應(yīng)之前可將糖類混合。然而通常優(yōu)選各血清群有單獨的偶聯(lián)物。優(yōu)選將各偶聯(lián)物以基本上1:1:1:1的比例混合(以糖類質(zhì)量測量)，例如，各血清群糖類之間的質(zhì)量差異在±10%之內(nèi)。組合物中各血清群的腦膜炎球菌抗原的典型含量為l-20)ig，例如各血清群2-10pg，或約4ng。除了1:1:1:1的比例，血清群A的劑量也可以加倍(2:1丄1)。偶聯(lián)物中糖類:蛋白質(zhì)的比例(w/w)在1:15(即蛋白質(zhì)過量)和15:1(即糖類過量)之間，優(yōu)選在1:10和10:1之間，更優(yōu)選在1:5和5:1之間。優(yōu)選載體蛋白過量。優(yōu)選糖類:蛋白質(zhì)之比約為1:12或約1:6或約1:3的偶聯(lián)物。偶聯(lián)物可與游離載體蛋白聯(lián)合使用[47]。然而，當(dāng)特定載體蛋白以游離形式或偶聯(lián)形式出現(xiàn)在本發(fā)明的組合物中時，未偶聯(lián)的形式優(yōu)選不超過組合物中載體蛋白總量的5%，更優(yōu)選不超過2%重量。類似地，未偶聯(lián)的糖類優(yōu)選不超過糖類總重量的15%?？刹捎萌魏魏线m的偶聯(lián)反應(yīng)，需要時可采用任何合適的接頭。偶聯(lián)之前糖類通常應(yīng)活化或功能化?；罨梢陨婕?，例如氰化試劑，如CDAP(例如1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎵四氟硼酸鹽)[48、49等]。其他合適的技術(shù)使用碳二亞胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、對-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU(也可參見參考文獻39的介紹)?？刹捎萌魏我阎椒?，例如參考文獻50和51中所描述的方法經(jīng)接頭基團進行連接。一種類型的連接涉及多糖的還原氨化，獲得的氨基與己二酸接頭基團的一端偶聯(lián)，隨后將己二酸接頭基團的另一端與一種蛋白質(zhì)偶聯(lián)[37、52、53]。其他接頭包括B-丙酰胺[54]、硝基苯-乙胺[55]、鹵?；u(haloacylhalide)[56]、糖苷接頭[57]、6-氨基己酸[58]、ADH[59]、C4到。12部分[60]等等。作為使用接頭的另一種選擇，可以采用直接連接。與蛋白質(zhì)的直接連接可以包括氧化多糖，隨后與該蛋白進行還原氨化，例如參考文獻61和62所述。優(yōu)選的方法包括在糖類中引入氨基基團(例如通過用-NH2取代末端二0基團)，隨后用己二酸二酯(例如己二酸N-羥基琥珀酰亞胺二酯)衍生化并與載體蛋白反應(yīng)。在一種優(yōu)選的偶聯(lián)方法中，使糖類與己二酸二酰肼反應(yīng)。對于血清群A，在該階段也可加入碳二亞胺。反應(yīng)之后加入氰基硼氫化鈉。然后例如通過超濾制備衍生的糖類。然后將衍生的糖類與載體蛋白(例如與破傷風(fēng)類毒素)混合并加入碳二亞胺。反應(yīng)之后可回收偶聯(lián)物。這種偶聯(lián)方法其它細節(jié)可見參考文獻10。可通過這種方法獲得的偶聯(lián)物是優(yōu)選用于本發(fā)明的偶聯(lián)物，例如含有破傷風(fēng)類毒素載體和己二酸接頭的偶聯(lián)物。優(yōu)選單獨制備偶聯(lián)物然后再混合?；旌现螅捎美鐭o菌無熱原的磷酸緩沖的生理鹽水調(diào)節(jié)混合的偶聯(lián)物的濃度。混合前，各偶聯(lián)物優(yōu)選含有不超過15)lg載體。給予本發(fā)明的腦膜炎球菌偶聯(lián)物的結(jié)果優(yōu)選為，對于給予的各種血清群，患者的血清殺菌抗體(SBA)反應(yīng)增強，同時SBA效價升高(與預(yù)先免疫過的患者接受混合的腦膜炎球菌偶聯(lián)物之前相比)至少4倍，優(yōu)選至少8倍。SBA檢驗是確定腦膜炎球菌保護作用的標準相關(guān)數(shù)(correlate)。有關(guān)腦膜炎球菌疫苗血清學(xué)相關(guān)數(shù)的其它細節(jié)見參考文獻63。^f本發(fā)欲游資^激游真&拔嚴遂分除了腦膜炎球菌偶聯(lián)物，用于本發(fā)明的組合物可任選含有1、2或3種以下其它抗原1.偶聯(lián)的肺炎鏈球菌(S./7"ewwom'ae)的莢膜糖[例如參考文獻31的第23章；參考文獻64-66]。優(yōu)選包含肺炎鏈球菌(S.;wewmom'^)多種血清型的糖類。例如，廣泛使用23種不同血清型的多糖混合物，諸如使用5到11種不同血清型多糖的偶聯(lián)疫苗[67]。例如，PrevNarTM[68]包含7種血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，每種糖類通過還原氨化與CRM197偶聯(lián)，每0.5毫升劑量含2ng各種糖類(4(ig的血清型6B)，偶聯(lián)物吸附在磷酸鋁佐劑上。當(dāng)用于本發(fā)明的組合物含有肺炎球菌偶聯(lián)物時，該組合物優(yōu)選至少包括血清型6B、14、19F和23F。2.偶聯(lián)的B型流感嗜血桿菌的莢膜糖[例如參考文獻31的第14章]。偶聯(lián)物的載體蛋白可以是破傷風(fēng)類毒素、CRM197、Dt或腦膜炎奈瑟球菌的外膜復(fù)合物。偶聯(lián)物的糖類部分可以是多糖(例如全長的磷酸聚核糖基核糖醇(PRP))，但優(yōu)選解聚莢膜多糖以形成寡糖(例如分子量約l-5kDa)。一種優(yōu)選的Hib偶聯(lián)物包括經(jīng)己二酸接頭與CRM197或Tt共價連接的寡糖[69、70]。給予Hib抗原優(yōu)選導(dǎo)致抗-PRP抗體濃度大于0.15ng/ml，更優(yōu)選大于l|ig/ml。當(dāng)組合物含有Hib糖類抗原時則優(yōu)選不再含有氫氧化鋁佐劑。如果組合物含有磷酸鋁佐劑則Hib抗原可被佐劑吸附[71]，或可不被吸附[27]。在混合抗原/佐劑時選擇正確的pH、選擇具有合適零電荷點的佐劑以及選擇在組合物中加入各種不同抗原的合適順序可以防止吸附[72]。3.腦膜炎奈瑟球菌血清群B的蛋白質(zhì)抗原[例如參考文獻73]。所述組合物可含有一種或多種這些其它抗原。這些抗原可以吸附或不吸附到鋁鹽上。如果以一系列劑量給予腦膜炎球菌偶聯(lián)物，則這些劑量中沒有一種、有一些或全部含有這些這些額外抗原。含有腦膜炎球菌偶聯(lián)物的組合物優(yōu)選不含白喉類毒素。它們優(yōu)選不含百日咳抗原。它們優(yōu)選不含乙肝病毒表面抗原。它們優(yōu)選不含脊髓灰質(zhì)炎病毒。組合物優(yōu)選含有每種腦膜炎球菌偶聯(lián)物不超過50pg破傷風(fēng)類毒素，且更優(yōu)選對于所有組合的腦膜炎球菌偶聯(lián)物不超過50昭破傷風(fēng)類毒素。資微，用于本發(fā)明的組合物將通常含有藥學(xué)上可接受的載體。這種載體包括任何本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體的載體。合適的載體可以是諸如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂質(zhì)聚合體(如油滴或脂質(zhì)體)等通常較大的、緩慢代謝的大分子。這種載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。所述疫苗也可含有稀釋劑，如水、鹽水、甘油等。此外也可存在諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等輔助物質(zhì)。典型的載體是無菌無熱原的磷酸緩沖的生理鹽水。藥學(xué)上可接受的載體及賦形劑的全面論述參見參考文獻74。用于本發(fā)明的組合物可含有抗菌劑，尤其是如果包裝成多劑量形式。用于本發(fā)明的組合物可含有吐溫類(聚山梨醇酯)去污劑，如吐溫80。去污劑通常以低水平存在，例如<0.01%。用于本發(fā)明的組合物可含有鈉鹽(例如氯化鈉和/或磷酸鈉)。鈉鹽可用于調(diào)節(jié)張力。NaCl的濃度為10±2mg/ml，例如約8.8mg/ml。磷酸鈉的濃度通常為1.2mg/ml。用于本發(fā)明的組合物將通常含有緩沖劑，如磷酸緩沖液。用于本發(fā)明的組合物可含有糖醇(例如甘露醇)或二糖(例如蔗糖或海藻糖)，例如約15-30mg/ml(例如25mg/ml)，尤其是如果要將它們凍干或者如果它們含有已經(jīng)從凍干材料重建的材料時。然而優(yōu)選的組合物不是凍干的，即所有腦膜炎球菌偶聯(lián)物從包裝階段到給藥階段都以液體形式存在。組合物將通常直接給予患者。直接遞送可以經(jīng)胃腸外注射實現(xiàn)(例如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或組織間隙注射)，或通過直腸、口服、陰道、局部、透皮、鼻內(nèi)、眼睛、耳部、肺部或其他粘膜給藥實現(xiàn)。優(yōu)選大腿或上臂肌內(nèi)給藥。注射可以通過注射針(例如皮下注射用針)，但或者可使用無針注射。典型的肌內(nèi)注射劑量是0.5ml。來自多種血清群的腦膜炎球菌偶聯(lián)物可混合成一種組合物給予。該組合物可以單劑量給予，或者可在多劑量方案中分一次以上給予。多次劑量可用于初次免疫接種方案和/或強化免疫接種方案。初次免疫之后可用腦膜炎球菌偶聯(lián)物加強免疫。可根據(jù)慣例確定初免劑量之間的時間間隔(例如4-16周)以及初免和加強免疫之間的時間間隔。通常可與其它疫苗同時給予偶聯(lián)物，如與D-T-P疫苗同時給予，或者與肺炎球菌偶聯(lián)疫苗同時給予，或者與流感疫苗同時給予，或者與MMR或MMRV疫苗同時給予。這些疫苗通常是單獨給予的，但在同一次就醫(yī)時給予。細菌感染影響身體的各個部位，因此本發(fā)明組合物可以各種形式制備。例如，該組合物可以制備成可注射的液體溶液或懸浮液。也可制備成適于在注射前溶解或懸浮在液體運載體中的固體形式(例如凍干的組合物)。該組合物可以制備為局部給藥，例如乳膏、油膏或粉末的形式。該組合物可以制備為口服給藥，例如藥片、膠囊或糖漿(任選進行調(diào)味)的形式。該組合物可以制備為肺部給藥，例如使用細微粉末或噴霧的吸入器的形式。該組合物可以制備為栓劑或陰道栓劑。該組合物可以為鼻、耳或眼睛給藥而制備成例如噴霧劑、滴劑、凝膠劑或粉末劑[例如參考文獻75和76]。然而通常，腦膜炎球菌偶聯(lián)物被制成供肌內(nèi)注射。用于本發(fā)明的組合物可以含有或不含疫苗佐劑?？捎糜诒景l(fā)明組合物的佐劑包括但不限于A#存,激廣游蘊合激適合用作本發(fā)明佐劑的含有礦物質(zhì)的組合物包括礦物鹽，例如鋁鹽和鈣鹽。本發(fā)明包括礦物鹽，例如氫氧化物(如過氧化物(oxyhydroxide))、磷酸鹽(如羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等[如參見參考文獻77的第8和9章]，或不同礦物質(zhì)化合物的混合物，這些化合物可采取任何合適的形式(如凝膠、晶體、無定形等)，優(yōu)選(具有)吸附性。含有礦物質(zhì)的組合物也可配配制為金屬鹽顆粒[78]。特別優(yōu)選磷酸鋁，典型的佐劑是P04/A1摩爾比在0.84和0.92之間的無定形羥基磷酸鋁，含量為0.6mgAl3+/ml?？捎玫蛣┝苛姿徜X吸附，例如每劑每偶聯(lián)物50-100figAl3+。當(dāng)組合物中含有一種以上偶聯(lián)物時，不需要吸附所有偶聯(lián)物。5.浙儲適合用作本發(fā)明佐劑的油乳劑組合物包括角鯊烯-水乳劑，例如MF59[參考文獻77的第10章；也可參見參考文獻79](利用微流化劑配制成亞微米顆粒的5%角鯊烯、0.5%吐溫80和0.5%司盤85)。也可用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。C.舒虔微參教腐77鄉(xiāng)"萄皂苷制劑也可用作本發(fā)明的佐劑。皂苷是在許多植物種類的樹皮、葉、莖、根、甚至花中發(fā)現(xiàn)的固醇糖苷和三萜系糖苷的異質(zhì)混合物(heterologousgroup)。皂樹(2w說a/"^o朋WflMolina)樹皮中的皂苷是廣泛研究的佐劑。皂苷也可購自麗花菝葜(5"脂7ax翻—(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、錐花絲石竹(G爐opM/ap畫.cwto")(婚紗花(bridesveil))和肥皂草OSa/o"flWac#c/a"a/&)(皂根(soaproot))。皂苷佐劑制劑包括純化的制劑，例如QS21，以及脂質(zhì)制劑，例如ISCOM。QS21的商品名為StimulonTM。也可利用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已經(jīng)鑒定了用這些技術(shù)特別純化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B禾卩QH-C。皂苷優(yōu)選QS21。參考文獻80公開了QS21的制備方法。皂苷制劑也可含有固醇，例如膽固醇[81]?？陕?lián)用皂苷和膽固醇來形成稱為免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)的獨特顆粒[參考文獻77的第23章]。ISCOM—般也含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM優(yōu)選含有一種或多種QuilA、QHA和QHC。參考文獻81-83進一步描述了ISCOM。ISCOM任選不含其它去污劑[84]。皂苷佐劑開發(fā)的綜述見參考文獻85和86。D.瘋毒,諒毒微粒病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可用作本發(fā)明的佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常含有一種或多種任選與磷脂混合或用磷脂配制的病毒蛋白質(zhì)。它們通常是非病原性、非復(fù)制性，通常不含有任何天然病毒基因組?？芍亟M產(chǎn)生或從完整病毒分離病毒蛋白。適用于病毒體或VLP中的病毒蛋白包括源自以下的蛋白質(zhì)流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣殼蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德畢斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、諾瓦克病毒、人乳頭瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、Q卩-噬菌體(例如外殼蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty(例如逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白pl)。參考文獻87-92進一步討論了VLP。例如，參考文獻93進一步討論了病毒體。五.潘蘿或微主激好生激適用于本發(fā)明的佐劑包括細菌或微生物衍生物，例如腸細菌脂多糖(LPS)的無毒衍生物、脂質(zhì)A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和它們的解毒衍生物。LPS的無毒衍生物包括單磷?；|(zhì)A(MPL)和3-0-脫酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是具有4、5或6條?；湹?脫-0-酰化單磷?；|(zhì)A的混合物。參考文獻94公開了3脫-O-?；瘑瘟柞；|(zhì)A的優(yōu)選"小顆粒"形式。3dMPL的這種"小顆粒"足夠小從而可經(jīng)0.22pm膜無菌過濾[94]。其它無毒的LPS衍生物包括單磷?；|(zhì)A模擬物，例如氨基垸基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529[95、96]。脂質(zhì)A衍生物包括大腸桿菌的脂質(zhì)A的衍生物，例如OM-174。例如，OM-174描述于參考文獻97和98。適合用作本發(fā)明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通過磷酸鍵與鳥苷相連的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫刺激性。CpG可含有核苷酸修飾/類似物，例如硫代磷酸酯修飾物并且可以是雙鏈或單鏈的。參考文獻99、100和101公開了可能的類似物取代，例如用2'-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻102-107進一步討論了CpG寡核苷酸作為佐劑的作用。CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[108]。CpG序列，例如CpG-AODN特異地誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，或者，例如CpG-BODN更特異地誘導(dǎo)B細胞應(yīng)答。參考文獻109-111討論了CpG-A和CpG-BODN。CpG優(yōu)選是CpG-AODN。優(yōu)選將CpG寡核苷酸構(gòu)建為5'端易于為受體識別。兩條CpG寡核苷酸序列任選在它們的3'端相連以形成"免疫聚物"(immunomer)。參見，例如參考文獻108和112-114。細菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本發(fā)明的佐劑。蛋白質(zhì)優(yōu)選源自大腸桿菌(大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素"LT'〕、霍亂(病毒)("CT")或百日咳(病毒)("PT")。參考文獻115描述了解毒的ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑的應(yīng)用，參考文獻116描述了其作為胃腸外佐劑的應(yīng)用。毒素或類毒素優(yōu)選為含有A和B亞基的全毒素形式。A亞基優(yōu)選含有解毒性突變；B亞基優(yōu)選未突變。佐劑優(yōu)選是解毒的LT突變體，例如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，特別是LT-K63和LT-R72作為佐劑的應(yīng)用見參考文獻117-124。氨基酸取代的數(shù)字基準優(yōu)選以參考文獻125所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亞基比對為基礎(chǔ)，該文獻專門全文納入本文作為參考。F人免疫調(diào)節(jié)劑適合用作本發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細胞因子，例如白介素(如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[126]等)[127]、干擾素(如，干擾素-力、巨噬細胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。G生物粘合劑和粘膜粘合劑生物粘合劑(bioadhesive)和粘膜粘合劑(mucoadhesive)也可用作本發(fā)明的佐劑。合適的生物粘合劑包括酯化的透明質(zhì)酸微球[128]，或者粘膜粘合劑，例如聚(丙烯酸)的交聯(lián)衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素。殼多糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑[129]。//.微微粒也可用作本發(fā)明的佐劑?？蓮纳锟山到夂蜔o毒的材料(例如，聚(a-羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等)，優(yōu)選聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即，直徑約100nm至150(im，優(yōu)選約200nm至30pm，最優(yōu)選約500nm至10|im的顆粒)，任選將這些微粒處理成帶負電的表面(例如，用SDS)或帶正電的表面(例如，用陽離子洗滌劑，如CTAB)。/.微浙參教劍77鄉(xiāng)"，萄適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子描述于參考文獻130-132?？椧椅⒒蝾wZ鄉(xiāng)鄉(xiāng)適用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[133]。這種制劑還包括聯(lián)用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性劑[134]以及聯(lián)用至少一種其它非離子表面活性劑，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑[135]。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-硬脂?；?steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂?；选⒕垩跻蚁?4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。丄.應(yīng)壟微適合用作本發(fā)明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰(normuramyl)-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙?；邗?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚酰-Sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。K覆錄薪尸C尸"PCPP制劑描述于，例如參考文獻136和137中。M欲辟#墜諾^￥眾^激適合用作本發(fā)明佐劑的咪唑并喹諾酮化合物包括參考文獻138和139中進一步描述的咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物(例如，"瑞喹莫德3M")。見-銀^"基M",眾^欽縮氨基硫脲化合物的例子，以及配制、制造和篩選適合用作本發(fā)明佐劑的所有這類化合物的方法包括參考文獻140所述內(nèi)容?？s氨基硫脲在刺激人外周血單核細胞產(chǎn)生細胞因子如TNF-a方面特別有效。O.經(jīng)嚴維^激色胺酮化合物的例子，以及配制、制造和篩選適合用作本發(fā)明佐劑的所有這類化合物的方法包括參考文獻141所述內(nèi)容。色胺酮化合物在刺激人外周血單核細胞產(chǎn)生細胞因子如TNF-a方面特別有效。本發(fā)明也可包括以上鑒定的一種或多種佐劑各方面的組合。例如，本發(fā)明可采用以下佐劑組合物(1)皂苷和水包油乳劑[142];(2)皂苷(如QS21)+無毒LPS衍生物(如3dMPL)[143];(3)皂苷(如QS21)+無毒LPS衍生物(如3dMPL)+膽固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任選+固醇)[144];(5)3dMPL與(例如)QS21和/或水包油乳劑的組合[145];(6)SAF，含有10。/。鯊烯、0.4。/。吐溫80tm、5%普朗尼克-嵌段聚合物L(fēng)121禾口thr-MDP，或微流體化成為亞微米乳液或渦旋振蕩產(chǎn)生粒度較大的乳液。(7)Ribi佐劑系統(tǒng)(RAS)(RibiImmunochem)，含有2%鯊烯、0.2%吐溫80和一種或多種細菌細胞壁組分，所述組分選自單磷酰脂質(zhì)A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或細胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS(Detox);(8)—種或多種無機鹽(如鋁鹽)+LPS的無毒衍生物(如3dMPL);和(9)一種或多種無機鹽(如鋁鹽)+免疫刺激性寡核苷酸(如含CpG基序的核苷酸序列)。參考文獻77的第7章公開了用作免疫刺激劑的其它物質(zhì)。特別優(yōu)選使用氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑，且偶聯(lián)物通常被吸附到這些鹽上[例如參考文獻9的實施例7和8;參考文獻10的實施例J]。也可以與鋁鹽混合但不吸附[27、72]。磷酸鈣是另一種優(yōu)選的佐劑?？蓪⑴悸?lián)物分別與佐劑混合(任選被吸附)然后再將偶聯(lián)物混合物在一起，或者可以先將偶聯(lián)物混合在一起然后在于佐劑混合。用于本發(fā)明的組合物的pH宜為6-8，優(yōu)選約為7。可用緩沖液維持穩(wěn)定的pH。當(dāng)組合物含有氫氧化鋁鹽時，優(yōu)選使用組氨酸緩沖液[146]。組合物可以是無菌和/或無熱原的。組合物可以對人等滲。組合物可包含防腐劑(例如硫柳汞、2-苯氧乙醇)，或者可不含防腐劑。優(yōu)選的本發(fā)明的組合物不含任何含汞物質(zhì)，例如不含硫柳汞。為防止抗原、尤其是偶聯(lián)物抗原之間相互影響，優(yōu)選含有聚陰離子聚合物，如聚-L-谷氨酸[147]。組合物可裝在藥瓶內(nèi)，或者可裝在裝好的注射器內(nèi)。注射器可以配備或不配備針頭。注射器通常含有單劑量組合物，而藥瓶可含有單劑量或多劑量。可注射的組合物將通常為液體溶液或懸浮液。或者它們可以固體形式(例如被凍干)存在，在注射之前用液體載體制成溶液或懸浮液。組合物可以單位劑量形式或多劑量形式包裝。對多劑量形式而言，藥瓶優(yōu)于預(yù)裝的注射器?？沙Ｒ?guī)建立有效劑量體積，但該組合物的典型人類劑量體積約為0.5ml。當(dāng)組合物要在使用之前臨時制備(例如當(dāng)組分以凍干形式存在時)并以試劑盒的形式出現(xiàn)時，該試劑盒可包含兩個藥瓶，或者可包含一個已經(jīng)裝好的注射器和一個藥瓶，注射器的內(nèi)容物用于在注射之前復(fù)活藥瓶內(nèi)的內(nèi)容物。就含有血清群A莢膜糖的組合物而言，血清群A的糖類可被凍干，而其它血清群的糖類可以液體形式存在。組合物將含有免疫學(xué)有效量的腦膜炎球菌偶聯(lián)物以及所需要的任何其它組分。'免疫學(xué)有效量'指給予個體該用量(單一劑量或作為系列劑量的一部分)可在患者中引起保護性的抗-腦膜炎球菌免疫應(yīng)答。該用量取決于所治療個體的健康和身體狀況、年齡、待治療個體的分類學(xué)分組(例如非人靈長類、靈長類等等)、該個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗的配方、主治醫(yī)生對身體狀況的評估以及其他相關(guān)因素。估計該用量應(yīng)處于可通過常規(guī)試驗確定的相對較寬的范圍內(nèi)，每劑中各腦膜炎球菌抗原的典型含量為每種血清群l-20)ig(根據(jù)糖類測定)，例如每種血清群2-10ng。優(yōu)選劑量為每種血清群約4pg(即四價混合物的總量為16pg)。組合物中載體蛋白的總量優(yōu)選不超過100嗎/劑，例如<90路/劑、〈80)Lig/劑、<70昭/劑、<60叱/劑、〈50)ig/劑等。組合物中載體蛋白的總量通常為至少10嗎/劑?？k術(shù)語"含有"包括"包含"以及"由……構(gòu)成"，例如"含有"X的組合物可僅由X構(gòu)成或可包含其它的物質(zhì)，例如X+Y。與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語"約"表示，例如xi10。/。。"基本上"不排除"完全"，例如"基本上無"Y的組合物可完全無Y。"基本上"可視需要從本發(fā)明定義中省去。本發(fā)明的實施方式iWB7份^/C/W55/T錄凝凝合欽沒,載沐，劍可按照參考文獻9和10的描述制備血清群A+C、C+W+Y或A+C+W+Y的腦膜炎球菌偶聯(lián)物的混合物。需要的話可將它們與氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑混合，也如參考文獻9和10的描述。這些疫苗可用共價連接到糖類的破傷風(fēng)類毒素(Tt)載體蛋白[147]制備。選擇接受兒童D-T-P疫苗(D-T-Pa或D-T-Pw)的患者，包括那些接受含有D-T-P和其它抗原(例如D-T-P-Hib四價、D-T-P-HBsAg四價、D-T-P-Hib-HBsAg五價、D-T-P-Hib-HBsAg-IPV六價等)的疫苗的患者接受含有Tt載體的偶聯(lián)物的混合物。選出的對照組患者接受兩種偶聯(lián)物混合物中的一種。對照患者先前未接受過破傷風(fēng)類毒素，無論是作為單獨的抗原或是作為偶聯(lián)物中的載體蛋白。評價了四價偶聯(lián)物在患者何種引起免疫應(yīng)答的能力。如果測試組的抗-腦膜炎球菌免疫應(yīng)答明顯低于對照患者，尤其是如果偶聯(lián)物無法在患者中引起有效的SBA反應(yīng)，則表明有載體抑制。在臨床試驗V59P2中測試了5種制劑，該試驗在芬蘭和德國進行，其中包括620名12-16個月大的對象。疫苗采用CRM197載體和磷酸鋁佐劑[10]。用每0.5ml藥劑中糖類質(zhì)量的微克數(shù)表示，各血清群糖類的劑量如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在0時給兒童注射疫苗，其中25%的兒童4周后接受第二次疫苗劑量。給予疫苗1個月后采集患者的血清，在采用人補體的SBA試驗中檢測抗各血清群腦膜炎奈瑟球菌的殺菌抗體。SBA效價與O時的血清相比升高，其標準為》1:4和》1:8。還測定了抗各血清群的莢膜糖的抗體效價(GMT)。結(jié)果見下表l。因此，該三價和四價疫苗在兒童中都具有免疫原性。每種偶聯(lián)物糖含量低至2.5pg時具有免疫原性。產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可加強，給予第二次劑量后SBA效價大幅增加。在該試驗中未觀察到載體抑制的證據(jù)。應(yīng)當(dāng)理解，以上僅通過舉例描述了本發(fā)明，可對其作出改進而不超越本發(fā)明的范圍和精神。表1-V59P2試驗的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>參考文獻(其內(nèi)容在此全文并入以供參考)[I]Armand等，(1982)■/歷o/.Sto"t/.10:335-339.[2]Cadoz等，(1985)K願."e3:340-342。[3]MA#ra(1997)46(RR-5)1-10.[4]Baklaic等，(1983)/"/e"./mww".42:599-604.[5]Jones(2001)C群/羅幼,gDrags2:47-49.[6]Costantino%，(1992)r腦."e10:691-8.[7]Lieberman等，(1996)275:1499-503.[8]WO2005/000345.[9]WO02/058737.[10]WO03/007985.[II]Rennels等，(2002)Pea^^/"/e"IfcJ21:978-979.[12]WO2004/013400.[13]Campbell等，(2002)￡fe186:1848-1851.[14〗Herzenberg等，(1980)淑臟285:664-667.[15]Schutze等，(1985)//畫畫/135:2319-2322.[16]Dagan等，(1998)66:2093-2098.[17]Barington等，(1994)/"/ec"wmw"62:9-14.[18]Dilohn等，(1989)2(8677):1415-8.[19]Granoff等，(1993)Kcc/"e增刊1:S46-51.[20]Granoff等，(1994)X4M4272:1116-1121.[21]Barington等，(1993)61:432-438.[22]澳大利亞專利748716(授權(quán)自W098/51339).[23]Olander等，(2001)racd"e20:336-341.[24]Burrage等，(2002)/"/ec,/mww"70:4946-4954.[25]Peeters等，(1999)59:3504-3510.[26]Hoppenbrouwers等，(1999)17:2588-98.[27]WO02/00249.[28]WO00/56360.[29]Reddin等，(2001)F￡MS/mm/"o/Mei/M/cra&W31:153-162.[30]Podda等，(1991)&cc/"e9:741-745.[31]Plotkin和Orenstein編的(f疫^V」(T^cc/"e^，2004，ISBN0-7216-9688-0[32]Ramsay等，(2001)丄認"357(9251):195-196.[33]Lindberg(1999)Facc/"e17增刊2:S28-36.[34]Buttery和Moxon(2000)JiCo〃尸/z;^c/ara34:163-168.[35]Ahmad和Chapnick(1999)/"/e"C""7VoW/爿w13:113-33，vii.[36]Goldblatt(1998)J:MedM/craWo/.47:563-567.[37]歐洲專利0477508.[38]美國專利5,306,492.[39]W098/42721.[40]Dick等，見Cruse等編的(f錄凝資帝j^Cwy'wga^KaccZ"一Karger，Basel,1989，10:48-114.[41]Hermanson(f主激錄凝發(fā)術(shù)j1(B/oc呵'wga,e7fec/zw々腦」，AcademicPress，SanDiego(1996)ISBN:0123423368.[42]WO03/080678.[43]Glode等，(1979)J/"/e"Z^139:52-56WO94/05325;美國專利5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án)物，其中所述各偶聯(lián)物含有破傷風(fēng)類毒素載體蛋白和莢膜糖，且其中所述患者已經(jīng)用破傷風(fēng)類毒素預(yù)先免疫過。文檔編號A61K47/48GK101163508SQ200680005096公開日2008年4月16日申請日期2006年1月13日優(yōu)先權(quán)日2005年1月14日發(fā)明者C·J·馬歇爾申請人:諾華疫苗和診斷有限公司