專利名稱：半乳糖凝集素組合物及其治療干眼綜合癥的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了用于治療干眼綜合癥的組合物、方法和試劑 盒，其中含有半乳糖凝集素蛋白。
背景技術(shù)：
干眼綜合癥(DES)是一種常見(jiàn)病癥，在30至45歲的人群 中有10%的人感染這一病癥，在45歲以上的人群中有20%的人 感染這一病癥，并且這一數(shù)量還在漸增(參見(jiàn)Schein等人于1997 年在《Am J Ophthamol》124， 723 - 72上發(fā)表的文章；Brewitt 和Sistani于2001年在《Surv of Ophthalmol》45: S119 - S202上 發(fā)表的文章)。干眼綜合癥能夠引發(fā)眼睛刺痛，視力模糊和視力 波動(dòng)，并且增加了能夠威月辦4見(jiàn)力的角力莫感染及潰病的危險(xiǎn)。干眼 綜合癥的組織學(xué)效應(yīng)可以表現(xiàn)為眼表上皮細(xì)月包中的結(jié)力莫杯狀細(xì) 胞的密度降低，這種眼表上皮細(xì)胞發(fā)生不正常的增殖和分化，由 眼表上皮細(xì)胞分泌的粘液減少，并且分泌不正常的粘液物質(zhì)(參 見(jiàn)Murillo - Lopez和Pflugfelder于1996年在由Krachmer J, Mannis M， Holland E編4專的《The Cornea Mosby》 一書(shū)中的文章 "干眼癥"，圣路易斯，MO.663 - 686;或者參見(jiàn)Dursun等人于 2002年在《Invest Ophthamol & Vis Sci》 43:632-638中的文章)。 干眼癥是一種'隄性疾病，它的癥狀和跡象受環(huán)境因素的纟及大影 響，例如濕度和空氣流動(dòng)，也^^決于對(duì)某些用眼作業(yè)的需要，例 如閱讀或者4吏用計(jì)算才幾。干眼綜合癥的典型癥狀表現(xiàn)為眼燒灼感，眼癢，異物感，眼 刺痛，眼干燥，畏光，纟見(jiàn)覺(jué)疲勞以及眼紅。干眼病是一種'隄性疾 病，它的癥狀和跡象受環(huán)境因素的纟及大影響，例如濕度和空氣流 動(dòng)，也耳又決于對(duì)某些用眼作業(yè)的需要，例如閱讀或者使用計(jì)算才幾
(參見(jiàn)Rheinstrom于1999年在由Yanoff編輯的《目艮-牛學(xué)》第一 版中發(fā)表的文章"干眼癥"，由Mosley國(guó)際有限7>司編輯，圣3各 易其斤，MO;或者參見(jiàn)Foulks于2003年在《目艮表》1: 20 - 30中 發(fā)表的文章)。
盡管已經(jīng)有很多種類的人工淚液可以使用，但所有這些人工 淚液都只能短時(shí)間的緩解癥狀。到目前為止還沒(méi)有藥物能4丑轉(zhuǎn)這 一局面。因此，本領(lǐng)域需要其他的藥物制劑和組合物來(lái)治療干眼 綜合癥。特別的，需要治療干眼綜合癥的制劑、組合物和治療方 法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明描述了一種治療哺乳動(dòng)物干眼癥的方法，包纟舌向哺乳 動(dòng)物施以治療有效劑量的半乳糖凝集素蛋白。本發(fā)明的 一種實(shí)施 方式描述了一種預(yù)防哺乳動(dòng)物干眼癥的方法，包4舌先確定需要 預(yù)防干眼癥的哺乳動(dòng)物，然后向該哺乳動(dòng)物施以治療有歲文劑量的 半乳糖凝集素蛋白。因此，本方法適用于下述需要被治療或者被 預(yù)防的哺乳動(dòng)物，這類哺乳動(dòng)物處于至少一種選自下述的狀況 眼上皮缺損；預(yù)先^f吏用了抗組胺劑；預(yù)先^f吏用了消炎藥；以及預(yù) 先經(jīng)過(guò)了受激準(zhǔn)分子激光處理。例如，這種哺乳動(dòng)物是人類。并 且，所述的半乳糖凝集素選自半乳糖凝集素-8,半乳糖凝集素 -7和半乳糖凝集素-3。在某些實(shí)施方式中，干眼癥是一種持續(xù) 的綜合癥。例如，千眼癥能夠?qū)е律掀つp。進(jìn)一步的，上皮磨 損能夠?qū)е陆悄と睋p。
ii一般的，上述方法使用的半乳糖凝集素-8包含如序列4或 者序列5所示的氨基酸序列。例如，半乳糖凝集素-8包含了與 序列4或者序列5基本上同源的氨基酸序列。這里使用的術(shù)語(yǔ)"基 本上同源"是指相對(duì)于序列4或者序列5的氨基酸序列來(lái)說(shuō)，半 乳糖凝集素-8具有至少60%的序列同一性，或者具有至少70 %的序列同一性，或者具有至少80%的序列同一性，又或者具有 至少90%的序列同一性。
一般的，上述方法使用的半乳糖凝集素-7包含如序列2所 示的氨基酸序列。例如，半乳糖凝集素-7包含了與序列2在基 本上同源的氨基酸序列。這里使用的術(shù)語(yǔ)"基本上同源"是指相 對(duì)于序列2的氨基酸序列來(lái)iJL,半乳凈唐凝集素-7具有至少60% 的序列同一性，或者具有至少70%的序列同一性，或者具有至少 80%的序列同一性，又或者具有至少90%的序列同一性。在某些 實(shí)施方式中，半乳糖凝集素-7包括了一種半乳糖凝集素-7半 乳糖苷結(jié)合區(qū)域。
一4殳的，上述方法4吏用的半乳糖凝集素-3包含如序列1所 示的氨基酸序列。例如，半乳糖凝集素-3包含了與序列1基本 上同源的氨基酸序列。這里使用的術(shù)語(yǔ)"基本上同源"是指相對(duì) 于序列1的氨基酸序列來(lái)i)L，半乳4唐;疑集素-3具有至少60%的 序列同一性，或者具有至少70%的序列同一性，或者具有至少 80%的序列同一性，又或者具有至少90%的序列同一性。在某些 實(shí)施方式中，半乳糖凝集素-3包括了一種半乳糖凝集素-3半 乳糖普結(jié)合區(qū)域。
本發(fā)明的另 一種實(shí)施方式涉及一種能夠促進(jìn)治療干眼癥的 藥物組合物，所述藥物組合物包括藥物學(xué)合適的載體或者稀釋劑 和一定量的半乳糖凝集素-8蛋白，其中半乳糖凝集素-8蛋白 的量能夠充分從而促進(jìn)結(jié)膜和/或角膜上皮細(xì)胞的完好。本發(fā)明的
12涉及一種能夠促進(jìn)治療干眼癥的藥物組合物，所 述藥物組合物包括藥物學(xué)合適的載體或者稀釋劑和一定量的半
乳糖凝集素-7蛋白，其中半乳糖凝集素-7蛋白的量能夠充分 促進(jìn)結(jié)膜和/或角膜上皮細(xì)胞的完好。本發(fā)明的另 一種實(shí)施方式涉 及一種能夠促進(jìn)治療干眼癥的藥物組合物，所述藥物組合物包括 藥物學(xué)合適的載體或者稀釋劑和一定量的半乳糖凝集素_3蛋 白，其中半乳糖凝集素-3蛋白的量能夠充分促進(jìn)結(jié)膜和/或角膜 上皮細(xì)胞的完好。本發(fā)明的另一種實(shí)施方式涉及一種能夠促進(jìn)治 療干眼癥的藥物組合物，所述藥物組合物包括藥物學(xué)合適的載體 或者稀釋劑和一定量的半乳糖凝集素_ 8蛋白，其中半乳糖凝集 素-8蛋白的量能夠充分促進(jìn)結(jié)膜和/或角膜上皮細(xì)胞的完好。在 上述任意的藥物組合物中，所述干眼癥是一種周期性發(fā)生的上皮 磨損干眼疾病。例如，所述干眼疾病導(dǎo)致的損傷屬于角膜缺損。 進(jìn)一步的，所述干眼癥是由受激準(zhǔn)分子激光laser角膜切除術(shù)引 起的。
在這些涉及藥物組合物的不同實(shí)施方式中，其中的半乳并唐凝 集素-8含有如序列4或者序列5所示的氨基酸序列，或者其中 的半乳糖凝集素-8含有與序列4或者序列5的氨基酸序列在基 本上同源的氨基酸序列?；蛘撸霭肴樘悄?8含有一種 半乳糖凝集素-8的N-末端結(jié)構(gòu)域， 一種半乳糖凝集素-8的 富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的結(jié)構(gòu)域?；蛘?，所述半乳糖凝集 素-8含有一種半乳4唐凝集素-8的富含力甫氨酸、甘氨酸和酪氨 酸的結(jié)構(gòu)域，以及一種半乳糖凝集素-8的半乳糖苦結(jié)合區(qū)域。 例如，所述半乳糖凝集素-8含有一種半乳糖凝集素-8的半乳 糖苷結(jié)合區(qū)域?；蛘?，藥物組合物中的半乳糖凝集素-7含有如 序列2所示的氨基酸序列。例如，其中的半乳糖凝集素-7含有 與序列2的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列。或者，所述 半乳糖凝集素-7含有一種半乳糖凝集素-7的半乳糖苷結(jié)合區(qū)域?；蛘撸幬锝M合物中的半乳^唐凝集素-3含有如序列1所示 的氨基酸序列。例如，其中的半乳糖凝集素-3含有與序列1的 氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列?；蛘?，所述半乳糖凝集 素-3含有一種半乳糖凝集素-3的半乳糖苷結(jié)合區(qū)域。
本發(fā)明進(jìn) 一 步描述了治療哺乳動(dòng)物干眼疾病的方法，包4舌向 該哺乳動(dòng)物施以治療有效劑量的物質(zhì)，所述物質(zhì)能夠改變淚"莫在 角膜表面或者結(jié)膜表面上的分布。本發(fā)明還描述了治療哺乳動(dòng)物 干眼疾病的方法，包括向患有干眼癥的哺乳動(dòng)物施以治療有效劑 量的物質(zhì)，所述物質(zhì)能夠影響半乳糖凝集素-8蛋白的表達(dá)。例 如，所述物質(zhì)包括具有如序列4或者序列5所示的氨基酸序列的 半乳糖凝集素-8蛋白。例如，所述物質(zhì)包括具有與序列4或者 序列5所示的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列的半乳^唐凝 集素-8蛋白。


附圖1描述了人類半乳糖凝集素-3的氨基酸序列和人類半 享'14唐凝集素-3組合物(Accession No. BAA22164 in GenBank, 序歹'J 1 )。
附圖2描述了人類半乳糖凝集素-7的氨基酸序列和人類半 享14唐凝集素一 7纟且合4勿(Accession No. 155469 in GenBank,序歹'J 2)。
附圖3描述的是采用漸進(jìn)式多序列比對(duì)方法(CLUSTAL W 軟件)，將來(lái)自于人類半乳糖凝集素-3的氨基酸序列(序列1)、 來(lái)自于野兔半乳糖凝集素-3的氨基酸序列(Genebank中的 Accession No.JC4300 )、來(lái)自于小雞半乳4唐-疑集素-3的氨基酸序 歹'J ( Genebank中的Accession No.AAB02856 )、以及來(lái)自于倉(cāng)鼠半乳泮唐凝集素-3的氨基酸序歹'J ( Genebank中的Accession CAA55479 )進(jìn)行多序列比對(duì)。在該圖中，第一條序列(上邊) 表示的是人類半乳糖凝集素-3的第1 - 250位氨基酸(序列1)， 第二條序列表示的是倉(cāng)鼠半乳糖凝集素-3的第1 - 245位氨基 酸，第三條序列表示的是野兔半乳糖凝集素-3的第1 - 242位氨 基酸，第四條序列(下邊)表示的是小雞半乳糖凝集素-3的第 1 -262位氨基酸。
附圖4描述的是采用漸進(jìn)式多序列比對(duì)方法(CLUSTAL W 軟件)，將來(lái)自于人類半乳糖凝集素-7的氨基酸序列(序列2)、 來(lái)自于鼠類(rat)半乳糖凝集素-7的氨基酸序列(Genebank中 的Accession No.P97590 )、以及來(lái)自于小鼠(mouse )半孝14唐凝集 素—7的氨基酸序歹'J ( Genebank中的Accession No.054974 )、進(jìn) 行多序列比對(duì)。在該圖中，第一條序列(上邊)表示的是鼠類(rat) 半乳糖凝集素-7的第1 - 136位氨基酸，第二條序列表示的是小 鼠(mouse)半乳糖凝集素-7的第l-136位氨基酸，第三條序 列(下邊)表示的是人類半乳糖凝集素-7的第1-136位氨基酸 (序歹'J 2)。
附圖5是在PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)中瀏覽人類半乳糖凝集素-3 (序歹ij 1)所得的結(jié)果的概況。
附圖6是在PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)中瀏覽人類半乳糖凝集素-7 (序列2)所得的結(jié)果的概況。
附圖7描述的是人類半乳糖凝集素-3的半乳糖苦結(jié)合區(qū)域 與來(lái)自于PFAM的hidden Markov model ( HMM )數(shù)據(jù)庫(kù)的保守 氨基酸序列(PF00337 )進(jìn)行的序列比對(duì)。上邊的序列表示的是 〃隊(duì)守氨基酸序列(PF00337,序列3),而下邊的氨基酸序列表示 的是序列1的第117 - 247 4立氨基酸。附圖8描述的是人類半乳糖凝集素_ 7的半乳糖苷結(jié)合區(qū)域 與來(lái)自于PFAM的hidden Markov model ( HMM ) tt才居庫(kù)的^f呆守 氨基酸序列(PF00337 )進(jìn)行的序列比對(duì)。上邊的序列表示的是 保守氨基酸序列(PF00337,序列3),而下邊的氨基酸序列表示 的是序歹'J 2的第5 _ 135位氨基酸。
附圖9中包含了一系列的角膜照片，這些角膜帶有2毫米的 磨損或者帶有受激準(zhǔn)分子激光傷口 ，這些帶有傷口的角膜被允許 在體內(nèi)進(jìn)行部分愈合，然后以石蠟切片的形式凈皮進(jìn)行半乳糖凝集 素-3的免疫反應(yīng)性分析。在附圖9A的三幅照片中，(i)表示的 是正常角膜的蘇木素和曙紅染色反應(yīng)，(ii)表示的是被磨損后的 角膜立即進(jìn)行的蘇木素和曙紅染色反應(yīng)，(iii)表示的是被受激 準(zhǔn)分子激光損傷后的角膜立即進(jìn)行的蘇木素和曙紅染色反應(yīng)。在 附圖9B的四幅照片中，(i)表示的是正常gal-3 + 〃小鼠角膜的 免疫組織化學(xué)染色反應(yīng)，(ii)表示的是被受激準(zhǔn)分子激光損傷后 的愈合型gal-3 + /+小鼠角膜的免疫組織化學(xué)染色反應(yīng)，(iii)表 示的是正常gal-3 +小鼠角膜的免疫組織化學(xué)染色反應(yīng)，(iv) 表示的是被受激準(zhǔn)分子激光損傷后的愈合型gal- 3 +小鼠角膜 的免疫組織化學(xué)染色反應(yīng)。深色代表陽(yáng)性免疫染色，WE代表傷 口邊緣；LE代表遷移性上皮細(xì)胞的前邊緣；箭形代表上皮細(xì)胞； 箭頭代表白細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞。
附圖10的圖表舉例說(shuō)明了 P -乳糖(Lac)和蔗糖(Sue) 對(duì)受傷角月莫上皮細(xì)胞的愈合速率的影響。
附圖11的一組圖表舉例說(shuō)明了野生型小鼠(gal-3 + /+小鼠) 和半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠(gal-3 —〃小鼠)的受傷角膜上 皮細(xì)胞的愈合速率，其中這些角膜傷口是由受激準(zhǔn)分子激光治療 引起的，或者是由堿處理引起的，并且這些傷口被允許在體內(nèi)或 者體外進(jìn)行愈合。
16附圖12的表格描述了通過(guò)使用cDNA微陣列技術(shù)以及半定 量化PCR技術(shù)，4企測(cè)出的野生型小鼠(gal-3 + /+小鼠)和半乳 糖凝集素-3缺陷型小鼠(gal-3 —7—小鼠)的半乳糖凝集素-7 的基因表達(dá)中存在的區(qū)別，以及兩者對(duì)管家基因進(jìn)行的選擇的區(qū) 另'J ( GAPDH代表D -甘油醛-3 -磷酸脫氬酶；RPS29代表核糖 體蛋白S29; ODC代表鳥(niǎo)氨酸脫羧酶)。
附圖13舉例說(shuō)明了通過(guò)使用(A) western印跡分析法，(B) 免疫組織化學(xué)分析法，以及(C)使用小鼠胚胎纖維原細(xì)胞，檢 測(cè)出的野生型小鼠(gal-3 + /+小鼠)和半乳糖凝集素-3缺陷型 小鼠(gal - 3 +小鼠)的半乳糖凝集素-7的表達(dá)中存在的區(qū)別。
附圖14的圖表舉例說(shuō)明了在半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠 (gal-3 —〃小鼠)(附圖14A)和野生型小鼠(gal-3 + 〃小鼠)(附 圖14B)中，外源性半乳糖凝集素-3對(duì)小鼠的受傷角膜上皮細(xì) i包的愈合速率的影響。
附圖15的圖表舉例說(shuō)明了當(dāng)外源性半乳糖凝集素-3存在的 情況下，(3 -乳糖(Lac )和蔗糖(Sue )對(duì)野生型小鼠(gal - 3 + /+小鼠)的受傷角膜上皮細(xì)胞的愈合速率的影響。
附圖16包4舌A、 B兩個(gè)圖表，(A)的圖表舉例i兌明了外源 性半乳糖凝集素-7對(duì)野生型小鼠(gal-3 + 〃小鼠)的受傷角膜 上皮細(xì)胞的愈合速率的影響，包括單獨(dú)使用外源性半乳糖凝集素 -7的情況、外源性半乳糖凝集素-7與(3 -乳糖(Lac )結(jié)合使 用的情況、以及外源性半乳糖凝集素-7與蔗糖(Sue )結(jié)合使用 的情況。(B)的圖表對(duì)比了外源性半乳糖凝集素-7對(duì)于野生型 小鼠(gal-3 + /+小鼠)和半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠(gal-3 — /_小鼠)的受傷角膜上皮細(xì)胞的愈合速率的影響。
17附圖17描述了人類半乳糖凝集素-1的氨基酸序列(序列6)。
附圖18描述了人類半乳糖凝集素-8的短形式的氨基酸序列 (序列4)。
附圖19表示出了人類半乳糖凝集素-1 (序歹ij 6)的氨基酸 序列，鼠類(rat)半乳糖凝集素-1的氨基酸序列，小鼠(mouse ) 半乳糖凝集素-1的氨基酸序列，以及倉(cāng)鼠半乳糖凝集素-1的 氨基酸序列，這些序列之間具有4艮高的序列同一性，因而，在哺 乳動(dòng)物當(dāng)中，半乳糖凝集素-1的序列是高度保守的。陰影部分 表示在四種哺乳動(dòng)物的序列當(dāng)中，此處的氨基酸殘基是不相同 的。鼠類和人類半乳糖凝集素-1的氨基酸序列具有90.4%的序 列同一性；小鼠和人類半乳糖凝集素-1的氨基酸序列具有88.2 %的序列同一性；倉(cāng)鼠和人類半乳糖凝集素-1的氨基酸序列具 有91.2%的序列同一性。該附圖還表示出在不相同的氨基酸殘基 中，大多數(shù)殘基發(fā)生的都是保守性變化，例如，由精氨酸耳又代位 置19處的賴氨酸，由亮氨酸取代位置24處的纈氨酸，由絲氨酸 取代位置73處的蘇氨酸，以及由天冬氨酸取代位置136處的谷 氨酸。
附圖20表示的是人類半乳糖凝集素-8 (序列4)的每種短 形式(316個(gè)氨基酸)的氨基酸序列，以及與之相應(yīng)的小鼠(mouse) 半乳糖凝集素-8的短形式的氨基酸序列，鼠類(rat)半乳糖凝 集素-8的短形式的氨基酸序列，小雞半乳糖凝集素-8的短形 式的氨基酸序列，和青蛙半乳糖凝集素-8的短形式的氨基酸序 列。在非人類半乳糖凝集素-8氨基酸序列中的劃線部分代表為 與人類鼠半乳糖凝集素-8序列進(jìn)行序列比對(duì)而引入的缺口 (gaps)。三種哺乳動(dòng)物的半乳糖凝集素-8的氨基酸序列之間具 有很高的序列同一性，具有78.2%的序列同一性，而在剩余的21.8
18%的不同之中，絕大部分變化都屬于4呆守性變化，例如在人類半
乳糖凝集素-8的位置20處是苯丙氨酸，而在小鼠和鼠類半乳糖 凝集素-8的相應(yīng)位置處為酪氨酸；在人類半乳#唐凝集素-8的 位置22處是甘氨酸，而在鼠類半乳糖凝集素-8的相應(yīng)位置處為 絲氨酸；在人類半乳糖凝集素-8的位置26處是甘氨酸，而在嚙 齒動(dòng)物類半乳糖凝集素-8的相應(yīng)位置處為天冬氨酸。而且，脊 推動(dòng)物半乳糖凝集素-8與人類半乳糖凝集素-8具有43.0%的 序列同一性，因此，半乳糖凝集素-8序列在哺乳動(dòng)物中具有高 度同一性，并且在脊推動(dòng)物中也是高度保守的。
附圖21的柱形圖表示出在小鼠模型中施用半乳糖凝集素對(duì) 干眼綜合癥產(chǎn)生的影響，所述干眼綜合癥是由于在第0天注射白 細(xì)胞介素-la (在該圖中用IL-1來(lái)表示)而引起的，以天數(shù) 作為時(shí)間函凄t (as a function of time )。在第1天和第2天，以一 天四次的頻率向每個(gè)組中的5個(gè)小鼠模型以滴眼液的形式施用半 乳糖凝集素-3,所述滴眼液中的半乳糖凝集素-3濃度為75微 克/毫升或者150微克/毫升。對(duì)照組小鼠模型不注射白細(xì)胞介素 -loc，也不向其施用滴眼液。對(duì)于"纟爰沖液"組中的小鼠才莫型， 每天以四次的頻率向其施以載體溶4某即可。 <吏用Zoukhri, D等 人在《Invest Ophthalmol Vis Sci》42 ( 5 ): 925 - 932中發(fā)表的文 章中所述的方法，通過(guò)熒光素清除試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)淚液的動(dòng)力學(xué)特 征，其中，較低的數(shù)值代表較好的淚液流動(dòng)性。數(shù)據(jù)顯示使用 半乳糖凝集素進(jìn)行治療能夠使淚液的動(dòng)力學(xué)特性恢復(fù)到正常水 平，與沒(méi)施用半乳糖凝集素的對(duì)照組動(dòng)物相比，施用了半乳糖凝 集素的動(dòng)物在第2天的數(shù)據(jù)具有了 p<0.05的統(tǒng)計(jì)顯著性。
具體實(shí)施例方式
本申請(qǐng)?zhí)峒岸喾N專利文獻(xiàn)，科技文獻(xiàn)以及其他出版物。上述 文獻(xiàn)和出版物的內(nèi)容在此引入作為參考。此外，本申請(qǐng)?zhí)峒暗降?br> 19所有網(wǎng)站的內(nèi)容(截止到本申請(qǐng)的申請(qǐng)日之前)在此引入作為參考。
本發(fā)明在此提供了很多實(shí)施方式，這些實(shí)施方式都是基于結(jié) 合了碳水化合物的蛋白——半乳糖凝集素能夠促進(jìn)淚膜在角膜 表面或者結(jié)膜表面的分布這一原理來(lái)實(shí)現(xiàn)的。半乳糖凝集素是一
類結(jié)合了半乳糖的蛋白質(zhì)，它們能夠高特異性的與黏蛋白上的o
-聯(lián)寡糖中的Gal (3 1 - 4GlcNAC相結(jié)合。由于很多半乳糖凝集 素都是二價(jià)的或者多價(jià)的，因而它們能夠通過(guò)與分泌型黏蛋白的 寡糖鏈的結(jié)合，來(lái)促進(jìn)淚膜在角膜上皮細(xì)胞頂端表面或者結(jié)膜上 皮細(xì)胞頂端表面的跨膜黏蛋白(或者其他糖蛋白)上的分布。
本發(fā)明提供了包含半乳糖凝集素-8、半乳糖凝集素-3和/ 或半乳糖凝集素-7的藥物組合物，能夠有效的增強(qiáng)哺乳動(dòng)物受 傷組織的傷口的再上皮化(表皮再植)。本發(fā)明還提供了治療哺 乳動(dòng)物組織的上皮損傷的方法，包括向患有上皮損傷的哺乳動(dòng)物 施以治療有效劑量的半乳糖凝集素-1,半乳糖凝集素-3，半乳 糖凝集素-7,半乳糖凝集素-8，或者半乳糖凝集素-1、半乳 糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8中的至少兩 種的組合物。當(dāng)使用半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳 糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8的組合物時(shí)，其中的任意一種 半乳糖凝集素都可以在其他半乳糖凝集素之前施用、與其他半乳 糖凝集素同時(shí)施用、或者在其他半乳糖凝集素之后施用。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)當(dāng)角膜出現(xiàn)損傷之后，半乳糖凝集素-3在遷 移性角膜上皮細(xì)胞中表現(xiàn)為增量調(diào)節(jié)作用(見(jiàn)實(shí)施例1)。本發(fā)明 同樣發(fā)現(xiàn)具有半乳糖凝集素-3缺陷型的小鼠的角膜跨上皮受 激準(zhǔn)分子laser損傷以及角膜堿燒灼性損傷的再上皮化(表皮再 植)明顯的慢于野生型小鼠(見(jiàn)實(shí)施例2)。本發(fā)明進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) 在半乳糖凝集素-3缺陷型的小鼠中，許多與損傷相關(guān)的基因(例如，tolloid-like蛋白和半乳糖凝集素-7)的表達(dá)都是不正常的 (見(jiàn)實(shí)施例3)。此外，本發(fā)明證明了外源性半乳糖凝集素-3和 半乳糖凝集素-7能夠促進(jìn)角膜損傷的再上皮化(表皮再植)(分 另)J見(jiàn)實(shí)施侈寸4和實(shí)施侈'J 5 )。
半乳糖凝集素
外源性凝集素是一類蛋白質(zhì)，因其具有特異性結(jié)合糖類并且 凝集細(xì)胞的能力而得名(例如參見(jiàn)由Sharon于1993年在《生物 化學(xué)科學(xué)發(fā)展趨勢(shì).》is: 221中發(fā)表的文章)。已經(jīng)表明，外源 性凝集素參與了非常多種類的細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞與細(xì)胞間的相 互作用，以及細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用。外源性凝集素廣泛分布 于才直物、無(wú)脊推動(dòng)物和哺乳動(dòng)物中。動(dòng)物外源性凝集素^皮分組為 四個(gè)截然不同的家;^臭l)C類外源性凝集素；2)P類外源性凝: 集素；3)半乳糖凝集素(原來(lái)也被稱為S類外源性凝集素)；以 及4)正五聚蛋白(例如參見(jiàn)由Barondes等人于1994年在《生 物4匕學(xué)雜志》269: 20807中發(fā)表的文章)。
所有被詳細(xì)分析過(guò)的哺乳動(dòng)物半乳糖凝集素都能夠識(shí)別P -乳糖和相關(guān)的P -半乳糖苷。盡管所有的哺乳動(dòng)物半乳糖凝集 素對(duì)小分子P -乳糖都表現(xiàn)出相似的親和性，但它們對(duì)于更復(fù)雜 的糖結(jié)合物卻表現(xiàn)出明顯不同的結(jié)合特異性(參見(jiàn)Henrick等人 于1998年在《糖生物學(xué)》8: 45上發(fā)表的文章；Sato等人于1992 年在《生物化學(xué)雜志》267: 6983上發(fā)表的文章；以及Seetharaman 等人于1998年在《生物化學(xué)雜志》273: 13047上發(fā)表的文章)。 除了能夠結(jié)合P -半乳糖苷這種糖類之外，半乳糖凝集素還具有 紅血球凝集活性。層粘連蛋白， 一種含有多個(gè)聚乳糖胺鏈的天然 產(chǎn)生的糖蛋白，已經(jīng)被證明是某些半乳糖凝集素的天然配體。層 粘連蛋白是基底膜中的一種組分，是位于所有上皮細(xì)胞之下并且 圍繞個(gè)體肌肉、脂肪和雪旺細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)。已經(jīng)知曉，在哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)的過(guò)程中，細(xì)胞與基底膜之間的相互作用能夠影響不 同細(xì)胞類型的遷移和/或分化。半乳糖凝集素中不含有能指定膜移 位的傳統(tǒng)序列，^旦它們能夠在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)^f亍分泌和定位。除了對(duì)P -半乳糖香這種糖類具有相似的親和性之外，半乳糖凝集素家族
的成員在糖類識(shí)別結(jié)構(gòu)i或(CRD;也可以稱為糖結(jié)合區(qū)i或)具有 明顯的序列相似性，可以4吏用X光晶體結(jié)構(gòu)分析確定上述序列中 的相關(guān)氨基酸殘基(參見(jiàn)Lobsanov等人于1993年在《生物化學(xué) 雜志》267: 27034上發(fā)表的文章；和Seetharaman等人在《Supra》 上發(fā)表的文章)。半乳糖凝集素具有許多種類的生物學(xué)功能，包 括細(xì)胞粘附(參見(jiàn)Cooper等人于1991年在《細(xì)胞生物學(xué)雜志.》 115: 1437中發(fā)表的文章)，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)(參見(jiàn)Wells等人于1991 年在《纟田胞》64: 91中發(fā)表的文章)，細(xì)胞遷移(參見(jiàn)Hughes 于1992年在《Curr.Opin.Struct.Biol.》2: 687中發(fā)表的文章)，腫 瘤性轉(zhuǎn)移(參見(jiàn)Raz等人于1990年在《Int丄Cancer》46: 871中 發(fā)表的文章)和免疫應(yīng)答(參見(jiàn)Offner等人于1990年在 《J.Neuroimmunol》28: 177中發(fā)表的文章)。目前，半乳糖凝集 素家力矣具有12個(gè)^皮定義的真核成員。
半乳糖凝集素-3
典型的半乳糖凝集素-3蛋白家族成員(先前知曉的CBP-35 (并唐結(jié)合蛋白35), Mac-2 (巨p盆細(xì)月包表面抗原2), L-34, ￡ BP (免疫球蛋白E結(jié)合蛋白)和RL - 29 )包含約240個(gè)氨基酸 到約270個(gè)氨基酸，其分子量在約25kDa到約29kDa的范圍。通 常情況下，半乳糖凝集素-3由一種短的N-末端區(qū)域、 一種含 有半乳糖苷結(jié)合區(qū)域的C-末端區(qū)域、以及一種介于其間并富含 脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的區(qū)域組成，后一區(qū)域是由7-IO個(gè)重 復(fù)氨基酸序列組成的(參見(jiàn)Liu等人于1996年在《生物化學(xué)》 35: 6073中發(fā)表的文章；以及Cherayil等人于1990年在《Proc.Natl.Acad.Sci.》，美國(guó)，87: 7324中發(fā)表的文章)。這種氨 基酸的前后重復(fù)與在骨膠原基因超家族中發(fā)現(xiàn)的相似。不同半乳 糖凝集素-3蛋白中的氨基酸序列的重復(fù)次數(shù)不同，這種重復(fù)的 次數(shù)隨種類不同而不同。由于半乳糖凝集素-3蛋白具有的N-末端區(qū)域，使得該蛋白在結(jié)合到糖結(jié)合物配體表面之后能夠經(jīng)受 聚合作用。
半乳糖凝集素-3能夠在許多炎癥細(xì)胞(例如，激活的巨噬 細(xì)胞，嗜》威性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞)、上皮細(xì)胞及各種組織的成纖 維細(xì)胞中表達(dá)(參見(jiàn)Perillo等人于1998年在《分子醫(yī)學(xué)雜志》 76:402中發(fā)表的文章)。它存在于細(xì)胞表皮上、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM ) 內(nèi)、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以及細(xì)胞核內(nèi)。細(xì)胞表皮上的半乳糖凝集素-3和 細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的半乳糖凝集素-3被認(rèn)為是通過(guò)與互補(bǔ)的糖結(jié)合 物的結(jié)合來(lái)介導(dǎo)細(xì)月包與細(xì)月包間、細(xì)月包與基質(zhì)間的相互作用的，所 述的互補(bǔ)的糖結(jié)合物中含有存在于許多細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表皮 分子中的聚乳糖胺鏈。半乳糖凝集素-3被認(rèn)為是通過(guò)與層粘連 蛋白的結(jié)合來(lái)抑制細(xì)胞與基質(zhì)的粘附作用的。在細(xì)胞核中，半乳 糖凝集素-3是通過(guò)改變已知的細(xì)胞粘附分子(例如，整合蛋白 oc6(31和a4(3 7,參見(jiàn)Warlfield等人于1997年在《I畫(huà)sion Metastasis》17: 101中發(fā)表的文章；以及Matarrese等人于2000 年在《InU.Canner》85: 545中發(fā)表的文章)和細(xì)胞分裂素(例 ^口，白纟田月包介素一 1，參見(jiàn)Jeng等人于1994年在《Immunol丄ett》 42: 113中發(fā)表的文章)的表達(dá)來(lái)間接改變細(xì)胞與基質(zhì)的相互作 用的。在某些給定的器官例如腎臟中，半乳糖凝集素-3的表達(dá) 受發(fā)育影響因素的調(diào)控，在受損傷之后，半乳糖凝集素-3在肺 泡上皮細(xì)胞和肝細(xì)月包中的表達(dá)水平是上調(diào)的。已經(jīng)表明，在細(xì)月包 增殖過(guò)程中，半乳糖凝集素-3集中在某些細(xì)胞類型的細(xì)胞核中。 在某些腫瘤中半乳糖凝集素-3的表達(dá)被加強(qiáng)，這表明半乳糖凝 集素-3在細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起了作用。的確，半乳糖凝集素-3在病態(tài)的轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系中的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)移傾向的顯著增加(參見(jiàn)
Raz等人在《Supra》中發(fā)表的文章)。
人類半乳糖凝集素-3有250個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，其分子量約為 26.1kDa(序歹'J 1，附圖1)。正如附圖1、 3、 5和7中所描述的， 人類半乳糖凝集素-3含有下述結(jié)構(gòu)域、信號(hào)序列、或者其他結(jié) 構(gòu)特征(關(guān)于PS和PF前綴辨識(shí)數(shù)量的總說(shuō)明，請(qǐng)查閱 Sonnhammer等人于1997年在《蛋白質(zhì)》28: 405中發(fā)表的文章) 位于序列1的1 - 14位氨基酸殘基處的N-末端結(jié)構(gòu)域；位于序 列1的15-116位氨基酸殘基處的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸 的結(jié)構(gòu)域；位于序列1的117 -247位氨基酸殘基處的半乳糖苷 結(jié)合區(qū)&戈；位于序列1的181 - 200位氨基酸處的一種galaptin 4言號(hào)序列(PROSITE凄t4居庫(kù)編號(hào)PS00309); ^f立于序列1的4 - 7位氨基酸處的一種潛在的N -糖基化位點(diǎn)(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù) 編號(hào)PS00001 ); ^f立于序列1的137 - 139 4立和194一196 4立的氨 基酸處的兩個(gè)潛在的蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù) 編號(hào)PS00005 ); 4立于序列1的6 - 9 4立和175 — 178 4立的氨基酉吏 處的兩個(gè)潛在的酪蛋白II磷酸化位點(diǎn)(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào) PS00006); >(立于序列l(wèi)的24 — 294立、27 - 32^f立、34 — 3SM立、43 一48 4立、52 — 57 4立、61 —66 4立、65 — 70 4立以及68 — 73 4立的氛 基酸處的/\個(gè)潛在的肉豆蔻?；稽c(diǎn)(PROSITE凄t據(jù)庫(kù)編號(hào) PS00008 )。
這里定義的"半乳糖凝集素-3蛋白，，可以包括一種半乳糖 凝集素-3的"N -末端結(jié)構(gòu)域"， 一種半乳糖凝集素-3的"富 含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的結(jié)構(gòu)域"，和/或一種半乳糖凝集素 -3的"半乳糖苷結(jié)合區(qū)域"。這些結(jié)構(gòu)域?qū)⒃诤竺孢M(jìn)行進(jìn)一步的 描述。
24這里使用的半乳糖凝集素-3的"N-末端結(jié)構(gòu)域"包含一 種長(zhǎng)約10-20個(gè)氨基酸的氨基酸序列，優(yōu)選是長(zhǎng)約14個(gè)氨基酸 的氨基酸序列，并且該序列與序列1中的1 - 14位氨基酸具有至 少60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99%或者100%的同一'〖生。 所述N -末端結(jié)構(gòu)域可以包含一種N -糖基化位點(diǎn)(PROSITE數(shù) 據(jù)庫(kù)編號(hào)PS00001 )和/或一種酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn) (PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)PS00006)。所述N-糖基化位點(diǎn)具有下 述重復(fù)序列N-{P}-[ST]-{P}，而所述酪蛋白激酶II石粦酸化位點(diǎn) 具有下述重復(fù)序列[ST]-X(2)-[DE]。在上述重復(fù)序列以及在本 發(fā)明描述的其他基序或者信號(hào)序列中，使用標(biāo)準(zhǔn)IUPAC命名法 用單個(gè)字母代表氨基酸。在這種表示形式中，每個(gè)要素之間用破
折號(hào)(——)隔開(kāi)；方括號(hào)([])表示該位置處可以接受的特定 殘基；X表示該位置處可以接受的任意氨基酸殘基；圓括號(hào)(()) 內(nèi)的數(shù)字表示該任意氨基酸殘基的數(shù)量。在某些實(shí)施方式中，所 述N-末端結(jié)構(gòu)域包含序列1中的氨基酸L7和L11。如附圖3 中所示，在幾個(gè)不同種類哺乳動(dòng)物的半乳糖凝集素-3中，這些 氨基酸是保守的，因此具有催化和/或結(jié)構(gòu)作用。
這里4吏用的半乳糖凝集素-3的"富含脯氨酸、甘氨酸和酪 氨酸的結(jié)構(gòu)域"包含一種長(zhǎng)約60 - 140個(gè)氨基酸的氨基酸序列， 更優(yōu)選是長(zhǎng)約80- 120個(gè)氨基酸的氨基酸序列，或者是長(zhǎng)約90 -110個(gè)氨基酸的氨基酸序列，并且該序列與序列1中的15-116 ^f立氨基酸具有至少60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99%或者 100%的同一性。所述富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的結(jié)構(gòu)域還 可以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)或者^(guò)乂個(gè) N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)PS00008 ),這些位 點(diǎn)具有下述重復(fù)序列G-{EDRKHPFYW}-X(2)-[STAGCN]-{P}。 在某些實(shí)施方式中，所述富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的結(jié)構(gòu)域 包含下述來(lái)自序歹"1的氨基酸及氨基酸區(qū)域G21, P23, G27,
25N28, P30, G32, G34, P37， Y41-P46, G53, Y55-G57, P61, G62, G66, P72, G73, G77, Y79-G81, P83， G87, Y89, P90, G99, Y101, P102, P106, Y107, A109, L114,以及V116。在 幾個(gè)不同種類哺乳動(dòng)物的半乳糖凝集素-3中，這些氨基酸及氨 基酸區(qū)域是保守的，因此具有催化和/或結(jié)構(gòu)作用(參見(jiàn)附圖3 中用"*"表示的氨基酸)。
這里使用的半乳糖凝集素-3的"半乳糖苷結(jié)合區(qū)域"包含 一種長(zhǎng)約80 - 180個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其與PFAMlt據(jù)庫(kù)編 號(hào)為PF00337的重復(fù)序列(序歹'J 3)進(jìn)行序列比對(duì)的結(jié)果為至少 150比特值(bit score )。優(yōu)選的，半乳糖凝集素-3的半乳糖苷 結(jié)合區(qū)域包含至少約100- 160個(gè)氨基酸，更優(yōu)選包含至少約110 - 150個(gè)氨基酸，或者包含至少約120- 140個(gè)氨基酸，并且其與 PFAM凌t才居庫(kù)纟扁號(hào)為PF00337的重復(fù)序歹'J (序歹'J 3)進(jìn)^f亍序歹'J比 對(duì)的結(jié)果為至少150比特值(bit score),更優(yōu)選為至少175比特 值(bit score),最優(yōu)選為200比特值(bit score )或者更高。
如果想將一種特定序列與PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)為PF00337的重 復(fù)序列進(jìn)行序列比對(duì)以計(jì)算其比特值，可以 <吏用乂人 www.sanger.ac.uk/Software/Pfam中獲4尋的,默;人參凄t進(jìn)入PFAM #: 據(jù)庫(kù)HMMs (例如PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)，2.1版本)針對(duì)想要比對(duì)的序 列進(jìn)行4企索。對(duì)PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)的描述可以參見(jiàn)Sonnhammer等人 在《Supra》中發(fā)表的文章，對(duì)HMMs數(shù)據(jù)庫(kù)的詳細(xì)描述可以參 見(jiàn)例如Gribskov等人于1990年在《Meth.Enzymol》183: 146中 發(fā)表的文章，以及Stultz等人于1993年在《蛋白質(zhì)科學(xué)》2: 305 中發(fā)表的文章。
半乳糖凝集素-3的半乳糖苷結(jié)合區(qū)域可以進(jìn)一步包含一 種、優(yōu)選兩個(gè)蛋白激酶C石粦酸化位點(diǎn)(PROSITE彩:據(jù)庫(kù)編號(hào) PS00005 ); —種酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)PS00006);和/或一種galaptin信號(hào)序列(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù) 編號(hào)PS00309 )。所述蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)具有下述重復(fù)序列 [ST]-X-[RK]。所述galaptin信號(hào)序列具有下述重復(fù)序歹'J : W國(guó)[GEK]-X-[EQ]-X-[KRE]-X ( 3 ，6 )畫(huà)[PCTF]-[LIVMF]-[NQEGSKV]-X-[GH]-X(3)畫(huà)[DENKHS]-[LIVMFC]。在某些實(shí)施方 式中，所述半乳糖凝集素-3的半乳糖苷結(jié)合區(qū)域包含下述來(lái)自 序列1的氨基酸和氨基酸區(qū)域P117, Y118, L120-L122, G125, P128, R129, L131-I134, G136-V138, N141， N143, R144， L147, F149, R151，G152, D154, A156-F163, E165， R169-N174， N179-G182， E184-R186, F190-E193， G195， P197-K199， Q201-L203, E205， D207-Q220, N222, R224, L228， 1231, 1236, G238-I240，以及L242-S244。在幾個(gè)不同種類哺乳動(dòng)物的半乳 糖凝集素-3中，這些氨基酸及氨基酸區(qū)域是保守的，因此具有 催化和/或結(jié)構(gòu)作用(參見(jiàn)附圖3中用"*"表示的氨基酸)。
本發(fā)明中的某些半乳糖凝集素-3蛋白包含如序列1所表示 的人類半乳糖凝集素-3的氨基酸序列。本發(fā)明中的其他半乳糖 凝集素-3蛋白包含的氨基酸序列在基本上同源于序列1表示的 氨基酸序列。這里使用的術(shù)語(yǔ)"基本上同源"是指第一氨基酸序 列包含了足夠數(shù)量的、或者最少數(shù)量的與第二氨基酸序列中的比 對(duì)氨基酸殘基相同的氨基酸殘基，這樣第 一氨基酸序列與第二氨 基酸序列就能夠具有相同的結(jié)構(gòu)區(qū)i或和/或相同的功能活性。例 如，某些氨基酸序列包含與序列l(wèi)相同的結(jié)構(gòu)區(qū)域，其與序列1 具有至少60%或者65%的序列同一性，優(yōu)選具有至少75%的序 列同一性，更優(yōu)選具有至少85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94 %、 95%、 96%、 97%、 98%或者99%的序列同一'1"生，這種氨基 酸序列被稱為與序列1的氨基酸序列在基本上同源。特別的，那 些經(jīng)過(guò)偶然的或者故意的i秀導(dǎo)改變的蛋白質(zhì)，例如序列1中的某 些氨基酸殘基發(fā)生缺失、添加、取代或者修飾，也屬于本發(fā)明定
27義的半乳糖凝集素-3蛋白的范圍之內(nèi)。同樣可以意識(shí)到，這里 定義的半乳糖凝集素-3蛋白可以包含乂人其他種類的哺乳動(dòng)物中 獲得的半乳糖凝集素-3蛋白的氨基酸區(qū)域，所述的其他種類的 哺乳動(dòng)物包括^f旦不局限于牛，犬科動(dòng)物，貓科動(dòng)物，7>山羊，綿 羊，豬類，鼠考牛動(dòng)物以及馬。
4安照下面描述的方法進(jìn)4亍序列間的同 一 性計(jì)算。要確定兩個(gè) 氨基酸序列間的同 一性百分?jǐn)?shù)，需要將兩個(gè)序列——對(duì)齊以達(dá)到 最佳比較的目的(例如，可以在第一種序列和第二個(gè)序列中的一 種或者兩個(gè)中引入缺口 (gaps)，以便達(dá)到最佳的對(duì)齊效果)。然 后對(duì)相應(yīng)的氨基酸位置或者核苦位置處的氨基酸殘基進(jìn)行比較。 當(dāng)?shù)谝环N氨基酸序列某位置處的氨基酸殘基或核苷與第二個(gè)氨 基酸序列的相應(yīng)位置處的氨基酸殘基或核苷相同時(shí)，所述位置處 的蛋白質(zhì)就是相同的。兩個(gè)序列間的同 一性百分tt是一種基于兩 個(gè)序列相同位置的數(shù)量的函數(shù)，還要考慮到為進(jìn)行最佳比對(duì)而引 入到兩個(gè)序列中的缺口的數(shù)量，以及每個(gè)缺口的長(zhǎng)度。
可以〗吏用凄t學(xué)運(yùn)算法則來(lái)完成序列的比乂十和兩個(gè)序列的同 一性百分凄t的計(jì)算。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以-使用默i人參 數(shù)在比對(duì)軟件程序中計(jì)算兩個(gè)氨基酸序列的同 一性百分?jǐn)?shù)。適合 的程序包括，例如，Thompson等人于1994年在《核S臾研究》22: 4673發(fā)表的文章中涉及的CLUSTALW (漸進(jìn)式多序列比對(duì))程 序(www.ebi.ac.uk/clustalw )， Tatusova和Madden于1999年在 《FEMS Microbiol丄ett.》174: 247發(fā)表的文章中涉及的BL2SEQ 程序(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2eq/bl2.html), Notredame和 Higgins于1996年在《一亥酸研究》24: 1515發(fā)表的文章中涉及的 SAGA程序 (igs-server.cnrs-mrs.fr/ ~ cnotred ), 以及Morgenstern 等人于1998年在《生物信息學(xué)》14: 290發(fā)表的文章中涉及的 DIALIGN禾呈序(bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/dialign )。
28半乳糖凝集素- 7
典型的半乳糖凝集素-7蛋白質(zhì)家族成員以單體形式存在， 所述單體包含約130個(gè)到140個(gè)氨基酸，其分子量約為15kDa到 16kDa (例如，參見(jiàn)Magnaldo等人于1995年在《生物學(xué)發(fā)展》 168: 259中發(fā)表的文章；和Madsen等人于1995年在《生物化 學(xué)雜志》270: 5823中發(fā)表的文章)。半乳糖凝集素-7的表達(dá)與 上皮細(xì)力包層化的發(fā)作有關(guān)(參見(jiàn)Timmons等人于1999年在 《IntJ.Dev.Biol》43: 229中發(fā)表的文章)。半乳糖凝集素-7被認(rèn) 為在細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用中發(fā)揮作用。在細(xì)胞 與細(xì)胞接觸的區(qū)域中(例如，在人類表皮的上層)發(fā)現(xiàn)存在半乳 糖凝集素-7;在軟瓊脂角化細(xì)胞中半乳糖凝集素-7的表達(dá)^l急 劇的負(fù)調(diào)節(jié)，并且在惡性角化細(xì)胞系中是缺失的。半乳糖1是集素 -7對(duì)于常態(tài)角化細(xì)力包的維持來(lái)i兌可能是必需的(參見(jiàn)Madsen 等人在《Supra》中發(fā)表的文章)。
人類半乳糖凝集素-7包含136個(gè)氨基酸，其分子量約為 15.1kDa (見(jiàn)附圖2中的序列2)。如附圖2， 4， 6和8中所示， 人類半乳糖凝集素-7含有下述結(jié)構(gòu)域，信號(hào)序列或者其他結(jié)構(gòu) 特征 一種半乳糖苷結(jié)合區(qū)域，位于序列2的5 - 135位氨基酸 殘基處； 一種galaptin信號(hào)序列(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)PS00309 ), 位于序列2的70 - 89位氨基酸殘基處； 一種N-糖基化^f立點(diǎn) (PROSITE凄t才居庫(kù)編號(hào)PS00001 )， 4立于序列2的29 — 32 4立氨 基酸殘基處； 一種蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)編 號(hào)PS00005 ), ^f立于序歹'J 2的132 — 134 ^立氨基酉臾歹戈基處； 一種 酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)PS00006)， 位于序列2的9- 12位氨基酸殘基處；以及兩個(gè)肉豆蔻?；稽c(diǎn) (PROSITE凄史才居庫(kù)編號(hào)PS00008 ), ^f立于序列2的13 — 18、 44 - 49位的氨基酸殘基處。這里定義的"半乳糖凝集素-7蛋白"包含一種半乳糖凝集
素-7的"半乳糖苷結(jié)合區(qū)域"。這個(gè)區(qū)域?qū)⒃谙旅娴膬?nèi)容中進(jìn)一 步描述。
這里使用的半乳糖凝集素-7的"半乳糖苷結(jié)合區(qū)域"包含 一種長(zhǎng)約80 - 180個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其與PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)編 號(hào)為PF00337的重復(fù)序列(序列3)進(jìn)行序列比對(duì)的結(jié)果為至少 80比特值(bit score )。優(yōu)選的，半乳糖凝集素-7的半乳糖苷結(jié) 合區(qū)i或包含至少約100- 160個(gè)氨基臥復(fù)，更^f尤選包含至少約110 -150個(gè)氨基酸，或者包含至少約120- 140個(gè)氨基酸，并且其與 PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)為PF00337的重復(fù)序列(序列3 )進(jìn)行序列比 對(duì)的結(jié)果為至少80比特值(bit score)，更優(yōu)選為至少100比特 值(bit score),最優(yōu)選為120比特值(bit score)或者更高。所 述半乳糖凝集素-7的半乳糖苷結(jié)合區(qū)域可以包含一種N-糖基 化位點(diǎn)(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)PS00001 ); —種蛋白激酶C磷 酸化位點(diǎn)(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)PS00005 ); —種酪蛋白激酶 II磷酸化位點(diǎn)(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)PS00006); —種或者兩 個(gè)肉豆蔻?；稽c(diǎn)(PROSITE凌t據(jù)庫(kù)編號(hào)PS00008 );和/或一 種galaptin信號(hào)序歹'J ( PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)PS00309 )。在某些 實(shí)施方式中，所述半乳糖凝集素-7的半乳糖苷結(jié)合區(qū)域包含下 述來(lái)自于序列2的氨基酉菱序列和氨基酉菱區(qū)i或Ml, S2， H6, K7, L10, Pll, G13, R15, G17-V19, R21-G24,V26, P27， A30, R32-Q43, D46-N63, K65, Q67, G68， W70畫(huà)G76， G78， P80-L90, 192， G97-K99, V101， G103， D104, Y107, H109, F110， H112, R113, P115, V119， R120， V122-L130, S132, 1135,以及F136。 在幾個(gè)不同種類哺乳動(dòng)物的半乳糖凝集素-7中，這些氨基酸及 氨基酸區(qū)域是保守的，因此具有催化和/或結(jié)構(gòu)作用(參見(jiàn)附圖4 中用表示的氨基酸)。
30本發(fā)明中的某些半乳糖凝集素-7蛋白包含如序列2所表示 的人類半乳糖凝集素_ 7的氨基酸序列。本發(fā)明中的其他半乳糖 凝集素-7蛋白包含的氨基酸序列在基本上同源于序列2表示的 氨基酸序列。特別的，那些經(jīng)過(guò)偶然的或者故意的誘導(dǎo)改變的蛋 白質(zhì)，例如序列2中的某些氨基酸殘基發(fā)生缺失、添加、取代或 者修飾，也屬于本發(fā)明定義的半乳糖凝集素-7蛋白的范圍之內(nèi)。 同樣可以意識(shí)到，這里定義的半乳糖凝集素-7蛋白可以包含從 其他種類的哺乳動(dòng)物中獲得的半乳糖凝集素-7蛋白的氨基酸區(qū) 域，所述的其他種類的哺乳動(dòng)物包括^旦不局限于牛，犬^牛動(dòng)物， 貓牙牛動(dòng)物，7>山羊，綿羊，豬類，鼠^f動(dòng)物以及馬。
半乳糖凝集素_ 8
半乳糖凝集素-8是一類被廣泛表達(dá)的蛋白，存在于例如肝 臟、心臟、肌肉、腎臟、脾臟、下肢和大腦中，人類及鼠類半乳 糖凝集素-8蛋白及半乳糖凝集素-8基因序列是可以獲得的(例 如參見(jiàn)Hadari等人于 1997年在《Trends in Glycosci and Glycotechnol》9: 103-112中發(fā)表的文章)。由于半乳糖凝集素-8具有很高的親水活性，并且具有與黏蛋白上的O-聯(lián)寡糖中的 Gal P 1 _ 4GlcNAC相結(jié)合的能力，這使得半乳糖凝集素-8成為 治療干眼綜合癥的理想制劑。
目前已知兩種半乳糖凝集素-8的氨基酸序列類型， 一種是 含316個(gè)氨基酸的序列類型(Accession編號(hào)000214,建立于1997 年11月1日)，另一種是含359個(gè)氨基酸的序列類型(Accession 編號(hào)Q8TEV1，建立于2002年6月1日)。上述兩個(gè)序列雖然主 要長(zhǎng)度相同或者相似，但其區(qū)別并不僅僅在于總長(zhǎng)度不同，兩者 還有一些其他區(qū)別。使用單字母方法表示的316個(gè)氨基酸的序列 類型如下(序列4):
31MLSLNNLQNIIYNPVIPYVG TIPDQLDPGT LIVICGHVPS DADRFQVDLQ NGSSVKPRAD 60 VAFHFNPRFK RAGCIVCNTLINEKWGREEITYDTPFKREK SFEIVIMVLK DKFQVAVNGK 120 HTLLYGHRIG PEKIDTLGIY GKVNIHSIGF SFSSDLQSTQ ASSLELTEIS RENVPKSGTP 180 QLSLPFAARL NTPMGPGRTV VVKGEVNANA KSFNVDIXAG KSKDIALHLN PRLNIKAFVR 240
NSFLQESWGE EERNITSFPF SPGMYFEMIIYCDVREFKVA VNGVHSLEYK HRFKELSSID 300 TLEINGDIHL LEVRSW 316
長(zhǎng)一些的氨基酸序列類型(359個(gè)氨基酸)如下(序列5):
MMLSLNNLQN HYSPVIPYV GTIPDQLDPG TLIVICGHVP SDADRFQVDL QNGSSVKPRA 60 DVAFHFNPRF KRAGCIVCNT LINEKWGREEITYDTPFKRE KSFEIVIMVL KDKFQVAVNG 120 KHTLLYGHRIGPEKIDTLGIYGKVNIHSIG FSFSSDLQST QASSLELTEI SRENVPKSGT 180 PQLPSNRGGDISKIAPRTVY TKSKDSTYNH TLTCTKIPPT NYVSKILPFA ARLNTPMGPG 240 GTWVKGEVN ANAKSFNVDL LAGKSKHIAL HLNPRLNIKA FVRNSFLQES WGEEERNITS 300
FPFSPGMYFE MIIYCDVREF KVAVNGVHSL EYKHRFKELS SIDTLE腦D IHLLEVRSW 359
這里定義的"半乳糖凝集素-8蛋白，，可以包含一種半乳糖 凝集素-8的"N-末端結(jié)構(gòu)域"， 一種半乳糖凝集素-8的"富 含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的結(jié)構(gòu)域"，和/或一種半乳糖凝集素
-8的"半乳糖苷結(jié)合區(qū)域"。這些結(jié)構(gòu)域?qū)⒃诤竺娴膬?nèi)容中進(jìn)行
進(jìn)一步描述。
這里4吏用的半乳糖凝集素-8的"N-末端結(jié)構(gòu)域"包含一 種長(zhǎng)約10-20個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，優(yōu)選是一種長(zhǎng)約14 個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，并且該序列與序列4或者序列5的 1 - 14^f立氨基酸具有至少60% 、 70%、 80%、 90%、 95%、 99% 或者100%的同一'l"生。所述N-末端結(jié)構(gòu)i或可以包含一種N-#唐 基化位點(diǎn)(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)PS00001 )和/或一種酪蛋白激 酶II磷酸化位點(diǎn)(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)PS00006)。所述N-糖基化位點(diǎn)具有下述重復(fù)序列N-{P}-[ST]-{P}，而所述酪蛋白 激酶II-粦酸化位點(diǎn)具有下述重復(fù)序列[ST]-X(2)-[DE]。在上迷 重復(fù)序列和其他基序或者信號(hào)序列中，使用標(biāo)準(zhǔn)IUPAC命名法 用單個(gè)字母代表氨基酸。在這種表示形式中，每個(gè)要素之間用破
折號(hào)(——)隔開(kāi)；方括號(hào)([])表示該位置處可以接受的特定
32殘基；X表示該位置處可以接受的任意氨基酸殘基；圓括號(hào)(()) 內(nèi)的凌t字表示該任意氨基酸殘基的凄史量。
這里使用的半乳糖凝集素-8的"富含脯氨酸、甘氨酸和酪 氨酸的結(jié)構(gòu)域，，包含一種長(zhǎng)約60- 140個(gè)氨基酸的氨基酸序列， 更優(yōu)選是長(zhǎng)約80- 120個(gè)氨基酸的氨基酸序列，或者是長(zhǎng)約90 -110個(gè)氨基酸的氨基酸序列，并且該序列與序列4和序列5中 各自的15—116<立氨基酉臾具有至少60%、 70%、 80%、 90%、 95 %、 99%或者100%的同一'1"生。所述富含脯氨酸、甘氨S臾和酪氨 酸的結(jié)構(gòu)域還可以包含一種、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、 七個(gè)或者7\個(gè)N-肉豆蔻酰^M立點(diǎn)(PROSITE泰:才居庫(kù)編號(hào) PS00008 ),這些 <立點(diǎn)具有下述重復(fù)序列 G-{EDRKHPFYW}-X(2)-[STAGCN]-{P}。在某些實(shí)施方式中，所 述富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的結(jié)構(gòu)域包含下述來(lái)自序列4的 氨基酸及氨基酸區(qū)域G20, P23，P28， G29， G36, P39，以 及其他的對(duì)于本領(lǐng)域:技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的類似殘基。在幾個(gè) 不同種類哺乳動(dòng)物的半乳糖凝集素-8中，這些氨基酸及氨基酸 區(qū)域是保守的，因此具有催化和/或結(jié)構(gòu)作用。在某些實(shí)施方式中， 所述富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的結(jié)構(gòu)域包含下述來(lái)自序列5 的氛基f復(fù)及氛基酉臾區(qū)；或G21，P24, P29， G30, G37, P40， 以及其他的對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的類似殘基。
這里使用的半乳糖凝集素-3的"半乳糖苷結(jié)合區(qū)域"包含 一種長(zhǎng)約80 - 180個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其與PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)編 號(hào)為PF00337的重復(fù)序列(序歹'J 3)進(jìn)行序列比對(duì)的結(jié)果為至少 150比特值(bit score )。優(yōu)選的，半乳糖凝集素-8的半乳糖苷 結(jié)合區(qū)域包含至少約100- 160個(gè)氨基酸，更優(yōu)選包含至少約110 -150個(gè)氨基酸，或者包含至少約120- 140個(gè)氨基酸，并且其與 PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)為PF00337的重復(fù)序列(序歹'J 3)進(jìn)行序列比
33對(duì)的結(jié)果為至少150比特值(bit score),更優(yōu)選為至少175比特 值(bit score),最優(yōu)選為200比特值(bit score )或者更高。
如果想將一種特定序列與PFAM凄丈據(jù)庫(kù)編號(hào)為PF00337的重 復(fù)序列進(jìn)行序列比對(duì)以計(jì)算其比特值，可以 <吏用乂人 www.sanger.ac.uk/Software/Pfam中獲得的默認(rèn)參凄t進(jìn)入PFAM彰 據(jù)庫(kù)HMMs (例如PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)，2.1版本)針對(duì)想要比對(duì)的序 列進(jìn)行檢索。對(duì)PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)的描述可以參見(jiàn)Sonnhammer等人 在《Supra》中發(fā)表的文章，對(duì)HMMs數(shù)據(jù)庫(kù)的詳細(xì)描述可以參 見(jiàn)例如Gribskov等人于1990年在《Meth.Enzymol》183: 146中 發(fā)表的文章，以及Stultz等人于1993年在《蛋白質(zhì)科學(xué)》2: 305 中發(fā)表的文章。
半乳糖凝集素-8的半乳糖苦結(jié)合區(qū)域可以進(jìn)一步包含一 種、優(yōu)選兩個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào) PS00005 ); —種酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)(PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)編 號(hào)PS00006);和/或一種galaptin 4言號(hào)序列(PROSITE凄t才居庫(kù) 編號(hào)PS00309 )。所述蛋白激酶C -粦酸化位點(diǎn)具有下述重復(fù)序列 [ST]-X-[RK]。
所述galaptin信號(hào)序列具有下述重復(fù)序列 W-[GEK]-X-[EQ]-X-[KRE]國(guó)X(3,6)-[PCTF]-[LIVMF]- [NQEGSKV] -X-[GH]-X(3)- [DENKHS]-[LIVMFC]。在某些實(shí)施方式中，所述 半乳糖凝集素-8的半乳糖苷結(jié)合區(qū)域包含下述來(lái)自序列4的氨 基酸和氨基酸區(qū)域L123-L124, G126， P131 ， R128, L140-I146, 以及其他如前所述的相似位點(diǎn)。在幾個(gè)不同種類哺乳動(dòng)物的半乳 糖凝集素-8中，這些氨基酸及氨基酸區(qū)域是保守的，因此具有 催化和/或結(jié)構(gòu)作用(參見(jiàn)附圖3中用"*"表示的氨基酸)。
本發(fā)明中的某些半乳糖凝集素_ 8蛋白包含如序列4和序列 5所表示的人類半乳糖凝集素-8的氨基酸序列。本發(fā)明中的其 他半乳糖凝集素-8蛋白包含的氨基酸序列在基本上同源于序列4或者序列5表示的氨基酸序列。這里使用的術(shù)語(yǔ)"基本上同源" 是指第 一種氨基酸序列包含了足夠數(shù)量的、或者最少數(shù)量的與第 二個(gè)氨基酸序列中的比對(duì)氨基酸殘基相同的氨基酸殘基，這樣第 一種氨基酸序列與第二個(gè)氨基酸序列就能夠具有相同的結(jié)構(gòu)區(qū) i^和/或相同的功能活性。例如，某些氨基酸序列包含與序列4 或者序列5相同的結(jié)構(gòu)區(qū)i或，其與序列4或者序列5具有至少60 %或者65%的序列同一性，優(yōu)選具有至少75%的序列同一性， 更優(yōu)選具有至少85 % 、 90 % 、 91 % 、 92 % 、 93 % 、 94 % 、 95 % 、 96%、 97%、 98%或者99%的序列同一性，這種氨基酸序列一皮稱 為與序列4或者序列5的氨基酸序列在基本上同源。特別的，那 些經(jīng)過(guò)偶然的或者故意的i秀導(dǎo)改變的蛋白質(zhì)，例如序列4或者序 列5中的某些氨基酸殘基發(fā)生缺失、添加、取代或者修飾，也屬 于本發(fā)明定義的半乳糖凝集素-8蛋白的范圍之內(nèi)。同樣可以意 識(shí)到，這里定義的半乳糖;疑集素-8蛋白可以包含乂人其他種類的 哺乳動(dòng)物中獲得的半乳糖凝集素-8蛋白的氨基酸區(qū)域，所述的 其他種類的哺乳動(dòng)物包括但不局限于牛，犬科動(dòng)物，貓科動(dòng)物， 乂>山羊，綿羊，豬類， 一牛動(dòng)物以及馬。
干眼綜合癥—皮認(rèn)為是眼科學(xué)中的"普通感冒"，是導(dǎo)致病人 向眼科醫(yī)師抱怨的第二常見(jiàn)的癥狀。有將近150萬(wàn)美國(guó)人都患有 干眼癥。這種疾病是由于淚膜的結(jié)構(gòu)缺陷或者功能缺陷而引起 的。淚力莫具有一種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，其產(chǎn)生的淚液和翻轉(zhuǎn)(turnover) 都是保持眼表健康的重要因素。淚膜由三個(gè)層構(gòu)成黏蛋白層(最 內(nèi)層)，水液層(中間層)以及脂質(zhì)層(最外層)。三個(gè)層中任意 一層的功能紊亂都可以導(dǎo)致干眼疾病的發(fā)生。淚力莫通過(guò)存在于其 最內(nèi)層的黏蛋白分子與上皮細(xì)胞的表面相連接。所述黏蛋白層能 促進(jìn)淚膜在角膜表面的均勻分布，是維持眼表適度濕潤(rùn)的必不可 少的物質(zhì)。如果黏蛋白分子沒(méi)有黏附于眼球上，將會(huì)導(dǎo)致上皮缺 損，即使使用了普通的水樣淚液。淚膜的分布缺陷將導(dǎo)致眼表或者淚膜的傷害，并且造成干眼疾病。內(nèi)層的黏蛋白層是由結(jié)膜杯 狀細(xì)胞、結(jié)膜上皮細(xì)胞和角膜上皮細(xì)月包分泌的。眼黏蛋白可以形
成膜(例如MUCI和MUCU)，或者形成凝膠/分泌凝膠(例如 MUC5AC )。
黏蛋白是一類大分子糖蛋白，其中O-聯(lián)糖類占黏蛋白質(zhì)量 的至少一半。豐富的O-聯(lián)糖側(cè)鏈?zhǔn)鞘桂さ鞍拙哂懈哂H水性的原 因。人們認(rèn)為，正是由于這種親水特性，才使得水液層能夠均勻 分布于眼球之上。
本發(fā)明是基于半乳糖凝集素具有能治療干眼綜合癥(DES ) 這一治療學(xué)用途而完成的。這種用途是基于半乳糖凝集素具有的 糖類結(jié)合特性而產(chǎn)生的，并不限于使用了任何特殊的方法。以眼 藥水形式局部施用半乳糖凝集素能夠促進(jìn)淚膜的分布，這一作用 是通過(guò)將分泌型黏蛋白與^爭(zhēng)膜黏蛋白相結(jié)合或者與存在于結(jié)膜上 皮細(xì)胞表面和角膜上皮細(xì)胞表面的其他糖蛋白相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明的實(shí)施例檢驗(yàn)了在三個(gè)不同的患有干眼的小鼠模型 中分別局部施用半乳糖凝集素溶液所產(chǎn)生的作用。在一種^^莫型 中，依照Pflugfelder實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的方法(參見(jiàn)Dursun等人于2002 年在《Invest Ophtha腦l&Vis Sci》43: 632 - 638中發(fā)表的文章； 以及Pflugfelder等人于2003年在《目艮表》1: 31 — 36中發(fā)表的文 章)，通過(guò)在普通小鼠的尾部施用東莨菪^5成片劑，導(dǎo)致小鼠淚液 不足。第二個(gè)模型利用MRL/lpr自體免疫小鼠，其具有淚腺炎性 病變(inflammatory lesions),這個(gè)才莫型 一皮-i人為具有干火喿綜合癥 (Sjogrens Syndrome)(參見(jiàn)Jabs等人于1991年在《Invest Ophthamol&Vis Sci》32: 371 _ 380中發(fā)表的文章；以及Jabs等 人于1997年在《當(dāng)代眼科研究》16: 909 - 916中發(fā)表的文章)。 對(duì)第三個(gè)沖莫型進(jìn)行白細(xì)胞介素-1 oc的注射，從而得到一種等^介于具有干燥綜合癥的動(dòng)物模型(參見(jiàn)Zoukhri, D等人在《Invest Ophthamol&Vis Sci》42 ( 5 ): 925 - 932中發(fā)表的文章)。
對(duì)三個(gè)模型進(jìn)行體內(nèi)淚液試驗(yàn)、體內(nèi)淚液清除試驗(yàn)以及體內(nèi) 角膜熒光素染色試驗(yàn)，并將結(jié)果與使用溶媒處理過(guò)的對(duì)照組動(dòng)物 進(jìn)行比較，以確定在這些參數(shù)之下不同濃度的半乳糖凝集素-1、 半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8單獨(dú)使 用或者組合〗吏用而產(chǎn)生的作用。在體內(nèi)試-驗(yàn)之后， -使用生化方法 對(duì)分離的淚腺進(jìn)行試驗(yàn)，使用組織病理學(xué)方法對(duì)眼表進(jìn)行試馬會(huì)。 進(jìn)一步的，4企-驗(yàn)到在進(jìn)行東萊菪石咸處理之前先4吏用半乳糖凝集素 溶液作預(yù)處理而產(chǎn)生的作用，這是半乳糖凝集素與(3 -乳糖—— 一種半乳糖凝集素抑制劑共同使用而產(chǎn)生的可能的作用。
實(shí)施例得到的數(shù)據(jù)表明，在上述動(dòng)物模型中，半乳糖凝集素 對(duì)與干眼綜合癥有關(guān)的可測(cè)量參#:產(chǎn)生了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的影響。相 比4支于4吏用安慰劑處理過(guò)的動(dòng)物，使用半乳糖凝集素處理過(guò)的動(dòng) 物的眼角膜的角膜熒光素染色減少，這有力的證明了半乳糖凝集 素對(duì)于人類干眼綜合癥具有優(yōu)秀的治療潛能。由于兩種動(dòng)物才莫型 代表了千眼綜合癥的不同形式，任何一種模型產(chǎn)生的陽(yáng)性結(jié)果都 有助于確定半乳糖凝集素在治療干眼綜合癥中所起的作用，并指 導(dǎo)臨床治療的重點(diǎn)，包括其他動(dòng)物試驗(yàn)以確定為發(fā)揮最大藥效、 持續(xù)最長(zhǎng)藥效時(shí)間、以及半乳糖凝集素與角膜和外源性黏蛋白的 最優(yōu)結(jié)合特性而需要使用的半乳糖凝集素的最佳濃度。進(jìn)一步 的，對(duì)其進(jìn)4于毒性研究以確定一種安全的眼用劑量，在獲得臨床 試—瞼批準(zhǔn)之前達(dá)到FDA的要求。
淚液的最內(nèi)層由黏蛋白組成，所述黏蛋白是由結(jié)月莫杯狀細(xì) 胞、角膜上皮細(xì)胞以及結(jié)膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生的。所述黏蛋白以分泌 型黏蛋白的形式存在并被釋放，或者所述黏蛋白仍然以^爭(zhēng)膜黏蛋 白的形式與上皮細(xì)胞相連接。這些分子是具有豐富o-聯(lián)寡糖側(cè)鏈的糖蛋白。這些側(cè)鏈決定了黏蛋白具有高親水特性，從而使水 液層均勻分布于眼J求之上。所述7JC液層由淚^泉產(chǎn)生，占淚月莫《且成
的約90% ，其中絕大部分是由水組成的，所述水中含有溶解鹽類，
葡萄糖，溶酶菌，淚液特異性前血清白蛋白，乳鐵傳遞蛋白，分
泌型免疫J求蛋白A以及其他蛋白。最外層的脂質(zhì)層能延遲水分蒸 發(fā)，它是由從瞼板腺產(chǎn)生的皮脂腺組成的。眨眼動(dòng)作可以使脂質(zhì) 層分布于淚膜表面(參見(jiàn)RheinstromSD于1999年發(fā)表的文章《干 眼癥》，收錄于由Yanoff等人編著的《眼科學(xué)》第1版，Mosley 國(guó)際有限7>司，圣^各易斯，MO)。
國(guó)家視力研究所將造成干眼癥的情況分為兩個(gè)主要的種類 水液層缺陷和蒸發(fā)缺陷。然而，臨床表現(xiàn)通常是兩種發(fā)病途徑的 結(jié)合(淚液的減少通常導(dǎo)致缺陷性油層分布的過(guò)多蒸發(fā)，而瞼板 腺疾病通常是與分泌不足性干眼癥相關(guān)聯(lián)的)。將水樣淚液缺陷 組次分類為干燥綜合癥型干眼癥以及非干燥綜合癥型干眼癥，能 夠發(fā)現(xiàn)兩個(gè)組之間存在重大的區(qū)別，并強(qiáng)調(diào)了干燥綜合征的炎性 表達(dá)(參見(jiàn)Foulks于2003年在《目艮表》1: 20 — 30中發(fā)表的文 章)。
水液層缺陷是最常見(jiàn)的導(dǎo)致干眼癥的原因，這通常是因?yàn)闇I 腺分泌的淚液的減少造成的，盡管其原因也包括淚液蒸發(fā)的增 多。導(dǎo)致分泌減少的原因包括干燥綜合癥，衰老性分泌不足，淚 腺切除，維生素A缺失，類肉狀瘤和淋巴瘤中的免疫淚腺損傷， 感官缺失或者運(yùn)動(dòng)反應(yīng)缺失，結(jié)膜瘢痕，以及隱形眼鏡的佩帶(參 見(jiàn)Rolando和Zierhut于2001年在《Surv Ophthalmol.》 45:S203 -S210中發(fā)表的文章)。水液層的組成成分的改變，例如電解液 濃度的增加，生長(zhǎng)因子的缺失，或者前炎性細(xì)月包因子的出現(xiàn)，以 及緩慢的淚液翻轉(zhuǎn)(tear turnover ),都同樣能夠?qū)е卵郾頁(yè)p傷。杯狀細(xì)胞缺陷以及由此產(chǎn)生的黏蛋白水平的降低，伴隨著很 多形式的干眼癥。某些細(xì)節(jié)處的失調(diào)會(huì)促4吏杯狀細(xì)胞的缺失。這
些失調(diào)包括維生素A的缺失，因?yàn)榫S生素A對(duì)于維持眼表的杯 狀細(xì)胞和黏蛋白是非常重要的，并且它能夠調(diào)節(jié)結(jié)膜的失調(diào)，例 如Stevens Johnson干燥綜合癥，沙目艮，類天皰掩，以及4匕學(xué)火免傷。 局部藥物處理以及防腐劑的 <吏用也同才羊能夠損傷眼表和杯狀細(xì) 胞(參見(jiàn)Rheinstrom SD于1999年發(fā)表的文章《干目艮癥》，收錄 于由Yanoff等人編著的《眼科學(xué)》第1版，Mosley國(guó)際有限公 司，圣3各易斯，MO; 以及Abelson等人于2003年在《Rev Ophthalmol》10: 1中發(fā)表的文章)。
i貪斷4支術(shù)除了能夠用以i平估病人的不適癥狀，已經(jīng)i正明該^支 術(shù)還能夠用于確定干眼綜合癥的嚴(yán)重程度及其起因。可以通過(guò)無(wú) 創(chuàng)性測(cè)量法使用熒光素溶液測(cè)定淚膜破裂時(shí)間(TBUT),進(jìn)而評(píng) 估淚膜的不穩(wěn)定性，并且測(cè)定生物顯樣￡技術(shù) 見(jiàn)察到的首次淚膜石皮 裂時(shí)間?？梢允褂媒?jīng)典的或者改進(jìn)的淚液分泌試驗(yàn)(Schirmer test)對(duì)淚液進(jìn)^"評(píng)估。熒光素或者類似染津+在眼表的著色程度 按照慣例被用來(lái)診斷眼表改變(alteration)的嚴(yán)重程度。這些染 料能夠著色于被剝奪了黏蛋白保護(hù)的上皮表面，或者著色于暴露 于上皮細(xì)胞膜的上皮表面。已經(jīng)創(chuàng)建了一套標(biāo)準(zhǔn)化分級(jí)體系來(lái)量 化損傷的嚴(yán)重程度。這些測(cè)試也同樣被例行公事的用在臨床試驗(yàn) 中，以評(píng)估作為研究對(duì)象的干眼癥治療方法的治療效果(參見(jiàn) Foulks于2003年在《目艮表》1: 20 — 30中發(fā)表的文章)。
人工淚液是目前干眼癥治療中的支柱。有很多種類的產(chǎn)品可 以使用，^旦所有這些產(chǎn)品才是供的都只是對(duì)癥狀的短時(shí)緩解。目前 尚不存在藥物能4丑轉(zhuǎn)這一局面?？梢酝ㄟ^(guò)向鹽類當(dāng)中添加高分子 量聚合體來(lái)制造人工淚液，高分子量聚合體是例如纖維素酯(甲 基纖維素，羥丙基曱基纖維素)或者聚乙烯醇。已經(jīng)制備了其他
39的人工淚液成分，來(lái)嘗試才莫擬淚液中的黏蛋白成分。研究表明， 人工淚液中使用的防腐劑能夠產(chǎn)生某些毒性，因此，已經(jīng)能夠得
到以單位劑量裝并瓦的不含防腐劑的人工淚液(參見(jiàn)Rheinstrom SD于1999年發(fā)表的文章《千眼癥》，收錄于由Yanoff等人編著 的《眼科學(xué)》第l版，Mosley國(guó)際有限公司，圣路易斯，MO; 以及Abelson等人于2003年在《Rev Ophthalmol》10: 1中發(fā)表
的文章)。
不同的治療形式也已經(jīng)被引入，包括那些針對(duì)于淚膜脂質(zhì)層的功 能失調(diào)以及針對(duì)于能導(dǎo)致疾病的潛在免疫性起因或者激素性起 因的治療方法(參見(jiàn)Brewitt等人于2001年在《Surv of Ophthalmol》45:S119-S202中發(fā)表的文章)。 一皮研究的治療方法 包括4吏用例如15 (S) - HETE (羥基-二十^友四烯酸)的局部 促分泌素的方法(參見(jiàn)Gamache等人于2000年在《眼角膜》 19:6:S88中發(fā)表的文章)，使用合成的P2Y2受體激動(dòng)劑的方法(參 見(jiàn)Jumblatt等人于1998年在《Exp Eye Res》67:341-346 )，以及 4吏用例如環(huán)孢菌素A和糖皮質(zhì)激素的抗炎劑的方法(參見(jiàn) Pflugfelder于2003年在《目艮表》1:31-36中發(fā)表的文章)。
已經(jīng)知曉，黏蛋白對(duì)健康的眼淚膜生理機(jī)能起到一定的作 用。黏蛋白是一類以蛋白為中樞(backbone)的大分子量糖蛋白， 并且具有高含量的糖。除了用于構(gòu)建黏蛋白層，黏蛋白自身還形 成一種多糖蛋白復(fù)合物，其具有的支架樣的結(jié)構(gòu)能夠幫助促進(jìn)細(xì) 胞粘附。它們還能夠防御眼表?yè)p傷。黏蛋白還負(fù)責(zé)提供淚膜的親 水性。它可以穩(wěn)定淚膜并且降低淚膜的表面張力，允許水液層均 勻分布于眼球表面上。如果沒(méi)有黏蛋白層，淚液將不能粘附于眼 表，從而導(dǎo)致眼表易于損傷(參見(jiàn)Abelson等人于2003年在《Rev Ophthalmol》10: 1中發(fā)表的文章)。
40體內(nèi)產(chǎn)生的兩種主要類型的黏蛋白是膜結(jié)合型黏蛋白(也 被稱為附膜黏蛋白)和分泌型黏蛋白。所述膜結(jié)合型黏蛋白 (MUC1, MUC2以及MUC4)內(nèi)含于細(xì)胞的脂質(zhì)雙分子層中。由 角膜非杯狀細(xì)胞及結(jié)膜非杯狀細(xì)胞表達(dá)的膜結(jié)合型黏蛋白被認(rèn)
為能夠促進(jìn)由杯狀細(xì)月包產(chǎn)生的分泌型黏蛋白(MUC5AC, MUC7) 在眼表的分布。兩種類型的黏蛋白的共同作用形成了 一種才幾能正 常的淚膜(參見(jiàn)Danjo等人于1998年在《Invest Ophthalmol Vis Sci》39: 2602-2609中發(fā)表的文章；以及Watanabe于2002年在 《眼角膜》21: S17-S22中發(fā)表的文章)。
結(jié)膜黏蛋白的缺陷是導(dǎo)致某些類型的干眼癥的原因之一。可 能的原因包括杯狀細(xì)胞密度的降低，黏蛋白分布及其性質(zhì)的改 變，以及黏蛋白信使RNA表達(dá)的減弱(參見(jiàn)Gipson等人于2000 年在《視網(wǎng)膜研究進(jìn)展》16: 1: 81-98中發(fā)表的文章；或者Gilbard 于2000年發(fā)表的文章"干眼疾病，，，收錄于Albert M等人編輯的 《目艮科學(xué)原理和實(shí)踐》第2版，費(fèi)城W.B.Saunders公司982-1001 中)。維生素A的缺失，局部的藥物治療，包含防腐劑的滴劑的 表達(dá)劑量以及生成瘢痕的結(jié)膜失調(diào)也都能夠損傷杯狀細(xì)胞和眼 表(參見(jiàn)Danjo等人于1998年在《Invest Ophthalmol Vis Sci》39: 2602-2609中發(fā)表的文章；以及Abelson等人于2003年在《Rev Ophthalmol》10: 1中發(fā)表的文章)。
干眼癥患者眼表的跨膜黏蛋白也發(fā)生了改變。研究者指出， 與普通患者產(chǎn)生的黏蛋白相比，干眼癥患者產(chǎn)生的跨膜黏蛋白例 如MUC1是不能使蛋白糖基化的。其發(fā)生變化的結(jié)構(gòu)潛在的改變 了它們?cè)谘郾淼臋C(jī)能，并且能夠?qū)е赂裳鄄〉倪M(jìn)一步發(fā)展(參見(jiàn) Danjo等人于1998年在《Invest Ophthalmol Vis Sci》39: 2602-2609 中發(fā)表的文章)。
41半乳糖凝集素在淚液不足中的作用
半乳糖凝集素是一類糖結(jié)合型蛋白質(zhì)，是用于促進(jìn)淚膜在角 膜表面和結(jié)膜表面的分布的理想的選擇。這類蛋白質(zhì)以高親和性
的方式與黏蛋白相結(jié)合，特別是對(duì)于與黏蛋白的o-聯(lián)糖側(cè)鏈的結(jié) 合來(lái)說(shuō)。不需要被任何特殊理論和反應(yīng)機(jī)理所限制，半乳糖凝集 素能夠通過(guò)將分泌型黏蛋白與跨膜黏蛋白(或者其他糖蛋白)結(jié) 合的方式來(lái)促進(jìn)淚膜在角膜表面和結(jié)膜表面的分布。在具有黏蛋 白缺陷的眼睛中，夕卜源性半乳糖凝集素可以延長(zhǎng)或者加強(qiáng)黏蛋白 的結(jié)合。并且，半乳糖凝集素能夠通過(guò)將其自身與角膜表面的糖 結(jié)合蛋白相結(jié)合的方式來(lái)促進(jìn)淚膜更均勻的分布，即使是在黏蛋 白缺失的環(huán)境中。
在非眼睛組織中，已經(jīng)證實(shí)了黏蛋白與半乳糖凝集素之間存 在相互作用。已經(jīng)表明，半乳糖凝集素通過(guò)其與不同黏蛋白的強(qiáng)
結(jié)合親和力來(lái)調(diào)節(jié)黏蛋白的表達(dá)和產(chǎn)生。半乳糖凝集素-3以一 種〖農(nóng)度依賴、(concentration — dependent)的方式與來(lái)自人類纟吉腸 癌細(xì)胞中的翻蛋白相結(jié)合，并調(diào)節(jié)該黏蛋白的表達(dá)(參見(jiàn)Bresalier 等人于1996年在《癌癥研究》56: 4354 - 4357中發(fā)表的文章； 以及Dudas等人于2002年在《腸胃病學(xué)》118: 1553中發(fā)表的文 章)。在卵巢腫瘤細(xì)胞中， 一種黏蛋白樣的糖蛋白CA125與半乳 #唐埃是集素_ 1才目結(jié)合(參見(jiàn)Seelenmeyer等人與2002年在《纟田月包 ,牛學(xué)雜志》116: 1305 - 1318中發(fā)表的文章)。
半乳糖凝集素構(gòu)建了一種廣泛分布的糖結(jié)合蛋白家族，其特 點(diǎn)表現(xiàn)為它們與存在于許多細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM )糖蛋 白中的包含l3 -半乳#唐苷的多#唐的親和力。在哺乳動(dòng)物中，目前 存在半乳糖凝集素家族中的14種成員(半乳糖凝集素-1到半乳 糖凝集素-14)，因它們的糖識(shí)別區(qū)域(CRD)的結(jié)構(gòu)相似性而 定義。半乳糖凝集素是一類可溶性蛋白質(zhì)。在細(xì)胞內(nèi)，它們大量
42存在于細(xì)月包質(zhì)中，并且已經(jīng)在增生細(xì)胞的核內(nèi)測(cè)到半乳糖凝集 素- i和半乳沖唐;疑集素-3。在纟田月包夕卜，它們存在于細(xì)月包表面和細(xì)
胞外基質(zhì)(ECM)當(dāng)中。與某些生長(zhǎng)因子(例如bFGF)和細(xì)胞 因子(例如，白細(xì)月包介素-1 )相類似，半乳4唐凝集素中不含有 經(jīng)典信號(hào)序列或者3爭(zhēng)膜結(jié)構(gòu)域，它是由細(xì)胞通過(guò)非經(jīng)典途徑分泌 的，這一非經(jīng)典途徑還沒(méi)有被深入的理解。某些半乳糖凝集素具 有廣泛的組織分布，例如半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3， 半乳糖凝集素-8以及半乳糖凝集素-9,而其他半乳糖凝集素則 表現(xiàn)出組織特異性，例如半乳糖凝集素-4,半乳糖凝集素-5 以及半乳糖凝集素-6。半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素_ 3是 兩個(gè)被最廣泛研究的半乳糖凝集素。在細(xì)胞外，這兩種外源性凝 集素被認(rèn)為是通過(guò)與寡糖的結(jié)合而在細(xì)胞與細(xì)胞的粘附和細(xì)胞 與基質(zhì)的粘附中發(fā)揮作用，以截然不同的同系物的形式纖維連 結(jié)蛋白，層粘連蛋白，玻連蛋白以及整合蛋白類。絕大部分的半 乳4唐省是集素或者由于具有兩個(gè)^f唐識(shí)別區(qū)i或(CRD),或者由于以 同型二聚體的形式存在，因而在官能上是二價(jià)的。這種二價(jià)特性 允許外源性凝集素 一方面與分泌型黏蛋白糖蛋白的寡糖鏈相互 作用，另 一方面與^爭(zhēng)膜黏蛋白的寡4唐或者角力莫頂面(apical surface)上的其他糖蛋白相互作用，以促進(jìn)淚膜在眼表的分布。 一些研究表明，半乳糖凝集素-3在鼠類角膜上皮細(xì)胞和人類角 膜上皮細(xì)胞中表達(dá)。外源性半乳糖凝集素_ 3和半乳糖凝集素-7 能夠刺激小鼠動(dòng)物;漠型的角膜傷口的再上皮化，同時(shí)在角膜上皮 細(xì)胞的細(xì)胞遷移中發(fā)揮作用(參見(jiàn)Cao等人于2002年在《生物 化學(xué)雜志》277: 4229 - 4230中發(fā)表的文章；以及Cao等人于2003 年在《主要眼科學(xué)》121: 82 - 86中發(fā)表的文章)。
在對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的初步研究中，使用了兩種不同的角膜損 傷愈合模型，過(guò)去發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠;漠型(半乳糖凝集素-3 + /+ )相比，半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠模型(半乳糖凝集素-3-/-)的傷口再上皮化表現(xiàn)的明顯減慢。相反，在半乳糖凝 集素-1缺陷型小鼠模型和野生型小鼠模型中，兩者的角膜上皮 細(xì)胞傷口閉合速率沒(méi)有區(qū)別。外源性半乳糖凝集素-3和半乳糖 凝集素_ 7以一種濃度依賴的方式加速了角膜石咸性燒傷傷口的再
上皮化。這個(gè)作用^皮竟?fàn)幮証f唐(competing sugar)--(3 -乳并唐
所抑制，而不一皮不相關(guān)的二糖——蔗糖所抑制(參見(jiàn)Cao等人于 2002年在《生物化學(xué)雜志》277: 42299-4230中發(fā)表的文章； 以及Cao等人于2003年在《主要眼科學(xué)》121: 82- 86中發(fā)表 的文章)。
實(shí)施例
材料和方法
下述材料和方法用于本發(fā)明的所有實(shí)施例中。
具有療效濃度的半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳 糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8的人工淚液溶液
一種典型的人工淚液溶液，由半乳糖凝集素濃縮物制成，用 于動(dòng)物試-驗(yàn)研究。所述溶液是緩沖液，PH中性，是等壓的，并 且包含例如羧甲基纖維素(CMC)或者羥丙基曱基纖維素 (HMPC )之類的增稠劑以增加粘性。還制備了 一種同樣的對(duì)照組 溶液，含有除半乳糖凝集素之外的所有成分。上述溶液中不含防 腐劑，因?yàn)榉栏瘎┠軌驉夯掀p傷。因此，為每個(gè)實(shí)施例提供 了新鮮的)容液，并在耳又液過(guò)程中對(duì)溶液進(jìn)4亍冷凍。各種;容液不同 的配方包括人工淚液對(duì)照溶液；分別含有1(H鼓克/毫升半乳糖 凝集素_ 1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7或者半乳糖凝 集素-8或者它們兩個(gè)兩個(gè)(成對(duì))的組合的人工淚液溶液；分 別含有20微克/毫升半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳
44糖凝集素-7或者半乳糖凝集素-8或者它們兩個(gè)兩個(gè)(成對(duì)) 的組合的人工淚液〉容液；以及還含有0.1MP -乳糖的上述纟容液， 其中的|3 -乳糖是一種竟?fàn)幮远?，?dān)當(dāng)半乳糖凝集素抑制劑的 作用。
在正常小鼠中使用東荒菪堿誘導(dǎo)其淚液不足，作為干眼綜合 癥的一種動(dòng)物模型
東^菪堿是一種抗膽堿劑，作用于膽堿能毒蕈堿受體。透皮 性東莨菪石成(scop )片劑通常一皮用來(lái)達(dá)到抗嘔吐的目的，并且用 于治療人類的運(yùn)動(dòng)病。在一傷^^開(kāi)的i侖文(參見(jiàn)Dursun等人于 2002年在《Invest Ophthamol & Vis Sci》 43: 632-638中發(fā)表的 文章)中，以這種方式使用東莨菪堿進(jìn)行處理，其結(jié)果表現(xiàn)為淚 液顯著的、統(tǒng)計(jì)上的明顯減少，與對(duì)照組相比，淚液的量減少到 對(duì)照組的不到20%。；淚液熒光素清除和角膜羧基熒光素的吸收 都增加了大約3倍。進(jìn)一步的，將試-驗(yàn)動(dòng)物it入吹氣頭罩中，這 些參數(shù)的增加表現(xiàn)的更為劇烈。此外，與對(duì)照組相比，使用東莨 菪石成處理并#皮;故置于吹氣頭罩中的小鼠的結(jié)膜杯狀細(xì)胞的密度 減少了多于90%。由于透皮性藥片的運(yùn)送體系能夠提供受控制 的、持續(xù)的給藥途徑，因而淚液的減少能纟寺續(xù)超過(guò)24小時(shí)，這 與局部使用阿托品的處理方法相反，后者的過(guò)程只能持續(xù)幾個(gè)小 時(shí)。重復(fù)施用新的東莨菪堿片劑可以進(jìn)一 步延長(zhǎng)這種作用。
在這個(gè)實(shí)施例中^f吏用C57BL/6型小鼠(由Charles River Laboratories, Wwilmington, MA ^是供)。這類小鼠有6周到8周 大小，性別混合。使用電剃刀在經(jīng)過(guò)麻痹的小鼠的尾巴上剃出一 種長(zhǎng)1英寸的部分。^1奪透皮性東萊菪石咸片劑(由Novartis, Summit, NJ提供)切成4小塊兒，將每個(gè)單獨(dú)的四分之一部分施用到剃 了毛的尾巴上。經(jīng)過(guò)48小時(shí)之后再次施用東莨菪石成片劑，以維
45持穩(wěn)定的藥物釋放。將試驗(yàn)動(dòng)物(小鼠)置于吹氣頭罩中1小時(shí)，
在試-驗(yàn)中的每一天此步艱《進(jìn)4亍3次。 MRL/lpr型自體免疫型小鼠
在這個(gè)試-驗(yàn)中使用MRL/Mp-lpr/lpr (MRL/lpr)型小鼠(由 Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME ^是供)。這類小鼠屬于次同 類系，在其生長(zhǎng)到16周之內(nèi)會(huì)發(fā)生自體免疫疾病，導(dǎo)致淚腺的 炎性病變。才艮據(jù)病因?qū)W和邏輯學(xué)的評(píng)估，這類小鼠被指出是人類 干燥綜合癥的才莫型(參見(jiàn)Jabs等人于1991年在《Invest Ophthamol & Vis Sci》32: 371 — 380中發(fā)表的文章；以及Jabs等人于2001 年在《當(dāng)前眼科研究》16: 909 - 916中發(fā)表的文章)。這里所述 的實(shí)施例中使用的這類小鼠是至少16周大小的，性別混合。
對(duì)動(dòng)物才莫型的淚液、淚液清除以及角"莫染色的測(cè)量法
4吏用染有S^紅的沖帛線(由Zone-quick, Oasis, Glendora, CA
4是供)來(lái)測(cè)定水樣淚液。？使用《聶子夾住棉線，并通過(guò)動(dòng)物的側(cè)向 眼角將其施用到眼表中，持續(xù)i分鐘。利用棉線上的刻度，以毫
米為單位，通過(guò)測(cè)量棉線濕潤(rùn)的程度來(lái)測(cè)量水樣淚液。
利用2微升的1%的熒光素鈉(由Alcon, Fort Worth, TX提
供)，將其以液滴的形式施用到眼表之上以測(cè)量淚膜破裂時(shí)間 (TBUT)。 4吏用裂隙燈活組織顯孩"竟4企查淚力莫，然后記錄淚"莫擴(kuò) 散的時(shí)間長(zhǎng)短。
在進(jìn)行了淚膜破裂時(shí)間的測(cè)量之后，立即進(jìn)行熒光素染色， 通過(guò)將2微升的1 %的熒光素鈉以液滴的形式施用到眼表之上的 方式進(jìn)4亍染色。在施用過(guò)后的5分鐘之后，〗吏用裂隙燈活組織顯 微鏡對(duì)角膜的焚光素染色進(jìn)行評(píng)估。熒光素染色法通常被應(yīng)用于臨床中，用以評(píng)^介角膜表面的損傷?？梢灶A(yù)期，患有干眼癥的動(dòng) 物的角膜表面能夠被熒光素染色，而正常的角膜表面不能夠被染
色。可以〗吏用Fl分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)記錄熒光素染色的程度，這類似于 在臨床干眼癥研究中所-使用的。
等歲支治療
設(shè)計(jì)出治療進(jìn)度表和測(cè)量進(jìn)度表，以便對(duì)每 一 種短期效果 (半乳糖凝集素處理過(guò)后2小時(shí))和長(zhǎng)期效果(半乳糖凝集素處 理過(guò)后14小時(shí))進(jìn)行評(píng)估?？梢灶A(yù)期，在執(zhí)行了每天4次(4x/day ) 的治療進(jìn)度之后，半乳糖凝集素提供了一種長(zhǎng)期的益處。對(duì)治療 進(jìn)度的改進(jìn)，對(duì)測(cè)量進(jìn)度的改進(jìn)，或者對(duì)能對(duì)角膜產(chǎn)生有益效果 的必要?jiǎng)┝康母倪M(jìn)都屬于本發(fā)明所述實(shí)施例的等價(jià)治療。例如， 如果使用20微升/毫升的半乳糖凝集素進(jìn)行治療后能夠發(fā)現(xiàn)應(yīng) 答，而使用10微升/毫升的半乳糖凝集素進(jìn)行治療后不能夠發(fā)現(xiàn) 應(yīng)答，那么， 一種另外的包含更高劑量(50微升/毫升)的實(shí)施 例也屬于等價(jià)治療的范圍之內(nèi)。
半乳糖凝集素-1,半乳糖凝集素_ 3,半乳糖凝集素-7以 及半乳糖凝集素-8的制備
本領(lǐng)域普通4支術(shù)人員可以理解，本發(fā)明所述的半乳糖;疑集素 能夠通過(guò)任何的可利用的資源來(lái)獲得。這些資源包括但不局限 于，從天然資源中分離的蛋白質(zhì)，通過(guò)重組方法或者合成方法獲 得的蛋白質(zhì)，例如通過(guò)固相程序。依照本發(fā)明，可以在重組DNA 分子中使用編碼半乳糖凝集素_ 3,半乳糖凝集素-7和半乳糖凝 集素-8的多核苷酸序列，以達(dá)到在適合的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā) 明所述的半乳糖凝集素進(jìn)4亍表達(dá)的目的。Cherayil等人、Madsen 等人、以及Hadri等人在《supra》中發(fā)表的文章中分別詳細(xì)的描 述了對(duì)人類半乳糖凝集素-1,半乳糖凝集素-3,半乳糖凝集素-7以及半乳糖凝集素-8的克隆方法。為了能夠表達(dá)出具有生 物活性的半乳糖凝集素-1,半乳糖凝集素-3,半乳糖凝集素-7或者半乳糖凝集素-8，編碼半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素
-3，半乳糖凝集素-7以及半乳糖凝集素_ 8的核酸序列或者它 們的功能性等價(jià)物被插入到一種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，適當(dāng)?shù)妮d體 是例如 一 種包含轉(zhuǎn)錄和翻i爭(zhēng)所述插入的編碼序列所必需的元素 的載體?？梢?吏用本領(lǐng)域j支術(shù)人員已知的方法來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體， 所述表達(dá)載體包含一種編碼半乳糖凝集素-1、編碼半乳糖凝集 素-3、編碼半乳4唐凝集素-7或者編碼半乳糖;疑集素-8的序列， 以及適合的轉(zhuǎn)錄控制元件或翻譯控制元件。這些方法包括體外重 組DNA技術(shù)，合成技術(shù)以及體內(nèi)重組或者基因重組?？梢允褂?本領(lǐng)域任何的已知技術(shù)來(lái)完成缺失、添加、取代反應(yīng)的導(dǎo)入，例 如4吏用基于PCR的i秀變方法。這些才支術(shù),皮i己載于Sambrook等人 于1989年發(fā)表的文章《分子克隆 一種實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》中，冷泉 港出X反it， Plainview,紐約；以及Ausubel等人于1989年發(fā)表 的文章《分子生物學(xué)當(dāng)^t草案》中，John Wiley & Sons,紐約， NY。可以利用許多種類的表達(dá)載體/宿主體系來(lái)容納和表達(dá)編碼 半乳糖凝集素-1、編碼半乳糖;疑集素-3、編碼半乳糖凝集素-7或者編碼半乳糖湊是集素-8的序列。這些表達(dá)載體/宿主體系包 4舌j旦不局限于樣i生物，例如l吏用重紐j元菌素、質(zhì)斗立DNA表達(dá) 載體或者粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；使用酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化的酵母菌；使用病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng) 細(xì)胞體系；使用病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV; 煙草花葉病毒，TMV)轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞體系；或者使用細(xì)菌表達(dá) 載體(例如，Ti， pBR322,或者pET25b質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞 體系；或者動(dòng)物細(xì)"包體系?？蛇x4奪的，本發(fā)明所述的半乳糖凝集 素可以通過(guò)使用化學(xué)方法合成一種整個(gè)的或者部分的半乳4唐凌是 集素-1，半乳糖凝集素-3,半乳糖凝集素-7或者半乳糖凝集 素-8的氨基酸序列而制成。例如，可以使用各種固相(solidphase )技術(shù)來(lái)完成肽的合成(參見(jiàn)Roberge等人于1995年在《科 學(xué)》269: 202中發(fā)表的文章)，也可以使用例如431A肽合成器 (從Foster City應(yīng)用生物系統(tǒng)獲得，加拿大)依照制造商提供的 -說(shuō)明書(shū)來(lái)完成肽的自動(dòng)合成。
藥物組合物
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一類藥物組合物，其中這些藥 物組合物包括半乳糖凝集素-1,半乳糖凝集素-3,半乳糖凝集 素-7和/或半乳糖凝集素-8,并且選擇性的包括藥物可接受載 體。在某些實(shí)施方式中，這類組合物選擇性的進(jìn)一步包括一種或 者多種額外的治療劑。在某些實(shí)施方式中，所述額外的治療劑是 選自生長(zhǎng)因子、消炎藥、升壓劑、膠原酶抑制劑、局部使用的類 固醇、金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑、抗壞血酸、血管緊張素II、血管
緊張素ni、鈣網(wǎng)蛋白、四環(huán)素、纖維連接蛋白(纖連蛋白)、血
小板反應(yīng)蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF )、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF )、 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、表皮 生長(zhǎng)因子(EGF)、血小^反源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、神經(jīng)元分化 因子(NDF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、維生素B族例如生物素 以及透明質(zhì)酸。
這里〗吏用的術(shù)語(yǔ)"藥物可4妻受載體"包括任4可的以及所有的 溶劑，稀釋液，或者其他液體溶4某，分散劑或者懸浮劑，表面活 性劑，等壓劑，增稠劑或者乳化劑，防腐劑，固體粘合劑，潤(rùn)滑 劑及其類似物，對(duì)于這些藥物可4妄受載體的選4奪應(yīng)當(dāng)適應(yīng)所需求 的特定用藥形式。在1995年由巴拿馬(PA) Easton的Mack出 版社出版、由Gennaro編輯的《雷明頓制藥一+學(xué)》 一書(shū)中7>開(kāi)了 用于制備藥物組合物的各種載體，以及制備藥物組合物的方法。 可以作為藥物可接受載體的物質(zhì)的一些例子包括但不局限于糖 類，例如葡萄糖和蔗糖；淀粉類，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，例如羧曱基纖維素鈉，乙基纖維素，和醋酸
纖維素；粉末狀黃茂膠；麥芽；凝膠；滑石粉；賦形劑，例如可 可油和蠟狀栓劑；油類，例如花生油，棉花籽油，紅花油，芝麻 油，橄片覽油，玉米油和大豆油；乙二醇類，例^口丙二醇；酯類， 例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；|￡沖劑，例如氫氧化4美和氫 氧化鋁；褐藻酸；無(wú)熱源的水；等壓性鹽；林才各氏溶液；普通酒 精，和磷酸緩沖液，以及其他沒(méi)有毒性的可以兼容的潤(rùn)滑劑，例 如十二烷基磺酸鈉和硬脂酸鎂，還包括著色劑，釋放劑，涂層劑，
甜味劑，風(fēng)味劑以及芳香劑，防腐劑和抗氧化劑也可以使用在本 發(fā)明的組合物中，4艮據(jù)配方設(shè)計(jì)師的判斷來(lái)選4奪。
治療有歲支劑量
在另一方面，才艮據(jù)本發(fā)明所述的治療方法，在此描述了一種 讓眼睛接觸藥物組合物以治療干眼癥的方法。因此，本發(fā)明^是供 了 一類治療干眼癥的方法，包括向需要4妻受治療的生物體施用一 類治療有效劑量的藥物組合物，所述藥物組合物中含有包括半乳 糖凝集素-3、半乳糖凝集素_ 7和/或半乳糖凝集素-8在內(nèi)的活 性成分，施用的劑量和時(shí)間以能夠達(dá)到所希望的效果而必需的劑 量和時(shí)間為準(zhǔn)?？梢砸庾R(shí)到，本發(fā)明的方法包括施用本發(fā)明所述 的藥物組合物作為 一種治療措施，來(lái)促進(jìn)淚膜在角膜表面和結(jié)膜 表面的分布，或者將其作為一種預(yù)防措施，用以減少與干眼癥相 關(guān)的并發(fā)癥(例如，作為一種傷口沖洗:容液，在炎性環(huán)境下4吏用 抗組胺劑進(jìn)行的外科手術(shù)或者治療的過(guò)程中和/或過(guò)程之后使 用)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，所述藥物組合物的"治療有 效劑量"是指能夠有效改善干眼癥的量。所述組合物在本發(fā)明所 述的方法中，可以以任何有效的劑量以及任何能有效治療眼睛的 纟會(huì)藥^各徑來(lái)施用。因此，這里所-說(shuō)的"能夠有效改善干眼癥的量，， 是指能夠改善淚膜的足夠的藥物組合物的量。確切的劑量由不同
50的醫(yī)師根據(jù)需要治療的病人的個(gè)體情況來(lái)選擇。對(duì)給藥劑量和給 藥方式進(jìn)行調(diào)整，以-提供充足水平的活性成分或者維持所希望的 藥效。需要考慮的其他額外因素包括疾病狀況的嚴(yán)重程度，例如
干眼的程度，疾病的歷史；患者的年齡、以及性別；用藥期間的 飲食，用藥時(shí)間和用藥頻率；藥物的結(jié)合；反應(yīng)的壽文感性；以及 治療的耐受性/應(yīng)答性。長(zhǎng)效的藥物組合物可以以一天凄t次、 一天 一次、3到4天一次、 一周一次、或者兩周一次的頻率給藥，這 取決于特定組合物的半衰期及其清除速率。
優(yōu)選以單位劑量形式配制本發(fā)明中的活性成分，以達(dá)到減少 用藥次數(shù)并保持劑量均勻的目的。術(shù)語(yǔ)"單位劑量"在這里是指 適合于需要被治療的患者的體質(zhì)的離散的活性成分單元。然而， 可以理解，本發(fā)明所述組合物每天施用的總劑量將由主治醫(yī)師來(lái) 決定，并且在合理的醫(yī)療鑒定的范圍之內(nèi)。對(duì)于任何活性成分來(lái) -說(shuō)，其治療有步支劑量最初都可以通過(guò)細(xì)力包結(jié)構(gòu)測(cè)試或者動(dòng)物才莫型 試驗(yàn)來(lái)評(píng)估，動(dòng)物模型通常使用小鼠，兔，狗，或者豬。這些動(dòng) 物才莫型還可以用來(lái)確定所希望的給藥濃度范圍以及給藥^各徑。當(dāng) 已經(jīng)選4奪了直接施用于眼睛作為給藥^各徑時(shí)，上述信息還可以 一皮 用來(lái)確定有效劑量，以及針對(duì)人類的其他的給藥路徑。治療有效 劑量是指能夠改善癥狀或者狀況的活性成分的量?？梢栽诩?xì)胞培 養(yǎng)中或者實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物中使用標(biāo)準(zhǔn)化制藥程序來(lái)檢測(cè)活性成分的 治療功效以及毒性，例如4吏用ED50 (對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械?0%來(lái)^兌 是治療有效的劑量)和LD50 (對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械?0%來(lái)說(shuō)是致命 的劑量)來(lái)檢測(cè)。毒性作用和治療性作用的劑量比稱為治療指數(shù)， 可以使用比例關(guān)系LD50/ED50來(lái)表示。治療指數(shù)大的藥物組合 物是優(yōu)選的。從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試以及動(dòng)物模型研究中獲得的數(shù)據(jù)被 用來(lái)制定人類使用的劑量范圍。藥物組合物的施用
當(dāng)活性成分以所需要的劑量與適合的藥物可接受載體配制 完畢之后，本發(fā)明所述的藥物組合物可以通過(guò)局部施用的給藥方 式施用于人類以及其他哺乳動(dòng)物，例如以眼用的方式(通過(guò)粉末、 藥膏、或者滴劑)，例如直4妄應(yīng)用于眼睛。可以選4奪的、其#^的 給藥路徑也是能夠預(yù)想到的，例如口服，直腸給藥，腸胃外給藥， 池內(nèi)給藥，陰道內(nèi)給藥，腹腔內(nèi)給藥，上頜給藥或者鼻腔內(nèi)給藥， 依照需要治療的癥狀的嚴(yán)重程度來(lái)選擇。
眼部給藥的液體配藥形式包括緩沖液，增溶劑，優(yōu)選的稀釋
液例如水，防腐劑例如thymosol,用以調(diào)節(jié)溶液的一種或者多種 生物高聚物或者聚合物，例如聚乙二醇，羥丙基甲基纖維素，透 明質(zhì)酸鈉，丙烯酸鈉或者羅望子月交。
口服給藥的液體配藥形式包括<旦不局限于，藥物可4妄受乳 液，孩i乳液，卩容液，懸浮液，；瞎?jié){以及中藥西劑。除了活性成分
液，例如水或者其他溶液，增溶劑和乳化劑，例如普通酒精，異 丙醇，氨基甲酸乙酯，乙酸乙酯，苯曱醇，苯甲酸千酯，丙二醇， 1, 3-丁二醇，二甲基曱酰胺，油類(特別的，棉花津予油，落花 生油，玉米油，胚芽油，橄一覽油，蓖麻油，以及芝麻油)，甘油， 四氫糠醇，聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，以及它們的混合物。 除了惰性稀釋液，所述口服組合物還可以包括輔助劑，例如潤(rùn)濕 劑，乳化和懸浮劑，甜味劑，風(fēng)味劑以及芳香劑。
局部纟會(huì)藥或者透皮性纟會(huì)藥的本發(fā)明藥物組合物的配藥形式 包括藥膏，藥貼，乳霜，洗液，凝膠體，粉末，溶液，吸入劑 或者片劑。在無(wú)菌環(huán)境下將所述活性成分與藥物可接受載體進(jìn)行 混合，同時(shí)也可以加入4壬何需要的防腐劑或者緩沖劑。例如，眼
52部感染或者皮爿夫感染者可以〗吏用液態(tài)的滴劑、噴霧、乳液或者乳 霜狀的配藥形式進(jìn)行處理。用藥的性質(zhì)可以是治療性的，或者也 可以是預(yù)防性的。預(yù)防性的組合物可以存在于或者被施用于潛在 傷口的位置處，或者傷口的發(fā)源處，例如隱形眼4竟，隱形眼4竟清 洗溶液和殘?jiān)芤?，存》t或者攜帶隱形眼鏡的容器，佩帶隱形眼 鏡的裝置，眼藥水，外科沖洗溶液，滴耳液，目艮罩，以及4吏用于 眼部區(qū)域的化妝品，包括眼霜，乳液，眉筆，目艮線，和眼影。本
科手術(shù)裝置或者用品，聽(tīng)力裝置或者用品(用品的例子例如紗布， 繃帶或者帶條)，以及這些裝置或者用品的制造方法或者使用方 法。本發(fā)明公開(kāi)的組合物可以是被涂覆、注入、粘結(jié)在上述裝置
所述的藥膏、藥片、乳霜和凝膠體中除含有本發(fā)明所述的活 性成分之外，還可以包括1武形劑，例如動(dòng)物脂肪和一直物脂肪，油 類，蠟，石蠟，淀粉，黃荒膠，纖維素衍生物，聚乙二醇，硅樹(shù)
脂，斑脫土，硅酸，滑石粉，氧化鋅，或者它們的混合物。
所述的藥物粉末和噴霧中除含有本發(fā)明所述的活性成分之
外，還可以包括1武形劑，例如滑石，硅酸，氫氧〗t鋁，》圭g臾4丐， 聚酰胺4分末，或者這些物質(zhì)的混合物。藥物噴霧還可以額外包括: 常用的推進(jìn)劑，例如氟氯烴。
透皮性片劑具有的附加的優(yōu)點(diǎn)是能夠?yàn)闄C(jī)體提供控釋的活 性成分。這類配藥形式可以通過(guò)爿奪組合物溶解于或者分散于適合 的介質(zhì)中來(lái)獲得。也可以向其中加入吸收促進(jìn)劑，以增加所述組 合物進(jìn)入皮膚的流量。其速率的控制可以通過(guò)加入速率控制膜或 者通過(guò)將所述組合物分散于一種多聚物基質(zhì)或者凝膠中來(lái)實(shí)現(xiàn)。注射類藥物的制備，例如無(wú)菌注射型液體或者油質(zhì)懸浮液， 可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)使用適當(dāng)?shù)姆稚┗蛘邼?rùn)濕劑以及 懸浮劑進(jìn)行配制。其中，無(wú)菌注射類組合物也可以是存在于非毒 性腸胃外可4妄受的稀釋液或者溶劑中的無(wú)菌注射型 >容液，懸浮液
或者乳化液，例如，在l, 3 - 丁二醇中存在的組合物溶液。這些 可4妄受溶々某和溶劑可以1吏用水，林才各氏溶液，U.S.P以及等壓的 氯化鈉溶液。除此之外，無(wú)菌的不揮發(fā)性油類通常作為一種溶劑 或者懸浮介質(zhì)來(lái)使用。為了達(dá)到這個(gè)目的，任〗可溫和的不揮發(fā)性 油類都可以使用，包括合成的單甘油酯或者甘油二酯。除此之外， 脂肪酸類也可以凈皮用于注射類藥物組合物的制備當(dāng)中，例如油 酉吏。所述的注射類組合物可以是無(wú)菌的，例如爿奪其通過(guò)一種細(xì)菌 截留過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，或者以無(wú)菌固體組合物形式將殺菌劑導(dǎo)入 注射類組合物中，其中殺菌劑在^f吏用之前可以預(yù)先,皮溶解于或者 分散于蒸鎦水或者其他無(wú)菌注射型介質(zhì)中。為了達(dá)到延長(zhǎng)活性成
分的作用的目的，通常希望能夠通過(guò)皮下注射或者肌肉注射來(lái)減 慢對(duì)活性成分的吸收。腸胃外給藥形式的活性成分的延時(shí)吸收可 以通過(guò)將所述活性成分溶解于或者懸浮于一種油性溶^ 某中來(lái)實(shí) 現(xiàn)。將活性成分在例如聚交酯-聚乙二醇這樣的生物可降解聚合 物中制成活性成分微膠嚢基質(zhì)，可以得到可注射用的補(bǔ)給形式 (depot forms)的藥物。才艮據(jù)活性成分與聚合物的比例，以及所 使用的特定聚合物的性質(zhì)，可以控制活性成分的釋放速率。其他 的生物可降解聚合物的例子包:fe:聚環(huán)原酯和聚酸酐。可注射用 的補(bǔ)給形式的藥物還可以通過(guò) <吏用脂質(zhì)體或者微乳液包裹活性 成分的方法進(jìn)行制備，其中的脂質(zhì)體或者微乳液是能夠被集體組 織所兼容的。
直腸給藥或者陰道給藥形式的組合物優(yōu)選是栓劑，可以通過(guò) 將本發(fā)明的活性成分與適當(dāng)?shù)姆谴碳ば再x形劑或者載體進(jìn)行混 合的方法來(lái)制備，其中非刺激性賦形劑或者載體的例子是可可油，聚乙二醇或者一種蠟狀栓劑，所述蠟狀栓劑在環(huán)境溫度下呈 固態(tài)，^旦在4幾體溫度下呈'液態(tài)，因ot匕可以在直腸月空內(nèi)或者陰道月空
內(nèi)融化，并且釋;^丈活性成分。
口服給藥形式的固體配藥形式包括膠嚢，片劑，丸劑，粉 末以及顆粒。在這類固體配藥形式中，活性成分與至少一種惰性 藥物可接受賦形劑或者載體進(jìn)行混合，其中惰性藥物可接受賦形 劑或者載體的例子是^^蒙酸鈉，或者^(guò)l酸二鈣和/或a)充填物或 者添加物，例如淀4分，蔗并唐，葡萄^唐，甘露醇，以及石圭酸，b) 結(jié)合劑，例如羧甲基纖維素，藻酸鹽，凝膠，聚乙烯基吡咯烷酮， 哀糖，以及阿拉伯樹(shù)膠，c)保濕劑，例如甘油，d)崩解劑，例 如瓊脂-瓊脂，碳酸釣，馬鈴薯淀粉或者木薯淀粉，褐藻酸，某 些石圭酸鹽類，以及石友酸鈉，e)〉容液阻滯劑，例如石蟲(chóng)普，f)吸4丈 力口速劑，例如季胺組合物，g)潤(rùn)濕劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸 甘油酯，h )吸收劑，例如高嶺土和斑脫土 ，以及i)潤(rùn)滑劑，例 如滑石，硬脂酸釣，石更脂酸4美，固體聚乙二醇，十二烷基磺酸鈉， 和它們的混合物。
相似類型的固體組合物還可以作為芯物質(zhì)添加到壽欠3交嚢或 者硬芯(hard-filled)凝膠膠嚢中，使用乳糖和高分子量聚乙二 醇及其類似物作為賦形劑。固體配藥形式的片齊ij,糖衣丸，膠嚢， 丸劑以及顆粒可以使用涂層劑和成殼物質(zhì)例如腸溶涂層、控釋涂 層和制藥4頁(yè)域/>知的其他涂層來(lái)制備。在這類固體配藥形式中， 活性成分可以與至少 一 種惰性稀釋液例如蔗#唐或者淀粉進(jìn)行混
釋液，例如片劑潤(rùn)滑劑和其他片劑輔助劑例如硬脂酸鎂和微晶纖 維素。如果該配藥形式是月交嚢，片劑以及丸劑，其還可以包含IC 沖劑。上述物質(zhì)可以選纟奪性的含有包埋劑，并且可以以組合物的 形式僅僅釋放活性成分，或者可以選擇的以 一 種延時(shí)的方式優(yōu)先
55釋放腸道內(nèi)某個(gè)部分的活性成分?？梢允褂玫陌窠M合物的例子包括聚合物以及蠟。
藥物組合物的用途
正如前面所討i侖并且在實(shí)施例中詳細(xì)描述的那樣，半乳糖凌是
集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8能夠通過(guò)將分泌型黏蛋白的寡糖鏈結(jié)合到跨膜祐蛋白(或者其他糖蛋白)之上而成為促進(jìn)淚膜分布的有效促進(jìn)劑。總之，可以相信，這些半乳糖凝集素能夠在臨床應(yīng)用中有效刺激(促進(jìn))干眼癥的治愈。
總之，本發(fā)明表明這些半乳糖凝集素能夠在臨床應(yīng)用中有效刺激(促進(jìn))與任何上皮組織有關(guān)聯(lián)的疾病的治愈，這些上皮組織包括但不局限于皮膚上皮細(xì)胞；角膜上皮細(xì)胞；胃腸道內(nèi)層；肺上皮細(xì)胞；腎小管內(nèi)表皮；血管內(nèi)表皮；子宮內(nèi)表皮；陰道內(nèi)表皮；尿道內(nèi)表皮；或者呼吸道內(nèi)表皮。本發(fā)明在其不同的實(shí)施方式中包含了對(duì)于各種上皮損傷類型的治療，包括但不局限于外科損傷，切除損傷，水泡，潰瘍，缺損，磨損，腐蝕，石皮口，療子，切口，痛處，以及由暴露于熱源或者化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的燒傷。這些損傷可以發(fā)生在正常個(gè)體中，或者發(fā)生在那些由于患有某些疾病而導(dǎo)^:傷口不能正常愈合的個(gè)體中，后者的例子包括-糖尿病，角膜營(yíng)養(yǎng)失調(diào)，尿毒癥，營(yíng)養(yǎng)不良，維生素缺失，肥胖，傳染病，免疫抑制，以及由使用類固醇進(jìn)行的組織治療、；改射治療、非甾體消炎藥(NSAID)、抗腫瘤藥和抗代謝藥而引起的并發(fā)癥。
半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8，例如這里4吏用的，能夠有效的^f足進(jìn)真皮損傷之后的真皮重建?？蛇x4奪的，本發(fā)明顯示出，半乳沖唐凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8能夠增強(qiáng)皮膚移植物在傷口床上的黏附，并且能夠刺激其從傷口
床上再上皮化。適合的皮膚移植物包括但不局限于自體移4直物，人造皮膚，同種異體移植物，自體真皮移植物，自體上皮移才直物，avacular移植物，布-布二氏移才直片，骨移才直物，胚組織移才直物，(脊推動(dòng)物)皮膚移植物，延時(shí)移植物，真皮移植物，上皮移植物，筋膜移才直物，全層角膜移才直片(full thickness grafts )，異種移植物，奇形移植物，同種移植物，增生移植物，角膜板層移植物，網(wǎng)狀植皮移植物，翁膜移植物，奧-提二氏移植物，omenpal移植物，修補(bǔ)移植物，帶蒂移植物，全層角膜移植片(penetratinggrafts),皮片移才直物，以及中厚皮片移植物。
半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳一唐凝集素-8在這里凈皮用來(lái)有效治療皮炎、皰滲，在這類皮炎皰疹中，水泡形成在真皮表皮連接處。半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8在這里一皮用來(lái)有效治療表皮+>懈癥，這是一種上皮與其下的真皮之間的黏附缺陷，能夠?qū)е骂l繁的、開(kāi)放性的、疼痛的水泡的產(chǎn)生。半乳糖凝集素通過(guò)加速這類損傷的再上皮化來(lái)治療表皮松懈癥。半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8在這里進(jìn)一步被用來(lái)有效治療天皰瘡疾病和類天皰疾疾病，其中，前者包括上皮細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞與細(xì)胞之間翻附性的缺失，后者包括真皮表皮連接處的細(xì)胞與細(xì)胞之間黏附性的缺失。半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8被用來(lái)治療各種潰瘍，這些潰瘍包括^旦不局限于^f唐尿病足潰癌，真皮潰瘍，#辱癡潰瘍，動(dòng)"永潰疬，以及靜月永癡血。
本發(fā)明包含用以促進(jìn)角膜組織愈合的方法。這包括治療由下列途徑引起的角膜上皮缺陷角膜潰瘍，熱傷害，放射傷害，小
57水皰病，角膜磨損或者石皮口，為頭斧正近一見(jiàn)而進(jìn)4于的準(zhǔn)分子激光外
考牛手術(shù)，異物，以及無(wú)菌化角膜淺層滲透；該方法包4舌治療由下列途徑引起的化學(xué)燒傷暴露于酸或者堿(例如，氫氟酸，蟻酸，無(wú)水氨，骨泥，和石炭酸)或者其他化學(xué)制劑例如白^#,金屬元素，硝酸鹽，烴類，以及焦油；該方法包括治療下列類型的角月莫病例如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性角膜病，糖尿病性角膜病，和Thygeson淺層點(diǎn)狀角膜??；該方法還包括治療下述類型的角膜炎例如病毒性角膜炎(例如變態(tài)皰發(fā)性角膜炎或者皰滲樣角膜炎)以及細(xì)菌性角膜炎；該方法還包括治療下述類型的角膜營(yíng)養(yǎng)不良例如才各子樣角膜營(yíng)養(yǎng)不良，上皮基底膜營(yíng)養(yǎng)不良(EBMD )以及Fuch，
s角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良。
-使用這里所述的方法，半乳糖凝集素_ 1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8能夠有效治療胃腸潰并且?guī)椭铀俜?nèi)層的愈合、腺體黏膜的重生以及十二指腸黏膜內(nèi)層的愈合。炎性腸疾病，例如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎，能夠分別導(dǎo)致小腸黏膜表面或大腸黏膜表面的破壞。因此，半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素_ 8可以被用來(lái)促進(jìn)黏膜表面的修復(fù)，以幫助更快速的愈合，并且能夠阻止或者削弱炎性腸疾病的發(fā)展進(jìn)程。半乳4唐凝集素_1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8 一皮期望與黏蛋白相結(jié)合，促進(jìn)黏蛋白黏附于上皮細(xì)胞的頂面(apicalsurface),因此可以被用來(lái)保護(hù)胃腸道遠(yuǎn)離攝取的或者外科手術(shù)中帶來(lái)的有害物質(zhì)。半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8可以被用來(lái)減輕內(nèi)臟毒性所產(chǎn)生的副作用，其中內(nèi)臟毒性來(lái)自于細(xì)菌感染療法，真菌感染療法，；故射療法，化學(xué)療法或者其他療法。半乳糖凝集素-8、半乳糖凝集素-3、和/或半乳糖凝集素-7能夠被用來(lái)例如預(yù)防性的或者治療性的阻止或者削弱黏膜炎，食道炎，或者胃炎(例如，用來(lái)治愈與口腔潰瘍、食道潰瘍、腸內(nèi)潰瘍、結(jié)腸潰瘍、直腸潰瘍、和膽門潰瘍相關(guān)耳關(guān)的損傷)。
半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8能夠有效的促進(jìn)尿路上皮的愈合。包括尿路上皮細(xì)胞在內(nèi)的組織層容易在許多治療行為中受到損傷，包括導(dǎo)管插入術(shù)，外科手術(shù)，或者細(xì)菌感染療法(例如，^使用一種能夠引起兩性間傳播的疾病例如淋病的制劑進(jìn)行感染的方法)。本發(fā)明同樣包括用以促進(jìn)女性生殖道中的組織愈合的方法，包括向患者施以治療有效劑量的半乳糖凝集素-8、半乳糖凝集素-3、和/或半乳糖凝集素-7。女性生殖道組織損傷可以由各種各樣的情形導(dǎo)致，包括4吏用邗i絲酵母感染， <吏用Trichomonis感染，4吏用加德納菌感染，淋病，衣原體感染，支原體感染，以及其他兩性間傳纟番的疾病。
使用這里所述的方法，半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8能夠有效的促進(jìn)腎臟上皮細(xì)力包的^f奮復(fù)，因而能夠減輕或者治愈腎臟和病理學(xué)疾病例力口急性腎衰竭、慢性腎衰竭以及晚期腎臟疾病。使用本發(fā)明所述的方法，半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8能夠有效的促進(jìn)乳房組織的修復(fù)，因而可以被用來(lái)促進(jìn)由外科手術(shù)、外傷或者腫瘤導(dǎo)致的乳房組織損傷的愈合。使用這里所述的方法，半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8能夠有效的促進(jìn)由外傷、外科手術(shù)或者化學(xué)制劑導(dǎo)致的腦組織損傷的愈合，并且減輕由外傷、外科手術(shù)或者化學(xué)制劑導(dǎo)致的腦組織損傷的程度。
半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳4唐凌是集素-8可以一皮予貞防性的施用，以減輕或者阻止由各種病理形態(tài)導(dǎo)致的肺部損傷。例如，半乳糖省是集素-1、半乳4唐
59凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8可以被用來(lái) 促進(jìn)肺泡和支氣管上皮細(xì)胞的修復(fù)，用以阻止、削弱或者治愈急 性或者慢性肺部疾病。肺氣腫， 一種能夠?qū)е吕鄯e性的肺泡缺損 和吸入性損傷的疾病，是由例如吸煙和燒傷引起的，并能夠?qū)е?支氣管上皮細(xì)胞和肺泡的壞死。肺氣腫能夠通過(guò)施用半乳糖凝集 素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素 -8纟皮有《丈治療，而其損傷可歸因于〗匕學(xué)療法、》丈射療法、肺癌、 哮喘、黑肺(煤塵肺)以及其他肺損傷情況。
可以預(yù)期，本發(fā)明包^fe的治療方法不局限于治療人類的傷 口，也可以#:用來(lái)治療其他^壬<可哺乳動(dòng)物，這類哺乳動(dòng)物包括^f旦 不局限于牛科，犬科，貓科，公山羊，綿羊，豬科，鼠科，以 及馬科。當(dāng)治療一種給定種類的哺乳動(dòng)物的傷口時(shí)，優(yōu)選但不是 必須的是，使用的半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖 凝集素-7和/或半乳糖凝集素_ 8具有與該物種自身存在的半乳 糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖 凝集素-8的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列。
本發(fā)明記載的這些實(shí)施例中的所有動(dòng)物治療試驗(yàn)都符合"視 力和眼科學(xué)研究聯(lián)合會(huì)決議——眼科研究中動(dòng)物的使用方法"的 規(guī)定 (Association for Research in Vision and Ophthalmology Resolution on the Use of Animals in Vision Research ), 并且遵照 NIH指南中關(guān)于"實(shí)-險(xiǎn)性動(dòng)物的保護(hù)和使用"的建議(the recommendations of the NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals )。
60實(shí)施例1 -半乳糖凝集素-3在受傷的遷移性角膜上皮細(xì)胞的增
量調(diào)節(jié)作用
為了確定在受傷后的愈合角膜的上皮細(xì)胞中，半乳糖凝集素 3的表達(dá)水平是否發(fā)生變化，使用帶有2毫米受激準(zhǔn)分子激光器 切口和磨損傷口的小鼠角膜，并允許上述切口和傷口在體內(nèi)進(jìn)行 部分愈合，然后使用兔類抗人類半乳糖凝集素-3 mAb M3/38(美 國(guó)典型微生物保藏中心，Rockville, MD )對(duì)小鼠角膜進(jìn)4亍免疫 染色處理。角膜上皮細(xì)胞是一種基層鱗狀上皮細(xì)胞。在鼠科動(dòng)物 中，角膜上皮細(xì)胞占整個(gè)角膜厚度的20 - 25% ，它由5到6層細(xì) 胞層組成。在上皮細(xì)胞基底膜之下的是角膜基質(zhì)，在鼠一牛動(dòng)物中， 角膜基質(zhì)占整個(gè)角膜厚度的70 _ 80 % 。磨損傷口使上皮細(xì)月包發(fā)生 移位，而完整的留下了角膜基質(zhì)。相反， 一皮廣泛應(yīng)用于頭斧正近魂j 的受激準(zhǔn)分子激光治療在移除上皮細(xì)胞的同時(shí)也移除了里面的 角膜基質(zhì)。
通過(guò)肌肉內(nèi)注射1.25%阿佛丁 ( 0.2毫升/10體重)使瑞士韋 伯斯特小鼠(Taconic實(shí) -驗(yàn)動(dòng)物月良務(wù)中心，Germantown ，紐約) 一皮麻醉。阿佛丁是通過(guò)混合2.5克的2， 2， 2三溴丁醇、5亳升 的2 —曱基—2 — 丁醇(Aldrich， Milwaukee, WI)詳口 195毫升的 蒸餾水而制得的。將普魯卡因滴眼液(ALCAINETM，購(gòu)買自Alcon 實(shí)驗(yàn)室，F(xiàn)ort Worth,得克薩斯州)作為局部麻醉劑施用于角膜 之上。在第一組小鼠中，使用APEX PLUS 受激準(zhǔn)分子激光器 (Summit Technology of Waltham, MA )只于小鼠的右目艮進(jìn)4亍透皮寸生 受激準(zhǔn)分子激光切除術(shù)(2毫米光學(xué)區(qū)，42到44微米切除深度， PTK模式)。在第二組小鼠中，使用Alger刷(Alger Equipment Company of Lago Vista， 4尋克薩其斤州))寸小鼠的右眼制造2毫米 的磨4員傷口 。在進(jìn)4亍過(guò)上述手術(shù)后，所有的動(dòng)物都4妄受月幾肉內(nèi)注射丁丙i若 啡(0.3毫克/毫升，注射0.2毫升，BUPRENEXTM，購(gòu)買自Reckitt & Colman制藥^>司，Richmond,梵蒂岡)作為止痛劑。全會(huì)動(dòng) 物施用抗生素藥膏(VETROPOLYCINTM，購(gòu)買自Pharmaderm， Melville,紐約)，并允許角膜在體內(nèi)進(jìn)4亍部分愈合16到18小時(shí)。 在愈合階段的最后，使用前述方法對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉，并通過(guò)使其 頸部脫臼的方法將動(dòng)物致死。爿奪動(dòng)物眼J求固定于福爾馬林中2小 時(shí)，然后再將其用固體石蠟進(jìn)行包埋。在平行于眼軸的位置處進(jìn) 行組織切片(5微米厚度)。使用間二曱苯脫去組織切片上的石蠟， 再4吏用分級(jí)的乙醇溶液(100%, 70%和30% )對(duì)切片進(jìn)4亍再水 合(re-hydrated)。為了進(jìn)行免疫染色，按順序使用3 %雙氧水 (37°C, 10分鐘)、2.5%正常山羊血清對(duì)組織切片進(jìn)4亍誘導(dǎo)，兩 者的作用分別為阻礙內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性以及阻礙非特異性 結(jié)合。然后，組織切片按照順序先進(jìn)行mAbM3/38 (未稀釋的雜 交瘤液體，l小時(shí))的誘導(dǎo)，然后用生物素化抗兔類免疫球蛋白 G ( 1: 200, Vector實(shí)-驗(yàn)室，Burlingame,力口拿大)i秀導(dǎo)1小時(shí)， 用新鮮制備的抗生物素蛋白D和生物素過(guò)氧化物酶的混合物 (Vector實(shí)驗(yàn)室)誘導(dǎo)20小時(shí)，最后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB ) -只義氧7Ki式劑(Kirkegaard & Perry實(shí)-瞼室，Gaithersburg, MD )進(jìn) 行誘導(dǎo)。使用不相關(guān)的mAb或者只使用介質(zhì)處理組織切片，以 得到陰性對(duì)照組。
如附圖9中所示，正常角膜的石^"切片(附圖9A和9B)與 愈合型角膜的石蠟切片(附圖9C和9D)的免疫組織化學(xué)染色試 驗(yàn)表明與正常上皮細(xì)胞相比，在兩種角膜傷口愈合的動(dòng)物模型 中，使用mAb M3/38進(jìn)行處理的愈合角膜的遷移性上皮細(xì)胞的 前邊纟彖的染色現(xiàn)象更加明顯，尤其是在基底細(xì)月包層和中間細(xì)月包層 處。在愈合角膜上皮細(xì)胞和正常角膜上皮細(xì)月包中，在細(xì)胞與基質(zhì) 連接點(diǎn)的位置處的免疫染色現(xiàn)象更加明顯。雖然正常角膜的基質(zhì)細(xì)胞不能夠與mAb M3/38發(fā)生反應(yīng)，但在愈合角膜內(nèi)的基質(zhì)中 的細(xì)胞強(qiáng)烈的表達(dá)半乳糖凝集素-3,尤其是在遷移性上皮細(xì)胞 內(nèi)的區(qū)域中。
當(dāng)允許角膜在包含非必需氨基酸、L-谷氨酸鹽、抗生素和 0.4%小牛血清白蛋白(BSA)的不含血清的Eagle， s培養(yǎng)液中 進(jìn)行16到18小時(shí)的器官培養(yǎng)以進(jìn)行愈合的時(shí)候，角膜上皮細(xì)胞 中的半乳糖凝集素-3具有類似的免疫反應(yīng)性。然而，纟皮允許進(jìn) 行體外愈合的角膜的前基質(zhì)中缺乏表達(dá)半乳糖凝集素-3的細(xì) 胞，這表明，被允許進(jìn)行體內(nèi)愈合的角膜基質(zhì)中的半乳糖凝集素 -3陽(yáng)性細(xì)胞最可能是白細(xì)胞而不是角膜細(xì)胞。
為了確定半乳糖凝集素-3的糖識(shí)別區(qū)域是否在受傷的角膜 上皮細(xì)胞的片層遷移中發(fā)揮作用，在二糖P -乳糖和蔗糖存在以 及不存在的情況下，將帶有2毫米受激準(zhǔn)分子激光切口和磨損傷 口的角膜進(jìn)行器官培養(yǎng)愈合。其中，乳糖中包含半乳糖，能 夠結(jié)合半乳糖凝集素，而蔗糖中缺乏半乳糖，不能結(jié)合半乳糖凝 集素。在這些試-險(xiǎn)中，當(dāng)P -乳糖存在時(shí)，角膜傷口的再上皮化 速率明顯減慢，而蔗糖的存在與否則不產(chǎn)生影響。如附圖10中 所示，愈合速率以平方毫米/小時(shí)來(lái)表示，在各個(gè)不同組中的結(jié)果 K至少兩個(gè)i式馬全的± SEM平均<直) <又用*質(zhì)纟且，0.088 ±0.003 (N = 29);介質(zhì)中力口入P -乳壽唐組，0.063 ± 0.003 (N= 19);介 質(zhì)中加入蔗泮唐纟且0.084 ± 0.004 (N= 10)。
實(shí)施例2 -野生型小鼠和半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠的角膜上
皮傷口的閉合
為了確定在半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠中的角膜傷口的再 上皮化是否被削弱，使用四種不同的角膜傷口愈合模型進(jìn)行試 驗(yàn)。通過(guò)目標(biāo)性阻斷半乳糖凝集素-3基因來(lái)獲得半乳糖凝集素
63-3缺陷型小鼠(gal-3_/_),其方法如Hsu等人于2000年在 《Am.J.Pathol》156: 1073發(fā)表的文章中所述。特別的，使用抗新 霉素基因阻斷編碼糖識(shí)別區(qū)域的基因區(qū)域。這包括使用一種抗抗 生素基因來(lái)取代一種0.5kb的基因區(qū)內(nèi)4 -基因區(qū)外-5 ( intron4
-exon5)的片斷。 <吏用Southern印跡法以及\Vestern印跡法來(lái) 證實(shí)所述半乳糖凝集素-3基因已經(jīng)^皮滅活。
主要的，帶有受激準(zhǔn)分子激光切口的角膜(如實(shí)施例1中所 述)或者帶有堿燒傷傷口的角膜被允許在體內(nèi)或者體外進(jìn)行部分 愈合(如實(shí)施例i中所述)。為了造成堿性傷害，使用環(huán)鋸 (trephine)制<卡一種2毫米的過(guò)濾;f反(Whatman50， Whatman國(guó) 際， 一每德斯通，英國(guó))，將其浸泡于0.5N的NaOH中，然后將其 至于第二組小鼠的右眼的角膜表面處，放置時(shí)間30秒。然后使
用過(guò)量的PBS漂洗眼睛。在愈合階段的最后，使用亞曱基藍(lán)進(jìn)行 染色， -使傷口區(qū)域顯現(xiàn)。然后在標(biāo)準(zhǔn)距離處對(duì)染色傷口進(jìn)行拍照， 根據(jù)染色傷口映出的圖形將傷口區(qū)域的輪廓描繪在。使用 SIGMASCAN 軟件(SPSS芝加哥科學(xué)，IL )對(duì)這些輪廓進(jìn)行 數(shù)字化和量化分析。對(duì)于不同的傷口愈合型gal - 3 +/+小鼠才莫型的 傷口閉合速率的分析表明在gal-3 +八小鼠模型中，以平方毫米 /小時(shí)表示傷口閉合速率，由受激準(zhǔn)分子激光切除術(shù)損傷的角膜中 的傷口閉合速率慢于由堿燒傷損傷的角膜中的傷口閉合速率。同 樣的，不管造成損傷的方法如何，在體內(nèi)進(jìn)行愈合的角膜的傷口 閉合速率要快于在器官培養(yǎng)中進(jìn)行愈合的角膜的傷口閉合速率。 如附圖11中所示，gal-3 + /+小鼠模型中的傷口閉合速率為受 激準(zhǔn)分子激光切除術(shù)損傷/體內(nèi)愈合組0.076 ±0.003平方毫米/ 小時(shí)，受激準(zhǔn)分子激光切除術(shù)損傷/體外愈合組0.050士0.003平 方毫米/小時(shí)，堿燒傷損傷/體內(nèi)愈合組0.182±0.003平方毫米/ 小時(shí)，堿燒傷損傷/體外愈合組0.106± 0.005平方毫米/小時(shí)。 其中每個(gè)組的結(jié)果都代表了至少兩次試驗(yàn)的± SEM平均值(每組中N = 9或者更多)。gal-3 + 〃小鼠模型組與gal-3+小鼠模型 組的比較表明不論角膜是由受激準(zhǔn)分子激光切除術(shù)帶來(lái)?yè)p傷， 還是由堿處理帶來(lái)?yè)p傷，也不論角膜被允許在體內(nèi)愈合還是在體 外愈合，以平方毫米/小時(shí)表示的傷口閉合速率在gal-3 +小鼠 模型組中明顯的慢于gal-3 + 〃小鼠模型組。在不同的gal_3—/_ 小鼠模型組中的傷口閉合速率為受激準(zhǔn)分子激光切除術(shù)損傷/ 體內(nèi)愈合組0.060 ± 0.004平方毫米/小時(shí)，受激準(zhǔn)分子激光切除 術(shù)損傷/體外愈合組0.036 ±0.005平方毫米/小時(shí)，石威燒傷損傷/ 體內(nèi)愈合組0.150± 0.008平方毫米/小時(shí)，石咸燒傷損傷/體外愈 合組0.081 ±0.004平方毫米/小時(shí)。同樣的，其中每個(gè)組的結(jié)果 都代表了至少兩次試驗(yàn)的土SEM平均值(每組中N=8或者更 多)。
實(shí)施例3 -半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠中受傷的遷移性角膜上
皮細(xì)胞的基因表達(dá)類型
為了嘗試?yán)斫庠趃al - 3 +小鼠模型中角膜上皮細(xì)胞傷口的 再上皮化受干擾的原因，使用cDNA微陣列技術(shù)比較了愈合型 gal - 3+ /+小鼠模型與gal - 3 — z —小鼠模型的角膜中的基因表達(dá)類 型，得到的結(jié)果進(jìn)一步通過(guò)半定量化RT-PCR來(lái)i正實(shí)。
利用實(shí)施例1中描述的方法，在30個(gè)gal-3 + /+小鼠模型和 30個(gè)gal-3 —/_小鼠模型的右眼進(jìn)行透上皮性受激準(zhǔn)分子激光切 口 (直徑2毫米)。允許角膜在體內(nèi)進(jìn)行20到24小時(shí)的部分愈 合。在愈合階段的最后，將動(dòng)物致死并分離角膜，分離后將角膜 立即》丈入液態(tài)氮中，送至Clontech實(shí)驗(yàn)室，PaloAlto,力口拿大， 在該實(shí)'驗(yàn)室中利用SMART cDNA技術(shù)分析基因表達(dá)類型。主 要的，使用由ATLAS 純化全部RNA標(biāo)記體系(Pure Total RNA Labeling System )才是供的i式劑分離出全4[5 RNA。 /人30個(gè)gal - 3 + /+小鼠角膜和30個(gè)gal-3 —/_小鼠角膜中分離得到的RNA的量分別為3.5微克和2.6《斂克。gal-3 + 〃小鼠角膜和gal-3 —卜小鼠 角膜的RNA制備的A260: A280比率分別為1.48和1.37。兩組 制備方法中核糖體RNA 28S: 18S的比率都為1.8。這確保了才是 取(制備)出的RNA的質(zhì)量是令人滿意的。為了制備探針，先 使用175納克的RNA、 一種經(jīng)過(guò)修飾的oligo ( dT )前體(CDS 前體)、POWERSCRIPTTM逆轉(zhuǎn)錄酶、以及SMART II寡核普 酸來(lái)合成單鏈cDNA。對(duì)照組的制備包括樣品的培養(yǎng)，其中不使 用逆轉(zhuǎn)錄酶。4吏用長(zhǎng)3巨離(LD ) - PCR進(jìn)4亍cDNA的擴(kuò)增反應(yīng)。 為了確定擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)的最適宜次凌l,分別在第15周期、第18 周期、第21周期和第24周期收集等量的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝 月交電泳分^f。在適宜的擴(kuò)增周期例如第23周期時(shí)產(chǎn)生的擴(kuò)增雙 鏈cDNA的量在1到1.6微克之間。根據(jù)用于ATLASTM微陣列的 SMART cDNA兮罙針合成才支術(shù)(Clontech )的4喿作手冊(cè)中描述的 方法，4吏用Klenow酶以及33P- oc ATP對(duì)擴(kuò)增的cDNA( 500納克) 進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記。將被標(biāo)記的#:針通過(guò)NUCLEOSPINTM 過(guò)濾裝置進(jìn)行過(guò)濾純化，然后與小鼠1.2k-I ATLAS 尼龍cDNA 孩吏陣列(Clontech)進(jìn)行雜交。這是一種寬的光i普排列，由大約 1200個(gè)小鼠基因構(gòu)成。進(jìn)行雜交之后，將膜暴露于掃描測(cè)定儀中， 然后使用ATLASIMAGETM2.0軟件(Clontech)進(jìn)行分析。通過(guò) 半定量化RT-PCR對(duì)得到的lt據(jù)進(jìn)4于一交-驗(yàn)。
為進(jìn)行RT-PCR，先使用前面描述的步驟從愈合型gal-3 + / + 小鼠和gal _ 3_/—小鼠的角膜中提耳又全部的RNA和單《連cDNA。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)在50微升容積的容器內(nèi)進(jìn)行，使用14納克的 cDNA,從Clontech公司購(gòu)買獲得的常用的基因特異性前體，以 及從ADVANTAGE 2型PCR試劑盒(Clontech )中得到的其他 試劑。使用的退火溫度為68°C,反應(yīng)過(guò)程取決于PCR擴(kuò)增反應(yīng) 進(jìn)行的循環(huán)次數(shù)。為了對(duì)管家基因進(jìn)行分析，在每隔5個(gè)循環(huán)周 期時(shí)收集5微升等量的擴(kuò)增產(chǎn)物，從第18循環(huán)周期開(kāi)始收集，然而，為了對(duì)不同的基因表達(dá)反應(yīng)進(jìn)行分析，在每隔一種循環(huán)周
期時(shí)收集擴(kuò)增產(chǎn)物，從第28循環(huán)周期開(kāi)始收集。^使用1.5%瓊脂 糖/ethedium溴化物凝膠電泳方法分析在不同循環(huán)周期收集的擴(kuò) 增產(chǎn)物(附圖12)。
這些試驗(yàn)表明與gal-3 + /+小鼠的愈合型角膜相比，gal-3 +小鼠的愈合型角膜中的半乳糖凝集素-7、其他半乳糖苷結(jié)合 型蛋白、以及tolloid-like蛋白(TLL )、金屬蛋白酶的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平被顯著的降低?？傊cgal-3 + 〃小鼠的愈合型角膜相 比，gal-3 —7—小鼠的愈合型角膜中的半乳糖凝集素-7的基因轉(zhuǎn) 錄減少12倍(附圖12)， TLL的基因轉(zhuǎn)錄減少14倍(數(shù)據(jù)未顯 示)。通過(guò)使用微陣列技術(shù)(附圖12)和半定量化RT-PCR技術(shù) (附圖12,其中GAPDH代表D -甘油醛-3 -磷酸脫氫酶；RPS29 代表核糖體蛋白S29; ODC代表鳥(niǎo)氨酸脫羧酶)進(jìn)行探測(cè)，發(fā)現(xiàn) 在gal - 3+ /+小鼠的愈合型角膜和gal _ 3 +小鼠的愈合型角膜中， 各種管家基因的mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平相似。
為了確定在g al - 3 +小鼠的愈合型角膜中的半乳糖凝集素 -7蛋白的表達(dá)水平是否同樣下降，使用去垢劑取出gal-3 + /+小 鼠的愈合型角膜和gal - 3 —/_小鼠的愈合型角膜進(jìn)行Western印跡 分析(附圖13A),并使用gal-3 + /+小鼠的愈合型角膜和gal-3 —/_小鼠的愈合型角膜的石蠟切片對(duì)抗半乳糖凝集素-7多克隆 抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究(附圖13B)。將分析出的免疫反應(yīng) 性分為強(qiáng)(+ + + )、中(+ + )、弱(+ )、或者陰性(不反應(yīng)) (-)幾個(gè)等級(jí)。與gal-3 + /+小鼠的愈合型角膜相比，在gal-3 一 z _小鼠的愈合型的遷移性角膜上皮細(xì)胞中檢測(cè)到顯著降低的半 乳^f唐凝集素-7免疫反應(yīng)性。其結(jié)果表現(xiàn)為gal-3 + /+小鼠+ + + 36/42, ++ 5/42, +或者更少1/42; ga卜3 —卜小鼠+ + + 3/42， ++26/42， +或者更少13/42。同樣的，在細(xì)月包i備養(yǎng)基
67中生長(zhǎng)的gal - 3 +小鼠胚胎纖維原細(xì)胞(MEF )與在細(xì)胞培養(yǎng)基 中生長(zhǎng)的gal - 3 + /+小鼠胚胎纖維原細(xì)胞相比，前者表達(dá)降低水平 的半乳糖凝集素-7 (附圖13C)。
實(shí)施例4 -在野生型小鼠和半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠中，夕卜 源性半乳糖凝集素-3對(duì)小鼠角膜傷口的再上皮化的刺激
我們已經(jīng)證明，在gal-3_/小鼠模型中，其角膜上皮細(xì)胞的 傷口閉合速率受到干擾(見(jiàn)實(shí)施例2),現(xiàn)在希望確定是否外源性 半乳糖凝集素-3也能夠?qū)υ谄鞴倥囵B(yǎng)中進(jìn)行愈合的角膜的再上 皮化產(chǎn)生刺激作用。在這項(xiàng)研究中，將帶有堿燒傷傷口的gal-3 + /+小鼠角膜和gal - 3 +小鼠角膜放在不含血清的培養(yǎng)液中進(jìn)行 誘導(dǎo)培養(yǎng)，該過(guò)程在不同劑量的重組半乳糖凝集素-3存在和不 存在的情況下進(jìn)4亍。
重組型的全長(zhǎng)人類半乳糖凝集素-3是在大腸埃希氏菌中制 備的，并且采用先前描述的方法進(jìn)行純化(參見(jiàn)Yang等人于1998 年在《生物化學(xué)》37: 4086中發(fā)表的文章)。根據(jù)實(shí)施例2中描 述的方法，使用堿浸泡過(guò)的過(guò)濾板在經(jīng)過(guò)麻醉的小鼠的雙眼上制 造堿燒傷傷口 (直徑2毫米)。在受傷之后，將動(dòng)物模型致死并 分離得到眼球，在外源性半乳糖凝集素-3存在或者不存在的情 況下對(duì)眼球進(jìn)行18到20小時(shí)的誘導(dǎo)培養(yǎng)。把動(dòng)物模型的左眼作 為對(duì)照組，僅使用不含血清的介質(zhì)對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。將動(dòng)物右 眼在不含血清的介質(zhì)中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，所述介質(zhì)中還包含下述的 各種待測(cè)試劑(i)半乳糖凝集素-3 ( 5到20微克/毫升)，(ii) 半乳糖凝集素-3( 10微克/毫升)，并加入0.1M的P -乳糖，(iii) 半乳糖凝集素-3 ( 10孩i克/毫升)，并加入0.1M的蔗糖，(iv) O.IM的P -乳糖，或者(v) O.IM的蔗糖。在愈合階段的最后， 剩余的未愈合傷口區(qū)域被染色、拍照、并且使用SIGMASCAN 軟件(SPSS芝加哥科學(xué)，IL)進(jìn)行量化分析，釆用實(shí)施例2所述的方法進(jìn)行。其中每個(gè)組都包含三只眼球的最小值，并且所有 試一驗(yàn)都進(jìn)^f于了至少兩次。
在gal - 3 +小鼠模型中，外源性半乳糖凝集素-3對(duì)角膜傷 口的再上皮化速率不產(chǎn)生任何影響(附圖14A),但是在831-3 + /+小鼠模型中，濃度為10微克/毫升和20微克/毫升的外源性半乳 糖凝集素-3通過(guò)濃度依賴的方式刺激角膜傷口的閉合速率(附 圖14B)(濃度為0和5微克/毫升時(shí)0.090 土 0.010平方毫米/小 時(shí)；濃度為10微克/毫升時(shí)0.129±0.010平方毫米/小時(shí)；濃度 為20微克/毫升時(shí)0.154±0.004平方毫米/小時(shí)；所有數(shù)值都是 耳又至少兩次試驗(yàn)的± SEM平均值，N-7或者更多)。如附圖15 中所示，在gal-3 + /+小鼠模型中，半乳糖凝集素-3對(duì)于角膜上 皮細(xì)胞傷口的閉合速率的刺激效應(yīng)被(3 -乳糖特異性的抑制，而 不被蔗糖所抑制(10微克/毫升半乳糖凝集素-3: 0.127 ±0.010 平方毫米/毫升；1(H鼓克/毫升半乳糖凝集素-3加上0.1MP -乳 糖0.103 ±0.014平方毫米/毫升；10樣i克/毫升半乳糖凝集素-3 加上0.1M嚴(yán)糖0.130 土 0.003平方毫米/毫升。所有數(shù)值都是耳又 至少兩次試驗(yàn)的± SEM平均值，N二7或者更多)。
實(shí)施例5-在野生型小鼠和半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠中，夕卜 源性半乳糖凝集素-7對(duì)小鼠角膜傷口的再上皮化的刺激
在一種單獨(dú)的研究中，使用cDNA微陣列技術(shù)(例如在實(shí)施 例3中使用到的)對(duì)正常小鼠角膜和ga1-3 + /+小鼠的愈合角膜的 基因表達(dá)類型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在愈合角膜中，半乳糖凝集素-7的表達(dá)被顯著的增量調(diào)節(jié)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與實(shí)施例3中描述的研究 結(jié)果一同表明在gal-3〃—小鼠的愈合角膜中，半乳糖凝集素-7的表達(dá)被負(fù)調(diào)節(jié)(減量調(diào)節(jié))，因而需要設(shè)計(jì)一類試驗(yàn)以確定外 源性半乳糖凝集素-7是否會(huì)對(duì)在器官培養(yǎng)中愈合的角膜的再上 皮化產(chǎn)生刺激作用。在這項(xiàng)研究中，將帶有堿性燒傷傷口的gal
69-3 +小鼠角膜在不含血清的培養(yǎng)液中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，這種培養(yǎng) 是在不同劑量的重組半乳糖凝集素-7存在以及不存在的情況下 進(jìn)行的。
重組型的全長(zhǎng)人類半乳糖凝集素-7是在大腸埃希氏菌中制 備的，通過(guò)將cDNA(以EST克隆的形式從美國(guó)典型培養(yǎng)保藏中 心獲4尋，馬納薩斯，梵蒂岡)克隆到pET25b質(zhì)4立(乂人Novagen 公司購(gòu)買獲得，麥迪遜，WI)中的方法。根據(jù)實(shí)施例2中描述的 方法，使用堿浸泡過(guò)的過(guò)濾板在經(jīng)過(guò)麻醉的小鼠的雙眼上制造堿 燒傷傷口 (直徑2毫米)。在受傷之后，將動(dòng)物模型致死并分離 得到眼3求，在外源性半乳糖凝集素-7存在或者不存在的情況下 對(duì)眼球進(jìn)行18到20小時(shí)的誘導(dǎo)培養(yǎng)。把動(dòng)物模型的左眼作為對(duì)
不含血清的介質(zhì)中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，所述介質(zhì)中還包含下述的各種 待測(cè)試劑(i)半乳糖凝集素-7 (20微克/毫升)，(ii)半乳糖 )疑集素_ 7 ( 20孩吏克/毫升)，并加入0.1M的(3 -乳沖唐，或者(iii) 半乳糖凝集素-7 (20微克/毫升)，并加入0.1M的蔗糖。在愈合 階段的最后，剩余的未愈合傷口區(qū)域被染色、拍照、并且使用 SIGMASCAN 軟件(SPSS芝加哥科學(xué)，IL )進(jìn)行量化分析， 采用實(shí)施例2所述的方法進(jìn)行。其中每個(gè)組都包含六只眼3求的最 小值，并且所有試—驗(yàn)都進(jìn)4于了至少兩次。
如附圖16中所示，外源性半乳糖凝集素-7刺激傷口閉合速 率(<義<吏用介質(zhì)0.036 ± 0.006平方毫米/小時(shí)；20孩i克/毫升半 乳糖凝集素-7: 0.072 ± 0.004平方毫米/小時(shí)；所有數(shù)值都是:f又 至少兩次試—驗(yàn)的士SEM平均^f直，N=10或者更多)。如附圖16 中所示，半乳糖凝集素-7對(duì)于角膜上皮細(xì)胞傷口的閉合速率的 刺激效應(yīng)被P -乳糖特異性的抑制，而不一皮蔗糖所抑制(20孩吏克 /毫升半乳糖凝集素-7: 0.072 ± 0.004平方毫米/小時(shí)；20孩吏克/
70毫升半浮14唐凝集素一 7力口上0.1M (3 —享14唐0.050 ± 0.004平方毫 米/小時(shí)；20微克/毫升半乳糖凝集素-7加上0.1M蔗糖0.079 ±0.007平方毫米/小時(shí)。所有數(shù)值都是取至少兩次試驗(yàn)的土SEM 平均值，N-9或者更多)。如附圖16中所示，當(dāng)將外源性半乳 糖凝集素-7加入到gal-3"+小鼠的受傷角膜而不是gal-3_/ — 小鼠的受傷角膜中時(shí)，角膜傷口的閉合速率被進(jìn)一步提高了 (0.094±0.003 gal - 3 + /+平方毫米/小時(shí))。
實(shí)施例6-在野生型小鼠和半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠中，皮
月夫上皮細(xì)月包傷口的閉合
通過(guò)腹膜內(nèi)注射1.25。/。P可佛丁 (0.2毫升/10克體重)對(duì)gal -3小小鼠和ga1-3 —/_小鼠進(jìn)行麻醉。在進(jìn)行激光處理之前，使 用刀片將小鼠背部區(qū)域的毛剃掉。使用受激準(zhǔn)分子激光器 (Summit Technology of Waltham, MA )在小鼠背部制造長(zhǎng)6毫米 的透上皮性皮膚傷口。手術(shù)之后，向傷口表面施用抗生素藥膏， 并且在皮下注射丁丙i若啡(2毫克/千克體重)以減輕術(shù)后的疼痛。 傷口被允許在體內(nèi)進(jìn)行部分愈合，并且在手術(shù)后24小時(shí)、48小 時(shí)和72小時(shí)時(shí)進(jìn)行檢查。在愈合階段的最后，再次使用腹膜內(nèi) 注射1.25%阿佛丁 (0.2毫升/10克體重)對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，并且 使用Sigma掃描軟件對(duì)傷口區(qū)域進(jìn)行拍照和量化分析。對(duì)比兩 組小鼠模型(例如，gal-3+〃小鼠和ga1-3—/_小鼠)的傷口閉合 速率。然后，通過(guò)使小鼠吸入二氧化碳或者給予過(guò)量劑量的戊巴 比妥將動(dòng)物f丈死。
實(shí)施例7 _外源性半乳糖凝集素-3對(duì)皮膚傷口再上皮化的影響
通過(guò)腹膜內(nèi)注射1.25 %阿佛丁 (0.2毫升/10克體重)對(duì)動(dòng)物 模型(小鼠57BL/6以及129種混合的遺傳背景；年齡6周到 8周大；性別混合)進(jìn)行麻醉。在進(jìn)行激光處理之前， -使用刀
71片將小鼠背部區(qū)域的毛剃掉。使用受激準(zhǔn)分子激光器(Summit Technology of Waltham, MA )在小鼠背部制造兩個(gè)長(zhǎng)6毫米的透 上皮性皮力夫傷口 (每側(cè)一種傷口)。手術(shù)之后，向傷口表面施用 抗生素藥膏，并且在皮下注射丁丙諾啡(2毫克/千克體重)以減 輕術(shù)后的疼痛。傷口被允許在體內(nèi)進(jìn)行部分愈合。每隔4到6個(gè) 小時(shí)，向右側(cè)傷口上施用含有半乳糖凝集素-3的藥膏，向左側(cè) 傷口上<義<義施用載體作為對(duì)照組。在愈合階_度的最后(24到48 小時(shí))，再次-使用腹膜內(nèi)注射1.25%阿佛丁 (0.2毫升/10克體重) 對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，并且使用Sigma掃描軟件對(duì)傷口區(qū)域進(jìn)行拍 照和量化分析。對(duì)比兩組小鼠模型(例如，經(jīng)過(guò)半乳糖凝集素-3處理的小鼠以及對(duì)照組小鼠)的傷口閉合速率。然后，通過(guò)使 小鼠吸入二氧化碳或者給予過(guò)量劑量的戊巴比妥將動(dòng)物致死。
實(shí)施例8 -外源性半乳jf唐凝集素-7對(duì)皮膚傷口再上皮化的影響
通過(guò)腹膜內(nèi)注射1.25%阿佛丁 ( 0.2毫升/10克體重)對(duì)動(dòng)物 模型(小鼠57BL/6以及129種混合的遺傳背景；年齡6周到 8周大；性別混合)進(jìn)行麻醉。在進(jìn)行激光處理之前，使用刀 片將小鼠背部區(qū)域的毛剃掉。使用受激準(zhǔn)分子激光器(Summit Technology of Waltham, MA )在小鼠背部制造兩個(gè)長(zhǎng)6毫米的透 上皮性皮膚傷口 (每側(cè)一種傷口)。手術(shù)之后，向傷口表面施用 抗生素藥膏，并且在皮下注射丁丙諾啡(2毫克/千克體重)以減 輕術(shù)后的疼痛。傷口被允許在體內(nèi)進(jìn)行部分愈合。每P鬲4到6個(gè) 小時(shí)，向右側(cè)傷口上施用含有半乳糖凝集素-7的藥膏，向左側(cè) 傷口上<又<又施用載體作為對(duì)照組。在愈合階孚殳的最后(24到48 小時(shí))，再次使用腹膜內(nèi)注射1.25 %阿佛丁 (0.2毫升/10克體重) 對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，并且使用Sigma掃描軟件對(duì)傷口區(qū)域進(jìn)行拍 照和量化分析。對(duì)比兩組小鼠模型(例如，經(jīng)過(guò)半乳糖凝集素-
727處理的小鼠以及對(duì)照組小鼠)的傷口閉合速率。然后，通過(guò)使 小鼠吸入二氧化碳或者給予過(guò)量劑量的戊巴比妥將動(dòng)物致死。
實(shí)施例9 -外源性半乳糖凝集素-8或者半乳糖凝集素-1對(duì)白
化病變種型兔的干眼癥的影響
通過(guò)腹膜內(nèi)注射1.25%阿佛丁 (0.2毫升/10克體重)對(duì)動(dòng)物 模型(兔白化病變種型；年齡6周到8周大；性別混合) 進(jìn);f亍麻醉。通過(guò)每天重復(fù)進(jìn)^f亍1.0%阿4乇品石危酸鹽flr液的方法^吏 每個(gè)小兔模型都患上干眼癥(參見(jiàn)Burgalassi， S等人于1997年 在《眼一牛學(xué)研究》31: 229 - 235中發(fā)表的文章)。通過(guò)淚液分泌 試驗(yàn)以及在焚光染色后對(duì)角膜的檢查結(jié)果來(lái)評(píng)估每個(gè)動(dòng)物模型 患有的干眼綜合癥。
每隔4到6個(gè)小時(shí)，向每個(gè)動(dòng)物模型的右眼施用含有半乳糖 凝集素-8溶液的滴眼液，而對(duì)其左眼僅僅施用載體溶液，作為 對(duì)照組。在愈合階段的最后(24到48小時(shí))，再次使用腹膜內(nèi)注 射1.25%阿佛丁 (0.2毫升/10克體重)對(duì)動(dòng)物才莫型進(jìn)行麻醉，并 且使用Sigma掃描軟件對(duì)眼部區(qū)域進(jìn)行拍照和量化分析。評(píng)估 兩組眼球(經(jīng)過(guò)半乳糖凝集素-8處理的右眼，以及作為對(duì)照組 的左目艮)的眼3求表面以及干眼癥的癥狀，并且對(duì)兩組眼3求表面進(jìn) 行比較。然后，通過(guò)使小鼠吸入二氧化碳或者給予過(guò)量劑量的戊 巴比妥將動(dòng)物致死，并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化毒物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)4于分才斤。
人類和其他脊推動(dòng)物體內(nèi)的各種半乳糖凝集素-8蛋白的氨 基酸序列(附圖18以及序列4和序歹'j 5)在本質(zhì)上是等同的(附 圖20)，尤其是那些其他哺乳動(dòng)物種類。類似的，人類和其他哺 乳動(dòng)物體內(nèi)的各種半乳糖凝集素-！蛋白的氨基酸序列(附圖19
以及序列6)也是在基本上同源的。保守變化和非保守(less conservation)變〗匕發(fā)生的^f立點(diǎn)表明這些〗立點(diǎn)上的殘基可以發(fā)生
73變化，以獲得其他功能性半乳糖凝集素-8蛋白和/或半乳糖凝集
素-1蛋白，其中這些蛋白能夠治愈干眼綜合癥以及其他眼部適 應(yīng)癥。
實(shí)施例10 -天仙子》威動(dòng)物才莫型使用半乳J瞎凝集素治療干眼綜合 癥(DES),以及在進(jìn)行天仙子石成處理之前，使用半乳糖凝集素
溶液進(jìn)4亍預(yù)處理所產(chǎn)生的作用
根據(jù)下面的治療方案所描述的方法施用人工淚液溶液，其中 每毫升溶液中含有0農(nóng)吏克、10微克或者20微克半乳糖凝集素-1、 半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8中的一 種或者兩種。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)每個(gè)動(dòng)物才莫型的一只眼睛進(jìn)4亍處 理，每次Y吏用lO孩i升滴劑。在一組施用過(guò)天仙子;威片劑的動(dòng)物 模型中，以每天4次的頻率在一只眼睛上施用10微克/毫升半乳 4唐凝集素〉容液，在施用天仙子石成片劑之后立即開(kāi)始施用半乳^唐凝 集素溶液。向接受半乳糖凝集素處理的動(dòng)物模型組的小鼠施以每 種濃度的半乳斗唐凝集素溶液。將所述的處理過(guò)的動(dòng)物才莫型組和處 理過(guò)的眼睛打亂順序任意排列，然后再將其編碼，以^f呆i正測(cè)量是 在完全隨沖幾的情況下進(jìn)4于的。每種動(dòng)物;模型的一只眼睛4妄受一種 處理溶液，另 一只眼睛4妻受對(duì)照滴眼液處理。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在兩 邊進(jìn)行分別測(cè)量。
實(shí)施例11-天仙子石成(Scopalomine )動(dòng)物沖莫型施用半乳糖凝 集素-3和(3 -乳糖---種半乳糖凝集素抑制劑的組合治療
重復(fù)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的步驟，其中使用添加了 0.1M P -乳糖的10孩t克/毫升半乳糖凝集素溶液，以確定半乳糖凝集素 的作用是否能夠被竟?fàn)幮远撬种啤?duì)天仙子堿動(dòng)物才莫型的治療方案
第 一天-基線測(cè)量(baseline measurements )(淚'液，淚月莫石皮 裂時(shí)間，熒光素染色)
施用天仙子石成
第二天-在施用天仙子石咸24小時(shí)候進(jìn)行預(yù)處理測(cè)量(第二 天，0時(shí)間點(diǎn))
在測(cè)量之后的0小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)和12小時(shí)的時(shí)4美施用 半乳糖省是集素或者對(duì)照滴眼液
在l-2小時(shí)、4-5小時(shí)、8-9小時(shí)的時(shí)候?qū)?dòng)物暴露于吹 氣面罩
第三天-在0時(shí)間點(diǎn)施用新的天仙子石咸片齊寸
在0時(shí)間點(diǎn)、4小時(shí)、8小時(shí)和12小時(shí)的時(shí)候施用半乳糖凝 集素或者對(duì)照滴眼液
在前次處理之后的2小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量(第三天，時(shí)間2小時(shí))
在1-2小時(shí)、4-5小時(shí)、8 - 9小時(shí)的時(shí)候?qū)?dòng)物暴露于吹 氣面罩
第四天-測(cè)量(第四天，O時(shí)間點(diǎn))
在0時(shí)間點(diǎn)、4小時(shí)、8小時(shí)和12小時(shí)的時(shí)候施用半乳糖凝 集素或者對(duì)照滴眼液
75在1-2小時(shí)、4-5小時(shí)、8-9小時(shí)的時(shí)候?qū)?dòng)物暴露于吹 氣面罩
第五天-在0時(shí)間點(diǎn)施用新的天仙子石咸片劑
在0時(shí)間點(diǎn)、4小時(shí)、8小時(shí)和12小時(shí)的時(shí)4矣施用半乳津唐;疑 集素或者對(duì)照滴眼液
在1-2小時(shí)、4-5小時(shí)、8-9小時(shí)的時(shí)候?qū)?dòng)物暴露于吹 氣面罩
第六天-測(cè)量(第六天，O時(shí)間點(diǎn))
實(shí)施例12 -在自體免疫型MRL/lpr小鼠模型中，半乳糖凝集素_ 1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8在
千眼綜合癥中所起的作用
將經(jīng)過(guò)處理的動(dòng)物纟莫型組和經(jīng)過(guò)處理的眼睛打亂順序^f壬意 排列，然后再將其編碼，以保i正測(cè)量是在完全隨機(jī)的情況下進(jìn)4亍 的。每種動(dòng)物才莫型的一只眼睛4妄受一種處理〉容液，另一只眼睛才妻 受對(duì)照滴眼液處理。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在兩邊進(jìn)行分別測(cè)量。
治療方案
第一天-基線測(cè)量(baseline measurements )(淚液，淚月莫石皮 裂時(shí)間，熒光素染色)
在O時(shí)間點(diǎn)、4小時(shí)、8小時(shí)和12小時(shí)的時(shí)候施用半乳糖凝 集素或者對(duì)照滴眼液第二天-在0時(shí)間點(diǎn)、4小時(shí)、8小時(shí)和12小時(shí)的時(shí)候施用 半乳津唐凌是集素或者對(duì)照滴眼液
在前次處理之后的2小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量(第二天，時(shí)間2小時(shí))
第三天-測(cè)量(第三天，0時(shí)間點(diǎn))
在測(cè)量之后的O小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)和12小時(shí)的時(shí)候施用 半乳糖凝集素或者對(duì)照滴眼液
第四天-在0小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)和12小時(shí)的時(shí)^f'美施用半 乳沖唐凝集素或者對(duì)照滴眼液
在前次處理之后的2小時(shí)后進(jìn)4于測(cè)量(第四天，時(shí)間2小時(shí))
第五天-在O小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)和12小時(shí)的時(shí)候施用半 乳糖凝集素或者對(duì)照滴眼液
第六天-測(cè)量(第六天，0時(shí)間點(diǎn))
實(shí)施例13 _半乳糖;疑集素_ 3對(duì)患有干眼綜合癥的生物體的
修復(fù)
為了確定半乳糖凝集素在治療干眼綜合癥中所起的作用，需 要借助一組使用白細(xì)胞介素-1處理的動(dòng)物模型體系，使用四組
小鼠才莫型，每組5只，按照如下方法對(duì)小鼠進(jìn)行處理。在其中三 組中，依照處理患有干燥綜合癥的小鼠模型的標(biāo)準(zhǔn)方法(參見(jiàn) Zoukhri, D等人在《Invest Ophthalmol Vis Sci》42 ( 5 ): 925 -932中發(fā)表的文章)，在第0天主合小鼠注射白細(xì)胞介素-l(IL-l )。 然后，乂人第一天開(kāi)始，以每天四次的頻率向注射過(guò)白細(xì)月包介素-1的小鼠再施用75纟鼓克/毫升或者150農(nóng)i克/毫升的滴眼液，所述滴眼液中含有半乳糖凝集素-3。另外一組小鼠模型以相似的方 式僅使用緩沖液進(jìn)行處理，每天處理4次(不含半乳糖凝集素)。 按照前面描述的方法(參見(jiàn)Zoukhri等人發(fā)表的文章)使用熒光 清除法對(duì)每個(gè)小鼠的干眼癥的程度進(jìn)行評(píng)估。
附圖21表示出早在治療的第一天，與對(duì)照組小鼠相比， 在使用了每次75微克/毫升或者每次150微克/毫升半乳糖凝集素
-3處理過(guò)的小鼠中，由熒光清除法測(cè)量到其淚液分泌是增強(qiáng)的， 并且在第二天，經(jīng)過(guò)半乳糖凝集素-3處理的小鼠的千眼癥狀被 全部治愈。事實(shí)上，在使用低劑量(75微克/毫升)半乳糖凝集 素處理的情況中，在第二天已經(jīng)觀察到淚液分泌有些改善，最適 宜的用藥劑量甚至可以Y氐于這個(gè)凄t值。在附圖21中，表示半乳 糖凝集素處理過(guò)的才莫型組第二天的lt值的柱形圖上方的星號(hào)的 含義是與患有干眼癥并且僅僅使用緩沖溶媒處理的對(duì)照模型組 中測(cè)得的數(shù)值相比，前者的數(shù)值具有統(tǒng)計(jì)顯著性，其值p0.05。 總之，在使用半乳糖凝集素-3處理一天到兩天后，半乳糖凝集 素-3能夠治療千眼癥并且治愈其癥狀。我們已知，在哺乳動(dòng)物 體內(nèi)含有的半乳糖凝集素具有相當(dāng)高程度的同一性，并且已知在 半乳糖凝集素蛋白家族的不同成員中存在功能性氨基酸序列和 特異性氨基酸序列的保守同一性，因此可以預(yù)期，半乳糖凝集素
-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8 中的任何一種，或者這些半乳糖凝集素的混合物，它們?cè)谥斡?眼癥和其^也相關(guān)綜合癥中都具有相似、的有凌文作用。
結(jié)論
本發(fā)明證明了半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素-7在角膜 傷口的再上皮化過(guò)程中起到一定作用。實(shí)施例1的免疫組織化學(xué) 研究表明在角膜受到損傷之后，半乳糖凝集素-3以高密度的 形式聚集在角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞與基質(zhì)的連接處位點(diǎn)上，這是一
78種能夠影響細(xì)月包與基質(zhì)間的相互反應(yīng)及由此產(chǎn)生的細(xì)月包遷移的
理想位點(diǎn)。在實(shí)施例2中，與野生型小鼠相比，半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠的角膜傷口的再上皮化過(guò)程表現(xiàn)出明顯的緩慢。實(shí) 施例3表明在角膜受到損傷之后，與野生型小鼠相比，半乳糖 凝集素-3缺陷型小鼠的半乳糖凝集素-7表達(dá)水平明顯降低。 在實(shí)施例4和實(shí)施例5中，外源性重組半乳壽唐凝集素-3和半乳 糖凝集素-7表現(xiàn)出能夠刺激gal - 3 + /+小鼠的角膜傷口的再上皮 化。實(shí)施例6-8才是供了用以測(cè)定半乳糖凝集素對(duì)傷口再上皮化 的作用的方法。實(shí)施例9- 12提供了用以測(cè)定半乳糖;疑集素對(duì)干 眼綜合癥的治療效果的方法。實(shí)施例13表示出半乳糖凝集素對(duì) 干眼癥產(chǎn)生的快速有效的修復(fù)作用。實(shí)施例1還進(jìn)一步證明了半 乳糖凝集素-3對(duì)于角膜上皮細(xì)胞傷口閉合速率的刺激性作用會(huì) 被包含相關(guān)半乳糖苷化學(xué)結(jié)構(gòu)的竟?fàn)幮远?P -乳糖)所抑制， 但是不會(huì)被不相關(guān)的化學(xué)結(jié)構(gòu)不相干的二糖(蔗糖)所影響。這 個(gè)結(jié)果表明，外源性半乳糖凝集素對(duì)角膜的有益作用直接由糖類 識(shí)別結(jié)構(gòu)i或(CRD)所產(chǎn)生。
不需要結(jié)合任何的特殊理論，關(guān)于半乳糖;疑集素-i、半乳
糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8能夠促進(jìn)干 眼綜合癥的修復(fù)這一機(jī)制，本發(fā)明給出了下述答復(fù)。
正如前面所纟是到的，半乳糖凝集素-3 一皮認(rèn)為是通過(guò)與互補(bǔ) 的糖結(jié)合物的結(jié)合來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作 用的，所述的互補(bǔ)的糖結(jié)合物中含有存在于許多細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì) 胞表皮分子中的聚乳糖胺《連，例如某些纖維連4妄蛋白亞型、層粘 連蛋白亞型、以及整合蛋白亞型(參見(jiàn)Liu于2000年在《免疫 學(xué)臨床》97: 79中發(fā)表的文章；以及Perillo于《Supra》中發(fā)表 的文章)。然而，本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)外源性半乳糖凝集素-3不會(huì)加速 gal-3—/_小鼠的傷口的再上皮化(參見(jiàn)實(shí)施例4),這表明細(xì)胞內(nèi)半乳糖凝集素-3對(duì)于傷口愈合的過(guò)程具有顯著的貢獻(xiàn)，最優(yōu) 選的，通過(guò)影響特異性細(xì)胞表面受體和/或細(xì)胞外基質(zhì)受體的表 達(dá)，來(lái)依次影響細(xì)月包與基質(zhì)間的相互作用和細(xì)月包遷移。這一乂見(jiàn)點(diǎn) 與某些公開(kāi)的論文相一致，這些論文中記栽，與不表達(dá)半乳糖凝 集素-3或者表達(dá)少量半乳糖凝集素-3的親本細(xì)胞系相比，半 乳糖凝集素-3在乳腺癌細(xì)胞系中的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了 a 4 (3 7整 合蛋白和a6(3 1整合蛋白水平的提升，并且加強(qiáng)了其與包括層粘 連蛋白、纖維連4妄蛋白和玻連蛋白在內(nèi)的各種細(xì)胞外基質(zhì)分子的 黏附(參見(jiàn)Wwarfield在《supra》中發(fā)表的文章"supra and Mattarese，，)。在另夕卜一篇i侖文中(Dudas等人于2000年在《胃腸 病學(xué)》118: 1553中發(fā)表的文章)，經(jīng)過(guò)半乳糖;疑集素-3轉(zhuǎn)染的 結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞系表達(dá)了升高水平的特異性翻蛋白——MUC2 ， 這是外源性凝集素自身的主要配體(參見(jiàn)Bresalier等人于1996 年在《腫瘤研究》56: 4353中發(fā)表的文章)。外源性半乳糖凝集 素- 3對(duì)于gal - 3 + /+小鼠的傷口的再上皮化的刺激性作用能夠被 乳糖所抑制，這一事實(shí)提出了一種令人感興趣的可能性，即細(xì)胞 內(nèi)半乳糖凝集素-3可能的確調(diào)節(jié)了某些蛋白的糖基化，所述蛋 白是外源性凝集素自身的細(xì)胞表面受體或者細(xì)胞外基質(zhì)受體。由 于在某些情況下，發(fā)現(xiàn)外源性凝集素在核內(nèi)與核糖核蛋白復(fù)合物 聯(lián)接在一起，并且能夠作為前體-mRNA剪接因子(參見(jiàn)Dagher 等人于1995年在《Proc. Natl. Acad. Sci》美國(guó)92: 1213中發(fā)表 的文章)，因此，有人提出細(xì)胞內(nèi)半乳糖凝集素-3具有在核基質(zhì) 上產(chǎn)生作用的潛能，以影響復(fù)雜的生物反應(yīng)過(guò)程。同才羊的，Wang 等人已經(jīng)證明，在前列腺癌細(xì)胞中，半乳糖凝集素-3與核基質(zhì) 聯(lián)接在一起，并且與雙鏈DNA和RNA相結(jié)合(參見(jiàn)Wang等人 于1995年在《生物化學(xué)、生物物理學(xué)研究交流》217: 292中發(fā) 表的文章)。使用小鼠cDNA微陣列技術(shù)對(duì)愈合型gal - 3 + /+小鼠角膜和 gal - 3 +小鼠角膜的基因表達(dá)類型進(jìn)行的分析表明，與野生型小 鼠相比，gal - 3 -小鼠的愈合型角膜表達(dá)了顯著降低水平的半乳 糖凝集素-7 (參見(jiàn)實(shí)施例3和實(shí)施例5 )。半乳糖凝集素-7首 次被才艮道于1994年(參見(jiàn)Barondes于《supra》中發(fā)表的文章)， 它的特征被分析的并不像半乳糖凝集素-3那樣清楚。不同于半 乳糖凝集素-3,半乳糖凝集素-7表現(xiàn)出顯著程度的組織特異 性。在成年動(dòng)物中，半乳糖凝集素-7的表達(dá)受到上皮細(xì)胞的限 制，形成或者必定會(huì)形成分層的狀態(tài)(參見(jiàn)Timmons等人于 《supra》中發(fā)表的文章)。半乳糖凝集素-7蛋白被認(rèn)為是在細(xì)胞 與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞間的相互反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡中起作用(參見(jiàn) Leonidas于1998年在《生物4匕學(xué)》37: 13930;以及Bernerd等 人于1999年在《Proc. Natl. Acad. Sci.》美國(guó)96: 11329中發(fā)表的 文章)。通常，在半乳糖凝集素-7的表達(dá)和角質(zhì)細(xì)胞增殖過(guò)程中 存在一種逆向4目關(guān)(inverse correlation )，且在纟至過(guò)SV40專爭(zhēng)4匕的 角質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系中，半乳糖凝集素-7的表達(dá)被 抑制。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)外源性半乳糖凝集素-3不會(huì)對(duì)gal - 3 —卜小 鼠的角膜傷口的再上皮化產(chǎn)生刺激作用，并且gal - 3 +小鼠的愈 合型角膜中包含了降低水平的半乳糖凝集素-7,這一發(fā)現(xiàn)表明 半乳糖凝集素-3可以通過(guò)調(diào)節(jié)半乳糖凝集素-7來(lái)產(chǎn)生對(duì)傷口 再上皮化的影響，至少部分通過(guò)調(diào)節(jié)半乳糖凝集素-7來(lái)產(chǎn)生對(duì) 傷口再上皮化的影響。的確，研究發(fā)現(xiàn)，不同于半乳4唐;疑集素-3，半乳糖凝集素-7以乳糖抑制性的方式加速gal-3 +小鼠的 角膜傷口的再上皮化。同樣的，gal-3 +小鼠的胚胎纖維原細(xì)胞 表達(dá)降低水平的半乳糖凝集素- 7。
不管這些反應(yīng)中包含怎樣的反應(yīng)才幾制，關(guān)于半乳一唐;疑集素-3和半乳糖凝集素-7能夠刺激角膜傷口的再上皮化這一發(fā)現(xiàn)為 上皮細(xì)胞傷口的治療方案提供了一種明顯的提示，尤其是對(duì)于非愈合型上皮細(xì)胞傷口來(lái)說(shuō)。目前，對(duì)于永久性角膜上皮缺陷的治 療仍然是一種主要的臨床難題。而且，進(jìn)一步的需要能夠有效治
療術(shù)后移植性損傷、老年人患有的慢性損傷、；溽瘡潰瘍以及皮膚 l爭(zhēng)脈瘀血潰瘍的方法。許多已知的生長(zhǎng)因子(例如，表皮生長(zhǎng)因 子，轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，角質(zhì)細(xì)^^生長(zhǎng)因 子，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)能夠刺激細(xì)胞增殖，在角膜內(nèi)以及在皮月夫 上皮細(xì)胞傷口的愈合過(guò)程中對(duì)其進(jìn)行有效性測(cè)試，所有生長(zhǎng)因子
耳又得的結(jié)果均是令人失望的(參見(jiàn)Eaglstein于1997年在《北美 外科臨床》77: 689中發(fā)表的文章；Singer和Clark于1999年在 《N. Engl. J. Med.》341: 738中發(fā)表的文章；Zieske牙口 Gipson于 2000年在"眼科學(xué)原理和實(shí)踐"中第364: 372頁(yè)中發(fā)表的文章， 該書(shū)由D.M.Albert和F.A.Jakobiec編輯，W.B， Saunders 乂>司， 費(fèi)i成，PA; Schultz等人于1994年在《目艮睛》8: 184中發(fā)表的文 章；Kandarakis等人于1984年在《美國(guó)眼科學(xué)雜志》98: 411中 發(fā)表的文章；以及Singh和Foster于1987年在《美國(guó)眼科學(xué)雜 志》103: 802中發(fā)表的文章)。在這些論文當(dāng)中，使用生長(zhǎng)因子 對(duì)傷口再上皮化的加速程度遠(yuǎn)不及本發(fā)明中描述的半乳糖凝集 素對(duì)傷口再上皮化的加速程度。同樣的，4吏用例如表皮生長(zhǎng)因子 之類的生長(zhǎng)因子處理角膜上皮細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致增生(參見(jiàn)Singh和 Foster于1989年在《角膜》8: 45中發(fā)表的文章)，這是一種明 顯不希望發(fā)生的情況。在這個(gè)方面，半乳糖凝集素-3和半乳糖 凝集素-7的臨床應(yīng)用比生長(zhǎng)因子更具吸引力，這是因?yàn)橥庠葱?凝集素沒(méi)有表現(xiàn)出能夠在上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂的 性質(zhì)。在過(guò)去的十年里，人們發(fā)現(xiàn)了受激準(zhǔn)分子激光切削術(shù)能夠 修正角膜輪廓以矯正近視的能力。每個(gè)星期，成千上萬(wàn)次的受激 準(zhǔn)分子激光切削手術(shù)#皮用以幫助近一見(jiàn)患者擺脫眼4竟和隱形眼4竟 帶來(lái)的困擾?？紤]到世界范圍內(nèi)有25 - 30%的人群患有近視，可 以估算，在一種計(jì)算年(given year)里，^f叉在美國(guó)就將進(jìn)行將近 五十萬(wàn)次這樣的手術(shù)。在某些案例中，在受激準(zhǔn)分子激光手術(shù)之后，上皮細(xì)胞的愈合將產(chǎn)生一種延遲。這種延遲是我們非常不希 望看到的，因?yàn)樗菇悄ぬ幱谝谆夹g(shù)后模糊、感染性角膜炎和潰 瘍的危險(xiǎn)之中。再一次的，基于半乳糖凝集素的治療方法可以幫 助在這些案例中促進(jìn)傷口的再上皮化。
其他實(shí)施方式
基于本發(fā)明在此公開(kāi)的內(nèi)容具有的詳述性和具體操作性，本 領(lǐng)域技術(shù)人員很容易想到本發(fā)明的其他實(shí)施方式。這里記載的詳 述和實(shí)施例〗又僅^皮看作是示范例，本發(fā)明的真實(shí)范圍由后面的4又
利要求來(lái)表征。
8權(quán)利要求
1. 一種治療哺乳動(dòng)物干眼癥的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物施以治療有效劑量的半乳糖凝集素蛋白。
2. 才艮據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)一步包括在給藥之前， 先確定所述哺乳動(dòng)物是需要預(yù)防干眼癥的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中需要接受預(yù)防或者治療的 哺乳動(dòng)物的特4正是具有至少一種選自下述的狀況眼上皮缺 損；預(yù)先使用了抗組胺劑；預(yù)先使用了消炎藥；以及預(yù)先經(jīng) 過(guò)了受激準(zhǔn)分子激光處理。
4. 才艮據(jù)^K利要求1所述的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物是人類。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素蛋白 是選自半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3,半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8中的至少一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的干眼癥是一種持續(xù) 的綜合癥。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的干眼癥能夠?qū)е律?皮磨損。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的上皮磨損會(huì)產(chǎn)生角 膜缺損。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-8 蛋白包括序列4或者序列5所示的氨基酸序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-8 蛋白包括一種與序列4或者序列5所示的氨基酸序列在基本 上同源的氨基S臾序列。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的基本上同源是指 與序列4或者序列5所示的氨基酸序列相比，具有至少60 %的序列同一性，至少70%的序列同一性，至少80%的序 列同一性，或者至少90%的序列同一性。
12. 才艮據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素- 8 蛋白包括一種半乳糖凝集素-8的N-末端結(jié)構(gòu)域， 一種半 乳糖凝集素-8的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的結(jié)構(gòu)域， 以及一種半乳糖凝集素-8的半乳糖苷結(jié)合區(qū)域。
13. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-3 蛋白包括一種半乳糖凝集素-3的富含脯氨酸、甘氨酸和酪 氨酸的結(jié)構(gòu)域，和一種半乳糖凝集素-3的半乳糖苷結(jié)合區(qū) 域。
14. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-7 蛋白包括一種半乳糖凝集素-7的N-末端結(jié)構(gòu)域， 一種半 乳糖凝集素-7的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的結(jié)構(gòu)域， 以及一種半乳糖凝集素-7的半乳糖苷結(jié)合區(qū)域。
15. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-1 蛋白包括一種半乳糖凝集素-1的N-末端結(jié)構(gòu)域， 一種半 乳糖凝集素-1的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的結(jié)構(gòu)域， 以及一種半乳糖凝集素-1的半乳糖苷結(jié)合區(qū)域。
16. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-7 蛋白包括序列2所示的氨基酸序列。
17. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-7 蛋白包括一種與序列2所示的氨基酸序列在基本上同源的氨 基酸序列。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的基本上同源是指 與序列2所示的氨基酸序列相比，具有至少70%的序列同一 性，至少80%的序列同一性，或者至少90%的序列同一性。
19. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-3 蛋白包括序列1所示的氨基酸序列。
20. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-3 蛋白包括一種與序列1所示的氨基酸序列在基本上同源的氨 基酸序列。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的基本上同源是指 與序列1所示的氨基酸序列相比，具有至少700/。的序列同一 性，至少80%的序列同一性，或者至少90%的序列同一性。
22. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-3 蛋白包括一種半乳糖凝集素-3的半乳糖苷結(jié)合區(qū)域。
23. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-1 包括序列6所示的氨基酸序列。
24. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-1 蛋白包括一種與序列6所示的氨基酸序列在基本上同源的氨 基酸序列。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的基本上同源是指 與序列6所示的氨基酸序列相比，具有至少60%的序列同一 性，至少70%的序列同一性，至少80%的序列同一性，或 者至少90%的序列同一性。
26. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-1 蛋白包括一種半乳糖凝集素_1的半乳糖苷結(jié)合區(qū)域。
27. —種對(duì)干眼癥的治療具有促進(jìn)作用的藥物組合物，所述組合 物包括一種藥物可4妄受載體或者稀釋液，以及一定劑量的至 少一種選自半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝 集素-7和半乳糖凝集素-8的半乳糖凝集素蛋白，所述半 乳糖凝集素的劑量足夠1"足進(jìn)結(jié)膜上皮細(xì)月包和/或角膜上皮細(xì) 月包的完整性。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述的干眼癥是 具有周期性上皮腐蝕的干眼疾病。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中所述的干眼疾病 造成的傷口屬于角膜傷口 。
30. 才艮據(jù)4又利要求28所述的藥物組合物，其中所述的干眼癥是 由受激準(zhǔn)分子激光切削術(shù)引起的。
31. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖凝 集素-8蛋白包4舌序列4或者序列5所示的氨基酸序列。
32. 才艮據(jù)4又利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖;疑 集素-8蛋白包括與序列4或者序列5所示的氨基酸序列在 基本上同源的氨基酸序列。
33. 才艮據(jù)4又利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖凝 集素-8蛋白包括一種半乳糖凝集素-8的N -末端結(jié)構(gòu)域， 和一種半乳糖凝集素-8的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的 結(jié)構(gòu)域。
34. 根據(jù)4又利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖埃是 集素-8蛋白包括一種半乳糖凝集素-8的富含脯氨酸、甘 氨酸和酪氨酸的結(jié)構(gòu)域，和一種半乳糖凝集素-8的半乳4唐 苷結(jié)合區(qū)域。
35. 根據(jù)4又利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖凝 集素-8蛋白包括一種半乳糖凝集素-8的半乳糖苷結(jié)合區(qū) 域。
36. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的藥物組合物，其中所述的基本上同 源是指與序列4或者序列5所示的氨基酸序列相比，具有至 少60%的序列同一性，至少70%的序列同一性，至少80% 的序列同一性，或者至少90%的序列同一性。
37. 根據(jù)一又利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳4唐凝 集素-7蛋白包括序列2所示的氨基酸序列。
38. 才艮據(jù)4又利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖凝一 集素-7蛋白包括與序列2所示的氨基酸序列在基本上同源 的氨基酸序列。
39. 才艮據(jù)一又利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳4唐;疑 集素-7蛋白包括一種半乳糖凝集素-7的半乳糖苷結(jié)合區(qū) 域。
40. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的藥物組合物，其中所述的基本上同 源是指與序列2所示的氨基酸序列相比，具有至少60%的序 列同一'性，至少70%的序列同一'l"生，至少80%的序列同一 性，或者至少90%的序列同一性。
41. 根據(jù)4又利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖埃是 集素-3蛋白包括序列1所示的氨基酸序列。
42. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖凝 集素-3蛋白包括與序列1所示的氨基酸序列在基本上同源 的氨基酸序列。
43. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的藥物組合物，其中所述的基本上同 源是指與序列1所示的氨基酸序列相比，具有至少60%的序 列同一性，至少70%的序列同一性，至少80%的序列同一 性，或者至少90%的序列同一性。
44. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖凝 集素-3蛋白包括一種半乳糖凝集素-3的半乳糖苷結(jié)合區(qū) 域。
45. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖凝 集素_ 3蛋白包括一種半乳糖凝集素-3的N-末端結(jié)構(gòu)域， 和一種半乳4唐凝集素-3的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的 結(jié)構(gòu)域。
46. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖凝 集素-3蛋白包括一種半乳糖凝集素-3的富含脯氨酸、甘 氨酸和酪氨酸的結(jié)構(gòu)域，和一種半乳糖凝集素-3的半乳糖 苦結(jié)合區(qū)域。
47. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖凝 集素-1蛋白包括序列6所示的氨基酸序列。
48. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖凝 集素-1蛋白包括與序列6所示的氨基酸序列在基本上同源 的氨基酸序列。
49. 才艮據(jù)4又利要求48所述的藥物組合物，其中所述的基本上同 源是指與序列6所示的氨基酸序列相比，具有至少60%的序 列同一性，至少700/。的序列同一'l"生，至少80%的序列同一 性，或者至少90%的序列同一性。
50. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖凝 集素-1蛋白包括一種半乳糖凝集素-1的N-末端結(jié)構(gòu)i或， 和一種半乳糖凝集素-1的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的 結(jié)構(gòu)域。
51. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖凝 集素-1蛋白包括一種半乳糖凝集素-1的富含脯氨酸、甘 氨酸和酪氨酸的結(jié)構(gòu)域，和一種半乳糖凝集素-1的半乳#唐 香結(jié)合區(qū)域。
52. 才艮據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述的半乳糖凝 集素-1蛋白包括一種半乳糖凝集素-1的半乳糖苷結(jié)合區(qū)域。
53. —種治療哺乳動(dòng)物干眼疾病的方法，包4舌向該哺乳動(dòng)物施以 治療有效劑量的能夠影響淚膜在角膜表面或者結(jié)膜表面上 的分布的物質(zhì)。
54. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述的物質(zhì)是至少一種 選自半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8的蛋白。
55. —種治療哺乳動(dòng)物干眼疾病的方法，包4舌向患有干眼癥的哺 乳動(dòng)物施以治療有效劑量的物質(zhì)，所述物質(zhì)能夠影響半乳糖 凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖 凝集素-8中的至少一種蛋白的表達(dá)。
56. —種用于治療干眼癥的試劑盒，其包括一種容器盒，溶于一 種藥物可接受載體或者稀釋液中的選自半乳糖凝集素_ 1、 半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8中 的至少一種蛋白，以及^f吏用it明書(shū)。
57. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的試劑盒，其中所述蛋白以單位劑量 形式存在。
全文摘要
本發(fā)明提供一種治療哺乳動(dòng)物干眼癥的方法，包括向患有上皮缺損的哺乳動(dòng)物施以治療有效劑量的半乳糖凝集素-1蛋白、半乳糖凝集素-3蛋白、半乳糖凝集素-7蛋白和/或半乳糖凝集素-8蛋白。本發(fā)明提供了藥物及眼科組合物以及試劑盒，包括藥物活性成分，適當(dāng)?shù)妮d體或者稀釋液，其中藥物活性成分是半乳糖凝集素-1蛋白、半乳糖凝集素-3蛋白、半乳糖凝集素-7蛋白和/或半乳糖凝集素-8蛋白。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101500589SQ200680009189
公開(kāi)日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2006年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月13日
發(fā)明者諾爾加漢·潘吉瓦尼 申請(qǐng)人:塔夫斯大學(xué)