專利名稱：：免疫活性組合物的制作方法免疫活性組合物
背景技術(shù)：
：0001本發(fā)明提供了免疫活性組合物，其能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫或者耐受性。在非感染或感染宿主中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的該組合物包括抗原表位，但排除了或者消除了參與免疫"逃逸"或誘導(dǎo)耐受性的表位。保護(hù)性免疫也可以通過包括病原體相關(guān)分子模式(一種或者多種病原體相關(guān)分子模式)的組合物，和/或有或者沒有抗原表位的載體來誘導(dǎo)。誘導(dǎo)耐受性的另一種免疫活性組合物包括逃逸表位(一種或者多種)，或?qū)Σ≡w逃逸很重要的分子模式(一種或者多種)，有或者沒有載體。此外，本發(fā)明提供了鑒別這樣的免疫活性分子的方法。0002免疫生物學(xué)的進(jìn)展已經(jīng)鑒定了免疫調(diào)節(jié)劑開發(fā)的主要免疫學(xué)因素，包括對誘導(dǎo)控制病原體的先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答的需求。0003隨著普遍的抗生素抗性的出現(xiàn)，免疫調(diào)節(jié)劑成為用于產(chǎn)生針對微生物——包括細(xì)胞內(nèi)病原體的長效保護(hù)的最有效方法。免疫調(diào)節(jié)劑的當(dāng)前問題焦點在于要求開發(fā)新穎的載體(vectors)、有效的運載體(carriers)和佐劑系統(tǒng)。0004由于病原體也能誘導(dǎo)Th2應(yīng)答和耐受性，這一認(rèn)識可用于，自身免疫性疾病、移植和其它醫(yī)學(xué)應(yīng)用的免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)。許多病原體通過皮膚和粘膜進(jìn)入身體。因此這些施用途徑特別適合于，針對通過皮膚、呼吸道、胃腸道或性器官進(jìn)入而感染的免疫調(diào)制。傳統(tǒng)的疫苗通過腸胃外施用，這遠(yuǎn)離感染的實際部位，并且它們的粘膜反應(yīng)是不太明顯的。0005顯然，現(xiàn)在除了Toll樣受體(Toll-likereceptors(TLRs))，還有在先天性免疫應(yīng)答中起著重要作用的其它受體和途徑。識別細(xì)胞內(nèi)微生物的微生物基序的核苷酸-寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-oligomerizationdomain(NOD))蛋白質(zhì)就是這樣的一個實例。Mindin，一種胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，也是針對幾種細(xì)菌表面成分的炎癥反應(yīng)的介質(zhì)。這些研究和其它研究表明，先天性免疫涉及獨立于TLR信號傳導(dǎo)的其它因素，并且表明NFkB或IL-1的產(chǎn)生不足以控制感染。0006在控制感染中涉及的先天性免疫的典型元素是(l)促炎應(yīng)答NFKB介導(dǎo)的，活化許多發(fā)炎因子，過度剌激可以導(dǎo)致休克；(2)陽離子宿主防御肽由細(xì)菌病原體相關(guān)分子豐莫式(bacterialpathogenassociatedmolecularpatterns(PAMPS))所刺激的肽和信號分子的增量產(chǎn)生；(3)吞噬細(xì)胞激活嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)殺死效應(yīng)增加(氧化機(jī)制和非氧化機(jī)制均增強，細(xì)胞因子產(chǎn)生增加)；(4)趨化性吞噬細(xì)胞的內(nèi)皮粘附增加，細(xì)胞遷移至感染位點，血細(xì)胞滲出；(5)細(xì)胞外殺傷機(jī)制補體活化，增加的鐵離子螯合，抗微生物肽的分泌，降解性酶的產(chǎn)生；(6)感染封閉通過纖維蛋白原活化的凝塊形成；(7)創(chuàng)傷修復(fù)成纖維細(xì)胞生長和粘附，血管生成；和(8)獲得性免疫應(yīng)答B(yǎng)-細(xì)胞和T-細(xì)胞活化，通常通過樹突狀細(xì)胞進(jìn)行。0007對先天性免疫的刺激可以通過使用干擾素，單磷酰基-磷脂A，咪喹莫特(imiquimod)，CpG核苷酸或者陽離子肽實現(xiàn)。然而，先天性免疫具有抵擋感染的有限能力，在此種情況下，獲得性免疫應(yīng)答將獲得控制權(quán)。0008近來，已經(jīng)認(rèn)識到樹突狀細(xì)胞對于連接先天性免疫和獲得性免疫是必要的，并且，這一知識使得免疫學(xué)家可以針對差的免疫原性抗原設(shè)計免疫調(diào)節(jié)策略。樹突狀細(xì)胞(Dendriticcells(DC))起源于骨髓譜系和淋巴譜系的前體細(xì)胞，但是，是主要的抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presentingcells(APC))。樹突狀細(xì)胞(DCs)存在于每一種組織中，并且在感染期間，是與入侵病原體接觸的關(guān)鍵免疫細(xì)胞。它們是先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答的橋梁。0009內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它細(xì)胞，包括未成熟的樹突狀細(xì)胞(DCs),表達(dá)病原體模式識別受體(TLR受體，凝集素結(jié)構(gòu)域受體和其它受體)，這些受體結(jié)合保守的病原體相關(guān)分子結(jié)構(gòu)(pathogenassociatedmolecularstructures)(縮寫為PAMPs)，所述結(jié)構(gòu)是由病原體，如來自革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖，來自革蘭氏陽性細(xì)菌的脂磷壁酸(lipoteichoicacid)，肽葡聚糖，肽葡聚糖相關(guān)脂蛋白，細(xì)菌DNA，和來自革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌的鞭毛蛋白，以及病毒RNA共享的結(jié)構(gòu)。不同細(xì)胞表達(dá)允許對病原體產(chǎn)生定制(tailored)反應(yīng)的不同受體。未成熟的抗原捕獲DC，一旦活化，就會分化為成熟的抗原呈遞DC，該抗原呈遞DC能在MHCII類和I類中背景中呈遞抗原，以及上調(diào)表面共刺激分子如CD80和CD86的表達(dá)。0010成熟和活化DC遷移到次級淋巴器官(淋巴結(jié)、脾和丕氏斑(Peyer氏斑，Peyer'spatches)中，在這里它們轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞區(qū)域。DC與T細(xì)胞的相互作用以及T細(xì)胞的刺激依賴于細(xì)胞因子、趨化因子和粘附分子，如細(xì)胞間細(xì)胞粘附分子(intercellularcelladhesionmolecules(I-CAMs))，白細(xì)胞功能相關(guān)分子(leukocytefunctionassociatedmolecule1(LFA-l))和樹突狀細(xì)胞特異性ICAM結(jié)合非整合素因子(dendriticcellspecificICAMgrabbingnonintegrin(DC-SIGN))。0011依賴于局部細(xì)胞因子環(huán)境和抗原，在不同程度上觸發(fā)了輔助性T細(xì)胞(Thl)和體液抗體介導(dǎo)的Th2或Treg定向的免疫應(yīng)答?？乖膭┝恳呀?jīng)表明指導(dǎo)Thl/Th2分化，高劑量優(yōu)先刺激Th-l反應(yīng)，低劑量刺激Th-2反應(yīng)。已經(jīng)表明展示抗原蛋白和DNA疫苗的運載體發(fā)明物由不成熟的樹突狀細(xì)胞吸收，并且導(dǎo)致免疫應(yīng)答。因此，DC代表為免疫系統(tǒng)的調(diào)制而開發(fā)的一個主要的、但不是唯一的靶標(biāo)。0012粘膜DCs，通過胞飲作用和受體介導(dǎo)的胞吞作用，攝取外源入侵者，特別地提供了一個重要的一線防衛(wèi)。DC在粘膜免疫中起著重要的作用，因為身體粘膜就像身體內(nèi)外之間的屏障一樣發(fā)揮作用?？梢栽诤粑篮蛢?nèi)臟的內(nèi)層發(fā)現(xiàn)DC。朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans細(xì)胞)是在皮膚和粘膜中發(fā)現(xiàn)的一個DC群。DCs和M細(xì)胞將抗原轉(zhuǎn)運到下面的淋巴濾泡，這是內(nèi)臟的免疫誘導(dǎo)位點。類似的鼻和支氣管相關(guān)淋巴組織已經(jīng)在呼吸道中描述。該系統(tǒng)在胃腸道中很重要，但在呼吸道中，下面的DC網(wǎng)絡(luò)可能是更重要的。在口服施用的情況下，免疫調(diào)節(jié)劑必須未降解地通過胃和上部腸道(theupperintestines)。通過鼻、眼睛或者生殖器途徑施用，這樣的降解不可能發(fā)生。隨后，免疫調(diào)節(jié)劑必須通過腸道上皮而被攝取，因此可以被吸收，隨后通過抗原呈遞細(xì)胞呈遞到免疫感受態(tài)細(xì)胞。免疫感受態(tài)細(xì)胞位于上皮中、固有層中或者基底膜之下。因此，免疫調(diào)節(jié)劑成分必須配制有運載體，通過該運載體接受這些免疫調(diào)節(jié)劑成分。當(dāng)結(jié)合到微粒運載體上時，通?？梢越邮艿氖?，分子可以通過Peyer氏斑中的M-細(xì)胞轉(zhuǎn)運通過屏障層。0013生物活性分子的成熟前分解或者釋放，已經(jīng)妨礙了顆粒基疫苗和藥物給藥技術(shù)的發(fā)展。這就是，為什么在公開文獻(xiàn)中，仍然要求高劑量的抗原/藥物，以便獲得與注射對等物可相當(dāng)?shù)姆磻?yīng)的最有可能的解釋。除了抗原和藥物的利用不足而外，其它主要的批判是M細(xì)胞在Peyer氏斑(thePeyer'spatches(PP))中運送顆粒的較差能力，和不足的免疫，以及在人體中誘導(dǎo)的其它反應(yīng)。PP的上皮M細(xì)胞已知允許從腸轉(zhuǎn)運某些細(xì)菌、病毒和原生動物。幾項研究已經(jīng)表明，依賴于大小的攝取——最大直徑為l(Him，可以通過M-細(xì)胞、DCs和Caco-2細(xì)胞發(fā)生。0014關(guān)于顆?！ㄟ^M細(xì)胞，以及PPs中、及其附近存在的不同類型樹突狀細(xì)胞(DCs)進(jìn)行攝取——的近期信息，提供了對所涉及機(jī)制的理解。跟隨在面包酵母細(xì)胞(釀酒酵母)進(jìn)入到PP的攝取和動力學(xué)研究之后，是Beyer(BeyerT.等人；作為抗原投遞設(shè)備的細(xì)菌載體和病毒樣顆粒樹突狀細(xì)胞在抗原呈遞中的角色(Bacterialcarriersandvirus-like-particlesasantigendeliverydevices:Roleofdendriticcellsinantigenpresentation),Curr.DrugTargets-Infect.Disord,20011，287-302)，從而認(rèn)為它為經(jīng)過粘膜轉(zhuǎn)運的一種惰性模式。就酵母細(xì)胞在M細(xì)胞中、M細(xì)胞之下的細(xì)胞間袋和基底膜之下的空間中的分布，發(fā)現(xiàn)了與轉(zhuǎn)運到不同類型的吞噬、抗原加工巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞相一致的典型的時間依賴性。依賴于DCs所處的位置，發(fā)現(xiàn)它們一旦激活，就會在產(chǎn)生Thl或Th2-指導(dǎo)的細(xì)胞因子的PP微環(huán)境中，有不同的功能。隨后，細(xì)胞因子和趨化因子微環(huán)境將決定Th細(xì)胞分別分化為Thl和Th2亞類型，并且也影響T細(xì)胞的存活或凋亡。0015而且，B細(xì)胞的分化和粘膜血漿細(xì)胞的歸巢，通過各自的細(xì)胞因子(除了TGF-p、IL-4、IL-5和IL-10之外，還有IL-6)和特異性歸巢受體a4b7調(diào)節(jié)。因此，可以得到這樣的結(jié)論，似乎在粘膜中存在可以利用的機(jī)制，通過該機(jī)制，免疫系統(tǒng)的粘膜調(diào)制可以誘導(dǎo)更加分化的免疫應(yīng)答，從而相對于其它施用途徑獲得的反應(yīng)，可以更好地模仿針對天然感染的反應(yīng)。0016盡管已經(jīng)得到了很多關(guān)于DC、它們的前體和其已經(jīng)提出的多種DC亞型的知識，但是，完全程度的DC功能復(fù)雜性和可塑性，使得很難預(yù)測關(guān)于一種特定疫苗對DCs以及隨后的Thl、Th2和Treg反應(yīng)的作用。然而，從體外成熟DC獲得的一些結(jié)果可能推測為從淋巴器官分離的成熟DC，這是由于它們表現(xiàn)出相似特征(ShortmanK.等人；Mouseandhumandentriticcellsubtypes.Nat.Rev.Immunol.2002Mar2(3):151-61)。例如，己經(jīng)在體外研究了支原體脂肽MALP-2調(diào)制DC反應(yīng)的潛力(WeigtH.等人；Syntheticmycoplasma-derivedlipopeptideMALP-2inducesmaturationandfunctionofdendriticcells,lmmunobiology2003,207(3):223-33)。DC的MALP-2處理誘導(dǎo)CD80、CD86的表達(dá)，和生物活性TNF-a和IL-10的釋放；以及，通過后者，引起自身淋巴細(xì)胞的增殖，和IL-4、IL-5和Y-INF的產(chǎn)生。這些特征與刺激T細(xì)胞的能力有關(guān)，從而提示了MALP-2對DC在體內(nèi)的一種可能作用。0017合成的運載體，可能使抗原對MHCI類和II類呈遞發(fā)揮免疫刺激作用。合成的運載體可以發(fā)展為通用系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以被改制適合于多種潛在應(yīng)用。這些運載體的特征可以顯著地影響免疫應(yīng)答的結(jié)果和效率。合成的運載體，如顆粒，可以減輕疫苗開發(fā)和生產(chǎn)中的質(zhì)量保證和驗證的障礙，從而縮短批準(zhǔn)和上市時間。0018不同感染微生物的幾種免疫刺激成分(肽、蛋白質(zhì)、脂類或多糖)可用于疫苗接種。這些成分可以合成，從微生物純化，或者通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。然而，當(dāng)以自由的、可溶的形式進(jìn)行口服或者腸胃外施用時，它們需要合適的佐劑。0019兒種基于顆粒的系統(tǒng)已經(jīng)作為多種抗原和藥物的載體進(jìn)行了測試。殼聚糖、聚-DL-乳酸或者聚丙烯淀粉微粒，之前己經(jīng)作為藥物載體系統(tǒng)進(jìn)行了描述。美國專利5,603,960和6，521，431描述了這些系統(tǒng)的實例。在一個報道中，發(fā)現(xiàn)共價結(jié)合有人血清清蛋白(humanserumalbumin(HAS))的淀粉微粒，作為模式抗原，當(dāng)被腸胃外使用時，在老鼠中發(fā)揮著強佐劑作用，單獨微粒是不能產(chǎn)生免疫原性的。0020應(yīng)當(dāng)指出，盡管攝取最有可能依賴于載體結(jié)構(gòu)，但也依賴于載體的可能的粘附特性。瓊脂糖和其它多糖具有固有的粘膜粘附特性，這可促進(jìn)它們與不同粘膜的相互作用，并且有助于攝取。發(fā)明概述0021按照本發(fā)明，描述了新穎的組合物，用作一種或多種能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫或耐受性的免疫活性組合物。在非感染或感染宿主中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的該組合物，包括抗原表位，但排除了或者消除了參與免疫"逃逸"或誘導(dǎo)耐受性的表位。保護(hù)性免疫也可以通過組合物來誘導(dǎo)，該組合物包括一個或多個病原體相關(guān)分子模式，和/或帶有或者沒有帶有表位的載體。誘導(dǎo)耐受性的另一種免疫活性組合物包括一個或多個逃逸表位，或?qū)Σ≡w逃逸很重要的一個或多個的分子模式，其帶有或者不帶有載體。此外，本發(fā)明提供了鑒別這樣的免疫活性分子的方法。合適的實例是病原體相關(guān)分子模式(pathogenassociatedmolecularpattern(PAMPs))識別分子，其上附著有或者沒有附著修飾的支原體抗原。這樣的分子組合物似乎在未感染和感染宿主中調(diào)制抗支原體免疫應(yīng)答。一些抗原誘導(dǎo)耐受性或者免疫逃逸。0022因此，本發(fā)明的一個方面是一種誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的免疫活性組合物，該組合物包括(1)至少一種病原體相關(guān)分子模式(pathogenassociatedmolecularpattern)s(2)任選地，至少一種免疫活性抗原或抗原表位；和(3)至少一種對將組合物投遞到生物有效的運載體，從而誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。0023在許多情況下，期望包括至少一種免疫活性抗原或抗原表位。下面進(jìn)一步描述了合適的實例。典型地，該至少一種免疫活性表位缺乏逃逸表位。這對防止可能會導(dǎo)致病原體進(jìn)化的選擇壓力很重要，所述病原體的復(fù)制沒有被免疫應(yīng)答阻斷。對于病原體選擇壓力可能是重要的，這樣的病原體的一個實例是流感病毒，該病毒突變很快，這樣需要為每一個流感季節(jié)準(zhǔn)備一種新的疫苗，以便提供針對可能導(dǎo)致人類疾病的一種或多種特定菌株流感的免疫。選擇壓力可能重要的病原體的另一個實例是人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvims(HIV))，該病毒突變也很快。0024因此，本發(fā)明的另一個方面是一種誘導(dǎo)耐受性的免疫活性組合物，該組合物包括(1)至少一種病原體相關(guān)分子模式；(2)任選地，至少一種免疫活性抗原或抗原表位；和(3)至少一種將組合物有效投遞到生物的載體，從而誘導(dǎo)耐受性。0025典型地，免疫活性抗原表位是肽、蛋白質(zhì)、重組肽或者多肽、重組蛋白質(zhì)、脂、碳水化合物、核酸或其它生物活性分子，或它們中任意的組合。典型地，如果免疫活性抗原表位是肽或蛋白質(zhì)，那么肽或蛋白質(zhì)具有免疫調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)制。典型地，轉(zhuǎn)錄后調(diào)制涉及碳水化合物和/或脂部分。典型地，轉(zhuǎn)錄后調(diào)制(posttranslationalmodulation)含有末端甘露糖化；在這一可選方案中，典型地，免疫調(diào)節(jié)的末端甘露糖化物質(zhì)是從免疫保護(hù)性組合物被貧化的。這可以通過氧化步驟、通過酶處理、或者通過糖特異性親和結(jié)合，進(jìn)行減少。可選地，轉(zhuǎn)錄后調(diào)制涉及脂部分，脂部分通過脫脂去除。0026典型地，免疫活性抗原表位是肽或蛋白質(zhì)，免疫活性肽或者蛋白質(zhì)沒有免疫調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄后修飾。而且，典型地，免疫活性肽或蛋白質(zhì)沒有能夠進(jìn)行N-糖基化和/或硫辛?；?lipoylation)的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的備選方案中，免疫活性抗原表位是肽或蛋白質(zhì)，免疫活性蛋白質(zhì)或肽具有能結(jié)合細(xì)胞表面糖胺聚糖(glycosaminoglycan(GAGs))的氨基酸序列。典型地，這些氨基酸序列本質(zhì)上是多堿基的，其通式是XBBXBX、XBBBXXBX、BBXXBBBXXBB、BBBXXB、BXBXB、BBB、BXBXXXBXB或BXBXXXXXBXB，其中B是堿性氨基酸，X是任何其它氨基酸。典型地，GAG結(jié)合氨基酸序列用于產(chǎn)生肽或蛋白質(zhì)的抗體，這些抗體能干預(yù)病原體結(jié)合到細(xì)胞表面。GAG可以選自肝素及其類似物。免疫活性抗原肽或蛋白質(zhì)，單獨地或者與抗體一起，可具有補體激活活性。免疫活性表位可以是眾多的肽，這些肽能結(jié)合成一個單一的多肽。免疫活性抗原表位可以包括T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。0027典型地，病原體相關(guān)分子模式選自(1)TLRl受體激動劑；(2)TLR2受體激動劑；(3)TLR3受體激動劑；(4)TLR4受體激動劑；C5)TLR5受體激動劑；C6)TLR6受體激動劑；(7)TLR7受體激動劑；(8)TLR8受體激動劑；(9)TLR9受體激動劑；(10)NOD-l激動劑；(11)NOD-2激動劑；(12)DC-SIGN;(13)L-SIGN;和(14)甘露糖受體。0028當(dāng)病原體相關(guān)分子模式是NOD-l激動劑或者NOD-2激動劑時，NOD-l激動劑或者NOD-2激動劑可選自細(xì)菌肽葡聚糖及細(xì)菌肽葡聚糖的衍生物。0029本發(fā)明的另一個方面是一種鑒別免疫活性肽的方法，該免疫活性肽能千預(yù)結(jié)合病原體的糖胺聚糖，所述方法包括步驟(1)進(jìn)行肝素吸附；(2)進(jìn)行免疫親和選擇；和(3)任選地，進(jìn)行一種或多種通過免疫親和選擇分離的蛋白質(zhì)的蛋白水解消化，以產(chǎn)生免疫活性肽。免疫親和選擇能通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的方法進(jìn)行，例如在G.T.Hermanson等人，"ImmobilizedAffinityLigandTechniques"(AcademicPress,Inc.,SanDiego,1992)中描述的方法；其它方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
也是己知的。0030本發(fā)明的另一個方面仍然是一種鑒別免疫活性肽的方法，該免疫活性肽能干預(yù)結(jié)合病原體的糖胺聚糖，包括利用多堿價線性基序，使用生物信息學(xué)分析方法，分析序列數(shù)據(jù)。0031本發(fā)明的另一個方面仍然是一種鑒別補體活化免疫活性肽的方法，該方法包括如下步驟(1)進(jìn)行補體固定抗體與補體蛋白質(zhì)的結(jié)合；(2)使用用于蛋白質(zhì)抗原的免疫親和選擇的抗體；和(3)任選地，進(jìn)行分離的蛋白質(zhì)抗原的蛋白水解消化。0032通過這些方法產(chǎn)生的免疫活性肽也是本發(fā)明的側(cè)面。另外，保護(hù)性抗體可以基于用于解決宿主微生物中疾病的已鑒別的免疫活性肽。0033在上面描述的組合物中，分子可以以混合物出現(xiàn)。此外，分子可以化學(xué)連接在一起。典型地，載體是微粒。優(yōu)選地，微粒有窄的粒徑分布范圍，并且是多孔的。典型地，微粒的直徑小于大約lOpm;更特別地，微粒的直徑小于大約5pm。典型地，微粒是用生物聚合物制成的。在一個可選的方案中，免疫活性抗原表位非共價結(jié)合到微粒上。在另一個可選的方案中，免疫活性抗原表位共價結(jié)合到微粒上。不止一種免疫活性抗原表位和不止一種模式識別受體激動劑可以與微粒相關(guān)。不止一種模式識別受體激動劑可以與微粒相關(guān)聯(lián)結(jié)合。0034本發(fā)明的另一個方面是一種在對象中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括的步驟有施用免疫學(xué)活性有效量的組合物，該組合物包括至少一種免疫活性抗原表位，和至少一種與微粒相關(guān)聯(lián)的病原體識別(pathogenrecogniztion(PR))受體激動劑，其中微粒比病原體小或者與病原體的大小范圍相同。該組合物包括不止一種的病原體識別受體激動劑。0035本發(fā)明的另一個方面仍然是一種體內(nèi)投遞免疫活性組合物的方法，以便在個體中引發(fā)免疫應(yīng)答，該方法包括的步驟有，施用免疫學(xué)活性有效量的組合物，該組合物包括至少一種與微粒相關(guān)的病原體識別(PR)受體激動劑，其中微粒比病原體小，或者與病原體的大小范圍相同。0036本發(fā)明的另一個方面仍然是一種體內(nèi)投遞免疫活性組合物的方法，以便在對象中引發(fā)免疫應(yīng)答，該方法包括的步驟有，施用免疫活性有效量的組合物，該組合物包括至少一種免疫活性抗原表位，和至少一種與微粒相關(guān)的病原體識別(PR)受體激動劑，其中微粒比病原體小，或者與病原體的大小范圍一樣。0037本發(fā)明的另一個方面是一種引發(fā)針對至少一種病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，該方法包括的步驟有，以單劑量或多劑量，施用免疫活性有效量的組合物，該組合物包括一種或多種免疫活性抗原表位，和與微粒相結(jié)合的復(fù)數(shù)個的PR受體激動劑的組合，其中所述微粒比病原體小，或者與病原體的大小范圍相同，并且免疫應(yīng)答包括Thl或Th2反應(yīng)，或者Thl和Th2反應(yīng)的組合。0038本發(fā)明的另一個方面仍然是一種引發(fā)針對至少一種病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，該方法包括的步驟有，以單劑量或多劑量，施用免疫活性有效量的組合物，該組合物包括有一種或多種免疫活抗原表位，排除了參與免疫活性逃逸機(jī)制的抗原，以及包括有與微粒相結(jié)合的PR受體激動劑的組合，其中所述微粒比病原體小，或者與病原體的大小范圍相同。0039在根據(jù)本發(fā)明的施用或者投遞方法中，組合物的施用可以通過粘膜途徑、腸胃外途徑或皮膚途徑發(fā)生。也可以選擇其它施用途徑。0040在根據(jù)本發(fā)明的誘導(dǎo)免疫性的方法中，典型地，免疫應(yīng)答干預(yù)致病微生物上的糖胺聚糖結(jié)合元件(glycosaminoglycanbindingelements)。0041可以選擇地，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以在誘導(dǎo)免疫耐受性的方法中使用。一種引發(fā)針對免疫活性試劑的耐受性的方法包括有如此步驟施用免疫活性有效量的組合物，該組合物包括一種或多種免疫活性抗原表位，和與微粒相關(guān)的PRR激動劑的組合，其中微粒比病原體小，或者與病原體的大小范圍相同，免疫應(yīng)答包括調(diào)節(jié)性反應(yīng)的誘發(fā)，或免疫功能或免疫逃逸的下調(diào)。其中，該組合物可以包括具有含脂部分的免疫活性抗原表位。免疫活性的含脂部分可以附著到微粒，獨立于免疫活性抗原表位。免疫活性的含脂部分可以具有碳水化合物組分；碳水化合物組分可以是N-糖基化的結(jié)果。免疫活性抗原表位可以包括含有至少一個氨基酸的基序，該氨基酸選自天冬酰胺、蘇氨酸和絲氨酸，其中基序是Asp-X-Ser或Asp-X-Thr基序，其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。附圖簡述0042參考說明書、所附權(quán)利要求和附圖，本發(fā)明將更加易于理解，其中圖1是圖表，顯示了適合在根據(jù)本發(fā)明的微粒載體組合物中使用的瓊脂糖微粒的粒徑分布(實施例1);圖2是圖表，顯示了TNF-ot通過PBMC(A)的分泌，或者組織因子(B)用如下物質(zhì)處理后的分泌，肽葡聚糖(PepG)處理(白條)，或者細(xì)菌CpGDNA(細(xì)菌DNA)處理(黑條)，或者兩者同時處理、且使用與它們單獨加入時相同的濃度(陰影條)；P和D后面的數(shù)字分別表示PepG和細(xì)菌DNA(bactDNA)的濃度，單位為^tg/ml;從左到右，它們是P3+D15，P3+D5,P3+D1.5,Pl+D15，P1+D5,P1+D1.5，P0.3+D15,P0.3+D5和P0.3+DL5。圖3是圖表，顯示了通過不同方法制備的顆粒對不同Thl和Th2反應(yīng)的誘導(dǎo)，使用ConA-剝離或高碘酸鈉處理的抗原，以及TLR2、TLR3、TLR4禾卩TLR9激動劑的多種組合(灰條，TNF-aX100，黑條，IL-10);圖4是圖表，顯示了如圖3那樣的用不同方式制備的顆粒處理的單核細(xì)胞的TNF-a/IL-10比率；禾口圖5是圖表，顯示了暴露給微粒制劑后，樹突狀細(xì)胞中MHC-II和CD86的誘導(dǎo)。優(yōu)選實施方案的描述0043本發(fā)明描述了免疫活性組合物，將分子靶向某些細(xì)胞群并且在動物模型中引發(fā)反應(yīng)的方法，和產(chǎn)生目標(biāo)組合物的方法。0044存在產(chǎn)生更有效的免疫調(diào)節(jié)試劑和投遞運載工具的需求，用于大量的疾病或狀況，以及用于保護(hù)免受當(dāng)前疫苗對其不能使用或無效的病原體的破壞。0045使用減毒、死傷或遺傳修飾病原體的傳統(tǒng)疫苗局限于，病原體的分子模式和與免疫系統(tǒng)的病原體識別受體(PathogenRecognitionReceptors(PRR))的相互作用決定的免疫應(yīng)答。能建立慢性感染的成功病原體具有分子模式，該分子模式可以使病原體避開身體的免疫應(yīng)答，而其它病原體，如流感病毒，使用導(dǎo)致逃逸的突變(抗原性漂移和抗原性連續(xù)變異)時，如抗體的產(chǎn)生，抗體產(chǎn)生導(dǎo)致增加的病毒攝取以維持自身。0046通常，病原體-特異性抗體，在感染的控制中，以多種方式發(fā)揮著重要作用。然而，在某些情況下，特異性抗體的存在對病原體是有益的。該活性已知為感染的抗體依賴的增強作用(antibody-dependentenhancement(ADE))。感染的ADE是這樣一種現(xiàn)象，其中病原體特異性抗體增強病原體的進(jìn)入；并且，在某些情況下，病原體，如病毒，通過與Fc受體的相互作用，復(fù)制到單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞中。已經(jīng)針對代表無數(shù)的、具有公共和牲畜健康重要性的科和屬的病原體，對該現(xiàn)象進(jìn)行了體外和體內(nèi)報導(dǎo)。這些病原體，如雞毒支原體(Mga/fc印&wm)，具有一些共同的特征，如在巨噬細(xì)胞中的優(yōu)先復(fù)制，建立持續(xù)性的能力，和抗原性的多樣性。0047對于某些病原體，感染的ADE己經(jīng)成為通過接種疫苗進(jìn)行疾病控制的重大關(guān)注點。從而，對于開發(fā)對ADE風(fēng)險很小或者無風(fēng)險的疫苗，已經(jīng)有多種途徑。與ADE相關(guān)的病原體表位的鑒別，或者中和作用，對這一目的是非常重要。此外，清楚的理解病原體通過ADE進(jìn)入后的細(xì)胞內(nèi)事件，對發(fā)展有效干預(yù)很重要。然而，ADE的機(jī)制仍然需要更好的理解。因此，針對這些病原體的有效疫苗很難開發(fā)。所以，我們己經(jīng)鑒定了通過干預(yù)重要的細(xì)胞附著機(jī)制而對保護(hù)性免疫而言具有重要性的基序，和需要從制劑中排除的基序，以便誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，而沒有逃逸。我們也鑒別了誘導(dǎo)逃逸或者耐受性的基序。0048我們已經(jīng)研究了通過載體將免疫活性分子靶向某些細(xì)胞的可能性，該載體包括多糖，如天然瓊脂糖，從而獲得先天性和獲得性免疫應(yīng)答的免疫調(diào)制，保護(hù)免受感染。顯然，本發(fā)明可以在其它應(yīng)用中使用，其中其它受體也可以使用其它顆粒來靶向。瓊脂糖的優(yōu)勢在于，它是天然多糖，可生物降解的D-半乳糖聚合物，證明與哺乳動物細(xì)胞具有相容性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，腸胃外施用的瓊脂糖微顆粒表現(xiàn)出弱巨噬細(xì)胞活化能力，和與氫氧化鋁可比的佐劑特性(GronlundH.等人，Carbohydrate-basedparticles:anewadjuvantforallergen-specificimmunotherapy.Immunology2002107,523-529)。0049從最終使用者的角度而言，重要的是，疫苗生產(chǎn)不要求冷凍存儲，仍然可以有很長的保存期。瓊脂糖顆?？梢詽M足這些要求。而且，重要的是，疫苗或者藥物投遞載體的施用要盡可能的簡單。這就是為什么不用針、通過粘膜、尤其是可口服施用的組合物，比腸胃外更有優(yōu)勢。然而，由于消化系統(tǒng)的作用，口服應(yīng)用已經(jīng)遇到穩(wěn)定性問題的困擾。0050我們已經(jīng)確定，偶合到多孔瓊脂糖基質(zhì)上的抗原可以受到保護(hù)，不受消化道內(nèi)部的降解的影響。配體和顆粒之間的連接確保，同一抗原加工細(xì)胞吸收佐劑和抗原。而且，瓊脂糖微顆粒(<5>im)的大小使它們適合于允許顆粒進(jìn)入到Peyer氏斑(PPs)中。0051未甲基化CpGDNA，聚I:C，或MALP-2作為佐劑的效果提示病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)基序，如果與抗原共同固定化，將通過表達(dá)適當(dāng)?shù)腜AMP受體的不同APCs，將免疫活性組合物的攝取定向到粘膜表面上。0052多種DC亞型和其它免疫感受態(tài)細(xì)胞有不同的模式識別受體。使用配體的組合，能實現(xiàn)細(xì)胞的適當(dāng)亞型的定向。0053因此，我們認(rèn)為受體激動劑(PAMP受體)分子，如Toll樣受體(TLR)，凝集素受體或NOD受體激動劑，應(yīng)該與生物活性分子一起共同固定到載體上。我們認(rèn)為，當(dāng)免疫系統(tǒng)暴露給設(shè)計的"合成微生物"時，可以提高附著特性、免疫活性組合物的靶向和攝取，這可能顯著地增強定向攝取，可以實現(xiàn)這樣的免疫調(diào)節(jié)劑和定制免疫應(yīng)答的效率。定制靶向也可以提高藥物動力學(xué)，降低這樣設(shè)計的免疫調(diào)節(jié)劑的潛在副作用。0054Toll樣受體(TLRs)和NOD、凝集素受體等，是微生物來源的分子的病原體模式識別受體。它們是先天性和獲得性免疫系統(tǒng)的主要傳感器。當(dāng)前已識別了10個TLR(TLR1-10)。每個識別一種或多種特異性配體，且進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在通過細(xì)菌產(chǎn)物的細(xì)胞活化中，有規(guī)律地發(fā)現(xiàn)涉及最新發(fā)現(xiàn)的受體和受體相互作用。這些受體之間的協(xié)作開始發(fā)揮作用，以改進(jìn)配體區(qū)別和反應(yīng)的特異性，該證據(jù)正在增加。在配體結(jié)合之后，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)受體在脂卵筏中成簇。這樣的研究也透露出，獨立于和依賴于骨髓分化主要反應(yīng)基因88(MyD88)的途徑。0055每個TLR是1型跨膜受體，該受體有富含亮氨酸的胞外結(jié)構(gòu)域，和含有稱作Toll/IL-lR同源(TIR)結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)域的胞內(nèi)部分，該受體一旦激活，就會導(dǎo)致，在信號傳導(dǎo)的依賴于MyD88形式中，補充MyD88蛋白質(zhì)。使用TLRs、NOD-l和NOD-2的富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域，一些微生物病原體也可以被內(nèi)吞，并且直接在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮它們的活性，通常是這樣，例如，在細(xì)胞內(nèi)革蘭氏陽性細(xì)菌肽葡聚糖感應(yīng)中。然而，這些多種途徑似乎朝著NF-K|3的核轉(zhuǎn)運和炎癥基因的活化，和不同細(xì)胞因子的產(chǎn)生方向趨同。TLRs7、8和9的連接導(dǎo)致IFN-a和IL-12p70，從而用交叉呈遞/CTL引發(fā)了強Thl反應(yīng)。TLR3的活化導(dǎo)致INF-a和Thl反應(yīng)，而TLR5通過IL-12p70誘導(dǎo)Thl,TLR4通過IL-12p70和INF-a產(chǎn)生誘導(dǎo)Thll，所有這些都導(dǎo)致交叉呈遞/CTL。然而TLRsl、2和6的連接誘導(dǎo)具有高IL-10水平的弱IL-12p70反應(yīng)，和一些其它PRR(病原體識別受體)，如DC-SIGN導(dǎo)致ThO/Th2/Treg反應(yīng)。0056TLR-4已經(jīng)是該受體家族中的被最廣泛研究者。已知從革蘭氏陰性細(xì)菌識別脂多糖，從革蘭氏陽性細(xì)菌識別脂磷壁酸，盡管TLR-2結(jié)合細(xì)菌脂蛋白/脂肽、分枝桿菌或者支原體成分。0057Lps2突變，在TLR-3和不依賴于TLR-4MyD88的途徑中，鑒別出TIR抗性接頭蛋白(TIRresistanceadaptorprotein(TIRAP))的作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TIRAP是處于TLR-2和TLR-4下游的另一種細(xì)胞內(nèi)參與者。不依賴于MyD88的途徑，也顯示出涉入調(diào)節(jié)DC的LPS介導(dǎo)成熟過程。TLR-1和TLR-6，已知作為與TLR-2受體形成的異質(zhì)二聚體的另一部分而發(fā)揮作用。0058TLR-3識別雙鏈病毒RNA。TLR-5被鑒別為是從革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌來源的細(xì)菌鞭毛蛋白的受體，通過MyD88發(fā)出信號。TLR-7響應(yīng)單鏈RNA和小的合成的免疫修飾物，如咪喹莫特、R-848、溴匹立明(bropirimine)和洛索立賓(loxoribine)。TLR-9已知檢測未甲基化的細(xì)菌DNA。當(dāng)前正在研究CpGDNA寡核苷酸作為佐劑并且刺激用于疫苗開發(fā)的人樹突狀細(xì)胞的能力。0059TLR-4、TLR-7和TLR-9在疫苗開發(fā)方面是特別重要的。人TLR-8被最新鑒別為單鏈RNA和雷西莫特(resiquimod(R-848))的受體。最近己經(jīng)提議，將TLR-7、TLR8和TLR-9看做TLR受體家族中的亞組，原因在于它們的配體在內(nèi)體/溶酶體(lysosomal)區(qū)室中被識別。0060C型(鈣依賴型)凝集素受體(CLRs)也被表達(dá)，它們結(jié)合到通常在病毒、細(xì)菌和其它病原體的表面糖蛋白上發(fā)現(xiàn)的保守寡糖上。通過DCs表達(dá)的CLRs包括甘露糖受體(CD206)、DEC-205(CD205)、Langerin(CD207)和DC特異性細(xì)胞間粘附分子3-結(jié)合非整合素因子(DC-SIGN;CD209)。這些受體不僅在DCs和其它組織的多種亞型上的表達(dá)不同，而且它們也識別不同寡糖，從而區(qū)別不同的配體。0061DC-SIGN是一種44kDa的II型跨膜蛋白，其結(jié)合且內(nèi)化幾種病毒，如HIV、伊包拉病毒(Ebola病毒)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、登革病毒(Dengue病毒)、肝炎C病毒，以及細(xì)菌，如分枝桿菌，雖然也涉及其它受體。其它病原體也可以與DC-SIGN相互作用。它在DC的功能中非常重要，在通過ICAM-3介導(dǎo)天然T細(xì)胞相互作用中，和作為滾動受體中，介導(dǎo)DC特異性的依賴于ICAM-2的遷移過程。0062已經(jīng)描述了TLR和其它免疫識別受體之間的協(xié)作。其實例是由凝集素-1(dectin-l)和TLR2的協(xié)作確定的炎癥反應(yīng)。復(fù)合顆粒，如酵母細(xì)胞壁，通過多個先天性免疫受體而被識別，包括TLR2-TLR6、凝集素-1(dectin-l)和CD14。TLR2-TLR6雜二聚體激活NF-kB,以及趨化因子和細(xì)胞因子如TNF-a的產(chǎn)生。凝集素-l(dectin-l)識別細(xì)胞壁中的a-葡聚糖，并且觸發(fā)吞噬作用，以及通過NADPH-氧化酶激活活性氧產(chǎn)生。此外，凝集素-1(dectin-l)信號傳導(dǎo)與TLR2-TLR6信號傳導(dǎo)結(jié)合起來，以增強特異性細(xì)胞因子如IL-12的產(chǎn)生。0063由于TLR受體之間的協(xié)作，結(jié)合其它受體，和胞內(nèi)分子下游機(jī)制之間的相互作用，在微生物病原體化合物如脂磷壁酸、CpGDNA和肽葡聚糖之間觀察到協(xié)同作用一點都不奇怪，這提示當(dāng)在免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)中組合使用時，TLR活化劑作為佐劑的作用可能被擴(kuò)大。0064適當(dāng)?shù)腜RR(pathogenrecognizationreceptors(病原體識別受體))酉己體與生物活性分子的共固定化可能允許免疫應(yīng)答的定向調(diào)制，導(dǎo)致強細(xì)胞反應(yīng)(在相對強大的Thl影響下)和/或體液反應(yīng)(在Th2影響下)?？蛇x地，當(dāng)用不同的組合物固定化時，可以獲得免疫耐受性。0065甚至在存在已建立的體液免疫或耐受性的情況下，誘導(dǎo)強的細(xì)胞反應(yīng)是可能的。這樣，我們可以預(yù)期開發(fā)出在非感染和感染宿主中都有效的免疫調(diào)節(jié)劑。這樣的結(jié)果將極大地增強疫苗接種的實用性。0066我們已經(jīng)在小雞模型系統(tǒng)中建立了，當(dāng)動物在支原體侵犯之前被接種疫苗時，可達(dá)到針對雞毒支原體(Myco;j/a訓(xùn)ag"〃/呵W/cw"！)的感染性菌株的一個顯著程度的保護(hù)。此外，也可以在感染前的動物中觀察到特異性病理癥狀的逆轉(zhuǎn)，這表明這樣的疫苗對于處理受感染畜群是有效的。由于各種微生物菌株的廣泛抗生素抗性，以及逐漸增加著的公眾和管理制度對于允許在農(nóng)場動物中使用抗生素預(yù)防劑的關(guān)注，這個效應(yīng)是有顯著意義的。另外，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，相對于使用已經(jīng)整合了抗原的微粒的文獻(xiàn)(Brayden，D.2001EuropeanJournalofPharmaceuticalSciences14:183-189)中描述的超過100昭，用該方法誘發(fā)保護(hù)性反應(yīng)，每只動物僅僅需要少量的抗原(lOpg)。這建議了，免疫調(diào)節(jié)劑分子盡管穿過了動物的內(nèi)臟，但仍然沒有被降解，并且它被以有效方式釋放到靶粘膜免疫細(xì)胞中。這是對現(xiàn)有的免疫活性組合物的顯著改進(jìn)。0067然而，隨著抗原劑量的逐歩升高，觀察到保護(hù)性作用的降低，這表明在免疫親和純化抗原中存在有免疫抑制成分。DC-SIGN已經(jīng)牽扯在病原體的逃逸機(jī)制中。DC-SIGN是C型凝集素，對含高甘露糖的脂分子有特異性。支原體膜包括高比例的脂類，不同的支原體已經(jīng)顯示出結(jié)合到伴力豆球蛋白A親和樹脂上，這表明在支原體表面上存在甘露糖。我們假定，參與免疫逃逸的分子，包括轉(zhuǎn)錄后N-糖基化分子，其包括在含有末端甘露糖部分的純化蛋白上的轉(zhuǎn)錄后脂甘露聚糖修飾，可以介導(dǎo)該作用。隨后嘗試了通過酶消化或者化學(xué)分解去除末端甘露糖。此外，末端甘露糖基化脂蛋白，在甘露糖特異性的固定化凝集素-伴力球蛋白A(ConA)柱上，被吸附出來。0068ConA柱保留了大約三分之一的純化抗原組分，并且用該抗原制備的疫苗表現(xiàn)出最高的保護(hù)效果，以及隨著抗原濃度的增加，表現(xiàn)出線性的劑量-反應(yīng)。另一方面，從ConA柱回收的抗原在動物中引起炎癥反應(yīng)的抑制，而在它們的內(nèi)部器官中發(fā)現(xiàn)了非常高水平的病原體。似乎雞毒支原體(Mgfl///w;^/CWm)的這些甘露糖化組分正在參與該病原體的逃逸機(jī)制，從而導(dǎo)致免疫抑制和針對病原體的耐受性的發(fā)展。我們也闡述了，適當(dāng)?shù)目乖卣饔兄趯⒚庖邞?yīng)答變?yōu)楸Ｗo(hù)性或者耐受性。這證實了我們的假設(shè)，也支持了用固定化支原體膜進(jìn)行的觀察，即脂甘露聚糖轉(zhuǎn)錄后修飾可能在宿主中誘導(dǎo)病原體耐受性。這一理解現(xiàn)在可用于制備免疫調(diào)節(jié)的微粒，賦予其潛在地誘導(dǎo)耐受性或者抑制已有免疫應(yīng)答的特性。抗原的胎轉(zhuǎn)錄后修飾在發(fā)展針對病原體的耐受性中發(fā)揮了作用。因此，我們也嘗試純化抗原的脫酰作用，被證明足具有效果的，從而確認(rèn)了脂類在支原體的病理機(jī)理中的/S色。0069這些實驗得到的主要結(jié)論是，盡管合并到這些氨基酸基序中的配體可用于誘導(dǎo)耐受性，但如果想獲得保護(hù)性免疫，天然蛋白質(zhì)的分析得到的表位疫苗不應(yīng)該含有氨基酸中富含的表位，其能經(jīng)受糖基化和/或硫辛?；?lipoylation)(Asn,Thr,Ser)。這為根據(jù)本發(fā)明的組合物和方法提供了多個用途。0070在隨后的研究中，我們已經(jīng)使用了來自已經(jīng)接種疫苗、受到保護(hù)的動物的血液和血清，以便鑒別對于保護(hù)性負(fù)責(zé)的抗原表位。這樣，我們已經(jīng)集中精力開發(fā)基于表位的疫苗的科學(xué)依據(jù)，大規(guī)模產(chǎn)生支原體，又及抗原蛋白的純化對于許多應(yīng)用是成本太高的。在之前的研究中，我們已經(jīng)表明，多種支原體能用于結(jié)合肝素和肝素類似物(Szathmary,S.等人Bindingofmycoplasmastosolidphaseadsorbents.ActaVetHung2005,53(3):299-307)。糖胺聚糖(Glycosaminoglycans(GAGs))在哺乳動物細(xì)胞的表面上表達(dá)，病原體的表面上存在的糖胺聚糖結(jié)合蛋白介導(dǎo)對靶細(xì)胞的粘附(WadstromT,LjunghA:Glycosaminoglycan-bindingmicrobialproteinsintissueadhesionandinvasion:keyeventsinmicrobialpathogenicity.JMedMicrobiol1999，48(3):223-233)。已經(jīng)報導(dǎo)了幾種類型的共有序列，其特征在于區(qū)域中主要為堿性氨基酸XBBXBX、XBBBXXBX、BBXXBBBXXBB、BBBXXB、BXBXB、BBB、BXBXXXBXB或BXBXXXXXBXB，其中B是堿性氨基酸，X是任何其它氨基酸?？紤]這一點的另一種方式是，病原性的機(jī)制中涉及線性堿性基序。這些序列對附著可能是必要的，附著作為病原體通過粘膜進(jìn)入機(jī)制中的初始步驟。因此，該能力的中和作用可以保護(hù)其免受感染，并且可能允許開發(fā)針對多種病原體微生物的廣譜治療方法。這種可能性以前沒有認(rèn)可為疫苗開發(fā)的基礎(chǔ)。我們認(rèn)定臨近或者在空間上接近GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原表位可以被中和，并且我們提出了這樣的結(jié)合位點能結(jié)合到中和表位中的可能性。0071因此，我們使用親和層析法，在肝素Actigel樹脂上，繼續(xù)從雞毒支原體(M.gflf/^epricw/M)中，分離月干素結(jié)合蛋白(SterogeneBioseparations,Inc.,Carlsbad,CA)。隨后，我們已經(jīng)，從接種過針對雞毒支原體的疫苗的小雞身上獲得的中和血漿中，純化出IgG。純化的IgG被固定到活化樹脂ActigelALD(SterogeneBioseparations，Inc.，Carlsbad,CA)上，分離的肝素結(jié)合蛋白被吸附到柱上。結(jié)合蛋白通過在柱上加入胰蛋白酶來消化，含有免疫原性表位的肽片段，包括肝素結(jié)合序列，被洗脫，用MALDI-MS分析，以便得到序列信息。使用這樣的抗原表位或者針對這樣的表位的單克隆抗體純化的IgGs，當(dāng)體內(nèi)施用時，也可以為感染宿主賦予保護(hù)性免疫?？蛇x地，可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
己知的其它蛋白水解酶，如胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、V-8蛋白酶、胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶，來代替胰蛋白酶。0072在平行實驗中，我們己經(jīng)將分離的肝素結(jié)合蛋白重新吸附到肝素Actigel上，并且進(jìn)行結(jié)合蛋白的類似的胰蛋白酶消化。也通過用于序列信息的MALDI-MS分析從樹脂回收的片段。0073鑒別參與調(diào)理-吞噬作用(opso-phagocytosis)的表位也很重要，其使用了補體系統(tǒng)。特別地，從固定化Clq柱上已接種疫苗的小雞血清中純化補體固定抗體，這樣的抗體用于鑒別能誘導(dǎo)這樣的反應(yīng)的表位。隨后固定化純化的IgG，且用于從粗MG溶解產(chǎn)物捕獲蛋白質(zhì)抗原。而在柱子上，用蛋白酶消化結(jié)合的蛋白，洗脫且用MALDI-MS分析表位序列，以便獲得序列信息。使用這樣的抗原表位純化的IgGs，或者針對這樣的表位的單克隆抗體，當(dāng)被體內(nèi)施用時，也能給感染宿主賦予保護(hù)性免疫。0074當(dāng)前一些基于微生物的疫苗的一個主要問題是，共同施用免疫刺激和免疫抑制表位，以及與病原體自身上存在的PRR激動劑的混合物一起，這些之中的一些誘導(dǎo)Thl，一些誘導(dǎo)Th2或者Treg反應(yīng)。這些疫苗不會克服宿主中多種感染劑的持續(xù)性，并且在缺乏臨床疾病的情況下，可以將宿主變?yōu)?病原體工廠"。該方法甚至給病原體施加了選擇壓力，可以導(dǎo)致更多毒力菌株的發(fā)展。相反，我們的策略是產(chǎn)生人工"病原體模仿"微粒，其僅僅含有免疫刺激表位，而將參與來自免疫系統(tǒng)的病原體逃逸的表位和/或PRR激動劑、以及合適的指導(dǎo)免疫應(yīng)答的PRR激動劑分子排除在外。已鑒定表位也可以結(jié)合成為單一多肽，在特定抗原表位肽之間存在剪接序列或接頭。通過該方法，克服了持久病原體產(chǎn)生的扭曲型免疫應(yīng)答，發(fā)展了細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的平衡混合，這導(dǎo)致感染劑的根除。當(dāng)需要克服不期望的自身免疫性應(yīng)答時，該逃逸表位或PRR激動劑可用于開發(fā)耐受性。0075典型地，生物活性分子是免疫系統(tǒng)產(chǎn)生活性的分子，如免疫原或調(diào)制免疫功能的其它分子，如免疫刺激劑、免疫抑制劑、或誘導(dǎo)免疫耐受性的試劑。0076生物活性分子可以非共價或共價結(jié)合到微粒上。共價結(jié)合的方法在本領(lǐng)域是已知的，并且已經(jīng)描述，例如在P.Tijssen的"PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays"(Elsevier,Amsterdam,1985，pp.283-289)，S.S.Wong的ChemistryofProteinConjugationandCrosslinking"(CRCPress，BocaRaton,Florida,1993)，在T.E.Creighton編著白勺"ProteinFunction:APracticalApproach"(IRLPress，Oxford,1989),禾口在GT.Hermanson的"BioconjugateTechniques"(AcademicPress,SanDiego，1996)中，所有這些被引入本發(fā)明，作為參考。典型地，當(dāng)微粒是瓊脂糖時，生物活性分子附著到瓊脂糖的羥基上。通常，多糖的羥基殘基可以由某些化合物通過形成中間反應(yīng)衍生物而活化，所述衍生物含有用于隨后的親核置換的離去基團(tuán)。這些活化羥基與親核試劑如胺(例如蛋白質(zhì)或者肽中的賴氨酸基團(tuán))的反應(yīng)導(dǎo)致穩(wěn)定的共價健，其將生物活性分子交聯(lián)到瓊脂糖上。合適的試劑包括羰基二咪唑、氯甲酸酯衍生物、三氟乙垸磺酰氯、甲苯磺酰氯、溴化氰、二乙烯基砜、三聚氯氰和雙環(huán)氧化物?？梢赃x擇地，碳水化合物如瓊脂糖的羥基可以用氯乙酸修飾，以便產(chǎn)生羧酸酯功能基團(tuán)。作為另一個備選方案，可以在多糖上產(chǎn)生胺功能基團(tuán)；碳水化合物分子或產(chǎn)生的乙醛的還原末端可以與低鏈長度(即典型地，鏈上的碳原子小于大約6個)的二胺化合物反應(yīng)，得到短的烷基胺間隔基，其可用于隨后的偶聯(lián)反應(yīng)?？梢允褂秒p酰肼化合物類似地產(chǎn)生酰肼基團(tuán)。然后使用多種反應(yīng)，將所得到的功能基團(tuán)偶合到生物活性分子上。例如，如果產(chǎn)生了羧基，它們隨后通過混合酐方法、碳二亞胺方法，使用二環(huán)己基碳二亞胺，和N-羥基丁二酰亞胺酯方法，偶聯(lián)到蛋白質(zhì)或者肽上。脂肪族胺可以通過多種方法偶聯(lián)到蛋白質(zhì)或者肽上，包括碳二亞胺、甲苯-2,4-二異氰酸酯或順丁烯二酰亞胺化合物(malemidecompounds),特別是順丁烯二酰亞胺衍生物的N-羥基丁二酰亞胺酯。該化合物的實例是4-(N-馬來酰亞胺甲基)-環(huán)己垸-l-羧酸。另一個實例是m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基丁二酰亞胺酯?？梢允褂玫牧硪环N試劑仍然是N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯。而且，雙功能酯，如二甲基庚二胺鹽(dimethylpimelimidate)、己二亞氨二甲酯(dimethyladipimidate)或辛二甲酸二甲酯(dimethylsuberimidate)，可用于將含有氨基的部分偶合到蛋白質(zhì)上。用于將化合物，包括肽、蛋白質(zhì)和碳水化合物，以及其它化合物，共價連接到固體載體上的其它方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
也是己知的。非共價連接的方法依賴于多個非共價相互作用，如氫鍵、疏水鍵和可以穩(wěn)定相互作用的鹽鍵。0077典型地，生物活性分子是一種或多種的肽、蛋白質(zhì)、重組肽、重組蛋白質(zhì)、脂、碳水化合物、核酸、糖蛋白或糖脂。也可以使用這些分子的組合，這樣多個生物活性分子可附著在相同的微粒上。0078如果免疫活性分子是肽或蛋白質(zhì)，它可能已經(jīng)經(jīng)受了免疫調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄后修飾。典型地，這些涉及糖和/或脂部分。一個實例是末端甘露糖化。然而，其它糖殘基可以加入到蛋白質(zhì)或肽上。可以選擇地，可以以這樣的方式分離免疫活性分子，這樣，免疫活性分子的制備物基本缺乏末端甘露糖化分子。該貧化可以通過氧化步驟如高碘酸鹽氧化，通過酶處理，典型地用水解酶，或者通過糖特異性親和結(jié)合，和對貧化組分的隨后純化來進(jìn)行。用于末端甘露糖基殘基的貧化的其它方法，在本
技術(shù)領(lǐng)域：
是已知的。0079類似地，可以以這樣的方式分離免疫活性分子，這樣在免疫活性分子的制備物中，基本上沒有含脂的免疫調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后部分。該貧化可以通過化學(xué)水解或者通過十五烷酸的共沉淀來進(jìn)行。可選地，含脂免疫調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄后部分可以用帶電的去污劑封閉。特別合適的去污劑是十六垸基三甲基氯化銨(cetyltrimethylammoniumchloride)?？蛇x地，可以使用類似的季銨去污劑。0080典型地，任選存在的靶分子是病原體模式識別分子(pathogenpatternrecognitionmolecule)。在另一個備選方案中，病原體模式識別分子是TLR受體激動劑，如TLR1受體激動劑，TLR2受體激動劑，TLR3受體激動劑，TLR4受體激動劑，TLR5受體激動劑，TLR6受體激動劑，TLR7受體激動劑，TLR8受體激動劑，或者TLR9受體激動劑。在另一個備選方案中，病原體模式識別分子是NOD蛋白質(zhì)激動劑，如NOD-l激動劑或NOD-2激動劑。典型地，NOD蛋白質(zhì)激動劑是細(xì)菌肽葡聚糖或細(xì)菌肽葡聚糖的衍生物。0081多于一種生物活性分子，如免疫活性分子，和不止一種的病原體模式識別分子，在存在的情況下，可以被整合到組合物中，與微粒穩(wěn)定地結(jié)合。0082本發(fā)明的另一個方面是，通過給目標(biāo)施用上面描述的免疫活性有效量的組合物，在目標(biāo)中引發(fā)免疫應(yīng)答。典型地，該組合物也包括靶分子，如病原體模式識別分子。不止一種免疫活性分子和不止一種病原體模式識別分子可以整合到該組合物中。0083本發(fā)明的另一個方面仍然是一種體內(nèi)投遞免疫活性組合物的方法，該方法包括給具有活性免疫系統(tǒng)的生物，施用上面描述的組合物的有效量。而且，不止一種免疫活性分子和不止一種病原體模式識別分子可以整合到組合物中。體內(nèi)投遞免疫活性組合物可以通過粘膜表面、腸胃外途徑、皮膚途徑或皮下途徑完成?？梢允褂闷渌┯猛緩?。0084本發(fā)明的另一個方面仍然是一種誘發(fā)針對至少一種病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給目標(biāo)施用免疫有效量的組合物，該組合物包括一種或多種免疫活性分子(即免疫原)，和與上面描述的微粒穩(wěn)定結(jié)合的TLR受體激動劑的組合，以便在目標(biāo)中誘發(fā)針對病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答。保護(hù)性免疫應(yīng)答包括Thl或Th2反應(yīng)，或者Thl和Th2反應(yīng)的組合。施用可以通過單一劑量或者多劑量的方式進(jìn)行。0085本發(fā)明的另一個方面仍然是誘發(fā)針對免疫活性試劑的方法，該方法包括給對象施用免疫有效量的組合物，該組合物包括一種或多種免疫活性分子(即免疫原)，和與微粒穩(wěn)定結(jié)合的TLR受體激動劑和NOD蛋白質(zhì)激動劑的組合，以便在目標(biāo)中誘導(dǎo)針對免疫活性試劑的耐受性。免疫活性分子可以具有含脂部分，其可以附著到獨立于免疫活性分子之剩余部分的微粒上?？蛇x地，含脂的免疫活性部分可以進(jìn)一步包括碳水化合物基團(tuán)。0086根據(jù)本發(fā)明的組合物的毒性和療效可通過細(xì)胞培養(yǎng)物或者實驗動物中的標(biāo)準(zhǔn)藥物程序確定，例如用于確定LD5o(可以使50%群體致死的劑量)和ED50(在50%群體中治療上有效的劑量)。毒性和療效之間的劑量比率是療效系數(shù)，可以表示為比率LD5o/ED50。表現(xiàn)出大療效系數(shù)的化合物是優(yōu)選的。從這些細(xì)胞培養(yǎng)測定法和動物研究獲得的數(shù)據(jù)，可以在配置用于人類或其它動物的劑量范圍中使用。這些組合物的劑量優(yōu)選地在循環(huán)濃度的范圍內(nèi)，其包括具有很小或無毒性的ED5()。該劑量可以在這樣的范圍內(nèi)變化，該范圍依賴于所用的劑量形式和所用的施用途徑。0087對于根據(jù)本發(fā)明的許多組合物，最初可以從細(xì)胞培養(yǎng)測定法估計治療上有效的劑量。例如，可以在動物模型中配置劑量，以便獲得包括在細(xì)胞培養(yǎng)物(即，相關(guān)于組合物對被測量的免疫系統(tǒng)參數(shù)的效果，獲得半最大反應(yīng)的測試組合物的濃度)中確定的ICso的循環(huán)血漿濃度范圍。這樣的信息可以用于更準(zhǔn)確地確定人體的有用劑量。例如可通過HPLC測定血漿水平。0088精確的配方、施用途徑和劑量可以由單個醫(yī)師根據(jù)病人的情況來選擇。(例如參考Fingl等人，在ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,1975，Ch.1p.l中)。應(yīng)該注意到，由于毒性或者由于器官功能障礙，主治醫(yī)師將知道如何且何時終止、中斷或者調(diào)整施用。相反，如果臨床反應(yīng)不厲害(排除毒性)，主治醫(yī)師也將知道將治療調(diào)整至更高程度。在相關(guān)的失調(diào)管理中，施用劑量的數(shù)量級將根據(jù)要治療的疾病情況的嚴(yán)重程度和施用途徑來變化。例如，疾病情況的嚴(yán)重程度可以被評估，部分地，通過標(biāo)準(zhǔn)預(yù)后評價方法來評估。進(jìn)一步，劑量，以及也許是劑量頻率，也將根據(jù)單一病人的年齡、體重和反應(yīng)而變化。與上面討論的程序可比的程序，可以在獸藥中使用。0089使用藥物上可接受的載體，將此處描述的、用于本發(fā)明的實踐組合物，配置為對全身施用合適的劑量，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。借助于適當(dāng)?shù)妮d體選擇和合適的制造實踐，本發(fā)明的組合物，尤其是那些配置為溶液的組合物，可以腸胃外施用，如通過靜脈注射。這些組合物可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的、藥物上可接受的載體，容易地配置為適合于粘膜或皮下施用的劑型。0090下面實施例對本發(fā)明進(jìn)行了示意性說明。這些實施例僅用于示意性說明的目的，沒有限制本發(fā)明的意圖。實施例1微粒的選擇0091l-10|im范圍內(nèi)的瓊脂糖微粒己經(jīng)由SterogeneBioseparations，Inc.(Carlsbad，CA)生產(chǎn)，且使用SaturnDigiSizer5200(MicromeritisInstrumentCorp)湖U試。圖1所示數(shù)據(jù)表明，粒徑分布為75%的是5拜以下的微粒，24%的是5-10叫的微粒，1%的高于10的微粒。實施例2雞毒支原體(MG)的培養(yǎng)0092在O.lml的支原體培養(yǎng)基中，加入凍干形式的雞毒支原體(K781R-16P)，放置到1.5ml的培養(yǎng)基中，置于37'C的培養(yǎng)器中。通過顏色變化(粉紅到桔黃色或者黃色)，或者通過鋪平板于瓊脂平板上且檢查菌落，來監(jiān)控支原體的生長。通過將感染培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮介質(zhì)中，培養(yǎng)大體積(10-15L)的支原體培養(yǎng)物。隨后，以5500rpm將培養(yǎng)物離心30分鐘。用PBS洗滌沉淀物(以5500rpm進(jìn)行20分鐘)，直到上清液的OD28G低于0.2。將沉淀物重懸于20mL的PBS中。實施例3用于MG抗原純化的免疫親和柱的制備步驟l:0093在64mL的抗-雞毒支原體雞血清中，將128mL去離子(DI)水加入到玻璃燒杯中。使用冰醋酸將溶液的pH調(diào)節(jié)到4.5?？焖贁嚢枞芤?，但小心避免飛濺或者起泡。將CAP-8沉淀溶液(SterogeneBioseparations，Inc.Carlsbad,CA)用力攪拌10分鐘。隨后，計量拿出64mL的CAP-8沉淀溶液，并且緩慢地加入到攪拌1到2分鐘的時間期間而形成的渦流的側(cè)壁上。然后攪拌減速到僅僅使溶液運動的速率。室溫下攪拌溶液30分鐘，然后轉(zhuǎn)移至適當(dāng)大小的離心管中，沉淀物以5500rpm旋轉(zhuǎn)15分鐘。將上清液輕輕倒出到一個容器中，用20mL的20mM醋酸鈉，pH4.8的緩沖液，將沉淀物洗滌一次。使用0.22pm注射過濾器，過濾上清液。步驟2:0094SP吞吐量增強陽離子交換樹脂(SterogeneBioseparations,Inc.Carlsbad,CA)在3柱床體積的1MNaOH中懸浮10分鐘，然后用DI水洗滌至中性。隨后，用10柱床體積的pH4.8的0.5M醋酸鈉洗滌，然后用20柱床體積的DI水洗滌。樹脂用15柱床體積的pH4.8的20mM醋酸鈉平衡，使用20mM醋酸鹽，pH4.8的填充緩沖液填充到柱中。將步驟l的上清液以3mL/分鐘的流速加載到柱上，用20mM醋酸鈉，pH4.8緩沖液洗滌柱。將流經(jīng)液和洗滌液組合起來。測量針對pH4.8的20mM醋酸鈉的OD280。用50mM磷酸鈉，300mMNaCl，pH8.0緩沖液洗脫柱，測量洗脫液的OD280。步驟3:0095在20mL的ActigelALD活化樹脂(SterogeneBioseparations,Inc.Carlsbad,CA)中，以10mg/mL加入純化的抗雞毒支原體的雞IgG溶液，隨后加入10.5mL的1M氰基硼氫化物(ALD偶合溶液，SterogeneBioseparations，Inc.Carlsbad,CA)。在2-8'C將懸浮液輕輕地混合20小時，隨后用DI水大量洗滌。樹脂儲存在pH7.0和2-8°C的PBS中。實施例4MG抗原的純化步驟1:0096在20ml的洗滌MG濃縮液中，加入0.2g的Mega-10去污劑，室溫混合20小時。在20小時培養(yǎng)后，在懸浮液中也加入lmL的Triton-X100,室溫下繼續(xù)混合1小時。隨后，以5000rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘。從沉淀物中分離上清液，將200ml的PBS，pH7.2，加入到上清液中。將MG蛋白質(zhì)溶液于2-8'C保存5天。步驟2:0097用5柱床體積的PBS，pH7.2，以3mL/分鐘流速，平衡20mL柱床體積的抗-MG-雞IgG-Actigel柱。將MG蛋白質(zhì)溶液以8-15mL/分鐘加載到柱上。將流經(jīng)物收集到分離的瓶中。用10個柱床體積的PBS，pH7.2，以8-15mL/分鐘的流速洗滌柱，然后用20-40mL的0.1M檸檬酸，pH2.5，以相同流速洗脫。使用2MTris，將洗出物的pH立即調(diào)節(jié)為7.2。使用柱流經(jīng)物重復(fù)該純化至少5次，以便吸附出所有抗原。將所有洗出物混合，且使用糖粉，在透析袋中，于2-8'C過夜?jié)饪s。用5L的PBS，pH7.2，于2-8。C將濃縮溶液過夜透析。進(jìn)行Bradford氏蛋白質(zhì)測定方法，以確定純化蛋抗原的濃度，使用血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。實施例5活化的瓊脂糖微粒0098用兩種不同方法活化顆粒。第一種活化方法由SterogeneBiosqmrations,Inc.(Carlsbad，CA)進(jìn)行，使用可商購的專有的醛連接化學(xué)，其提供了極度穩(wěn)定的配體連接。該化學(xué)的另一個優(yōu)勢是固定化的高度可重復(fù)性。該專有的醛化學(xué)允許多個配體的連續(xù)固定化。0099另一種活化使用溴化氰(CNBr)活化方法進(jìn)行。簡單地來說，在30mL的瓊脂糖微粒中，加入30mL的2M碳酸鈉溶液，在冰浴中保持3-5分鐘，沒有混合動作。然后，稱取1.5gCNBr，溶解到9mL的乙腈中。將CNBr溶液立即加入到樹脂混合物中，在冰浴上有力地混合2分鐘。隨后，用20柱床體積的冰冷水洗滌，以4500rpm旋轉(zhuǎn)，2'C，5分鐘。實施例6MG抗原與微粒的偶合0100偶合反應(yīng)發(fā)生在純化抗原上的氨基，和微粒上的醛基或CNBr-活化基團(tuán)之間。當(dāng)使用醛活化顆粒時，偶合用實施例3中描述的偶合試劑氰基硼氫化鈉介導(dǎo)?？乖灰?0pg/0.2mL和50pg/0.2mL微粒的濃度，固定化。0101在另一個偶合反應(yīng)中，以與如下相同的抗原濃度使用CNBr-活化微粒。在15mL的CNBr活化微粒中，加入pH8.0的純化的MG抗原溶液。于2-8°C輕輕地餛合溶液20小時。離心分離上清液，用IO柱床體積的DI水洗滌樹脂。偶合樹脂存儲在2-8。C的LAL水中。用Bradford蛋白測定方法，測量上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。實施例7支原體膜的制備和偶合0102在3.0mL濃縮的支原體抗原中，加入80mL的高壓滅菌的DI水，用攪拌棒于37'C混合1小時。以5000rpm將溶液離心30分鐘，用高壓滅菌水洗滌沉淀物兩次。在10mL的PBS中再造沉淀物。在1.5mL的CNBr活化微粒中，加入0.5mL的純化沉淀物，其是用pH8的0.1MNaHC03稀釋到1:3的。于2-8'C輕輕地混合溶液20小時。離心分離上清液，用IO柱床體積的DI水洗滌樹脂。將偶合樹脂存儲在2-8t:的LAL水中。用Bradford蛋白測定方法測量上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。實施例8N0D1受體活化劑與微粒的偶合0103肽葡聚糖(PG)，以22嗎/0.2mL樹脂，溶解在0.1MNaHC03中，且加入到根據(jù)實施例6制備的CNBr-活化的微粒中。允使反應(yīng)2-8。C過夜進(jìn)行。離心分離上清液，徹底地用LAL等級水，也就是存儲介質(zhì)，洗漆樹脂。實施例9TLR3活化劑與微粒的偶合0104聚I:C,以10嗎/0.2mL珠子，固定到根據(jù)實施例6的pH8，0.1MNaHC03的CNBr-活化的微粒中。使反應(yīng)于2-8。C過夜進(jìn)行。離心分離上清液，徹底地用LAL等級水，也就是存儲介質(zhì)，洗滌樹脂。實施例10TLR4活化劑與微粒的偶合0105細(xì)菌脂多糖，以2昭/0.2mL樹脂，溶解到pH8，0.1MNaHC03中，并且根據(jù)實施例6固定化到CNBr-活化的微粒上。允許反應(yīng)于2-8'C過夜進(jìn)行。離心分離上清液，徹底地用LAL等級水，也就是存儲介質(zhì)，洗滌樹脂。實施例11TLR5活化劑與微粒的偶合0106鞭毛蛋白，以2嗎/0.2mL樹脂，溶解到pH8，0.1MNaHC。3中,并且根據(jù)實施例6固定化到CNBr-活化的微粒中。允許反應(yīng)于2-8。C過夜進(jìn)行。離心分離上清液，徹底地用LAL等級水，也就是存儲介質(zhì)，洗滌樹脂。實施例12TLR1和TLR6活化劑與微粒的偶合0107含有支原體MALP-2的表面抗原，以2pg/0.2mL樹脂，溶解到pH8，0.1MNaHC03中，并且根據(jù)實施例6固定到CNBr-活化的微粒上。使反應(yīng)于2-8。C過夜進(jìn)行。離心分離上清液，徹底地用LAL等級水，也就是存儲介質(zhì)，洗滌樹脂。實施例13TLR7/TLR8活化劑與微粒的偶合0108單鏈RNA或抗病毒咪唑喹啉咪喹莫特(Aldara)，以2pg/0.2mL樹脂，溶解到pH8，0.1MNaHC03中，并且固定到根據(jù)實施例6的CNBr-活化的微粒上。使反應(yīng)于2-8t過夜進(jìn)行。離心分離上清液，徹底地用LAL等級水，也就是存儲介質(zhì)，洗滌樹脂。實施例14TLR9活化劑與微粒的偶合0109CpGDNA，以10嗎/0.2mL樹脂，溶解到pH8，0,1MNaHC。3中，并且固定到根據(jù)實施例6的CNBr-活化的微粒上。使反應(yīng)于2-8t過夜進(jìn)行。離心分離上清液，徹底地用LAL等級水，也就是存儲介質(zhì)，洗滌樹脂。實施例15組合PAMP識別受體激動劑分子組合物固定化到微粒上0110NODl激動劑和TLR激動劑4和9，以2嗎/0.2mL樹脂，10嗎/0.2mL樹脂和2嗎/0.2mL樹脂混合在一起，分別溶解到pH8，0.1MNaHC03中，并且固定到根據(jù)實施例6的CNBr-活化的微粒上。使反應(yīng)于2-8r過夜進(jìn)行。離心分離上清液，徹底地用LAL等級水，也就是存儲介質(zhì)，洗滌樹脂，于2-8i:存儲在相同的溶液中。實施例16MG抗原與組合PAMP識別受體激動劑分子組合物一起固定化到微粒上0111MG抗原在實施例6中描述的條件下偶合1小時。隨后，在實施例13描述的條件下加入TLR激動劑混合物，使反應(yīng)于2-8。C過夜進(jìn)行。離心分離上清液，徹底地用LAL等級水，也就是存儲介質(zhì)，洗滌樹脂。實施例17動物研究l0112這些結(jié)果是3組實驗的平均值。0113給三天大小的小雞(無雞毒支原體(MG)和滑液囊支原體(M^"ov/ae(MS))，沒有用ELISA檢測到MG和MS母體抗體)接種疫苗。每組有10只小雞。在實驗的第14天，用雞毒支原體R,。w菌株攻擊小雞。研究在第28天終止。0114這些組如下設(shè)置攻擊之前用微粒疫苗組合物處理Gl-G5Gl二僅用微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G2二用帶有雞毒支原體親和純化抗原(1(Vg/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G3二用帶有受體激動劑(10嗎細(xì)菌DNA，大腸桿菌+2嗎大腸桿菌LPS和2嗎肽葡聚糖/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G4二用帶有雞毒支原體親和純化抗原(10嗎/劑量)和受體激動劑(IO嗎細(xì)菌DNA，大腸桿菌+2嗎大腸桿菌LPS和2嗎肽葡聚糖/劑量)的微粒(0,2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G5二用帶有雞毒支原體膜(107/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊用微粒疫苗組合物攻擊后處理G6-G7G6二攻擊，且用帶有雞毒支原體親和純化抗原(10pg/劑量)和受體激動劑(IO嗎細(xì)菌DNA,大腸桿菌+2嗎大腸桿菌LPS和2嗎肽葡聚糖/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)在攻擊后口服處理G7二攻擊，且用帶有受體激動劑(IO嗎細(xì)菌DNA，大腸桿菌+2嗎大腸桿菌LPS和2嗎肽葡聚糖/劑量)的微粒(0.2mU小雞)在攻擊后口服處理G8和G9陽性和陰性對照組G8二攻擊，且未處理G9二未攻擊，且未處理時間羅列0115第一天(Dl):建立G1到G9組。犧牲IO只小雞用于ELISA測定，PCR以及雞毒支原體和滑液囊支原體的培養(yǎng)，以確認(rèn)實驗小雞對母體抗體是陰性的，且存在雞毒支原體和滑液囊支原體。0116第O天(DO):攻擊前對G1-G5接種。0117第14天(D14):攻擊G1-G8組。0118第15天(D15):攻擊后對G6-G7接種。0119第28天(D28):Gl-G9。安樂死、尸體剖檢且對從特定器官、氣管、氣囊和肺的雞毒支原體(MG)分離物鋪平板。進(jìn)行氣管和肺的組織學(xué)檢查。0120D14和D28:對小雞放血，以獲得將用于測試MG特異性抗體的血清，使用血清平板凝集(SPA)試驗和阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。0121在為期90天的Dl，1天大小的肉種小雞分配為8組中的1組(10只小雞/組)。記錄小雞的單個體重。小雞如此分配，以便每組中小雞的平均體重不會顯著不同。根據(jù)處理，和以適當(dāng)形式記錄的體重，每只雞用彩色的和帶編號的翅膀標(biāo)簽來識別。處理0122在第0天，用不同的疫苗組合物處理G1-G5的小雞，0.2mL，每只動物lmLPBS。劑量如上描述。攻擊后，在第15天處理G6-G7。攻擊0123在第14天，用雞毒支原體的毒性R-菌株的新鮮肉湯培養(yǎng)物，攻擊Gl-G8共8組動物，滴定度為大約8.01ogl。CFU/ml。使用噴霧技術(shù)，將10mL的該新鮮肉湯培養(yǎng)物施用于這些組中的每一只動物。簡單地，將這些雞放置在0.22立方米分離單元中。然后在1個大氣壓下，噴灑lOmL的新鮮的雞毒支原體R-菌株培養(yǎng)物，持續(xù)大約100秒，并且將小雞暴露20分鐘。(在實驗室中，已經(jīng)使用該技術(shù)在幾次實驗中獲得成功結(jié)果)。安樂死和病理學(xué)0124在D28天，在實驗研究的最后，對所有組施以安樂死。尸體剖檢每只雞，對與MG相關(guān)的粗損害記分。記錄氣管、左右胸氣囊和腹膜中滲出物的存在情況。根據(jù)下述系統(tǒng)對損害記分在氣f^7:0=沒有滲出物，1=輕微變紅，和少量滲出物，2=粘膜變紅，滲出物。^"右氣囊0=無損害，l二漿液性滲出物，2=帶有小塊纖維蛋白的漿液性滲出物，3=漿液狀、纖維蛋白性滲出物，輕微增厚的氣囊壁，4=大量纖維蛋白性滲出物，非常厚的氣囊壁。^^^:0=無滲出物，1=漿液性滲出物，2=帶有小塊纖維蛋白的漿液性滲出物，3二漿液狀、纖維蛋白性的滲出物。MG分離0125在尸體剖檢過程中，使用拭子對氣管、胸氣囊、肝臟、肺、脾、腎臟和心臟進(jìn)行無菌取樣。然后將拭子上的材料鋪平板于支原體瓊脂(MA)上，于37°C，在5%C02培養(yǎng)器中培養(yǎng)。在第2、4和7天觀察平板上的支原體，然后以周為間隔，最多觀察三周。用PCR測試陽性菌落，以鑒別雞毒支原體和滑液囊支原體。尸體剖檢0126在MG攻擊之后，在氣囊和腹膜中鑒別到顯著的病理學(xué)損害。然而，與沒有處理、攻擊的對照組(G8),以及僅用顆粒處理的組(Gl)相比，在用顆粒加受體激動劑(G3，G6，p<0.001)，顆粒加純化抗原(G2，p<0.001)，和純化抗原加受體激動劑(G4,G6p0.001)處理的組中，記錄到損害得分的顯著降低。然而，如果它們在攻擊之前就被施用，當(dāng)與攻擊后施用相比時，用顆粒加純化抗原或顆粒加純化抗原加受體激動劑，獲得了較好的結(jié)果。當(dāng)用固定到顆粒上的雞毒支原體膜處理G5時，在一些情況下，病理學(xué)損害比攻擊組本身更明顯。這導(dǎo)致這樣的結(jié)論，即用雞毒支原體膜接種，阻止了針對病原體攻擊的適當(dāng)免疫應(yīng)答，從而引起免疫抑制，且允許更明顯的感染。支原體的再次分離0127支原體可以，從未接種疫苗的、感染的對照組小雞的內(nèi)部器官中，被頻繁地再次分離。與未接種疫苗的對照組(G8，PO.Ol)，和僅用顆粒處理的組(Gl,p<0.001-0.01)，或者用顆粒加受體激動劑(G3,G7，p<0.05)處理的組相比，在用顆粒加純化抗原、有或者沒有受體激動劑(G2、G4、G6)處理的組中，注意到再次分離率(呼吸+內(nèi)部器官的再次分離率)顯著降低。然而，在用顆粒加受體激動劑(G3，G6)和對照組(G8)處理的組之間，有顯著較低的再次分離率(P<0.05)。當(dāng)比較來自實驗組的呼吸道(氣管、肺、氣囊)或其它內(nèi)部器官(肝臟、脾、腎臟和心臟)的支原體的再次分離率時，也得到了類似結(jié)果。當(dāng)用固定到顆粒上的雞毒支原體膜處理G5時，在某些情況下，來自器官的雞毒支原體的再次分離率高于攻擊組本身。這導(dǎo)致這樣的結(jié)論，即用雞毒支原體膜接種疫苗可以阻止針對病原體攻擊的適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答，從而引起免疫抑制，且允許更顯著的感染。0128結(jié)果如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>血清學(xué)結(jié)果0129這些組的血清學(xué)反應(yīng)在實驗結(jié)束時不同。未處理的、攻擊組(G8)的反應(yīng)與僅用顆粒處理的組(Gl)的反應(yīng)不同。同時，與僅用顆粒處理的組(Gl)相比，在用顆粒加純化抗原和PRR激動劑處理的組(G4)(PO.05)中注意到非常強烈的反應(yīng)。與用顆粒加純化抗原處理的組(G2)相比，如果加入PRR(G4,G6)，注意到非常高的血清學(xué)反應(yīng)(P<0.05)。如果在攻擊前(G4)或者攻擊后(G6)使用顆粒加抗原加PRR，那么血清學(xué)結(jié)果之間沒有顯著差異。討論0130雞毒支原體能引起氣囊和腹膜的顯著炎癥，伴隨有氣管、氣囊和肺的定居現(xiàn)象(colonization)。也可以從內(nèi)部器官頻繁地檢測支原體。我們已經(jīng)開發(fā)了一種新型的"病原體模仿"免疫活性組合物，其包括微生物大小范圍內(nèi)的微粒(<5pm)，具有與不同PRR激動劑分子一起共價固定化的免疫親和純化抗原。0131我們的結(jié)果表明，沒有任何修飾的顆粒不能刺激任何免疫應(yīng)答。單獨顆粒不能保護(hù)小雞，使其免受雞毒支原體引起的腹膜炎和氣囊炎的傷害，也不能保護(hù)器官的免受支原體定居。0132當(dāng)使用PRR激動劑、不使用抗原，涂敷顆粒時，支原體攻擊的血清學(xué)反應(yīng)沒有受到影響。然而，支原體的器官定居降低了，病理學(xué)損害得分也降低了。這證實了我們的體外觀察，即PRR激動劑確實刺激或者增強了導(dǎo)致增強保護(hù)的先天性免疫應(yīng)答。然而，所施加的免疫調(diào)節(jié)劑的量不能完全保護(hù)動物，使其免受大劑量的高度致病菌株的攻擊。這點對于先天性免疫系統(tǒng)也是已知的，因為它典型地不足以克服大劑量的病原體。然而，數(shù)據(jù)表明，該新穎免疫調(diào)節(jié)劑能保護(hù)動物，使其免受較低劑量的攻擊。0133當(dāng)將純化抗原加入到用PRR激動劑涂敷的顆粒中時，增強了支原體特異性的血清學(xué)反應(yīng)。顯著降低了器官的定居現(xiàn)象，病理學(xué)損害得分也低。當(dāng)通過粘膜并且在攻擊前注射疫苗時，該效果更明顯，但當(dāng)在攻擊后通過粘膜施用疫苗時，注意到了類似的正面效果。0134一個有趣的觀察是，增加的抗原濃度(高達(dá)50嗎/劑量)實際上降低了疫苗的保護(hù)效果。這表明親和純化抗原中存在免疫抑制組分。為了鑒別這些組分，并且消除它們的作用，設(shè)計了一個新的動物實驗(參見下面)。0135在接種疫苗后，在攻擊之前，每日檢查接種疫苗的小雞，以評估疫苗的安全性。發(fā)現(xiàn)這些小雞在臨床上是健康的，沒有顯示出疫苗的任何副作用。與未接種疫苗組相比，這些雞的飼料和水消耗沒有變化。在實驗過程中尸體剖檢的動物沒有顯示出炎癥癥狀，或者器官大小/重量的變化。疫苗表現(xiàn)是安全的。實施例180136如前述實施例描述的制備親和純化MG抗原。將純化抗原分為三組，用于固定化之前的下述處理。1.內(nèi)切糖苷酶H消化0137在53.6mL抗原(大約1.5mg)中，加入2.5單位的酶，于37。C過夜培養(yǎng)。次日使混合物通過冷凍的固定化甘露聚糖柱(5mL)，收集流經(jīng)物。該樣品命名為EndoH抗原。2.高碘酸鹽處理0138在53.6mL抗原(大約1.5mg)中，加入固體高碘酸鈉，至終濃度為15mM，混合后保持冷凍l小時。以2倍摩爾使用方式加入甘油，將樣品再培養(yǎng)l小時。針對PBS，透析過夜。透析樣品命名為高碘酸鹽(Periodate(PJ))抗原。3.ConA結(jié)合抗原的去除0139使純化抗原(大約1.5mg，于53.6mL中)通過2mL固定化ConA柱。收集流經(jīng)物。樣品命名為ConA流經(jīng)物。用pH9.5的50mMTRIS中的1Ma-甲基甘露葡糖苷，洗脫結(jié)合的抗原。樣品命名為ConA洗提物?？乖幚?140抗原的特征如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>"寸于EndoH處理，被處理抗原的初始量是2.51nig。(53.6ml的該制備物和40.3ml的0.0246mg/ml的之前的雞毒支原體制備物)。實施例19動物研究II0141這些結(jié)果是3次實驗的平均。對三天大小的小雞(無雞毒支原體(MG)和滑液囊支原體(MS)，沒有能通過ELISA檢測到的MG和MS母體抗體)接種疫苗。每組有IO只小雞。在實驗的第14天，用雞毒支原體R,。w菌株攻擊小雞。研究在第28天結(jié)束。這些組如下設(shè)置Gl-未攻擊，且未處理G2-攻擊，且未處理攻擊之前處理兩周G3二用帶有雞毒支原體親和純化抗原(10嗎/劑量)和TLR激動劑(IO叱細(xì)菌DNA,大腸桿菌+2嗎大腸桿菌LPS和2嗎肽葡聚糖/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G4二用帶有雞毒支原體親和純化抗原(50嗎/劑量)和TLR激動劑(10pg細(xì)菌DNA,大腸桿菌+2嗎大腸桿菌LPS和2嗎肽葡聚糖/劑量)的微粒(02mL/小雞)口服處理，并且攻擊G5二用帶有雞毒支原體親和純化ConA吸附抗原(IO嗎)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G6二用帶有雞毒支原體親和純化EndoH消化抗原(IO嗎)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G7-用帶有雞毒支原體親和純化高碘酸鹽氧化抗原(IO嗎)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G8二用帶有雞毒支原體親和純化ConA吸附抗原(IO嗎)+TLR激動劑(IO嗎細(xì)菌DNA,大腸桿菌+2嗎大腸桿菌LPS和2嗎肽葡聚糖/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G9-用帶有雞毒支原體親和純化ConA吸附抗原(50嗎)+TLR激動劑(IO嗎細(xì)菌DNA,大腸桿菌+2pg大腸桿菌LPS和2嗎肽葡聚糖/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G10二用帶有雞毒支原體親和純化EndoH消化抗原(IO昭)+TLR激動劑(10嗎細(xì)菌DNA,大腸桿菌+2嗎大腸桿菌LPS和2昭肽葡聚糖/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊Gll=用帶有雞毒支原體親和純化EndoH消化抗原(50昭)+TLR激動劑(10嗎細(xì)菌DNA，大腸桿菌+2嗎大腸桿菌LPS和2昭肽葡聚糖/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G12-用帶有雞毒支原體親和純化高碘酸鹽氧化抗原(10ng)+TLR激動劑(10叫細(xì)菌DNA,大腸桿菌+2嗎大腸桿菌LPS和2昭肽葡聚糖/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G13二用帶有雞毒支原體親和純化高碘酸鹽氧化抗原(5(^g)+TLR激動劑(10嗎細(xì)菌DNA，大腸桿菌+2嗎大腸桿菌LPS和2昭肽葡聚糖/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G14-用帶有雞毒支原體親和純化EndoH消化抗原(10|ag)+TLR激動劑(10嗎細(xì)菌DNA,大腸桿菌+2嗎大腸桿菌LPS和2嗎肽葡聚糖/劑量)加氨基胍(i.p.)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理7天，并且攻擊G15-用帶有在珠子上的雞毒支原體抗原ConA洗脫物的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊時間羅列0142Dl:建立Gl到G15組。犧牲10只小雞用于ELISA測定、PCR和雞毒支原體和滑液囊支原體的培養(yǎng)，以確認(rèn)實驗小雞對母體抗體是陰性，且存在支原體。0143DO:攻擊前，接種G3-G14。D14:攻擊G2-G15組。0144D28:Gl-G15。安樂死、尸體剖檢且鋪平板來自特定器官、氣管、氣囊和肺的雞毒支原體(MG)的分離物。進(jìn)行氣管和肺的組織學(xué)檢查。0145D14和D28:對小雞抽血，以獲得用于測試MG特異性抗體的血清，使用血清平板凝集(SPA)試驗和阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。0146在為期150天的Dl天，1天大小的肉種小雞分配為15組中的1組(10只小雞/組)中。記錄小雞的個體體重。小雞如此分配，以便每組中小雞的平均體重不會顯著不同。根據(jù)處理，每只雞用彩色和帶編號的翅膀標(biāo)簽來識別，以及以適當(dāng)形式記錄的體重。攻擊0147在D14天，用雞毒支原體的毒性R-菌株的新鮮肉湯培養(yǎng)物，攻擊14組G2-G15動物，滴定度為大約8.0loglQCFU/ml。使用噴霧技術(shù)，將10mL的該新鮮肉湯培養(yǎng)物施用于這些組中的每只動物。簡單地，將這些雞放置在0.22立方米的分離單元中。然后在l個大氣壓下，噴灑10mL的新鮮雞毒支原體R-菌株培養(yǎng)物，持續(xù)大約100秒，并且將小雞暴露20分鐘。(在實驗室中，已經(jīng)使用該技術(shù)在幾次實驗中取得成功結(jié)果)。安樂死和病理學(xué)0148在D28天，在實驗研究的最后，對所有組施以安樂死。尸體剖檢每只雞，對與MG相關(guān)的肉眼損害記分。記錄氣管、左右胸氣囊和腹膜中滲出液的存在。根據(jù)下述系統(tǒng)對損害記分在氣,^:0=沒有滲出液，l二輕微變紅和少量滲出液，2=粘膜變紅且有滲出液。左右氣囊0=無損害，1-漿液狀滲出液，2=帶有小塊纖維蛋白的漿液狀滲出液，3=漿液狀、有纖維蛋白性的滲出液，和輕微增厚的氣囊壁，4=大量纖維蛋白性的滲出液，和非常厚的氣囊壁。^^^:0=無滲出液，1=漿液狀滲出液，2=帶有小塊纖維蛋白的漿液狀滲出液，3=漿液狀、有纖維蛋白性的滲出液。結(jié)果0149結(jié)果如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>MG分離0150在尸體剖檢過程中，使用拭子對氣管、胸氣囊、肝臟、肺、脾、腎臟和心臟進(jìn)行無菌取樣。然后拭子上的材料鋪平板于支原體瓊脂(MA)上，于37'C在5。/。C02培養(yǎng)器中，培養(yǎng)。在第2、4和7天觀察平板上的支原體，然后以周為間隔，最多觀察三周。用PCR測試陽性菌落，以鑒別雞毒支原體和滑液囊支原體。尸體剖檢和再次分離0151在MG攻擊之后，在氣囊和腹膜中鑒別到顯著的病理學(xué)損害。然而，與沒有處理、攻擊的對照組相比，在用處理的純化抗原加TLR接種的組中，記錄到損害得分和再次分離率的顯著降低，其中最好的是ConA柱提取抗原(G9)。然而，用ConA洗脫的抗原組分G15，病原體損害得分高，再次分離率與陽性對照組相同。這導(dǎo)致這樣的結(jié)論，即用雞毒支原體抗原組分接種阻止針對病原體攻擊的適當(dāng)免疫應(yīng)答，從而引起免疫抑制，且允許更明顯的感染。討論0152這些實驗的結(jié)果表明，從親和純化抗原匯合液中去除免疫抑制抗原，對疫苗組合物的保護(hù)作用有顯著提高。此外，化學(xué)修飾或者抗原上的含糖轉(zhuǎn)錄后修飾的酶促分解，也導(dǎo)致改進(jìn)的保護(hù)免疫。0153相反，我們也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，偶合到微粒上的分離的免疫抑制抗原的施用，導(dǎo)致免疫抑制和發(fā)展了針對病原體的耐受性。這樣，我們已經(jīng)示范性說明，適當(dāng)?shù)目乖卣骺梢詫⒚庖邞?yīng)答改變?yōu)楸Ｗo(hù)或者耐受性。保護(hù)和耐受性在開發(fā)調(diào)制免疫應(yīng)答的合理方法方面非常重要。隨后，我們已經(jīng)決定，靶向涉入免疫應(yīng)答發(fā)展中的額外抗原表面決定簇。實施例200154如前述實施例的描述，制備親和純化MG抗原。將純化抗原分為三組，用于進(jìn)行固定化之前的下述處理。1.MG抗原脫酰作用0155在27mL抗原(大約0.65mg)中，加入8mL的1MNaOH和lOmg的十五烷酸，于70'C將溶液輕輕地攪拌45分鐘。然后調(diào)節(jié)pH至8.0，以3000rpm離心5分鐘去除沉淀物。樣品命名為脫?？乖?DeacylatedAntigens)。2.高碘酸鹽處理0156目的在于比實施例18更嚴(yán)格的反應(yīng)。在25mL抗原(大約0.6mg)中，加入固體高碘酸鈉，至終濃度為80mM，混合后室溫下保持2.5小時。然后以2倍摩爾使用方式加入甘油，將樣品再培養(yǎng)l小時。針對PBS，過夜進(jìn)行透析。透析樣品命名為高碘酸鹽抗原。實施例21動物研究IH0157這些結(jié)果是3次實驗的平均。對三天大小的小雞(無雞毒支原體(MG)和滑液囊支原體(MS)，沒有由ELISA檢測到的MG和MS母體抗體)接種疫苗。每組有10只小雞。在實驗的第14天，用雞毒支原體Rj。w菌株攻擊小雞。研究在第28天結(jié)束。0158這些組如下設(shè)置Gl^未攻擊且未處理G2-攻擊且未處理攻擊之前處理兩周G3二用帶有雞毒支原體親和純化、ConA吸附抗原(10嗎/劑量)十TLR激動劑(10嗎細(xì)菌DNA,大腸桿菌+2嗎大腸桿菌LPS和2昭肽葡聚糖/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G4二用帶有雞毒支原體親和純化、脫?？乖?10嗎/劑量)+丁01激動劑(IO昭細(xì)菌DNA，大腸桿菌+2嗎大腸桿菌LPS和2昭肽葡聚糖/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G5二用帶有雞毒支原體親和純化、ConA吸附抗原(IO昭)+TLR激動劑(25嗎聚I:C+10pg細(xì)菌DNA和2嗎肽葡聚糖/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊G6-用帶有雞毒支原體親和純化、高碘酸鹽處理且脫酰的抗原(IO嗎)+TLR激動劑(IO嗎聚I:C+10嗎細(xì)菌DNA和2昭肽葡聚糖/劑量)的微粒(0,2mL/小雞)口服處理，并且攻擊攻擊后處理1天G7-用帶有雞毒支原體親和純化ConA吸附抗原(IO嗎)+TLR激動劑(25嗎聚I:C+10嗎細(xì)菌DNA和2貼肽葡聚糖/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理G8二用帶有雞毒支原體親和純化高碘酸鹽處理且脫酰的抗原(IO嗎)+TLR激動劑(25嗎聚I:C+10嗎細(xì)菌DNA和2昭肽葡聚糖/劑量)的微粒(0.2mL/小雞)口服處理，并且攻擊時間羅列0159Dl:建立Gl到G9組。犧牲10只小雞用于ELISA測定、PCR和雞毒支原體和滑液囊支原體的培養(yǎng)，以確認(rèn)實驗小雞對母體抗體是陰性，且存在支原體。0160DO:攻擊前，接種G3-G6。0161D14:攻擊G2-G9組。0162D15:攻擊之后，接種G7-G9組。0163D28:Gl-G9。安樂死、尸體剖檢且鋪平板來自特定器官、氣管、氣囊和肺的雞毒支原體(MG)的分離物。進(jìn)行氣管和肺的組織學(xué)檢查。0164D14和D28:對小雞抽血，以獲得將用于測試MG特異性抗體的血清，使用血清平板凝集(SPA)試驗和阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。0165在為期90天的D1天，1天大小的肉種小雞分配為9組中的1組(10只小雞/組)。記錄小雞的單獨體重。小雞如此分配，以便每組中小雞的平均體重不會顯著不同。根據(jù)處理，每只雞用彩色和帶編號的翅膀標(biāo)簽來識別，以及，以適當(dāng)形式記錄體重。攻擊0166在D14天，用雞毒支原體的毒性R-菌株的新鮮肉湯培養(yǎng)物，攻擊9組G2-G9動物，滴度為大約8.01og1()CFU/ml。使用噴霧技術(shù)，將10mL的該新鮮肉湯培養(yǎng)物施用于這些組中的每一只動物。簡單地，將這些雞放置在0.22立方米的分離單元中。然后在1個大氣壓下，噴灑10mL的新鮮雞毒支原體R-菌株培養(yǎng)物，持續(xù)大約100秒，并且將小雞暴露20分鐘。安樂死和病理學(xué)0167在D28天，在實驗研究的最后，對所有組施以安樂死。尸體剖檢每只雞，對與MG相關(guān)的肉眼損害記分。記錄氣管、左右胸氣囊和腹膜中滲出液的存在。根據(jù)下述系統(tǒng)對損害記分在氣,^:0=沒有滲出液，1=輕微變紅和少量滲出液，2=粘膜變紅且有滲出液。^"右氣蘆0=無損害，1=漿液狀滲出液，2=帶有小塊纖維蛋白的漿液狀滲出液，3=漿液狀、有纖維蛋白的滲出液，輕微增厚的氣囊壁，4二大量纖維蛋白的滲出液，非常厚的氣囊壁。^^M:0=無滲出液，l二漿液狀滲出液，2=帶有小塊纖維蛋白的漿液狀滲出液，3=漿液狀、有纖維蛋白的滲出液。結(jié)果0168結(jié)果如表4所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>0169在尸體剖檢過程中，使用拭子對氣管、胸氣囊、肝臟、肺、脾、腎臟和心臟進(jìn)行無菌取樣。然后將拭子上的材料鋪平板于支原體瓊脂(MA)上，于37。C在5。/。C02培養(yǎng)器中培養(yǎng)。在第2、4和7天觀察平板上的支原體，然后以周為間隔，最多觀察三周。用PCR測試陽性菌落，以鑒別雞毒支原體和滑液囊支原體。尸體剖檢和再次分離0170在MG攻擊之后，在氣囊和腹膜中鑒別到顯著的病理學(xué)損害。然而，與沒有處理、攻擊的對照組相比，在用處理的純化抗原加TLR組接種的組中，記錄到損害得分和再次分離率的顯著降低，所有組得到了可比結(jié)果，最好的是脫酰抗原(G4)。在感染后接種疫苗組中，ConA處理抗原加TLR3，4，9給出了最好的結(jié)果。甚至用該組合物感染后，似乎也能獲得保護(hù)性免疫。討論0171這些實驗的結(jié)果表明，從親和純化抗原匯合液去除或者阻斷免疫抑制逃逸抗原或者抗原決定簇，可以顯著地提高對疫苗組合物的保護(hù)作用。此外，抗原上的含糖轉(zhuǎn)錄后修飾(N-糖基化)的去除和化學(xué)修飾也導(dǎo)致改進(jìn)的保護(hù)免疫。另外，抗原上的脂部分被化學(xué)去除或者阻斷，也導(dǎo)致顯著的免疫保護(hù)作用。0172我們也已經(jīng)示意性描述，使用適當(dāng)?shù)目乖揎?，可以將免疫?yīng)答改變?yōu)楸Ｗo(hù)。這在開發(fā)調(diào)制免疫應(yīng)答的合理方法方面非常重要。隨后，我們已經(jīng)建立了一個體外系統(tǒng)，在組織培養(yǎng)物中重新產(chǎn)生各自的免疫應(yīng)答。這樣的系統(tǒng)可以有關(guān)于免疫活性組合物產(chǎn)生的免疫應(yīng)答預(yù)測值，從而能縮短產(chǎn)品丌發(fā)周期。實施例22體外研究0173在用外周血制備，用肽葡聚糖(PepG)(Sigma,StLouis，Ml)，細(xì)菌CpGDNA(KMBiomedicals,Aurora,OH;LPS<0.2EU/ml，用鱟變形細(xì)胞裂解產(chǎn)物測定方法測量)，或者兩者處理的PBMC中測量TNF-a分泌。通過ELISA，從5小時培養(yǎng)后的培養(yǎng)物上清液，測量TNF-ou0174從用于TNF-a分析的相應(yīng)的PBMC培養(yǎng)物中，評估單核細(xì)胞中的組織因子(TF)，其代表先天性免疫系統(tǒng)。使用TFELISA(Imubindkit,AmericanDiagnostica,Greenwich,CT)的制造商推薦的方法，用Triton-XlOO從粘附細(xì)胞提取TF。0175結(jié)果如圖2所示(P和D之后的數(shù)字分別表示PepG和細(xì)菌DNA的濃度，單位為^g/ml;從左到右，它們是P3+D15、P3+D5、P3+D1.5、Pl+D15、Pl+D5、Pl+D1.5、P0.3+D15、P0,3+D5禾卩P0.3+D1.5)。PBMC(A)分泌的TNF-a，和用PepG(白條)，或者細(xì)菌CpGDNA(黑條)，或者兩者同時以與當(dāng)單獨加入時相同的濃度(陰影條)處理后的組織因子(B)。P和D之后的數(shù)字分別表示PepG和細(xì)菌DNA的濃度，單位為嗎/ml。當(dāng)以所有測試濃度，在PepG(3或1.5昭/mL)的效果總和之間和單獨CpGDNA的作用之間進(jìn)行比較時，并且當(dāng)PepG和細(xì)菌DNA同時加入時，對于TNF-a和TF，P<0.05;學(xué)生t試驗(Student't測試)(n=4)。這是三個中的代表性實驗。0176現(xiàn)有結(jié)果表明了通過PBMC中的PepG和細(xì)菌DNA誘導(dǎo)TNF-a和TF，和兩個分子之間的協(xié)同效果。在PepG或者細(xì)菌DNA作用之后，可能涉及共同的下游信號途徑的直接作用，或者由分泌化合物所介導(dǎo)的間接作用。TNF-a是針對致熱原的宿主反應(yīng)的一種重要的早期媒介，并且是能觸發(fā)感染性休克的新陳代謝、血液動力學(xué)、組織和細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)的整個幅度范圍上的唯一內(nèi)源性媒介。細(xì)菌DNA和PepG的協(xié)同作用已經(jīng)暗示了敗血病的發(fā)病機(jī)制，如之前假設(shè)的那樣，其中每一個分子，盡管在體內(nèi)以低濃度存在，可能擴(kuò)大另一個分子的作用。不同顆粒組合物的不同Thl和Th2反應(yīng)的體外誘導(dǎo)的示意性說明0177通過來自健康志愿者的外周血的Ficoll分離，制備外周血單核細(xì)胞。將單核細(xì)胞以1()6細(xì)胞/ml的密度鋪平板于1.5mlRPMI-1640(IrvineScientific,Irvine:CA)上，用100U/ml青霉素/鏈霉素，2mM谷氨酰胺和3%胎牛血清補充，并且用0.15mL的微粒(在無菌PBS中)培養(yǎng)18小時。微粒含有ConA剝離的或高碘酸鈉處理的抗原，以及TLR激動劑2、3、4和9，如下面圖表中所示。實施例19中描述了珠子的制備。0178結(jié)果如圖3(灰條，TNF-aX100，黑條，IL-IO)和圖4所示，其中給出了TNF-a/IL-10的比率。0179TNF-a禾卩IL-10比率分析表明，ConA剝離的抗原與TLR2、4、9的共固定化給出了最顯著的Thl反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其與體內(nèi)結(jié)果相關(guān)(參見實施例19)。該組合物始終對動物中的支原體攻擊給出了最好的保護(hù)作用。實施例20180為了進(jìn)一步表征針對免疫調(diào)節(jié)劑微粒的細(xì)胞反應(yīng)，我們將樹突狀細(xì)胞暴露在這些微粒下。我們已經(jīng)觀察到MHCI和MHCII分子和共刺激分子CD80和CD86的上調(diào)節(jié)。任何PRR激動劑組合的存在，似乎必須測量在18小時處理之后的樹突狀細(xì)胞表面上的MHCII增加。由于在細(xì)胞表面上存在MHC是個動力學(xué)過程，可能需要用ConAAg珠子溫育不同的時間，以便觀察細(xì)胞表面上MHC分子的增加。MHC允許抗原呈遞到T細(xì)胞，CD86與T細(xì)胞上的CD28相互作用。樹突狀細(xì)胞伴隨的抗原呈遞和B7-共刺激配體(如CD80和CD86)相互作用，導(dǎo)致T細(xì)胞活化。這些體外數(shù)據(jù)表明微粒導(dǎo)致了標(biāo)志樹突狀細(xì)胞成熟的變化，和導(dǎo)致了誘導(dǎo)先天性和獲得性免疫所要求的變化。018118小時暴露給不同微粒制劑后，確定樹突狀細(xì)胞表面上的MHCI和MHCII以及CD80和CD86表達(dá)沒有抗原或者PRR激動劑固定到其上的對照組微粒(對照組)，和去除了ConA結(jié)合抗原后的雞毒支原體抗原被固定到其上的微粒，用或者沒有下述PRR激動劑組合1)PepG、LPS、細(xì)菌DNA(細(xì)菌DNA)(ConAAg+PRR2、4、9)，或者2)聚I:C、LPS、細(xì)菌DNA(ConAAg+PRR3、4、9)。圖5所示為MHC-II和CD86在樹突狀細(xì)胞中的誘導(dǎo)。0182結(jié)果顯示了微粒通過DCs對TNF-a分泌的作用。對照組微粒不誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基中TNF-a的可檢測分泌。與對照組微粒相比，其它三種類型的微粒(在ConA結(jié)合抗原貧化后的雞毒支原體，和用PepG、LPS、細(xì)菌DNA和polyI:C共固定化的類似抗原)通過DCs誘導(dǎo)顯著數(shù)量的TNF-a。有趣地是，與單獨抗原相比，細(xì)菌化合物如免疫調(diào)節(jié)劑的存在，產(chǎn)生了較少的TNF-a。這些結(jié)果表明微粒確實與DCs相互作用，且能激活TLRs和NOD受體，以產(chǎn)生與這些分子在免疫系統(tǒng)的細(xì)胞上的已知作用相一致的生理學(xué)反應(yīng)。我們已經(jīng)示意性說明了微粒能被靶向DCs。實施例24從MG中純化肝素結(jié)合蛋白0183如實施例2中的描述，培養(yǎng)雞毒支原體，按照實施例4的步驟1中公開的那樣，將濃縮且洗滌的支原體，予以滅活。簡單地，在75mL粗MG膜蛋白中，加入0.75Mega-lO，室溫下將溶液混合20小時。隨后，在溶液中加入3.75mL的TritonX-IOO，室溫下再次混合1小時。以5000rpm旋轉(zhuǎn)溶液10分鐘，從沉淀中分離上清液。然后，將75mLTris緩沖液(20mMTris,0.1MNaCI，pH7.2)加入到上清液中。用5柱床體積的Tris緩沖液，以3ml/分鐘流速平衡肝素-Actigd柱。將MG蛋白溶液以8-15mL/分鐘的流速加載到柱上，將流經(jīng)物收集到單獨的瓶子中。用IO柱床體積的Tris緩沖液，以8-15mL/分鐘的流速，洗滌柱，用含有2MNaCl的Tris緩沖液，以8-15mL/分鐘的流速，洗脫柱。在用10柱床體積的Tris緩沖液洗滌后，將MG蛋白溶液再次應(yīng)用到柱上，如上再次洗脫。將洗脫液集中到一起，使用3500MW截留透析管，針對Tris緩沖液透析。進(jìn)行蛋白質(zhì)測定，以確定洗脫蛋白質(zhì)的濃度。實施例25從中和血清純化IgG以及制備免疫親和柱0184根據(jù)實施例3，從接種疫苗的、中和雞血清純化大量IgG，且固定化到ActigelALD上。實施例26結(jié)合到免疫親和柱上的肝素結(jié)合MG蛋白的胰蛋白酶消化0185將2mg純化的MG蛋白加入到2ml的免疫親和柱上，允許結(jié)合15分鐘。用10mlTris緩沖液B(50mMTris,pH7.5，0.1MNaCl)洗滌柱。加入胰蛋白酶溶液，在Tris緩沖液B中為20嗎/ml，于37。C輕輕地將漿液攪拌1小時。用Tris緩沖液B洗滌掉片段和游離酶，用0.1M檸檬酸鹽，pH2.5，洗脫結(jié)合的肽。隨后用cc.NH4OH使其變中性，濃縮，且在C-18反相旋轉(zhuǎn)柱(Pierce)上純化，用MALDI-TOF分析肽組合物。實施例27結(jié)合到肝素柱上的肝素結(jié)合MG蛋白的胰蛋白酶消化0186將2mg純化的MG蛋白加入到2ml的肝素Actigel柱上，使其結(jié)合1小時。用1OmlTris緩沖液B洗滌柱。加入胰蛋白酶溶液，在Tris緩沖液B中為20pg/ml，于37'C輕輕地將漿液攪拌1小時。用Tris緩沖液B洗滌掉片段和游離酶，用含有1MNaCl的Tris緩沖液B洗脫結(jié)合的肽。濃縮洗脫物，且在C-18反相旋轉(zhuǎn)柱(Pierce)上純化，用MALDI-TOF分析肽組合物。實施例28Clq蛋白的純化和固定化0187根據(jù)McKay,EJ的方法進(jìn)行Clq的純化，即用于從不同動物種類純化血衆(zhòng)Clq的簡單的兩步程序(Asimpletwo-stepprocedureforthepurificationofplasmaClqfromdifferentanimalspecies),ImmunolLetters1981，3:303-308。通過適應(yīng)性修改我們的描述在美國專利5,801,063中的方法，將純化的Clq以3mg/ml固定化至ljAminogel(SterogeneBioseparations,Inc.,CarlsbadCA)上。實施例29補體結(jié)合IgG的純化和固定化0188將根據(jù)實施例24純化的多克隆中和抗體應(yīng)用到10ml的固定化Clq的柱上，在Tris緩沖液B中平衡，允許結(jié)合30分鐘。通過用10柱床體積的Tris緩沖液B洗滌，去除未結(jié)合的抗體，用含有l(wèi)MNaCl的相同緩沖液洗脫結(jié)合的抗體。隨后以3mg/ml將純化的IgG固定化到ActigelALD上。實施例30結(jié)合到免疫親和柱上的補體活化MG蛋白的胰蛋白酶消化0189如實施例2中的描述，培養(yǎng)雞毒支原體，按照實施例4的步驟1中公開的那樣，滅活濃縮且洗滌的支原體。在10ml的固定化補體活化抗體的柱上，以3ml/分鐘應(yīng)用30mL的MG溶解產(chǎn)物。以8ml/分鐘的流速，用20柱床體積的Tris緩沖液B洗滌柱，以去除未特異性吸附的蛋白質(zhì)。加入胰蛋白酶溶液，在Tris緩沖液B中為20pg/ml，于37'C輕輕地將漿液攪拌1小時。用Tris緩沖液B洗滌掉片段和游離酶，用pH2.5的0.1M檸檬酸鹽洗脫結(jié)合的肽。隨后用柱色譜(cc.)NH4OH使其中和，濃縮，且在C-18反相旋轉(zhuǎn)柱(Pierce)上純化，用MALDI-TOF分析肽組合物。01卯免疫活性肽的一個實例顯示出如下組成Lys-Leu-Ala-Leu-Thr-Ser-Glu-lle-Thr-Glu-Glu-lle-Tyr-Pro-Ser-Ala-Pro-Lys-Val-Ser-Arg-Lys-Gln-Arg-Gly-Val-His-Gly-Phe-Ser-Glu-Pro-Thr-Ser(SEQIDNO:1)。重要的是，該肽含有Arg-Lys-Gln-Arg的GAG/肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。另一個有用的序列是Leu-Leu-Ala-Lys-Lys-Thr-Asp-Lys-Ser-Val-Ser-Pro-Gln-Ala-Ser-Leu-Thr(SEQIDNO:2)。這些序列可通過接頭肽連接，其含有內(nèi)切蛋白酶的切割位點。這樣的接頭序列的實例是LIKFRSN(Leu-lle-Lys-Phe-Arg-Ser-Asn)(SEQIDNO:3)。其它接頭序列在本
技術(shù)領(lǐng)域：
是已知的。實施例31抗原肽表位和多表位肽的合成0191用FMOC方法合成抗原肽。實施例32確認(rèn)用于疫苗的保護(hù)性抗原肽0192將抗原肽與已接種疫苗小雞的中性血清混合，用競爭性ELISA確定到固定化肝素的結(jié)合抑制。肽樣品吸附到ELIS平板的壁上。隨后，用封閉溶液封閉壁，接著將免疫和未免疫對照組抗血清加入到壁上，于4'C溫育過夜。用洗滌溶液去除非特異性蛋白質(zhì)，隨后以100嗎/ml加入生物素標(biāo)記的肝素，在封閉緩沖液中稀釋1小時。對每一未結(jié)合的肝素洗滌三次后，每次洗滌10分鐘，加入鏈霉抗生物素蛋白過氧化物酶，以1:3000在封閉緩沖液中稀釋1小時。用洗滌緩沖液洗滌三次，每次10分鐘，去除過量共軛物，通過加入3,3'-二氨基聯(lián)苯胺溶液顯色。顯色信號與中和抗體的存在成反比。實施例30193病原體的抗原蛋白的生物信息學(xué)分析，也導(dǎo)致鑒別高抗原潛力的表位。己經(jīng)針對雞毒支原體MGA蛋白進(jìn)行了這樣的分析。在線性堿性基序的上下文中，進(jìn)一步分析抗原區(qū)域。如此預(yù)計的高抗原性的線性基序的一個實例是序列MHCI表位10-mer(10-聚體)是LLAKKTDKSV(SEQIDNO:4)，而MHCII15-mer是LLAKKTDKSVSPAQAS(SEQIDNO:5)。用SYFPEITHI方法(www.syfpdthi.de)鑒別這些結(jié)構(gòu)域。這表明，線性堿性基序?qū)嶋H上包括在高抗原傾向的斑點內(nèi)。用本
技術(shù)領(lǐng)域：
己知的技術(shù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，如J.Pevsner,"BioinformaticsandFunctionalGenomics"(Wiley-Liss,Hoboken，NJ.,2003)中描述的技術(shù)，使用了用于數(shù)據(jù)挖掘和匹配的數(shù)據(jù)庫和計算分析技術(shù)，和本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的序列對比。實施例34抗表位抗體的純化0194用末端生物素標(biāo)記合成鑒別的抗原肽。以lmg/ml濃度將生物素標(biāo)記的肽固定化到抗生物素蛋白Actigel(SterogeneBioseparations，Inc.Carlsbad,CA)上。以飽和濃度加入來自接種疫苗小雞的中性抗血清，通過用pH7.2的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。用ActisepElutionMedium(SterogeneBioseparations,Inc.Carlsbad,CA)洗脫特異性結(jié)合的抗體。本發(fā)明的優(yōu)點0195本發(fā)明提供了改進(jìn)的免疫調(diào)節(jié)組合物，和能定制的方法，例如，以便誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，或者引發(fā)耐受性。這些組合物是穩(wěn)定的，可以用很大范圍的免疫原和靶分子制備，以便對免疫應(yīng)答產(chǎn)生期望的作用。它們提供了除腸胃外施用之外的，用于這些試劑的施用途徑。它們保護(hù)免疫原和靶分子的未成熟分解或釋放。顆粒具有固有的粘膜粘附特性，其可以改進(jìn)與粘膜的相互作用，且有助于攝取。它們不要求其它的佐劑。0196根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物，利用了N-糖基化(甘露糖化)在免疫逃逸中的角色，以便通過從打算用作疫苗的組合物中去除適當(dāng)?shù)奶右荼砦?，避免免疫逃逸的發(fā)生。它們也使用了糖胺聚糖/肝素線性結(jié)合基序的鑒別，和干預(yù)這樣的結(jié)合的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物進(jìn)一步使用了己經(jīng)開發(fā)用于鑒別補體活化表位的方法。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物使用了這樣的發(fā)現(xiàn)，即使用幾種TLR激動劑極大地增強了免疫應(yīng)答。所有抗原和TLR激動劑能被靶向粘膜淋巴系統(tǒng)中的單一細(xì)胞。本發(fā)明的另一個改進(jìn)的方面是在單一顆粒上使用了合成的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位。0197在缺少此處未特別公開的任何一個或多個元素、一個或多個限制的情況下，此處示意性描述的本發(fā)明能合適地實踐。因此，例如，術(shù)語"包含"，"包括"，"含有"等，可以廣泛地理解，沒有限制。另外，此處使用的術(shù)語和表達(dá)被用作描述術(shù)語，不是限制，在使用這些術(shù)語，和除將來所示和描述的任何等價表達(dá)或其任何部分的表達(dá)中，沒有任何意圖，而也應(yīng)該認(rèn)識到，在本發(fā)明所要求的范圍內(nèi)，多種修飾都是可能的。因此，應(yīng)該理解到，盡管本發(fā)明已經(jīng)通過本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案和任選的特征、修飾和變化進(jìn)行了特別公開，且這些修飾和變化被認(rèn)為在本發(fā)明此處公開的范圍內(nèi)。此處，本發(fā)明已經(jīng)進(jìn)行了廣泛且一般地描述。落在一般公開范圍內(nèi)的每一個狹小類別和亞屬分組也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這包括每一發(fā)明的一般描述，條件是從屬中去除任何主題的否定限制，不管其中是否特別地含有已刪除的材料。0198此外，在本發(fā)明的特征或者方面根據(jù)馬庫什(Markush)組進(jìn)行描述的情況下，本
技術(shù)領(lǐng)域：
獲得學(xué)位的那些技術(shù)人員將認(rèn)識到，本發(fā)明也根據(jù)馬庫什組的任何單一成員或亞組進(jìn)行描述。也應(yīng)該理解到，上述描述的目的在于示意性而不是限制性。一旦閱讀了上述描述，許多實施方案對本
技術(shù)領(lǐng)域：
的熟練技術(shù)人員是顯而易見的。因此，不參考上述描述，本發(fā)明的范圍應(yīng)該可以確定，但相反，可以參考所述權(quán)利要求，以及這樣的權(quán)利要求有資格擁有的完全范圍的等價表達(dá)來確定。將所有項目和參考的公開，包括專利公開，引入此處作為參考。權(quán)利要求1.一種免疫活性組合物，所述組合物用于誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，該組合物包括(a)至少一種病原體相關(guān)分子模式；(b)任選地，至少一種免疫活性抗原或抗原表位；和(c)至少一種將組合物有效投遞到生物的載體，從而誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。2.如權(quán)利要求l所述的免疫活性組合物，其中組合物包括至少一種免疫活性抗原或抗原表位。3.—種誘導(dǎo)耐受性的免疫活性組合物，所述組合物包括(a)至少一種病原體相關(guān)分子模式(b)至少一種免疫活性抗原表位；和(C)至少一種將組合物有效投遞到生物的載體，從而誘導(dǎo)耐受性。4.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中至少一種免疫活性抗原表位缺乏逃逸表位。5.如權(quán)利要求2或3所述的組合物，其中免疫活性抗原表位是肽、蛋白質(zhì)、重組肽或者多肽、重組蛋白質(zhì)、脂、碳水化合物、核酸或其它生物活性分子，或它們中任意的組合。6.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中免疫活性抗原表位是肽或蛋白質(zhì)，并且其中肽或蛋白質(zhì)具有免疫調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)制。7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其中轉(zhuǎn)錄后調(diào)制涉及碳水化合物和/或脂部分。8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中轉(zhuǎn)錄后調(diào)制含有末端甘露糖化。9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中，免疫調(diào)節(jié)的末端甘露糖化物質(zhì)被從免疫保護(hù)性組合物中貧化。10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中，末端甘露糖化免疫活性物質(zhì)是通過氧化歩驟從組合物中貧化。11.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中，末端甘露糖化免疫活性物質(zhì)通過酶處理從組合物中貧化。12.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中，末端甘露糖化免疫活性物質(zhì)通過糖特異性親和結(jié)合從組合物中貧化。13.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中轉(zhuǎn)錄后調(diào)制涉及脂部分，并且其中脂部分通過去脂作用被去除。14.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中免疫活性抗原表位是肽或蛋白質(zhì)，并且其中免疫活性肽或者蛋白質(zhì)沒有免疫調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄后修飾。15.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中免疫活性抗原表位是肽或蛋白質(zhì)，并且其中免疫活性肽或者蛋白質(zhì)不具有能夠N-糖基化和/或硫辛酰基化(lipoylation)的氨基酸序列。16.如權(quán)利要求2或3所述的組合物，其中免疫活性抗原表位是肽或蛋白質(zhì)，并且其中免疫活性蛋白質(zhì)或肽具有能結(jié)合細(xì)胞表面糖胺聚糖(GAGs)的氨基酸序列。17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其中氨基酸序列本質(zhì)上是多堿價的，其通式是XBBXBX、XBBBXXBX、BBXXBBBXXBB、BBBXXB、BXBXB、BBB、BXBXXXBXB或BXBXXXXXBXB，其中B是堿性氨基酸，X是任何其它氨基酸。18.如權(quán)利要求16所述的組合物，其中GAG結(jié)合氨基酸序列被用于產(chǎn)生針對所述肽或蛋白質(zhì)的抗體，這些抗體能干預(yù)病原體結(jié)合到細(xì)胞表面。19.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中免疫活性抗原表位被用于產(chǎn)生針對所述表位的抗體，能夠干預(yù)病原體通過GAGs結(jié)合到細(xì)胞表面。20.如權(quán)利要求18所述的組合物，其中免疫活性抗原表位或蛋白質(zhì)具有能結(jié)合GAG的氨基酸序列，所述GAG選自肝素及其類似物。21.如權(quán)利要求20所述的組合物，其中免疫活性抗原肽或蛋白質(zhì)，單獨地或者與抗體一起，具有補體激活活性。22.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中免疫活性表位是多個肽，它們結(jié)合起來形成一個單一的多肽。23.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中免疫活性抗原表位包括T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。24.如權(quán)利要求1或3所述的組合物，其中病原體相關(guān)分子模式選自(a)TLR1受體激動劑(b)TLR2受體激動劑(c)TLR3受體激動劑(d)TLR4受體激動劑(e)TLR5受體激動劑(f)TLR6受體激動劑(g)TLR7受體激動劑(h)TLR8受體激動劑(i)TLR9受體激動劑(i)NOD-l激動劑；(k)NOD-2激動劑；(1)DC-SIGN;(m)L國SIGN;禾口(n)甘露糖受體。25.如權(quán)利要求24所述的組合物，其中病原體相關(guān)分子模式是NOD-l激動劑或者NOD-2激動劑，并且該NOD-l激動劑或者NOD-2激動劑選自細(xì)菌肽葡聚糖及細(xì)菌肽葡聚糖的衍生物。26.—種鑒別免疫活性肽的方法，該免疫活性肽能干預(yù)病原體的糖胺聚糖結(jié)合作用，所述方法包括如下步驟(a)進(jìn)行肝素吸附；(b)進(jìn)行免疫親和選擇；和(c)任選地，對通過免疫親和選擇分離的一種或多種蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白水解消化，以便產(chǎn)生免疫活性肽。27.—種鑒別免疫活性肽的方法，該免疫活性肽能干預(yù)病原體結(jié)合的糖胺聚糖結(jié)合作用，所述方法包括利用多堿價線性基序，使用生物信息學(xué)分析方法，分析序列數(shù)據(jù)。28.—種鑒別補體活化免疫活性肽的方法，該方法包括如下步驟(a)進(jìn)行補體固定抗體與補體蛋白質(zhì)的結(jié)合；(b)使用用于蛋白質(zhì)抗原的免疫親和選擇的抗體；和(C)任選地，進(jìn)行分離的蛋白質(zhì)抗原的蛋白水解消化。29.通過權(quán)利要求26、27或28產(chǎn)生的免疫活性肽。30.基于權(quán)利要求29的已鑒別免疫活性肽的保護(hù)性抗體，用于克服宿主生物的疾病。31.如權(quán)利要求l、2或3所述的組合物，其中分子以混合物出現(xiàn)。32.如權(quán)利要求1、2或3所述的組合物，其中分子通過化學(xué)方法連接在一起。33.如權(quán)利要求l、2或3所述的組合物，其中載體是微粒。34.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中微粒有窄的大小分布范圍。35.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中微粒是多孔的。36.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中微粒的直徑小于大約10pm。37.如權(quán)利要求36所述的組合物，其中微粒的直徑小于大約5pm。38.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中微粒是用生物聚合物制成的。39.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中免疫活性抗原表位非共價結(jié)合到微粒上。40.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中免疫活性抗原表位共價結(jié)合到微粒上。41.一種在對象中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括的步驟是施用免疫有效量的組合物，該組合物包括至少一種免疫活性抗原表位和至少一種與微粒相關(guān)的病原體識別(PR)受體激動劑，其中微粒比病原體小或者與病原體的大小范圍相同。42.如權(quán)利要求41所述的組合物，其中該組合物包括不止一種病原體識別受體激動劑。43.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中不止一種免疫活性抗原表位和不止一種病原體識別受體激動劑與微粒相結(jié)合。44.如權(quán)利要求43所述的組合物，其中不止一種免疫活性抗原表位包括T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。45.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中其中不止一種識別受體激動劑與微粒相關(guān)聯(lián)。46.—種體內(nèi)投遞免疫活性組合物的方法，以便在對象中引發(fā)免疫應(yīng)答，該方法包括的步驟有施用免疫上有效量的組合物，該組合物包括至少一種與微粒相關(guān)的病原體識別(PR)受體激動劑，其中微粒比病原體小或者與病原體的大小范圍相同。47.—種體內(nèi)投遞免疫活性組合物的方法，以便在對象中引發(fā)免疫應(yīng)答，該方法包括的步驟有施用免疫上有效量的組合物，該組合物包括至少一種免疫活性抗原表位，和至少一種與微粒相關(guān)的病原體識別(PR)受體激動劑，其中微粒比病原體小，或者與病原體的大小范圍相同。48.如權(quán)利要41、46或47所述的組合物，其中組合物的施用通過粘膜途徑發(fā)生。49.如權(quán)利要41、46或47所述的組合物，其中組合物的施用通過腸胃外途徑發(fā)生。50.如權(quán)利要41、46或47所述的組合物，其中組合物的施用通過皮膚途徑發(fā)生。51.—種引發(fā)針對至少一種病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，該方法包括的步驟有以單劑量或多劑量，施用免疫有效量的組合物，該組合物包括一種或多種免疫活性抗原表位，和與微粒相結(jié)合的PR受體激動劑組合，其中所述微粒比病原體小或者與病原體的大小范圍相同，并且免疫應(yīng)答包括Thl反應(yīng)或Th2反應(yīng)，或者Thl反應(yīng)和Th2反應(yīng)的組合。52.—種引發(fā)針對至少一種病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，該方法包括的步驟有以單劑量或多劑量施用免疫有效量的組合物，該組合物包括一種或多種免疫活抗原表位，排除了參與免疫活性逃逸機(jī)制的抗原，以及包括與微粒相聯(lián)合的PR受體激動劑的組合，其中所述微粒比病原體小或者與病原體的大小范圍相同。53.如權(quán)利要41、46、47、51或52所述的組合物，其中免疫應(yīng)答干預(yù)致病微生物上的粘多糖結(jié)合元件。54.—種引發(fā)針對至少免疫活性試劑的耐受性的方法，該方法包括的步驟有施用免疫有效量的組合物，該組合物包括一種或多種免疫活抗原表位，以及與微粒相聯(lián)合的PR受體激動劑的組合，其中所述微粒比病原體小或者與病原體的大小范圍相同，免疫應(yīng)答包括調(diào)節(jié)反應(yīng)的誘導(dǎo)，或免疫功能或免疫逃逸的下調(diào)。55.如權(quán)利要求54所述的組合物，其中，該組合物在其中包括免疫活性抗原表位，免疫活性抗原表位具有含脂部分。56.如權(quán)利要求55所述的組合物，其中，免疫活性的含脂部分附著到微粒上，獨立于免疫活性抗原表位。57.如權(quán)利要求54所述的組合物，其中，免疫活性的含脂部分具有碳水化合物組分。58.如權(quán)利要求57所述的組合物，其中碳水化合物組分是N-糖基化的結(jié)果。59.如權(quán)利要求54所述的組合物，其中免疫活性抗原表位包括含有至少一個氨基酸的基序，該氨基酸選自天冬酰胺、蘇氨酸和絲氨酸，其中基序是Asp-X-Ser或Asp-X-Thr基序，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。全文摘要本發(fā)明提供了一種微粒載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括一種或多種蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物、脂或其它生物活性物質(zhì)，其上附著或者未附著導(dǎo)向分子。此外，本發(fā)明也提供了免疫調(diào)節(jié)組合物，和在非感染和感染宿主中引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，以及免疫耐受性的誘導(dǎo)。文檔編號A61K39/395GK101370518SQ200680010442公開日2009年2月18日申請日期2006年1月30日優(yōu)先權(quán)日2005年1月28日發(fā)明者L·斯蒂普科維茨,P·格蘭迪克斯,S·紹特馬里申請人:蓋倫生物公司