專利名稱：含有pedf以及fgf2的伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的治療藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用攜帶神經(jīng)營養(yǎng)因子的慢病毒載體治療伴隨眼組織 細胞凋亡變性的疾患的治療藥物。技術(shù)背景對眼科領(lǐng)域的疾患而言，不適當?shù)闹委煏е轮旅ば缘闹匕Y發(fā)生。由 于沒有根本性的治療方法，不得不依賴對癥療法治療的疾病不在少^:。最 近，發(fā)現(xiàn)眼科領(lǐng)域中一部分重癥疾病的發(fā)生和惡化是與凋亡相關(guān)的。視網(wǎng)膜色素變性是一種多發(fā)性視網(wǎng)膜的視細胞層以及色素上皮層病 變，可導致凋亡發(fā)生的治愈困難的遺傳性疾患。視細胞大致分為桿體和推 體兩種細胞。桿體主要分布在稍微偏離視網(wǎng)膜中心的部位，與暗視條件下 的物體辨別以及視野的寬狹等有關(guān)。推體大多分布在視網(wǎng)膜中心的黃斑部 位，主要與中心視力以及色覺等有關(guān)。視網(wǎng)膜色素變性，由于視細胞受到 傷害，表現(xiàn)出夜盲，視野狹窄，視力下降的癥狀，隨著病情發(fā)展致盲的病 例很多。視網(wǎng)膜色素變性中的一部分疾病是由于視細胞和視網(wǎng)膜色素上皮 細胞特異性功能基因異常而引起的，大部分的視網(wǎng)膜色素變性至今仍然原 因不明。作為目前為止已搞清的致病基因，在常染色體隱性遺傳性視網(wǎng)膜 色素變性中已知有桿體的cGMP-磷酸二酯酶a以及b亞單位，桿體的環(huán)核 苷酸門控陽離子通道，視網(wǎng)膜的鳥氨酸環(huán)化酶，RPE65,細胞視黃醛結(jié)合蛋 白，停滯因子等基因。另外常染色體顯性遺傳性視網(wǎng)膜色素變性中已知有 視紫紅質(zhì)，盤膜邊緣蛋白/視網(wǎng)膜緩慢變性(RDS, retinal degeneration slow 的縮略語)，桿體外節(jié)盤膜蛋白(ROMl), X-連鎖視網(wǎng)膜色素變性中視網(wǎng)膜色 素變性GTP酶調(diào)節(jié)因子(RPGR)等基因。診斷是通過眼底觀察(陳舊性病 例為視網(wǎng)膜血管狹小，粗糙的芝麻鹽狀視網(wǎng)膜，骨小體樣色素沉著。非陳 舊性病例為無色素，白斑等)，視野(與向心性，環(huán)狀，地圖狀，中心性 等病變部位對應(yīng)的狹窄)，暗適應(yīng)(暗適應(yīng)曲線的第2次曲線閾值上升)， 視力下降，電生理學觀察(視網(wǎng)膜電圖(ERG)的振幅下降甚至消失)，熒光 眼底造影觀察(視網(wǎng)膜色素上皮萎縮以及視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜萎縮引起的高焚光) 進行判斷的。目前，尚無視網(wǎng)膜色素變性的有效治療方法，僅僅是采用對癥療法， 但是基因治療，視網(wǎng)膜移植，人工視網(wǎng)膜等的治療方法的研究正在開展之 中。使用神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因治療就是其中之一。據(jù)報道神經(jīng)營養(yǎng)因子對抑制凋亡有效。神經(jīng)營養(yǎng)因子的成纖維細胞生長因子2 (fibroblast growth factor 2: FGF2)通過使用視網(wǎng)膜光損傷模型(非專利文獻l),視網(wǎng)膜色 素變性模型(非專利文獻2-6),視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷(缺血再灌流，視 神經(jīng)切斷)模型(非專利文獻7)等的動物實驗，探討了其對眼科領(lǐng)域中的 基因治療的應(yīng)用。另外，本發(fā)明人還探討了神經(jīng)營養(yǎng)因子之一的色素上皮 衍生因子(Pigment epithelium derived factor: PEDF )在一見網(wǎng)膜色素變性的 治療上的應(yīng)用(非專利文獻8)。本發(fā)明人們還通過向具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的猴 免疫缺陷病毒(SIV: simian immunodeficiency vims )骨架的SIV載體中插 入PEDF，構(gòu)建了 SIV-PEDF載體，并進行了模型動物的探討，得到了良好 的結(jié)果(非專利文獻8 )。但是，對于最終致盲的重癥疾患的視網(wǎng)膜色素 變性，仍需要開發(fā)能發(fā)揮更高療效的治療方法。專利文獻1 :國際申請?zhí)朠CT/JP2002/005225 國際公開號 WO2002/101057專利文獻2:國際申請?zhí)朠CT/JP00/03955 國際公開號WO00/078987非專利文南史1: Lau D, Flannery J. Viral-mediated FGF-2 treatment of the constant light damage model of photoreceptor degeneration. Doc Ophthalmol. 2003 Jan;106(l):89-98.非專利文南足2: Akimoto M， Miyatake S, Kogishi J, Hangai M, Okazaki K, Takahashi JC， Saiki M, Iwaki M, Honda Y. Adenovirally expressed basic fibroblast growth factor rescues photoreceptor cells in RCS rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999 Feb;40(2):273-9.非專利文獻3: Uteza Y， Rouillot JS, Kobetz A, Marchant D, Pecqueur S, Arnaud E, Prats H, Honiger J, Dufier JL, Abitbol M, Neuner-Jehle M. Intravitreous transplantation of encapsulated fibroblasts secreting the human fibroblast growth factor 2 delays photoreceptor cell degeneration in Royal College of Surgeons rats. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar
16;96(6):3126-31.非專利文獻4: Neuner-Jehle M, Berghe LV， Bonnel S， Uteza Y， Benmeziane F, Rouillot JS, Marchant D, Kobetz A, Dufier JL, Menasche M, Abitbol M. Ocular cell transfection with the human basic fibroblast growth factor gene delays photoreceptor cell degeneration in RCS rats. Hum Gene Ther. 2000 Sep l;ll(13):1875-90.非專利文獻5: Lau D, McGee LH， Zhou S, Rendahl KG, Manning WC, Escobedo JA, Flannery JG. Retinal degeneration is slowed in transgenic rats by AAV-mediated delivery of FGF-2. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 Oct;41(ll):3622-33.非專利文獻6: Spencer B, Agarwala S, Gentry L, Brandt CR. HSV-1 vector-delivered FGF2 to the retina is neuroprotective but does not preserve functional responses. Mol Ther. 2001 May;3(5 Pt 1):746-56.非專利文獻7: Sapieha PS, Peltier M, Rendahl KG, Manning WC, Di Polo A. Fibroblast growth factor-2 gene delivery stimulates axon growth by adult retinal ganglion cells after acute optic nerve injury. Mol Cell Neurosci. 2003 Nov;24(3):656-72.非專利文獻8: Miyazaki M, Ikeda Y, Yonemitsu Y, Goto Y, Sakamoto T， Tabata T, Ueda Y, Hasegawa M, Tobimatsu S, Ishibashi T， Sueishi K. Simian lentiviral vector-mediated retinal gene transfer of pigment epithelium-derived factor protects retinal degeneration and electrical defect in Royal College of Surgeons rats.Gene Ther. 2003 Aug;10(17):1503-11.非專利文獻9 : Wahlin KJ， Campochiaro PA, Zack DJ， Adler R. Neurotrophic factors cause activation of intracellular signaling pathways in Muller cells and other cells of the inner retina, but not photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 ;41(3):927陽36.非專利文獻10: Valter K, van Driel D, Bisti S, Stone J. FGFRl expression and FGFRl-FGF-2 colocalisation in rat retina: sites of FGF-2 action on rat photoreceptors. Growth Factors. 2002 ;20(4): 177-88.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為鑒于這種狀況的發(fā)明，本發(fā)明要解決的問題是發(fā)現(xiàn)一種新的 伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的治療方法。本發(fā)明人為徹底解決上述問題，進行了銳意研究，想到了用兩種神經(jīng)營養(yǎng)因子PEDF和FGF2進行同時給藥的方法。通常認為PEDF和FGF2 的作用部位相異。PEDF的作用部位為視網(wǎng)膜的視細胞以及神經(jīng)節(jié)細胞，而 FGF2的作用部位則有FGF2受體位于視網(wǎng)膜的內(nèi)顆粒層的報道(非專利文 獻9 )和位于視細胞的報道(非專利文獻10 )。如果進行PEDF和FGF2的 同時給藥的話，通過兩者的協(xié)同作用，與以往相比可以獲得更好的效果。 本發(fā)明人構(gòu)建了 SIV-PEDF載體以及SIV-FGF2載體。SIV載體是以猴免疫 缺陷病毒作為骨架的載體，由于可能使導入的外源基因在宿主內(nèi)持續(xù)表達， 在慢性疾病的治療中，能夠提供特別適當?shù)乃幬飩鬏?。在RCS大鼠視網(wǎng)膜 色素變性疾病模型的網(wǎng)膜下腔進行上述載體給藥，并對其效果進行了探討。 載體給藥4周后，摘取大鼠后眼部分，對PEDF以及FGF2的表達量進行了 測定，證實SIV-hPEDF、 SIV-hFGF2載體給藥可以致使hPEDF以及hFGF2 基因表達。另外，在計數(shù)殘存視細胞數(shù)量時，可以觀察到單獨給藥組也有 視細胞保護效果，同時給藥組比單獨給藥組有更顯著的視細胞保護效果。 進而，通過視網(wǎng)膜電圖對視網(wǎng)膜的功能進行了評價，表明單獨給藥組，同 時給藥組這兩組都有功能維持的作用，但是同時給藥組的效果與單獨給藥 組相比具有更加顯著的效果。而且，在載體給藥8周后以及12周后，也表 明SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2載體的同時給藥有顯著的神經(jīng)保護效果。本 發(fā)明人從上述結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)，PEDF以及FGF2的同時給藥對視網(wǎng)膜色素變 性療效有更高的效果。PEDF以及FGF2的同時給藥不僅僅對視網(wǎng)膜色素變 性，而且對伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的治療也是有效的。也就是說， 本發(fā)明是通過FGF2以及PEDF的同時給藥對伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾 患進行治療的，并就以下的發(fā)明進行更加具體的說明。[1] 一種伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患治療用藥品，其特征是與 藥學可使用的介質(zhì)一起，包含下述(a)到(d)的任意 一種。(a) 色素上皮書f生因子(Pigment印ithelium derived factor: PEDF )基 因以及成纖維細胞生長因子2 ( fibroblast growth factor 2: FGF2 )基因(b) 色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor: PEDF)蛋 白質(zhì)以及成纖維細胞生長因子2 ( fibroblast growth factor 2: FGF2 )蛋白質(zhì) (c) 色素上皮書亍生因子(Pigment epithelium derived factor: PEDF )基 因以及成纖維細胞生長因子2 ( fibroblast growth factor 2: FGF2 )蛋白質(zhì)(d) 色素上皮書亍生因子(Pigment epithelium derived factor: PEDF )蛋 白質(zhì)以及成纖維細胞生長因子2 ( fibroblast growth factor 2: FGF2 )基因[2] 項[l]中記述的藥品，其特征是包含帶有PEDF基因以及FGF2 基因的重組猴免疫缺陷病毒載體的藥品，該PEDF基因以及FGF2基因分別 由不同的重組猴免疫缺陷病毒載體帶有，或者由一個重組猴免疫缺陷病毒 載體帶有。[3] 項[2]中記述的藥品，其特征是包含帶有PEDF基因的重組猴免 疫缺陷病毒載體以及帶有FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒載體。[4] 項[2]中記述的藥品，其中，包含帶有PEDF基因以及FGF2基因 的重組猴免疫缺陷病毒載體。[5] 項[2]到[4]的任意一項中記述的藥品，其中，猴免疫缺陷病毒載體 包含cPPT序列和/或WPRE序列。[6] 項[2]到[5]的任意一項中記述的藥品，其中，猴免疫缺陷病毒載體 用VSV-G進行假型化。[7] 項[2]到[6]的任意一項中記述的藥品，其中，猴免疫缺陷病毒載體 是來源于agm抹。[8] 伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的治療用試劑盒，其特征是包 含帶有PEDF基因的重組猴免疫缺陷病毒載體的混合物、以及包含帶有 FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒載體的混合物。[9] 伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的治療用試劑盒，其特征是內(nèi) 含包含帶有PEDF基因以及FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒載體的混合 物。[10〗 項[1]到[7]的任意一項中記述的藥品或者權(quán)利要求[8]或者[9]中 記述的試劑盒，其特征是伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患是指視網(wǎng)膜色 素變性，青光眼、視網(wǎng)膜脫落、視網(wǎng)膜缺血性疾病中的任意一種。[11] 伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的治療方法，其特征是用 PEDF以及FGF2或者編碼它們的基因進行給藥。[l2] 項[ll]中記述的治療方法，其特征是用帶有PEDF基因的重組 猴免疫缺陷病毒載體以及帶有FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒載體進行 給藥。[13] 項[12]中記述的治療方法，其特征是用帶有PEDF基因的重組 猴免疫缺陷病毒載體以及帶有FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒栽體進行 視網(wǎng)膜下腔給藥。[14] 項[ll]中記述的治療方法，其特征是用帶有PEDF基因以及 FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒載體進行給藥。[l5] 項[1司中記述的治療方法，其特征是用帶有PEDF基因以及 FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒載體進行一見網(wǎng)膜下腔給藥。[16] 伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的治療用藥品的制造方法，其 特征是包括利用包含在序列號1所記述的堿基序列中插入PEDF基因 的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備帶有PEDF基因的重組猴免疫缺陷病毒載 體的工藝。[17] 項[16]中記述的方法，其特征是包括利用包含序列號2所 記述的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備帶有PEDF基因的重組猴免疫缺陷病 毒載體的工藝。[18] 伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的治療用藥品的制造方法，其 特征是包括利用包含在序列號1所記述的堿基序列中插入FGF2基因 堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備帶有FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒載體 的工藝。[19] 項[18]中記述的方法，其特征是包括利用包含序列號3所 記述的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備帶有FGF2基因的重組猴免疫缺陷病 毒載體的工藝。[20] 伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的治療用藥品的制造方法，其 特征是包括利用含在序列號1所記述的堿基序列中插入PEDF基因以 及FGF2基因的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備帶有PEDF基因以及FGF2基 因的重組猴免疫缺陷病毒載體的工藝。[21] 項[16]到[20]中的任意一項中記述的方法，其特征是包括向?qū)?入有包含序列號4所記述的堿基序列的包裝載體的包裝細胞導入該基因 轉(zhuǎn)移載體的工藝。示意圖的簡單說明


圖1:為改造型基因轉(zhuǎn)移載體，改造型包裝載體，rev表達載體，VSV-G表達載體結(jié)構(gòu)的示意圖。圖2A:由原始型基因轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建改造型基因轉(zhuǎn)移載體的工藝的示意圖。(cx)表示下接圖2B的工藝。圖2B:為圖2A的延續(xù)圖。(a)表示上接圖2A的工藝。圖3:由原始型包裝載體構(gòu)建改造型包裝載體工藝的示意圖。圖4A: rev表達載體的構(gòu)建工藝的示意圖。((3)表示下接圖4B的工藝。圖4B:表示圖4A的延續(xù)圖。(p)表示上接圖4A的工藝。圖5: (a)為原始型基因轉(zhuǎn)移載體中cPPT單獨，WPRE單獨，cPPT以及WPRE同時攜帶的載體結(jié)構(gòu)的示意圖。(b)MOI為15的感染情況下，利用cPPT單獨，WPRE單獨，cPPT和WPRE同時攜帶的各種基因轉(zhuǎn)移載體時，觀察到的SIV載體產(chǎn)量的照片。左上原始型的無cPPT,WPRE的載體(對照)(-cPPT,-WPRE )，右上cPPT單獨攜帶(十cPPT，-WPRE ),左下WPRE單獨攜帶(-cPPT,十WPRE ),右下cPPT,WPRE同時攜帶(+cPPT，+WPRE )。圖6:為利用cPPT單獨，WPRE單獨，cPPT和WPRE同時攜帶的各基因轉(zhuǎn)移載體時，用外源基因(EGFP)陽性細胞數(shù)目比例對SIV載體的產(chǎn)量進行探討的結(jié)果。(a) 表中的MOI表示的是每個細胞中所感染的載體粒子數(shù)目，0.3, 1.5, 7.5, 15表示的是實際進行感染實驗的M01 (載體粒子數(shù)量/細胞數(shù)目)的數(shù) 值。在cPPT或者WPRE后面添加的(+ )號表示的是載體中含有cPPT或 者WPRE，(-)號表示的是載體中不含cPPT或者WPRE。表中數(shù)字為EGFP 陽性細胞的比例(百分率％)。(b) 圖為(a)表的數(shù)值圖形化表示。圖的縱坐標表示的是EGFP陽性細胞 的比例(百分率％)。圖7:表示的是MOI為15的感染情況下，利用cPPT單獨，WPRE單 獨，cPPT和WPRE同時攜帶的各種基因轉(zhuǎn)移載體時，基因?qū)爰毎邢鄬?細胞數(shù)量的蛋白表達量的比較結(jié)果。數(shù)值表示的是熒光強度的相對值(為 蛋白表達量的比較尺度)。圖8:是表示對RCS大鼠進行SIV-hPEDF載體單獨給藥，SIV-hFGF2 載體單獨給藥，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2載體同時給藥，并且同時給與SIV-EGFP的情況下，hPEDF蛋白質(zhì)的表達量以及hFGF2蛋白質(zhì)的表達量 的圖形。圖9:是表示對RCS大鼠進行SIV-hPEDF載體單獨給藥，SIV-hFGF2 載體單獨給藥，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2載體同時給藥，并且同時給與 SIV-EGFP的情況下，給藥后4周的殘存視細胞數(shù)量的圖形。圖10:是表示對RCS大鼠進行SIV-hPEDF載體單獨給藥，SIV-hFGF2 載體單獨給藥，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2載體同時給藥，并且同時給與 SIV-EGFP的情況下，給藥后8周的殘存視細胞數(shù)量的圖形。圖11:是表示對RCS大鼠進行SIV-hPEDF載體單獨給藥，SIV-hFGF2 載體單獨給藥，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2載體同時給藥，并且同時給與 SIV-EGFP的情況下，給藥后12周的殘存視細胞數(shù)量的圖形。圖12:是表示對RCS大鼠進行SIV-hPEDF載體單獨給藥，SIV-hFGF2 載體單獨給藥，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2載體同時給藥，并且同時給與 SIV-EGFP的情況下的視網(wǎng)膜電圖的結(jié)果圖。圖13:是表示對RCS大鼠進行SIV-hPEDF載體單獨給藥，SIV-hFGF2 載體單獨給藥，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2載體同時給藥，并且同時給與 SIV-EGFP的情況下的視網(wǎng)膜電圖的結(jié)果圖。發(fā)明的具體實施方式
本發(fā)明涉及一種利用色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor: PEDF )以及成纖維細胞生長因子2 ( fibroblast growth factor 2: FGF2 ) 治療伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的藥品。本發(fā)明人著眼于PEDF和 FGF2的凋亡抑制作用的靶細胞的不同，對于伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾 患，PEDF或者FGF2的同時給藥比它們?nèi)我獾膯为毥o藥都有更加顯著的效 果。在本發(fā)明的藥品中所包含的PEDF和FGF2，即可以是蛋白質(zhì)，也可以 是基因。人類PEDF(hPEDF)蛋白質(zhì)的氨基酸序列用序列號5,人類FGF2 (hFGF2)蛋白質(zhì)的氨基酸序列用序列號6來表示。另外hPEDF的cDNA 序列用序列號7， hFGF2蛋白質(zhì)的cDNA序列用序列號8來表示。包含在本發(fā)明的醫(yī)藥品中的PEDF基因和FGF2基因可以用實驗室常規(guī) 方法進行制備。例如可以將序列號7或者序列號8中記述的堿基序列 的一部分或者全部作為^l笨針，通過人^L網(wǎng)膜色素上皮細胞的cDNA文庫進 行制備?；蛘邔⑿蛄刑?或者序列號8中記述的堿基序列的一部分作為 引物，用人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的mRNA作為模板，使用常用的核酸擴增 法可進行制備。從上述基因制備本發(fā)明的藥品的情況下，即使DNA的狀態(tài) 不錯，但是最優(yōu)選的是處于插入載體狀態(tài)的。PEDF基因以及FGF2基因可 以分別由不同的載體帶有，也可以同時由一個載體帶有。作為藥品使用的 載體種類，只要是完全符合安全的載體是沒有限制的，但最好是慢病毒載 體，最優(yōu)選的是猴免疫缺陷病毒載體。病毒的生命周期大致分為感染和增殖兩個階段。其特征在于， 一般來 說病毒載體利用病毒的感染系統(tǒng)，可將基因高效地導入宿主細胞內(nèi)。為確 保安全性，去除了多數(shù)病毒載體的增殖系統(tǒng)，使其缺失自我復制能力，防 止在導入的細胞內(nèi)增殖。對載體粒子的結(jié)構(gòu)做一 筒單的說明，載體粒子中有被稱作衣殼的蛋白 質(zhì)外殼。衣殼是由gag基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)構(gòu)成的。其衣殼的外側(cè)有稱作 被膜的膜結(jié)構(gòu)。被膜具有決定所感染細胞種類的功能。在衣殼中，存在2 份載體基因組RNA拷貝和pol基因產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄酶。病毒載體一旦感染宿 主細胞，載體基因組RNA就會通過自己的上述逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄，之后 整合進宿主染色體，成為前病毒DNA,而具有感染能力。一般來說病毒載體可以通過包裝載體和基因轉(zhuǎn)移載體進行制備。包裝 載體攜帶有除去了包裝信號的病毒DNA。病毒DNA含有病毒蛋白質(zhì)序列。 將包裝載體導入宿主后，在宿主細胞(包裝細胞)中，由于沒有包裝信號， 形成空的病毒顆粒。另一方面，基因轉(zhuǎn)移載體攜帶有整合進宿主染色體DNA 所必需的來源于病毒的基因序列及要導入的外源基因。將這個基因轉(zhuǎn)移載 體導入到包裝細胞后，由基因轉(zhuǎn)移載體提供的載體基因組DNA被整合進宿 主染色體，通過轉(zhuǎn)錄形成載體基因組RNA。該載體基因組RNA被包埋進包 裝細胞產(chǎn)生的病毒顆粒中，生成具有導入核酸分子進入宿主內(nèi)部能力的病 毒顆粒。在本發(fā)明中的"病毒載體"是指缺乏自我復制能力，具有將核酸分子 導入宿主內(nèi)部的能力的病毒顆粒。"重組"病毒載體是指通過基因重組技 術(shù)構(gòu)建的病毒載體。利用編碼病毒基因組的DNA和包裝細胞構(gòu)建的病毒載 體包含在重組病毒載體中。本發(fā)明中的"猴免疫缺陷病毒(SIV)載體"是指在病毒顆粒中的核酸
分子內(nèi)，作為病毒載體功能所必需的序列為SIV基因組由來序列的載體。 本發(fā)明中的"作為病毒載體功能所必需的序列，，是指從5，端開始順次為5'LTR的R區(qū)域、U5區(qū)域，包裝信號(cp) ， RRE, 3'LTR的啟動子區(qū)域 以外的U3區(qū)域，R區(qū)域序列。從5，LTR區(qū)域開始到包裝信號的堿基序列表 示為序列號9, RRE序列表示為序列號10,缺失3'LTR的啟動子區(qū)域的 U3區(qū)域到R區(qū)域的堿基序列表示為序列號11。本發(fā)明中的SIV載體只要 與上述定義相符也可加以改造，例如，"作為病毒載體功能所必需的序列" 只要來自SIV,其他來自SIV的序列或者來自SIV以外的序列也可以包含 在內(nèi)。作為可包含的最適序列來講，例如可以列舉后面記述的cPPT ( central polypurine tract), 內(nèi)魯卩啟動子(CMV) ， WPRE ( woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。在本發(fā)明中，猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency vims; SIV )包 括有SIV的所有抹以及其亞型。作為SIV單離林來說，可以例舉出SIVagm, SIVcpz， SIVmac， SIV腿d， SIVsm, SIVsnm, SIVsyk等來，但并不僅僅于 這些病毒抹。猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Vims, SIV)是作為猴子的 HIV樣病毒被發(fā)現(xiàn)的，與HIV —起構(gòu)成靈長類慢病毒(Primates Lentivims ) 群(井戶榮治，速水正憲，fvL免疫不全々O義co遺伝子t感染 病原性. 蛋白質(zhì)核酸酵素Vol,.39,No.8. 1994)。進而這個群又大致分類為四個群 1)包含成為人類獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immune deficiency syndrome, AIDS )病因的HIV-1和從黑猩猩分離的SIVcpz的HIV-1群，2)從 白頂白眉浙吳(Cercocebus atys )分離的SIVsmm和《彌浙吳(Macaca mulatta )分 離的SIVmac，以及對人類感染頻率較低的，具有病原性的HIV-2 ( Jaffar, S. et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retroviral., 16(5), 327-32, 1997 )構(gòu) 成的HIV-2群，3)由非洲綠猴(Cercopithecus aethiops )分離出來的SIVagm 為代表的SIVagm群，4)由山魈(Papio sphinx)分離出來的SIVmnd為代 表的SIVmnd群組成。其中，SIVagm以及SIVmnd沒有自然宿主的病原性才艮道(Ohta， Y. et al., Int. J. Cancer, 15, 41(1)， 115-22, 1988; Miura, T. et al., J. Med. Primatol" 18(3-4)， 255-9， 1989;速水正憲，日本臨床，47, 1， 1989 ),特別是在本實施例 中使用的SIVagm中的一種TYO-1抹，據(jù)報道即使是在自然宿主中，對食
蟹猴(Macaca facicularis ),獼猴 (Macaca mulatta)的感染實驗中也為表 現(xiàn)出病原性(Ali, M. et al, Gene Therapy, 1(6)， 367-84， 1994; Honjo, S. et al., J. Med. Primatol., 19(1)， 9-20， 1990)。由于沒有關(guān)于SIVagm對人類感染，致 病的報道，對人類的病原性不得而知， 一般來說，靈長類的慢病毒有很高 的種特異性，從自然宿主致使其他種類感染，致病的病例很少，并且具有 其致病頻率低或者進程緩慢的傾向。(Novembre， F. J. et al., J. Virol" 71(5), 4086-91,1997 )。因此，以SIVagm、特別是SIVagm TYO-l抹為基礎(chǔ)制備 的病毒載體同以HIV-1以及其他慢病毒為基礎(chǔ)制備的載體相比，安全性更 高，最適合在本發(fā)明中使用。SIVagm TYO-l林的基因組堿基序列用序列號 12來表示。本發(fā)明的猴免疫缺陷病毒載體可以擁有其它逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組RNA 序歹'J的一部分。例如，具有人類免疫在夾陷病毒(Human Immunodeficiency Virus; HIV)，貓免疫在夾陷病毒(Feline Immunodeficiency Vims: FIV) (Poeschla, E. M. et al.， Nature Medicine, 4(3), 354-7, 1998 )，山羊關(guān)節(jié)炎腦 炎病毒(Caprine Arthritis Encephalitis Virus: CAEV ) ( Mselli-Lakhal， L. et al" Arch. Virol., 143(4), 681-95, 1998 )等其他慢病毒基因組序列的一部分與猴免 疫缺陷病毒基因組一部分相置換而成的嵌合序列的載體也包含在本發(fā)明的 猴免疫缺陷病毒載體中。帶有本發(fā)明的色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor: PEDF )基因的重組猴免疫缺陷病毒載體(SIV-PEDF載體)是指攜帶PEDF 基因的重組SIV載體。另外帶有本發(fā)明的FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒 載體(SIV-FGF2載體)是指攜帶FGF2基因的重組SIV載體。還有帶有本發(fā) 明的PEDF基因以及FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒載體是指攜帶PEDF 基因和FGF2基因兩種基因的重組SIV載體。本發(fā)明的SIV-PEDF載體只要 符合上述定義，是與種類以及結(jié)構(gòu)無關(guān)的，最優(yōu)選的例子可例舉利用包含 在序列號1中記述的堿基序列中插入PEDF基因堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體 來制備SIV載體，更優(yōu)選的例子可例舉利用包含序列號2中記述的堿基序 列的基因轉(zhuǎn)移載體制備的SIV載體。同樣，本發(fā)明的SIV-FGF2載體只要符 合上述定義，是與種類以及結(jié)構(gòu)無關(guān)的，最優(yōu)選的例子可例舉利用包含在 序列號1中記述的堿基序列中插入PEDF基因堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制 備SIV載體，更優(yōu)選的例子可例舉利用包含序列號3中記述的堿基序列的
基因轉(zhuǎn)移載體制備SIV載體。另外同樣，帶有本發(fā)明的PEDF基因以及FGF2 基因的重組猴免疫缺陷病毒載體只要符合上述定義，是與種類以及結(jié)構(gòu)無 關(guān)的，最優(yōu)選的例子可例舉利用包含在序列號l中記述的堿基序列中插入 PEDF基因以及FGF2基因的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備SIV載體。帶有SIV-PEDF載體以及SIV-FGF2載體等的本發(fā)明的PEDF基因和/ 或FGF2基因的SIV載體可以進行VSV-G假型化。VSV-G假型化是指，使 載體的被膜包含水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus; VSV)的表面糖 蛋白質(zhì)VSV-G蛋白而言的。VSV-G蛋白可以是來源于任意VSV抹的蛋白。 例如，可以使用來自Indiana血清型毒抹(J. Virology 39: 519-528 (1981)) 的VSV-G蛋白，但不僅局限于此。另外，VSV-G蛋白可以是天然蛋白質(zhì)的 衍生物，通過一個或者多個氨基酸發(fā)生置換、缺失、和/或增加等得到的修 飾蛋白。VSV-G假型化載體可以在病毒產(chǎn)生時通過與VSV-G蛋白共存來制 備。例如，通過VSV-G表達載體的轉(zhuǎn)染，來自整合入宿主染色體DNA的 VSV-G基因的表達誘導，或者通過使VSV-G在包裝細胞內(nèi)進行表達，經(jīng)由 這個細胞產(chǎn)生的病毒顆粒可以被VSV-G假型化。由于VSV-G蛋白質(zhì)是一 種糖蛋白會形成一種穩(wěn)定的3聚體，存在于細胞膜上，因此純化過程中不 會引起載體粒子的破壞，可以用離心進行高濃度的濃縮(Yang, Y. et al., Hum GeneTher: Sep, 6(9), 1203-13. 1995 )。SIV-PEDF載體以及SIV-FGF2載體等的帶有本發(fā)明的PEDF基因和/ 或FGF2基因的SIV載體可以進一步含有來自其它病毒的被膜蛋白。例如， 作為這種蛋白質(zhì)，最好是來自感染人類細胞的病毒被膜蛋白。對這種蛋白 質(zhì)沒有特別的限定，可例舉出逆轉(zhuǎn)錄病毒的兼嗜性病毒被膜蛋白等。作為 這種逆轉(zhuǎn)錄病毒的兼嗜性病毒被膜蛋白，例如可以使用來自小鼠白血病病 毒(MuMLV ) 4070A抹的被膜蛋白。另外，也可以使用來自MuMLV 10A1 的凈皮月莫蛋白(例如pCL-lOAl(Imgenex) ( Naviaux, R. K. et al.， J. Virol. 70: 5701-5705 (1996))。另外，作為皰滲病毒科的蛋白，可以舉出例如，單純性 皰瘆病毒的gB, gD, gH, gp85蛋白，EB病毒的gp350, gp220蛋白等。 作為嗜肝病毒科的蛋白，可以例舉出B型肝炎病毒的S蛋白等。對于本發(fā)明的重組猴免疫缺陷病毒載體來說，可以對LTR( long terminal repeat)進行改造。LTR為逆轉(zhuǎn)錄病毒特征性序列，位于病毒基因組的兩端。 5'LTR作為啟動子發(fā)揮作用，促進來自前病毒的mRNA轉(zhuǎn)錄。因此，如果 將包裝在病毒顆粒內(nèi)帶有編碼病毒RNA基因組的基因轉(zhuǎn)移載體的5'LTR的 啟動子活性的部分置換為其它的強有力的啟動子的話，可增加基因轉(zhuǎn)移載 體的mRNA轉(zhuǎn)錄量，提高包裝效率，使載體滴度提高。進而，例如慢病毒 的情況下，已知5' LTR的轉(zhuǎn)錄活性被病毒蛋白tat促進，將5' LTR置換成 不依賴tat蛋白的啟動子時，可以從包裝載體中刪除tat。另外，感染細胞并 侵入細胞內(nèi)的病毒RNA發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄后，形成使兩端的LTR結(jié)合在一起的環(huán) 狀結(jié)構(gòu)，結(jié)合部位與病毒的整合酶偶聯(lián)，而被整合進細胞的染色體中。由 前病毒轉(zhuǎn)錄的mRNA是從5' LTR內(nèi)的轉(zhuǎn)錄起始點開始至下游3' LTR的 polyA序列，5'LTR的啟動子部分未被包裝在病毒內(nèi)。因此，即使置換啟動 子，插入把細胞染色體的部分也不發(fā)生變化。綜上所述，5' LTR的啟動子 的置換實現(xiàn)了更高的滴度與更高安全性的載體制備。因此，可以進行基因 轉(zhuǎn)移載體的5'端啟動子的置換，提高被包裝載體的滴度。另外，刪除部分3'LTR的序列，通過制備防止靶細胞載體全長mRNA 轉(zhuǎn)錄的自我失活型載體(Self Inactivating Vector : SIN載體)，可以提高其 安全性。侵染到靶細胞染色體的慢病毒的前病毒形成3' LTR的U3部分與 5'端結(jié)合的形式。因此，基因轉(zhuǎn)移載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在逆轉(zhuǎn)錄后，處于整合 進耙細胞染色體的狀態(tài)，U3定位于5'端，在此與來自基因轉(zhuǎn)移載體的轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物具有同樣結(jié)構(gòu)的RNA可以被轉(zhuǎn)錄。假設(shè)在靶細胞內(nèi)有慢病毒或者其類 似蛋白質(zhì)存在的情況下，轉(zhuǎn)錄的RNA被再次包裝，有可能對其他細胞進行 再次感染。另外通過3'LTR的啟動子，位于病毒基因組的3'端的來自宿主 的基因有可能一皮表達(Rosenberg, N.， Jolicoeur, P., Retoroviral Pathogenesis. Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 475-585, 1997 )。這種現(xiàn)象 在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中已經(jīng)被視為一種問題，作為回避方法，開發(fā)了 SIN載 體(Yu, S. F. et al,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83(10)， 3194-8， 1986)。通過使 基因轉(zhuǎn)移載體上的3' LTR的U3部分缺失，令靶細胞內(nèi)沒有5' LTR及3' LTR 的啟動子，就不會發(fā)生全長RNA及宿主基因的轉(zhuǎn)錄。然后，只有來自內(nèi)部 啟動子的目的基因進行轉(zhuǎn)錄，以實現(xiàn)安全性提高，以及載體表達提高。這 樣的載體最適用于本發(fā)明。SIN載體的構(gòu)建可以按照常規(guī)方法或者本發(fā)明人 的專利申請國際公開號WO2002/101057 (專利文獻1 )的實施例1-4中記 述的方法等進行。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等在其基因組中包含LTR序列的病毒載體進行基
因治療的問題之一是導入的基因表達逐漸下降。原因之一是這些載體一旦被整合進宿主基因組中，由于宿主的作用機理造成其LTR被甲基化，導入 基因的表達受到抑制。(Challita， P. M. and Kohn, D. B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2567, 1994)。自我失活(SIN)型載體一旦被整合進宿主基因組就 會丟失大部分LTR序列，優(yōu)點是不受LTR甲基化引起的基因表達鈍化的影 響。本發(fā)明人通過將基因轉(zhuǎn)移載體的3'LTR的U3區(qū)域置換為其他啟動子序 列制備的自我失活型載體，在導入進靈長類ES細胞之后，已證實可以維持 兩個月以上的穩(wěn)定表達(專利文獻1 )。這樣，通過改造LTRU3區(qū)域進行 自我失活設(shè)計的SIN載體特別適用于本發(fā)明。具體來說，3'LTR的U3區(qū)域 的1或者多個堿基通過置換，缺失，和/或增加等進行改造的載體歸屬于本 發(fā)明。這個U3區(qū)域既可以僅為缺失，或者也可以為在該區(qū)域內(nèi)插入其它的 啟動子。作為這樣的啟動子來說，例如可以列舉出CMV啟動子、EF1啟動 子、或者CAG啟動子等。另外，最優(yōu)選的設(shè)計為通過LTR以外的啟動子轉(zhuǎn)錄編碼本發(fā)明載體的 PEDF基因以及FGF2基因。例如，如上所述，將LTRU3區(qū)域置換成非LTR 啟動子的情況下，最優(yōu)選的是，通過這種改造的LTR驅(qū)動PEDF基因或者 FGF2基因的表達。或者如實施例所示，在與LTR區(qū)域不同的位置上加入非 LTR啟動子，通過連接其下游PEDF基因或者FGF2基因，可以誘導非LTR 依賴的PEDF基因或者FGF2基因的表達。本發(fā)明人，通過構(gòu)建非LTR啟 動子驅(qū)動的外源基因表達的SIV載體表明在ES細胞中的外源基因可以長期 穩(wěn)定地表達(專利文獻l )。同樣，在PEDF基因或者FGF2基因的上游連 接非LTR啟動子，由該啟動子導致的PEDF基因或者FGF2基因轉(zhuǎn)錄的載 體特別適用于本發(fā)明。作為非LTR啟動子來說，例如可列舉出CMV啟動 子，EF1啟動子，或者CAG啟動子，尤其是CMV啟動子最好。在本實施 例中使用的CMV啟動子的堿基序列用序列號13來表示。這樣的載體， 尤其是在上述自我失活(SIN)型載體構(gòu)建中會發(fā)揮較高的效果。以HIV載體為首的慢病毒載體，在宿主基因組帶有全部HIV前病毒的 情況下，有報道指出外源載體和內(nèi)源性前病毒之間會發(fā)生重組，擔心會不 會出現(xiàn)可復制的病毒。這在將來實際給HIV感染患者使用HIV載體時確實 是一個很大的問題。這次使用的SIV載體由于幾乎沒有與HIV相同的序列， 是刪除掉80 %以上的病毒來源序列的不可復制病毒，因此這種危險性極小， 與其他慢病毒載體相比安全性很高。本發(fā)明的SIV-PEDF載體和SIV-FGF2 載體是一定程度之上刪除了上述"作為病毒載體功能所必需的序列，，以外 的SIV基因組序列的載體，最優(yōu)選的是這個載體中來源自SIV基因組序列 的40。/。以上，或者是50%以上，或者是60%以上，或者是70%以上，更 優(yōu)選的是80%以上被刪除掉的不可復制病毒。在逆轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生中，使宿主細胞中具有包裝信號的基因轉(zhuǎn)移載體 DNA發(fā)生轉(zhuǎn)錄，在gag, pol蛋白以及被膜蛋白質(zhì)存在的情況下，形成病毒 顆粒。包裝細胞內(nèi)的gag,pol蛋白可以使用包裝載體進行提供。被膜蛋白也 可由包裝載體進行提供，也可以由其他載體進行提供。例如實施例所示， 可以由VSV-G表達載體進行提供。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移載體最基本地要具有5'LTR,包裝信號序列，PEDF 基因和/或FGF2基因，以及3 ，LTR序列。LTR序列可以進行上述的SIV載 體改造的LTR改造。另外，也可以加入上述的cPPT序列，CMV序列，RRE 序列等?；蜣D(zhuǎn)移載體DNA中編碼的包裝信號序列為了能維持該序列形成 的結(jié)構(gòu)功能，最好盡可能長地被加入進去，另一方面，為了抑制該載體DNA 上的包裝信號與供給gag， pol蛋白的包裝載體之間發(fā)生重組出現(xiàn)的野生型 病毒的頻率，需要將這些載體間的重復序列控制在最小限度范圍內(nèi)。因此， 在基因轉(zhuǎn)移載體DNA的構(gòu)建中，為了使包裝效率以及安全性二者都得到滿 足，最好使用包含有盡可能短的包裝所必需的序列，。例如，使用來自SIVagm的包裝載體的情況下，由于來自HIV的基因 轉(zhuǎn)移載體未被包裝，因此，作為用于基因轉(zhuǎn)移載體DNA的包裝信號來源， 只受SIV的限制。但是，使用來自HIV的包裝載體的情況下，由于來自SIV 的基因轉(zhuǎn)移載體也會被包裝，使重組病毒的出現(xiàn)頻率下降，所以可以將來 自不同慢病毒的基因轉(zhuǎn)移載體和包裝載體進行組合并形成載體粒子。如此 制備的SIV載體也包括在本發(fā)明的載體中。在這種情況下，最優(yōu)選的是靈 長類慢病毒之間產(chǎn)生的組合(例如，HIV和SIV)。在基因轉(zhuǎn)移載體DNA中，最好將gag蛋白改造為非表達。病毒gag蛋 白對于生命體來說，被作為異物識別，有可能表現(xiàn)出抗原性。另外，也有 可能影響到細胞的功能。要使gag蛋白不表達，可以通過gag起始密碼子的 下游堿基的增加或者缺失等進行框移改造。另外，最好是在gag蛋白的編碼 區(qū)域產(chǎn)生部分缺失。 一般來說，在病毒的包裝中，gag蛋白的編碼區(qū)域的5'
端是必要的。因此，在基因轉(zhuǎn)移載體中，最好是使gag蛋白質(zhì)的C末端的 編碼區(qū)域缺失。在不對包裝效率產(chǎn)生很大影響的范圍內(nèi)，盡可能大范圍地刪除gag編碼區(qū)域。另外，最好將gag蛋白的起始密碼子(ATG)置換成 ATG以外的密碼子。置換的密碼子應(yīng)適宜地選"^奪對包裝效率沒有影響的。 具有依此構(gòu)建的包裝信號的基因轉(zhuǎn)移載體DNA,通過導入到適當?shù)陌b細 胞中，就可以進行病毒載體生產(chǎn)了。產(chǎn)生的病毒載體比如可以從包裝細胞 的培養(yǎng)上清中進行回收。進而，在基因轉(zhuǎn)移載體DNA中，最好進行以提高PEDF基因以及FGF2 基因的導入效率以及表達效率的改造。比如進行提高導入效率的改造例子， 可以列舉cPPT序列的導入。cPPT原本是存在于SIV基因組的一個序列。 在HIV病毒中很久以前就有報道(P.Charneau et al. : J.Virol 65: 2415-2431, 1991),報道指出，在HIV載體中導入cPPT后，載體基因組向細胞核的移 動加快，基因?qū)胄侍岣?A.Sirvenetal. : Blood 96:4103-4110, 2000)。在 本實施例中使用的cPPT堿基序列用序列號14來表示。另外作為提高表達 效率的改造例子，可以列舉WPRE序列的導入。WPRE是具有提高基因表 達步支率功能的因子(US Patent 6284469 : RNA export element and methods of use)。有報道指出在其它的慢病毒載體中，同時導入cPPT和WPRE兩個 因子，最終可以進一步提高各自的效果(SC. Barry etal. : Hum. Gene Ther. 12: 1103-1108,2001)。在本實施例中使用的WPRE堿基序列用序列號15來表 示。帶有SIV-PEDF載體以及SIV-FGF2載體等的本發(fā)明的PEDF基因和/ 或FGF2基因的SIV載體中，cPPT可以采用與常見的慢病毒載體的定位一 樣的定位。例如、cPPT可以定位在啟動子與外源基因之間，或者定位在RRE 序列的上游，最好是定位在驅(qū)動PEDF轉(zhuǎn)錄的上述非LTR啟動子的上游。 WPRE可以定位在PEDF或者FGF2基因的下游。作為這種基因轉(zhuǎn)移載體最 好的具體實例，可以例舉出使用包含在序列號l中記述的堿基序列中插入 PEDF基因的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備的SIV載體，使用包含在序列號 1中記述的堿基序列中插入FGF2基因的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備的 SIV載體，以及使用包含在序列號1中記述的堿基序列上插入PEDF基因 和FGF2基因的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備的SIV載體；更好的例子為， 使用包含序列號2中記迷的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備的SIV載體，使 用包含序列號3中記述的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備的SIV載體。
在本發(fā)明中，包裝載體可以使用刪除了對PEDF基因和/或FGF2基因 的導入非必需序列的載體。作為非必需序列，可以列舉出被稱作修飾基因 的vif,vpr和調(diào)控基因的tat,rev。有報道指出修飾基因產(chǎn)物在載體中是非必 需的(V.Kim et al.: J.Virol 72:811-816, 1998),近年來，為了提高安全性，經(jīng) 常使用刪除了修飾基因的載體。另外，tat也可刪除，rev可用其它質(zhì)粒移走， 使安全性進一步提高，是開發(fā)中的所謂第三代載體。從包裝載體中去除掉 rev的情況下，可以另外構(gòu)建rev表達載體，在SIV-PEDF載體和SIV-FGF2 載體等的帶有本發(fā)明的PEDF基因和/或FGF2基因的SIV載體制備中可以 使用該rev表達載體。SIVagm TYO-1抹的rev堿基序列用序列號16來表 示。按上述方法構(gòu)建的包裝載體，例如，可以進行包括啟動子序列、病毒 核心蛋白質(zhì)序列(gag)、逆轉(zhuǎn)錄酶序列(pol) 、 polyA序列在內(nèi)的構(gòu)建， 如實施例所示，上述構(gòu)建也可以再加上RRE序列。另外rev表達載體可以 將調(diào)控該序列的啟動子放置在rev序列的上游、將polyA序列放置在rev序 列的下游進行構(gòu)建。作為用于包裝細胞的細胞來說，通常來講只要是用于病毒生產(chǎn)的細胞 抹都可以?？紤]到應(yīng)用于人類的基因治療，細胞來源以人類的或者猴子的 較為適宜。可以用作包裝細胞使用的人類細胞抹，例如包括293細胞，293T 細月包，293EBNA細胞，SW480細胞，u87MG細胞，HOS細胞，C8166細 胞，MT-4細胞，Molt-4細胞,HeLa細胞，HT1080細胞，TE671細胞等。來源于猴子的細胞抹，例如，COS1細胞，COS7細胞，CV-1細胞，BMT10細胞等。SIV-PEDF載體以及SIV-FGF2載體等本發(fā)明的帶有PEDF基因和/或 FGF2基因的SIV載體實質(zhì)上可以進行完全純化。純化方法包括過濾器過濾， 離心分離，以及柱層析純化等已知的純化/分離方法來進行。例如將載體懸 液通過0.45)am的過濾器進行過濾后，42500xg、 90分鐘，4。C下進行離心， 可以對載體進4亍沉淀和濃縮。另外如上所述，本發(fā)明的藥品可以利用PEDF蛋白質(zhì)和FGF2蛋白質(zhì)進 行制備，PEDF蛋白質(zhì)和FGF2蛋白質(zhì)其cDNA用有關(guān)人員常用的方法進行 制備，可以將該cDNA插入到適當?shù)谋磉_載體，導入進宿主細胞進行表達。 這些cDNA可以分別由不同的載體帶有，也可以同時由 一個載體帶有。cDNA 的制備如上述所示。表達載體可以選擇適宜的宿主細胞進行。本發(fā)明的藥品可以用于伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的治療以及預(yù) 防。例如可以用于視網(wǎng)膜色素變性，青光眼，視網(wǎng)膜脫落，視網(wǎng)膜缺血性 疾患的治療及預(yù)防，特別是適用于視網(wǎng)膜色素變性的治療及預(yù)防。上述SIV-PEDF載體以及SIV-FGF2載體等的帶有PEDF基因和/或FGF2基因 的SIV載體根據(jù)需要與藥學可使用的所希望的載體材料或者介質(zhì)進行適當 的組合，可以作為上述疾患的藥品。"藥學可使用的介質(zhì)"是指可以與載 體共同給藥，所述介質(zhì)對基因的導入沒有統(tǒng)計學意義上的抑制的材料。具 體來講，例如可以考慮使用滅菌水，生理鹽水、培養(yǎng)基，血清，生理鹽水 的磷酸鹽緩沖液(PBS)等適當?shù)慕M合。此外，其它的還可以含有穩(wěn)定劑、 殺菌劑等。本發(fā)明的藥品的形態(tài)為PEDF蛋白以及FGF2蛋白或者為存在于 同 一介質(zhì)中的SIV-PEDF載體以及SIV-FGF2載體的混合物，可以作為 一種 藥品使用。將SIV-PEDF載體以及SIV-FGF2載體作為一個混合物時，可以 將各個載體在確保如下所述的給藥量的范圍內(nèi)進行配合?；蛘叻謩e將 SIV-PEDF載體以及SIV-FGF2載體作為混合物進行制備，也可以作為含有 兩種混合物的治療用試劑盒使用。PEDF以及FGF2的基因、蛋白質(zhì)都可以 作為同樣的試劑盒使用。將PEDF蛋白以及FGF2蛋白作為本發(fā)明的藥品時 的介質(zhì)材料以及形態(tài)與使用載體時的情況是相同的。將含有本發(fā)明的SIV-PEDF以及SIV-FGF2的治療藥品進行給藥的情況 下，只要能獲得抑制視網(wǎng)膜凋亡變性的效果，對給藥途徑?jīng)]有特別要求， 最好是視網(wǎng)膜下腔給藥，玻璃體內(nèi)給藥，前房內(nèi)給藥，更優(yōu)選的是視網(wǎng)膜 下腔給藥。包含本發(fā)明的SIV-PEDF和SIV-FGF2的藥品的給藥量(每一個 眼球用量)，例如可以是2.5xl05TU-2.5xl08TU , 最優(yōu)選用量是 5.0xl05TU-5.0xl07TU。另外，在本說明書中引用的全部前期技術(shù)文獻都作為參考編入本說明 書中。實施例以下依據(jù)實施例對本發(fā)明進行更具體的說明。最重要的是，本發(fā)明并 不局限于以下的實施例。 實施例1VSV-G假型SIV載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建使用了如圖1中所示的4種質(zhì)粒(基因轉(zhuǎn)移載體，包裝載 體，rev表達載體，VSV-G表達載體)。關(guān)于其中基因轉(zhuǎn)移載體，包裝載體， 及rev表達載體這3種，它們是通過改造原始型載體質(zhì)粒(PCT/JP00/03955 ) 而制備的。關(guān)于VSV-G表達載體使用沒有經(jīng)過改造的原有型載體。在質(zhì)粒制備時，使用了市場上出售的各種試劑盒。限制性內(nèi)切酶使用 New England Biolabs公司的產(chǎn)品，質(zhì)粒DNA的提耳又，純化，回收使用 QIAGEN的試劑盒(QIAquick PCR purification kit, QIAquick Nucleotide Removal kit, QIAquick Gel extraction kit, Plasmid Maxi kit )。 PCRl吏用TaKaRa 的EX Taq酶，使用的引物對外委托廠商(SIGMA GENOSYS JAPAN )合成。 DNA末端的脫磷酸化使用Takara的堿性磷酸酶(來自E.coli C75)。連接時使 用Takara的DNA Ligation kit ver.2,轉(zhuǎn)化使用TOYOBO的DH5a COMPETENT high感受態(tài)纟田月包。1-1.基因轉(zhuǎn)移載體的改造向原始型基因轉(zhuǎn)移載體中導入cPTT(中心多嘌呤管道，central polypurine tract)以及WPRE(土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，woodchuck hepatitis vims posttranscriptional regulatory element), 以改造基因4爭一多載體的'性能(圖 2A,B)。使用的原始型基因轉(zhuǎn)移載體為非病原性的非洲綠猴免疫缺陷病毒 的克隆抹SIVagm作為基本載體，順次具有5，LTR區(qū)域，RRE, CMV (巨 細胞病毒，cytomegalovirus )啟動子，EGFP(增強型綠色熒光蛋白，enhanced green fluorescent protein )基因，3 ，LTR。該原始型基因轉(zhuǎn)移載體是由本發(fā)明 人構(gòu)建出來的載體，并已對構(gòu)建方法等進行了報道(專利文獻2)。該原始 型基因轉(zhuǎn)移載體的堿基序列用序列號17來表示。具體的載體改造方法如下。首先，用限制性內(nèi)切酶SacII酶切原始型的 基因轉(zhuǎn)移載體，樣品進行電泳，去除CMV啟動子和EGFP基因后，進行自 我連接。其次，為了消除質(zhì)粒的Not I位點，用NotI酶切上述載體，將酶 切末端用T4DNA聚合酶進行平滑化處理，并進行自我連接。接下來，將上述載體用限制性內(nèi)切酶SacII酶切，進行BAP處理，將 酶切末端脫磷酸化處理。以原始型的基因轉(zhuǎn)移載體作為模板，用引物1F(序 列號18)和1R(序列號19)進行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物用SacII酶 切，制備在CMV啟動子(序列號13)的末端添加上SacII位點的片斷。 將該CMV啟動子片斷連"t妄到BAP處理的上述載體的Sac II位點。將載體依次用Notl、 BamHI進行酶切，在其酶切位點將兩種合成的寡 聚DNA2F (序列號20)和2R (序列號21 )進行退火制備好的接頭連接 上，以改變限制性內(nèi)切酶的位點。將載體用限制性內(nèi)切酶SacII酶切，進行 BAP處理，將酶切末端脫磷酸化處理。為了得到導入用的cPTT片斷(序列號14),以含有SIVagmTYOl 基因組(序列號12)的質(zhì)粒pSA212作為模板，用引物3F(序列號22) 和3R(序列號23)進行PCR反應(yīng)。將該PCR擴增片斷的末端用SAC II 酶切，制備成在cPPT的兩端添加有SACII位點的片斷。將cPPT片斷連接 到BAP處理的上述載體的Sac II位點上。將載體用BamHI酶切，進行BAP處理，將酶切末端脫磷酸化處理。 為了得到導入的WPRE片斷，以裝有WPRE cDNA (序列號15 )的質(zhì)粒 作為模板，用引物4F(序列號24)和4R(序列號25)進行PCR反應(yīng)。 將得到的PCR擴増產(chǎn)物的末端用BamH I和Bgl II酶切，制備成在WPRE 的末端添加有限制性內(nèi)切酶位點的片斷。將上述WPRE片斷連接在載體的 BamHI位點上，最終得到無攜帶基因的改造型基因轉(zhuǎn)移載體(序列號1)。制備攜帶基因片斷，并加入到上述的改造型基因轉(zhuǎn)移載體Notl部點上。 EGFP片斷以裝有EGFPcDNA (序列號26)的質(zhì)粒作為模板，用引物5F (序列號27)和5R(序列號28)進行PCR反應(yīng)，用Not I酶切進行制 備。FGF2片斷以裝有hFGF2cDNA (序列號8)的質(zhì)粒作為模板，用引 物6F(序列號29)和6R(序列號30)進行PCR反應(yīng)，用NotI酶切進 行制備。PEDF片斷以裝有hPEDF cDNA (序列號7 )的質(zhì)粒作為模板， 用引物7F (序列號31 )和7R (序列號32 )進行PCR反應(yīng)，進行pGEM-T Easy vector載體(Promega公司)的TA克隆，用Notl酶切進行制備。另外，在構(gòu)建含有cPPT,WPRE的質(zhì)粒的同時，為了確認cPPT,WPRE 的效果，分別制備了單獨加入有cPPT或者單獨加入有WPRE的基因轉(zhuǎn)移載 體。1-2.包裝載體的改造在原始型包裝載體中除了 gag,pol之外，還包括所謂的修飾基因vif,vpr
和調(diào)控基因tat，rev。然而，已知修飾基因產(chǎn)物在載體中是非必須的(V.Kim et al.: J.Virol 72:811-816, 1998),近年來，為了提高安全性，使用刪除了修飾基 因的載體。另外，tat也被刪除，rev通過其它的質(zhì)粒移去，而更加安全了， 開發(fā)了被稱作第三代的載體，目前，載體的第三代化成為當務(wù)之急。因此 即使在本發(fā)明中，從原始型包裝載體(序列號33)中去除輔助的基因 (vif，vpr,tat),將rev轉(zhuǎn)移至別的質(zhì)粒，提高了安全性(圖3)。方法基本 上為以前所報道的HIV載體的方法(T. Dull, et al.: J. Virol 72:8463-8471, 1998)。具體來講，首先，將包裝載體的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NotI酶切，接著 用EcoT221酶切。樣品進行電泳，除去EcoT22I-Not I片斷，回收片斷較大 的載體片斷和作為pol基因一部分的EcoT22I-EcoT221片斷。將這兩種合成寡聚DNA1F (序列號34)和1R(序列號35 )進行退 火而制備的接頭連接于上述載體的EcoT22I-Not I位點。接下來將載體用 EcoT22I酶切，進行BAP處理，將酶切末端脫磷酸化處理，在BAP處理的 EcoT221位點加入回收好的pol基因的EcoT221片斷。將上述載體進行NotI酶切，進行BAP處理，將酶切末端脫磷酸化處 理。為了得到RRE片斷，將原始型的包裝載體(序列號33)作為模板， 用引物8F(序列號36)和8R(序列號37)進行PCR反應(yīng)，進行pGEM-T Easy vector載體(Promega公司)的TA克隆。用Not I將RRE片斷切出。 連接RRE片斷于脫磷酸化處理的載體Not I位點，最終得到改造型包裝載 體(序列號4)。1-3. rev表達載體的構(gòu)建rev蛋白目前為止依靠原始型的包裝載體供給，隨著上述包裝載體改造， 將rev蛋白以其它的表達質(zhì)粒的形式進行供給，并重新構(gòu)建了表達載體。Rev 在基因組上的內(nèi)含子被分成為兩部分，將它們連接在一起加入到表達質(zhì)粒 中(圖4A,B )。首先，以原始的包裝載體作為模板，通過PCR制備成兩條片斷。5'端 的片斷使用引物1F(序列號38)和1R(序列號39) ， 3，端的片斷使 用引物2F(序列號40)和2R(序列號41 )進行擴增。回收兩種PCR 片斷，混合，作為PCR的模板，使用引物1F和2R進行擴增，得到以連接
兩個片斷為目的的rev基因斷片(序列號16)。將PCR擴增的rev片斷 TA克隆到pGEM-T Easy vector載體。接下來，將該載體用EcoRI酶切，回 收添加有EcoRI位點的rev片斷。另 一方面，將蛋白表達pCI載體(Promega 公司)用EcoRI酶切，對酶切位點進行BAP處理。將回收的rev片斷和pCI 表達載體連接起來，作為rev表達載體備用。實施例2 對攜帶有cPPT,WPRE的SIV載體的功能評價 為了調(diào)查cPPT和WPRE的導入效果，除了 cPPT和WPRE同時攜帶外， 還生產(chǎn)出cPPT單獨攜帶，WPRE單獨攜帶的載體，與原始型的對照進行比 較。所使用的全部基因轉(zhuǎn)移載體都攜帶EGFP。包裝載體使用原始型(序列 號33)。2-1. SIV載體的制備將來自人類胎兒腎細胞的細胞抹293T細胞按照每一個15cm塑料培養(yǎng) 皿大約lxl07 (次日密度為70-80% )進行接種，在20ml含10%胎牛血清 的D-MEM培養(yǎng)基(Gibco BRL )中進行24小時培養(yǎng)。24小時培養(yǎng)后，將 培養(yǎng)基用10ml的OPTI-MEM培養(yǎng)基進行置換(Gibco BRL ),作為轉(zhuǎn)染細 胞備用。按照每一個培養(yǎng)皿基因轉(zhuǎn)移載體為6嗎、包裝載體3 jig、 VSV-G表達 載體l嗎溶解在1.5ml的OPTI-MEM培養(yǎng)基后，加入40jil的PLUS Reagent 試劑(Invitrogen公司)進行攪拌，在室溫下放置15分鐘?；蜣D(zhuǎn)移載體使 用cPPT和WPRE同時攜帶、cPPT單獨攜帶、WPRE單獨攜帶或者原始型 (cPPT和WPRE都不攜帶)的載體。在其中加入1.5ml的OPTI-MEM培養(yǎng) 基稀釋的60[il的LIPOFECTAMINE Reagent試劑(Invitrogen公司)進行攪 拌，在室溫下放置15分鐘。將上述的DNA復合物滴加到15cm培養(yǎng)皿的細胞上，小心振蕩混勻， 在37°C, 5 %C02的孵育器中進行3小時的孵育。孵育后，在培養(yǎng)亞中加入 13ml的含20 %胎牛血清的D-MEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染的次日，用新鮮 的含10 %胎牛血清的D-MEM培養(yǎng)基30ml換液后進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染2天后， 回收上清，用0.45pm的過濾器過濾，作為載體懸液備用。2-2. SIV載體的滴度測定SIV載體滴度包括由表達所攜帶基因的蛋白的細胞數(shù)目計算出的功能滴度(Functional titer : TU/ml)和由載體粒子數(shù)目計算出的數(shù)值(Particle titer 顆粒滴度顆粒/ml)。因為cPPT和WPRE的性能評價要在一致的顆粒滴 度條件下對細胞進行感染和評價，因此，如下所示用斑點印跡法對顆粒滴 度進行了測定。首先，用市場上出售的試劑盒(QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA mini kit )從上述生產(chǎn)的載體懸液抽取RNA。其次，利用狹隙雜交裝置在HybondN十 濾膜(Amersham公司)上對RNA加樣。同時通過定量曲線計算出所用質(zhì) 粒DNA的摩爾數(shù)量。另外，RNA的處理方法按照濾膜產(chǎn)品附帶提供的實 驗步驟進行。將DNA加熱并迅速冷卻。將濾膜用堿固定后，進行雜交。雜 交使用羅氏公司DIG標記的信號檢測系統(tǒng)。探針利用DIG標記的NTP進行 制備，雜交后的操作使用DIG Easy Hyb, DIG Wash and Block Buffer Set試劑 盒(羅氏公司)。利用anti-DIG AP conjugate antibody抗體(羅氏公司)以 及CSPD (羅氏公司)，進行化學發(fā)光，用魯米諾圖像分析儀(富士寫真膠 巻LAS-1000)對信號進行檢測定量。2-3.SIV載體對細胞的基因?qū)爰霸u價測定好顆粒滴度的4種載體如下所示通過變化MOI(感染復數(shù)， multiplicity of infection)對細胞進行感染，進行FACS分析。將293T細胞按 照每1孔為lxl()S個接種到6孔塑料培養(yǎng)板上，在37。C、 5。/。C02下培養(yǎng)過 夜。次日，用血球計數(shù)板計算培養(yǎng)板每1孔的細胞數(shù)量，除去培養(yǎng)板的培 養(yǎng)基，分別加入用新鮮的含10%胎牛血清的D-MEM培養(yǎng)基2ml稀釋的載 體，使MOI(顆粒/細胞)為0.3、 1.5、 7.5、 15。感染l天后，將細胞的培養(yǎng) 基用2ml的新鮮培養(yǎng)基進行交換。感染2天后，在熒光顯微鏡下觀察通過 載體進行基因?qū)氲腅GFP,測定EGFP陽性細胞的比例，并測定熒光強度 (作為EGFP蛋白量水平的數(shù)值)。2-4.載體功能評價的結(jié)果以原始型基因轉(zhuǎn)移載體作為對照，生產(chǎn)了 cPPT單獨攜帶、WPRE單獨 攜帶、cPPT和WPRE同時攜帶的4種載體。載體設(shè)計的模式圖如圖5-(a)所示。在測定生產(chǎn)出來的載體顆粒滴度的時候，未發(fā)現(xiàn)4種載體粒子產(chǎn)量的 差異。用載體粒子數(shù)對MOI (每一個細胞所感染的載體粒子數(shù))進行統(tǒng)一，對293T細胞進行基因?qū)?，在焚光顯^t鏡下進行觀察，MOI:15的情況下， 如圖5-(b)所示，不含cPPT和WPRE的原始型的對照(-cPPT,-WPRE)中， EGFP陽性細胞的數(shù)量少，熒光弱。cPPT單獨攜帶(+cPPT,-WPRE )時EGFP 陽性細胞的數(shù)量增加。WPRE單獨攜帶(-cPPT,十WPRE )時EGFP陽性細胞 的數(shù)量與對照相比僅稍有增加，但EGFP蛋白的熒光增強。cPPT和WPRE 同時攜帶(+cPPT，+WPRE)時，兩個因子發(fā)揮了協(xié)同效果，細胞數(shù)量、熒 光強度二者都比cPPT、 WPRE單獨攜帶時有大幅度的増加，得到了超出預(yù) 期的結(jié)果。在用FACS調(diào)查EGFP陽性細胞比例時(圖6),所有的基因插入比例 均呈MOI依賴性的増加，而且cPPT和WPRE同時攜帶與對照相比，導入 效率大約上升了 10倍。也就是說，實際上的功能滴度(產(chǎn)量)上升了 10倍。另夕卜，在調(diào)查EGFP陽性細胞的平均熒光強度時，(圖7),表明cPPT 和WPRE同時攜帶的比WPRE單獨攜帶的要高出很多，細胞基礎(chǔ)的蛋白表 達量也大幅度增加。實施例3攜帶治療基因的SIV載體的大量制備及濃縮 如圖l所示，以改造型基因轉(zhuǎn)移載體、包裝載體、rev表達載體、以及 VSV-G表達載體4種質(zhì)粒為基礎(chǔ)，如下制備SIV載體。攜帶PEDF和FGF2 的治療基因的載體以每20個15cm培養(yǎng)皿為單位進行生產(chǎn)。按照每一個15cm的塑料培養(yǎng)皿大約1><107(次日密度為70-80% )接種 293T細胞，在20ml的含10 %胎牛血清的D-MEM培養(yǎng)基中進行24小時培 養(yǎng)。24小時培養(yǎng)后，將培養(yǎng)基用10ml的OPTI-MEM培養(yǎng)基進行置換，用 于轉(zhuǎn)染。按照每一個培養(yǎng)皿基因轉(zhuǎn)移載體為IO昭，包裝載體5昭、rev表達 載體2嗎，VSV-G表達載體2嗎溶解在ljml的OPTI-MEM培養(yǎng)基后，加 入40^1的PLUS Reagent試劑(Invitrogen公司)進行攪拌，在室溫下放置 15分鐘。在其中加入用1.5ml的OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋的60jil的 LIPOFECTAMINE Reagent進行攪拌，在室溫下放置15分鐘。將該DNA復
合物滴加到上述的15cm培養(yǎng)皿的細胞中，小心振蕩混勻，在37°C， 5%C02 的孵育器中進行3小時的孵育。在上述培養(yǎng)皿中加入13ml含20。/。胎牛血清 的D-MEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后的次日，用新鮮的30ml含10%胎牛血清的D-MEM培養(yǎng)基進行 交換培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染兩天后，回收上清，加入20ml新鮮培養(yǎng)基?；厥盏纳锨逵?0.45jim的過濾器進行過濾，在4。C下保存。轉(zhuǎn)染三天后，回收上清，用0.45pm 的過濾器進行過濾，與前一天回收的載體混合，利用高速離心機進行濃縮 操作。將回收的載體懸液加入到經(jīng)過滅菌處理的試管中分裝，在42500G,4 X:下進行1小時的離心。這種離心操作重復二次，將載體懸液濃縮成500 倍-1000倍。載體作為沉淀物進行沉淀，沉淀物在含5%胎牛血清的PBS 中進行溶解。濃縮后的載體進行小量分裝后，在-80。C下進行保存， 一部分 -波用來進行顆粒滴度測定。顆粒滴度的測定如前述方法同樣進行。實施例4 SIV-hPEDF, SIV-hFGF2同時給藥時的視細胞變性抑制效果 的探討視網(wǎng)膜色素變性是治療困難的遺傳性疾患，目前尚無有效的治療方法。 本發(fā)明人進行了 SIV載體對小動物視網(wǎng)膜的導入特性和長期毒性試驗、以 及以疾病模型動物(RCS大鼠)為対象的SIV-PEDF給藥的效果判定試驗 (Gene therapy 10, 1503-1511， 2003 )并得到了良好的結(jié)果。由于考慮到神經(jīng) 營養(yǎng)因子PEDF, FGF2的耙細胞不同。因此對這兩種神經(jīng)營養(yǎng)因子的同時給 藥的神經(jīng)保護效果進行了探討。SIV-hFGF2以及SIV-hPEDF為利用上述方法所構(gòu)建的。將SIV-hPEDF， SIV-hFGF2， SIV-EGFP (對照)的各載體懸液按照載 體濃度total 2.5xl07TU/ml進行制備。將3周齡的RCS大鼠分成SIV-hPEDF 單獨給藥組，SIV-hFGF2單獨給藥組，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2同時給 藥組，SIV-EGFP給藥組四個組，進行視網(wǎng)膜下腔給藥。通過上述載體的視 網(wǎng)膜下給藥，PEDF以及FGF2基因被導入到視網(wǎng)膜色素上皮細胞，并在此 分泌出神經(jīng)保護因子，作用于神經(jīng)細胞。載體導入4周后，觀察各動物組，探討載體給藥的影響。PEDF以及FGF2 作用的視細胞、內(nèi)顆粒層等神經(jīng)細胞層以及視網(wǎng)膜色素上皮細胞位于視網(wǎng) 膜內(nèi)。但是，單獨摘^^視網(wǎng)膜較為困難。因此，摘取了大鼠的后眼部分。 后眼部分包含視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和鞏膜三層膜。通過ELISA法分別對摘取的
后眼部分的hPEDF,hFGF2蛋白量進行了測定。載體導入4周后的眼球后眼 部分，表現(xiàn)出hPEDF的表達在SIV-hPEDF給藥組中有增高的趨勢。另夕卜， hFGF2的表達在SIV-hFGF2單獨給藥組以及同時給藥組中有增高的趨勢， 并證實了 SIV-hPEDF、 SIV-hFGF2載體給藥所引起的hPEDF以及hFGF2基 因表達(圖8)。接下來，在載體導入4周后，S周后以及12周后，制備了最大切片面 積標本，對視網(wǎng)膜的10個位置(A1-A10)上每lOOpm范圍內(nèi)的視細胞的 細胞核數(shù)目進行了計數(shù)。SIV-hPEDF、 SIV-hFGF2各單獨組，以及同時給藥 組中，載體注射部位附近的3個位置的(Al-A3)視網(wǎng)膜組織中，殘存視細 胞具有統(tǒng)計學意義，在同時給藥組中，證實比單獨組有更高的神經(jīng)保護效 果(圖9)。另夕卜，載體導入8周后以及12周后，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2 的同時給藥引起顯著的神經(jīng)保護效果也得到證實(圖IO以及圖11)。進而，進行了作為功能性評價的電生理學的探討(視網(wǎng)膜電圖ERG)。 視網(wǎng)膜電圖是記錄對光刺激的視網(wǎng)膜電位變化的檢查方法，視網(wǎng)膜發(fā)揮功 能的情況下，會得到高的振幅。a波來自視細胞，b波主要來自米勒細胞和 雙極細胞。SIV-hPEDF, SIV-hFGF2的兩個單獨給藥組中，與SIV-EGFP組 相比，a，b波兩者都得到了有顯著統(tǒng)計學意義的高振幅結(jié)果。而且，在同時 給藥組中，得到了高振幅的a,b波，證實同時給藥組可以獲得更好的神經(jīng)保 護效果。(圖12以及圖13)。另外，追加實驗組中進行了組織學探討，未能觀察到SIV-hPEDF、 SIV-hFGF2的同時給藥有明顯的炎癥、增殖、以及新生血管的結(jié)果(無數(shù) 據(jù)表示)。工業(yè)化利用的可能性通過本發(fā)明，提供了一種新的治療視網(wǎng)膜色素變性的方法。本發(fā)明的 PEDF以及FGF2的同時給藥與以前的^L網(wǎng)膜色素變性治療方法相比，可以 預(yù)期有更顯著的好效果。特別是利用SIV-PEDF載體以及SIV-FGF2載體的 給藥方法能使患者細胞內(nèi)的PEDF以及FGF2得以持續(xù)提供，在減少患者的 侵害頻率，經(jīng)濟成本等方面上，已經(jīng)證明是一種非常有效的治療方法。
權(quán)利要求
1、一種伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患治療用藥品，其特征在于與藥學可使用的介質(zhì)一起，包含下述(a)到(d)的任意一種。(a)色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factorPEDF)基因以及成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2FGF2)基因(b)色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factorPEDF)蛋白質(zhì)以及成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2FGF2)蛋白質(zhì)(c)色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factorPEDF)基因以及成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2FGF2)蛋白質(zhì)(d)色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factorPEDF)蛋白質(zhì)以及成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2FGF2)基因
2、 權(quán)利要求1中記述的藥品，其特征是包含帶有PEDF基因以及FGF2 基因的重組猴免疫缺陷病毒載體的藥品，該PEDF基因以及FGF2基因分別 由不同的重組猴免疫缺陷病毒載體帶有，或者由一個重組猴免疫缺陷病毒 載體帶有。
3、 權(quán)利要求2中記述的藥品，其特征是包含帶有PEDF基因的重組 猴免疫缺陷病毒載體以及帶有FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒載體。
4、 權(quán)利要求2中記述的藥品，其特征是包含帶有PEDF基因以及FGF2 基因的重組猴免疫缺陷病毒載體。
5、 權(quán)利要求2到4的任意一項中記述的藥品，其中，猴免疫缺陷病毒 載體包含cPPT序列和/或WPRE序列。
6、 權(quán)利要求2到5的任意一項中記述的藥品，其中，猴免疫缺陷病毒 載體用VSV-G進行假型化。
7、 權(quán)利要求2到6的任意一項中記述的藥品，其中，猴免疫缺陷病毒 載體來源于agm4朱。
8、 伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的治療用試劑盒，其特征是包含 帶有PEDF基因的重組猴免疫缺陷病毒載體的混合物、以及包含帶有FGF2 基因的重組猴免疫缺陷病毒載體的混合物。
9、 伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的治療用試劑盒，其特征是內(nèi)含 包含帶有PEDF基因以及FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒載體的混合物。
10、 權(quán)利要求1到7的任意一項中記述的藥品或者權(quán)利要求8或者9 中記述的試劑盒，其特征是伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患是指^L網(wǎng)膜 色素變性，青光眼、視網(wǎng)膜脫落、視網(wǎng)膜缺血性疾病中的任意一種。
11、 伴隨眼組織細胞凋亡的變性疾患的治療方法，其特征是用PEDF 以及FGF2或者編碼它們的基因進行給藥。
12、 權(quán)利要求11中記述的治療方法，其特征是用帶有PEDF基因的 重組猴免疫缺陷病毒載體以及帶有FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒載體 進行給藥。
13、 權(quán)利要求12中記述的治療方法，其特征是用帶有PEDF基因的 重組猴免疫缺陷病毒載體以及帶有FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒載體 進行視網(wǎng)膜下腔給藥。
14、 權(quán)利要求11中記述的治療方法，其特征是用帶有PEDF基因以 及FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒載體進行給藥。
15、 權(quán)利要求14中記述的治療方法，其特征是用帶有PEDF基因以 及FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒載體進行視網(wǎng)膜下腔給藥。
16、 伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的治療用藥品的制造方法，其特 征是包括利用包含在序列號1所記述的堿基序列中插入PEDF基因的堿 基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備帶有PEDF基因的重組猴免疫缺陷病毒載體的 工藝。
17、 權(quán)利要求16中記述的方法，其特征是包括利用包含序列號2 所記述的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備帶有PEDF基因的重組猴免疫缺陷 病毒載體的工藝。
18、 伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的治療用藥品的制造方法，其特 征是包括利用包含在序列號1所記述的堿基序列中插入FGF2基因堿基 序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備帶有FGF2基因的重組猴免疫缺陷病毒載體的工藝
19、 權(quán)利要求18中記述的方法，其特征是包括利用包含序列號3 所記述的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備帶有FGF2基因的重組猴免疫缺陷 病毒載體的工藝。
20、 伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的治療用藥品的制造方法，其特 征是包括利用包含在序列號1所記述的堿基序列中插入PEDF基因以及FGF2基因的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備帶有PEDF基因以及FGF2基因 的重組猴免疫缺陷病毒栽體的工藝。
21、權(quán)利要求16到20中的任意一項中記述的方法，其特征是包括 向?qū)胗邪蛄刑?所記述的堿基序列的包裝載體的包裝細胞中導入該 基因轉(zhuǎn)移載體的工藝。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的治療視網(wǎng)膜色素變性等的伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾患的方法。主要涉及兩種神經(jīng)營養(yǎng)因子色素上皮衍生因子(PEDF)和成纖維細胞生長因子2(FGF2)的同時給藥。考慮到PEDF和FGF2的作用部位不同。構(gòu)建了SIV-PEDF載體以及SIV-FGF2載體，上述載體給藥于視網(wǎng)膜色素變性疾病模型的RCS大鼠的視網(wǎng)膜下腔，并探討了其效果。載體給藥4周后，8周后以及12周后，發(fā)現(xiàn)同時給藥組比單獨給藥組具有明顯的視細胞保護效果。進而，通過視網(wǎng)膜電圖對視網(wǎng)膜功能進行了評價，表明同時給藥組的效果要比單獨給藥組具有更顯著的效果。通過上述結(jié)果初次發(fā)現(xiàn)，PEDF以及FGF2的同時給藥對于視網(wǎng)膜色素變性的治療，具有比以前更高的療效。
文檔編號A61K48/00GK101160139SQ20068001288
公開日2008年4月9日 申請日期2006年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日
發(fā)明者上田泰次, 宮崎勝德, 居石克夫, 池田康博, 田畑壽晃, 米滿吉和, 長谷川護, 飯?zhí)镎虏?申請人:生物載體株式會社