專利名稱：：含精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及血漿精氨酸的消除、提供所述消除的組合物以及可受益于所述消除及其效果的疾病的治療，例如針對(duì)一氧化氮的合成。因此，本發(fā)明涉及治療某些腫瘤，比如惡性黑色素瘤和肝癌，以及涉及預(yù)防和治療感染性休克。本文中引用的所有文件、文章和專利或?qū)＠暾?qǐng)?jiān)诖送ㄟ^參考引入本中請(qǐng)。
背景技術(shù)：
：精氨酸是一種非必需氨基酸。由于精氨琥珀酸合成酶和精氨琥珀酸裂合酶的作用，精氨酸在尿素循環(huán)過程中由瓜氨酸分兩步合成。第一種酶催化瓜氨酸向精氨琥珀酸的轉(zhuǎn)化，第二種酶執(zhí)行向精氨酸的轉(zhuǎn)化。精氨酸在精氨酸酶的作用下被代謝成鳥氨酸，鳥氨酸能進(jìn)而通過由鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)被轉(zhuǎn)化成瓜氨酸。然而，已表明某些類型的腫瘤細(xì)胞需要被供給精氨酸，這使人們考慮精氨酸阻抑作為稱為精氨酸營養(yǎng)缺陷型的這些形式腫瘤的可能治療方法。精氨酸脫亞胺酶的抗肺瘤活性已成為許多出版物的主題。因此，對(duì)于惡性黑色素瘤和肝癌的體內(nèi)活性已被證明。然而，此酶具有一些大的缺點(diǎn)。精氨酸脫亞胺酶在哺乳動(dòng)物中不產(chǎn)生，而是得自微生物，這使得它對(duì)于哺乳動(dòng)物而言成為高抗原性的化合物。此外，此酶在哺乳動(dòng)物中具有非常短的約5小時(shí)的半衰期，且必須每曰以高劑量施用以有效。為克服這些缺點(diǎn)，作者建議此酶的聚乙二醇化形式，即與聚乙二醇(PEG)綴合的精氨酸脫亞胺酶，這導(dǎo)致更少抗原性的制劑，并具有更長半衰期(7至9天)。在處理這一題目的工作中，我們可提及以下的涉及黑色素瘤和肝癌治療的文獻(xiàn)F.Izzo等，J.Clin.Oncol.2004,22:1815-1822;CM.Ensor等，CancerResearch2002，62:5443-5450;F.W.Holtsberg等，J.Control.Release2002，80:259-271;J.S.Bomalaski等，Preclinica,ResearchArticleNov/Dec2003,1,5:284-293;CurleyS.A.等，Hepatogastroenterology,50，1214-6，2003。美國專利4，965，857提出完全不同的方法，包括使用反應(yīng)器體外處理血液，其中在反應(yīng)器中精氨酸脫亞胺酶作用于體外循環(huán)?，F(xiàn)今基于聚乙二醇化精氨酸脫亞胺酶的治療是令人感興趣的，但具有與在短時(shí)間間隔內(nèi)相對(duì)大劑量地重復(fù)施用相關(guān)的某些限制，因?yàn)榘胨テ谌匀欢?，并且具有與以高劑量重復(fù)施用相關(guān)的毒性，長期來說具有誘發(fā)高水平的針對(duì)活性主體的抗體的風(fēng)險(xiǎn)，其可導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)并抑制活性主體。因此，根據(jù)我們的處理使用具有更好生物利用度(更好的生物活性、更長的半衰期)的活性產(chǎn)品是相當(dāng)有益的，使得有可能優(yōu)化所施用酶的量并降低其毒性(甚至在重復(fù)治療的情況下)，并限制免疫反應(yīng)和臨床過敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。使用紅細(xì)胞作為藥物產(chǎn)品載體的優(yōu)點(diǎn)很久以前就被提出。它們具有天然的生物相容性且在輸注后其通過已知過程可被完全生物降解，并且在體內(nèi)具有相對(duì)長的半衰期(在人約為30天的半衰期)。在其紅細(xì)胞中表現(xiàn)出缺乏此酶的高精氨酸血癥患者的治療中，有人建議并試驗(yàn)包封精氨酸酶，尿素循環(huán)的一種天然酶(C.G.Millan，J.ControlledRelease2004,95:27-49;K.Adriaenssens等,Int.J.Biochem.1984，16，7:779-786)。其目的在于補(bǔ)償與內(nèi)源性精氨酸酶缺乏相關(guān)的代謝和酶缺乏。精氨酸酶具有約9.5的堿性最適pH值，且其活性在生理pH下低。與此相反，精氨酸脫亞胺酶具有約6.5的最適pH，在生理pH下保持超過其70%的活性，且其與精氨酸的親和力比精氨酸酶大1000倍B.J.Dillon等，Med.Sci.Monit.2002，8,7:248-253。在此項(xiàng)研究中，關(guān)于一氧化氮NO合成的抑制，作者報(bào)道了精氨酸脫亞胺酶對(duì)于細(xì)胞外精氨酸的強(qiáng)活性，但缺少對(duì)于細(xì)胞內(nèi)精氨酸的活性(巨噬細(xì)胞)。NO是一種生物介質(zhì)(biomediator)并被認(rèn)為基本上是由細(xì)胞外精氨酸合成的。感染性休克是由NO和肺瘤壞死因子TNFa介導(dǎo)的。對(duì)于NO合成的抑制已被設(shè)想為抗感染性休克的治療方法，因此有了在前的Dillon等人和J.B.Thomas(Biochem.J.2002,363,581-587)的工作。NO似乎也參與癌變過程中，如LindDS.在Arginineandcancer.J.Nutr.2004:2837S-41中所沖艮道的。NO合成的潛力。然而，此酶不具有細(xì)胞內(nèi)酶L性，生理pH并非其最適pH，其具有短的半衰期并且其可能誘發(fā)免疫反應(yīng)?；诖藦?fù)雜情況，發(fā)明人自我設(shè)定了提供有效降解血漿精氨酸和/或抑制一氧化氮NO合成的技術(shù)方案的目標(biāo)。因此，本發(fā)明涉及含有精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞在制備用于降低體內(nèi)血漿精氨酸濃度的藥物產(chǎn)品中的用途。根據(jù)IUBMB酶命名法，精氨酸脫亞胺酶被指定為EC3.5.3.6。所用的酶可為天然、合成或人工來源的，或得自基因工程(例如在整合表達(dá)編碼此酶的基因的載體之后，在宿主細(xì)胞如大腸桿菌中生產(chǎn)該酶)?？墒褂玫木彼崦搧啺访咐缑枋鲇贓P-A-1011717、EP-A-0414007、US-A-5372942、JP-A-6062867、JP-A-20534卯、JP-A-2035081。在一種等同方式中，本發(fā)明包括此酶類似物的用途，所述類似物尤其可為被l務(wù)飾的酶以增強(qiáng)其酶活性(EP-A-O981607)。本發(fā)明目的在于消除血漿精氨酸，這意味著降低血漿中精氨酸的濃度。不希望被理論束綽，認(rèn)為血漿精氨酸通過被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入被處理的紅細(xì)胞。本發(fā)明的紅細(xì)胞表現(xiàn)為生物反應(yīng)器，進(jìn)入其中的精氨酸被精氨酸脫亞胺酶降解。本發(fā)明提供了其它的優(yōu)點(diǎn)。在其生命末期，紅細(xì)胞基本上在肝、脾和骨髓以及肺中被巨噬細(xì)胞破壞。這導(dǎo)致精氨酸脫亞胺酶的靶向釋放，引起血漿精氨酸的局部消除。此效應(yīng)被利用于影響這些器官的疾病的治療，尤其是腫瘤，例如肝癌。本發(fā)明采取的解決方案使得可能以一種不尋常的方式把幾種決定性優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，即允許長時(shí)間作用的紅細(xì)胞的壽命、酶保存在特定環(huán)境中，一方面該環(huán)境是有利的，其pH通常低于7.4,在此pH下酶表現(xiàn)出超過80%的酶活性，并且另一方面，該環(huán)境有保護(hù)作用，因?yàn)樗雒概c免疫系統(tǒng)相隔離，從而降低了發(fā)生對(duì)該酶的免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，這在重復(fù)治療的情況下具有很大優(yōu)勢(shì)。該酶被紅細(xì)胞膜保護(hù)免于任何抗精氨酸脫亞胺酶抗體的影響，因此其酶活性被保留，甚至當(dāng)在被治療患者的血液中出存在抗體時(shí)也是如此。此外，由于此酶不作用于細(xì)胞內(nèi)的精氨酸，因此健康細(xì)胞被保留。因此，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在精氨酸依賴的肺瘤中特別令人感興趣的應(yīng)用，其中血漿精氨酸消除的有利效應(yīng)已被證明(例如參見前面引用的F.Izzo等，2004;CM.Ensor等，2002;F.W.Holtsberg等，2002;J.S.Bomalaski等，2003;以及CurleyS.A.等，2003)。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案，所述藥物產(chǎn)品意在治療精氨酸依賴的腫瘤，精氨酸依賴意思是指涉及需要精氨酸以進(jìn)行復(fù)制的腫瘤細(xì)胞的腫瘤不能合成其需要的一些或全部精氨酸，因此需要供應(yīng)精氨酸。血漿精氨酸消除將使這些細(xì)胞失去對(duì)其發(fā)育所必需的精氨酸，導(dǎo)致這些細(xì)胞的靶向死亡、抑制腫瘤生長或消退腫瘤實(shí)體。根據(jù)一個(gè)特征，本發(fā)明涉及這些紅細(xì)胞在制備用于治療肝癌或原發(fā)性肝癌的藥物產(chǎn)品上的用途。根據(jù)第二個(gè)特征，本發(fā)明涉及這些紅細(xì)胞在制備用于治療各種形式的惡性黑色素瘤的藥物產(chǎn)品上的用途，所述各種形式的惡性黑色素瘤例如表面擴(kuò)散黑色素瘤和結(jié)節(jié)性黑色素瘤。根據(jù)本發(fā)明的笫二個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及這些紅細(xì)胞在制備用于抑制一氧化氮合成的藥物產(chǎn)品上的用途。應(yīng)當(dāng)指出，所述藥物產(chǎn)品至少部分地通過血漿精氨酸的降解而起作用，如在前面引用的Dillon等，2002中所描述的。根據(jù)此實(shí)施方案的一個(gè)特征，本發(fā)明涉及這些紅細(xì)胞在制備用于預(yù)防和/或治療感染性休克的藥物產(chǎn)品上的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些紅細(xì)胞在制備藥物產(chǎn)品上的用途，所述藥物產(chǎn)品用于治療以下形式的癌癥之一-乳癌(ShenWei-Chiang等，CaliforniaBreastcancerresearch:http:〃www.cbcrp.org/research/PageGrant.aspgrant—id=1954)-神經(jīng)母細(xì)胞瘤(GongH.等,Int.J.Cancer2003，106:723-8)-白血病(GongH.等，Leukemia2000,Vol.14,826-9;NohE.J.等，Int.J.Cancer2004，112:502-8);或用于抑制血管生成和用于治療相關(guān)疾病，比如血管瘤、血管纖維瘤、關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、新生血管性青光眼、角膜疾病、更年期和其它形式的黃斑變性、翼狀胬肉、視網(wǎng)膜性變性、晶體后纖維組織增生、銀屑病、毛細(xì)血管擴(kuò)張、化膿性肉芽腫、脂溢性皮炎、痤掩、癌癥和與血管生成相關(guān)的轉(zhuǎn)移癌(WO0209741;Parkl.S.等:Br.J.Cancer2003,89:卯7-14)。本發(fā)明還涉及包含精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞。本發(fā)明還涉及這些紅細(xì)胞在藥學(xué)可接受鹽溶液(通常為紅細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)，含有NaCl和一種或多種選自以下成分的溶液葡萄糖、右旋糖、腺嘌呤和甘露醇；例如SAG-甘露醇或ADsol)中的懸液。所述溶液可提供紅細(xì)胞的保存，且其可包括防腐劑例如L-肉堿。所述懸液可以包裝好待用或供用前稀釋。即用型產(chǎn)品(如需要，用前稀釋后)的最終血細(xì)胞比容值優(yōu)選為40-70%。其可靜務(wù)，內(nèi)施用，優(yōu)選通過輸注施用。這種懸液或者包含根據(jù)本發(fā)明之紅細(xì)胞的任何可施用制劑本身構(gòu)成了本發(fā)明所覆蓋的藥物產(chǎn)品或藥物組合物。所述藥物產(chǎn)品或組合物尤其可用于前述各種應(yīng)用。例如，其可以包裝成用于輸注的柔性袋(flexiblebag),或供注射施用的一些其它形式。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特征，所述藥物產(chǎn)品包含血細(xì)胞比容值在40-70%之間的紅細(xì)胞懸液，所述血細(xì)胞比容值優(yōu)選在45-55%之間，更優(yōu)選為50%。優(yōu)選以10至250ml的體積包裝。對(duì)應(yīng)于醫(yī)療處方的被包封酶的量優(yōu)選全部包含于血袋中。醫(yī)療處方可在1至200IU/kg體重間變動(dòng)。本發(fā)明還涉及精氨酸依賴形式的癌癥或者或前述的其它癌性或非癌性疾病之一的治療方法，所述精氨酸依賴形式的癌癥例如肝癌和惡性黑色素瘤，所述治療方法包括給有此需要的患者施用有效量的所述藥物產(chǎn)品，尤其是通過靜脈內(nèi)途徑、通過注射或輸注施用，優(yōu)選通過輸注施用。根據(jù)感興趣的模式，在腫瘤切除手術(shù)之后對(duì)患者進(jìn)行治療。本發(fā)明還涉及意欲抑制一氧化氮合成和/或預(yù)防和/或治療感染性休克的治療方法，其包括給患者施用有效量的所述藥物產(chǎn)品，尤其是通過靜樂K內(nèi)途徑、通過注射或輸注施用，優(yōu)選通過輸注施用。根據(jù)這些不同的治療方法中的一種特別有利的模式，在用所述酶包封處理以后，以其自身的紅細(xì)胞對(duì)患者進(jìn)行治療。作為一種變化形式，紅細(xì)胞得自一個(gè)或多個(gè)供體。因此，所述方法可包括從患者或一個(gè)或多個(gè)供體收集一個(gè)或多個(gè)血液樣品(例如血袋)，制備紅細(xì)胞保存物或濃縮物，根據(jù)本發(fā)明摻入酶以及分批生產(chǎn)摻入所述酶的紅細(xì)胞，然后將懸液(藥物產(chǎn)品)通過靜脈內(nèi)途徑施用給患者。通常，施用處理后紅細(xì)胞的懸液體積對(duì)應(yīng)于1至200IU酶/kg體重。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特征，施用10-250ml的血細(xì)胞比容在40-70%之間的紅細(xì)胞懸液，血細(xì)胞比容優(yōu)選在45-55%之間，更優(yōu)選50%。根據(jù)一個(gè)特別的模式，在足夠長的時(shí)間中以15天至三個(gè)月的頻率施用這種懸液，優(yōu)選每月一次。將活性成分包封于紅細(xì)胞中的技術(shù)是已知的，并且在此優(yōu)選的通過裂解-重密封的基本技術(shù)描述于專利EP-A-101341和EP-A-679101，其可供本領(lǐng)域技術(shù)人員參考。根據(jù)此技術(shù)，透析器的第一隔室持續(xù)供應(yīng)紅細(xì)胞懸液，而第二隔室含有相對(duì)于紅細(xì)胞懸液低滲的水溶液以裂解紅細(xì)胞；接著，在重密封單元中，在所述酶存在下通過增加滲透壓和/或膨脹壓導(dǎo)致紅細(xì)胞的重密封，然后收集含有酶的紅細(xì)胞懸液。在迄今描述過的變化形式中，將優(yōu)選在法國專利申請(qǐng)No.0408667中描述的方法，其提供了高效、可重復(fù)、可靠和穩(wěn)定的酶包封方法。此方法包括以下步驟1-將濃縮紅細(xì)胞(packedredbloodcells,PRBC)(或血球濃縮物)懸于血細(xì)胞比容值大于或等于65。/。的等張溶液中，在+1至+8C冷藏，2-對(duì)來自相同PRBC的紅細(xì)胞樣品測量滲透脆性，其中步驟1和2可以任意次序進(jìn)行(包括平行)，3—在+1至+8X:維持恒定的溫度下進(jìn)行裂解和酶的內(nèi)化(特別是在一個(gè)和相同腔室中)，其包括將血細(xì)胞比容值大于或等于65%的紅細(xì)胞懸液和，:'l至+，'C冷藏的等張裂解溶液通過透析筒(dialysiscartridge);作4-重密封過程(特別是在第二腔室中進(jìn)行)，其中所述溫度為+30至+40x:，在高張溶液存在下進(jìn)行。"內(nèi)化"意為酶侵入紅細(xì)胞內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)特征，將PRBC懸于大于或等于65Y。、優(yōu)選大于或等于70%的高血細(xì)胞比容值的等張溶液中，將此懸液冷藏于+1至+8*C,優(yōu)選+2至+6'C，典型地約+4'C。根據(jù)一個(gè)特別的變化形式，所述血細(xì)胞比容值為65-80%,優(yōu)選70-80%。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)重要特征，在就要進(jìn)行裂解步驟之前測定紅細(xì)胞的滲透脆性。有利地，紅細(xì)胞或含有紅細(xì)胞的懸液處在接近或等于所選裂解溫度下。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)有利的特征，一旦獲得滲透脆性的測量值即迅速使用，即在取樣后很快進(jìn)行裂解過程。取樣和裂解開始之間的時(shí)間延遲優(yōu)選小于或等于30分鐘，甚至更優(yōu)選小于或等于25分鐘或甚至20分鐘?？煽刂仆肝龅膬蓚€(gè)參數(shù)是細(xì)胞在透析器中的停留時(shí)間(作為后者特性的函數(shù))和透析液的摩爾滲透壓濃度。必須相對(duì)于待進(jìn)行裂解/重密個(gè)參數(shù)。此滲透抗性可通過以下參數(shù)中至少一個(gè)進(jìn)行表征a.溶血出現(xiàn)時(shí)(即孔形成開始時(shí))介質(zhì)的摩爾滲透壓濃度。b.溶血速率V，從曲線％溶血=f(介質(zhì)的摩爾滲透壓濃度)的線性部分的斜率確定。c.給定摩爾滲透壓濃度的溶血百分?jǐn)?shù)。d.獲得50。/o溶血(Hso)的摩爾滲透壓濃度。e.獲得一定溶血百分?jǐn)?shù)(例如50%)的所需時(shí)間。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，滲透抗性通過參數(shù)b、d或b和d進(jìn)行表征。因此必須在短時(shí)間內(nèi)測定滲透脆性，與取樣和裂解開始之間的短時(shí)間延遲相適應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特征，通過半透膜，對(duì)已知等張性的低張溶液例如水(蒸餾水等)測定一個(gè)或多個(gè)這些溶血參數(shù)?？煽紤]手動(dòng)方法。然而，根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，使用自動(dòng)測量儀器測定滲透脆性，所述自動(dòng)測量儀器被設(shè)計(jì)用來在小于15分鐘內(nèi)，更特別地在小于12分鐘內(nèi)，優(yōu)選地在小于IO分鐘內(nèi)測定紅細(xì)胞樣品的滲透脆性，并且以短時(shí)間延遲利用所得結(jié)果來調(diào)節(jié)裂解參數(shù)，并開始裂解。可使用至少部分自動(dòng)操作以下所述手動(dòng)技術(shù)的儀器測定滲透脆性，所述手動(dòng)技術(shù)由J.V.Dacie描述于PracticalHaematology,2ndedition,Churchill,London1956。這種儀器的實(shí)例描述于J.Didelon等人的文章ClinicalHemorheologyandMicrocirculation23(2000)31-42。其原理基于使用這樣的裝置，在所述裝置中將待評(píng)價(jià)的紅細(xì)胞懸液樣品和合適體積的已知等張性的低張溶液(例如蒸餾水)置于半透膜的兩側(cè)，使得當(dāng)NaCl離子向溶液(例如蒸餾水)擴(kuò)散時(shí)產(chǎn)生慢的紅細(xì)胞溶血作用。通過用波長808nm激光照射測定透光率，來監(jiān)測一段時(shí)間內(nèi)的溶血過程(參看J.Didelon等，Biorheology37，2000:409-416)。光電池測量透過所述懸液的光的變化。例如，測量10分鐘。所述儀器提供一個(gè)或多個(gè)如上提到的參數(shù)a-e。根據(jù)第一個(gè)模式，在其中溫度變化不影響測量的情況下，對(duì)初始溫度為+1至+8'C的樣品測量滲透脆性，優(yōu)選也在此溫度下以蒸餾水測量。根據(jù)第二個(gè)模式，對(duì)溫度維持在+1至+8。C的樣品測量滲透脆性。因此，可對(duì)J.Didelon等人(同上)描述的測量儀器進(jìn)行改進(jìn)以允許溫度調(diào)整。所述溫度優(yōu)選接近或等于裂解溫度。一旦這些參數(shù)中的一個(gè)或多個(gè)已被確定，可應(yīng)用考慮所述一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的關(guān)系式，以確定透析器中細(xì)胞的流速或透析液的摩爾滲透壓濃度，在此濃度下足以獲得包封所述酶的紅細(xì)胞和/或期望量的后者紅細(xì)胞的流速=[Ax(H5())]+Bx(V)+K-A和B-可適應(yīng)透析器和裂解液的摩爾滲透壓濃度的關(guān)系式的變量-K-調(diào)節(jié)常數(shù)。透析液的摩爾滲透壓濃度=[Cx(H5o)+[Dx(V)1+K-C和D=可適應(yīng)透析器和透析器中紅細(xì)胞流速的關(guān)系式的變量。-K-調(diào)節(jié)常數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，當(dāng)紅細(xì)胞懸液的溫度為+1至+8""C且已測量滲透脆性且已記錄裂解參數(shù)時(shí)，開始裂解過程。才艮據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，測量帶來約50%溶血的以g/L計(jì)的NaCl濃度(參數(shù)d.)并根據(jù)所測量的濃度值調(diào)節(jié)透析筒中紅細(xì)胞懸液的流速。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，當(dāng)紅細(xì)胞懸液的溫度為+1至+8。C且已測量滲透脆性和已記錄裂解參數(shù)時(shí)，開始裂解過程。根據(jù)一個(gè)有利的特性，將待處理的初始懸液置于上述的裂解-內(nèi)化腔室中。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所迷方法使用配有溫度控制的冷藏模塊，在此模塊中置入一袋于+1至+8。C冷藏的紅細(xì)胞懸液，其已經(jīng)連接或隨后連接至一次性無菌可拆卸組件，所述一次性無菌可拆卸組件包含透析筒、將所述筒連接至所述袋以及連接至所述裂解液的管，并且此外所述模塊具有提供紅細(xì)胞懸液和裂解溶液的循環(huán)的裝置，其中所述模塊中的溫度穩(wěn)定在+1至+8。C的溫度。冷藏模塊的尺寸使得它能容納所述袋和所述一次性可拆卸組件。在所述單個(gè)冷藏模塊內(nèi)，由很多管連接在一起的袋、透析筒和裂解溶液的布置是根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)有利特征。術(shù)語"袋"指通常用于輸血和血衍生物領(lǐng)域中的柔性袋或小袋。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)重要的方面，采取步驟保持紅細(xì)胞在袋中處于均勻懸液中，以保持通過透析器的懸液的穩(wěn)定的血細(xì)胞比容值。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特征，所迷袋被配以回路中的外循環(huán)，其提供所述懸液出入所迷袋的循環(huán)。"透析筒"意為包含兩個(gè)被透析隔離物分離的隔室的單元，通過其可發(fā)生離子交換，通過向一隔室內(nèi)引入含鹽的水溶液，使得位于另一隔室中的水性溶液的滲透壓以可控方式改變。這種筒在醫(yī)藥領(lǐng)域中被廣泛使用。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的模式，使用中空纖維透析筒，例如具有以下的規(guī)格纖維內(nèi)徑為100-400nm，纖維的總外表面積0.3-2m2，纖維長度為10—40cm,超濾系數(shù)為1.5—8ml/h.mmHg。已經(jīng)提到，當(dāng)袋中懸液的溫度在+l至+8'C時(shí)可開始裂解過程。根據(jù)一個(gè)令人感興趣的變化形式，通過位于外部回路循環(huán)上的傳感器控制懸液的溫度。根據(jù)測定的滲透脆性，可針對(duì)兩個(gè)主要參數(shù)采取行動(dòng)，所述兩個(gè)參數(shù)為透析筒中紅細(xì)胞懸液的流速和裂解溶液的摩爾滲透壓濃度，優(yōu)選在兩種情況下對(duì)裂解溶液設(shè)定恒定流速。流速的值并非決定性的。通常，對(duì)如上所述的中空纖維透析筒而言，裂解溶液的流速被設(shè)定在50-300ml/min,優(yōu)選150-250ml/min。裂解溶液是相對(duì)于紅細(xì)胞懸液而言低張的鹽水溶液。當(dāng)其被^:定到恒定值時(shí)，裂解溶液的摩爾滲透壓濃度通?？蔀?0-120mOsm,優(yōu)選70—110mOsm，例如約90mOsm。舉例來說，裂解溶液可包含Na2HP04和/或NaH2P04和糖例如葡萄糖。根據(jù)第一個(gè)模式，調(diào)節(jié)通過透析筒的紅細(xì)胞懸液的流速，同時(shí)固定裂解緩沖液的流速和摩爾滲透壓濃度。滲透脆性越高意味著懸液流速越高。典型地，對(duì)于具有上述規(guī)格的筒而言，流速將需要在5-200ml/min的范圍內(nèi)變化，優(yōu)選為10-40ml/min。根據(jù)第二個(gè)模式，調(diào)節(jié)裂解溶液的摩爾滲透壓濃度，同時(shí)固定懸液和裂解溶液的流速。滲透脆性越高意味著裂解溶液摩爾滲透壓濃度越高。通常，摩爾滲透壓濃度將需要在10-200mOsm/l的范圍內(nèi)變化，優(yōu)選為20-150mOsm/1。根據(jù)第三個(gè)模式，通過透析筒的紅細(xì)胞懸液的流速和裂解溶液的摩爾滲透壓濃度均被調(diào)節(jié)。待包封的酶可存在于懸液袋中和/或可以引入優(yōu)選逐漸引入透析筒上游或下游的懸液循環(huán)中。由于被引入的體積小，因此酶的冷藏是任選的。優(yōu)選地，紅細(xì)胞懸液從與受體血型相容的PRBC制得，除去白細(xì)胞，沒有列出的病原體，特別是盛于袋中，例如500ml袋。當(dāng)意欲將紅細(xì)胞用于易于表現(xiàn)移植物/宿主免疫反應(yīng)的高度免疫抑制的患者時(shí)，其可被輻照過(R.J.Davey,Immunol.Invest.1995,24(1-2):143-149)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體特征，用于制備懸液的起始PRBC被事先處理以從血液中除去除紅細(xì)胞以外的成分。這種處理，例如以鹽水溶液洗滌以除去血漿或防腐溶液是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的。根據(jù)一個(gè)特別的模式，在待包封酶存在下進(jìn)行洗滌。可通過任何通常的技術(shù)進(jìn)行洗涂，例如用于紅細(xì)胞洗滌的四重袋(quadruple-bag)或4國袋技術(shù)(4-bag)(MacoPharma法和傳送袋)。也可使用COBE2991CellProcessor型的自動(dòng)紅細(xì)胞洗滌器。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)特征，可事先以增加和/或均勻化其滲透抗性的溶液處理紅細(xì)胞。這樣的溶液是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的。例如，含有L-肉堿的溶液可提供紅細(xì)胞滲透抗性的提高。作為另一些實(shí)例，我們可提及肝素、檸檬酸鹽-磷酸鹽-右旋糖(CPD)和甘露醇的溶液。裂解步驟的溫度優(yōu)選地保持在+2至+6x:,甚至更優(yōu)選在+4t:左右。優(yōu)選地通過加熱所述裂解后懸液和加入高張重密封溶液來進(jìn)行重密封步驟。重密封溫度可為+30至+40。C。其優(yōu)選為+35至+38'C，例如約37'C。孵育典型地可持續(xù)15至45分鐘。優(yōu)選地，將離開透析筒的懸液和高張重密封溶液引入優(yōu)選連續(xù)引入到中間袋中。在此加熱懸液并在期望溫度下孵育足夠時(shí)間以確保重密封。根據(jù)一個(gè)特別的方面，將所述中間袋置于加熱模塊或容器中，調(diào)節(jié)其內(nèi)部溫度到所選溫度。作為一種變化形式，將懸液和重密封溶液引入中間袋中。當(dāng)所有懸液已被收集到此袋中時(shí)，將其密封并轉(zhuǎn)移至加熱模塊并在期望溫度下孵育。重密封紅細(xì)胞的懸液隨后可經(jīng)歷一個(gè)或多個(gè)以鹽水溶液洗滌的步驟，以除去重密封不好的或未重密封的細(xì)胞、殘留物和細(xì)胞外血紅蛋白。根據(jù)另一個(gè)特征，將紅細(xì)胞包裝于紅細(xì)胞存儲(chǔ)溶液中，例如含有L-肉堿的存儲(chǔ)溶液。所制備的紅細(xì)胞優(yōu)選存儲(chǔ)于+1至+8'C的溫度下，優(yōu)選+2至+6'C，典型地約+4'C。產(chǎn)品的最終血細(xì)胞比容值優(yōu)選為40-80%,典型地為40-70%。可使用裂解-重密封裝置實(shí)施本發(fā)明，所述裝置包含-可在+1至+8X:的溫度下冷藏的模塊，其包括制冷裝置和溫度調(diào)節(jié)裝置，-一次性無菌可拆卸組件，所述組件設(shè)計(jì)用于配合所述模塊并且包括透析筒，所述透析筒一方面可連接至裂解溶液進(jìn)料口，另一個(gè)方面可連接至紅細(xì)胞懸液進(jìn)料口，-用于控制通過裂解筒的紅細(xì)胞懸液的流速和/或調(diào)節(jié)裂解溶液的摩爾滲透壓濃度的裝置，其中所述控制和調(diào)節(jié)作為待處理紅細(xì)胞滲透脆性的函數(shù)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述可拆卸組件為一次性試劑盒并包含袋和管，所述袋含有紅細(xì)胞懸液，所述管將所述袋連接至透析筒，并且所述模塊包含與所述管聯(lián)合工作以使紅細(xì)胞懸液從所述袋到達(dá)和通過所述筒的泵，所述泵任選地與流量調(diào)節(jié)裝置相連。該組件確保維持無菌。根據(jù)一個(gè)有利的特征，所述袋還配有兩端以回路連接至所述袋的管，且所述模塊包含與所述管聯(lián)合工作以提供袋內(nèi)容物進(jìn)出所述袋的循環(huán)的泵。根據(jù)另一個(gè)有利的特征，在所述管回路上配置有溫度傳感器。根據(jù)另一個(gè)特征，酶注射管與連接所述袋與透析筒之"血液，，入口的管相連。根據(jù)另一個(gè)特征，透析筒通過管與瓶相連，所述瓶可容納裂解溶液，且冷藏模塊包含用于接收所述瓶和泵的裝置，所述泵可與所述管聯(lián)合運(yùn)行以使裂解溶液到達(dá)和通過透析筒。根據(jù)一個(gè)特征，制冷和溫度控制裝置能維持所述模塊中的溫度在+2至+6'C，優(yōu)選地約為+4'C。根據(jù)另一個(gè)特征，透析筒的"血液"出口與出口管相連，所述出口導(dǎo)管導(dǎo)向或能導(dǎo)向所述模塊外部。根據(jù)另一個(gè)特征，用于活性成分注射的管與所述出口管相連。該出口管可與第二袋(中間袋)相連，所述第二袋能在裂解后收集紅細(xì)胞懸液和重密封溶液(優(yōu)選通過開口入其開口稍上游之出口管內(nèi)的第二管引入中間袋中)。所述袋有利地被配置在第二模塊內(nèi)，所述第二模塊配有控制所述模塊內(nèi)溫度在+30至+40。C、優(yōu)選+35至+38。C的裝置。根據(jù)一個(gè)有利的實(shí)施方案，一次性可拆卸組件包含所有以下部分袋、循環(huán)管、注射管(配有注射設(shè)備或者意在與這種設(shè)備聯(lián)合運(yùn)作的接受器)、透析筒、以及優(yōu)選地裂解溶液瓶。優(yōu)選地，可移動(dòng)組件自身不具有意在冷藏或加熱的特定裝置。這些功能僅通過模塊或腔室提供，其中所述組件的兩部分置于所述模塊或腔室中。用于本發(fā)明方法和裝置的泵優(yōu)選為蠕動(dòng)泵；根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述泵提供懸液進(jìn)出初始袋的再循環(huán)并且用于使裂解緩沖液循環(huán)的泵具有預(yù)定的恒定轉(zhuǎn)速，而將懸液送到透析筒的泵具有的轉(zhuǎn)速可以作為待處理紅細(xì)胞的滲透脆性的函數(shù)來控制?？赏ㄟ^任何合適的裝置引入酶，例如固定流量注射泵，任選被驅(qū)動(dòng)，與相應(yīng)的注射管連接。作為一種變化形式，所述注射泵可被蠕動(dòng)泵替代。所述設(shè)備包括控制通過裂解筒的紅細(xì)胞懸液流速和/或調(diào)節(jié)裂解溶液的摩爾滲透壓濃度的裝置，其中所述流速和濃度作為待處理紅細(xì)胞的滲透脆性的函數(shù)。根據(jù)一個(gè)特征，流速調(diào)節(jié)裝置設(shè)計(jì)成控制將懸液發(fā)送到透析筒的泵。根據(jù)另一個(gè)可替代的特征，調(diào)節(jié)裝置設(shè)計(jì)成調(diào)節(jié)裂解溶液的摩爾滲透壓濃度，或者通過稀釋以降低摩爾滲透壓濃度，或者通過引入合適的溶質(zhì)提高所述摩爾滲透壓濃度。作為一個(gè)變化形式，將根據(jù)待處理紅細(xì)胞滲透脆性而調(diào)節(jié)摩爾滲透壓溶度的裂解溶液引入所述模塊中。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的模式，所述設(shè)備包括用于控制裂解過程和任選地重密封過程的電子裝置，所述控制是根據(jù)操作者輸入的指令(例如操作者直接輸入關(guān)于紅細(xì)胞懸液流速的數(shù)據(jù))，或者根據(jù)操作者輸入的與滲透脆性相關(guān)的數(shù)據(jù)(所述電子裝置然后被設(shè)計(jì)成用于確定和調(diào)節(jié)裂解參數(shù)，例如紅細(xì)胞懸液的流速)。所述電子裝置優(yōu)選連接溫度傳感器(用于控制模塊內(nèi)的溫度和/或紅細(xì)胞懸液溫度傳感器處的溫度)。所述裝置能控制并操作泵，例如通過透析筒的懸液的壓力和流速。優(yōu)選地，所述模塊至少在一面配有玻璃表面，用于視覺控制安裝以及溶液與懸液的循環(huán)。現(xiàn)將參考附圖在用作非限定性實(shí)例的實(shí)施方案的基礎(chǔ)上更詳細(xì)地對(duì)本發(fā)明作出描述，其中-圖l為根據(jù)本發(fā)明的裂解-重密封設(shè)備的示意圖；-圖2為所述方法的流程圖；-圖3為舉例說明在有或無ADI(精氨酸脫亞胺酶)的情況下，紅細(xì)胞上清液中精氨酸對(duì)比瓜氨酸濃度的圖；-圖4和圖5代表關(guān)于紅細(xì)胞中精氨酸和瓜氨酸濃度的藥代動(dòng)力學(xué)的圖；對(duì)于三組以ADILE(荷載精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞)、ADI(游離的精氨酸脫亞胺酶)十RBC、或RBC處理的小鼠，圖4表明精氨酸濃度隨時(shí)間的變化(至處理后48小時(shí))，圖5表明瓜氨酸濃度隨時(shí)間的變化(至處理后48小時(shí))。本文使用RBC或BC指紅細(xì)胞。實(shí)施例1:裝置首先參考圖1。由虛線表示的第一方框描述具有大體形狀為平行六面體的第一模塊l,所述第一模塊l具有玻璃覆蓋的前面(未顯示)，其被配置成能打開和關(guān)閉。此模塊的后部有蠕動(dòng)泵Pl、P2和P3以及現(xiàn)將描述的接收可拆卸組件的裝置(未顯示)。泵Pl和P3具有預(yù)定的恒定輸送量?？刂票肞2以使其輸送量變化。所述可拆卸組件包括體積可變的袋2，所述袋2容納待裂解的紅細(xì)胞懸液。所述袋2配以柔性管3，所述柔性管3以回路與泵Pl聯(lián)合運(yùn)行以提供進(jìn)出袋的循環(huán)從而維持紅細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)。所述袋還在其底部與柔性管4連接，所述柔性管4與透析筒5之"血液"隔室的入口相連。所述管4與泵P2聯(lián)合運(yùn)行，其提供懸液從所述袋到筒的循環(huán)。驅(qū)動(dòng)注射泵PS1與筒5上游的管4相連，且所述注射泵使得可以將酶引入紅細(xì)胞循環(huán)中。筒5的"血液"隔室的出口與出口柔性管6相連，所述出口柔性管6開口于模塊1的外部。第二驅(qū)動(dòng)注射泵PS2與管6相連，且此注射泵使得可以將酶引入到裂解紅細(xì)胞循環(huán)中。容納裂解溶液的瓶7被布置在模塊1中并通過柔性管8與筒5的"透析液"入口相連，所述柔性管8與泵P3聯(lián)合運(yùn)行以提供裂解溶液通過筒5的循環(huán)。最后，離開所述筒的裂解溶液通過柔性排出管9從模塊1除去，所述柔性排出管9的末端在位于模塊1外面的瓶10中。出口管6進(jìn)入大體形狀為平行六面體的第二模塊11，所述笫二模塊ll具有玻璃覆蓋的前面(未顯示)，其被配置成能被打開和關(guān)閉。此模塊的后部有接收形成可拆卸組件之部分的元件的裝置(未顯示)，該組件剛剛被部分描述。所述元件包含柔性袋12,所述柔性袋12與管6相連，并且其中將存儲(chǔ)裂解溶液。驅(qū)動(dòng)注射泵PS3與管6相連以注射重密封產(chǎn)品?？刹鹦督M件完全由柔性、透明的塑料制成，以便過程完全可見。所述設(shè)備還配有未顯示的多種裝置-用于冷卻模塊l內(nèi)部并調(diào)節(jié)其溫度在+2至+4'C的裝置，其包括位于管3上的用于測量其中懸液循環(huán)溫度的傳感器，以及用于測定模塊l內(nèi)部溫度T1的傳感器，-模塊11還配有加熱其內(nèi)部并調(diào)節(jié)其中溫度T2在+37至+38'C的裝置；在該模塊內(nèi)安放溫度傳感器。-用于在Dl和D2處檢測管內(nèi)紅細(xì)胞存在的裝置(例如超聲或比色)，-用于測量透析筒入口壓力的裝置PR1。-電子設(shè)備，其一方面接收從溫度和壓力傳感器以及檢測裝置傳來的數(shù)據(jù)，另一方面接收關(guān)于裂解參數(shù)設(shè)定的數(shù)據(jù)；基于所述數(shù)據(jù)，該設(shè)備控制泵P1、P2和P3。流程圖見圖2。所述電子設(shè)備包括計(jì)算機(jī)，其被設(shè)計(jì)成執(zhí)行上述流程圖。所述設(shè)備的執(zhí)行導(dǎo)致含有酶的含紅細(xì)胞懸液的袋12的復(fù)原。實(shí)施例2:制備包封精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞從患者取400ml血液。將保存在4"€的血液脫除白細(xì)胞并以鹽水溶液洗以除去血漿，并置于250ml體積的柔性袋中，調(diào)整血細(xì)胞比容至80%。將精氨酸脫亞胺酶的水性溶液加到紅細(xì)胞懸液中以得到400IU酶/ml的濃度及70%的血細(xì)胞比容。取lml于4匸的懸液并將其置于前面引用的J.Didelon等人2000年描述的測定滲透脆性的儀器中，其工作原理在前面描述過。測量持續(xù)10分鐘。該儀器使其可以確定給出50。/。溶血的鹽度。該鹽度通常為3-5.5gNaCl/升。將含有紅細(xì)胞懸液和酶的250ml容量的柔性袋2置于實(shí)施例1的裝置中，允許懸液和低張裂解溶液逐漸進(jìn)入各自的透析筒隔室中。作為前述步驟中測定的鹽度參數(shù)(滲透脆性或抗性)的函數(shù)，控制透析器中紅細(xì)胞懸液的流速為15-30ml/min。將重密封溶液以10%v/v加入緊接袋12上游的裂解紅細(xì)胞懸液中。將懸液于371C在袋中孵育30分鐘。然后將其以鹽水溶液洗滌，向其加入防腐溶液(SAG-甘露醇)，然后將此袋在+4X:存儲(chǔ)直到其被使用。此方法使得可以獲得酶活性為80-180IU/ml純紅細(xì)胞的紅細(xì)胞。根據(jù)通常的輸血實(shí)踐，將全部體積的懸液通過靜脈輸注給患者施用。實(shí)施例3:體外試驗(yàn)精氨酸脫亞胺酶是一種精氨酸分解代謝酶，其將精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣习彼岷秃蔽?ammoniac)。本研究的目的在于觀察并確認(rèn)得自綠膿桿菌(Psw^附rmasaen^/wosfl)的精氨酸脫亞胺酶一旦被包封到紅細(xì)胞中后的消除活性。在此目的中，荷載精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞與含有精氨酸的緩沖液一起孵育。隨后通過HPLCMSMS方法評(píng)價(jià)瓜氨酸和精氨酸水平。制備荷載精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞(RBG)重組的含SeMet的L-精氨酸脫亞胺酶(ADI)(120Ul/ml)的溶液源自綠膿桿菌。新鮮肝素化OF1小鼠血液得自CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室，將所述血液離心(800g，于4。C10分鐘)以除去血漿和血沉棕黃層(buffycoat)。將濃縮紅細(xì)胞以0.9%NaCl洗滌3次(800g，于4。C10分鐘)(l:1v/v)。在最終洗滌后，將紅細(xì)胞與(CGR-ADI)或不與(CGR-LR)20Ul/ml精氨酸脫亞胺酶混合，并調(diào)整RBC懸液的血細(xì)胞比容到70%(使用AD溶液或鹽水)。通過連續(xù)流透析過程(截止值10Kd)進(jìn)入透析袋而獲得紅細(xì)胞的裂解。在4TC對(duì)足夠體積的40mOsm/1的裂解緩沖液(NaH2P04，2H200.73g/l;Na2HP04，12H205.035g/l;葡萄糖0.36g/1)進(jìn)行低張步驟60分鐘。每引入lml紅細(xì)胞加入100ml低張溶液。收集后，將裂解紅細(xì)胞懸液在37C孵育10分鐘。然后通過在37"于1/10(v/v)的重密封溶液(腺噪呤0.39g/l;肌苷15.6g/l;丙酮酸鈉6.4g/1;NaH2P04，H204.9g/1;NaHP04,12H2010.9g/1,葡萄糖11.5g/1;NaCl50g/l)中孵育30分鐘將所述細(xì)胞重密封并退火。重密封后將紅細(xì)胞在310mOsm/l、pH7.4含4%BSA的Tris中洗滌3次(800g,于4。C10分鐘)。在透析步驟之前和之后，使用CobasMicros601CS14/12細(xì)胞計(jì)數(shù)器監(jiān)測全血和RBC懸液的血細(xì)胞比容(Ht)、平均細(xì)胞體積(MCV)、平均細(xì)胞血紅蛋白(MCHC)和平均細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)。透析后CGR-ADI和CGR-LR懸液的血細(xì)胞比容為25%。在透析步驟之前和之后，收集RBC懸液(有或無ADI)的試樣用于隨后的ADI活性測定。ADI活性測定在透析之前和之后，對(duì)收集的RBC懸液(CGR-ADI和CGR-LR)的試樣進(jìn)行ADI活性測定。在透析前通過用0.9%NaCl適當(dāng)稀釋將CGR-ADI和CGR-LR試樣的血細(xì)胞比容從70%調(diào)節(jié)到40%。透析后CGR-ADI和CGR-LR試19樣懸液的血細(xì)胞比容為25%且未被調(diào)整。通過測量全血或上清液中ADI活性確定ADI包封率。為測定全血中的ADI活性，將三分之一的RBC懸液試樣在液氮中冷凍5分鐘并在37X:溫?zé)?，然后使?0nl在50mMMES中的冷凍RBC10倍稀釋液進(jìn)行酶活性測定。為確定紅細(xì)胞外的酶活性，將另外三分之二的紅細(xì)胞懸液在4C離心10分鐘，并使用10nl在50mMMES中的上清液2倍稀釋液進(jìn)行酶測定。通過Prescott和Jones的比色法對(duì)10分鐘內(nèi)形成的瓜氨酸量進(jìn)行定量。標(biāo)準(zhǔn)測定混合物含有900nlMES緩沖液0.1MpH6.0、20mMMgCl2和10上清液或者冷凍RBC樣品。通過加入lml10mML-精氨酸開始反應(yīng)并允許反應(yīng)在37X:持續(xù)5、10、15或20分鐘。通過加入lml安替比林-二乙酰單肟溶液使反應(yīng)在這些不同時(shí)間停止。將混合物煮沸20分鐘并測定在466nm的吸光度。通過適當(dāng)稀釋瓜氨酸儲(chǔ)備液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。15至20分鐘之間的ADI活性被定義為每分鐘由酶形成的瓜氨酸的微摩爾數(shù)。所有測定均雙份進(jìn)行。體外功能性測定通過在含有精氨酸的緩沖液中孵育荷載精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞(CGR-ADI)并觀察精氨酸和瓜氨酸氨基酸的水平來完成體外測定。以未對(duì)照。將1ml預(yù)溫?zé)岬暮奢d精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞(CGR-ADI)與1ml含有300jiM精氨酸、20mMMgCl2的pH7.4Tris緩沖液混合。Tris緩沖液以320mOsm/kgpH7.4制備。通過在同樣條件下將等價(jià)量CGR-LR與含有精氨酸的緩沖液相混合完成對(duì)照測定。混合通過上下運(yùn)動(dòng)而實(shí)現(xiàn)。將400jil代表時(shí)間0的樣品迅速收集在ependorf管中并在41C放置。將余下的混合物在37'C孵育30分鐘。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將400jil代表時(shí)間30(30分鐘)的樣品收集在ependorf管中并在4tl放置。對(duì)于所有收集的400pl樣品，將四分之三(300nl)在4'C離心10分鐘。離心后，收集100nl上清液試樣并在-20。C冷凍。將另外四分之一直接在液氮中冷凍五分鐘。在37'C溫?zé)岷?，收?0nl的樣品試樣并在-20°C冷凍。然后通過HPLC/MS/MS方法對(duì)每個(gè)樣品中的精氨酸和瓜氨酸水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果見圖3。在37'C下于30分鐘內(nèi)，包裹ADI的RBC能使介質(zhì)(上清液)中的精氨酸從約135nmol/L消耗到約42nmol/L。在同樣時(shí)間內(nèi)，介質(zhì)(紅細(xì)胞夕卜)中的瓜氨酸濃度從約17nmol/L到約110nmol/L。上清液中的ADI活性在檢測限以下(<0.1U1/MI)。在RBC沉淀中測量的活性為2.56Ul/mL。其證明精氨酸脫亞胺作用是由紅細(xì)胞內(nèi)ADI提供的，且精氨酸進(jìn)入紅細(xì)胞而被消化。此外，強(qiáng)烈提示進(jìn)入紅細(xì)胞產(chǎn)生的瓜氨酸通過紅細(xì)胞膜進(jìn)入RBC外介質(zhì)中。關(guān)于對(duì)照RBC，其為處理過的紅細(xì)胞，其中ADI以鹽水替代，來自RBC外介質(zhì)的精氨酸在37X:于30分鐘內(nèi)僅從約165nmol/L降到約157nmol/L，瓜氨酸僅從約1nmol/L達(dá)到約2nmol/L。這種低消耗可通過進(jìn)入RBC的精氨酸酶的內(nèi)源活性來解釋。我們?cè)俅螐?qiáng)調(diào)精氨酸酶在精氨酸消化期間不產(chǎn)生瓜氨酸，其對(duì)ADI是特異性的。實(shí)施例4:作為對(duì)注射兩種精氨酸脫亞胺酶制劑響應(yīng)的小鼠血漿中精氨酸濃度的動(dòng)力學(xué)研究本研究的目的在于探尋作為對(duì)注射荷載精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞響應(yīng)的OF1小鼠中精氨酸和瓜氨酸的血漿藥代動(dòng)力學(xué)。試驗(yàn)和對(duì)照物質(zhì)的制備重組的含SeMet的L-精氨酸脫亞胺酶(ADI)(120Ul/ml)來源于綠膿桿菌。在洗后小鼠紅細(xì)胞(RBC)和Sag-甘露醇1/3(v/v)(Haemonetics)中稀釋游離精氨酸脫亞胺酶(ADI+RBC)，以得到最終濃度10Ul/ml的血細(xì)胞比容50%的濃縮RBC。在加入前以10mMMgCl2補(bǔ)充Sag-甘露醇。試驗(yàn)物質(zhì)(ADILE)由荷載精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞(RBC)組成。荷載精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞的制備過程如ADI的體外功能性試驗(yàn)中所描述而確定。透析前將ADI與洗后濃縮紅細(xì)胞混合，以具有50Ul/ml的最終濃度。透析后，包封RBC與添加10mMMgCh的Sag-甘露醇1/3(v/v)相混合。最終血細(xì)胞比容調(diào)節(jié)至50%。包封后獲得的ADI活性為8.35Ul/ml的血細(xì)胞比容50%的包封RBC。以最終血細(xì)胞比容為50%重懸于Sag-甘露醇(以10mMMgCl2補(bǔ)充)的洗后RBC來制備無酶的第三種樣品(CGR)。加入鹽水溶液來代替ADI。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用CobasMicros601CS14/12細(xì)胞計(jì)數(shù)器來監(jiān)測透析步驟之前和之后的全血和RBC懸液的血細(xì)胞比容(Ht)、平均細(xì)胞體積(MCV)、平均細(xì)胞血紅蛋白(MCHC)和平均細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)。在透析步驟之前和之后，收集RBC懸液的試樣用于隨后的ADI活性測定。如前所述確定ADI活性測定方法。動(dòng)物64只OFl雌性小鼠，5-6周齡，重18-22g，取自CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室(L，Arbresle,法國)。在處理前在無特定病原體級(jí)(SPF)的動(dòng)物飼養(yǎng)中心觀察動(dòng)物7天。試驗(yàn)方案由法國農(nóng)業(yè)和研究部批準(zhǔn)。將64只健康OF1小鼠隨機(jī)分為4只小鼠的1個(gè)組和20只小鼠的3個(gè)組。處理小鼠接受通過靜脈內(nèi)途徑的單次注射，注射體積為250pl。處理日程表處理日程表按以下進(jìn)行選擇來自組1的小鼠不處理；來自組2的小鼠用血細(xì)胞比容50%的洗后小鼠紅細(xì)胞(RBC)處理；來自組3的小鼠接受荷載精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞(ADILE)的單次注射；組4的小鼠接受在血細(xì)胞比容50"/。的洗后小鼠RBC懸液中的游離精氨酸脫亞胺酶(ADI+RBC)的單次注射。不同的產(chǎn)品樣品以雙盲方式來施用。處理后，通過心臟穿刺處死小鼠。在處死之前4吏用IsofluraneForene(Centravet，Bondoufle，法國)麻醉小鼠。小鼠的處死按下表描述進(jìn)行。在肝素鋰玻璃管中收集約800pi全血并在收集后迅速保存在水-水浴中。將血樣迅速在+4t:以2,500g離心10分鐘以獲得血漿。將約200nl血漿轉(zhuǎn)移到聚丙烯管中，迅速在-2ox:冷凍。將余下的血細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)入聚丙烯管中，迅速在-20"C冷凍直到分析。在一小管血漿和血細(xì)胞沉淀中測量精氨酸和瓜氨酸的水平。氨基酸分析在提取精氨酸和瓜氨酸后以HPLC/MS/MS法測定血漿和血細(xì)胞沉淀中精氨酸和瓜氟酸的濃度。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>NA:不適用結(jié)果參見圖4-51)考慮到紅細(xì)胞沉淀中精氨酸的劑量，在接受游離或包裹ADI的小鼠中觀察到濃度的強(qiáng)烈和迅速的降低。在接受正常RBC的小鼠中，未只見察到明顯改變。然而，對(duì)ADI游離組(ADI+RBC)而言，在12小時(shí)內(nèi)精氨酸的濃度回到正常值；對(duì)包泉ADI(ADILE)而言，在至少48小時(shí)內(nèi)精氨酸的濃度維持非常低的水平。2)在消耗精氨酸的同時(shí)，產(chǎn)生瓜氨酸。然而，觀察到盡管對(duì)于ADILE而言高水平維持多達(dá)48小時(shí)，而對(duì)于ADI+RBC組則在24小時(shí)內(nèi)回到正常值。在接受正常RBC的小鼠中，未觀察到明顯變化。這證明通過裂解/重密封步驟可以將ADI包裹在RBC中，且荷載到RBC中的ADI比游離溶液中ADI的效率長得多。權(quán)利要求1.含精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞在制備用于降低體內(nèi)血漿精氨酸濃度的藥物產(chǎn)品中的用途。2.權(quán)利要求l的用途，用于治療精氨酸依賴的腫瘤。3.權(quán)利要求2的用途，用于治療肝癌。4.權(quán)利要求2的用途，用于治療惡性黑色素瘤。5.權(quán)利要求l的用途，用于抑制一氧化氮合成。6.權(quán)利要求l的用途，用于預(yù)防和/或治療感染性休克。7.權(quán)利要求2的用途，用于治療乳癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤或T-細(xì)胞淋巴母細(xì)胞白血病或抑制血管生成或治療相關(guān)疾病。8.含精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞。9.權(quán)利要求8的紅細(xì)胞，其懸于藥學(xué)可接受的液體中。10.含權(quán)利要求8或9的紅細(xì)胞或紅細(xì)胞懸液的藥物產(chǎn)品。11.權(quán)利要求10的藥物產(chǎn)品，用于降低血漿精氨酸濃度。12.權(quán)利要求10的藥物產(chǎn)品，用于治療精氨酸依賴的胖瘤。13.權(quán)利要求12的藥物產(chǎn)品，用于治療選自以下的腫瘤惡性黑色素瘤、肝癌、乳癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和T-細(xì)胞淋巴母細(xì)胞白血病，或用于抑制血管生成或用于治療相關(guān)疾病。14.權(quán)利要求10的藥物產(chǎn)品，用于抑制NO的合成。15.權(quán)利要求14的藥物產(chǎn)品，用于預(yù)防和/或治療感染性休克。全文摘要含精氨酸脫亞胺酶的紅細(xì)胞在制備用于降低體內(nèi)精氨酸血漿濃度的藥物產(chǎn)品中的用途。所述用途特別涉及治療精氨酸依賴的腫瘤例如肝癌和惡性黑色素瘤、或抑制一氧化氮合成、以及預(yù)防和/或治療感染性休克。文檔編號(hào)A61K38/50GK101163497SQ200680013742公開日2008年4月16日申請(qǐng)日期2006年4月25日優(yōu)先權(quán)日2005年4月25日發(fā)明者揚(yáng)·戈德弗蘭,皮埃爾-奧利維耶·瓜諾申請(qǐng)人:愛瑞泰克藥物公司