專利名稱：：用于修復(fù)心臟組織的方法和組合物的制作方法用于修復(fù)心臟組織的方法和組合物發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及修復(fù)和/或再生心臟組織的方法以及實(shí)現(xiàn)這種修復(fù)和/或再生的組合物。發(fā)明背景哺乳動(dòng)物尤其是人類心臟組織的再生長期以來是醫(yī)學(xué)界的期望。就一些組織而言，人體組織的修復(fù)大部分是依靠移植來自供體的相似組織來實(shí)現(xiàn)。組織移^fc^本上是以自Herrick雙胞胎中一個(gè)到另一個(gè)的腎臟移植開始的，后來，南非醫(yī)生ChristianBarnard在1967年12月3日將DeniseDarval的心臟移植給LouisWashkansky，這使得這一技術(shù)舉世聞名，從此組織移植成為了用于延長晚期病人壽命的廣泛接受的方法。人體組織移植從其最初應(yīng)用開始就遇到了重大問題，主要是由于身體的天然免疫系統(tǒng)而產(chǎn)生的組織排斥。這經(jīng)常造成應(yīng)用組織移植僅能延長非常有限的壽命(Washkansky手術(shù)后只活了18天)。為了克服身體免疫系統(tǒng)的問題，很快開發(fā)出了許多抗排斥藥(比如Imuran、環(huán)孢霉素)以抑制免疫系統(tǒng)并因此延長組織在排斥之前的應(yīng)用。但是，排斥問題仍然產(chǎn)生了對組織移植替代方法的需求。近年來，研究人員使用多能性胚胎干細(xì)胞作為組織移植的替代方案進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。使用胚胎干細(xì)胞所基于的理論是它們在理論上能夠用于再生身體內(nèi)幾乎任何組織。然而，胚胎干細(xì)胞在組織再生上的應(yīng)用也遇到了問題。在這些問題中較為嚴(yán)重的有，所移植的胚胎干細(xì)胞的的可控性有限，它們有時(shí)生長成為腫瘤，并且可用于研究的人胚胎干細(xì)胞將受到患者免疫系統(tǒng)的排斥(Nature,June17,2002:Pearson,"StemCellHopesDouble",ncws@imture.com,publishedonline:21June2002)。另夕卜，胚胎干細(xì)胞的廣泛應(yīng)用還負(fù)擔(dān)了倫理、道德和政治因素，使得其廣泛應(yīng)用仍然存在疑問。干細(xì)胞的多能性特點(diǎn)首先在骨髓中得到的成體干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。Verfaille，C.M.etal"Pluripotencyofmesenchymalstemcellsderivedfromadultmarrow.TV"似fe417，publishedonline20June;doi:10.1038/nature00卯0，(2002)citedbyPearson,H.Stemcellhopesdouble,news@nature.com,publishedonline:21June2002;doi:10.1038/news020617-ll。Boyseetal.，美國專利No.6,569,427Bl公開了低溫保存以及低溫保存的胎兒和新生兒血液可用于治療或預(yù)防多種疾病與病癥如貧血、惡性腫瘤、自身免疫病和多種免疫功能障礙及缺陷。Boyse還乂〉開了使用異源基因序列的造血重建在基因治療中的應(yīng)用。但是，Boyse的公開缺乏用于治療應(yīng)用的細(xì)胞擴(kuò)增。臍帶血庫CorCell提供了對臍帶血干細(xì)胞擴(kuò)增、低溫保存和移植的統(tǒng)計(jì)。"ExpansionofUmbilicalCordBloodStemCells",InformationSheetUmbilicalCordBlood,CorCell，Inc.(2003).—種擴(kuò)增方法7>開了4吏用一種生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器具有位于中央的基于膠原蛋白的基質(zhì)。ResearchCenterJulich:BloodStemCellsfromtheBioreactor.PressreleaseMay17,2001。研究繼續(xù)致力于闡明干細(xì)胞擴(kuò)增中涉及的分子機(jī)制。例如，CorCell的文章公開了，名為A-l的信號分子輔助臍帶血干細(xì)胞的發(fā)育。OhishiK.etal"Delta-1enhancesmarrowandthymusrepopulatingabilityofhumanCD34+/CD38-cordbloodcells.Clin.Invest.110:1165-1174(2002)。因此，需要提供不基于器官移植或應(yīng)用胚胎干細(xì)胞的修復(fù)心臟組織的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及修復(fù)心臟組織和補(bǔ)充心臟細(xì)胞的方法，其具體通過使用血液干細(xì)胞組合物和身體的自我修復(fù)能力來實(shí)現(xiàn)，所述組合物包含來源于TVEMF擴(kuò)增的血的成體干細(xì)胞，優(yōu)選經(jīng)TVEMF擴(kuò)增。用于治療需要心臟修復(fù)的哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)的本發(fā)明方法包括將治療有效量的來源于血的經(jīng)擴(kuò)增成體干細(xì)胞引入哺乳動(dòng)物，所述成體干細(xì)胞經(jīng)過TVEMF擴(kuò)增，且每單位體積中的細(xì)胞數(shù)是其來源的血液中的每單位體積中細(xì)胞數(shù)的至少七倍，其中經(jīng)TVEMF擴(kuò)增的干細(xì)胞保持其三維幾何結(jié)構(gòu)(three-dimensionalgeometry)及其細(xì)胞-細(xì)胞支持(cell-to-cellsupport)以及細(xì)胞-細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)(cell-to-cellgeometry)。所述方法包括在足以允許人體系統(tǒng)利用所i^ii細(xì)胞有效修復(fù)受損心臟組織的時(shí)間中進(jìn)行這樣的引入。本發(fā)明還部分涉及來自哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)的用于修復(fù)心臟組織的血液干細(xì)胞組合物，優(yōu)選地，其中所述干細(xì)胞經(jīng)過TVEMF擴(kuò)增。本發(fā)明還涉及來自哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)的血液干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞單位體積中的數(shù)目是它們來源材料(例如，TVEMF擴(kuò)增之前干細(xì)胞的血來源)的至少7倍；并且其中所iiifiL液干細(xì)胞的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)與天然(優(yōu)選來源的)血中的干細(xì)胞相同或基;M目同。這些細(xì)胞優(yōu)選通過本文所述的TVEMF擴(kuò)增方法制得。本發(fā)明也涉及包含這些細(xì)胞的組合物，其按照需要添加其它成分，包括可藥用載體、低溫保存劑和細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明還涉及通過以下步驟制備用于修復(fù)心臟組織的干細(xì)胞和干細(xì)胞組合物的方法將血混合物置于TVEMF生物反應(yīng)器的培養(yǎng)室中，對血混合物施加TVEMF，以及在TVEMF生物反應(yīng)器中TVEMF擴(kuò)增血液干細(xì)胞以制備經(jīng)TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞和干細(xì)胞組合物。優(yōu)選地，施加在細(xì)胞上的TVEMF為約0.05高斯到約6.0高斯。本發(fā)明還涉及通過以下步驟低溫保存所述經(jīng)擴(kuò)增干細(xì)胞的方法將其溫度降低至-120。C到-196。C并持續(xù)一年或更長，之后將溫度升高到適于將所述細(xì)胞引入哺乳動(dòng)物的溫度。本文也包含了用于修復(fù)心臟組織的組合物，以及這種組合物和/或擴(kuò)增的血液干細(xì)胞本身在制備用于修復(fù)或再生心臟組織的藥物中的用途。附圖簡述附圖中，圖1以示意圖方式舉例說明了生物反應(yīng)器的培養(yǎng)載體流程(flowloop)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案；圖2是本發(fā)明的TVEMF生物>^應(yīng)器的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的側(cè)視圖3是圖2的TVEMF生物反應(yīng)器的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的側(cè)面投影圖4是TVEMF生物反應(yīng)器的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的俯視截面圖；圖5是TVEMF生物反應(yīng)器的俯M截面圖；圖6是隨時(shí)間變化電磁力裝置的側(cè)視圖，該裝置能容納生物反應(yīng)器并向生物反應(yīng)器4C供隨時(shí)間變化的電磁力；圖7是圖6所示裝置的前視圖；圖8是圖6所示裝置的前視圖，進(jìn)一步顯示其中的生物反應(yīng)器。附圖詳述用最簡單的話來說，旋轉(zhuǎn)式TVEMF生物反應(yīng)器包含細(xì)胞培養(yǎng)腔室和隨時(shí)間變化的電磁力源。在運(yùn)行中，血混合物被置于細(xì)胞培養(yǎng)腔室中。細(xì)胞培養(yǎng)腔室旋轉(zhuǎn)一段時(shí)間，在此期間，隨時(shí)間變化電磁力源在腔室內(nèi)產(chǎn)生隨時(shí)間變化的電磁力。在該期間結(jié)束時(shí)，將TVEMF擴(kuò)增的血混合物從腔室移出。在較復(fù)雜的TVEMF生物反應(yīng)器系統(tǒng)中，隨時(shí)間變化電磁力源可以集成到TVEMF生物及^應(yīng)器，如圖2-5所示，但是也可與生物應(yīng)^應(yīng)器相鄰，如在圖6-8中。另夕卜，向細(xì)胞提供支持的流體載體如培養(yǎng)基或緩沖液(優(yōu)選與下文討論的加入血混合物的培養(yǎng)勤目似)可以周期性更新和移出。本文描述優(yōu)選的TVEMF生物反應(yīng)器?，F(xiàn)在參看圖1，其展示了在一個(gè)完整的用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)載體流程1的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)帶有細(xì)胞培養(yǎng)腔室19，優(yōu)選旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)腔室，充氧器21,輔助培養(yǎng)栽體定向流動(dòng)的裝置，優(yōu)選通過4吏用主泵15，以及供應(yīng)多支管17，其選擇性輸入這種培養(yǎng)栽體需求，例如但不限于營養(yǎng)物3、緩沖劑5、新鮮培養(yǎng)基7、細(xì)胞因子9、生長因子11以及激素13。在此優(yōu)選實(shí)施方案中，主泵15提供新鮮流體栽體到充氧器21，流體載體在此被充入氧氣并且通過細(xì)胞培養(yǎng)腔室19。來自細(xì)胞培養(yǎng)腔室19的已使用流體栽體中的廢物被移去并傳送到廢物18，剩下的細(xì)胞培養(yǎng)栽體返回到多支管17，必要時(shí)它在此接受新鮮補(bǔ)充，之后使用泵15通過充氧器21循環(huán)到細(xì)胞培養(yǎng)腔室19。在培養(yǎng)載體流程1中，培養(yǎng)載體通過腔室19中的活細(xì)胞培養(yǎng)物并且圍繞如圖1所示的培養(yǎng)載體流動(dòng)回路1循環(huán)。在此回路1中，根據(jù)化學(xué)傳感器(未顯示)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以維持細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器腔室19中的恒定*?？刂贫趸痑力并引入酸或堿以校正pH值。氧氣、氮?dú)夂投趸既芙庠跉怏w交換系統(tǒng)(未顯示)中，以支持細(xì)胞呼吸。閉合回路1添加氧氣，并從循環(huán)氣體容量中移去二氧化碳。盡管圖1是可用于本發(fā)明的培養(yǎng)載體流動(dòng)回路的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，但是本發(fā)明并不限于此。可以手動(dòng)、自動(dòng)或者通過其他控制手段向生物反應(yīng)器輸入培養(yǎng)載體例如但不限于氧氣、營養(yǎng)物、緩沖劑、新鮮培養(yǎng)基、細(xì)胞因子、生長因子和激素，比如可以類似于廢物和二氧化碳的控制和移除。圖2和3展示了帶有集成的隨時(shí)間變化電磁力源的TVEMF生物反應(yīng)器10的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。圖4是以優(yōu)選方式用于本發(fā)明的一種旋轉(zhuǎn)式TVEMF生物反應(yīng)器10的橫截面圖。圖4的TVEMF生物反應(yīng)器10舉例說明帶有集成的隨時(shí)間變化電磁力源。圖5也舉例說明帶有集成的隨時(shí)間變化電磁力源的TVEMF生物反應(yīng)器的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。圖6-8顯示帶有相鄰的隨時(shí)間變化電磁力源的旋轉(zhuǎn)式生物>^應(yīng)器?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)到圖2，圖2展示的是本發(fā)明的TVEMF生物反應(yīng)器10的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的側(cè)視圖。圖2包含由基座112支撐的馬達(dá)外罩lll。馬達(dá)113位于馬達(dá)夕卜軍111內(nèi)部，且通過第一線114和第二線115連接至其內(nèi)帶有控制裝置的控制盒116,由此通過轉(zhuǎn)動(dòng)控制鈕117可對馬達(dá)113的轉(zhuǎn)速進(jìn)行增量控制。馬達(dá)外軍111內(nèi)部i殳置有馬達(dá)113，使得馬達(dá)軸118縱向穿過外罩111延伸，且馬達(dá)軸118是徑向的，使得軸118的中心與在徑向腔室119位置的地球平面平行，優(yōu)選地用包括但不限于塑料的透明材料制成。在此優(yōu)選實(shí)施方案中，徑向腔室119連接到軸118使得腔室119圍繞徑向軸旋轉(zhuǎn)，而徑向軸與水平面平行。腔室119被線團(tuán)120所纏繞。線團(tuán)120的尺寸和纏繞圏數(shù)4吏得，當(dāng)優(yōu)選為0.1mA到1000mA的方波電流供應(yīng)在線圏120上時(shí)，在腔室119內(nèi)產(chǎn)生優(yōu)選為0.05高斯到6高斯的隨時(shí)間變化的電磁力。線團(tuán)120在軸118的末端通過線123和124連接至第一環(huán)121和第二環(huán)122。然后，環(huán)121和122與第一電磁傳送線125和第二電磁傳送線128相接觸，使得腔室119可以旋轉(zhuǎn)同時(shí)電流恒定地供應(yīng)到線團(tuán)120上。電>^發(fā)生裝置126與線125、128相連接。通過旋轉(zhuǎn)電磁發(fā)生裝置鈕127調(diào)節(jié)其輸出，從而使得電磁發(fā)生裝置126提供方波到線125、128和線團(tuán)120上。圖3是可用于本發(fā)明中的圖2所示TVEMF生物反應(yīng)器10的側(cè)面投影圖?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)到圖4展示的帶有培養(yǎng)腔室230的旋轉(zhuǎn)式TVEMF生物反應(yīng)器IO，該腔室優(yōu)選是透明的，并且適于在其中含有血混合物，另外包含外殼220，其包括第一290和第二291圓柱形橫向末端帽構(gòu)件，該構(gòu)件與第一228和第二229末端表面相對，末端表面設(shè)置成安裝內(nèi)部圓柱管狀玻璃構(gòu)件293和外部管狀玻璃構(gòu)件294。提供合適的壓力密封。在內(nèi)部293與外部294管狀構(gòu)件之間是環(huán)形線加熱器296，其用于獲得細(xì)胞生長的合適的培養(yǎng)溫度。所述線加熱器296也可用作隨時(shí)間變化的電磁力裝置，用以給培養(yǎng)腔室230提供隨時(shí)間變化的電場，或者，如圖5所述，獨(dú)立的線圉144可用于提供隨時(shí)間變化的電磁力。第一末端帽構(gòu)件2卯和第二末端帽構(gòu)件291具有內(nèi)部彎曲表面，其與末端表面228、229相鄰，以促進(jìn)腔室230內(nèi)的混合物流動(dòng)更平滑。第一末端帽構(gòu)件290和第二末端帽構(gòu)件291分別具有第一中央流體傳遞軸頸構(gòu)件292和第二中央流體傳遞軸頸構(gòu)件295，其分別旋轉(zhuǎn)式安^fr輸入軸223和輸出軸225上。每個(gè)傳遞軸頸構(gòu)件294、295具有凸緣以承載在末端帽構(gòu)件2卯、291中的凹陷沉孔中，并且其上附著第一鎖緊墊團(tuán)環(huán)297和第二鎖緊墊團(tuán)環(huán)298以防止相對于軸223、225的徑向運(yùn)動(dòng)。每個(gè)軸頸構(gòu)件294、295具有中間環(huán)形凹陷，其與徑向擴(kuò)展的、沿圓周布置的通勤目連。軸頸構(gòu)件292、295上的每個(gè)環(huán)形凹陷通過末端帽構(gòu)件290和291中的第一放射狀設(shè)置通道278和第二放射狀設(shè)置通道279分別與第一輸入偶合件203和第二輸入偶合件204相偶合。放射狀通道278或279中的載體流動(dòng)通過軸頸構(gòu)件294或295中的第一環(huán)形凹陷和徑向通道，以允許栽體通過軸頸構(gòu)件292、295ii^到達(dá)軸頸292、295的每個(gè)末端，在此其進(jìn)入圍繞軸223、225。附著在末端帽構(gòu)件290和291的是包含^軸承的第一管狀軸承支架205和第二管狀軸承支架206，該^JK軸承相對地支撐輸入軸223和輸出軸225上的外部支架220。第一軸承支架205具有附著的第一鏈輪210，其用于為外部支架220提供旋轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)，其旋轉(zhuǎn)方向圍繞輸入軸223和輸出軸225以及徑向軸221。第一軸承支架205和第二軸承支架206也具備從線加熱器296和任何其它傳感器向外供電的功能。內(nèi)部濾器裝置235包括內(nèi)部管狀組件215和外部管狀組件216，其沿它們的長度方向具有孔或洞，該裝置有帶孔的第一217和第二218內(nèi)部濾器裝置末端帽組件。內(nèi)部管狀組件215構(gòu)建成兩部分，其兩部分帶有互鎖的位于中央的偶合部分，其每一部分分別附著于末端帽217或218。外部管狀組件216設(shè)置在第一217和第二內(nèi)部濾器裝置末端帽組件之間。所述末端帽組件217、218分別被旋轉(zhuǎn)式支持在輸入軸223和輸出軸225之上。內(nèi)部組件215通過釘和中央定位的(interfitting)凹槽219旋轉(zhuǎn)式附著至輸出軸225。十微米織法的聚酯布224布置在外部組件216的外表面之上，并且附著在任一末端的O環(huán)。因?yàn)閮?nèi)部組件215被偶合釘附著在輸出驅(qū)動(dòng)軸225上的槽，所以輸出驅(qū)動(dòng)軸225可旋轉(zhuǎn)內(nèi)部組件215。所述內(nèi)部組件215與第一217和第二218末端帽相偶合，所述帽支持外部組件216。輸出軸225延伸通過第一靜止支架240中的軸承，并與第一鏈輪241相偶合。如舉例所示，輸出軸225具有管狀孔222，其從位于密封之間的第一靜止支架240中的第一端口或通道289延伸至內(nèi)部組件215,使得流體栽體的流動(dòng)可從內(nèi)部組件215中通過靜止支架240而退出。內(nèi)部組件235的第一217和第二218末端帽與外部支架220中的軸頸292、295之間是葉片組件50a和50b的第一227和第二226轂。在輸入軸223上的第二轂226通過釘231偶合至輸入軸223,<吏得第二轂226隨輸入軸223旋轉(zhuǎn)。每個(gè)轂227、226具有軸向延伸的通道，用于傳送載體使之穿過轂。輸入軸223延伸穿過第二靜止支架260中的軸承，該支架用于旋轉(zhuǎn)式支持輸入軸223。第二徑向通道267延伸穿過輸入軸223到保持墊圏和環(huán)的過渡位置，所述墊圏和環(huán)設(shè)置在面板與支架260之間的第二環(huán)狀凹陷232中。第二末端帽組件291中的第三放射狀通道272允許凹陷中流體載體從第二末端帽組件291中退出。盡管沒有顯示，第三通道272通過管線和Y型連接頭連接至通道278和279的每個(gè)。圖4中顯示樣品端口，其中沿第一軸ll伸的第一鉆孔237與腔室230的角233相交，形成受限的開口234。該鉆孔237在一端帶有沉孔和帶螺紋的環(huán)，以螺紋形容納圓柱形閥組件236。閥組件236具有互補(bǔ)成形的頂端，以接合開口234并稍微突出到腔室230的內(nèi)部。閥組件236上的O環(huán)243提供密封。沿第二軸的第二鉆孔244與第一鉆孔237相交在O環(huán)243與開口234之間的位置。彈性體或塑料阻塞物245封閉了第二鉆孔244，并且可用皮下注射器進(jìn)入用以取樣品。為了取樣品，閥組件236向后移，以使得開口234和鉆孔244可以ii^。然后可使用注射器提取樣品，開口234可被重新封閉。沒有外部污染到達(dá)TVEMF生物M器10的內(nèi)部。在運(yùn)行中，載體輸入到第二端口或通道266，而后到軸通道，由此通過第三放射狀通道272到達(dá)第一放射狀設(shè)置的通道278和第二放射狀設(shè)置的通道279。當(dāng)載體通過軸頸292、294中的徑向通道進(jìn)入腔室230時(shí)，載體撞擊在轂227、226的末端表面228、229上，并放射狀以及軸向分軟而通過轂227、226中的通道。通過轂227、226的載體撞擊在末端帽組件217、218上，并且放射狀分狀開來。ii^流體載體的液流因此放射狀向外離開徑向軸221，并以螺旋管形式流動(dòng)，通過聚酯布224以及濾器裝置235中的開口從每個(gè)末端退出，以經(jīng)過通道266和289退出。通過控制外部支架220、腔室230和內(nèi)部濾器裝置235的旋轉(zhuǎn)速度和旋轉(zhuǎn)方向，可獲得任何期望類型的載體動(dòng)作。然而，很重要的是可以在連續(xù)供應(yīng)新鮮流體載體的同時(shí)獲得回轉(zhuǎn)器操作這一事實(shí)。如果不使用集成式環(huán)形線加熱器296施加隨時(shí)間變化的電磁力，可通過另一個(gè)優(yōu)選的隨時(shí)間變化電磁力源進(jìn)行施加。例如，圖6-8舉例說明了隨時(shí)間變化電磁力設(shè)備140，其提供電磁力給生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述生物反應(yīng)器不帶有集成式隨時(shí)間變化電磁力、而是帶有相鄰的隨時(shí)間變化電磁力裝置。具體地，圖6是隨時(shí)間變化電磁力裝置140的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。圖6是裝置140的側(cè)面投影圖，其中包含支持基座145，支持在基座145之上的圓柱體線團(tuán)支持物146，其中線圏147圍繞支持物146纏繞。圖7是圖6中舉例說明的隨時(shí)間變化電磁力裝置140的前投影圖。圖8是隨時(shí)間變化電磁力裝置140的前投影圖，其舉例說明在運(yùn)行中整個(gè)生物反應(yīng)器148放入圓柱體線團(tuán)支持物146中，該支持物146由支持基座145所支持并由線圏147所纏繞。因?yàn)殡S時(shí)間變化電磁力裝置140鄰近生物反應(yīng)器148，隨時(shí)間變化電磁力裝置140可重復(fù)使用。另外，因?yàn)殡S時(shí)間變化電磁力裝置140鄰近生物反應(yīng)器148，裝置140可用于在所有類型的生物反應(yīng)器中產(chǎn)生電磁力，優(yōu)選旋轉(zhuǎn)型。運(yùn)行中，在TVEMF擴(kuò)增期間，本發(fā)明的TVEMF生物反應(yīng)器IO在細(xì)胞培養(yǎng)腔室中包含血混合物。在TVEMF擴(kuò)增期間，可以評估并調(diào)節(jié)含有血混合物的腔室的旋轉(zhuǎn)速度，以使得血混合物基本上保持在徑向軸處或者在徑向軸周圍。確保提高轉(zhuǎn)速以防止與壁撞擊。例如，如果血混合物中的血液干細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)循環(huán)的向下側(cè)時(shí)過分向內(nèi)向下落以及在旋轉(zhuǎn)循環(huán)的向上側(cè)時(shí)過分向外并且不充分向上，則優(yōu)選提高轉(zhuǎn)速。最優(yōu)情況下，建議用戶優(yōu)選地選擇旋轉(zhuǎn)速率以使得壁碰撞頻率和強(qiáng)度盡可能小，從而維持血液干細(xì)胞的三維幾何結(jié)構(gòu)以及它們的細(xì)胞-細(xì)胞支持和細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。本發(fā)明優(yōu)選的速率是從5到120RPM，更優(yōu)選從10到30RPM。血混合物可優(yōu)選地通過優(yōu)選為透明的培養(yǎng)腔室視覺上評價(jià)，并手動(dòng)調(diào)節(jié)。血混合物的評價(jià)和調(diào)節(jié)也可通過傳感器(例如，激光)自動(dòng)進(jìn)行，該傳感器監(jiān)測血液干細(xì)胞在TVEMF生物反應(yīng)器10中的位置。指示過多細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的傳感器讀數(shù)將自動(dòng)引起相應(yīng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速的機(jī)制。另外，在運(yùn)行中，本發(fā)明預(yù)期電磁發(fā)生裝置被打開并調(diào)節(jié)，使得方波輸出在含有血混合物的腔室中產(chǎn)生期望的電磁場，優(yōu)選在0.05高斯到6高斯的范圍。優(yōu)選地，所述方波具有約2到約25周/秒的頻率，更優(yōu)選約5到約20周/秒，例如約10周/秒，并且導(dǎo)體的RMS值為約1到1000mA，優(yōu)選l到6mA。但是，這些^lt并不意在限制本發(fā)明的TVEMF，因?yàn)樗鼈兛苫诒景l(fā)明的其它方面而變化。例如，可通過標(biāo)準(zhǔn)^殳備比如EN131Ce11SensorGaussMeter測量TVEMF。按照本發(fā)明所預(yù)期，在不偏離本發(fā)明范圍的情況下，可對受到隨時(shí)間變化電磁力的旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器作出多種改變，因此上文描述中所含的所有內(nèi)容應(yīng)該被理解為舉例說明，而不是限制。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明涉及修復(fù)、補(bǔ)充和再生人體中心臟組織的方法。本發(fā)明可通過下文所述優(yōu)選實(shí)施方案更完整的進(jìn)行描述，但并不僅限于此。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中描述了制備成體干細(xì)胞的方法，所述干細(xì)胞可協(xié)助身體修復(fù)、替換和再生心臟組織。從患者體內(nèi)移出血細(xì)胞。這些細(xì)胞的亞群目前稱為成體干細(xì)胞。將所述血細(xì)胞(包括成體干細(xì)胞)置于如本文所述的生物反應(yīng)器中。所述生物反應(yīng)器容器以一定速度旋轉(zhuǎn)，使得血細(xì)胞懸浮以維持其三維幾何結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞-細(xì)胞支持和幾何結(jié)構(gòu)。在所述細(xì)胞在所述反應(yīng)器中的時(shí)間內(nèi)，可以對其提供營養(yǎng)物，使其暴露于激素、細(xì)胞因子或生長因子，和/或進(jìn)行遺傳修飾，并且優(yōu)選除去有毒物質(zhì)。通常所除去的有毒物質(zhì)是來自血細(xì)胞，其包括瀕死細(xì)胞的有毒顆粒物以及顆粒細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞的有毒物質(zhì)。擴(kuò)增這些細(xì)胞的亞群，產(chǎn)生大量細(xì)胞。所述細(xì)胞的擴(kuò)增是受控的，使得這些細(xì)胞在足夠的時(shí)間里(優(yōu)選在七天內(nèi))擴(kuò)增至少七倍。接著將所述細(xì)胞靜脈注射或直接注射進(jìn)待修復(fù)的心臟組織中或者與其緊鄰部位，使身體的天然系統(tǒng)修復(fù)和再生心臟組織。另外，在此方法中，可對血液干細(xì)胞進(jìn)行操作以改變其治療特征，優(yōu)選通過對所述細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾。下文的定義意在輔助描述和理解本
發(fā)明內(nèi)容中所定義的術(shù)語。這些定義并不意味將這些術(shù)語限制在少于通過本申請所描述的內(nèi)容。另外，關(guān)于TVEMF包括幾種定義，在此方面的所有定義應(yīng)被理解為互相補(bǔ)充，而不應(yīng)理解為互相抵觸.本申請全篇中使用的術(shù)語"成體干細(xì)胞"指多能性細(xì)胞，其是未分化的且能產(chǎn)生多種分化細(xì)胞.在本發(fā)明中，成體干細(xì)胞優(yōu)選CD34+/CD38-,成體干細(xì)胞也稱為體細(xì)胞干細(xì)胞(somaticstemcells),并且不是直接來源于胚胎的胚胎千細(xì)胞。本申請全篇中使用的術(shù)語"血"指哺乳動(dòng)物中成體干細(xì)胞的兩種主要來源外周血或臍帶血。"外周血，，是全身性血，即哺乳動(dòng)物中全身性循環(huán)的或者已循環(huán)的血。所述哺乳動(dòng)物不指胎兒。就本發(fā)明目的而言，沒有理由區(qū)分位于相同循環(huán)回路中不同部分的外周血。術(shù)語"臍帶血，，指來自胎兒或嬰兒的臍帶和/或胎盤的血。臍帶血是已知最豐富的干細(xì)胞來源之一。術(shù)語"臍帶"不以任何方式將本發(fā)明的術(shù)語"臍帶血，，限制在來自臍帶的血；胎兒或嬰兒胎盤的血與臍帶的血是混合的。就本發(fā)明目的而言，沒有理由區(qū)分位于相同循環(huán)回路中不同部分的血。本申請全篇中使用的術(shù)語"血細(xì)胞，，指來自血的細(xì)胞；"外周血細(xì)胞"指來自外周血的細(xì)胞；"臍帶血細(xì)胞，，指來自臍帶血的細(xì)胞。能夠復(fù)制的血細(xì)胞可經(jīng)受TVEMF生物反應(yīng)器中的TVEMF擴(kuò)增，并可存在于本發(fā)明的組合物中。本申請全篇中使用的術(shù)語"血液干細(xì)胞，，指來自血的成體干細(xì)胞。血液干細(xì)胞是成體干細(xì)胞，其如上文所述也稱為體細(xì)胞干細(xì)胞，而不是直接來源于胚胎的胚胎干細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的血液干細(xì)胞是CD34十/CD38-細(xì)胞。本申請全篇中使用的術(shù)語"血液干細(xì)胞組合物"或其提法指本發(fā)明的血液干細(xì)胞，所述血液干細(xì)胞(1)其每單位體積數(shù)量是天然血液來源的至少7倍，并且具有與自然存在的血液干細(xì)J^目同或非常相似的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持，和/或(2)已經(jīng)過TVEMF擴(kuò)增，并保持了上述的三維幾何結(jié)構(gòu)和支持。本發(fā)明血液干細(xì)胞組合物中的血液干細(xì)胞與某載體在一起，所述栽體可以是可藥用載體、血漿、血、白蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)基、生長因子、銅螯合劑、激素、緩沖劑、低溫保存劑或某種其它物質(zhì)。涉及天然血時(shí)，優(yōu)選將本發(fā)明的血液干細(xì)胞與其原始的血(即外周血、臍帶血、混合外周血與臍帶血或其它血)來源相比。但是，如果這一比較不可用，則天然血可指這些血的平均或典型特征(優(yōu)選相同的哺乳動(dòng)物物種)作為本發(fā)明血液干細(xì)胞的來源。本發(fā)明的"血液干細(xì)胞藥物組合物"是適于對哺乳動(dòng)物優(yōu)選A^fe用的血液干細(xì)胞組合物。這樣的組合物包含治療有效量的經(jīng)擴(kuò)增(優(yōu)選TVEMF擴(kuò)增)血液干細(xì)胞。經(jīng)擴(kuò)增的血液干細(xì)胞的治療有效量(本文其它部分也有討論)優(yōu)選為至少1000個(gè)干細(xì)胞，更優(yōu)選至少104個(gè)干細(xì)胞，還更優(yōu)選至少105個(gè)干細(xì)胞，更優(yōu)選至少107到109個(gè)干細(xì)胞或甚至更多的干細(xì)胞，比如1012個(gè)干細(xì)胞。這些數(shù)量的經(jīng)擴(kuò)增干細(xì)胞可以以一次或多次劑量施用。如本申請全篇中所指出，施用于患者的干細(xì)胞的數(shù)量可能受限于根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增增殖的來源血中原始可用的干細(xì)胞數(shù)量。不限于理論地，相信在施用之后未被身體利用的干細(xì)胞將簡單地通過天然身體系統(tǒng)除去。本申請全篇中使用的術(shù)語"血混合物，，指血/血細(xì)胞與輔助所述細(xì)胞擴(kuò)增的物質(zhì)的混合物，該物質(zhì)比如用于細(xì)胞生長的培養(yǎng)基，該物質(zhì)將放置于TVEMF生物及^應(yīng)器中(比如在細(xì)胞培養(yǎng)腔室中)。所述"血混合物"血細(xì)胞可簡單地通過將全血與諸如細(xì)胞培養(yǎng)基之類的物質(zhì)混合而存在于血混合物中。血混合物也可由本申請全篇中所述含有血液干細(xì)胞的來自血的細(xì)胞制備物(如"血沉棕黃層")制成。優(yōu)選地，血混合物包含€034+/€038-血干細(xì)胞以及011>6"0，8培養(yǎng)基(DMEM)。優(yōu)選地，約一半的血混合物是細(xì)胞培養(yǎng)基如DMEM。本申請全篇中使用的術(shù)語"TVEMF，指"隨時(shí)間變化的電磁力(TimeVaryingElectromagneticForce)"。如上文所討論的，本發(fā)明的TVEMF是方波(遵循傅立葉曲線)。優(yōu)選地，方波頻率為約10周/秒，導(dǎo)體RMS值為約1到1000mA，優(yōu)選1到6mA。但是，這些Wt并不意在限制本發(fā)明的TVEMF，因?yàn)檫@些可才艮據(jù)本發(fā)明的其它方面而變化。例如，可通過標(biāo)準(zhǔn)i殳備比如EN131Ce11SensorGaussMeter進(jìn)行測量TVEMF。本申請全篇中使用的術(shù)語"TVEMF生物反應(yīng)器，，指施加TVEMF的旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器，如上文中所更詳細(xì)描述的。施加到生物反應(yīng)器上的TVEMF優(yōu)選在0.05到6.0高斯的范圍內(nèi)，優(yōu)選0.05-0.5高斯。參閱如圖2、3、4和5，作為TVEMF生物反應(yīng)器的實(shí)例(不意味著限制)。在一個(gè)簡單的實(shí)施方案中，本發(fā)明的TVEMF生物反應(yīng)器使得封閉的血混合物在適當(dāng)?shù)母咚顾较?根據(jù)施加的TVEMF)旋轉(zhuǎn)，并允許其中的血細(xì)胞(包括干細(xì)胞)擴(kuò)增。優(yōu)選地，TVEMF生物反應(yīng)器允許交換生長培養(yǎng)基(優(yōu)選帶有添加劑)并允許對血混合物充氧氣。所述TVEMF生物反應(yīng)器提供用于細(xì)胞生長數(shù)天或更多的機(jī)制。不限于任何理論地，所述TVEMF生物Jl應(yīng)器使得反應(yīng)器中的細(xì)胞受到TVEMF，以使TVEMF穿過細(xì)胞或接觸細(xì)胞，從而使細(xì)胞經(jīng)歷TVEMF擴(kuò)增。在TVEMF擴(kuò)增過程中，TVEMF生物反應(yīng)器優(yōu)選以5到120rpm、更優(yōu)選10到30rpm的速率旋轉(zhuǎn)，以使壁碰撞頻率和強(qiáng)度盡可能小，從而維持血流細(xì)胞的三維幾何結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞-細(xì)胞支持和細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。本申請全篇中使用的術(shù)語"TVEMF擴(kuò)增的血細(xì)胞"指在置于TVEMF生物反應(yīng)器中并受到約0.05至6.0高斯的TVEMF之后每單位體積數(shù)量增加的血細(xì)胞。每單位體積數(shù)量上的增加是細(xì)胞在TVEMF生物反應(yīng)器中復(fù)制的結(jié)果，使得生物反應(yīng)器中細(xì)胞總數(shù)增加。每單位體積中細(xì)胞數(shù)量增加明確地不是因?yàn)榱黧w體積的簡單減少，例如，血液體積從70ml減少到10ml從而每ml細(xì)胞的數(shù)量增加。本申請全篇中使用的術(shù)語"TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞，，指在置于TVEMF生物反應(yīng)器并受到約0.05至6.0高斯的TVEMF之后每單位體積數(shù)量增加的血液干細(xì)胞。每單位體積干細(xì)胞數(shù)量上的增加是細(xì)胞在TVEMF生物反應(yīng)器中復(fù)制的結(jié)果，使得生物及一應(yīng)器中干細(xì)胞總數(shù)增加。每單位體積中干細(xì)胞數(shù)量的增加明確地不是因?yàn)榱黧w體積的簡單減少，例如，血液體積從70ml減少到lOml從而每ml干細(xì)胞的數(shù)量增加。本申請全篇中使用的術(shù)語"TVEMF擴(kuò)增"(TVEMF-expanding)指在TVEMF(旋轉(zhuǎn))反應(yīng)器中在TVEMF存在下TVEMF反應(yīng)器中細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制(分裂并生長)的步驟。血液干細(xì)胞(優(yōu)選CD34+ZCD38-干細(xì)胞)優(yōu)選復(fù)制且不經(jīng)歷進(jìn)一步分化，使得所有或基本上所有根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增的€034+(038-干細(xì)胞在其處于生物反應(yīng)器中的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行復(fù)制而不發(fā)生分化。"基本上所有"意在指至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少卯％、再優(yōu)選至少95%、再優(yōu)選至少97%、最優(yōu)選至少99%的CD34十/CD38-細(xì)胞不發(fā)生分化而使其在TVEMF擴(kuò)增過程中不再是CD34十/CD38畫。本申請全篇中使用的術(shù)語"TVEMF擴(kuò)增"指通過讓細(xì)胞受到約0.05到約6.0高斯的TVEMF而使TVEMF生物>^應(yīng)器中的血細(xì)胞(優(yōu)選血液干細(xì)胞)數(shù)量增加的過程。優(yōu)選地，血液干細(xì)胞數(shù)量的增加在每單位體積的數(shù)量上是原始血來源的至少7倍。根據(jù)本發(fā)明的TVEMF生物反應(yīng)器中的血液干細(xì)胞的擴(kuò)增提供了維持或具有與TVEMF擴(kuò)增前血液干細(xì)^目同或基^目同的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)的血液干細(xì)胞。TVEMF擴(kuò)增的其它方面也可提供本發(fā)明的血液干細(xì)胞的異乎尋常的特征。不限于理論地，TVEMF擴(kuò)增不只提供高濃度的維持三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持及幾何結(jié)構(gòu)的血液干細(xì)胞。不限于理論地，TVEMF可以在TVEMF擴(kuò)增期間影響干細(xì)胞的一些特性，例如上調(diào)促進(jìn)生長的基因，或者下調(diào)阻止生長的基因?？傊琓VEMF擴(kuò)增使得促#液干細(xì)胞生長而不發(fā)生分化。本申請全篇中使用的術(shù)語"TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞"指經(jīng)歷了TVEMF擴(kuò)增過程的細(xì)胞。本申請全篇中使用了術(shù)語"修復(fù)"、"補(bǔ)充"和"再生"。這些術(shù)語并不意在彼此抵觸，而是涉及總體的組織修復(fù)。在本申請全篇中，提到修復(fù)心臟組織、治療心臟疾病、治療心臟病癥并不是排他性的，而是指組織修復(fù)的總體目標(biāo)，其中組織中的改善源于施用本文討論的干細(xì)胞。盡管本發(fā)明部分涉及有癥狀、可能危及生命的心臟疾病或病癥，但是本發(fā)明也意在包括對較小修復(fù)的治療，甚至是在哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)健康上的癥狀或問題被注意到之前，通過早期引入擴(kuò)增的干細(xì)胞對心臟疾病/病癥進(jìn)行防止/預(yù)防。本申請全篇中使用的術(shù)語"有毒物質(zhì)"或者相關(guān)術(shù)語可指對細(xì)胞(優(yōu)選血液干細(xì)胞)或者對患者有毒性的物質(zhì)。具體地，術(shù)語有毒物質(zhì)指死細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及可以是血中特有的或不常見的物質(zhì)(如外周血中的鐮刀狀細(xì)胞、臍帶血中的母體尿或者廢物或者其它組織或廢物)。其它有毒物質(zhì)在本申請中有所討論。從血液中除去這些物質(zhì)是本領(lǐng)域中特別是將血制品引入患者的相關(guān)領(lǐng)域中公知的。本申請全篇中使用的術(shù)語"骨髓釆集術(shù)"指將針插入骨髄并抽取骨髄。這樣的采集術(shù)是本領(lǐng)域公知的。本申請全篇中使用的術(shù)語"自體，，指供體(擴(kuò)增之前血液干細(xì)胞的來源)和受體是同一哺乳動(dòng)物的情況。本發(fā)明包括自體心臟組織的修復(fù)及補(bǔ)充。本申請全篇中使用的術(shù)語"異體"指供體(擴(kuò)增之前血液干細(xì)胞的來源)和受體不是同一哺乳動(dòng)物的情況。本發(fā)明包括異體心臟組織的修復(fù)及補(bǔ)充。本申請全篇中使用的術(shù)語"CD34+，，指血細(xì)胞表面存在表面抗原(CD34)。在所有的發(fā)育狀態(tài)下，CD34蛋白都存在于造血干細(xì)胞的表面o本申請全篇中使用的術(shù)語"CD38-"指血細(xì)胞表面缺乏表面抗原(CD38)。CD38不存在于^^發(fā)明干細(xì)胞的表面。本申請全篇中使用的術(shù)語"細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)，，指細(xì)胞的幾何結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞彼此之間相對的間距、距離和物理關(guān)系。例如，本發(fā)明的TVEMF擴(kuò)增干細(xì)胞波此保持與在體內(nèi)相同的關(guān)系。所述擴(kuò)增的細(xì)胞處于細(xì)胞之間自然間距的范圍內(nèi)，這與例如無法保持這種距離的二維擴(kuò)增容器相反。本申請全篇中使用的術(shù)語"細(xì)胞-細(xì)胞支持"指一個(gè)細(xì)胞對相鄰細(xì)胞提供的支持。例如，在體內(nèi)健康組織和細(xì)胞與其它細(xì)胞保持相互作用，例如化學(xué)的、激素的、神經(jīng)的(可用/合適時(shí))相互作用。在本發(fā)明中，這些相互作用維持在正常的功能參數(shù)范圍內(nèi)，例如，這意味著它們不會(huì)開始對其他細(xì)胞傳送有毒或損傷信號(除非這是天然血環(huán)境中存在的)。本申請全篇中使用的術(shù)語"三維幾何結(jié)構(gòu)，，指細(xì)胞在三維狀態(tài)下的幾何結(jié)構(gòu)(與其天然狀態(tài)相同或非常近似)，這與例如在培#^中培養(yǎng)的細(xì)胞的二維幾何結(jié)構(gòu)相反，在培養(yǎng)臟中所述細(xì)胞變得扁平和/或伸展。對于上述三個(gè)定義中的每一個(gè)而言，涉及維持本發(fā)明干細(xì)胞的細(xì)胞-細(xì)胞支持和幾何結(jié)構(gòu)以及三維幾何結(jié)構(gòu)時(shí)，術(shù)語"基4^目同，，指本發(fā)明的TVEMF擴(kuò)增細(xì)胞中提供正常的幾何結(jié)構(gòu)和支持，使得所述細(xì)胞不以例如失去功能、不能修復(fù)組織或者對其它細(xì)胞有毒或有害的方式發(fā)生改變。關(guān)于上文所定義術(shù)語或其它本申請全篇中所使用術(shù)語的其它表述不意味著受到上述定義的限制，而是可對這些定義作出貢獻(xiàn)。在本申請全篇中提供了關(guān)于本發(fā)明多個(gè)方面的信息，這并不意味著只限制在它所包含的章節(jié)，而是意味著對從整體上理解本發(fā)明作出貢獻(xiàn)。本發(fā)明涉及提供TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞，其用于修復(fù)、補(bǔ)充和再生心臟組織。本發(fā)明可通過如下文所描述的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行更完整的描述，但是并不意在僅限于此。^Mt方法-制備TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞組合物在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中描述了用于制備TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞的方法，所述干細(xì)胞可協(xié)助身體修復(fù)、替換和再生心臟組織。在此優(yōu)選方法中，血收集自哺乳動(dòng)物，優(yōu)選靈長類哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人，例如按照本申請全篇所述和按照本領(lǐng)域已知完成，優(yōu)選如本領(lǐng)域公知地通過注射器完成。血液可在收集后立即擴(kuò)增并^f吏用，或以擴(kuò)增或未擴(kuò)增的形式低溫保存?zhèn)溆?。只以不威脅到受試者的量取血。優(yōu)選地，收集約10到約500ml血；更優(yōu)選約100-300ml，甚至更優(yōu)選150-200ml。本發(fā)明的血收集不意味著限制，而是也可包括例如其它直接收集哺乳動(dòng)物血的方法、合并來自一個(gè)或多個(gè)來源的血的方法、例如通過由商品或其它來源間接獲得血的方法，包括例如來自"血庫"的低溫保存的外周血或臍帶血或以其它方式保存的以備將來使用的血液。當(dāng)從哺乳動(dòng)物直接收集時(shí)，一般將血抽入一個(gè)或多個(gè)注射器中，其中優(yōu)選含有抗凝血?jiǎng)?。血可保存在注射器或者轉(zhuǎn)移到其他容器中。接著可將血分離成其各個(gè)部分；白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血漿。這在離心機(jī)(旋轉(zhuǎn)血液容器直至血分離的裝置)中實(shí)現(xiàn)或者通過沉降(將沉淀物注入血液容器中以使血分離的過程)實(shí)現(xiàn)。其次，一5j6l液被分離，紅細(xì)胞(RBC)在底部，白細(xì)胞(WBC)在中間，血漿在頂部，則將白細(xì)胞移出用于保存。中間層也稱為"血沉棕黃層"，含有目的血液干細(xì)胞；血的其它部分是不需要的。就一些庫而言，這就將是它們處理的范圍。但是，其它庫會(huì)通過從WBC中移出單核細(xì)胞(在此情況下是白細(xì)胞的一個(gè)亞群)來繼續(xù)處理血沉棕黃層。盡管不是所有人都贊同此方法，但其保存的較少，保存細(xì)胞所需的低溫氮也較少。分離血細(xì)胞的另一種方法是在分離器比如CobeSpectra細(xì)胞分離器中對所有收集到的血進(jìn)行一輪或多輪(優(yōu)選三輪)連續(xù)的流式白細(xì)胞分離術(shù)。這一方法將具有一個(gè)細(xì)胞核的血細(xì)胞從其它血細(xì)胞中分離出來。干細(xì)胞是具有一個(gè)細(xì)胞核的組中的一部分。分離血細(xì)胞的其他方法是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選地，從血液樣品中移除RBC。盡管人們可能具有相同的HLA型(是干細(xì)胞移植所需的)，但其也可能具有不同的血型。通過移除RBC可以使對干細(xì)胞移植的有害反應(yīng)最小化。因此，通過除去RBC，干細(xì)胞樣品更有可能與更多的A^目容。RBC還可能在融化時(shí)破裂，釋放出游離的血紅蛋白。這種類型的血紅蛋白可嚴(yán)重影響接受移植者的腎臟。另外，當(dāng)RBC破裂時(shí)，干細(xì)胞的生存力降低。同時(shí)，尤其是在低溫保存血或?qū)⒀D(zhuǎn)移至另一哺乳動(dòng)物時(shí)，可以檢測血以確保不存在傳染病或遺傳性疾病，比如HIV/AIDS、肝炎、白血病或免疫疾病。如果存在這些疾病，則可棄用所述血，或在指出未來使用者需要考慮的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)后使用。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，血細(xì)胞可得自需要修復(fù)心臟的人或不需要修復(fù)的供體。在收集之前，在3天中每12小時(shí)使用G-CSF6ng/kg處理餘沐，然后第四天處理一次。在優(yōu)選方法中，迅法用相似量的GM-CSF。接著從供體收集血，可以通過分離器如CobeSpectra細(xì)胞分離器使供體的總血液體積進(jìn)行3輪連續(xù)的流式白細(xì)胞分離術(shù)來分離PBC。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，血細(xì)胞可從供體獲得。在收集之前，在3天中每12小時(shí)使用G-CSF(優(yōu)選以0.3ng到5ng的量，更優(yōu)選1ng/kg到100ng/kg,再優(yōu)選5ng/kg到20ng/kg，再優(yōu)選6ng/kg)處理供體，然后第四天處理一次。在優(yōu)選方法中，還施用相似量的GM-CSF。其它替代方案是單獨(dú)使用GM-CSF或其它生長因子分子、白介素。接著從供體收集血，其可以以血液混合物整體使用或者首先如本申請全篇中所討論地分離成細(xì)胞組分，其中包括干細(xì)胞(CD34+/CD38-)的細(xì)胞部分用于制備待擴(kuò)增的血液混合物。細(xì)胞可被分離，例如，通過分離器如CobeSpectra細(xì)胞分離器使供體的總血液體積進(jìn)行3輪連續(xù)的流式白細(xì)胞分離術(shù)。優(yōu)選地，將擴(kuò)增的干細(xì)胞再引入同一供體，該供體需要修復(fù)心臟組織，如本文所述。但是，也可應(yīng)用異體引入，如本文所述。其它收集前施用(pre國collectionadministration)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。優(yōu)選地，從血中除去紅細(xì)胞，并將包括血液干細(xì)胞的剩余細(xì)胞與合適培養(yǎng)基一起置于TVEMF生物反應(yīng)器中(見"血混合物，，)，如本文所述。在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中，僅將上文所述的"血沉棕黃層，，(其包括血液干細(xì)胞，如本文所述)細(xì)胞材料置于TVEMF生物反應(yīng)器中。其它實(shí)施方案包括移除其他非干細(xì)胞以及血成分，以制備不同的血制備物。這些血制備物甚至可含有作為剩下的僅有血組分的CD34+ZCD38-血液干細(xì)胞。除去血細(xì)胞中的非干細(xì)胞類型可通過負(fù)性分離技術(shù)(negativeseparationtechniques)來實(shí)現(xiàn)，其比如但不限于沉降和分離。許多負(fù)性分離方法是本領(lǐng)域公知的。但是，正性選擇技術(shù)也可使用，并且在本發(fā)明中是優(yōu)選的。用于除去血中多種組分和正性選擇CD34十/CD38-的方法是本領(lǐng)域中已知的，只要它們不裂解或者不可逆地?fù)p傷所需的血液干細(xì)胞就可以使用。例如，可應(yīng)用對〔034+/€038-有選擇性的親和方法。優(yōu)選地，從血中制備如上文所述的"血沉棕黃層"，然后從"血沉棕黃層"中分離出其中的CD34十/CD38-細(xì)胞用于TVEMF擴(kuò)增。所收集的血或如上文所述的所需細(xì)胞部分必須置于TVEMF生物反應(yīng)器中用于TVEMF擴(kuò)增。如上文所討論的，術(shù)語"血混合物"包括血(或者所需細(xì)胞部分，例如沒有紅細(xì)胞的血，或者優(yōu)選vMufii中分離出的CD34十/CD38-血液干細(xì)胞)與允許這些細(xì)胞擴(kuò)增的物質(zhì)的混合物，這些物質(zhì)比如用于細(xì)胞生長的培養(yǎng)基，其將置于TVEMF生物反應(yīng)器中。細(xì)胞培養(yǎng)基、允許細(xì)胞生長和擴(kuò)增的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域公知的。優(yōu)選地，允許細(xì)胞擴(kuò)增的物質(zhì)是細(xì)胞培養(yǎng)基，更優(yōu)選是Dulbecco，s培養(yǎng)基。顯然，細(xì)胞培養(yǎng)基的組分必須不殺死或損傷細(xì)胞。在TVEMF擴(kuò)增之前或期間，其它組分也可添加到血混合物中。例如，可將血置于帶有Dulbecco，s培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，并且另外添加5%(或者其它所需量，比如在約1%到10%的范圍)Aj6l清白蛋白。也可在將血置于生物反應(yīng)器中之前，在生物反應(yīng)器外部或內(nèi)部在血中加入血混合物的其它添加物，包括但不限于生長因子、銅螯合劑、細(xì)胞因子、激素和其它可增強(qiáng)TVEMF擴(kuò)增的物質(zhì)。優(yōu)選地，來自一名個(gè)體的血收集物的全部體積(優(yōu)i^A血的量為約10ml到約500ml,更優(yōu)選約100ml到約300ml血，再優(yōu)選約150ml到約200ml血)與約細(xì)胞培養(yǎng)基如Dulbecco，s培養(yǎng)基(DMEM)混合，并且添加5%人血清白蛋白，以制備用于TVEMF擴(kuò)增的血混合物。例如，對于50到100ml血樣品，優(yōu)選使用約25到約100mlDMEM/5。/。人血清白蛋白，使得血混合物的總體積在置于生物反應(yīng)器時(shí)為約75到約200ml。作為一M則，收集的血越多越好；如果從一個(gè)個(gè)體收集了超過100ml，則優(yōu)選使用所有的這些血。在可獲得更大體積的情況下，例如通過合并(來自相同或不同來源的)血，可以優(yōu)選多于一個(gè)劑量。當(dāng)合并血收集物并一起TVEMF擴(kuò)增時(shí)，使用灌注式TVEMF生物反應(yīng)器是特別有用的。本發(fā)明的銅螯合劑可以是任何無毒銅螯合劑，優(yōu)選為青霉胺或鹽酸曲恩汀。更優(yōu)選地，青霉胺是溶于DMSO中的D(-)-2-#J^-3-巰基-3-曱基丁酸(Sigma-Aldrich)，以約10ppm的量添加到血混合物中。從哺乳動(dòng)物直接收集血時(shí)，也可對所述哺乳動(dòng)物施用所述銅螯合劑。優(yōu)選在從哺乳動(dòng)物收集血之前一天以上、更優(yōu)選兩天以上進(jìn)行這樣的施用。銅螯合劑的目的是在TVEMF擴(kuò)增之前降^fWi液中銅的量，無論是加入到血混合物或施用給血供體哺乳動(dòng)物或者兩者皆有。不限于理論地，相信可用銅量的減少可增強(qiáng)TVEMF擴(kuò)增。術(shù)語"置于TVEMF生物反應(yīng)器中"沒有限制性含義，血混合物可完全在生物^^應(yīng)器外部制成，然后再將混合物置于生物反應(yīng)器中。血混合物也可全部在生物反應(yīng)器內(nèi)部混合。例如，可將血(或其細(xì)胞成分)置于生物反應(yīng)器中并補(bǔ)充Dulbecco，s培養(yǎng)基和5"/。Aj6l清白蛋白，所述培養(yǎng)基和血清白蛋白預(yù)先存在于生物反應(yīng)器中、與血同時(shí)添加到生物^^應(yīng)器中或者在血之后添加到生物反應(yīng)器中。本發(fā)明的優(yōu)選血混合物包含以下成分分離自血樣品的血沉棕黃層的CD34+/CD38-干細(xì)胞和Dulbecco，s培養(yǎng)基，含有CD34+ZCD38-細(xì)胞的所述培養(yǎng)基總體積約為150-250ml,優(yōu)選200ml。更優(yōu)選地，血混合物中包含G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)。優(yōu)選地，G-CSF的存在量足以增強(qiáng)血液干細(xì)胞的TVEMF擴(kuò)增。更優(yōu)選地，在TVEMF擴(kuò)增之前血混合物中存在的G-CSF的量是約25到約200ng/ml混合物，更優(yōu)選約50到約150ng/ml混合物，再優(yōu)選是約100ng/ml'TVEMF生物反應(yīng)器容器(含有包括血液干細(xì)胞的血混合物)以一定速度旋轉(zhuǎn)，該速度使得血液干細(xì)胞懸浮并維持其三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，旋轉(zhuǎn)速度為5-120rpm，更優(yōu)選10-30rpm。這些速度并不意在限制，旋轉(zhuǎn)il^將至少部分取決于生物反應(yīng)器的類型和細(xì)胞培養(yǎng)腔室的尺寸以及其中放置的樣品。在細(xì)胞位于TVEMF生物反應(yīng)器期間，優(yōu)選對其供應(yīng)營養(yǎng)物和新鮮培養(yǎng)基(如DMEM和5%人血清白蛋白，見上文流體載體的討論)，使其接觸激素、細(xì)胞因子和/或生長因子(優(yōu)選&CSF);并除去有毒物質(zhì)。從TVEMF生物反應(yīng)器中的血細(xì)胞中除去的有毒物質(zhì)包括垂死細(xì)胞的有毒顆粒物質(zhì)以及粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的有毒物質(zhì)。細(xì)胞的TVEMF擴(kuò)增受到控制，使得細(xì)胞優(yōu)選擴(kuò)增(每單位體積的數(shù)量增加)至少七倍。優(yōu)選地，血液干細(xì)胞(以及其它細(xì)胞，如果存在的話)經(jīng)過至少4天的TVEMF擴(kuò)增，優(yōu)選約7到約14天，更優(yōu)選約7到約10天，再優(yōu)選約7天。TVEMF擴(kuò)增可在TVEMF生物jl應(yīng)器中持續(xù)到長達(dá)160天。盡管TVEMF擴(kuò)增甚至可長于160天，但此種長度的擴(kuò)增不是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。優(yōu)選地，TVEMF擴(kuò)增在TVEMF生物反應(yīng)器中以約26到約41'C的溫度實(shí)施，更優(yōu)選地，以37'C的溫度實(shí)施。監(jiān)測正在經(jīng)歷TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞的總體擴(kuò)增的一個(gè)方法是通過視覺檢查。血液干細(xì)胞一般為暗紅色。優(yōu)選地，用于形成血混合物的培養(yǎng)基的顏色為淺色或無色。一旦生物反應(yīng)器開始旋轉(zhuǎn)并且施加TVEMF，細(xì)胞優(yōu)選聚集在生物反應(yīng)器容器中央，培養(yǎng)基圍繞在有顏色的細(xì)胞簇周圍。通氧氣和添加其它營養(yǎng)物通常不影響通過構(gòu)建在生物反應(yīng)器上的觀察窗(一般是透明塑料的)觀察細(xì)胞蔟。簇的形成對于幫助干細(xì)胞保持它們的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)是重要的；如果所^H^t且細(xì)胞開始接觸到生物反應(yīng)器容器的壁，則提高轉(zhuǎn)速(手動(dòng)或自動(dòng))使得中央的細(xì)胞簇可再次形成。在細(xì)胞蔟形成后i^測量可觀察的細(xì)胞蔟直徑，其可與此后的蔟直徑做比較，以顯示出TVEMF生物反應(yīng)器中細(xì)胞大概的增長數(shù)。在TVEMF擴(kuò)增期間細(xì)胞數(shù)量增加的測量也可以按照本領(lǐng)域已知用于常規(guī)生物反應(yīng)器的許多方法進(jìn)行。TVEMF生物反應(yīng)器中也可包括自動(dòng)傳感器，以監(jiān)測和測量簇尺寸的增加。TVEMF擴(kuò)增過程可被仔細(xì)監(jiān)測，例如由實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員監(jiān)測，其將檢查細(xì)胞簇的形成以確保細(xì)胞在生物反應(yīng)器中保持成簇狀態(tài)，并且當(dāng)細(xì)胞簇開始分歉時(shí)將增加生物反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)。用于監(jiān)測細(xì)胞簇和監(jiān)測生物反應(yīng)器內(nèi)血混合物粘性的自動(dòng)系統(tǒng)也可用于監(jiān)測細(xì)胞簇。細(xì)胞簇粘性的改變在TVEMF擴(kuò)增過程開始約兩天后就可明顯觀察到，并且可在該時(shí)間附近增加TVEMF生物反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)速度。TVEMF生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)速在TVEMF擴(kuò)增過程中可以變化。優(yōu)選地，適時(shí)改變旋轉(zhuǎn)速度使得正在經(jīng)歷TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞不與TVEMF生物反應(yīng)器容器的側(cè)面接觸。并且，在TVEMF擴(kuò)增過程中，實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員可以例如一天一次、或每兩天一次地人工(例如使用注射器)向生物反應(yīng)器中加入新鮮培養(yǎng)基和優(yōu)選的如上文所述其它所需添加劑如營養(yǎng)物和生長因子，并且抽出含有細(xì)胞廢物和毒素的舊培養(yǎng)基。新鮮培養(yǎng)基和其它添加劑也可在TVEMF擴(kuò)增期間自動(dòng)泵入TVEMF生物>^應(yīng)器，廢物則自動(dòng)排出。在置于TVEMF生物反應(yīng)器并進(jìn)行TVEMF擴(kuò)增之后約7到約14天，血液干細(xì)胞可增加到它們初始數(shù)量的至少七倍。優(yōu)選地，TVEMF擴(kuò)增持續(xù)約7到10天，更優(yōu)選約7天。因此不需要在TVEMF擴(kuò)增期間進(jìn)行干細(xì)胞數(shù)量的測量。如上文及本申請全篇中所述，本發(fā)明的TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞具有與天然非TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞基本上相同的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。TVEMF擴(kuò)增完成后，TVEMF生物反應(yīng)器中的細(xì)胞物質(zhì)包含本發(fā)明組合物中的本發(fā)明干細(xì)胞。對于其他應(yīng)用，可從組合物中除去或加入多種物質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及離體哺乳動(dòng)物血液干細(xì)胞組合物，其功能為協(xié)助身體系統(tǒng)或組織修復(fù)、補(bǔ)充和再生組織，例如，本申請全篇中描述的組織。所述i且合物包含TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞，優(yōu)選其數(shù)量為原始血液來源中每單位體積血液干細(xì)胞數(shù)量的至少7倍。例如，優(yōu)選地，如果X數(shù)量的血液干細(xì)胞以某體積置于TVEMF生物Jl應(yīng)器中，那么TVEMF擴(kuò)增后，TVEMF生物反應(yīng)器中血液干細(xì)胞的數(shù)量將是至少7X(不包括擴(kuò)增過程中移出的細(xì)胞)。盡管這種至少7倍的擴(kuò)增并不是實(shí)行本發(fā)明所必需的，但是這種擴(kuò)增對于治療目的而言是特別優(yōu)選的。比如，需要時(shí)，TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞可以只是天然血中血液干細(xì)胞數(shù)量的2倍。優(yōu)選地，TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞的范圍為每單位體積天然血中干細(xì)胞數(shù)量的約4倍到約25倍。本發(fā)明還涉及包含來自哺乳動(dòng)物的血液干細(xì)胞的組合物，其中所述血液干細(xì)胞每單位體積的數(shù)量是來自哺乳動(dòng)物的天然血中血液干細(xì)胞的至少7倍；并且其中所^j6l液干細(xì)胞具有與天然血中的干細(xì)胞相同或相似或基4^t目同的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的組合物可包含可藥用載體；包括但不限于血漿、血、白蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)基、生長因子、銅螯合劑、激素、緩沖劑或低溫保存劑。"可藥用栽體，，指允許將所述干細(xì)胞導(dǎo)入哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)的試劑。這種載體可包括本文提及的物質(zhì)，具體地，包括任何可用于輸血的物質(zhì)，例如血液、血漿、白蛋白，還包括鹽水或緩沖液(優(yōu)選補(bǔ)充了白蛋白的緩沖液)，優(yōu)選來自待引入所述組合物的哺乳動(dòng)物。術(shù)語將組合物"引入"哺乳動(dòng)物意在指向動(dòng)物"施用"組合物。優(yōu)選地，通過靜脈內(nèi)對哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的干細(xì)胞。但是，如本領(lǐng)域7>知地，也可應(yīng)用其它施用形式。具體地，可應(yīng)用例如直接注射到心臟或心臟附近的組織，以使干細(xì)胞盡可能地接近受損位置。例如，就心臟病發(fā)作、心肌梗死的治療而言，優(yōu)選將只含有很少或不含除干細(xì)胞外其它細(xì)胞的干細(xì)胞組合物直接注射進(jìn)心肌。甚至更優(yōu)選地，這種注射還包含可接受量的G-CSF，傘J如k乂0.3ng至!]5fig的量，更優(yōu)選1ng/kg多』100ng/kg，更優(yōu)選5ng/kg到20ng/kg，甚至更優(yōu)選6ng/kg。施用干細(xì)胞可包含可藥用載體，例如本領(lǐng)域的一般描述所述。"可用栽體"通常指本發(fā)明血液干細(xì)胞可在其中存活的任何物質(zhì)，即無論是TVEMF擴(kuò)增之后、低溫保存之前或之后、還是引入(施用)哺乳動(dòng)物之前都對細(xì)胞沒有毒性。這種載體是本領(lǐng)域公知的，并且可以包括多種物質(zhì)，包括本申請全篇中就此目的描述的物質(zhì)。例如，血漿、血、白蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)基、緩沖劑和低溫保存劑都是本發(fā)明的可用載體。期望的載體部分取決于期望的用途。本領(lǐng)域已知的其它擴(kuò)增方法(不使用TVEMF)不提供血液干細(xì)胞在數(shù)量至少是天然血的至少七倍的擴(kuò)增并且同時(shí)還保持血液干細(xì)胞三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持不變。TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞具有與所來源jM目同或基;^目同的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)，或保持其不變。所述組合物包含TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞，優(yōu)選地懸浮在Dulbecco，s培養(yǎng)基中或者在準(zhǔn)備用于低溫保存的溶液中。所述組合物優(yōu)選不含有毒顆粒物質(zhì)，例如垂死細(xì)胞以及粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的有毒物質(zhì)或內(nèi)容物。所述組合物可以是包含TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞的低溫M組合物，這是通過降低組合物到-120°C到-196°C的溫度，并且保持低溫保存組合物在此溫度范圍直到其用于治療或其它應(yīng)用。如下文所討論地，優(yōu)選在低溫保存之前盡可能多的M合物中除去有毒物質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及使用TVEMF擴(kuò)增血液干細(xì)胞藥物組合物再生心臟組織的方法，所i^Jr液干細(xì)胞組合物是經(jīng)過低溫保存的或者是剛剛完成TVEMF擴(kuò)增的?？赏ㄟ^如靜脈內(nèi)注射或直接注射到待修復(fù)的組織來將細(xì)胞引入哺乳動(dòng)物體內(nèi)(優(yōu)")，以允許身體的天然系統(tǒng)修復(fù)和再生組織。優(yōu)選地，引入哺乳動(dòng)物身體的組合物不含有毒物質(zhì)以及可造成對所施用TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞有不利反應(yīng)的其它物質(zhì)。當(dāng)治療或研究需要個(gè)體血細(xì)胞，尤其是如果已經(jīng)發(fā)生疾病并且需要無該疾病的細(xì)胞時(shí)，所述細(xì)胞可便利地用于所述治療或研究。對于例如在生命后期需要修復(fù)心臟的人來說，保存的擴(kuò)增外周血或臍帶血可能是有用的。如果兒童有發(fā)生心臟病癥或需要修復(fù)心臟組織的傾向，則特別需要胯帶血。實(shí)施例1-TVEMF生物反應(yīng)器中細(xì)胞的實(shí)際TVEMF擴(kuò)增收集外周血并如表1所示擴(kuò)增外周血細(xì)胞，描述如下。A)收集與維持細(xì)胞如上文所述通過注射器從15個(gè)人類供體中收集人外周血(75ml;約0.75xl()6個(gè)細(xì)胞/ml)，將收集自10個(gè)供體的血懸浮在75ml的Iscove，s改良的Dulbecco，s培養(yǎng)基(IMDM)(GIBCO，GrandIsland,NY)中以制名Mfe混合物，所述培養(yǎng)基中補(bǔ)充了20%的5%人白蛋白(HA),100ng/ml重組人OCSF(AmgenInc.,ThousandOaks,CA)和100ng/ml重組人干細(xì)胞因子(SCF)(Amgen)。將每個(gè)血樣留下一部分作為"對照"樣品。將外周血混合物置于如本文圖2和3所示的TVEMF生物《Jl器中。TVEMF擴(kuò)增在37'C，6%C02及正常空氣中(VN比例下進(jìn)行。TVEMF生物>^應(yīng)器最初以10轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)的速度旋轉(zhuǎn)，然后如本申請所述按需要進(jìn)行調(diào)節(jié)，以保持外周血細(xì)胞懸浮在生物反應(yīng)器中。對生物反應(yīng)器施加6mA隨時(shí)間變化的電流。對外周血混合物施加的方波TVEMF約為0.5高斯。(頻率約10周/秒)。TVEMF生物反應(yīng)器中外周血混合物中的培養(yǎng)基每一到兩天進(jìn)行更換/更新。在第io天，將細(xì)胞從TVEMF生物反應(yīng)器中移出，用PBS洗滌并進(jìn)行分析。結(jié)果示于表1。對照數(shù)據(jù)指沒有進(jìn)行擴(kuò)增的人外周血樣品；擴(kuò)增樣品指TVEMF擴(kuò)增后的各個(gè)對照樣品。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>一定體積的對照細(xì)胞懸浮液或擴(kuò)增樣品置于特制的帶有微網(wǎng)的顯微鏡栽玻片上，并對樣品中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù))獲得對照和擴(kuò)增樣品的總細(xì)胞計(jì)數(shù)。對照樣品和TVEMF擴(kuò)增10天后的擴(kuò)增樣品中的總細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果在表l中顯示。如下測定表1中顯示的相應(yīng)CD34+的增加使用人CD34選擇試劑盒(EasySep陽性選擇，StemCellTechnologies)將擴(kuò)增樣品中的CD34+細(xì)胞與其它細(xì)胞分離開，并如上文所述使用計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后使用FACScan流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson)進(jìn)行確認(rèn)。通過克隆發(fā)生測定對CFU-GEMM和CFU-GM進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過臺盼蘭排除測試測定細(xì)胞成活力(其中成活細(xì)胞是活細(xì)胞，非成活細(xì)胞是死細(xì)胞)。在所有擴(kuò)增樣品中，答案"是，，表示CD34+細(xì)胞以與總細(xì)胞計(jì)數(shù)相應(yīng)的量增加。C)造血集落形成細(xì)胞的量的增加在此TVEMF擴(kuò)增組織培養(yǎng)系統(tǒng)中孵育供體的外周血細(xì)胞顯著增加了造血集落形成細(xì)胞的數(shù)目。在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中測定時(shí)，觀察到最多至第7天的CFU-GM(最高為7倍)和CFU-GEMM(最高為9倍)集落形成細(xì)胞數(shù)目的持續(xù)增長，沒有明顯的平臺期。D)CD34+細(xì)胞的增加在此TVEMF擴(kuò)增組織培養(yǎng)系統(tǒng)中孵育來自正常供體的MNC顯著增加了CD34+細(xì)胞的數(shù)目。在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中測定時(shí)，到培養(yǎng)的第6天，CD34+細(xì)胞的平均數(shù)目增加了十倍，在同一天出現(xiàn)平臺期。操作方法-修復(fù)心臟組織下文描述修復(fù)人體心臟組織的說明性方案。鑒定15名患有重度缺血性心臟衰竭并且沒有其它標(biāo)準(zhǔn)血管重建療法可選擇的患者參與此方案?；颊甙错樞蚣尤?，前10名患者指定為治療組，后5名患者為對照組。所有患者在加入時(shí)均置于最高耐受度的醫(yī)學(xué)治療下。以下納入標(biāo)準(zhǔn)是加入患者所必需的(1)具有可通過單光子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(SPECT)檢測的可逆性灌注缺損(reversibleperfusiondefect)的慢性冠狀動(dòng)脈疾病；(2)左心室(LV)射血分?jǐn)?shù)(EF)<40%;(3)通過冠狀動(dòng)脈造影評估為不適于進(jìn)行經(jīng)皮膚血管重建或手術(shù)血管重建；和(4)簽署知情同意書。如果符合以下排除標(biāo)準(zhǔn)中任一項(xiàng)，則患者不能加入^究(l)難以獲得用于經(jīng)皮膚法的血管入口；(2)瘤形成或其它可影響患者短期生存的復(fù)合病變的既往史或當(dāng)前史；(3)嚴(yán)重的心室節(jié)律失常(持續(xù)的室性心動(dòng)(4)LV動(dòng)脈瘤；(5)原因未知的異常基線實(shí)驗(yàn)室異常；(6)骨組織有放射學(xué)異常；(7)原發(fā)性血液疾?。?8)加入研究時(shí)三個(gè)月以內(nèi)的急性心M^t死；(9)通過2D多普勒超聲心動(dòng)圖發(fā)現(xiàn)存在靜脈血栓；(10)在進(jìn)行所述方案的時(shí)間血液動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定；(ll)心房顫動(dòng)；或者(12)任何將患者置于過度風(fēng)險(xiǎn)的狀況。治療組的基線評估包括完整的臨床評估(病史和身體)、實(shí)驗(yàn)室評估(完整的血液計(jì)數(shù)、血液化學(xué)、C反應(yīng)性蛋白[CRP、腦鈉素[BNP、肌酸激酶[CK-MB和肌鉀蛋白血清水平)、使用斜面跑臺法的運(yùn)動(dòng)應(yīng)激測試、2D多普勒超聲心動(dòng)圖、雙嘧達(dá)莫SPECT灌注掃描和24小時(shí)動(dòng)態(tài)心電圖。對照組接受除24小時(shí)動(dòng)態(tài)心電圖、CK-MB和肌鉤蛋白血清水平之外的上述基線評估。剛好在所述方案之前測量治療組患者的血清CRP、完整血液計(jì)數(shù)、CK、肌釣蛋白和BNP水平并進(jìn)行ECG。在所述方案之后立刻進(jìn)行另一次ECG和2D多普勒超聲心動(dòng)圖，然后開始進(jìn)行24小時(shí)動(dòng)態(tài)心電圖。血清CRP、CK和肌釣蛋白水平也在24小時(shí)的時(shí)候進(jìn)行評估。在進(jìn)行注射方案之后監(jiān)測患者48小時(shí)。使用含有5%人血清白蛋白的肝素化鹽水對例如根據(jù)實(shí)施例1制備的TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞進(jìn)行徹底清洗，并通過如100jim尼龍篩進(jìn)行過濾以除去細(xì)胞聚集體。將所述細(xì)胞重懸在含有5%人血清白蛋白的鹽水中，以作為藥物TVEMF擴(kuò)增血液干細(xì)胞組合物用于注射。將所述組合物的一小部分用于細(xì)胞計(jì)數(shù)和使用臺盼蘭排除法進(jìn)行的成活力測試。細(xì)胞成活力預(yù)期為>98%，與表1中所示結(jié)W目似。觀察到粒細(xì)胞-巨嗜細(xì)胞集落形成單位與CD45'。CD34+細(xì)胞之間存在高相關(guān)性。可如前所述進(jìn)行成纖維細(xì)胞集落形成測定，以確定推定的間充質(zhì)祖細(xì)胞(progenitormesenchymal)鐠系的存在'清況。進(jìn)行所述組合物的細(xì)菌和真菌培養(yǎng)以確保其為陰性。生物素化的或者與異硫氰酸熒光素(Pharmingen)、藻紅蛋白(PE)或PerCP綴合的以下抗體是可用的來自BectonDickinson的抗CD45作為靈長類白細(xì)胞標(biāo)記(克隆HI30)、抗CD34作為itife祖細(xì)胞標(biāo)記(克隆HPCA-II)，抗CD3作為靈長類T細(xì)胞標(biāo)記(克隆SK7)，抗CD4作為T細(xì)胞亞群標(biāo)記(克隆SK3)，以及抗CD8作為T細(xì)胞亞群標(biāo)記(克隆SKI);來自CaltagLaboratories(Burlingame，Calif)的抗CD14作為單核細(xì)胞標(biāo)記(克隆TUK4)，抗CD19作為靈長類B細(xì)胞標(biāo)記(克隆SJ25-C1)，抗CD56作為NK細(xì)胞標(biāo)記(克隆NKInbl-1);來自Beckman-Coulter的抗HLA-DR(MHC-II，克隆B8.12.2)。生物素化的抗體可4吏用鏈霉抗生物素蛋白PECy7(CaltagLaboratories)顯示。三色免疫熒光分析可用于在總的有核骨髄細(xì)胞懸液中鑒定白細(xì)胞*。在染色之后，將根據(jù)制造商的說明使用BectonDickinson裂解緩沖液或相似溶液裂解紅細(xì)胞，并使用CD45抗體評估每個(gè)樣品中白細(xì)胞的百分比。數(shù)據(jù)的采集和分析可在熒光激活的細(xì)胞分選器上進(jìn)行，例如帶有CellQuest3.1軟件的Calibur(BectonDickinson)。在細(xì)胞注射治療組中，在來自實(shí)驗(yàn)室的藥物TVEMF擴(kuò)增血液干細(xì)胞組合物的預(yù)計(jì)到達(dá)時(shí)間之前-1小時(shí)將患者帶至心導(dǎo)管術(shù)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)施帶有雙平面LV血管造影的左心插管術(shù)。其后如前述實(shí)施左心房電機(jī)械標(biāo)領(lǐng)'Helectromechanicalmapping,EMM)。通過與先前由SPECT灌注造影鑒定的缺血區(qū)域相匹配來選擇大概的治療區(qū)域。接著使用電機(jī)械標(biāo)測通過鑒定該區(qū)域中有活力的心肌膜(單極電壓^6.9mV)來耙向具體的治療區(qū)域。優(yōu)選與機(jī)械活動(dòng)下降(局部線性收縮<12%，指示冬眠的心肌膜)有關(guān)的區(qū)域。可通過以下步驟制備NOGA注射導(dǎo)管將延長針調(diào)整為0°和90°的彎曲，并將0.1cc藥物TVEMF擴(kuò)增血液干細(xì)胞組合物擴(kuò)增的干細(xì)胞裝入針的封閉空間內(nèi)。使注射導(dǎo)管的尖端穿過主動(dòng)脈瓣并進(jìn)入靶區(qū)域，并在注射所述細(xì)胞之前仔細(xì)評估每個(gè)注射位點(diǎn)。在將細(xì)胞注射進(jìn)LV壁之前，必須符合以下標(biāo)準(zhǔn)(l)導(dǎo)管與LV壁垂直放置；(2)環(huán)穩(wěn)定性非常好(<4mm);(3)基礎(chǔ)電壓(underlyingvotage)>6.9mV;和(4)在延長針進(jìn)入心肌膜時(shí)存在室性早^。對治療組中的每名患者進(jìn)行15次注射，每次0.2cc，預(yù)計(jì)的細(xì)胞總數(shù)為約1千4百萬個(gè)細(xì)胞/0.2cc。優(yōu)選引入的干細(xì)胞數(shù)目在本申請中有所討論，最優(yōu)選約107到109個(gè)干細(xì)胞。對照組可接受不含有任何干細(xì)胞的注射。所有患者(治療和對照)接受2個(gè)月的非^V性隨訪評估。使用預(yù)計(jì)的V02n^調(diào)整患者的工作負(fù)荷。跑臺速度最初是0.5mph，傾斜度為0%到10%,鍛煉的計(jì)劃持續(xù)時(shí)間為IO分鐘。對超聲心動(dòng)圖數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。圖像可以數(shù)碼形式保存并進(jìn)行離線分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作測量收縮末期容量(ESV)，舒張末期容量(EDV)和EF。在基線和隨訪中使用相同的應(yīng)激方案進(jìn)行雙嘧達(dá)莫應(yīng)激和靜止SPECT成像。在靜止和應(yīng)激之后注射約740MBq锝-99msestamibi,以每分鐘142jig/kg體重的速率輸注雙嘧達(dá)莫4分鐘。1個(gè)小時(shí)后開始SPECT成像，使用居于140-keV光峰中間的15%窗口。使用1-檢測器Y照相機(jī)(Ecam，Siemens)進(jìn)行采集，獲取180°上(右前斜位45。到左后斜位45°)的32個(gè)投影(低能量，高解析度準(zhǔn)直；64x64矩陣；每個(gè)投影35秒)?？梢允褂眠m當(dāng)?shù)牟逯颠M(jìn)行坐標(biāo)轉(zhuǎn)換來從重建的軸面斷層照片中提取左心室的短軸以及垂直和水平長軸斷層照片。不應(yīng)用衰減或^t校正。定量SPECT分析在例如ICON工作站計(jì)算機(jī)(Siemens)或類似裝置上進(jìn)行。除了進(jìn)行質(zhì)控檢查以證實(shí)最大計(jì)數(shù)圓周剖面以外，所述分析使用完全自動(dòng)化的軟件包進(jìn)行。簡言之，處理參數(shù)(包括頂點(diǎn)和最底部斷層照片的短軸切片、LV腔的中央軸和用于心肌計(jì)數(shù)搜索的限制范圍)將自動(dòng)產(chǎn)生。接著使用最大計(jì)數(shù)圓周剖面采樣技術(shù)對短軸斷層照片采樣，對左心室體的采樣使用圓柱法，對于LV頂點(diǎn)的采樣使用球形法。與性別匹配的正常界限進(jìn)行比較。接著產(chǎn)生極性圖展示和定量值，以指示應(yīng)激心肌灌注缺損的范圍和嚴(yán)重程度。對照組患者在后期的隨訪中不接受NOGA成像或重復(fù)LV血管造影，以避免不必要的風(fēng)險(xiǎn)。治療組患者將接受4個(gè)月的侵入性隨訪評估，其由LV血管造影和EMM組成。LV血管造影可使用5F的豬尾導(dǎo)管通過股法實(shí)施。所有的血管造影圖在竇性心律穩(wěn)定的時(shí)期中在2個(gè)平面獲得30。右前斜位視角和60。左前斜位視角。心室容積不在早搏期間或之后測量。使用40mm球作為校準(zhǔn)設(shè)備。EMM根據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施，使用15mm的填充閾值。在采集到點(diǎn)之后，將使用一系列濾波器(filter)(中等設(shè)置)來進(jìn)行后處理分析，以消除內(nèi)部點(diǎn)、不符合標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)(位置穩(wěn)定性<4mm，環(huán)穩(wěn)定性<6mm，循環(huán)長度變化<10%)的點(diǎn)、在ST區(qū)段上升期間采集的點(diǎn)以及與左心室無關(guān)的點(diǎn)(例如心房中的點(diǎn))。作圖和注射的總方案時(shí)間約為81±19分鐘。電機(jī)械標(biāo)測可包含平均92±16個(gè)點(diǎn)。患者將在平均2±0.7個(gè)區(qū)段(下方6個(gè)、側(cè)部14個(gè)、前部2個(gè)、間隔5個(gè))接受平均15±2次細(xì)胞組合物注射。每次在0.2cc體積中注射1千4百萬個(gè)細(xì)胞。預(yù)計(jì)所注射細(xì)胞中的2-3%(約400，000/mm2)是_造血祖細(xì)胞(CD451()CD34+)。類似的，預(yù)計(jì)所注射細(xì)胞中的約0.1%(約15，000/mm2)是早期it^祖細(xì)胞(CDaS^CDSa+HLADR-)，預(yù)計(jì)所注射細(xì)胞中的約25到30%(約4，000，000/mm2)是CD4+T細(xì)胞(CD45+CD3+CD4+)。預(yù)計(jì)所注射細(xì)胞中的約15%(約2,200,000/mm2)是CD8+T細(xì)胞(CD45+CD3+CD8+),預(yù)計(jì)所注射細(xì)胞中的約2%(約1，600，000/mm2)是B細(xì)胞(CD45+CD19+)。預(yù)計(jì)所注射細(xì)胞中的約10%(約1,400，000/mm2)是單核細(xì)胞(CD45+CD14+)，預(yù)計(jì)所注射細(xì)胞中的約1-2%(約150，000/mm2)是NK細(xì)胞(CD45+CD56+)。這些實(shí)驗(yàn)的預(yù)計(jì)結(jié)果是，按照紐約心臟協(xié)會(huì)(NewYorkHeartAssociation,NYHA)和加拿大心血管學(xué)會(huì)心絞痛評分(CanadianCardiovascularSocietyAngimaScore,CCSAS)的分布，治療組中的患者與對照組相比在2個(gè)月的隨訪期中將出現(xiàn)較少的心力衰竭、較少的心絞痛癥狀。兩個(gè)組的基線鍛煉測試的變量(MET和Vo2max)相似。然而，MET和Vo2max在治療組的隨訪階段顯著提高。NYHA分級在使用TVEMF擴(kuò)增的干細(xì)胞治療后降低了一半，而不使用擴(kuò)增干細(xì)胞的保持不變。預(yù)計(jì)CCSAS也在治療后變成治療前的一半以下，但是未治療的患者基本保持不變。預(yù)計(jì)Vo2max在治療后約35%,而未治療的則基本保持不變。預(yù)計(jì)超聲心動(dòng)圖、ESV、體積在治療后將降低約15。/。，而未治療的將提高。預(yù)計(jì)SPECT、總的可逆性缺損在治療后將降低約80%，而未治療的將提高。對于EMM，片段分析將表明進(jìn)行了經(jīng)注射區(qū)^著的^改善。將顯示出注射位點(diǎn)^功能的顯著改善。因此可見，通過本文討論的治療可實(shí)現(xiàn)顯著的心臟修復(fù)。如果TVEMF擴(kuò)增的干細(xì)胞是靜脈內(nèi)注射的，預(yù)計(jì)可達(dá)到類似的結(jié)果，盡管修復(fù)時(shí)間可能較長。在動(dòng)物模型上或其它需要心臟組織修復(fù)的情況下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)預(yù)計(jì)會(huì)在組織學(xué)或病理性分析或其他所需分析中顯示本發(fā)明的心臟組織<務(wù)復(fù)。操作方法-低溫^Mf如上文所提及的，從哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)中收集血。優(yōu)選至少從血中除去紅細(xì)胞。血液干細(xì)胞(及所需的其它細(xì)胞和培養(yǎng)基)置于TVEMF生物反應(yīng)器中，受到隨時(shí)間變化電磁力，并且擴(kuò)增。如果在擴(kuò)增前未除去RBC，則優(yōu)選在TVEMF擴(kuò)增之后除去。在擴(kuò)增之后，細(xì)胞可低溫保存。此處拔，供關(guān)于低溫保存TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞和包含這種細(xì)胞的組合物的方法的其他細(xì)節(jié)，具體見下文。在TVEMF擴(kuò)增之后，優(yōu)選將TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞(包括TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞)轉(zhuǎn)移到至少一個(gè)含有至少一種低溫保護(hù)劑的低溫保存容器中。優(yōu)選地，首先用溶液(例如，緩沖溶液或所期望的低溫保存溶液)洗滌TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞，以除去培養(yǎng)基和TVEMF擴(kuò)增過程中存在的其它組分，接著將其混入允許對細(xì)胞低溫保存的溶液中。這種溶液一般稱為低溫保存劑、低溫保存液或防凍劑。將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到合適的低溫容器中，此容器一般降溫至-120n到-196'C，優(yōu)選約-130'C到約-150。C，并且維持在此溫度。優(yōu)選在冷凍過程中緩慢且小心地降低溫度，以不損傷所述干細(xì)胞或至少使損傷最小化。當(dāng)需要時(shí)，將細(xì)胞的溫度(即低溫容器的溫度)上升到與引y^A體相容的溫度(通常從約為室溫到約為體溫)，然后TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞被導(dǎo)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)，優(yōu)l人類，例如如上文所討論。冷凍細(xì)胞通常有破壞性。不限于理論地，在降溫過程中，細(xì)胞內(nèi)的水結(jié)水。然后可能通itxt細(xì)胞膜的滲透作用、細(xì)胞脫水、溶質(zhì)濃縮、以及冰晶形成而產(chǎn)生損傷。隨著在細(xì)胞外部形成水，有效水從溶液中被除去并從細(xì)胞中吸取水分，造成滲透脫水并提高溶質(zhì)濃度，最終破壞細(xì)胞。(討論參閱Mazur,P.,1977，Cryobiology14:251-272.)不同物質(zhì)具有不同的水點(diǎn)。優(yōu)選地，待用于低溫保存的血液干細(xì)胞組合物包含盡可能少的污染物質(zhì)，以盡可能使結(jié)晶和冷凍過程中對細(xì)胞壁的損傷最小。這些損傷作用可通過以下來降低或甚至避開(a)應(yīng)用低溫保護(hù)劑，(b)控制冷凍速率，以及(c)在足夠低的溫度保存，以盡可能減少降解反應(yīng)。在本發(fā)明中優(yōu)選包括低溫保存劑?？墒褂玫牡蜏乇Ｗo(hù)劑包括但不限于足量的二曱基亞砜(DMSO)(Lovelock,J.E.andBishop,M.W.H.，1959，Nature183:1394-1395;Ashwood國Smith,M.J.，1961,Nature1卯:1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(Rinfret，A.P.，1960,Ann.N.Y.Acad.Sci.85:576)、聚乙二醇(Sloviter，H.A.andRavdin，R.G，1962,Nature196:548)、白蛋白、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、i-赤鮮醇、D-核糖醇、D-甘露醇(Rowe，A.W.，etal.,1962，F(xiàn)ed.Proc.21:157)、D-山梨醇、i-肌醇、D國乳糖、氯化^UBender,M.A.，etal"1960，J.Appl.Physiol.15:520)、氨基酸葡萄糖溶液或者氨基酸(PhanTheTranandBender,M.A.，1960,Exp.CellRes.20:651)、曱醇、乙跣胺、單乙^_甘油酯(Lovelock,J.E.,1954，Biochem.J.56:265)和無機(jī)鹽(PhanTheTranandBender,M.A.，1960，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.104:388;PhanTheTranandBender,M.A.，1961inRadiobiology,ProceedingsoftheThirdAustralianConferenceonRadiobiology，IIbery,P.L.T"ed.，Butterworth,London,p.59)。在優(yōu)選實(shí)施方案中使用DMSO。DMSO為液體，低濃度下對細(xì)胞無毒。作為小分子，DMSO可自由穿過細(xì)胞并通過與水結(jié)合而改變其冷凍性來保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器，以及防止形成水而造成的損害。添加血漿(即，至濃度20-25%)可增加DMSO的保護(hù)效果。添加DMSO后，細(xì)胞應(yīng)保持在0'C或更低，因?yàn)榧sl。/。濃度的DMSO在高于4。C的溫度下是有毒的。我選擇的與TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞組合用于總組合物的優(yōu)選低溫保護(hù)劑為在60至80。/。氨基酸葡萄糖溶液中的20至40%二甲基亞砜溶液，或者15至25%的羥乙基淀粉溶液，或者4至6。/。的甘油、3至5%葡萄糖、6至10。/。葡彩瞎T10，或者15至25。/。聚乙二醇或者75至85%氨基酸葡萄糖溶液。上文所述的低溫保存劑的量優(yōu)選是整個(gè)組合物中低溫保存劑的總量(不只是添加到組合物中的物質(zhì)的量)。盡管待低溫保存的本發(fā)明組合物中可存在除血細(xì)胞和低溫保護(hù)劑之外的其它物質(zhì)，但例如由于如上文討論的關(guān)于冷凍機(jī)制的原因，本發(fā)明的TVEMF擴(kuò)增血液干細(xì)胞組合物的低溫保存優(yōu)選含有盡可能少的其它物質(zhì)。優(yōu)選地，將本發(fā)明的TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞組合物冷卻到溫度為約-120'C到約-196'C的范圍，優(yōu)選約-130'C到約-196。C，更優(yōu)選為-130。C到約-150'C。受控的緩慢冷卻速率是重要的。不同的低溫保護(hù)劑(Rapatz,G，etal.，1968，Cryobiology5(1):18-25)和不同的細(xì)胞類型有不同的最佳冷卻速率(對于降溫速度對于外周細(xì)胞存活的影響(以及對其移植潛力的影響)可參閱如Rowe,A.W.andRinfret，A.P.，1962,Blood20:636;Rowe,A.W.，1966，Cryobiology3(1):12-18;Lewis,J.P.,etal.，1967，Transfusion7(l):17-32;andMazur，P.，1970，Science168:939-949)。水變成冰時(shí)的熔化熱應(yīng)該盡可能小。冷卻過程可通過應(yīng)用例如可編程冷凍i殳備或者甲醇浴方法來實(shí)施。可編程冷凍裝置允許確定最佳冷卻速率并促進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的可重現(xiàn)的冷卻。可編程速率控制冷凍裝置比如Cryomed或Planar允i午將冷凍方案調(diào)整到期望的冷卻速率曲線。其它可接受的冷凍裝置可以是，例如，SanyoModelMDF-1155ATN-152C和ModelMDF-2136ATN-135C，PrincetonCryoTechTEC2000。例如，對于10%DMSO和20%血漿中的血細(xì)胞或者CD34十/CD38-細(xì)胞，最優(yōu)速率為從0'C到-200。C，l到3。C/分鐘。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此冷卻速率可用于本發(fā)明所述細(xì)胞。盛有所述細(xì)胞的低溫容器必須在低溫下穩(wěn)定，并且允許快速的熱傳遞，以^更于有效控制冷凍和解凍。密封塑料管(例如Nunc、Wheatoncryules)或玻璃安瓿可用于多個(gè)小量(1-2ml)，而較大體積(100-200ml)可在聚烯烴袋(例如Delmed)中冷凍，該聚烯烴flit在金屬板之間以便在冷卻期間更好的傳遞熱量。(骨髄細(xì)胞袋通過將其置于-80'。冷凍裝置中成功冷凍，幸好該冷凍裝置提供了約3'C/分鐘的冷卻速率)。在替代實(shí)施方案中，可應(yīng)用甲醇浴冷卻方法。曱醇浴方法特別適合大,的對多個(gè)小物品實(shí)施常規(guī)低溫保存。該方法不需要手動(dòng)控制冷凍速率也不需要記錄器監(jiān)測速率。在優(yōu)選的方面中，DMSO處理的細(xì)胞預(yù)先在水上冷卻并轉(zhuǎn)移到裝滿冷凍曱醇的盤中，其隨后被置于-130。C機(jī)械冰箱中(例如Harris或Revco)。曱醇浴和樣品的熱電偶檢測顯示期望的1到3'C/分鐘的冷卻速率。在至少兩個(gè)小時(shí)之后，樣品達(dá)到-80'C，然后可直接將其置于液氮(-196'C)中以永久絲。完全冷凍之后，TVEMF擴(kuò)增的干細(xì)胞可快速轉(zhuǎn)移到長期低溫保存容器中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，樣品可低溫保存在液氮(-196'C)中或者其蒸汽(-165*C)中。保存溫度應(yīng)低于-120。C，優(yōu)選低于-130。C。高效液氮水箱的可用性大大方便了這種保存，所述水箱類似于具有極低真空和內(nèi)部超絕熱的大Thermos容器，使得熱量泄漏和氮?dú)饬魇Ф急３衷诮^對低值。用于低溫保存細(xì)胞的優(yōu)選的裝置和程序由ThermogenesisCorp.,RanchoCordovo,CA制造，利用它們的程序?qū)⒓?xì)胞溫度降低到低于-130"。在冷凍和保存期間細(xì)胞盛放于Thermogenesis血漿袋中。其它水箱是市售的。例如，"BioArchive"冰箱不但冷凍而且提供低溫保存樣品比如本發(fā)明的血或細(xì)胞的目錄，例如同時(shí)管理高達(dá)3,626個(gè)冷凍血袋。此冰箱具有M臂，當(dāng)其在得到指示時(shí)將取出特定樣品，確保不擾亂其它樣品或使其暴露在較高溫度中。其它市售的冰箱包含但不限于SanyoModelMDF-1155ATN-152C和ModelMDF-2136ATN-135C,和PrincetonCryoTechTEC2000。在TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞組合物的溫度降低到低于-120'(:之后，優(yōu)選低于-130。C,它們可置于裝置中，比如Thermogenesis冷凍裝置。它們的溫度保持在-120"C到-196。C，優(yōu)選-130。C到-150'C。本發(fā)明的低溫保存TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞組合物的溫度不應(yīng)長時(shí)間處于約-120'C。根據(jù)本發(fā)明的低溫保存的TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞或其組合物可冷凍無限長時(shí)間，在需要時(shí)將其解凍。例如，組合物可冷凍長達(dá)18年。甚至更長的時(shí)間也是可行的，可能甚至長a餘沐的一生。需要時(shí)，可將其中裝有細(xì)胞的袋置于解凍系統(tǒng)中，比如ThermogenesisPlasmaThawer或ThermolineThawer系歹1中的其它裝置。低溫保存的組合物的溫度升至室溫。在另一個(gè)優(yōu)選解凍與低溫保護(hù)劑混合的細(xì)胞的方法中，可將保存在液氮中的裝有本發(fā)明的低溫保存的TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞組合物的袋置于液氮的氣相中15分鐘，然后暴露在室溫環(huán)境空氣中5分鐘，最后在37。C水浴中盡可能快的解凍。解凍的袋立刻用相同體積的溶液稀釋，該溶液是含有2.5%(重量/體積)Aj6i清白蛋白和5%(重量/體積)葡聚糖40(Solplex40;Sifra，Verona,Italy)的等滲鹽溶液，接著400g離心十分鐘。除去上清，用新鮮白蛋白/葡聚糖溶液重懸沉降下來的細(xì)胞?？蓞㈤哛ubinstein,P.etal"Processingandcryopreservationofplacental/umbilicalcordbloodforunrelatedbonemarrowreconstitution.tv"汰Sc/.92:10119-1012(1995)forRemovalofHypertonicCryoprotectant;此優(yōu)選解凍細(xì)胞方法的一種變4匕形式可見Lazzari，L.etal"Evaluationoftheeffectofcryopreservationonexvivoexpansionofhematopoieticprogenitorsfromcordblood,fioweManwv7>"朋.28:693-698(2001)。在細(xì)胞升溫到室溫后，它們可用于研究或再生治療。解凍的TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞組合物可直接引入哺乳動(dòng)物體內(nèi)，優(yōu)選人類，或者以其解凍形式用于期望的研究中。其中存在解凍細(xì)胞的溶液可被完全洗去，并換成或加入其他溶液或按需要進(jìn)行操作。在引入哺乳動(dòng)物體內(nèi)之前，優(yōu)選在馬上將要引入之前，可將多種添加劑加入解凍組合物(或者非低溫保存的TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞組合物)中。此類添加劑包括但不限于生長因子、銅螯合劑、細(xì)胞因子、激素、適宜的緩沖劑或稀釋劑。優(yōu)選地，添加OCSF。更優(yōu)選地，對于人類，以約20到約40ng/kg體重的量添加G-CSF,甚至再優(yōu)選地，以約30pg/kg體重的量。在引入之前，TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞組合物可與哺乳動(dòng)物自身或者合適供體的血漿、血液或白蛋白、或者其它物質(zhì)(例如可伴隨輸血的物質(zhì))混合。解凍的血液干細(xì)胞可用于例如檢驗(yàn)對期望用于治療或可用于治療的藥物是否有有害反應(yīng)。盡管FDA尚未批準(zhǔn)在美國將擴(kuò)增的血液干細(xì)胞用于組織再生，但是這一批準(zhǔn)看起來即將來臨。直接注射足量的擴(kuò)增血液干細(xì)胞應(yīng)能夠如本申請中所討論的用于修復(fù)和再生心臟組織。本發(fā)明的TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞組合物應(yīng)以足夠?qū)崿F(xiàn)組織修復(fù)或再生或者足夠治療目標(biāo)疾病或病癥的量引入哺乳動(dòng)物體內(nèi)，優(yōu)逸人類。優(yōu)選地，將至少20ml每ml含l(T到109干細(xì)胞的TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞組合物用于任何治療，優(yōu)選一次全部使用，尤其是當(dāng)發(fā)生外傷后需要立即組織修復(fù)的情況。此量對75-80kg的人體是特別優(yōu)選的。待引入其來源哺乳動(dòng)物的組合物中的TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞的量部分取決于來源血物質(zhì)中存在的細(xì)胞數(shù)量(特別是如果可用的數(shù)量相當(dāng)有限時(shí))。引入患者的TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞的優(yōu)選范圍可以是，比如，約10ml到約50ml的TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞組合物，其每1111含107到109干細(xì)胞，或者可能更多。盡管我們知道高濃度的任何物質(zhì)施用給哺乳動(dòng)物都可能是有毒的或者甚至是致死的，但是引入所有的哺乳動(dòng)物血液干細(xì)胞，例如在TVEMF擴(kuò)增后至少7倍，不可能造成TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞過量。在使用來自多個(gè)供體或同一供體多次收集的血的情況下，引入哺乳動(dòng)物的血液干細(xì)胞的數(shù)量可以更高。同樣，可引入患者的TVEMF細(xì)胞的劑量不受從一個(gè)個(gè)體收集所提供的血數(shù)量的限制；多次施用可更容易應(yīng)用，例如每天一次或兩次，或每周一次，或其它施用時(shí)間方案。并且，在治療組織時(shí)，所述組織類型可能準(zhǔn)許使用盡可能多的TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞或使用較小的劑量。例如，與其他組織相比，肝臟可能是最易于治療的，并且可能需要較少的干細(xì)胞。應(yīng)該理解，盡管上文所描述的實(shí)施方案通常涉及低溫保存TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞，但是TVEMF擴(kuò)增也可以在對已經(jīng)過低溫保存的、非擴(kuò)增、或者非TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞解凍之后進(jìn)行。同時(shí)，如果期望低溫保存，則可以在冷凍細(xì)胞之前或之后進(jìn)行TVEMF擴(kuò)增。例如，許多血庫有低溫保存的組合物，其包含處于冷凍保存狀態(tài)的血液干細(xì)胞，以備在某時(shí)間點(diǎn)的需要。這些組合物可纟艮據(jù)傳統(tǒng)方法解凍，然后按照此處所述進(jìn)行TVEMF擴(kuò)增，其包括按照此處所述的TVEMF過程的變化形式。此后，如上文所述，此TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞被認(rèn)為是本發(fā)明的組合物。在低溫保存之前進(jìn)行TVEMF擴(kuò)增是優(yōu)選的，例如假如發(fā)生外傷，已經(jīng)擴(kuò)增了患者的血液干細(xì)胞就不需要再花費(fèi)寶貴的額外數(shù)天來準(zhǔn)備。同樣，盡管不優(yōu)選，但應(yīng)注意本發(fā)明的TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞可低溫保存，然后解凍，然后如果不使用，再低溫保存。在冷凍所述細(xì)胞之前優(yōu)選進(jìn)行TVEMF擴(kuò)增(即數(shù)量的增加，而不是尺寸)。所述細(xì)胞也可在冷凍接著解凍之后進(jìn)行擴(kuò)增，即便在冷凍之前已經(jīng)進(jìn)行過擴(kuò)增。血液干細(xì)胞的擴(kuò)增可能需要若干天。在立刻提供血液干細(xì)胞是^f艮重要的情況下，比如生死仗關(guān)的情況或外傷的情況，尤其在如果需要在將細(xì)胞重新引入之前完成研究的情況下，可能沒有數(shù)天時(shí)間去等待血液干細(xì)胞擴(kuò)增。因此，預(yù)先估計(jì)到治療每拖延一分鐘都可決定生死的緊急情況，就特別期望從出生時(shí)就有可用的擴(kuò)增血液干細(xì)胞。還應(yīng)該理解，在TVEMF擴(kuò)增后經(jīng)過或不經(jīng)過低溫^M!"，本申請的TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞均可引入哺乳動(dòng)物，優(yōu)選來源哺乳動(dòng)物(血來源的哺乳動(dòng)物)。但是，這樣的引入無需僅限于來源哺乳動(dòng)物(自體)；TVEMF擴(kuò)增細(xì)胞也可轉(zhuǎn)移給不同的哺乳動(dòng)物(異體)。還應(yīng)該理解，盡管血是本發(fā)明優(yōu)選的成體干細(xì)胞來源，但來自骨髓的成體干細(xì)胞也可以以與本發(fā)明血液干細(xì)胞相似的方式進(jìn)行TVEMF擴(kuò)增并使用。骨髓不是易得的干細(xì)胞來源，而是必需通過采集術(shù)Upheresis)或其它昂貴且疼痛的方法進(jìn)行收集。本發(fā)明還包括研究心臟組織(例如與心臟疾病或病癥相關(guān)的)的方法。例如，所述方法可包括將TVEMF擴(kuò)增的干細(xì)胞引入用于此疾病狀態(tài)的測試系統(tǒng)。這樣的系統(tǒng)可包括但不限于例如患有此疾病的哺乳動(dòng)物、用于研究所述疾病的適當(dāng)動(dòng)物模型或用于研究所述疾病的體外測試系統(tǒng)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所>^知，TVEMF擴(kuò)增血液干細(xì)胞可用于研究心臟相關(guān)疾病可能的治療方法。在擴(kuò)增、保存、和解凍的完整過程中，本發(fā)明的血液干細(xì)胞均維持其三維幾何結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。盡管本文描述了優(yōu)選的實(shí)施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解本發(fā)明包括了多種變化與改良。本發(fā)明的范圍不限于上文所描述的實(shí)施方案。權(quán)利要求1.修復(fù)心臟組織的方法，其包括對哺乳動(dòng)物施用治療有效量的血液干細(xì)胞藥物組合物的步驟，所述組合物包含擴(kuò)增的血液干細(xì)胞，其在每單位體積中的數(shù)目是天然血中的至少7倍，并且其中所述血液干細(xì)胞具有與天然血中的干細(xì)胞基本相同的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。2.修復(fù)心臟組織的方法，其包括對哺乳動(dòng)物施用治療有效量的血液干細(xì)胞藥物組合物的步驟，所述組合物包含TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞，其在每單位體積中的數(shù)目是天然血中的至少2倍，并且其中所述血液干細(xì)胞具有與天然血中的干細(xì)胞基^目同的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中每單位體積中TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞數(shù)目是至少7倍。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述施用步驟包括將藥物血液干細(xì)胞組合物施用到人外周血流、心臟鄰近組織或心臟組織中的至少一處。5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述藥物血液干細(xì)胞組合物還包含人GM-CSF和人G-CSF中的至少一種。6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。7.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其在施用步驟之前，還包括以下步驟a.將血混合物置于TVEMF生物反應(yīng)器的培養(yǎng)腔室中；b.在TVEMF生物>^應(yīng)器中，使血液混合物受到TVEMF并對血液干細(xì)胞進(jìn)行TVEMF擴(kuò)增，直至每單位體積中TVEMF擴(kuò)增血液干細(xì)胞的數(shù)目是置于TVEMF生物反應(yīng)器中的每單位體積中血液干細(xì)胞數(shù)目的7倍以上；和c.將TVEMF擴(kuò)增細(xì)胞與可藥用載體混合以形成藥物血液干細(xì)胞組合物。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，還包括從TVEMF擴(kuò)增細(xì)胞中除去有毒物質(zhì)。9.才艮據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述TVEMF為約0.05到約6.0高斯。10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其在將血混合物置于TVEMF生物反應(yīng)器中之前還包括收集血的步驟，其中所述血收集自自體來源。11.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其在將血混合物置于TVEMF生物反應(yīng)器中之前還包括收集血的步驟，其中所述血收集自異體來源。12.根據(jù)權(quán)利要求ll的方法，其在將血混合物置于TVEMF生物反應(yīng)器中之前還包括收集血的步驟，其中所述血收集自哺乳動(dòng)物、血庫、醫(yī)院和低溫M血樣中至少一種。13.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所#混合物包含與其他血液成分分離開的CD34十/CD38-血液干細(xì)胞。14.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所i^A混合物包含與其他血液成分分離開的血沉棕黃層。15.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所#混合物不含紅細(xì)胞。16.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中施用于哺乳動(dòng)物的TVEMF擴(kuò)增血液干細(xì)胞的治療有效量是約20ml,每ml約107到約109個(gè)細(xì)胞。17.用于修復(fù)哺乳動(dòng)物心臟組織的血液干細(xì)胞藥物組合物，所述組合物包含擴(kuò)增的血液干細(xì)胞，其在每單位體積中的數(shù)目是天然血中的至少7倍，并且其中所a液干細(xì)胞具有與天然血中的干細(xì)胞基^目同的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。18.用于修復(fù)哺乳動(dòng)物心臟組織的血液干細(xì)胞藥物組合物，所述組合物包含TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞，其在每單位體積中的數(shù)目是天然血中的至少2倍，并且其中所述血液干細(xì)胞具有與天然血中的干細(xì)胞基;M目同的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。19.根據(jù)權(quán)利要求18的血液干細(xì)胞藥物組合物，其中每單位體積中TVEMF擴(kuò)增的血液干細(xì)胞的數(shù)目是至少7倍。20.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中所述組合物還包含選自以下的至少一種可藥用載體血漿、血、白蛋白和含有5。/。人血清白蛋白的鹽水。21.根據(jù)權(quán)利要求17到20中任一項(xiàng)的組合物在制備用于修復(fù)心臟組織的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物血液干細(xì)胞優(yōu)選CD34+/CD38-細(xì)胞的TVEMF擴(kuò)增，還涉及來源于TVEMF擴(kuò)增細(xì)胞的組合物，還涉及使用所述組合物治療心臟病或修復(fù)心臟組織的方法。文檔編號A61K38/19GK101166541SQ200680014301公開日2008年4月23日申請日期2006年2月27日優(yōu)先權(quán)日2005年2月28日發(fā)明者唐尼·拉德申請人:雷格內(nèi)泰克公司