專利名稱：具有校正突變-cftr加工活性的化合物及其應(yīng)用的制作方法
關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明
本發(fā)明在國家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)授予的資助號HL73856、EB00415、HL59198、EY13574和DK35124的政府支持下完成。政府可以享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
本發(fā)明也得到了囊性纖維化基金會(huì)和/或囊性纖維化治療基金會(huì)的資助。
背景技術(shù)：
囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)是哺乳動(dòng)物呼吸道、小腸、胰腺和睪丸的上皮細(xì)胞中表達(dá)的cAMP-活化的氯(Cl-)通道。CFTR是負(fù)責(zé)cAMP-介導(dǎo)Cl-分泌的氯離子通道。激素如β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑或毒素如霍亂毒素會(huì)導(dǎo)致cAMP增加、cAMP-依賴性蛋白激酶活化和CFTR Cl-通道的磷酸化，使該通道打開。細(xì)胞中Ca2+濃度增加也可激活不同的頂端膜通道。蛋白激酶C引起的磷酸化可打開或關(guān)閉頂端膜中的Cl-通道。CFTR主要位于上皮中，為Cl-離子跨頂端膜移動(dòng)提供通道，是調(diào)節(jié)鹽和水跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)速率的關(guān)鍵點(diǎn)。CFTR氯通道功能與各種疾病包括囊性纖維化(CF)以及某些類型的男性不育、多囊性腎病和分泌性腹瀉有關(guān)。
遺傳致死性疾病CF是由CFTR蛋白編碼基因中的突變引起的，CFTR蛋白是氣道、小腸、胰腺以及其它分泌性和吸收性上皮中表達(dá)的cAMP-活化Cl-通道。CF引起的主要臨床問題是反復(fù)性肺部感染，導(dǎo)致肺功能進(jìn)行性退化。最常見的CFTR突變是苯丙氨酸-508缺失(ΔF508-CFTR)，這種突變存在于約90％CF患者的至少一個(gè)等位基因中(Egan等，(2004)Science 304600-602)。ΔF508-CFTR導(dǎo)致Cl-不能透過，因?yàn)棣508-CFTR沒有被正確加工，使其滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(而非質(zhì)膜)。相對于野生型CFTR，ΔF508-CFTR也降低了固有的Cl-傳導(dǎo)率。
已研究了校正ΔF508-CFTR細(xì)胞加工和細(xì)胞內(nèi)固有功能缺陷的方案。在低溫下(＜30℃)(Denning等，(1992)Nature 358，761-764)或用高濃度的化學(xué)侶伴分子如甘油(Sato等，(1996)J.Biol.Chem.271，635-638；Brown，等(1996)，Cell Stress andChaperons 1，117-125)培養(yǎng)細(xì)胞能部分校正ΔF508-CFTR細(xì)胞加工的缺陷，其機(jī)制可能包括改善蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性(Sharma等，(2001)J.Biol.Chem.276，8942-8950)。毒胡蘿卜素引起的胞內(nèi)鈣濃度持續(xù)升高也能校正ΔF508-CFTR加工的缺陷(Egan等，(2002)Nature Med.8，485-492)，機(jī)制可能是干擾與分子伴侶的相互作用?；衔锶绫交∷狨ネㄟ^改變侶伴分子功能和/或增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄促進(jìn)ΔF508-CFTR細(xì)胞加工(Rubenstein等，(2000)Am.J.Physiol.278，C259-C267；Kang等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，838-843)。雖然這些方法能夠使人了解ΔF508-CFTR滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的機(jī)制，但它們可能無法提供臨床上有用的治療。
即使存在于細(xì)胞質(zhì)膜上，ΔF508-CFTR也明顯損傷了該通道的活性(Dalemans等，(1991)Nature 354，526-528)。細(xì)胞粘附膜片鉗測定顯示，即使采用最大的cAMP刺激，ΔF508-CFTR通道開放概率也降低，關(guān)閉時(shí)間延長(Haws等，(1996)Am.J.Physiol.270，C1544-C1555；Hwang等，(1997)Am.J.Physiol.273，C988-C998)。離體細(xì)胞膜中的膜片鉗測定表明，與野生型CFTR相比，ΔF508-CFTR磷酸化后活性水平降低了7倍。較高濃度的黃酮類物質(zhì)染料木黃酮(＞50μM，Hwang，等，(1997)Am.J.Physiol.273，C988-C998；Wang等，(2000)J.Physiol.524，637-638)或黃嘌呤類物質(zhì)異丁基甲基黃嘌呤(＞1mM，Drumm等，(1991)Science 254，1797-1799)與cAMP激動(dòng)劑聯(lián)用能提高ΔF508-CFTR通道活性。但這些研究仍然沒能提供任何臨床上有用的治療。
因此，仍然需要能校正突變體CFTR如ΔF508-CTFR的折疊或細(xì)胞加工的化合物，和用這種化合物研究和治療CF以及治療和控制其它分泌性疾病的方法。本發(fā)明解決了這些及其它需要。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了校正突變-囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(如ΔF508 CFTR)的細(xì)胞加工(如折疊、運(yùn)輸或翻譯后修飾)、可用于治療囊性纖維化(CF)的組合物、藥物制劑和方法。本發(fā)明的組合物和藥物制劑可含有本發(fā)明的含氨基苯并噻唑的化合物、含氨基芳基噻唑的化合物、含喹唑啉基氨基嘧啶酮的化合物、含雙氨基甲基聯(lián)噻唑的化合物或含苯基氨基喹啉的化合物或者它們的類似物或衍生物中的一種或多種化合物。
本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有式(I)化合物；或其藥學(xué)上可接受的衍生物，如各立體異構(gòu)體或其混合物；或其藥學(xué)上可接受的鹽
式中，R1獨(dú)立地選自氫或與R2稠合的C(＝O或＝S)NH基團(tuán)，R2獨(dú)立地選自連接于取代或未取代的烷基、取代或未取代的環(huán)烷基或者取代或未取代的芳環(huán)和取代或未取代的雜芳環(huán)的N＝CH或N-烷基。在一個(gè)實(shí)施方式中，該組合物還含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、藥學(xué)上可接受的稀釋劑、藥學(xué)上可接受的賦形劑和藥學(xué)上可接受的佐劑中的至少一種。在另一實(shí)施方式中，該組合物不含可檢測的二甲亞砜。
在某些實(shí)施方式中，該組合物的R1是氫，具有式(II)的化合物是具有式(Ia)的化合物
式中，R3獨(dú)立地選自取代或未取代的苯基，R4是取代或未取代的烷基。在一個(gè)實(shí)施方式中，R3選自4-(甲氧基)苯基、3-(硝基)苯基、4-(硝基)苯基或4-(氯)苯基。在另一實(shí)施方式中，R4選自氫或甲基。
在其它實(shí)施方式中，該化合物為式(Ib)化合物
式中，R5和R6選自取代或未取代的烷基，或者是稠合的取代或未取代的環(huán)烷基。在一個(gè)實(shí)施方式中，R5是乙基。在另一實(shí)施方式中，R6是乙基。在又一實(shí)施方式中，R5和R6是稠合的叔(丁基)環(huán)己烷基。
在代表性實(shí)施方式中，該化合物選自
本發(fā)明也提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有式(II)化合物；或其藥學(xué)上可接受的衍生物，如各立體異構(gòu)體或其混合物；或其藥學(xué)上可接受的鹽
式中，R1獨(dú)立地選自取代或未取代的苯基，R2獨(dú)立地選自氫或烷基，R3獨(dú)立地選自取代或未取代的苯基，取代或未取代的雜芳基，取代的氨基，取代的?；?。在一個(gè)實(shí)施方式中，該組合物還含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、藥學(xué)上可接受的稀釋劑、藥學(xué)上可接受的賦形劑和藥學(xué)上可接受的佐劑中的至少一種。在另一實(shí)施方式中，該組合物不含可檢測的二甲亞砜。
在一個(gè)實(shí)施方式中，R1選自未取代的苯基、未取代的聯(lián)苯基、3，4-二(甲基)苯基、4-(甲基)苯基、3，4-二(甲氧基)苯基、3，4-二(羥基)苯基、4-(溴)苯基、4-(丙烯)苯基、3-(甲基)-4-(甲氧基)苯基或3-(硝基)-4(甲基)苯基。在另一實(shí)施方式中，R2選自氫或甲基。在又一實(shí)施方式中，R3選自未取代的苯基、3-(氯)苯基、4-(氟)苯基、2-(甲基)苯基、2-(乙氧基)苯基、2，5-二(甲氧基)-4-(氯)苯基、4-(乙酰胺)苯基、未取代的嘧啶基、3-(甲基)吡啶基、二(甲基)亞丁基胺基、?；?噻吩基、?；?4-叔丁基-苯基)或?；?甲硫基-咪唑-5-苯基。在代表性實(shí)施方式中，該化合物選自
本發(fā)明也提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有式(III)化合物；或其藥學(xué)上可接受的衍生物，如各立體異構(gòu)體或其混合物；或其藥學(xué)上可接受的鹽
式中，R1選自氫、烷基或烷氧基；R2選自氫、烷基或烷氧基；R3是烷基；R4選自羥基或羰基；R5和R6選自稠合環(huán)烷基、氫、烷基或者取代或未取代的苯基。在一個(gè)實(shí)施方式中，該組合物還含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、藥學(xué)上可接受的稀釋劑、藥學(xué)上可接受的賦形劑和藥學(xué)上可接受的佐劑中的至少一種。在另一實(shí)施方式中，該組合物不含可檢測的二甲亞砜。
在一個(gè)實(shí)施方式中，R1選自氫、甲基、乙基、甲氧基或乙氧基。在另一實(shí)施方式中，R2選自氫、甲基、乙基、甲氧基或乙氧基。在又一實(shí)施方式中，R3選自甲基或乙基。在又一實(shí)施方式中，R4選自羥基或羰基。在又一實(shí)施方式中，R5選自氫、甲基、乙基、未取代的苯基或2-甲硫基-1H-苯并咪唑基。在又一實(shí)施方式中，R6選自氫、甲基、乙基、未取代的苯基或2-甲硫基-1H-苯并咪唑基。在又一實(shí)施方式中，R5和R6是稠合的環(huán)戊基(cyclopenyl group)。在代表性實(shí)施方式中，該化合物選自
本發(fā)明也提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有式(IV)化合物；或其藥學(xué)上可接受的衍生物，如各立體異構(gòu)體或其混合物；或其藥學(xué)上可接受的鹽
式中，R1是烷基，R2是取代或未取代的苯基；或者取代或未取代的苯基。在一個(gè)實(shí)施方式中，該組合物還含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、藥學(xué)上可接受的稀釋劑、藥學(xué)上可接受的賦形劑和藥學(xué)上可接受的佐劑中的至少一種。在另一實(shí)施方式中，該組合物不含可檢測的二甲亞砜。
在一個(gè)實(shí)施方式中，R1是甲基。在另一實(shí)施方式中，R2選自3-(硝基)苯基、2-甲氧基苯基、2-乙氧基苯基、1-苯基乙基-1-酮基或3-氯-6-甲氧基苯基。在代表性實(shí)施方式中，該化合物選自
本發(fā)明也提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有式(V)化合物；或其藥學(xué)上可接受的衍生物，如各立體異構(gòu)體或其混合物；或其藥學(xué)上可接受的鹽
式中，R1選自氫或烷基；R2選自氫或烷基；R3是烷基；R4選自氫、烷基、烷氧基或鹵素基團(tuán)；R5選自氫、烷基、烷氧基或鹵素基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該組合物還含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、藥學(xué)上可接受的稀釋劑、藥學(xué)上可接受的賦形劑和藥學(xué)上可接受的佐劑中的至少一種。在另一實(shí)施方式中，該組合物不含可檢測的二甲亞砜。
在一個(gè)實(shí)施方式中，R1選自氫或甲基。在另一實(shí)施方式中，R2選自氫或甲基。在又一實(shí)施方式中，R3選自氫或甲基。在又一實(shí)施方式中，R4選自氫、溴、氯或甲氧基。在又一實(shí)施方式中，R5選自氫、溴、氯或甲氧基。在代表性實(shí)施方式中，該化合物選自
本發(fā)明也提供了治療患有突變-CFTR相關(guān)性疾病的對象的方法，所述方法包括給予所述對象治療有效量的選自本發(fā)明化合物的化合物。在一些實(shí)施方式中，所述疾病是囊性纖維化。在一些實(shí)施方式中，治療后，所述對象肺中粘液的細(xì)菌滴度降低、咳嗽或打噴嚏減少、胰功能不全減輕或汗液中電解質(zhì)水平降低。在一些實(shí)施方式中，所述對象是非人動(dòng)物。在特別感興趣的實(shí)施方式中，所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方式中，所述突變-CFTR是ΔF508-CFTR。
本發(fā)明也提供了提高產(chǎn)生突變-CFTR蛋白的細(xì)胞的離子通透性的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞接觸有效量的本發(fā)明化合物，這種接觸能有效提高所述細(xì)胞CFTR-介導(dǎo)的離子通透性。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞含有編碼所述突變-CFTR蛋白的重組表達(dá)盒。在其它實(shí)施方式中，所述細(xì)胞含有編碼所述突變-CFTR蛋白的基因組。在其它實(shí)施方式中，所述突變-CFTR是ΔF508-CFTR。
本發(fā)明也提供了治療患有突變-CFTR相關(guān)性疾病的對象的方法，所述方法包括給予所述對象治療有效量的選自本發(fā)明化合物的化合物。在一些實(shí)施方式中，所述疾病是囊性纖維化。在一些實(shí)施方式中，治療后，所述對象肺中粘液的細(xì)菌滴度降低、咳嗽或打噴嚏減少、胰功能不全減輕或汗液中電解質(zhì)水平降低。在一些實(shí)施方式中，所述對象是非人動(dòng)物。在特別感興趣的實(shí)施方式中，所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方式中，所述突變-CFTR是ΔF508-CFTR。
本發(fā)明也提供了提高產(chǎn)生突變-CFTR蛋白的細(xì)胞的離子通透性的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞接觸有效量的本發(fā)明化合物而提高所述細(xì)胞的離子通透性，其中所述化合物選自本發(fā)明化合物。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞含有編碼所述突變-CFTR蛋白的重組表達(dá)盒。在其它實(shí)施方式中，所述細(xì)胞含有編碼所述突變-CFTR蛋白的基因組。在其它實(shí)施方式中，所述離子通透性能提高離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性，從而提高離子跨越所述細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的速率。在其它實(shí)施方式中，所述突變-CFTR是ΔF508-CFTR。
通過以下詳述能明顯看出本發(fā)明的這些和其它目的和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡要說明 參照以下附圖，能更充分地理解本發(fā)明，以下附圖僅為說明目的。


圖1顯示了對象篩選步驟的示意圖。用測試化合物(10μM)在37℃培育共表達(dá)ΔF508-CFTR和鹵化物-敏感性YFP的FRT細(xì)胞。18-24小時(shí)后，通過在平板閱讀器上測定弗司扣林(20μM)+染料木黃酮(50μM)存在下碘化物淬滅YFP熒光來檢測ΔF508-CFTR的功能。
圖2是顯示在對照條件(37℃)下或27℃，用4-PBA(4mM)或校正化合物(10μM，37℃)培育24小時(shí)的碘離子流入的代表性軌跡。
圖3的A部分顯示了代表性校正化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，B部分顯示了所示校正化合物(SE，n＝5)的劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)。
圖4總結(jié)了用所示校正化合物于37℃或27℃培育表達(dá)ΔF508-CFTR的FRT細(xì)胞的最大碘離子流入(標(biāo)準(zhǔn)化至37℃對照)(SE，n＝5)。與對照細(xì)胞相比，所有化合物都引起碘離子流入顯著增加(p＜0.01)。
圖5顯示了基底外側(cè)膜通透后和氯離子梯度存在下測定的Ussing小室中頂端膜的氯離子流。濃度弗司扣林(20μM)，染料木黃酮(50μM)，CFTRinh-172(10μM)。左下角是FRT裸細(xì)胞(null cell)的測定(其它部分是表達(dá)ΔF508-CFTR的FRT細(xì)胞)。
圖6A顯示了用所示校正化合物校正的時(shí)程。細(xì)胞于27℃培育不同時(shí)間，用所示校正化合物或4-PBA(4mM)于37℃培育不同時(shí)間。測定弗司扣林/染料木黃酮存在下的ΔF508-CFTR活性。圖B顯示了用所示校正化合物校正的持續(xù)性。用所示校正化合物(或27℃)培育細(xì)胞24小時(shí)。在清洗后不同時(shí)間(或者從27℃回復(fù)到37℃)測定ΔF508-CFTR活性。
圖7顯示了用或不用校正化合物于37℃或27℃培育細(xì)胞時(shí)弗司扣林(20μM)或弗司扣林+染料木黃酮(50μM)的影響。
圖8顯示了弗司扣林劑量反應(yīng)關(guān)系。用所示校正化合物于37℃或27℃培育后用弗司扣林(沒有染料木黃酮)刺激表達(dá)ΔF508-CFTR的FRT細(xì)胞。
圖9顯示了用DMSO載體(左)或化合物corr-2b(第2條和第3條曲線)于37℃培育24小時(shí)后測定的頂端膜氯離子流。最右邊的曲線顯示用加入的所示化合物(20μM弗司扣林、20μM corr-2b、50μM染料木黃酮)于27℃培養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)果。
圖10，圖A是顯示所示校正化合物(10μM)對ΔF508-CFTR-CtHA在BHK細(xì)胞中表達(dá)模式的影響的western印跡。在不存在或存在校正化合物時(shí)于37℃培養(yǎng)所示細(xì)胞24小時(shí)、或于27℃培養(yǎng)24小時(shí)。用抗-HA第一抗體和HRP-偶聯(lián)的第二抗體觀察CFTR有增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光。實(shí)心箭頭表示復(fù)合物-糖基化形式(條帶C)，空心箭頭表示核心-糖基化形式(條帶B)。圖B顯示了圖A中數(shù)據(jù)的定量結(jié)果。
圖11，圖A顯示了在圖10A所示條件下在FRT細(xì)胞平行實(shí)驗(yàn)中用放射性抗HA抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定的ΔF508-CFTR的細(xì)胞表面密度對ΔF508-CFTR頂端膜流作圖得到的圖表。圖B是顯示用脈沖追蹤分析測定的折疊效率的western印跡。從15分鐘脈沖(P)期間摻入的放射性計(jì)算出翻譯速率。為了測定折疊效率，放射脈沖細(xì)胞150分鐘，然后追蹤120分鐘(C)。用磷光圖像分析測定核心-(空心箭頭)和復(fù)合物-糖基化(實(shí)心箭頭)的量。圖C顯示了成熟效率，表示為成熟的復(fù)合物-糖基化ΔF508-CFTR相對于圖B所示脈沖標(biāo)記庫的百分?jǐn)?shù)。
圖12，圖A顯示了在所示校正化合物存在下追蹤前和追蹤后3小時(shí)由抗-HA抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定的拯救的ΔF508-CFTR的細(xì)胞表面穩(wěn)定性。圖B顯示了表達(dá)溫度敏感型突變P574H-CFTR的FRT細(xì)胞中頂端膜氯離子流的結(jié)果。圖C顯示了圖B的頂端膜氯離子流研究的結(jié)果。
圖13顯示了對ΔF508純合對象(上面3條曲線)和非CF對象(最下面的曲線)的人呼吸道上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)物記錄到的代表性短路離子流。ΔF508細(xì)胞在DMSO載體或化合物corr-4b存在下于37℃維持培養(yǎng)24小時(shí)，或者27℃培育。濃度阿米洛利(10μM)、弗司扣林(20μM)、染料木黃酮(50μM)、CFTRinh-172(10μM)。
圖14，圖A是如圖13所示一系列實(shí)驗(yàn)的CFTRinh-172可抑制短路離子流(ΔIsc)的小結(jié)(SE，n＝12-14)。*，P＜0.05，**，P＜0.01。圖B顯示了在圖13所示條件下培養(yǎng)的純合N1303K-CFTR對象的人支氣管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)物記錄的短路離子流。
在描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解，本發(fā)明不受所述具體實(shí)施方式
的限制，因?yàn)檫@些實(shí)施方式可能改變。也應(yīng)理解，本文所用術(shù)語的目的僅為描述具體實(shí)施方式
，不意味著限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求書限制。
應(yīng)理解，除非另有明確說明，本文提供數(shù)值范圍時(shí)，也特別公開了該范圍上下限之間以下限單位的十分之一為間隔的各居間數(shù)值。本發(fā)明包括任何所示數(shù)值之間的較小范圍或所述范圍之間的數(shù)值和所述范圍的任何其它或居間數(shù)值。所述范圍可獨(dú)立地包括或排除這些較小范圍的上下限，可以特別排除這些范圍的端值，以使本發(fā)明也包括所述較小范圍任一端值、包括兩端端值、不包括兩端端值的各個(gè)范圍。所述范圍包括一個(gè)或兩個(gè)端值時(shí)，本發(fā)明也包括排除一個(gè)或兩個(gè)端值的范圍。
除非另有說明，本文所用的所有科技術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的相同含義。雖然類似于或等效于本文所述方法和材料的任何方法和材料均可用于實(shí)施或測試本發(fā)明，但下面描述了優(yōu)選的方法和材料。將本文所述的所有發(fā)表物納入本文作參考，與所引用發(fā)表物結(jié)合起來公開和描述本發(fā)明的方法和/或材料。應(yīng)理解，本文公開的內(nèi)容代替了與所引用發(fā)表物有矛盾的任何公開內(nèi)容。
必須注意，除非本文另有明確說明，本文和所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“這種”包括復(fù)數(shù)含義。因此，例如，提到“一種化合物”包括多種所述化合物，提到“這種細(xì)胞”則包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等效形式等。
提供本文所述的發(fā)表物僅僅是因?yàn)樗鼈冊诒旧暾埖奶峤蝗掌谥耙压_。在本發(fā)明說明書中沒有任何內(nèi)容應(yīng)被認(rèn)為是承認(rèn)本發(fā)明在所述發(fā)表物之后作出。而且，這些發(fā)表物所提供的
公開日期可能不同于實(shí)際
公開日期，實(shí)際
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發(fā)明詳述 本發(fā)明提供了至少可用于治療具有突變囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)(CFTR)蛋白的對象的組合物、藥物制劑和方法，尤其是所述CFTR中的突變與CFTR的細(xì)胞錯(cuò)誤加工(如折疊、運(yùn)輸或翻譯后修飾)有關(guān)時(shí)。這種突變CFTR的一個(gè)例子是ΔF508CFTR。如果不受限于理論，本發(fā)明的化合物和方法能“校正”所述突變CFTR蛋白的細(xì)胞錯(cuò)誤加工，可用于治療囊性纖維化(CF)。
通常，本發(fā)明的組合物和藥物制劑含有一種或多種含氮的雜芳族化合物，尤其感興趣的是含氨基苯并噻唑的化合物、含氨基芳基噻唑的化合物、含喹唑啉基氨基嘧啶酮的化合物、含雙氨基甲基聯(lián)噻唑的化合物和含苯基氨基喹啉的化合物，包括類似物或其衍生物。
定義 “突變囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白”或“突變-CFTR”是相對于野生型由CFTR基因產(chǎn)物的突變?nèi)缛笔蛔儭⒉迦胪蛔兓螯c(diǎn)(取代)突變產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。本文所用“突變囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白”或“突變-CFTR”是與功能性(如野生型)CFTR相比其功能發(fā)生障礙的蛋白，所述功能障礙包括以下一種或多種情況(i)CFTR產(chǎn)生(如轉(zhuǎn)錄或翻譯水平)異常；(ii)折疊和/或運(yùn)輸異常；(iii)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)異常；(iv)氯傳導(dǎo)率降低；(v)合成減少；等?！巴蛔?CFTR基因”是編碼突變-CFTR的基因或編碼序列。出于本申請目的，術(shù)語“基因組”和“基因”可互換使用，如“編碼突變-CFTR的基因組”和“編碼突變-CFTR的基因”可互換使用。
“門控缺陷型突變囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白”或“門控缺陷型突變-CFTR”是存在于細(xì)胞表面對離子通過該通道的門控(如調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn))有缺陷的突變-CFTR。因此，本文所用術(shù)語“門控缺陷型突變-CFTR”包括與(i)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)異常和/或(ii)氯傳導(dǎo)率降低有關(guān)的功能障礙。
“突變-CFTR蛋白-介導(dǎo)的疾病”指由存在突變-CFTR如ΔF508-CFTR產(chǎn)生的或與其相關(guān)的任何病癥、失調(diào)或疾病，或者這種病癥、失調(diào)或疾病的癥狀，如ΔF508-CFTR的離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性低于野生型CFTR而致的氯離子不通透。“突變-CFTR蛋白-介導(dǎo)的疾病”包括與至少一個(gè)等位基因上存在ΔF508-CFTR突變有關(guān)的患者疾病，因此包括兩個(gè)等位基因上都攜帶ΔF508-CFTR突變的對象以及具有兩種不同突變形式的CFTR的復(fù)合雜合對象，如具有一個(gè)拷貝的ΔF508-CFTR和一個(gè)拷貝的不同突變形式的CFTR的對象。
可通過特異性激活突變-CFTR的活性，如激活突變-CFTR的離子轉(zhuǎn)運(yùn)來治療這種疾病、失調(diào)、疾病或其癥狀。ΔF508-CFTR與囊性纖維化(CF)的存在有關(guān)，國家衛(wèi)生研究院網(wǎng)站ncbi.nlm.nih.gov上的人類孟德爾遺傳在線數(shù)據(jù)庫的登錄號602421(名為囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)物；CFTR)和登錄號219700(名為囊性纖維化；CF)描述了這種疾病，包括其癥狀。突變-CFTR蛋白-介導(dǎo)的疾病和癥狀包括胎糞性腸梗阻、肝病包括膽道阻塞和狹窄、胰功能不全、肺病包括慢性銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)感染和其它肺部感染、與輸精管發(fā)育異常或?qū)m頸粘液異常有關(guān)的不育以及癌癥包括腺癌。患有突變-CFTR蛋白-介導(dǎo)的疾病的許多對象是編碼ΔF508-CFTR蛋白的基因純合子。
“ΔF508-囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白”或“ΔF508-CFTR”是缺失了CFTR基因產(chǎn)物中的508位苯丙氨酸殘基的蛋白質(zhì)?！唉508-CFTR基因”是編碼ΔF508-CFTR的基因或編碼序列。ΔF508-CFTR基因通常由于缺失了對應(yīng)于編碼CFTR基因產(chǎn)物的508位苯丙氨酸殘基的三個(gè)核苷酸而產(chǎn)生。出于本申請目的，術(shù)語“基因組”和“基因”，如“編碼ΔF508-CFTR的基因組”和“編碼ΔF508-CFTR的基因”可互換使用。編碼ΔF508-CFTR的基因的一個(gè)例子參見例如WO 91/02796。
本文所用的“突變-CFTR激活物”是相對于不存在該化合物時(shí)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)，提高突變-CFTR的離子轉(zhuǎn)運(yùn)，尤其是氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)水平的化合物。特別感興趣的本發(fā)明CFTR激活物是特異性突變-CFTR激活物，如激活突變-CFTR活性而不影響CFTR細(xì)胞錯(cuò)誤加工的化合物。突變-CFTR激活物通常是突變-CFTR的高親和力激活物，如對突變-CFTR的親和力為至少約1微摩爾、約1-5微摩爾、約200納摩爾-1微摩爾、約50納摩爾-200納摩爾、或低于50納摩爾。
本文所用的“門控缺陷型突變-CFTR激活物”是相對于不存在該化合物時(shí)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)，提高門控缺陷型突變-CFTR的離子轉(zhuǎn)運(yùn)，尤其是氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)水平的化合物。特別感興趣的本發(fā)明CFTR激活物是特異性門控缺陷型突變-CFTR激活物，如激活門控缺陷型突變-CFTR活性而不影響(例如)CFTR細(xì)胞錯(cuò)誤加工的化合物。門控缺陷型突變-CFTR激活物通常是門控缺陷型突變-CFTR的高親和力激活物，如對門控缺陷型突變-CFTR(如ΔF508-CFTR、G551D-CFTR、G1349D-CFTR或D1152H-CFTR)的親和力為至少約1微摩爾、約1-5微摩爾、約200納摩爾-1微摩爾、約50納摩爾-200納摩爾、或低于50納摩爾。
本文所用的“ΔF508-CFTR激活物”是相對于不存在該化合物時(shí)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)，提高ΔF508-CFTR的離子轉(zhuǎn)運(yùn)，尤其是氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)水平的化合物。特別感興趣的本發(fā)明CFTR激活物是特異性ΔF508-CFTR激活物，如激活ΔF508-CFTR活性而不影響CFTR細(xì)胞錯(cuò)誤加工的化合物。ΔF508-CFTR激活物通常是ΔF508-CFTR的高親和激活物，如對ΔF508-CFTR的親和力為至少約1微摩爾、約1-5微摩爾、約200納摩爾-1微摩爾、約50納摩爾-200納摩爾、或低于50納摩爾。
如本文所用和在囊性纖維化領(lǐng)域內(nèi)，“突變CFTR的增效物”指能提高突變-CFTR(如ΔF508CFTR、G551D-CFTR、G1349D-CFTR或D1152H-CFTR)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)基礎(chǔ)水平的化合物，與野生型CFTR相比，突變CFTR(在不存在該化合物時(shí))的離子轉(zhuǎn)運(yùn)水平異常低。同樣，“突變-CFTR的增效物”指相對于不存在該化合物時(shí)突變-CFTR的離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力，能提高突變-CFTR的離子轉(zhuǎn)運(yùn)水平的化合物。
如本文所用和在囊性纖維化領(lǐng)域內(nèi)，“突變-CFTR的校正物”是通過校正CFTR多肽的根本缺陷，如翻譯后加工(如折疊、運(yùn)輸或翻譯后修飾，如翻譯后糖基化)所產(chǎn)生的缺陷，與不存在該化合物時(shí)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)水平相比能提高突變-CFTR的離子轉(zhuǎn)運(yùn)水平的化合物。特別感興趣的本發(fā)明CFTR校正物是能促進(jìn)特定突變-CFTR校正的化合物。突變-CFTR校正物通常對一種或多種突變-CFTR有高親和力，如對突變-CFTR的親和力為至少約1微摩爾、約1-5微摩爾、約200納摩爾-1微摩爾、約50納摩爾-200納摩爾、或低于50納摩爾。
本文所用的“聯(lián)用”指在給予第一種化合物的整個(gè)給藥期間給予第二種合物；其中所述第一種化合物的給藥期間與所述第二種化合物的給藥期間重疊，如在給予第二種化合物之前開始給予第一種化合物并且在第二種化合物給藥結(jié)束前中止第一種化合物的給藥；在給予第一種化合物之前開始給予第二種化合物并且在第一種化合物給藥結(jié)束前中止第二種化合物的給藥；在開始給予第二種化合物之前給予第一種化合物并且在第一種化合物的給藥結(jié)束前中止第二種化合物的給藥；在開始給予第一種化合物之前開始給予第二種化合物并且在第二種化合物的給藥結(jié)束前中止第一種化合物的給藥。同樣，“聯(lián)用”也指包括給予兩種或多種化合物的方案。本文所用“聯(lián)用”也指可在同一或不同制劑中、用相同或不同途徑和以相同或不同的劑型給藥的兩種或多種化合物。
術(shù)語“分離的化合物”指與天然共存的其它化合物基本分離或相對富集的化合物。以重量計(jì)，分離的化合物的純度通常為至少約80％，更通常為至少90％，更優(yōu)選為至少98％，最優(yōu)選為至少約99％。本發(fā)明應(yīng)包括非對映異構(gòu)體及外消旋和拆分的對映異構(gòu)純形式，以及它們的藥學(xué)上可接受的鹽。
疾病或疾病的“治療”包括(1)預(yù)防該疾病的至少一種癥狀，即使可能接觸或易于發(fā)生該疾病但尚未經(jīng)歷或出現(xiàn)該疾病的癥狀的哺乳動(dòng)物不產(chǎn)生明顯臨床癥狀，(2)抑制該疾病，即阻滯或降低該疾病或其癥狀的發(fā)展，或(3)緩解該疾病，即使該疾病或其臨床癥狀消退。
“治療有效量”或“有效量”指給予哺乳動(dòng)物或其它對象治療疾病時(shí)，足以實(shí)現(xiàn)所述疾病治療的化合物用量?！爸委熡行Я俊比Q于所用化合物、所治疾病和其嚴(yán)重程度以及治療對象的年齡、體重等。
術(shù)語“對象”和“患者”指可能需要本文所述的藥學(xué)方法、組合物和治療的任何哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物物種的一個(gè)或多個(gè)成員。因此，對象和患者包括但不限于靈長動(dòng)物(包括人)、犬、貓、有蹄類動(dòng)物(如馬、牛、豬)、禽類和其它對象。特別感興趣的是有商業(yè)價(jià)值的人類和非人動(dòng)物(如家畜和圈養(yǎng)動(dòng)物)。
“哺乳動(dòng)物”指任何哺乳動(dòng)物物種的一個(gè)或多個(gè)成員，包括例如犬、貓、馬、牛、羊；嚙齒動(dòng)物等和靈長動(dòng)物，特別是人。非人動(dòng)物模型，特別是哺乳動(dòng)物如靈長動(dòng)物、鼠類、兔類等可用于實(shí)驗(yàn)研究。
本文所用術(shù)語“單位劑型”指適合用作人和動(dòng)物對象的單位劑量的物理上分離的單元，各單元含有經(jīng)計(jì)算的預(yù)定量的本發(fā)明化合物與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、運(yùn)載體或載體聯(lián)用時(shí)該含量足以產(chǎn)生所需效果。本發(fā)明新單位劑型的規(guī)格取決于所用的具體化合物和準(zhǔn)備實(shí)現(xiàn)的效果，以及各化合物在宿主中的相關(guān)藥效。
術(shù)語“生理?xiàng)l件”應(yīng)包括與活細(xì)胞相容的條件，如與活細(xì)胞相容的溫度、pH、鹽度等的基本水環(huán)境條件。
“藥學(xué)上可接受的賦形劑”、“藥學(xué)上可接受的稀釋劑”、“藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體”和“藥學(xué)上可接受的佐劑”指可用于制備通常為安全、無毒并且沒有生物學(xué)或其它方面不良作用的藥物組合物的賦形劑、稀釋劑、運(yùn)載體和佐劑，包括獸醫(yī)應(yīng)用以及人類藥學(xué)應(yīng)用上可接受的賦形劑、稀釋劑、運(yùn)載體和佐劑。本說明書和權(quán)利要求書所用的“藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑、運(yùn)載體和佐劑”包括這些賦形劑、稀釋劑、運(yùn)載體和佐劑中的一種或多種。
本文所用“藥物組合物”應(yīng)包括適合給予對象，如哺乳動(dòng)物尤其是人的組合物。通常，“藥物組合物”應(yīng)無菌，優(yōu)選不含能夠在對象中引發(fā)不良反應(yīng)的污染物(如藥物組合物中的化合物應(yīng)是藥物級)。經(jīng)設(shè)計(jì)，可通過多種不同給藥途徑將藥物組合物給予需要的對象或患者，包括口服、含服、直腸、胃腸道外、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)等。在一些實(shí)施方式中，該組合物適合用除DMSO以外的滲透增強(qiáng)劑通過透皮途徑給藥。在其它實(shí)施方式中，該藥物組合物適合通過除透皮給藥以外的途徑給藥。
如本文所用，本發(fā)明化合物的“藥學(xué)上可接受的衍生物”包括其鹽、酯、烯醇醚、縮醛、縮酮、原酸酯、半縮醛、半縮酮、酸、堿、溶劑合物、水合物或前藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員運(yùn)用已知的衍生化方法不難制備這些衍生物?？蓪⑺a(chǎn)生的化合物給予動(dòng)物或人，而沒有顯著的毒副作用，所產(chǎn)生的化合物具有藥物活性或是前藥。
化合物的“藥學(xué)上可接受的鹽”指在藥學(xué)上可接受并具有母體化合物的所需藥理活性的鹽。這種鹽包括(1)與無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有機(jī)酸如乙酸、丙酸、己酸、環(huán)戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、馬來酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、葡糖庚糖酸、4，4′-亞甲基雙(3-羥基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羥基萘酸、水楊酸、硬脂酸、粘康酸等形成的酸加成鹽；或(2)母體化合物中存在的酸性質(zhì)子被金屬離子取代或與有機(jī)堿配位所形成的鹽，所述金屬離子如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子；所述有機(jī)堿如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等。
本發(fā)明化合物的“藥學(xué)上可接受的酯”指藥學(xué)上可接受并具有母體化合物的所需藥理活性的酯，包括但不限于酸性基團(tuán)的烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、環(huán)烷基和雜環(huán)基酯，所述酸性基團(tuán)包括但不限于羧酸、磷酸、次膦酸、磺酸、亞磺酸和硼酸。
本發(fā)明化合物的“藥學(xué)上可接受的烯醇醚”指藥學(xué)上可接受并具有母體化合物的所需藥理活性的烯醇醚，包括但不限于式C＝C(OR)的衍生物，式中R是氫、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)基。
本發(fā)明化合物的“藥學(xué)上可接受的烯醇酯”指藥學(xué)上可接受并具有母體化合物的所需藥理活性的烯醇酯，包括但不限于式C＝C(OC(O)R)的衍生物，式中R是氫、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)基。
本發(fā)明化合物的“藥學(xué)上可接受的溶劑合物或水合物”指藥學(xué)上可接受并具有母體化合物的所需藥理活性的溶劑合物或水合物復(fù)合物，包括但不限于本發(fā)明化合物與一種或多種溶劑或水分子，或1-約100，或1-約10，或者1-約2、3或4種溶劑或水分子的復(fù)合物。
“前藥”指將其給予哺乳動(dòng)物對象時(shí)能在體內(nèi)釋放式(I)活性母體藥物的任何化合物。通過修飾式(I)化合物中存在的官能團(tuán)制備式(I)化合物的前藥，可在體內(nèi)切割該修飾物以釋放母體化合物。前藥包括式(I)化合物，其中化合物(I)中的羥基、氨基或巰基鍵合于可在體內(nèi)被切割而分別再產(chǎn)生游離的羥基、氨基或巰基的任何基團(tuán)。前藥的例子包括但不限于式(I)化合物中羥基官能團(tuán)的酯(如乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物)、氨基甲酸酯(如N，N-二甲基氨基羰基)等。
本文所用術(shù)語“有機(jī)基團(tuán)”指任何含碳的基團(tuán)，包括烴基，分類為脂基、環(huán)基、芳基、其官能化衍生物和/或它們的各種組合。術(shù)語“脂基”指飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基，包括例如烷基、烯基和炔基。術(shù)語“烷基”指取代或未取代的飽和直鏈或支鏈烴基或鏈(如C1-C8)，包括例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、庚基、異丙基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基等。合適的取代基包括羧基、保護(hù)的羧基、氨基、保護(hù)的氨基、鹵素、羥基、保護(hù)的羥基、硝基、氰基、單取代氨基、保護(hù)的單取代氨基、雙取代氨基、C1-C7烷氧基、C1-C7?；1-C7酰氧基等。術(shù)語“取代的烷基”指用羥基、保護(hù)的羥基、氨基、保護(hù)的氨基、氰基、鹵素、三氟甲基、單取代氨基、雙取代氨基、低級烷氧基、低級烷硫基、羧基、保護(hù)的羧基、或羧基、氨基和/或羥基鹽取代一至三次的上述烷基。與雜芳環(huán)的取代基聯(lián)用時(shí)，術(shù)語“取代的(環(huán)烷基)烷基”和“取代的環(huán)烷基”是用與“取代的烷基”中所列基團(tuán)相同的基團(tuán)取代的。術(shù)語“烯基”指含有一個(gè)或多個(gè)碳-碳雙鍵的不飽和直鏈或支鏈烴基如乙烯基。術(shù)語“炔基”指含有一個(gè)或多個(gè)碳-碳三鍵的不飽和直鏈或支鏈烴基。術(shù)語“環(huán)基”指閉合的環(huán)烴基，分類為脂環(huán)基、芳基或雜環(huán)基。術(shù)語“脂環(huán)基”指具有類似于脂基的特性的環(huán)烴基。術(shù)語“芳基”指單環(huán)或多環(huán)芳族烴基，可包括一個(gè)或多個(gè)雜原子，其定義如下。術(shù)語“雜環(huán)基”指環(huán)中一個(gè)或多個(gè)原子為非碳元素(如氮、氧、硫等)的閉合環(huán)烴，進(jìn)一步定義見下。
“有機(jī)基團(tuán)”可以被官能化，或者連接有其它官能團(tuán)，如保護(hù)或無保護(hù)的羧基、氨基、羥基等。例如，術(shù)語“烷基”不僅包括純開鏈飽和烴烷基取代基，如甲基、乙基、丙基、叔丁基等，而且包括還攜帶本領(lǐng)域已知的其它取代基如羥基、烷氧基、烷基磺?；?、鹵原子、氰基、硝基、氨基、羧基等的烷基取代基。因此，“烷基”包括醚、酯、鹵代烷基、硝基烷基、羧基烷基、羥基烷基、硫代烷基等。
術(shù)語“鹵”和“鹵素”指氟、氯、溴和碘基團(tuán)?？梢杂邢嗤虿煌囊粋€(gè)或多個(gè)鹵素。特別感興趣的鹵素包括氯和溴基團(tuán)。
術(shù)語“鹵代烷基”指用一個(gè)或多個(gè)鹵原子取代的上述烷基。鹵原子可以相同或不同。術(shù)語“二鹵代烷基”指用相同或不同的兩個(gè)鹵基團(tuán)取代的上述烷基。術(shù)語“三鹵代烷基”指用相同或不同的三個(gè)鹵基團(tuán)取代的上述烷基。術(shù)語“全鹵代烷基”指烷基中每個(gè)氫原子都被鹵原子取代的上述鹵代烷基。術(shù)語“全氟烷基”指烷基中每個(gè)氫原子都被氟原子取代的上述鹵代烷基。
術(shù)語“環(huán)烷基”指完全飽和或部分飽和的飽和的單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)。這種基團(tuán)的例子包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、金剛烷基、環(huán)辛基、順式-或反式萘烷、雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯、環(huán)己-1-烯基、環(huán)戊-1-烯基、1，4-環(huán)辛二烯基等。
術(shù)語“(環(huán)烷基)烷基”指用上述環(huán)烷基環(huán)之一取代的上述烷基。這種基團(tuán)的例子包括(環(huán)己基)甲基、3-(環(huán)丙基)-正丙基、5-(環(huán)戊基)己基、6-(金剛烷基)己基等。
術(shù)語“取代的苯基”指用一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)(在一些情況下是一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)基團(tuán))取代的苯基，所述基團(tuán)選自鹵素、羥基、保護(hù)的羥基、氰基、硝基、三氟甲基、C1-C7烷基、C1-C7烷氧基、C1-C7酰基、C1-C7酰氧基、羧基、氧代羧基、保護(hù)的羧基、羧甲基、保護(hù)的羧甲基、羥甲基、保護(hù)的羥甲基、氨基、保護(hù)的氨基、(單取代)氨基、保護(hù)的(單取代)氨基、(雙取代)氨基、羧酰胺基、保護(hù)的羧酰胺基、N-(C1-C6烷基)羧酰胺基、保護(hù)的N-(C1-C6烷基)羧酰胺基、N，N-二(C1-C6烷基)羧酰胺基、三氟甲基、N-((C1-C6烷基)磺?；?氨基、N-(苯基磺?；?氨基或取代或未取代的苯基，以致于產(chǎn)生(例如)聯(lián)苯基或萘基。
術(shù)語“取代的苯基”的例子包括單-或二(鹵代)苯基如2、3或4-氯苯基，2，6-二氯苯基，2，5-二氯苯基，3，4-二氯苯基，2、3或4-溴苯基，3，4-二溴苯基，3-氯-4-氟苯基，2、3或4-氟苯基等；單或二(羥基)苯基如2、3或4-羥基苯基，2，4-二羥基苯基，其保護(hù)的羥基衍生物等；硝基苯基如2、3或4-硝基苯基；氰基苯基，如2、3或4-氰基苯基；單-或二(烷基)苯基如2、3或4-甲基苯基，2，4-二甲基苯基，2、3或4-(異丙基)苯基，2、3或4-乙基苯基，2、3或4-(正丙基)苯基等；單或二(烷氧基)苯基，如2，6-二甲氧基苯基，2、3或4-(異丙氧基)苯基，2、3或4-(叔丁氧基)苯基，3-乙氧基-4-甲氧基苯基等；2、3或4-三氟甲基苯基；單-或二羧基苯基或(保護(hù)的羧基)苯基如2、3或4-羧基苯基或2，4-二(保護(hù)的羧基)苯基；單-或二(羥甲基)苯基或(保護(hù)的羥甲基)苯基如2、3或4-(保護(hù)的羥甲基)苯基或3，4-二(羥甲基)苯基；單-或二(氨基甲基)苯基或(保護(hù)的氨基甲基)苯基如2、3或4-(氨基甲基)苯基或2，4-(保護(hù)的氨基甲基)苯基；或者單-或二(N-(甲磺?；被?)苯基如2、3或4-(N-(甲磺酰基氨基))苯基。此外，術(shù)語“取代的苯基”也代表取代基不同的二取代的苯基，如3-甲基-4-羥基苯基、3-氯-4-羥基苯基、2-甲氧基-4-溴苯基、4-乙基-2-羥基苯基、3-羥基-4-硝基苯基、2-羥基-4-氯苯基等。
術(shù)語“(取代的苯基)烷基”指上述取代的苯基中與上述烷基中的一種相連接的基團(tuán)。這種基團(tuán)的例子包括例如2-苯基-1-氯乙基、2-(4′-甲氧基苯基)乙基、4-(2′，6′-二羥基苯基)-正己基、2-(5′-氰基-3′-甲氧基苯基)-正戊基、3-(2′，6′-二甲基苯基)正丙基、4-氯-3-氨基芐基，6-(4′-甲氧基苯基)-3-羧基(正己基)，5-(4′-氨基甲基苯基)-3-(氨基甲基)-正戊基、5-苯基-3-氧代-正戊-1-基，(4-羥基萘-2-基)甲基等。
如上所述，術(shù)語“芳族”或“芳基”指六元碳環(huán)。如上所述，術(shù)語“雜芳基”指含有1-4個(gè)雜原子如氧、硫和/或氮原子(尤其是單獨(dú)的氮或與硫或氧環(huán)原子一起)的任選取代的五元或六元環(huán)。
而且，上述任選取代的五元或六元環(huán)可任選地與芳族5元或6元環(huán)系統(tǒng)稠合。例如，這些環(huán)可任選地與芳族5元或6元環(huán)系統(tǒng)如吡啶或三唑系統(tǒng)稠合，優(yōu)選與苯環(huán)稠合。
以下環(huán)系統(tǒng)是術(shù)語“雜芳基”表示的(取代或未取代的)雜環(huán)基團(tuán)的例子噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡咯烷基、咪唑基、異噁唑基、三唑基、噻二唑基、噁二唑基、四唑基、噻三唑基、噁三唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、噁嗪基、三嗪基、噻二嗪基四唑、1，5-[b]噠嗪基和嘌呤基，以及苯并-稠合衍生物，如苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基和吲哚基。
上述任選取代的雜芳環(huán)的取代基是1-3個(gè)鹵素、三鹵代甲基、氨基、保護(hù)的氨基、氨基鹽、單取代氨基、雙取代氨基、羧基、保護(hù)的羧基、羧酸鹽、羥基、保護(hù)的羥基、羥基鹽、低級烷氧基、低級烷硫基、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、(環(huán)烷基)烷基、取代的(環(huán)烷基)烷基、苯基、取代的苯基、苯基烷基和(取代的苯基)烷基。下面定義了雜芳基的取代基，或者在三鹵代甲基的情況下，該取代基可以是三氟甲基、三氯甲基、三溴甲基或三碘甲基。與上述雜芳環(huán)的取代基聯(lián)用時(shí)，“低級烷氧基”指C1-C4烷氧基，相似地，“低級烷硫基”指C1-C4烷硫基。
術(shù)語“(單取代)氨基”指含有一個(gè)取代基的氨基，所述取代基選自苯基、取代的苯基、烷基、取代烷基、C1-C4?；?、C2-C7烯基、取代的C2-C7烯基、C2-C7炔基、C7-C16烷芳基、取代的C7-C16烷芳基或雜芳基。(單取代)氨基還可具有氨基保護(hù)基，如術(shù)語“保護(hù)的(單取代)氨基”所述。術(shù)語“(雙取代)氨基”指含有兩個(gè)取代基的氨基，所述取代基選自苯基、取代的苯基、烷基、取代烷基、C1-C7?；?、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C7-C16烷基芳基、取代的C7-C16烷基芳基或雜芳基。這兩個(gè)取代基可以相同或不同。
術(shù)語“雜芳基(烷基)”指用上述雜芳基在任意位置上取代的上述烷基。
“任選的”或“任選地”指緊接其后描述的事件、情況、特征或要素可能但不一定發(fā)生，此詞語包括上述的事件或情況可發(fā)生和不發(fā)生。例如，“任選地用烷基單取代或雙取代的雜環(huán)基”指可能但不一定存在此烷基，此短語包括用烷基單取代或雙取代雜環(huán)基和不用烷基取代雜環(huán)基。
分子式相同但特性或原子鍵合順序或原子的空間排列不同的化合物稱為“異構(gòu)體”。原子空間排列不同的異構(gòu)體稱為“立體異構(gòu)體”。不互為鏡像的立體異構(gòu)體稱為“非對映異構(gòu)體”，彼此的鏡像無法重疊的立體異構(gòu)體稱為“對映異構(gòu)體”。當(dāng)化合物有不對稱中心時(shí)，例如，連接有四種不同基團(tuán)時(shí)，可能出現(xiàn)一對對映異構(gòu)體。對映異構(gòu)體的特征為其不對稱中心的絕對構(gòu)型，可用Cahn和Prelog的R-和S-順序法則表述，或用分子旋轉(zhuǎn)偏振光平面稱為右旋或左旋(即(+)或(-)-異構(gòu)體)的方式表述。手性化合物可以一種對映異構(gòu)體或兩種的混合物存在。含有等比例的兩種對映異構(gòu)體的混合物稱為“外消旋混合物”。
本發(fā)明化合物可具有一個(gè)或多個(gè)不對稱中心；因此，產(chǎn)生的所述化合物可以是(R)-或(S)-立體異構(gòu)體中的一種或其混合物。除非另有說明，本說明書和權(quán)利要求書中的具體化合物的描述或命名包括各自的對映異構(gòu)體和外消旋體或其它形式和它們的混合物。測定立體化學(xué)和分離立體異構(gòu)體的方法是本領(lǐng)域熟知的(參見例如，“Advanced Organic Chemistry”(高級有機(jī)化學(xué))，第4版，J.March，John Wiley&Sons，紐約，1992中第4章的討論)。
概述 本發(fā)明依據(jù)發(fā)現(xiàn)了能提高突變的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(突變-CFTR)如ΔF508-CFTR的離子轉(zhuǎn)運(yùn)的化合物。發(fā)現(xiàn)這種化合物可用于治療突變-CFTR-介導(dǎo)的疾病和疾病，如囊性纖維化(CF)的方法。發(fā)現(xiàn)這種化合物也可用于研究CFTR離子轉(zhuǎn)運(yùn)，尤其是ΔF508-CFTR的離子轉(zhuǎn)運(yùn)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了能校正突變的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(如ΔF508CFTR)的細(xì)胞加工(如折疊、運(yùn)輸或翻譯后修飾)的高親和力小分子化合物。本發(fā)明考慮的化合物包括以下結(jié)構(gòu)類型(1)含氨基苯并噻唑的化合物；(2)含氨基芳基噻唑的化合物；(3)含喹唑啉基氨基嘧啶酮的化合物；(4)含雙氨基甲基聯(lián)噻唑的化合物；和(5)含苯基氨基喹啉的化合物。
根據(jù)設(shè)計(jì)用于鑒定能校正突變-CFTR的細(xì)胞加工(如折疊或運(yùn)輸)的化合物的實(shí)驗(yàn)篩選大量候選化合物，從而發(fā)現(xiàn)了該主題化合物。通過篩選150,000種化學(xué)上不同的化合物，鑒定到幾種化合物和類似物是突變-CFTR的有效增效物。主題化合物在化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上與目前已知能提高突變-CFTR活性的化合物無關(guān)。
下面開始更詳細(xì)地描述本發(fā)明的組合物和方法。
組合物 含2-氨基苯并噻唑的化合物 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的校正化合物是本文所述的含2-氨基苯并噻唑的化合物，其含有取代的氨基苯并噻唑基。在特定實(shí)施方式中，主題化合物通常是下式(I)的化合物或其各立體異構(gòu)體或其混合物的藥學(xué)上可接受的衍生物
式中，R1獨(dú)立地選自氫或與R2稠合的C(＝O或＝S)NH基團(tuán)，R2獨(dú)立地選自連接于取代或未取代的烷基、取代或未取代的環(huán)烷基或者取代或未取代的芳環(huán)和取代或未取代的雜芳環(huán)的N＝CH或N-烷基。下面更詳細(xì)地描述R1和R2的示范性取代。
在某些實(shí)施方式中，含2-氨基苯并噻唑的化合物通常是式(I)化合物，式中，R1是氫。這種化合物通常是式(Ia)化合物或其各立體異構(gòu)體或其混合物的藥學(xué)上可接受的衍生物
式中，R3獨(dú)立地選自取代或未取代的苯基，R4是烷基如取代或未取代的飽和直鏈或支鏈烴基或鏈(如C1-C8)，包括例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基。下面更詳細(xì)地描述R3和R4的示范性取代。
在一些實(shí)施方式中，R3獨(dú)立地選自未取代的苯基、未取代的聯(lián)苯基或取代的苯基，如單-或二-(烷基)苯基、單-或二-(烷氧基)苯基、單-或二-(羥基)苯基、單-或二-(鹵代)苯基、單-或二-(烯基)苯基、單-或二-(硝基)苯基、單(烷基)-單(烷氧基)苯基、二(烷氧基)-單(鹵代)苯基和單(硝基)-單(烷基)苯基；R4獨(dú)立地選自氫或低級烷基，如甲基和乙基。
在代表性實(shí)施方式中，R3獨(dú)立地選自單-(烷氧基)苯基如4-(甲氧基)苯基、單-(硝基)苯基如3-(硝基)苯基或4-(硝基)苯基、或單(鹵代)苯基如4-(氯)苯基，R4獨(dú)立地選自氫或低級烷基如甲基和乙基。
在某些實(shí)施方式中，含2-氨基苯并噻唑的化合物通常為式(I)化合物，式中，R1和R2是含有R5和R6基團(tuán)的稠合硫酮取代的三唑烷環(huán)。這種化合物通常是式(Ib)化合物或其各立體異構(gòu)體或其混合物的藥學(xué)上可接受的衍生物
式中，R5和R6獨(dú)立地選自取代或未取代的烷基如取代或未取代的飽和直鏈或支鏈烴基或鏈(如C1-C8)，包括例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基或者或未取代的環(huán)烷基環(huán)。下面更詳細(xì)地描述R5和R6的示范性取代。
在一些實(shí)施方式中，R5是低級烷基(如C1-C4)如甲基和乙基，R6是低級烷基(如C1-C4)如甲基和乙基。在其它實(shí)施方式中，R5和R6是取代或未取代的環(huán)烷基，如(烷基)環(huán)烷基、如叔(丁基)環(huán)己烷基。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，含2-氨基苯并噻唑的化合物可包括下式化合物
含2-氨基-4-芳基噻唑的化合物 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明校正化合物是本文所述的含2-氨基-4-芳基噻唑的化合物，其含有氨基取代的芳基噻唑基。在特定實(shí)施方式中，主題化合物通常是下式(II)的化合物；或其各立體異構(gòu)體或其混合物的藥學(xué)上可接受的衍生物
式中，R1獨(dú)立地選自取代或未取代的苯基；R2獨(dú)立地選自氫或烷基，如取代或未取代的飽和直鏈或支鏈烴基或鏈(如C1-C8)，包括例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R3獨(dú)立地選自取代或未取代的苯基、取代或未取代的雜芳基、取代的氨基、取代的酮基。下面更詳細(xì)地描述R1、R2和R3的示范性取代。
在某些實(shí)施方式中，R1獨(dú)立地選自未取代的苯基、未取代的聯(lián)苯基或取代的苯基，如單-或二-(烷基)苯基、單-或二-(烷氧基)苯基、單-或二-(羥基)苯基、單-或二-(鹵代)苯基、單-或二-(烯基)苯基、單-或二-(硝基)苯基、單(烷基)-單(烷氧基)苯基、二(烷氧基)-單(鹵代)苯基和單(硝基)-單(烷基)苯基；R2獨(dú)立地選自氫或低級烷基(如C1-C4)，如甲基和乙基；R3獨(dú)立地選自未取代的苯基，取代的苯基如單-或二-(鹵代)苯基、單-或二-(烷基)苯基、單-或二-(烷氧基)苯基、單(酰胺)苯基或者單-或二-(烷氧基)-單-或二-(鹵代)苯基，未取代的雜芳基如嘧啶，取代的雜芳基如單-或二-(烷基)嘧啶，取代的氨基如單(烯基)氨基或取代的?；珲；?噻吩基，?；?，未取代的苯基，取代的苯基如單-或二-(鹵代)苯基、單-或二-(烷基)苯基、單-或二-(烷氧基)苯基、單(酰胺)苯基或者單-或二-(烷氧基)-單-或二-(鹵代)苯基，或者酰基烷硫基-咪唑-(5-未取代的苯基，取代的苯基如單-或二-(鹵代)苯基、單-或二-(烷基)苯基、單-或二-(烷氧基)苯基、單(酰胺)苯基或者單-或二-(烷氧基)-單-或二-(鹵代)苯基或其藥學(xué)上可接受的衍生物，其各立體異構(gòu)體或其混合物。
在代表性實(shí)施方式中，R1獨(dú)立地選自未取代的苯基，未取代的聯(lián)苯基，二-(甲基)苯基如3，4-二(甲基)苯基，單-(甲基)苯基如4-(甲基)苯基，二-(甲氧基)苯基如3，4-二(甲氧基)苯基，二-(羥基)苯基如3，4-二(羥基)苯基，單-(溴)苯基如4-(溴)苯基，單-(丙烯)苯基如4-(丙烯)苯基，單(甲基)-單(甲氧基)苯基如3-(甲基)-4-(甲氧基)苯基或單(硝基)-單(甲基)苯基如3-(硝基)-4(甲基)苯基；R2獨(dú)立地選自氫或甲基。
在代表性實(shí)施方式中，R3獨(dú)立地選自未取代的苯基，單-(氯)苯基如3-(氯)苯基，單-(氟)苯基如4-(氟)苯基，單-(甲基)苯基如2-(甲基)苯基，單-(乙氧基)苯基如2-(乙氧基)苯基，二(甲氧基)-單(氯)苯基如2，5-二(甲氧基)-4-(氯)苯基，單-(乙酰胺)苯基如4-(乙酰胺)苯基，未取代的嘧啶基，單-(甲基)嘧啶基如3-(甲基)嘧啶基，二(甲基)亞丁基胺基，?；绶曰?，酰基(4-叔丁基-苯基)基團(tuán)或?；琢蚧?咪唑-5-苯基。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，含2-氨基-4-芳基噻唑的化合物可包括下式化合物
含2-喹唑啉基-4-氨基嘧啶酮的化合物 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明校正化合物是本文所述的含2-喹唑啉基-4-氨基嘧啶酮的化合物，其含有取代或未取代的喹唑啉基和取代或未取代的嘧啶基。在特定實(shí)施方式中，主題化合物通常是下式(III)的化合物；或其各立體異構(gòu)體或其混合物的藥學(xué)上可接受的衍生物
式中，R1和R2獨(dú)立地選自氫、烷基如取代或未取代的飽和直鏈或支鏈烴基或鏈(如C1-C8)，包括例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基，烷氧基如甲氧基、乙氧基、丙氧基；R3是烷基如取代或未取代的飽和直鏈或支鏈烴基或鏈(如C1-C8)，包括例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R4獨(dú)立地選自羥基或羰基；R5和R6獨(dú)立地選自稠合環(huán)烷基、氫、烷基如取代或未取代的飽和直鏈或支鏈烴基或鏈(如C1-C8)，包括例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基或者取代或未取代的苯基，或者取代或未取代的(雜環(huán)烷基)烷基。以下更詳細(xì)地描述R1、R2、R3、R4、R5和R6的示范性取代。
在某些實(shí)施方式中，R1獨(dú)立地選自氫、低級烷基(如C1-C4)如甲基或乙基、或者烷氧基如甲氧基或乙氧基；R2獨(dú)立地選自氫、低級烷基(如C1-C4)如甲基或乙基或者烷氧基如甲氧基或乙氧基；R3獨(dú)立地選自低級烷基(如C1-C4)如甲基或乙基；R4獨(dú)立地選自羥基或羰基；R5和R6獨(dú)立地選自稠合環(huán)烷基如環(huán)戊基(cyclopenyl group)、氫、低級烷基(如C1-C4)如甲基或乙基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的(雜環(huán)烷基)烷基如2-甲硫基-1H-苯并咪唑基。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述含2-喹唑啉基-4-氨基嘧啶酮的化合物可包括下式化合物
含雙氨基甲基聯(lián)噻唑的化合物 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明校正化合物是本文所述的含雙氨基甲基聯(lián)噻唑的化合物，其含有取代的聯(lián)噻唑基團(tuán)和未取代的雜芳基。在特定實(shí)施方式中，主題化合物通常是下式(IV)的化合物；或其各立體異構(gòu)體或其混合物的藥學(xué)上可接受的衍生物
式中，R1是烷基如取代或未取代的飽和直鏈或支鏈烴基或鏈(如C1-C8)，包括例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R2是取代或未取代的苯基。下面更詳細(xì)地描述R1和R2的示范性取代。
在某些實(shí)施方式中，R1是低級烷基(如C1-C4)如甲基；R2是含有烷氧基如甲氧基或乙氧基、鹵素如氯或溴、硝基或者取代或未取代的飽和直鏈或支鏈烴基或鏈(如C1-C8)酮基如乙酮基、丙酮基、丁酮基或戊酮基的單-或二-取代的苯基。在代表性實(shí)施方式中，R1是甲基，R2獨(dú)立地選自單-或二-取代的苯基如單(硝基)苯基；單(烷氧基)苯基如2-、3-、4-或5-甲氧基苯基或2-、3-、4-或5-乙氧基苯基，單(酮)苯基如1-苯基丙-1-酮或1-苯基乙基-1-酮；或者二-取代的苯基如2-、3-、4-或5-(鹵代)-2-、3-、4-或5-(烷氧基)苯基如3-氯-6-甲氧基苯基。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述含雙氨基甲基聯(lián)噻唑的化合物可包括下式化合物
含2-(N-苯基氨基)喹啉的化合物 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明校正化合物是本文所述含2-(N-苯基氨基)喹啉的化合物，其含有取代或未取代的苯基和取代的喹啉基。在特定實(shí)施方式中，主題化合物通常為下式(V)描述的化合物；或其各立體異構(gòu)體或其混合物的藥學(xué)上可接受的衍生物
式中，R1獨(dú)立地選自氫或烷基如取代或未取代的飽和直鏈或支鏈烴基或鏈(如C1-C8)，包括例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R2獨(dú)立地選自氫或烷基如取代或未取代的飽和直鏈或支鏈烴基或鏈(如C1-C8)，包括例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R3是烷基如取代或未取代的飽和直鏈或支鏈烴基或鏈(如C1-C8)，包括例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R4獨(dú)立地選自氫或烷基如取代或未取代的飽和直鏈或支鏈烴基或鏈(如C1-C8)，包括例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基或烷氧基如甲氧基或乙氧基，或鹵素如溴、氯、氟；R5獨(dú)立地選自氫或烷基如取代或未取代的飽和直鏈或支鏈烴基或鏈(如C1-C8)，包括例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基或烷氧基如甲氧基或乙氧基，或鹵素如溴、氯、氟。下面更詳細(xì)地描述R1、R2、R3、R4和R5的示范性取代。
在某些實(shí)施方式中，R1獨(dú)立地選自氫或低級烷基(如C1-C4)如甲基；R2獨(dú)立地是氫或低級烷基(如C1-C4)如甲基；R3獨(dú)立地是氫或低級烷基(如C1-C4)如甲基；R4獨(dú)立地選自氫、鹵素如溴或氯、或者烷氧基如甲氧基或乙氧基；R5獨(dú)立地選自氫、鹵素如溴或氯、或者烷氧基如甲氧基或乙氧基。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，含2-(N-苯基氨基)喹啉的化合物可包括下式化合物
類似物和衍生化合物 本發(fā)明也提供了上述主題化合物的類似物和衍生物。術(shù)語“類似物”和“衍生物”指與本發(fā)明主題化合物結(jié)構(gòu)上相似或具有與本發(fā)明主題化合物相同的功能或活性的分子?？珊Y選主題化合物的類似物和衍生物中能有效校正突變的CFTR如ΔF508-CFTR的折疊或細(xì)胞加工的化合物。
在一些實(shí)施方式中，可用計(jì)算機(jī)建模篩選類似物或衍生物的3維文庫中能夠結(jié)合和校正突變的CFTR如ΔF508-CFTR的折疊或細(xì)胞加工的化合物。適用于本方法的示范性計(jì)算機(jī)建模程序是PREDICTTM 3D建模技術(shù)(Predix Pharmaceuticals，WoburnMA)，更詳細(xì)的內(nèi)容參見Becker等，PNAS 101(31)11304-11309(2004)。
本發(fā)明化合物的劑型 在藥物劑型中，本發(fā)明主題化合物可以其藥學(xué)上可接受的鹽形式給藥，或者也可單獨(dú)使用或以適當(dāng)結(jié)合的形式使用，也可與其它藥物活性化合物聯(lián)用。以下方法和賦形劑僅為示范性，而非限制性。
可采用適用于遞送常規(guī)藥物的常規(guī)方法和途徑，包括全身或局部途徑將藥物給予宿主。通常，本發(fā)明考慮的給藥途徑包括但不限于腸、胃腸道外或吸入途徑，如肺內(nèi)或鼻內(nèi)遞送。
常規(guī)的藥學(xué)上可接受的給藥途徑包括鼻內(nèi)、肺內(nèi)、肌肉內(nèi)、氣管內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、局部應(yīng)用、靜脈內(nèi)、直腸、經(jīng)鼻、口服和其它胃腸道外給藥途徑。如果需要，可聯(lián)合各給藥途徑，或根據(jù)藥物和/或所需效果調(diào)整給藥途徑?？山o予單劑量或多劑量的所述組合物。
在特別感興趣的實(shí)施方式中，通過肺內(nèi)吸入以氣霧劑給予本發(fā)明化合物?？捎每山邮艿募訅和七M(jìn)劑如二氯二氟甲烷、丙烷、氮?dú)獾扰渲票景l(fā)明化合物。
設(shè)計(jì)用于治療產(chǎn)品肺內(nèi)遞送的機(jī)械裝置包括但不限于噴霧器、計(jì)量吸入器和粉末吸入器，所有這些裝置都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。適合實(shí)施本發(fā)明的市售裝置的具體離子是Mallinckrodt，Inc.，密蘇里州圣路易斯生產(chǎn)的Ultravent噴霧器；Marquest Medical Products，Englewood，Colo.生產(chǎn)的Acorn II噴霧器；Glaxo Inc.，Research Triangle Park，北卡羅來納州生產(chǎn)的Ventolin計(jì)量吸入器；Fisons Corp.，馬薩諸塞州貝德福德生產(chǎn)的Spinhaler粉末吸入器；Inhale Therapeutic Systems，Inc.，加利福尼亞州圣卡洛斯的“駐云”裝置；Alkennes，馬薩諸塞州劍橋生產(chǎn)的AIR吸入器；和Aradigm Corporation，加利福尼亞州海達(dá)德生產(chǎn)的AERx肺部藥物遞送系統(tǒng)。特別感興趣的是PARI Respiratory Equipment，Inc.，加利福尼亞蒙特里的


和PARI BABYTM噴霧器。
用于計(jì)量吸入器裝置的制劑通常為細(xì)粒粉末?？赏ㄟ^凍干液體混合制劑然后研磨來制備這種粉末，也可含有穩(wěn)定劑如人血清白蛋白(HSA)。一般加入0.5％(w/w)以上HSA。此外，如果需要可將一種或多種糖或糖醇加入該制劑中。例子包括乳糖、麥芽糖、甘露醇、山梨糖醇、山梨糖、海藻糖、木糖醇和木糖。加入該制劑中的用量范圍是該混合物的約0.01-200％(w/w)，優(yōu)選約1-50％。然后凍干該制劑，研磨至所需粒度。
然后，將粒度適當(dāng)?shù)念w粒懸浮于用表面活性劑加強(qiáng)的推進(jìn)劑中。推進(jìn)劑可以是用于此目的的任何常規(guī)材料，如氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴或烴，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或它們的組合。合適的表面活性劑可包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性劑。然后，可將此混合物加到遞送裝置中。適用于本發(fā)明的市售計(jì)量吸入器的例子是Glaxo Inc.，Research Triangle Park，N.C.生產(chǎn)的Ventolin計(jì)量吸入器。
用于粉末吸入器的制劑包含含有偶聯(lián)物的細(xì)分干粉，也可包含填充劑，如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露醇，其含量應(yīng)能促進(jìn)粉末從該裝置噴散，如占制劑重量的50％-90％。在肺中具有氣動(dòng)特性的粉末顆粒對應(yīng)于密度約1g/cm.sup.2，直徑中值小于10微米，優(yōu)選0.5-5微米，最優(yōu)選1.5-3.5微米的顆粒。適用于本文所述內(nèi)容的粉末吸入器的例子是Fisons Corp.，馬薩諸塞州貝德福德生產(chǎn)的Spinhaler粉末吸入器。可用美國專利5,997,848、5,993,783、5,985,248、5,976574、5,922,354、5,785,049和5,654,007所述的方法產(chǎn)生和/或遞送用于這些裝置的粉末。
就口服制劑而言，主題化合物可單獨(dú)使用或加入合適添加劑制成片劑、粉末劑、粒劑或膠囊。常規(guī)添加劑如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；粘合劑如結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯樹膠、玉米淀粉或明膠；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉；潤滑劑如滑石粉或硬脂酸鎂；如果需要，還可加入稀釋劑、緩沖劑、濕潤劑、防腐劑和調(diào)味劑。
吸入給藥以外的胃腸道外給藥途徑包括但不限于局部、透皮、皮下、肌肉內(nèi)、眼窩內(nèi)、囊內(nèi)、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)和靜脈內(nèi)途徑，即消化道以外的任何給藥途徑?？蛇M(jìn)行胃腸道外給藥以實(shí)現(xiàn)藥物的全身或局部遞送。需要全身遞送時(shí)，給藥一般包括侵入性或全身吸收的經(jīng)局部或粘膜給予藥物制劑。
通過皮膚或粘膜的給藥方法包括但不限于局部施用合適的藥物制劑、透皮遞送、注射和表皮給藥。在透皮遞送中，采用吸收促進(jìn)劑或離子電滲是合適的方法。離子電滲遞送可用市售“貼劑”完成，這種劑型能通過電脈沖將其產(chǎn)物連續(xù)遞送幾天或更長時(shí)間而不需破損皮膚。
可用水性或非水性溶劑如植物油或其它類似油、合成脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸酯或丙二醇溶解、懸浮或乳化本發(fā)明主題化合物，將其配制到注射用制劑中；如果需要，可加入常規(guī)添加劑如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。
也可通過腸道給藥將該藥物遞送給對象。腸道給藥途徑包括但不限于口服和直腸(如采用栓劑)遞送。
而且，可通過與各種堿如乳化堿或水溶性堿混合將主題化合物制成栓劑。可通過直腸栓劑給予本發(fā)明化合物。栓劑可包括載體如可可油、碳蠟和聚乙二醇，它們可在體溫下融化，但在室溫下為固體。
本發(fā)明化合物的劑量 根據(jù)所治療的對象和疾病以及給藥途徑，可以(例如)每天0.1μg-10mg/kg體重的劑量給予主題化合物。劑量范圍很廣，因?yàn)椴煌溉閯?dòng)物的療效通常差異很大，人用劑量一般比大鼠用劑量小20、30或40倍(每單位體重)。相似地，給藥方式可能對劑量有很大影響。因此，例如，口服劑量可能約為注射劑量的十倍。局部遞送途徑可能要用更高的劑量。
典型劑型可以是適用于靜脈內(nèi)給藥的溶液；每天服用2-6次的片劑，或每天服用一次的一次釋放膠囊或片劑，其含有含量比例較高的活性成分等?？刹捎迷诓煌琾H值下溶解的膠囊材料、依靠滲透壓緩慢釋放的膠囊或任何其它已知的控釋方式獲得時(shí)間-釋放效應(yīng)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員不難理解，劑量水平隨具體化合物、癥狀的嚴(yán)重性和對象對副作用的易感性而不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難通過各種方式確定給定化合物的優(yōu)選劑量。
雖然所用劑量取決于要實(shí)現(xiàn)的臨床目標(biāo)，但合適劑量范圍是提供至多約1μg-1,000μg或約10,000μg主題組合物以減輕動(dòng)物對象的癥狀的劑量范圍。
可提供用于口服或直腸給藥的單位劑型如糖漿、酏劑和懸液，其中各劑量單位如茶匙、湯匙、片劑或栓劑含有預(yù)定量的組合物，所述組合物含有一種或多種本發(fā)明化合物。相似地，用于注射或靜脈內(nèi)給藥的單位劑型可包含用無菌水、生理鹽水或另一種藥學(xué)上可接受的載體作為溶液配制化合物的組合物。
用本發(fā)明化合物進(jìn)行聯(lián)合治療 在用于所述方法時(shí)，可將主題化合物與其它藥學(xué)活性制劑配制在一起或聯(lián)合給藥，所述其它藥學(xué)活性制劑包括其它突變CFTR的激活劑或突變-CFTR的增效劑?？捎弥黝}化合物提高另一種化學(xué)物質(zhì)如藥物(如其它的CFTR-激活劑，或門控缺陷型突變-CFTR的增效劑)的藥效，或減少產(chǎn)生所需生物學(xué)作用的另一種化學(xué)物質(zhì)如藥物(如其它CFTR-激活劑)的用量。
其它CFTR激活劑的例子包括但不限于胞內(nèi)cAMP水平提高劑，例如但不限于弗司扣林、咯利普蘭、8-溴-cAMP、茶堿、罌粟堿、cAMP和其鹽、類似物或衍生物。其它例子包括β激動(dòng)劑、妥布拉霉素(

Chiron Inc.，Emeryville，加州)和姜黃素(Egan等，(2004)Science 304600-603)。突變-CFTR的增效劑例子包括但不限于含有苯基甘氨酸的化合物和含有磺酰胺的化合物，其更詳細(xì)的描述參見2004年6月4日提交的美國臨時(shí)專利申請序列號60/576,966，全文納入本文作參考。
上述化合物也可與其它CF治療劑聯(lián)用，包括口服皮質(zhì)類固醇、布洛芬、利巴韋林(ribovarin)或抗生素如雙氯西林、頭孢菌素、頭孢氨芐、紅霉素、阿莫西林-克拉維酸、氨芐青霉素、四環(huán)素、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑、氯霉素環(huán)丙沙星、妥布拉霉素、慶大霉素、頭孢菌素、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類等。
用于與本發(fā)明化合物聯(lián)合治療的本文所述化合物可通過與本發(fā)明化合物給藥途徑相同的途徑給藥(如肺內(nèi)、口服、腸道等)?；蛘撸糜谂c本發(fā)明化合物聯(lián)合治療的化合物可通過不同于本發(fā)明化合物給藥途徑的途徑給藥。
藥盒 提供了含有單位劑量，通常是口服或注射劑量的主題化合物的藥盒。在這種藥盒中，除了含有該單位劑量的容器外，還有描述該藥物在治療感興趣病理疾病中的應(yīng)用和伴隨益處的信息性藥品說明書。優(yōu)選的化合物和單位劑量如上所述。
方法 提高突變-CFTR細(xì)胞的氯離子通透性的方法 本發(fā)明提供了提高含有感興趣的折疊或加工缺陷性突變-CFTR，如含有特別感興趣的ΔF508-CFTR而產(chǎn)生突變-CFTR蛋白的細(xì)胞的離子通透性的方法。通常，該方法包括使所述細(xì)胞接觸有效量的能校正突變-CFTR蛋白的折疊或加工缺陷而提高該細(xì)胞離子通透性的化合物。在特別感興趣的一個(gè)實(shí)施方式中，將本發(fā)明化合物與第二種突變-CFTR激活物或增效物聯(lián)合用于該方法。
在許多實(shí)施方式中，細(xì)胞突變-CFTR蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)膜上。檢測質(zhì)膜上存在突變-CFTR蛋白的方法是本領(lǐng)域熟知的，可包括但不限于(例如)用熒光、化學(xué)或生物標(biāo)簽標(biāo)記結(jié)合于CFTR蛋白的分子。結(jié)合于CFTR蛋白的分子的例子包括但不限于抗體(單克隆和多克隆)、FAB片段、人源化抗體和嵌合抗體。美國專利號6,201,107中公開了結(jié)合于CFTR蛋白的抗體的一個(gè)例子。
在許多實(shí)施方式中，為提高細(xì)胞對氯離子的通透性，使該細(xì)胞接觸本發(fā)明化合物，特別是與突變-CFTR激活物或增效物聯(lián)合提供時(shí)，能提高該細(xì)胞的跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)氯離子的速率。使所述細(xì)胞接觸本發(fā)明化合物通常能提高突變-CFTR蛋白的活性，從而增加離子轉(zhuǎn)運(yùn)。
在大多數(shù)實(shí)施方式中，突變-CFTR的離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性或細(xì)胞對離子的通透性可提高至多約10％、至多約20％、至多約50％、至多約100％、至多約150％、至多約200％、至多約300％、至多約400％、至多約500％、至多約800％或至多約1000％或更高。在某些實(shí)施方式中，某細(xì)胞檢測不到突變-CFTR的離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性或細(xì)胞對離子的通透性時(shí)，使該細(xì)胞接觸本發(fā)明化合物即可導(dǎo)致檢測到突變-CFTR的活性或細(xì)胞對離子的通透性。
可用任何方便的方法測定突變-CFTR和/或離子通透性的激活，這些方法可采用分子標(biāo)記物，如鹵化物敏感性GFP或另一種分子標(biāo)記物(如Galietta等，(2001)FEBS Lett.499，220-224)、膜片鉗實(shí)驗(yàn)和短路試驗(yàn)。
合適的細(xì)胞包括含有內(nèi)源性或引入的突變-CFTR基因的細(xì)胞。合適細(xì)胞包括攜帶含有表達(dá)突變-CFTR的表達(dá)盒的構(gòu)建物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(如COS、CHO、BHK、293、3T3細(xì)胞等)。本發(fā)明方法所用的細(xì)胞可以是體內(nèi)、離體或體外存在的細(xì)胞。本文所用術(shù)語“表達(dá)盒”指編碼突變-CFTR蛋白如ΔF508-CFTR的遺傳序列，如DNA或RNA。將表達(dá)盒引入細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域熟知的，參見例如，Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)。Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，第1、2、3卷(1989)。
治療囊性纖維化的方法 本發(fā)明也提供了治療患有突變-CFTR相關(guān)性疾病如囊性纖維化的對象的方法。通常，該方法包括給予所述對象有效量的激活突變-CFTR蛋白以提高離子轉(zhuǎn)運(yùn)的本發(fā)明化合物來治療該疾病。在特別感興趣的實(shí)施方式中，本發(fā)明化合物與第二種突變-CFTR激活物或增效物，如提高胞內(nèi)cAMP的化合物，如弗司扣林、含有苯基甘氨酸的化合物或含有磺酰胺的化合物聯(lián)合給藥。
本文所述化合物可用于治療突變-CFTR-介導(dǎo)的疾病，如與野生型CFTR相比，因突變-CFTR的存在和/或活性(如突變-CFTR的離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性)所產(chǎn)生的任何疾病、失調(diào)或疾病，或者這些疾病、失調(diào)或疾病的癥狀。這些疾病、失調(diào)、疾病或其癥狀可通過校正突變-CFTR的折疊或細(xì)胞加工如活化突變-CFTR的氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)的治療而緩解。囊性纖維化是與突變-CFTR如ΔF508-CFTR有關(guān)的遺傳病，是可用本發(fā)明化合物治療疾病的一個(gè)例子。特別感興趣的是將本發(fā)明化合物與第二種突變CFTR激活物或增效物聯(lián)用。
囊性纖維化多發(fā)于嬰兒、兒童和青年，病人有廣泛的外分泌腺功能障礙，特征癥狀是慢性肺病(由于呼吸道產(chǎn)生過多粘液)、胰腺功能不全、汗液中電解質(zhì)水平異常高和偶發(fā)的膽汁性肝硬化。與該疾病相關(guān)的還有肺抵抗細(xì)菌感染的免疫防御失效。
在病理學(xué)上，胰腺顯示出無定形嗜曙紅結(jié)石造成的胰管阻塞，結(jié)果是胰酶缺乏，導(dǎo)致脂肪痢和氮溢及小腸吸收不良。涉及器官和腺體系統(tǒng)的程度可能差異很大，結(jié)果是臨床表現(xiàn)有很大差異。
幾乎所有外分泌腺都受到分布和嚴(yán)重程度不同的囊腫性纖維化影響。涉及的腺體有三種類型腺囊腔被粘性或固體嗜曙紅物質(zhì)阻塞類型(胰腺、腸腺、肝內(nèi)膽管、膽囊、頷下腺)；組織學(xué)異常分泌物產(chǎn)生過量類型(氣管支氣管腺體和Brunner腺體)；組織學(xué)正常但鈉和氯分泌過量類型(汗腺、腮腺和小唾液腺)。十二指腸粘性分泌物，含有異常的粘多糖。98％的成年男性不育繼發(fā)于輸精管發(fā)育異常或其它形式的阻塞性無精子癥。女性不孕減少繼發(fā)于宮頸粘性分泌物，但許多患有CF的女性能懷孕至足月。然而，母親的并發(fā)癥發(fā)病率增加。
50％肺囊性纖維化患者通常有反復(fù)或慢性肺部感染相關(guān)的慢性咳嗽和哮喘?？人允亲罴值闹髟V，常伴有多痰、惡心、嘔吐和睡眠紊亂。隨著疾病發(fā)展，會(huì)發(fā)生肋間隔縮小、需使用輔助呼吸肌肉、桶狀胸畸形、杵狀指和發(fā)紺。上呼吸道癥狀包括鼻息肉和慢性或反復(fù)性鼻竇炎。青少年可能發(fā)生生長停滯、青春期延遲和運(yùn)動(dòng)耐量下降。青少年和成年人中的肺部并發(fā)癥包括繼發(fā)于肺高血壓的氣胸、咯血和右心心力衰竭。
在臨床上，85-90％的CF患者顯示胰功能不全，通常在生命早期出現(xiàn)，并且可能是進(jìn)行性的。表現(xiàn)包括常常排出松散、惡臭的油性糞便；腹部隆起；生長模式差，皮下組織和肌肉量減少，但食欲正常或貪吃。20％未治療的嬰兒和學(xué)步兒童可發(fā)生直腸脫垂。臨床表現(xiàn)可能與缺乏脂溶性維生素有關(guān)。
天氣熱時(shí)出汗過多或發(fā)熱可導(dǎo)致發(fā)生低滲性脫水和循環(huán)衰竭。在干旱天氣中，嬰兒可能出現(xiàn)慢性代謝性堿中毒。皮膚上形成鹽結(jié)晶和呈咸味說明很可能患有CF。
10％的CF成年患者發(fā)生胰島素-依賴性糖尿病，4-5％的青少年和成年人可發(fā)生伴有血管曲張和門靜脈高壓的多發(fā)性小葉膽汁性肝硬化。慢性和/或反復(fù)發(fā)作的腹痛可能與腸套疊、消化性潰瘍、闌尾周圍膿腫、胰腺炎、胃食管反流、食道炎、膽囊疾病或繼發(fā)于異常粘性糞便的部分腸梗阻。炎性并發(fā)癥可包括血管炎和關(guān)節(jié)炎。
可采用本發(fā)明化合物，或聯(lián)用這種化合物與特別感興趣的第二種突變-CFTR激活物或增效物來治療CF的任何上述癥狀。
可用上述方法治療人或動(dòng)物的CF和其癥狀。本領(lǐng)域已知幾種CF動(dòng)物模型。例如，Engelhardt等(J.Clin.Invest.902598-2607，1992)將支氣管異種移植物移植到大鼠氣管上和植入裸小鼠，開發(fā)了人氣道的動(dòng)物模型。近年生產(chǎn)了囊性纖維化的轉(zhuǎn)基因模型(如Clarke等，Science 2571125-1128，1992；Dorin等，Nature 359211-215，1992)。隨著近年來核酸轉(zhuǎn)移和干細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)的進(jìn)展，有可能通過改變各種動(dòng)物的野生型CFTR基因使其成為突變-CFTR基因。
許多動(dòng)物都顯示有人類的CF癥狀。具體說，許多動(dòng)物具有可以檢測出的氣道和腸道上皮離子通透性缺陷，類似于在人CF組織中所見的那些缺陷，和易于感染細(xì)菌。而且，大多數(shù)缺陷小鼠的腸道病理學(xué)類似于胎糞性腸梗阻。此外，似乎雜合子之間雜交產(chǎn)生的幼仔無出生前喪失。
適合用本發(fā)明方法治療的動(dòng)物包括患有突變-CFTR相關(guān)疾病的任何動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，如非人靈長動(dòng)物(如猴、黑猩猩、大猩猩等)、嚙齒動(dòng)物(如大鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠、雪貂等)、兔類、豬類(如豬、小型豬)、馬、犬、貓等。特別感興趣的是大型動(dòng)物。也可采用轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，如含有嵌合基因序列的哺乳動(dòng)物。制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法是本領(lǐng)域熟知的，參見例如，美國專利號5,614,396。一個(gè)具有CFTR缺陷的轉(zhuǎn)基因小鼠的例子參見(例如)WO 94/04669。
可測試這些動(dòng)物，以本發(fā)明主題化合物的活性和效力。通過(例如)在治療前和治療期間監(jiān)測對象的最大肺活量(FVC)、一氧化碳擴(kuò)散容量(DLCO)和/或靜息時(shí)室內(nèi)空氣pO2＞55mmHg來評估肺功能的改善。一種或多種這些參數(shù)的顯著改善表明有效。普通護(hù)理人員(如臨床醫(yī)生)熟知，可根據(jù)各種因素(如患者依賴性因素如疾病嚴(yán)重性等)、給予的化合物等調(diào)整給藥方案和劑量，從而向患者提供最優(yōu)療效。
適合治療的對象 適合用本發(fā)明方法治療的對象包括患有因突變-CFTR(通常有兩個(gè)等位基因突變的CFTR)的存在而導(dǎo)致或與其相關(guān)的突變-CFTR蛋白-介導(dǎo)的疾病、失調(diào)或疾病，或有這些疾病、失調(diào)或疾病癥狀的個(gè)體。而且，適合用本發(fā)明方法治療的對象包括患有囊性纖維化(CF)的個(gè)體。在許多實(shí)施方式中，特別感興趣的是治療患CF的人。
突變-CFTR蛋白-介導(dǎo)的疾病的癥狀包括胎糞性腸梗阻，肝病，包括膽道阻塞和和狹窄、胰功能不全、肺病包括慢性銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染和其它肺部感染、與輸精管發(fā)育異常或?qū)m頸粘液異常有關(guān)的不育以及癌癥包括腺癌。
本發(fā)明化合物通過提高突變-CFTR如ΔF508-CFTR介導(dǎo)的低水平離子轉(zhuǎn)運(yùn)而影響突變-CFTR的離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力。同樣，本發(fā)明化合物在臨床上特別可用于治療因CFTR基因的突變所產(chǎn)生的突變-CFTR在質(zhì)膜中表達(dá)、并且由于折疊或細(xì)胞加工缺陷導(dǎo)致其氯傳導(dǎo)能力降低(即該突變-CFTR是折疊或細(xì)胞加工缺陷型)類型的CF患者。同樣，在臨床上，本發(fā)明化合物可用于治療具有折疊或細(xì)胞加工突變的-CFTR如ΔF508-CFTR的CF患者。此外，在臨床上，本發(fā)明化合物與激活門控缺陷型突變-CFTR如ΔF508-CFTR或提高其效力的化合物G551D-CFTR、G1349D-CFTR或D1152H-CFTR來治療CF患者。
與CF有關(guān)的CFTR突變是本領(lǐng)域熟知的。根據(jù)CFTR蛋白，可將這些突變分為五大類。這些CFTR功能障礙類型包括CFTR產(chǎn)生有限(如轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)(I類)、折疊和/或運(yùn)輸異常(II類)、傳導(dǎo)調(diào)節(jié)異常(III類)、氯離子傳導(dǎo)減少(IV類)和合成減少(V類)。由于缺乏有功能的CFTR，I、II和III類突變一般與較嚴(yán)重的CF表型相關(guān)(即胰功能不全)，相比較而言，IV或V類突變可表達(dá)非常低水平的有功能的CFTR。在互聯(lián)網(wǎng)址為genet.sickkids.on.ca/cgi-bin/WebObjects/MUTATION的囊性纖維化突變數(shù)據(jù)庫中能找到CFTR基因中已鑒定到的不同突變的列表，特別納入本文作參考。
適合用本發(fā)明方法治療的對象可以是具體突變-CFTR的純合子，即是含具體突變-CFTR如ΔF508-CFTR兩個(gè)拷貝的純合子對象。此外，適合用本發(fā)明方法治療的對象也可以是含兩種不同CFTR突變的雜合子；即該對象的基因組包含CFTR的兩種不同突變形式，如該對象含有一拷貝的ΔF508-CFTR和一拷貝不同突變形式的CFTR。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，突變-CFTR多肽是ΔF508-CFTR。然而，本發(fā)明不應(yīng)僅限于治療含有這種CFTR突變形式的CF患者。而是，本發(fā)明應(yīng)該包括治療含有特征相似的，導(dǎo)致突變-CFTR在質(zhì)膜中表達(dá)和氯離子傳導(dǎo)能力降低或傳導(dǎo)調(diào)節(jié)異常的其它CFTR突變形式的CF患者。
實(shí)施例 提供以下實(shí)施例，以便為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制備和應(yīng)用本發(fā)明的完整公開內(nèi)容和描述，不旨在限制本發(fā)明者認(rèn)定的發(fā)明范圍，也不意味著下述實(shí)驗(yàn)是所進(jìn)行的所有和僅有的實(shí)驗(yàn)。我們努力保證所用數(shù)值(如量、溫度等)的精確性，但應(yīng)允許一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏離。除非另有說明，份數(shù)是重量份數(shù)，分子量是重均分子量，溫度是攝氏度，壓力為大氣壓或接近大氣壓。
下述實(shí)施例采用以下方法和材料。
細(xì)胞系 如前所述(Galietta等，JBC 27619723-19728(2001)；Ma等，JBC 27737235-37241(2002))，產(chǎn)生穩(wěn)定地共表達(dá)人ΔF508-CFTR和高靈敏度鹵化物-感受型綠色熒光類似物YFP-H148Q/I152L的Fischer大鼠甲狀腺(FRT)上皮細(xì)胞(Galietta等，F(xiàn)EBS Lett 499220-224(2001))。用相似方法產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)P574H-CFTR的FRT細(xì)胞。用補(bǔ)充有10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Coon改良F12培養(yǎng)基在塑料板上培養(yǎng)FRT細(xì)胞。在初次篩選中，用LabSystems多路分配器將細(xì)胞接種到黑色96孔微孔板(Corning-Costar)中，每孔接種50,000個(gè)細(xì)胞。接種18-24小時(shí)后進(jìn)行篩選。在短路離子流測定中，用Snapwell通透性支持物(Corning-Costar)培養(yǎng)細(xì)胞，每塊插入板500,000個(gè)細(xì)胞。用Snapwell插入板培養(yǎng)ΔF508/ΔF508純合CF對象(或N1303K/N1303K純合對象)的人鼻上皮細(xì)胞，在(Galietta等，Am.J.Physiol.275L917-L923(1998))所述的補(bǔ)充有激素的培養(yǎng)基中分化。
化合物 總共用150,000種不同的藥物類似化合物(＞90％的分子量為250-500道爾頓，ChemDiv and ChemBridge，加州圣地亞哥)進(jìn)行初篩。為了優(yōu)化，測試初篩中鑒定的＞1500種活性化合物的市售類似物。制備每孔含有一或四種化合物的平板用于篩選(1mM的DMSO溶液)。用NMR和液相色譜/質(zhì)譜驗(yàn)證用于后續(xù)分析的化合物。
篩選方法 用Beckman集成系統(tǒng)進(jìn)行篩選，該系統(tǒng)裝有3-米機(jī)械臂、含有多孔板傳送帶的CO2培養(yǎng)室、平板洗滌器、液體操作工作站、條碼閱讀器、去蓋臺(tái)、平板密封器和兩臺(tái)FluoStar熒光平板閱讀器(Optima、BMG Lab Technologies)，這兩臺(tái)熒光閱讀器各自裝有雙注射泵以及500±10nm激發(fā)光和535±15nm發(fā)射光濾光片(Chroma)。37℃(90％濕度，5％CO2)培育FRT細(xì)胞18-24小時(shí)，然后用50μL含有測試化合物(終濃度10μM)的培養(yǎng)基培育18-24小時(shí)。試驗(yàn)時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞，然后用含有弗司扣林(20μM)和染料木黃酮(50μM)的PBS培育。在平板閱讀器上連續(xù)記錄2秒的熒光(200ms/點(diǎn))測定各孔的I-流入(基線)，快速(＜1秒)加入165μL其中137mM Cl-被I-替代的PBS后再連續(xù)記錄12秒。I-流入速率的計(jì)算方法如下將最后11.5秒的數(shù)據(jù)擬合至指數(shù)函數(shù)，用于外推初始斜率，然后減去背景的初始熒光標(biāo)準(zhǔn)化。所有化合物平板都含有陰性對照(DMSO載體)和陽性對照(4-PBA，4mM)，還有單獨(dú)的低溫拯救(27℃培育18-24小時(shí))陽性對照板。實(shí)驗(yàn)分析顯示，Z′-因子＞0.6。
跨上皮流的測定 在Snapwell插入板上培養(yǎng)表達(dá)ΔF508-CFTR的FRT細(xì)胞7-9天。在測定前18-24小時(shí)加入測試化合物?；淄鈧?cè)溶液含有(以mM計(jì))130NaCl、2.7KCl、1.5KH2PO4、1CaCl2、0.5MgCl2、10葡萄糖、10Na-Hepes(pH 7.3)。在頂端浴溶液中，用葡糖酸鈉替代了65mM NaCl，CaCl2增加至2mM。向溶液中鼓入空氣泡，并維持在37℃。用250μg/ml兩性霉素B通透基底外側(cè)膜。就人支氣管上皮細(xì)胞而言，頂端和基底外側(cè)室含有126mM NaCl、0.38mM KH2PO4、2.1mM K2HPO4、1mM MgSO4、1mM CaCl2、24mM NaHCO3和10mM葡萄糖(基底外側(cè)膜不能通透)。通過Ag/AgCl電極和1MKCl瓊脂橋?qū)胧疫B接于DVC-1000電壓鉗(World Precision Instruments)，以記錄頂端膜或短路離子流。
校正機(jī)制的分析 生化研究采用了用野生型和ΔF508-CFTR的HA-標(biāo)記變體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞。在C-末端尾上標(biāo)記CFTR(CFTR-CtHA)，或者用三個(gè)HA表位標(biāo)記它的第四個(gè)胞外環(huán)(CFTR-3HA)。用如(Sharma等，JBC 2768942-8950(2001))所述的免疫印跡分析檢測復(fù)合物-糖基化的CFTR的累積。采用如(Sharma等，JCB 164923-933(2004))所述的碘化抗小鼠第二抗體或以Amplex-紅為底物的辣根過氧化物酶-偶聯(lián)的第二抗體通過HA抗體結(jié)合(在非通透細(xì)胞中)測定質(zhì)膜表達(dá)。通過非轉(zhuǎn)染細(xì)胞和在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中省去第一抗體測定非特異性抗體結(jié)合(采用相同的實(shí)驗(yàn)條件)。如(Du等，Nat.Struct.Mo.Biol.(2005))(有所修改)所述測定折疊效率。表達(dá)ΔF508-CFTR-CtHA的BHK細(xì)胞在校正物存在下耗盡了內(nèi)源性甲硫氨酸和半胱氨酸。為了監(jiān)測折疊，在0.2mCi/ml35S-甲硫氨酸和35S-半胱氨酸存在下培育細(xì)胞150分鐘，然后在完全培養(yǎng)基存在下再追蹤150分鐘。通過脈沖標(biāo)記等量的細(xì)胞15分鐘而不追蹤來測定摻入新合成CFTR中的放射性。通過免疫沉淀分離CFTR，通過熒光顯影觀察，采用如(Lukacs等，EMBO J.，136076-6086(1994))所述的磷光圖像分析定量。
實(shí)施例1 ΔF508-CFTR校正物的發(fā)現(xiàn)和鑒定 如圖1所示，在96孔板中用測試化合物(10μM)37℃培育共表達(dá)ΔF508-CFTR和熒光YFP鹵化物感受器的FRT細(xì)胞18-24小時(shí)。然后，洗去化合物加入增效物弗司扣林和染料木黃酮后測定ΔF508-CFTR介導(dǎo)的碘化物流入。最初篩選了150,000種化合物，產(chǎn)生45種使碘化物流入增加(Δd[I-]/dt)＞0.10mM/s的化合物和15種使碘化物流入增加＞0.20mM/s的化合物。圖2中顯示了各孔原始數(shù)據(jù)的例子。陰性對照是單用載體(DMSO)(標(biāo)為‘37℃’)，陽性對照是4-苯基丁酸酯(4-PBA)和降低溫度(27℃)的培育拯救。顯示了列舉的兩種活性化合物。
再次檢測活性化合物，通過CFTRinh-172抑制增加的碘化物流入和缺乏對FRT裸細(xì)胞的校正作用證實(shí)了ΔF508-CFTR特異性。通過篩選市售類似物初步優(yōu)化校正物的活性。三輪優(yōu)化測試了五種化合物骨架的＞1500種化合物，產(chǎn)生的活性校正物是氨基苯并噻唑、氨基芳基噻唑、喹唑啉基氨基嘧啶酮、雙氨基甲基聯(lián)噻唑和苯基氨基喹啉化合物類，其中四種見圖3A。圖3B顯示了劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)，參照虛線表示的27℃拯救。表1列舉了37種校正物和其效力(Ka，Vmax)，其中建立了五類校正物的結(jié)構(gòu)-活性數(shù)據(jù)組。圖4小結(jié)了幾種校正物的Vmax數(shù)據(jù)，與陽性和陰性對照作比較。幾種化合物的Vmax大于27℃拯救，發(fā)現(xiàn)化合物與27℃拯救聯(lián)用時(shí)對碘流入具有加成效應(yīng)。
圖5顯示了Ussing小室實(shí)驗(yàn)，測定在基底外側(cè)膜通透后、氯梯度存在下(頂端65mM，基底外側(cè)130mM)FRT細(xì)胞的頂端膜氯離子流。測定頂端膜氯離子流基線后，加入高濃度的增效物弗司扣林(20μM)，然后加入染料木黃酮(50μM)；各實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)加入CFTRinh-172(10μM)。用電生理學(xué)研究驗(yàn)證了獲自該熒光試驗(yàn)的數(shù)據(jù)。圖5左側(cè)顯示，27℃培養(yǎng)的表達(dá)ΔF508-CFTR的細(xì)胞離子流比37℃培養(yǎng)的離子流大得多(上部和中部曲線)，以及缺乏對FRT裸細(xì)胞的校正作用(底部)。測定前，將表達(dá)ΔF508-CFTR的細(xì)胞與校正物37℃培育24小時(shí)能提高弗司扣林/染料木黃酮刺激的和CFTRinh-172抑制的氯離子流(圖5，右側(cè))，與27℃拯救產(chǎn)生的效應(yīng)相當(dāng)或更大。
表1






圖6A小結(jié)了四種校正化合物進(jìn)行校正的時(shí)程(37℃培育)，顯示了27℃拯救和4-PBA的數(shù)據(jù)作為比較。早至加入化合物3小時(shí)后，就能觀察到校正，12-30小時(shí)后發(fā)生最大效應(yīng)。相反，27℃培育或4-PBA的校正作用發(fā)生得相對較慢。圖6B小結(jié)了洗去化合物后校正(或者溫度從27℃回復(fù)至37℃)的持久性數(shù)據(jù)。對大多數(shù)化合物而言，洗滌后校正作用持續(xù)了12小時(shí)以上，兩種校正物在24小時(shí)后仍有很高的活性。相反，27℃拯救的細(xì)胞24小時(shí)后幾乎沒有校正作用。
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來研究校正化合物可否改變?chǔ)508-CFTR的特性，如對cAMP-增高劑或?qū)υ鲂Щ衔锏拿舾行?。圖7小結(jié)了單用弗司扣林(20μM)與弗司扣林+染料木黃酮(50μM)的Vmax。有趣的是，相對于低溫處理，校正物處理的細(xì)胞中單用弗司扣林與弗司扣林+染料木黃酮產(chǎn)生的組合Vmax較高。因此，幾種校正化合物能提高單用弗司扣林引起的ΔF508-CFTR活化?；衔颿orr-2b最有效，弗司扣林反應(yīng)提供了～80％的Vmax。圖8顯示了弗司扣林劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)(不存在染料木黃酮)。雖然Vmax不同，但在各種情況下弗司扣林反應(yīng)的Ka約為3μM。如Ussing小室實(shí)驗(yàn)所示(圖9)，20μM(甚至高達(dá)50μM)的化合物corr-2b能提高弗司扣林反應(yīng)的相對幅度。這并非由化合物corr-2b的固有增效活性所致，因?yàn)樵?7℃拯救的細(xì)胞中它不能刺激CFTR的活性，以染料木黃酮作為陽性對照(圖9，右側(cè))。
高通量篩選產(chǎn)生了能校正ΔF508-CFTR細(xì)胞錯(cuò)誤加工和使質(zhì)膜表達(dá)和鹵離子通透性恢復(fù)至高于低溫拯救所達(dá)到的水平的幾類小分子。通過電生理學(xué)和生化測定證實(shí)了校正作用，其中采用了對照(不表達(dá))細(xì)胞和CFTR-選擇性抑制劑。
選擇上皮來源的細(xì)胞系(類似于天然的CFTR-表達(dá)細(xì)胞)用于初步篩選，以便快速評價(jià)單層細(xì)胞的氯離子流，和產(chǎn)生強(qiáng)大的低溫拯救反應(yīng)。對高通量篩選所用細(xì)胞系的其它要求包括在測試平板上快速生長、YFP-H148Q/I152L的表達(dá)穩(wěn)定且明亮、以及鹵離子通透性基礎(chǔ)水平低。如前所述YFP-H148Q/I152L熒光鹵化物指示劑顯色(Galietta等，F(xiàn)EBSLett.499220-224(2001))為明亮的細(xì)胞表達(dá)水平和超高的碘離子敏感性。篩選許多轉(zhuǎn)染和天然表達(dá)的上皮細(xì)胞系以及一百種以上的ΔF508-CFTR/YFP-H148Q/I152L轉(zhuǎn)染的FRT細(xì)胞克隆后選出所用的轉(zhuǎn)染FRT細(xì)胞系。
實(shí)施例2 ΔF508-CFTR校正物的機(jī)理分析 為了提供在校正物存在下ΔF508-CFTR生物合成加工的生化證據(jù)，通過免疫印跡分析，監(jiān)測成熟的復(fù)合物-糖基化ΔF508-CFTR-CtHA在乳倉鼠腎(BHK)細(xì)胞中的累積。用校正物在37℃培育細(xì)胞16-24小時(shí)導(dǎo)致復(fù)合物-糖基化的ΔF508-CFTR累積(圖10A)。這通過與核心-糖基化對應(yīng)物的電泳遷移(表觀M.W.～150kDa)相比，復(fù)合物-糖基化ΔF508-CFTR免疫反應(yīng)性條帶的電泳遷移較慢(表觀M.W.～170kDa)證明了這一點(diǎn)，核心-糖基化是沒處理細(xì)胞中的主要形式。在表達(dá)ΔF508-CFTR的FRT細(xì)胞中獲得了相似結(jié)果。校正物處理的細(xì)胞中復(fù)合物-糖基化ΔF508-CFTR的累積水平與不用校正物僅用低溫培育所產(chǎn)生的水平相當(dāng)(圖10B)。由于ER侶伴分子Grp78的表達(dá)水平未改變，表明校正化合物不產(chǎn)生ER應(yīng)激反應(yīng)。采用對胞外表位識(shí)別的抗-HA抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)了質(zhì)膜ΔF508-CFTR表達(dá)(Ma等，JBC 27737235-37241(2002))。用校正化合物培育顯著提高了質(zhì)膜ΔF508-CFTR的豐度，伴有弗司扣林/染料木黃酮-刺激的頂端膜氯離子流大致按比例增加(圖11A)。
ΔF508突變損傷了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上ΔF508-CFTR的構(gòu)象成熟過程和該通道的輸出能力，并使高爾基體后小體(post-Golgi compartments)中的復(fù)合物-糖基化ΔF508-CFTR不穩(wěn)定(Sharma等，2001；Sharma等，2004)。因此，校正化合物可能促進(jìn)了新合成ΔF508-CFTR的翻譯后折疊并提高了成熟的復(fù)合物-糖基化ΔF508-CFTR的穩(wěn)定性。為了確定校正作用的細(xì)胞基礎(chǔ)，用代謝物脈沖-追蹤技術(shù)測定新合成的核心-糖基化ΔF508-CFTR轉(zhuǎn)化為復(fù)合物-糖基化形式的比例，定量分析了校正物對ΔF508-CFTR翻譯后折疊效率的影響(圖11B)。通過將放射性脈沖標(biāo)記的時(shí)間從15分鐘延長到150分鐘，顯著提高了該試驗(yàn)的靈敏度。磷光圖像分析顯示，在37℃培育的BHK細(xì)胞中，與野生型CFTR的成熟效率(31±5％)相比，ΔF508-CFTR的成熟效率雖然低，但可測量(0.5±0.15％)。在其它異源表達(dá)系統(tǒng)中野生型CFTR成熟效率獲得的結(jié)果相似(Ward等，1994；Lukacs等，EMBO J136076-6086(1994))。在某些校正化合物的存在下，ΔF508-CFTR折疊效率提高了2-3倍(圖11C)。下一步評價(jià)ΔF508-CFTR-3HA在細(xì)胞表面的穩(wěn)定性。溫度降低時(shí)，ΔF508-CFTR-3HA首先在細(xì)胞表面累積(如圖10A)。然后，在校正物的存在下將溫度提高到37℃，通過4℃時(shí)結(jié)合于該通道的抗HA消失監(jiān)測ΔF508-CFTR的穩(wěn)定性。雖然在3小時(shí)追蹤期間，拯救的ΔF508-CFTR細(xì)胞表面密度降低約～20％，但校正化合物存在下細(xì)胞表面仍有50-90％的ΔF508-CFTR蛋白(圖12B和C)。因此，校正化合物也延長了拯救的ΔF508-CFTR蛋白在細(xì)胞表面的存留時(shí)間。
作為化合物校正缺陷的ΔF508-CFTR錯(cuò)誤加工的特異性的初始測試，檢測了化合物對P574H-CFTR的作用，P574H-CFTR是類似于ΔF508-CFTR的一種突變CFTR，保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，但可通過降溫培育24小時(shí)而拯救(Ostedgaard等，J.Cell Sci.，1122091-2098(1999))。用校正物或降低溫度培育細(xì)胞24小時(shí)。測定響應(yīng)于弗司扣林(它能完全激活這種CFTR突變體，Sheppard等，EMBO J.14876-883(1995))、然后是CFTRinh-172的頂端膜氯離子流。圖12顯示，盡管低溫拯救的對照為陽性，但能在表達(dá)ΔF508-CFTR的細(xì)胞中產(chǎn)生強(qiáng)大氯離子流的corr-4a化合物對P574H-CFTR細(xì)胞沒有作用。Corr-3a化合物產(chǎn)生的氯離子流增加兩倍。
CFTR的細(xì)胞加工包括翻譯、在ER中折疊、高爾基體運(yùn)輸、翻譯后糖基化和頂端質(zhì)膜靶向。質(zhì)膜CFTR通過胞吞作用內(nèi)化，然后再循環(huán)至質(zhì)膜或靶向溶酶體降解(Sharma等，2004；Gentzsch等，MBC 52684-2696(2004))。ΔF508-CFTR折疊無效。在BHK細(xì)胞中，99.5％新合成的ΔF508-CFTR靶向降解而不到達(dá)高爾基體。也有報(bào)道稱，在其它模式系統(tǒng)中ΔF508-CFTR幾乎完全存留在ER中。Corr-4b和corr-4c化合物將ΔF508-CFTR折疊效率提高了將近3倍，但不影響翻譯速率，這表明，該校正化合物可部分克服翻譯后折疊障礙。根據(jù)近年來的結(jié)構(gòu)研究，相信小分子可促進(jìn)NBD2和/或跨膜結(jié)構(gòu)域的折疊(Du等，Nat.Struct.Biol.，2005，Chen等，JBC 27939620-39627(2004))。對校正物的外周穩(wěn)定作用最簡單的解釋是，與沒有校正化合物時(shí)拯救的ΔF508-CFTR相比，構(gòu)象穩(wěn)定的突變體不易受泛素-依賴性外周質(zhì)量控制機(jī)制和溶酶體降解的影響(Sharma等，2004)。
實(shí)施例3 人氣道上皮中的ΔF508-校正 檢測了校正化合物對ΔF508-CFTR純合對象的人氣道上皮細(xì)胞原代分化培養(yǎng)物的作用。將可通透支持物上極化的細(xì)胞固定在Ussing小室中，用短路流分析測定氯分泌。用阿米洛利阻斷Na+流后，單用DMSO載體處理的細(xì)胞對弗司扣林、染料木黃酮或CFTRinh-172幾乎沒有反應(yīng)(圖13)。經(jīng)過弗司扣林和染料木黃酮處理后流增加可以看出，27℃培育24小時(shí)導(dǎo)致出現(xiàn)了顯著的氯離子流，以及CFTRinh-172的抑制作用。結(jié)果表明，用化合物corr-4a在37℃培育24小時(shí)也能同等程度地提高氯離子流。顯示了非CF支氣管上皮細(xì)胞的數(shù)據(jù)(圖13，下圖)以進(jìn)行比較。圖14A小結(jié)了A中所示一系列測定中CFTRinh-172抑制產(chǎn)生的短路離子流改變，包括第二種雙氨基甲基聯(lián)噻唑的數(shù)據(jù)。作為這些研究的陰性對照，檢測了同一校正化合物對N1303K-CFTR突變純合對象的人支氣管上皮細(xì)胞的作用，該對象也表現(xiàn)出CFTR加工缺陷(Gregory等，MCB113886-3893(1991))。圖14B顯示，所用化合物和條件與圖13所示ΔF508-CFTR細(xì)胞所用的相同時(shí)，沒有顯著校正N1303K-CFTR支氣管細(xì)胞的短路離子流。
上述內(nèi)容僅說明了本發(fā)明的原理。應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)出不同的安排方式，雖然本文沒有明確描述或顯示這些安排方式，但按照本發(fā)明原理的實(shí)施方式，應(yīng)屬于本發(fā)明的構(gòu)思和范圍內(nèi)。而且，本文敘述的所有例子和條件主要是為了幫助讀者理解本發(fā)明的原理和本發(fā)明者進(jìn)一步探究現(xiàn)有技術(shù)的構(gòu)思，不應(yīng)認(rèn)為本發(fā)明僅限于這些具體敘述的例子和條件。而且，敘述本發(fā)明的原理、各方面內(nèi)容和實(shí)施方式及其具體實(shí)施例的所有內(nèi)容都包括了其結(jié)構(gòu)和功能等同物。此外，應(yīng)認(rèn)為這種等同物包括目前已知的等同物和將來開發(fā)的等同物，即將來開發(fā)的具有相同功能(不管結(jié)構(gòu)如何)的任何部件。因此，本發(fā)明范圍不應(yīng)僅限于本文顯示和描述的示范性實(shí)施方式。而是本發(fā)明的范圍和構(gòu)思受所附權(quán)利要求書的限制。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，所述藥物組合物含有式(I)化合物；或其藥學(xué)上可接受的衍生物，如各立體異構(gòu)體或其混合物；或其藥學(xué)上可接受的鹽
式中，R1獨(dú)立地選自氫或與R2稠合的C(＝O或＝S)NH基團(tuán)，R2獨(dú)立地選自連接于取代或未取代的烷基、取代或未取代的環(huán)烷基或者取代或未取代的芳環(huán)和取代或未取代的雜芳環(huán)的N＝CH或N-烷基。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物還含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、藥學(xué)上可接受的稀釋劑、藥學(xué)上可接受的賦形劑和藥學(xué)上可接受的佐劑中的至少一種。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物不含可檢測的二甲亞砜。
4.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，R1是氫，所述式(II)化合物是具有式(Ia)的化合物
式中，R3獨(dú)立地選自取代或未取代的苯基，R4是取代或未取代的烷基。
5.如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，R3選自4-(甲氧基)苯基、3-(硝基)苯基、4-(硝基)苯基或4-(氯)苯基。
6.如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，R4選自氫或甲基。
7.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述化合物是式(Ib)化合物
式中，R5和R6選自取代或未取代的烷基，或者是稠合的取代或未取代的環(huán)烷基環(huán)基。
8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，R5是乙基。
9.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，R6是乙基。
10.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，R5和R6是稠合的叔(丁基)環(huán)己烷基。
11.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述化合物選自
12.一種藥物組合物，所述藥物組合物含有式(II)化合物；或其藥學(xué)上可接受的衍生物，如各立體異構(gòu)體或其混合物；或其藥學(xué)上可接受的鹽
式中，R1獨(dú)立地選自取代或未取代的苯基，R2獨(dú)立地選自氫或烷基，R3獨(dú)立地選自取代或未取代的苯基、取代或未取代的雜芳基、取代的氨基、取代的?；?。
13.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物還含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、藥學(xué)上可接受的稀釋劑、藥學(xué)上可接受的賦形劑和藥學(xué)上可接受的佐劑中的至少一種。
14.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物不含可檢測的二甲亞砜。
15.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，R1選自未取代的苯基、未取代的聯(lián)苯基、3，4-二(甲基)苯基、4-(甲基)苯基、3，4-二(甲氧基)苯基、3，4-二(羥基)苯基、4-(溴)苯基、4-(丙烯基)苯基、3-(甲基)-4-(甲氧基)苯基或3-(硝基)-4(甲基)苯基。
16.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，R2選自氫或甲基。
17.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，R3選自未取代的苯基、或者3-(氯)苯基、4-(氟)苯基、2-(甲基)苯基、2-(乙氧基)苯基、2，5-二(甲氧基)-4-(氯)苯基、4-(乙酰胺)苯基、未取代的嘧啶基、3-(甲基)嘧啶基、二(甲基)亞丁基胺基、酰基-噻吩基、?；?4-叔丁基-苯基)或酰基-甲硫基-咪唑-5-苯基。
18.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，所述化合物選自
19.一種藥物組合物，所述藥物組合物含有式(III)化合物；或其藥學(xué)上可接受的衍生物，如各立體異構(gòu)體或其混合物；或其藥學(xué)上可接受的鹽
式中，R1選自氫、烷基或烷氧基；R2選自氫、烷基或烷氧基；R3是烷基；R4選自羥基或羰基；R5和R6選自稠合環(huán)烷基、氫、烷基或者取代或未取代的苯基。
20.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物還含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、藥學(xué)上可接受的稀釋劑、藥學(xué)上可接受的賦形劑和藥學(xué)上可接受的佐劑中的至少一種。
21.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物不含可檢測的二甲亞砜。
22.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其特征在于，R1選自氫、甲基、乙基、甲氧基或乙氧基。
23.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其特征在于，R2選自氫、甲基、乙基、甲氧基或乙氧基。
24.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其特征在于，R3選自甲基或乙基。
25.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其特征在于，R4選自羥基或羰基。
26.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其特征在于，R5選自氫、甲基、乙基、未取代的苯基或2-甲硫基-1H-苯并咪唑基。
27.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其特征在于，R6選自氫、甲基、乙基、未取代的苯基或2-甲硫基-1H-苯并咪唑基。
28.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其特征在于，R5和R6是稠合的環(huán)戊基。
29.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其特征在于，所述化合物選自
30.一種藥物組合物，所述藥物組合物含有式(IV)化合物；或其藥學(xué)上可接受的衍生物，如各立體異構(gòu)體或其混合物；或其藥學(xué)上可接受的鹽
式中，R1是烷基，R2是取代或未取代的苯基；或取代或未取代的苯基。
31.如權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物還含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、藥學(xué)上可接受的稀釋劑、藥學(xué)上可接受的賦形劑和藥學(xué)上可接受的佐劑中的至少一種。
32.如權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物不含可檢測的二甲亞砜。
33.如權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其特征在于，R1是甲基。
34.如權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其特征在于，R2選自3-(硝基)苯基、2-甲氧基苯基、2-乙氧基苯基、1-苯基乙基-1-酮基或3-氯-6-甲氧基苯基。
35.如權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其特征在于，所述化合物選自
36.一種藥物組合物，所述藥物組合物含有式(V)化合物；或其藥學(xué)上可接受的衍生物，如各立體異構(gòu)體或其混合物；或其藥學(xué)上可接受的鹽
式中，R1選自氫或烷基；R2選自氫或烷基；R3是烷基；R4選自氫、烷基、烷氧基或鹵素基團(tuán)；R5選自氫、烷基、烷氧基或鹵素基團(tuán)。
37.如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物還含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、藥學(xué)上可接受的稀釋劑、藥學(xué)上可接受的賦形劑和藥學(xué)上可接受的佐劑中的至少一種。
38.如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物不含可檢測的二甲亞砜。
39.如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于，R1選自氫或甲基。
40.如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于，R2選自氫或甲基。
41.如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于，R3選自氫或甲基。
42.如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于，R4選自氫、溴、氯或甲氧基。
43.如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于，R5選自氫、溴、氯或甲氧基。
44.如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于，所述化合物選自
45.一種治療患有突變-CFTR相關(guān)性疾病對象的方法，所述方法包括給予所述對象治療有效量的權(quán)利要求1、12、19、30或36中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述疾病是囊性纖維化。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，治療后，所述對象肺中粘液或細(xì)菌滴度降低、咳嗽或打噴嚏減少、胰功能不全減輕或汗液中電解質(zhì)水平降低。
48.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述對象是非人動(dòng)物。
49.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
50.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述突變-CFTR是ΔF508-CFTR。
51.一種提高產(chǎn)生突變-CFTR蛋白的細(xì)胞的離子通透性的方法，所述方法包括
使所述細(xì)胞接觸有效量的權(quán)利要求1、12、19、30或36中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述接觸能有效提高所述細(xì)胞CFTR介導(dǎo)的離子通透性。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞含有編碼所述突變-CFTR蛋白的重組表達(dá)盒。
53.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞含有編碼所述突變-CFTR蛋白的基因組。
54.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述突變-CFTR是ΔF508-CFTR。
全文摘要
本發(fā)明提供了校正突變-囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(如ΔF508 CFTR)的細(xì)胞加工(如折疊、運(yùn)輸或翻譯后修飾)、用于治療囊性纖維化(CF)的組合物、藥物制劑和方法。本發(fā)明的組合物和藥物制劑可含有本發(fā)明的含氨基苯并噻唑的化合物、含氨基芳基噻唑的化合物、含喹唑啉基氨基嘧啶酮的化合物、含雙氨基甲基聯(lián)噻唑化合物或含苯基氨基喹啉的化合物或者他們的類似物或衍生物中的一種或多種。
文檔編號A61K31/425GK101605543SQ200680015035
公開日2009年12月16日 申請日期2006年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月18日
發(fā)明者A·弗克曼, N·佩德蒙特, L·J·V·加里耶塔 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)