專利名稱：：抑制g蛋白信號傳導(dǎo)的組合物和方法抑制G蛋白信號傳導(dǎo)的組合物和方法引言本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院資助(項(xiàng)目編號GM60286和DK46371)的研究過程中完成的。美國政府對本發(fā)明享有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
：已發(fā)現(xiàn)了G蛋白p亞基(37kDa)的5種哺乳動物同種型和G蛋白y亞基(7.8kDa)的12種同種型(Offermanns(2003)忍/o/7/i".Mo/.B/W83:101-30)。由G蛋白p亞基和y亞基構(gòu)成的專性異源二聚體(GJ5y)在真核細(xì)胞的許多通路中起著調(diào)控分子的作用(Neves，etal.(2002)5W匿e296:1636-9;ClaphamandNeer(1997)ifev.P/mr附"co/.7bx/"/.37:167-203)。G卩y最初凈皮鑒定為烏苷酸解離抑制劑(GDI)，它與結(jié)合有GDP的G蛋白a亞基(Ga)緊密結(jié)合，從而組成了G蛋白異源三聚體的基本形式，這個形式中Ga和G^在信號傳導(dǎo)中都沒有活性。激動劑激發(fā)的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)催化Ga上的GDP與GTP的交換，并且將G|3y從異源三聚體復(fù)合體上釋放，釋放出兩種有活性的信號傳導(dǎo)分子GotGTP和GPy。G^信號傳導(dǎo)的靶標(biāo)包括G蛋白調(diào)節(jié)的內(nèi)向整流型鉀通道(GIRK)(Krapivinsky,etal.(1993)丄273:16946-52)，I型、11型和IV型腺苷酸環(huán)4匕酶同種型(TangandGilman(1991)5We匿254:1500-3;Sunahara，etal.(1996)j/i肌Zev.尸/i7bja'"/.36:461-80)，絲裂素激活的蛋白激酶(MAPK)(SchwindingerandRobishaw(2001)Owcogewe20:1653-60)，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)(SchwindingerandRobishaw(2001)見上文)，磷轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(phosducin)(Schulz(2001)尸/^ir附flco/Wm43:1-10)，G蛋白受體激酶(GRK)家族的至少兩個成員(Koch，etal.(1993)/.C7^附.268:8256-60;Inglese，etal.(1994)7v"http://.Sc/.CAS^91:3637-41)和其他包含PH(plextrinhomology)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)包括發(fā)動蛋白(Lin，etal.(1998)tv"".t/5^95:5057-60;ScaifeandMargolis(1997)CW/57g""/9:395-401)和磷脂酶Cp(PLCp)的pi、卩2和卩3同種型(SternweisandSmrcka(1992)7>e</y丑/oc/fe附.6V*/.17:502-6;Li，etal.(1998)/.O^/w.273:16265-72)以及許多其他的蛋白。GP是一個由7個四股p折疊從一個中軸放射狀排列構(gòu)成的錐形螺旋結(jié)構(gòu)(Wall,etal.(1995)Ce〃83:1047-58;Lambright,etal.(1996)A^mm379:311-9)。每個p折疊由兩個連續(xù)的WD-40重復(fù)元件組成，由每個重復(fù)元件的C-端保守的Trp-Asp序列而得名(Gettemans，etal.(2003)^SW^ST/GE"2003:PE27)。Gy亞基是一個伸展螺旋分子，位于一個穿過錐形結(jié)構(gòu)的底面的疏水通道中。相對狹小的Gp錐形結(jié)構(gòu)"頂"表面是Ga(通過它的開關(guān)II區(qū)域)(Wall,etal.(1995)見上文；Lambright,etal.(1996)見上文)、磷轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(Loew，etal.(1998)A匿f匿6:1007-19;Gaudet,etal.(1996)CV〃87:577-88)和GRK2(Lodowski，etal.(2003)5Wewce300:1256-62)的主要結(jié)合位點(diǎn)，這正如這些復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)所示。突變分析表明，GPY的多種相互作用的配偶體包括PLC|32和腺苷酸環(huán)化酶結(jié)合于同一表面(Li，etal.(1998)見上文；Ford,etal.(1998)5Wewce280:1271-4)。例如在Ga和磷轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白結(jié)合GPy的晶體結(jié)構(gòu)中，位于Gp隆凸面?zhèn)鹊奈稽c(diǎn)作為輔助的結(jié)合面被某些GPy乾標(biāo)特異地識別(Wall,etal.(1995)見上文；Loew,etal.(1998)見上文；Gaudet,etal.(1996)見上文；Wall,etal.(1998)Structure6:1169-83)。隨機(jī)肽庫的噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于鑒定進(jìn)行結(jié)合所要求的序列和篩選與二聚體結(jié)合的肽(Scott，etal.(2001)EMfiO/.20:767-76)。雖然已經(jīng)篩選了上億的單個克隆，但是大部分與G(5^2結(jié)合的肽可以被分為與氨基酸序列不相關(guān)的四個類別。其中一類包括一種序列為Ser—Ik-Arg-Lys-Ala-Leu-Asn-Ile-Leu-Gly-Tyr-Pro-Asp-Tyr-Asp(SE()IDNO:1)的線性肽("SIRK"肽)。SIRK肽通過GPr/2的亞基抑制PLC卩2的激活，ICs。為5nM,并且阻斷PI3K的激活。相反，SIRK肽對I型腺苷酸環(huán)化酶或者電壓依賴的N-型Ca"通道活性的GP^2調(diào)控沒有或者幾乎沒有作用(Scott,etal.(2001)見上文)。這證明，對G卩y結(jié)合的配偶體選擇性的抑制可以實(shí)現(xiàn)。屬于全部四個類別中的各肽以某個范圍的親和力互相竟?fàn)幍嘏cGP^2結(jié)合，這說明通過噬菌體展示篩選技術(shù)分離到的所有克隆在G(5lY2上有共同的結(jié)合位點(diǎn)(Scott,etal.(2001)見上文)。后來的實(shí)驗(yàn)顯示，SIRK肽不但能阻斷異源三聚體的形成，而且在沒有Go^激活的時候，還能代替GPovGan復(fù)合體中的Gau，并在完整細(xì)胞中激活G蛋白依賴性ERK1和ERK2通路(Ghosh,etal.(2003)丄B/o/.CTie附.278:34747-50;Goubaeva，etal.(2003)/fi/o/.CAe/M.278:19634-41)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SIRK促使了不依賴于核苷交換的異源三聚體解聚(Goubaeva，etal.(2003)見上文；Ghosh,etal.(2003)見上文)，這可能地解釋了ERK在完整細(xì)胞中的激活。其他G(5y結(jié)合肽，例如由腺普酸環(huán)化酶II而得的QEHA(Weng，etal.(1996)/.fi/o/.C7id271:26445-26448;Chen,etal.(1997)TVn".fAS^94:2711-2714)和J5ARK(GRK2)的C-端區(qū)域第643-670個氨基酸(KochetaL(1993)見上文)雖然竟?fàn)幮缘嘏cGa亞基結(jié)合，但不能促進(jìn)異源三聚體的解聚(Ghosh,etal.(2003)見上文)。這表明，這些肽與Ga-G|iY亞基的竟?fàn)幮越Y(jié)合并不足以加速亞基解聚。使用摻雜誘變(dopingmutagenesis)和再篩選策略獲得了一個SIRK肽類似的肽，它與GplY2有更高的親和性。該肽的序列為Ser畫Ile國Gly-Lys畫Ala-Phe-Lys畫Ile-Leu畫Gly-Tyr-Pro隱Asp-Tyr畫Asp(SEQIDNO:2)(SIGK)。對SIGK肽的體外研究表明，它也可以替代異源三聚體中的Gau,并且也能有效地阻止異源三聚體的形成(Ghosh，etal.(2003)見上文)。SIRK/SIGK介導(dǎo)Ga"'GDP與G(5j2解離的機(jī)制目前還不清楚，但該機(jī)制被認(rèn)為需要Gpl72亞基內(nèi)構(gòu)象的改變，以使在肽存在的時候增加Gai,亞基解離的速度(Ghosh,etal.(2003)見上文)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種對可調(diào)節(jié)G蛋白的至少一種活性的試劑進(jìn)行鑒定的方法。該方法包括使G蛋白p亞基與一種待測試劑相接觸，并確定所述試劑是否與所述P亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)上的至少一個氨基酸殘基相互作用，從而鑒定一種可調(diào)節(jié)所述G蛋白至少一種活性的試劑。本發(fā)明還涉及一種對可與所述P亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基結(jié)合的試劑進(jìn)行鑒定的方法。該方法包括以下步驟，在一種肽存在的情況下——所述肽可與P亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基結(jié)合一一使G蛋白p亞基與一種待測試劑相接位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基結(jié)合:從:鑒定一種^與所述p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基結(jié)合的試劑。本發(fā)明還涉及一種調(diào)節(jié)G蛋白的至少一種活性的方法。該方法包括使G蛋白與有效量的一種試劑相接觸，所述試劑可與所述G蛋白p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基相互作用，從而對G蛋白的至少一種活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。本發(fā)明還是一種預(yù)防或治療一種疾病或病癥的方法，所述疾病或病癥與至少一種G蛋白PY亞基活性有關(guān)。該方法包括向患有與至少一種G蛋白|3y亞基活性有關(guān)的疾病或病癥的患者或具有該患病風(fēng)險(xiǎn)的患者提供有效量的一種試劑——所述試劑可與所述G蛋白p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基相互作用——以調(diào)節(jié)所述G蛋白的至少一種活性，從而預(yù)防或治療與至少一種G蛋白^亞基活性有關(guān)的疾病或病癥。與G蛋白Py亞基活性有關(guān)的疾病或病癥包括心力衰竭、成癮性、炎癥和阿片耐受等。本發(fā)明還提供一種用于鑒定一種試劑的試劑盒，所述試劑可與所述p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基結(jié)合。本發(fā)明的所述試劑盒包含一個SIGK肽或SIGK肽的書1"生物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了根據(jù)本發(fā)明的篩選方法進(jìn)行鑒定獲得的試劑，其中所述試劑具有式I、II或III的結(jié)構(gòu)。圖1顯示出，預(yù)測與G(3蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)結(jié)合的小分子可以在蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)干擾肽的相互作用。1,對照(DMSO);2，NSC3082053,NSC12155;4，NSC13984;5，NSC117079;6,NSC610930;7，NSC293161;8,NSC23128;9，NSC402959;10，NSC109268;11，NSC125910;12，溶于DMSO的SIGK。該檢測中使用的SIGK為20//M，每種小分子為200//M。圖2顯示出NSC119910與GPy結(jié)合，并干擾生理學(xué)相關(guān)的蛋白相互作用，如與Ga亞基的相互作用。圖3顯示出NSC119910抑制磷脂酶C-GP丫相互作用。磷脂酶的酶活性用成熟的方法測定(GhoshandSmreka(2003)T^o/.B/o/.237:67-75)。圖4顯示出在存在或不存在10//MNSC119910的條件下，用fMLP或ATP激動劑激活的嗜中性粒細(xì)胞的胞質(zhì)Ca"濃度的峰值。fMLP，n二3;ATP,n=2。圖5顯示出，在存在和不存在10^MNSC119910的情況下，用fMLP或ATP激活嗜中性粒細(xì)胞時，代表性實(shí)驗(yàn)證實(shí)的胞質(zhì)Ca"濃度的峰值和熒光強(qiáng)度降低到半峰值(t1/2)所需要的時間。圖6顯示出在本發(fā)明的示例化合物存在的情況下，PLC-P2和PLC-P3的激活;陂抑制。具體實(shí)施方式G蛋白的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)已經(jīng)被鑒定出來。SIGK結(jié)合GPy的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被揭示，該結(jié)構(gòu)表明SIGK作為一個a螺旋穿過Ga相互作用表面與GPy結(jié)合，并位于異源三聚體中被Ga的開關(guān)II結(jié)構(gòu)域的a螺旋區(qū)域占據(jù)的位置。不論SIGK是否存在，GPy的構(gòu)象都非常相似。因此，該晶體結(jié)構(gòu)揭示了該肽是如何阻斷Gcx-GPy相互作用的。該結(jié)構(gòu)也表明G(5逐漸演化為具有高度活性且高度特化的表面結(jié)構(gòu)，從而可與多種蛋白質(zhì)配偶體相互作用。該特化的表面在本文被稱為"蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)"或"GP的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)"。對該蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的各種特性進(jìn)行的分析表明，該表面可作為一個優(yōu)選的相互作用表面的基礎(chǔ)不是該位點(diǎn)的固有構(gòu)象柔性或非常高的表面可接近性，而是在此單個結(jié)合表面上存在豐富的多種類型的潛在可相互作用的化學(xué)物質(zhì)。已經(jīng)確定了蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)處識別氨基酸序列所需的該表面的特異氨基酸組合。而且，已經(jīng)證實(shí)了加速異源三聚體的解離或抑制蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成所需的特異的分子相互作用。因此，本發(fā)明涉及一種鑒定一種試劑的方法，所述試劑可調(diào)節(jié)(即阻斷或抑制，或者激活或加強(qiáng))G蛋白的至少一種活性，該方法通過以下步驟進(jìn)行使G蛋白p亞基與一種待測試劑接觸(例如，以高通量的方式篩選)，并確定該待測試劑是否與G蛋白(5亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基相互作用。G蛋白(5亞基意在包括所有五種已知的哺乳動物G蛋白P亞基同種型中的任何一種(Offermanns(2003)見上文)。G蛋白活性的意在指通過G蛋白向一個或多個下游蛋白質(zhì)傳導(dǎo)信號，所述下游蛋白質(zhì)包括但不限于G蛋白調(diào)控的內(nèi)向整流型鉀通道(GIRK)、腺苷酸環(huán)化酶I型、II型和IV型同種型、促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、G蛋白受體激酶(GRK)家族成員和其他包含PH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，包括發(fā)動蛋白、磷脂酶CP(PLCp)的pi、卩2和P3同種型。對G蛋白活性的調(diào)節(jié)是通過該試劑與蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基結(jié)合進(jìn)行的，從而阻斷Gk亞基和Ga亞基或者GPy亞基和本文所述的下游蛋白質(zhì)之間的相互作用。Gpy,結(jié)合SIGK的晶體結(jié)構(gòu)揭示了與SIGK肽相互作用的的殘差、可以;陂多種GPy結(jié)合蛋白(例如下游蛋白質(zhì))利用。例如，在G(^y2'GRK2復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)中，Gp,的Lys57、Tyr59、Trp99、Metl01、Leul17、Tyrl45、Metl88、Asp246和Trp332都參與了與GRK2的PH結(jié)構(gòu)域的接觸，并且Gp，的所有這些氨基酸殘基也參與了與SIGK的接觸(表1)。盡管存在這樣的事實(shí)，但與G^接觸的PH結(jié)構(gòu)域的二級結(jié)構(gòu)(RH-PH環(huán)、aCT區(qū)域和p4鏈)與純螺旋結(jié)構(gòu)的SIGK肽完全不同(Lodowski，etal.(2003)見上文)。這一論點(diǎn)內(nèi)容在G(^與磷轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白結(jié)合的復(fù)合體中也再次呈現(xiàn)(Ford，etal.(1998)見上文)，其中同樣一組GPi殘基與一個結(jié)合配偶體相接觸，該結(jié)合配偶體有著與GRK2不同的二級結(jié)構(gòu)。值得注意的是，Gau的開關(guān)II區(qū)域形成一個a-螺旋，該螺旋的結(jié)合方向與SIGK肽幾乎相同。然而，Ga"的開關(guān)II與SIGK肽沒有序列上的相似性，但它包含一個與SIGK的Lys4幾乎定位在相同位置的賴氨酸(Lys210)(Goubaeva，etal.(2003)見上文)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>文；Wall,etal.(1998)見上文);磷轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，磷轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白'G卩,Y2復(fù)合體(Gaude仁etal.(1996)見上文)、GRK2，GRK2'G卩,Y2復(fù)合體(Lodowski,etal.(2003)見上文)；SIGK，SIGKG卩巾復(fù)合體；PLCp,PLC卩2/3Gpr/2復(fù)合體突變分析(Li，etal.(1998)見上文；Ford,etal.(1998)見上文)；AC,I/II型腺苷酸環(huán)化酶.Gp^2復(fù)合體突變分析(Ford,etal.(1998)見上文)；GIRK，Gp,"與GIRK1/4通道相互作用突變分析(Ford,etal.(1998)見上文)；Ca++，GplY2與N型或P/Q型鈣通道相互作用突變分析(Ford,etal.(1998)見上文；Agler，etal.(2003)/.Ge".P/^s/o/.121:495-510)。帶下劃線的殘基表示SIGK.Gpm相互作用中的重要?dú)埢?。最后一行表示靶?biāo)和SIGK界面間相同的殘基的百分?jǐn)?shù)。若將GPy的靶標(biāo)PLC(52、腺苷酸環(huán)化酶和GIRK和CCalB鈣通道的突變數(shù)據(jù)納入該分析，SIGK在GP上的足印結(jié)果與上述幾個靶標(biāo)的足印結(jié)果類似(Li，etal.(1998)見上文；Ford,etal.(1998)見上文)。G卩中構(gòu)成蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的13個殘基中的9個(Lys57、Tyr59、Trp99、Metl01、Leul17、Tyrl45、Metl88、Asp246和Trp332)在Ga、GRK2和磷轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白復(fù)合體中也作為接觸殘基存在(表l)。這些殘基表明GP的多種結(jié)合配偶體使用了相同的一組殘基。13個殘基中的另外3個(Aspl86、Asp228和Asn230)為SIGK和兩個其他的蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)所共用。13個氨基酸中的另外一個，即Val100,通過其主鏈上的氧與SIGK接觸，并且不參與其他復(fù)合體的結(jié)合相互作用。對突變干擾最敏感的SIGK結(jié)合殘基也最頻繁地參與與其他Gp結(jié)合配偶體的相互作用。SIGK是通過隨機(jī)肽噬菌體展示被鑒定的，其中，序列上不相關(guān)的多種肽似乎都與G(5,上的同一個蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)結(jié)合。由于SIGK能夠接觸的殘基和參與蛋白質(zhì)GPy靶標(biāo)的結(jié)合的Gp，殘基之間有大范圍的重合，因此SIGK是多個GPy結(jié)合反應(yīng)的竟?fàn)幮砸种苿?。相關(guān)性很高的SIRK肽對幾個G(5Y-依賴性通路均有作用；它阻斷酶測定中的Gp，介導(dǎo)的PLC|52、PLCp3和PI3K的激活，并引起基于細(xì)胞的測定中ERKI/I1的激活(Scott,etal.(2001)見上文；Goubaeva，etal.(2003)見上文)。所述效應(yīng)對SIGK中與G卩的表面相互作用的殘基的突變很敏感，因?yàn)楸彼釖呙鑼?shí)驗(yàn)已表明SIGK的Lys4、Ala5、Phe6、Ue8、Leu9和Gly10的在抑制GPr^對PLC卩2的激活中都起到重要的作用(Scott，etal.(2001)見上文)。另外，在細(xì)胞培養(yǎng)物中，SIGK的Leu9對SIGK激活MAPK通路的能力十分重要(Goubaeva,etal.(2003)見上文)。然而，SIRK并不阻斷對I型腺苷酸環(huán)化酶或N-型Ca"通道的調(diào)控的抑制，雖然它們的足印實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Ga的和PLCp2的非常相像(Scott，etal.(2001)見上文)。相反，G卩中可阻止SIGK進(jìn)行結(jié)合的突變并不會對與其他的GPy結(jié)合配偶體的相互作用產(chǎn)生相同的影響。例如，將Leul17突變成丙氨酸會減小Gp^2激活I(lǐng)I型腺苷酸環(huán)化酶和PLC(53的能力，以及Gp!Y2結(jié)合GRK2和SIGK的能力，但是對GIRK1/GIRK4鉀通道的激活、CCalB釣通道的激活以及PLC卩2的激活沒有影響(表1)(Li，etal.(1998)見上文；Ford，etal.(1998)見上文)。類似地，Gp^2的Trp332突變?yōu)楸彼釙p小Gp^2對SIGK的親和性并會損傷對II型腺苷酸環(huán)化酶、CCalB和PLC(32和PLC(53的刺激活性，但不會影響與GRK2的相互作用、GIRK1/GIRK4的激活或者I型腺苷酸環(huán)化酶的抑制(Li，etal.(1998)見上文；Ford，etal.(19卵)見上文)。Gp^2的Leul17和Trp332都是的Gat和Gc^結(jié)合位點(diǎn)的一部分(Wall,etal.(1995)見上文；Lambright，etal.(1996)見上文；Wall,etal.(1998)見上文)，Leul17的突變還會影響Gau與Gp^2的結(jié)合(Li,etal.(1998)見上文；Ford，etal.(1998)見上文)。與其他可阻斷異源三聚體形成的肽(Ghosh,etal.(2003)見上文)不同，SIGK可促進(jìn)不依賴于核苷酸交換的Gp^2從Go^的解離(Ghosh,etaL(2003)見上文；Goubaeva，etal.(2003)見上文)。例如，由GRK2的C-端獲得的肽會阻斷異源三聚體的形成(Ghosh,etal.(2003)見上文)，但是并不會促進(jìn)Gan.G(5^2亞基的解聚，盡管GRK2.Gp^2復(fù)合體的結(jié)構(gòu)表明了該肽可能使用了與SIGK相同的G^表面(Lodowski，etal.(2003)見上文)。不拘囿于理論，SIGK可以通過兩種才幾制中的任一種來促進(jìn)異源三聚體的解聚。SIGK可能誘導(dǎo)G&構(gòu)象的變化，這種變化會擴(kuò)展到SIGK結(jié)合位點(diǎn)之外的其他區(qū)域，并破壞GPi和Gan之間的其他相互作用。然而，Gp^2'SIGK的結(jié)構(gòu)顯示，SIGK在其結(jié)合位點(diǎn)本身之外并不引起G(^的顯著的構(gòu)象變化。第二種機(jī)制是基于Gau可以動態(tài)地與G(3的兩個表面的4壬一個解離并與之再結(jié)合這一假設(shè)，其中一個表面是G^頂面的開關(guān)II相互作用位點(diǎn)，其中SIGK以相似的方向結(jié)合，另一個表面是位于G^的一號槳葉片結(jié)構(gòu)上的N-端相互作用表面。從開關(guān)II界面的Gau暫時釋放可使得SIGK可以接近G卩i。如果SIGK的解離速度比Gail的N-端解離速度小，則會出現(xiàn)Gail從Gp完全釋放的現(xiàn)象。因此，與Gp頂表面結(jié)合的GRK2肽可能解離得太快以至于不能促進(jìn)Ga的解離。GpY相互作用的這一動力模型有生物學(xué)的關(guān)聯(lián)，因?yàn)樵S多G(^結(jié)合靶是與GP頂表面外部有結(jié)合，并且還可以短暫地試著與GP上的其他表面結(jié)合。GplY2的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)能夠識別一系列具有各種二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)配體說明它可能是優(yōu)先的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的一個實(shí)例(見例如Delano,etal.(2000)^"/e"ce287:1279-1283)。優(yōu)先結(jié)合表面具有高溶劑可及性、低極性和高度的構(gòu)象柔性等特征(Scott,etal.(2001)見上文；Maetal.(2001)Cw/r.0/7,7/.X&w".11:364-9;BoganandThorn(1998)/飾/.B/》/.280:1-9;ClacksonandWells(1995)5We證267:383-6;DeLano(2002)Oz/T.O/,".肌o/.12:14-20)。而且，優(yōu)先結(jié)合位點(diǎn)可能包含含量極高的所謂"熱點(diǎn)"，即如果被突變成丙氨酸則會使結(jié)合能降低至少10倍的殘基(DeLano(2002)見上文)。熱點(diǎn)已經(jīng)被用來描述蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-小分子的界面，通常一個表面上任何熱點(diǎn)的點(diǎn)突變都會完全阻止復(fù)合體的形成，甚至是在結(jié)合界面只掩蓋了總表面積中的幾百A2時也是如此(BoganandThorn(1998)見上文；ClacksonandWells(1995)見上文；Tha謂，etal.(2003)丄顛.O纖125:15280-1;Zhang,etal.(2003)/.278:33097-104)。這些標(biāo)準(zhǔn)在本發(fā)明中被用來評估作為蛋白質(zhì)表面的的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)，所述蛋白質(zhì)表面的化學(xué)組成和表面性質(zhì)使得該表面易于用作蛋白結(jié)合位點(diǎn)。在Gp的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的12個殘基中，有8個(Lys57、Tyr59、Leul17、Tyrl45、Aspl86、Metl88、Asn230、和Trp332)符合作為熱點(diǎn)殘基的能量標(biāo)準(zhǔn)。用丙氨酸置換這些殘基中何一個都會使GP^2對SIGK的結(jié)合性降低10倍。很明顯，這些氨基酸殘基在能量上都是十分重要的節(jié)點(diǎn)，有利于促進(jìn)SIGK的結(jié)合。Gp，的SIGK結(jié)合表面包括在熱點(diǎn)中顯示出的比例很高的幾種殘基(BoganandThorn(1998)見上文)。它們包括酪氨酸、色氨酸和精氨酸；既能形成極性又能形成非極性相互作用的大殘基。Gp的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的芳香族殘基的數(shù)量比其他表面的該殘基量顯著更多。相對于可接近GP殘基的8.5%的總非甘氨酸表面，38%的SIGK結(jié)合表面是由Phe、Tyr、His或Trp構(gòu)成的。因此，G卩的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)更加非極性；總體上，G(i的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)中62%為非極性的，而G卩表面可接近的殘基中非極性的為29%。而且，天冬酰胺和天冬氨酸在熱點(diǎn)表面上具有中度有利的分布，在G(5的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的13個殘基中占4個。這種芳香族和帶電荷殘基的組合使得在Gp的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)可以容納具有不同化學(xué)特性的結(jié)合配偶體。優(yōu)先結(jié)合表面被期望具有高度表面可接近性(DeLano，etal.(2000)見上文)。為了分析G卩的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的這種性質(zhì)，在殘基、主鏈和側(cè)鏈水平計(jì)算GP分子上總的可接近表面面積。Gp的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)上大部分的氨基酸的可接近性都不比其他類型的G(3氨基酸顯著更高。然而，5個殘基顯示出顯著地偏離平均值Tyr59、Trp99、Metl01、Leul17和Trp332。對于Trp99,側(cè)鏈表面的可接近性大大高于類型的平均值；Tyr59、Trp99和Metl01的主鏈可接近性超過平均值。Leul17的主鏈和側(cè)鏈可接近性都顯著高于平均值。構(gòu)象的柔性或適應(yīng)性已經(jīng)被認(rèn)為是優(yōu)先結(jié)合表面的重要的決定因素，因?yàn)檫@類表面能更好地結(jié)合在結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)靶(DeLano，etal.(2000)見上文)。根據(jù)幾個蛋白質(zhì)復(fù)合體環(huán)境中的相對位置變化可對殘基的柔定量。四個晶體結(jié)構(gòu)(GP^2.SIGK、Gpiy2.Gail、GP,Y2.GRK2、G(5^2.磷轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白)中所有Gp殘基的沒有形成復(fù)合體的G卩m的RMSD直方圖分析顯示，Gp的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)殘基僅呈現(xiàn)出略高于平均側(cè)鏈位置分散度(分別為1.42A和1.35A)，Trp99、Asp228和Trp332的側(cè)鏈相對于平均值的正向偏離最大(均大于2A)。特別地，七號片結(jié)構(gòu)內(nèi)的Arg314和Trp332向的隆凸外凸出10A的距離以與磷轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白相互作用。原子B因子也提供了一種測量構(gòu)象柔撓性的方法。在沒有形成復(fù)合體的結(jié)構(gòu)中，Trp99、Val100和Metl01的B因子都超過平均值至少一倍的方差(Trp99超過平均值2倍方差)。當(dāng)與Gau、GRK2、磷轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和SIGK復(fù)合體形成復(fù)合體后，結(jié)合位點(diǎn)的這些殘基變得更加有序，B值與平均值接近并且有些情況下低于平均值最多達(dá)一倍的方差。因此，Gp識別結(jié)構(gòu)各異的結(jié)合配偶體的能力并不需要Gp的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的大多數(shù)殘基的構(gòu)象都具有高度柔撓性。Gpi的結(jié)構(gòu)上的細(xì)微的改變足以使之容納一系列的共同演化結(jié)的合配偶體。結(jié)構(gòu)分析和突變分析證明Gp上的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)可以被看作是熱表面，共同演化以促進(jìn)與多種蛋白質(zhì)靶標(biāo)的緊密結(jié)合。然而，GPY作為熱表面的機(jī)制是復(fù)雜的。Trp332是唯一符合熱點(diǎn)所有四個標(biāo)多爭的殘基，而Tyr59和Trp99則是具有所測試的熱點(diǎn)殘基四個特征中的三個。在Gp的頂部表面還有其他殘基對突變干擾敏感并被應(yīng)用在與許多結(jié)合配偶體的相互作用中，但它們并未表現(xiàn)出所期望的熱點(diǎn)構(gòu)象撓性柔性、溶劑可及性或非極性特征。在這類殘基中，Lys57和Metl88特別引人關(guān)注，通過突變分析和與已知的G(3y復(fù)合體結(jié)構(gòu)的比較結(jié)果表明這兩個殘基在GP中均是能量上的顯著結(jié)合的決定殘基，但并不符合熱點(diǎn)殘基的任何其他的統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。因此，G(J的蛋白質(zhì)的相互作用位點(diǎn)的氨基酸殘基旨在包括Lys57、Tyr59、Trp99、Val100、Metl01、Leul17、Tyrl45、Aspl86、Metl88、Asp228、Asn230、Asp246和Trp332。用圖示的方法提供了大鼠G(5氨基酸序列上的這些殘基的位置如下mgemeqlkqeaeqlkkqiadarkacaditlaelvsglewgrvqmrtrrtlrghla;k;工zamhwatdskllvsasqdgklivwdtyttnkvha工p:lrsswv^tcayapsgnfvacgg^dnmcs工yslksregnvkvsrelsahtgzlsccrflddnts!tvtssgdttcalwd工etgqqktvfvghtg^c^slavspdyklf工sgacdasaklwdvregtcrqtftghes^igaicffpggea工ctgsddascrlfdlradqeltayshes工icgitsvafslsgrllfagyddfncnvwdslkcervgvlsghdnrvsc!lgvtadgmavatgs，sflki麗(GENBANK編號AAA62620;SEQIDNO:3),其中蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)殘基用下劃線表示。同樣，這些殘基在人的Gp有相同的位置，其氨基酸序列如下MSEIjEQLjRQEAEQIjRNQ工RDARKACGDSTLiTQ工TAGLDPVGR工QMRTRRTLRGHLAS工ZAM麗GTDSRLLVSASQDGKL工工WDSYTTNKVHA工PLRSSWV^TCAYAXSGNFVACGGyDN工CSIYSLKTREGNVRVSRELPGHTG工LSCCRFIjDDNQ工工TSSGDTTCALWDIETG③TVGFAGHSGpV^S!LSIAPNGRTFVSGACDAS工KLWDVRDSMCRQTF工GHESg工gAVAFFP，YAFTTGSDDATCRIjFD:LRADQEKLjMYSHDNI工CG工TSVAFSRSGRLIiAGYDDFNCN工WDAMKGDRAGVLAGHDNRVSCLGVTDDGMAVATGS，SFIjK工麗(GENBANK編號AAA35922;SEQIDNO:4)，其中蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)殘基用下劃線表示。與位于Gp的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的這些氨基酸殘基的至少一個有相互作用的試劑可以通過各種異源的非鍵合相互作用結(jié)合以貢獻(xiàn)結(jié)合能，所述非鍵合相互作用包括但不限于范德華力接觸(例如，與曱硫氨酸或亮氨酸)、極性接觸(例如，與天冬氨酸或天冬酰胺)或者二者的組合(例如，與賴氨酸、色氨酸或酪氨酸)。通常需要試劑與Gp的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個氨基酸殘基相互作用以增強(qiáng)該試劑對一種或多種G蛋白相互作用蛋白質(zhì)的特異性并因此增強(qiáng)該試劑對一個或多個G蛋白介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路的特異性。對試劑是否與p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)上的至少一個氨基酸殘基相作用的測定，可以通過基于對G^亞基與其他肽或蛋白質(zhì)(所述其他肽或蛋白質(zhì)為已知的可與gpy亞基相互作用的肽或蛋白質(zhì)，例如，SIGK肽、Ga亞基、或下游蛋白)之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行檢測的各種體外或體內(nèi)分析來實(shí)現(xiàn)。本文公開了體外測定的一個實(shí)例。所述測定由以下步驟組成獲得分離的G(3Y復(fù)合體；在存在有與p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)上至少一個氨基酸殘基相結(jié)合的肽(例如下述序列的SIGK肽或SIGK肽書f生物SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQidNO:9、SEQidNO:10、SEQidNO:11、SEQidNO:12或SEQIDNO:13)的條件下，使G(3y復(fù)合體與待測試劑相接觸；并用例如ELISA測定的方法檢測所述待測試劑對所述肽與p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的結(jié)合進(jìn)行抑制的能力。最初篩選鑒定的其他噬菌體展示的肽(Scott，etal.(2001)見上文)也可以被使用。或者，體內(nèi)測定可以被用來測定待測試劑是否與p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)上的至少一個氨基酸殘基相互作用。用一個例子說明，考慮使用雙雜交測定，在該測定中使待測試劑與表達(dá)GPy亞基的細(xì)胞和例如SIGK等肽相接觸，其中p亞基與例如DNA結(jié)合域等融合，sigk肽與激活域融合。當(dāng)sigk肽和與GPy的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)結(jié)合的時候，會誘導(dǎo)報(bào)告蛋白的表達(dá)。如果待測試劑破壞了SIGK肽與G^的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)結(jié)合，則會阻斷報(bào)告蛋白的表達(dá)。其他篩選例如成熟的計(jì)算篩選或者檢測G蛋白依賴性下游蛋白的活性(例如，PLCp的酶活性)的篩選也與與本文所7>開的測定一起被考慮。按照本發(fā)明的方法篩選的待測試劑，本文中也稱之為化合物，它通常從試劑或化合物庫中獲得。這類庫或者包括純的試劑的集合或者包括試劑混合物的集合。純的試劑的實(shí)例包括但限于蛋白質(zhì)、多肽，肽、核酸、寡核苷酸、碳水化合物、脂、合成或半合成的化學(xué)物質(zhì)和純化的天然產(chǎn)品。試劑混合物的實(shí)例包括但不限于原核或真核細(xì)胞和組織提取物以及發(fā)酵液和細(xì)胞或組織培養(yǎng)的上清液等。對于試劑混合物，本發(fā)明的方法不僅被用來鑒定具有所需活性的混合物粗品，而且還提供了對混合物中有活性的試劑的純化進(jìn)行監(jiān)測的手段，從而將其作為治療藥物進(jìn)行表征和開發(fā)。特別地，對于經(jīng)上述方法鑒定的混合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過公知的方法將其連續(xù)地分級分離，所述公知的方法包括但不限于沉淀、離心、過濾、超濾、選擇性消化、萃取、色鐠、電泳或復(fù)合物形成?？梢岳米畛醯臏y定法對所得到的每個子部分的所需活性進(jìn)行測定，直至得到純的有生物活性的試劑。庫篩選可以按本文所示例的方法進(jìn)行，或者也可以以能夠?qū)崿F(xiàn)快速制備和多反應(yīng)處理的形式進(jìn)行。待測試劑以及測定組分的儲液是手工制備的，隨后的移液、稀釋、混合、洗滌、孵育、樣品讀數(shù)和數(shù)據(jù)收集都是通過市售的自動移樣儀、自動工作站和用于對測定中產(chǎn)生的信號進(jìn)行檢測的分析儀來完成的。這些檢測儀的實(shí)例包括但不限于發(fā)光計(jì)、分光光度計(jì)和熒光計(jì)以及測量放射性同位素衰變的儀器。為了進(jìn)一步評估使用本發(fā)明的篩選方法鑒定化合物或復(fù)合物的有效性，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可以使用與G蛋白相關(guān)的任何一種特定疾病或病癥的一個才莫型系統(tǒng)對化合物或復(fù)合物的吸收、分布、代j射和排泄以及在急性、亞慢性和慢性研究中的潛在毒性進(jìn)行評估。例如，在NG108-15/D2細(xì)胞和大鼠原代海馬神經(jīng)元中PY抑制因子的過量表達(dá)可以通過阻止腺苷酸環(huán)化酶的Py激活以阻斷s-阿片和大麻素受體誘導(dǎo)的PKACa的易位和基因表達(dá)(Yao,etal.(2003)TVa".^car/.fAS^100:14379-84)。因此，為了分析本發(fā)明中的化合物或復(fù)合物用于治療成癮性的效果，使NG108-15/D2細(xì)胞和/或大鼠原代海馬神經(jīng)元與所述化合物或復(fù)合物接觸，并且測定其對PKACa的易位的作用。阻斷8-阿片和大麻素受體誘導(dǎo)的PKACa的易位的化合物或復(fù)合物可用于對成癮性的治療。本發(fā)明中的化合物或復(fù)合物預(yù)防或治療心力衰竭的效果可以通過鼠擴(kuò)張性心肌病的遺傳模型進(jìn)行分析，所述遺傳模型涉及切除編碼肌肉LIM蛋白的肌肉限制性基因(MLP一)(Arber，etal.(1997)CW/88:393-403)。應(yīng)用這個模型已經(jīng)證明，與(5y結(jié)合并阻斷對(5-腎上腺素能受體激酶1活性的P，依賴性激活的P-腎上腺素能受體激酶1抑制因子BARK-ct，可以在異丙腎上腺素存在與不存在的情況下增強(qiáng)心臟的收縮(Koch,etal.(1995)5We證268:1350-3)，并且恢復(fù)左心室的大小和功能(Rockman,etal.(1998)iVW/.Sc/.95:7000-7005)。與之類似，本發(fā)明中阻斷P-腎上腺能素受體激酶1活性的P，依賴性激活的化合物或復(fù)合物可用于阻止或治療心力衰竭。本發(fā)明中的化合物或復(fù)合物預(yù)防阿片耐受的作用可以通過急性(Jiang，etal.(1995)/.尸/m/vwtfco/.7T^r.273:680-8)和慢性(WeHs，etal.(2001)/./^flr附"co/.Ex/;.7T^r.297:597-605)依賴型才莫型系統(tǒng)進(jìn)4亍分析，其中，將本發(fā)明中的化合物或復(fù)合物注射入小鼠的腦室內(nèi)，并選擇一類阿片樣物質(zhì)(例如嗎啡)測定耐受性。能夠減少為達(dá)到鎮(zhèn)痛效果所需的阿片樣物質(zhì)的量的化合物或復(fù)合物可用于預(yù)防阿片樣物質(zhì)的耐受。PLC-(J2、PLC-(53和PI3Ky已知參與化學(xué)引誘物介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。PI3K7缺陷型小鼠失去了嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生PtdIns(3，4，5)P3、嗜中性粒細(xì)胞遷移和用T細(xì)胞-非依賴性抗原羥基硝基苯基-FICOLLTM免疫產(chǎn)生含X鏈的抗體的能力(Li，etal.(2000)Sc/e"ce287:1046-1049)。缺少PLC-卩2和PLC-(i3的小鼠的嗜中性粒細(xì)胞中Ca"釋放、超氧化物的產(chǎn)生和MAC-1的上調(diào)的功能受損(Li，etal.(2000)見上文)。而且，PLC-P2缺陷型小鼠表現(xiàn)出不同類型的白細(xì)胞群的趨化性增強(qiáng)，并對細(xì)菌、病毒和免疫復(fù)合物敏感(Jiang，etal.(1997)7VW/.tAS^94(15):7971國5)。因此，為了分析本發(fā)明中的化合物或復(fù)合物對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，可給予小鼠所述化合物或復(fù)合-物，并測定其對嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生PtdIns(3，4，5)P3、嗜中性豐立細(xì)胞遷移、Ca"釋放、超氧化物的產(chǎn)生和用T細(xì)胞-非依賴性抗原羥基硝基苯基-FICOLLTM免疫產(chǎn)生含L鏈的抗體等能力的作用。選擇性加強(qiáng)PLC-P2和PLC-卩3和/或阻斷PI3Ky激活，從而抑制PtdIns(3,4，5)P3的產(chǎn)生、嗜中性粒細(xì)胞遷移和Tl-Ig^的產(chǎn)生的化合物或復(fù)合物，可用于治療炎性病癥，例如關(guān)節(jié)炎、變態(tài)反應(yīng)、克羅恩病等。選擇性阻斷例如PLC-P2激活從而有利于嗜中性粒細(xì)胞遷移的化合物或復(fù)合物可用于促進(jìn)對細(xì)菌和病毒感染的免疫反應(yīng)。使用本發(fā)明的篩選方法已經(jīng)鑒定了各種化合物或復(fù)合物，所述化合物或復(fù)合物與Gp亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)相結(jié)合以干擾或加強(qiáng)生理學(xué)相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用(例如，Ga亞基相互作用和PLCp相互作用)，從而調(diào)節(jié)G蛋白信號傳導(dǎo)通路的活性。因此，本發(fā)明的一個實(shí)施方案是為具有式I結(jié)構(gòu)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>式I具有式I結(jié)構(gòu)且示出了各種取代基R基團(tuán)的示例性化合物包括但不限于如下所示化合物及其可藥用鹽和復(fù)合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>本發(fā)明的另一個實(shí)施方案為具有式II結(jié)構(gòu)的化合物NSC306711與G(5的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)結(jié)合的其他示例性化合物包括但不局限于如下化合物及其可藥用鹽和復(fù)合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>　NSC201400<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>NSC19916本文公開的示例性化合物旨在包括所有對映異構(gòu)體、異構(gòu)體或互變異構(gòu)體，也包括這些化合物的保留了原化合物生物活性的衍生物。本發(fā)明的示例性化合物首先選自計(jì)算機(jī)篩選結(jié)果，從而鑒定與新的Gp的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)結(jié)合的配體。計(jì)算機(jī)篩選包括用SYBYL分子模擬軟件，按本文公開的X-射線結(jié)構(gòu)中確定的位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，模擬G卩的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)。計(jì)算機(jī)對接篩選采用的是美國國家癌癥研究所的1900化合物庫，其中所述化合物對Gp的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的對接試驗(yàn)用FLEXX(Tripos,Inc.,St.Louis,MO)進(jìn)4亍對接，用CSCORE(Tripos,Inc.)來評估對接結(jié)構(gòu)的能量和適合程度。產(chǎn)生依賴算法的化合物列表和相互作用的結(jié)構(gòu)模型，所述化合物被預(yù)測與Gp的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)相互作用。用本文〃>開的噬菌體ELISA結(jié)合測定法對選定的化合物進(jìn)行接下來的分析，以確定這些化合物是否能結(jié)合Gp的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)并干擾該表面的蛋白質(zhì)相互作用?；衔颪SC201400和NSC119916的ICso值分別是100nM和5^tiM，其他化合物在基于ELISA的檢測中被發(fā)現(xiàn)與GPy結(jié)合的親和性至少為50//M,并會干擾肽在蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的相互作用(圖1)。在噬菌體ELISA測定中對這些化合物進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)這些化合物對Gp的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)有較高的親和性，并且與它們相互作用的氨基酸殘基和與SIGK相互作用的氨基酸殘基相似。表2SIGKNSC30820NSC12155NSC117079NSC23128NSC402359NSC109268Lys57Tyr59:Lys57Tyr59Gln75!Lys57Ty:r59Gln75Ijys57Tyr59VallOOTrp99Trp99Trp99MetlOl:Leul17!Leul17Tyrl45Aspl86Metl88Asp228Asn230Asn230Asn230Cys204Asp228Asn230Asp246Asp246Th:r274Asp246Trp332Arg314Arg3141.C50100nM13岸43;UM16//M2,13,S工GKNSC125910NSC119910NSC30671Liys57Tyr59Liys57Lys57Tyr59Tyx59Tyr59Trp99Trp99Trp99VallOOVallOOMetlOlMetlOlLeul17lieul17Leul17Tyrl45Aspl86Metl88Metl88Cys204Asp228Asp228Asn230Asp246Thr274Ser316Trp332Trp332Trp332ic5068/^M100nM7拜帶下劃線的殘基表示在SIGK.Gp"2相互作用中的重要?dú)埢Ｗ詈笠恍斜硎久糠N化合物的ICs。值。為了進(jìn)一步說明這些化合物的應(yīng)用，已經(jīng)證明NSC119910可阻斷Ga亞基和GPy亞基間的相互作用(圖2)并抑制GPy亞基抑制與生理學(xué)靶標(biāo)的相互作用的能力，例如基于減小PLCP的酶活性來抑制體外實(shí)驗(yàn)中與PLC卩的相互作用(圖3)。反應(yīng)和炎癥是重要的。PI3Ky參與Tl-Ig^的產(chǎn)生，對于PI3Ky缺陷型小鼠，它缺乏中性粒細(xì)胞遷移(Li，etal.(2000)287:1046-9)。PLC通路參與趨化作用的下調(diào)和高炎癥反應(yīng)病癥(Li，etal.(2000)見上文)。因此就NSC119910是否抑制GPy/PLC相互作用并阻斷PLC激活進(jìn)行了測定。基于fura-2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，由于細(xì)胞內(nèi)貯存的陽離子的釋放，而產(chǎn)生的fMLP-刺激的嗜中性粒細(xì)胞的胞質(zhì)Ca"濃度會突然升高這一反應(yīng)(Anderson,andMahomed(1997)C7/"./附wwwo/.110:132-138;Geiszt，etal.(1997)/.C7ie附.272:26471-26478)被10的NSC119910抑制(圖4)。在NSC119910存在時，借助于ATP的[Ca^升高沒有被顯著地抑制(圖4),這表明該化合物對依賴fMLP的Ca"濃度升高的作用是特異的。而且，熒光降到峰值的一半所用的時間沒有被顯著地影響(圖5)。這些結(jié)果表明NSC119910能夠在體內(nèi)抑制可導(dǎo)致PLC激活的PLC/G-蛋白質(zhì)相互作用。阿片受體H、A和K通過a和(5y亞基與Gj和G。蛋白偶聯(lián)，并調(diào)控多個信號傳導(dǎo)通路。具體而言，在PLC-P3缺陷型小鼠中已顯示出阿片信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用增加，這表明PLC通過改變阿片依賴性的信號傳導(dǎo)組分抑制阿片4言號傳導(dǎo)(Xie，etal.(1999)7VW/.Sc/.f/5L496:10385-103卯)。假設(shè)PLC-卩3在阿片反應(yīng)中是作為負(fù)調(diào)控因子起著重要作用，可就NSC119910是否會抑制PLC-P3的激活并由此增強(qiáng)嗎啡誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用進(jìn)4亍測定。按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案(Xu，etal.(1998)丄漁r附腳/.7Ti，戸A284:196-201)在小鼠的腦室內(nèi)注射100腿ol的NSC119910和不同劑量(0.1、0.3、l和3nmo1)的嗎啡。注射后20分鐘在55。C熱水甩閃尾試驗(yàn)中測試小鼠的鎮(zhèn)痛反應(yīng)(Wells，etal.(2001)J.T^ww"co/.7T^ni/^"/1.297:597-605)。僅注射嗎啡的組的EDso值為0,74腿ol，而NSC119910+嗎啡的組的ED50為0.065nmol。兩個ED50值的差異顯示出嗎啡的劑量-反應(yīng)曲線向左偏移11倍(表3),這表明當(dāng)聯(lián)合給予NSC119910和嗎啡時，僅需要較少量的嗎啡就可以達(dá)到相似的鎮(zhèn)痛效果。因此，聯(lián)合給予阿片樣物質(zhì)和本發(fā)明的化合物可降低患者的阿片使用劑量，從而減少阿片樣物質(zhì)耐受的產(chǎn)生。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>已經(jīng)證明NSC119910能有效地調(diào)節(jié)G-蛋白質(zhì)相互作用，一系列用模擬軟件鑒定的NSC119910結(jié)構(gòu)類似物被用來分析與Gp的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的結(jié)合。這些類似物及其與G(iY的對應(yīng)的親和性是NSC119888-不結(jié)合NSC9。37-不結(jié)合<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>其中，Rt可以是取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的環(huán)烷基或取代的或未取代的環(huán)烯基；R2和R3獨(dú)立地為氫或羥基。在某些具體的實(shí)施方案中，R2和Rs均為羥基。本文使用的烷基是指僅由碳和氫原子組成的、完全飽和的、具有1個到8個碳原子的直鏈和有支鏈的烴鏈，烯基意在指包括至少一個碳-碳雙鍵、具有2至約10個碳原子的直鏈或有支鏈的脂肪族烴基團(tuán)。環(huán)烷基表示大約3至12個碳原子的非芳香族單環(huán)或多環(huán)系統(tǒng)。本文所使用的術(shù)語環(huán)烯基是指含大約3至12個碳原子并具有至少一個碳-碳雙鍵的單環(huán)或多環(huán)系統(tǒng)，。取代的烷基、環(huán)烷基、烯基或環(huán)烯基的取代基包括但不限于羥基、羧基、卣素(例如，氟、氯、溴或碘)或者取代的或未取代的烷基。除了nsc157411和nsc122390之外，nsc119910的類似物一般在式III的112和R3位上含有羥基，這似乎有助于結(jié)合；并且在式III的Ri上含有羧基取代的烷基、環(huán)烷基、烯基或環(huán)烯基取代基，它們似乎可調(diào)節(jié)活性、但非結(jié)合所需。因此，本發(fā)明的又一個實(shí)施方案為具有式in結(jié)構(gòu)的化合物及其可藥用鹽和復(fù)合物。對nsc119910的類似物選擇性調(diào)節(jié)plc-(52和plc-卩3激活的能力進(jìn)行了分析。在該分析中，plc-(52和plc-P3被純化并且在存在或不存在pY以及存在或不存在類似物的情況下，分別測定了PLC的酶活性。該分析的結(jié)果表明nsc119911似乎對plc-P2激活的阻斷比對plc-P3激活的阻斷更有效，nsc201400雖然阻斷肽和Py的結(jié)合但選擇性增強(qiáng)了plc-P3的激活(圖6)。而且，雖然nsc119910、nsc和類似物nsc119893阻斷€32+的流動，但是它們在其間并不干擾歴1^-依賴性erk的激活。類似地，nsc119911、nsc158110和nsc201400也不干擾fMLP-依賴性ERK的激活。本文公開的化合物和那些被發(fā)現(xiàn)與Gp的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)結(jié)合并干擾該表面上的蛋白質(zhì)相互作用的化合物可以被應(yīng)用在調(diào)節(jié)(即阻斷或抑制，或者增強(qiáng)或促進(jìn))G蛋白的至少一種活性的方法中。所述方法包括在體外和體內(nèi)使G蛋白與有效量的一種試劑相接觸，所述試劑與G蛋白p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基相互作用的，從而調(diào)節(jié)g蛋白的至少一種活性。試劑的有效量是指該量使G蛋白的活性降低或升高10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、卯％或100%。該活性的監(jiān)測可以基于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或檢測下游蛋白質(zhì)活性的酶測定進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，對g蛋白的一種或多種活性的調(diào)節(jié)可用于在模型系統(tǒng)中選擇性地分析g蛋白信號傳導(dǎo)事件以及預(yù)防或治療與g蛋白Py亞基信號傳導(dǎo)有關(guān)的疾病或病癥。對預(yù)防或治療特定疾病或病癥的化合物的選擇，將取決于與該疾病或病癥的依賴g蛋白的特定的下游蛋白。例如，與Gp的Lys57、Trp99、Metl01、Leul17、Aspl86、Asp228、Asp246和/或Trp332相互作用的化合物可用于預(yù)防或治療腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)的疾病和病癥，而與Lys57、Tyr59、Trp99、Metl01、Leul17、Tyrl46、Metl88、Asp246和/或Trp332相互作用的化合物對GRK2-相關(guān)疾病或病癥可能會更適合。考慮到了這種對特定下游蛋白的選擇性可能會減少那些對g蛋白Py亞基信號傳導(dǎo)相關(guān)的全部活性均抑制的拮抗物帶來的副作用。預(yù)防或治療通常包括如下步驟首先是識別出患有g(shù)蛋白Py亞基的至少一種活性相關(guān)的疾病或病癥(例如，充血性心力衰竭、成癮性、高炎癥反應(yīng)或低炎癥反應(yīng)或者阿片耐受)的患者或具有該患病風(fēng)險(xiǎn)的患者。利用例如標(biāo)準(zhǔn)臨床實(shí)踐方法確定這類個體后，向所述個體給予藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的本文公開的或者利用本發(fā)明的篩選方法鑒定的選擇性化合物。大部分情況下的治療針對的是人，但是在表述上并不排除用于對農(nóng)畜例如家畜和家禽，和寵物例如狗、貓或馬的治療。對化合物的劑量和有效量的選擇是根據(jù)這樣一種所需結(jié)果進(jìn)行的，所述結(jié)果為患者中與g蛋白(3y亞基信號傳導(dǎo)有關(guān)的疾病或病癥的至少一種指征或癥狀得到減輕或逆轉(zhuǎn)。例如，與充血性心力衰竭相關(guān)的某些一般性指征或癥狀包括心率加快、呼吸頻率增加、呼吸比普通人快且深、呼吸急促喘息、易怒、煩躁、無端發(fā)怒、腫脹、浮腫、水腫、體重突然增加或緩慢增加、食欲減弱、出汗、咳嗽、淤血或喘鳴、活動水平降低、疲勞、倦怠、排尿減少或者膚色蒼白、起斑或發(fā)暗。與成癮性相關(guān)的一般性指征和癥狀包括但不限于無論是在家、學(xué)?；騿挝粚λ说膽B(tài)度、表現(xiàn)和關(guān)系的改變和其他行為的改變。在預(yù)防或治療炎癥時，選擇性地調(diào)節(jié)PLC通路或PI3Ky會對不同的炎癥的治療有幫助。例如，為了減少嗜中性粒細(xì)胞向炎癥(例如關(guān)節(jié)炎)位點(diǎn)的遷移，需要給予一種化合物，所述化合物選擇性地抑制相反，為了促進(jìn)炎癥應(yīng)答，例如為了增強(qiáng)對細(xì)菌或病毒感染的免疫應(yīng)答，需要給予選擇性抑制PLC通路激活的化合物。藥物組合物可以是可藥用鹽或復(fù)合物的形式，并可以以在可藥用載體中使用適當(dāng)?shù)膭┝坎⒌男问教峁?。這些藥物組合物可以通過本領(lǐng)域熟知的方法和包含載體制得。關(guān)于這些方法和配料的一份公認(rèn)的總覽是Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,AlfonsoR.Gennaro，editor,20thed.LippincottWilliams&Wilkins:Philadelphia,PA，2000。可藥用載體、組分或運(yùn)載劑，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑包嚢材料，參與將測試化合物從身體的一個器官或部分運(yùn)送或轉(zhuǎn)運(yùn)至身體的另一個器官或部分。每種載體都必須在可與制劑中的其他成分配伍并且對患者無害這些方面是可接受的?？梢杂米骺伤幱玫妮d體的物質(zhì)的實(shí)例包括糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；西黃蓍膠粉；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；油類，例如花生油、棉子油、紅花油、麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原的水；等滲鹽水；格林氏液；乙醇；pH緩沖溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；和制劑中使用的其他無毒可配伍物質(zhì)。組合物中還可以存在濕潤劑、乳化劑和潤滑劑，例如月桂碌^酸鈉和硬脂酸4美，以及著色劑、包衣材料、甜味劑、調(diào)味劑和增香劑、防腐劑和抗氧化劑。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)實(shí)踐，本發(fā)明的組合物可以采用胃腸外給藥(例如，靜脈、腹腔內(nèi)、皮下或肌肉注射)、局部給藥(包括含服和舌下)、口服、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)或直腸內(nèi)等方式給藥。劑量水平的選擇取決于各種因素，包括所使用的本發(fā)明的具體化合物的活性、給藥途徑、給藥時間、使用的具體化合物的排泄或代謝速率、治療時間、與所述使用的具體化合物聯(lián)合使用的其他藥物、化合物和/或材料、接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀態(tài)、總體健康狀況和過往醫(yī)療史，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中已知的類似因素。具有本領(lǐng)域普通專業(yè)技能的醫(yī)生或獸醫(yī)能夠很容易地確定所需的藥物組合物的有效量，并給出處方。例如，醫(yī)生或獸醫(yī)可以從化合物的劑量水平低于達(dá)到理想效果所需的劑量水平開始，然后逐步增加劑量直至達(dá)到理想的效果。這被認(rèn)為是在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員必備的能力范圍之內(nèi)的，他們可以查閱關(guān)于具體化合物或類似化合物的已有文獻(xiàn)確定最佳劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，通過閱讀本文公開的內(nèi)容，根據(jù)本文中定?；谟?jì)算預(yù)測和/或基于它們包含式I、II或III的結(jié)構(gòu)或與本文/>開的示例化合物相類似的結(jié)構(gòu)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選出用于篩選的其他的化合物。通過下面的非限制性的實(shí)施例來更詳細(xì)地描述本發(fā)明。實(shí)施例1:材料狀購買自AlphaDiagnosticInternational(SanAntonio,TX)或SIGMA-Genosys(St.Louis,MO)，進(jìn)行HPLC純化到90%以上，并通過質(zhì)^普測定分子量。Ni-NTA瓊脂糖購買自Q1AGEN(Valencia,CA)?？股锼氐鞍祖溍顾匕鼉羝さ木郾揭蚁┲榱Ｙ徺I自Spherotec(Libertyville，IL)。HRP綴合的抗M13抗體購買自AmershamBiosciences(Piscataway，NJ)。HRP綴合的中性鏈親和素(neutravidin)購買自Pierce(Rockford，IL)。除非另外指明，所有的分子生物學(xué)試劑均購買自INVITROGENTM(Carlsbad,CA)。實(shí)施例2:GP^2和SIGK肽的表達(dá)和純化攜帶野生型牛G[^cDNA和N-末端(His)6-標(biāo)記的牛Gy2cDNA的桿狀病毒被用來產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)。用高滴度的G^和GY2的桿狀病毒感染High-5細(xì)胞(INVITROGENTM，Carlsbad,CA;2乂106個細(xì)胞/mL)。用經(jīng)改動的標(biāo)準(zhǔn)方法(KozazaandGilman(1995)/.必,V/.C7^附.270:1734-41)純化Gp^2。所有步驟均在4°C下完成。在感染后的60個小時以2600fif離心收獲細(xì)胞，然后按照每升細(xì)胞培養(yǎng)物50mL裂解緩沖液(20mMHEPES,pH8，150mMNaCl，5mMp誦ME,1mMEDTA，1mLSIGMA⑧蛋白酶抑制劑混合物P-2714)的比例將細(xì)胞重懸。用聲裂法裂解細(xì)胞以2600g離心以沉淀膜。將膜搗碎從而在100mL裂解緩沖液中重懸并勻漿。加入1%的蘆布若爾(C12E10，SIGMA,St.Louis，MO)并攪拌使膜溶解，得到的溶液以125,000g超速離心使之澄清。將上清液上樣到Ni-NTA瓊脂糖(QIAGEN,Valencia,CA)柱上，用裂解緩沖液+1%的蘆布若爾平衡。沖柱，并且利用Ni-A(20mMHEPES，pH8，0.4MNaCl，5mMp-ME，0.5%,布若爾，0.15%膽酸鹽)和Ni-B(20mMHEPESpH8，0.1MNaCl，5mMp畫ME，0.25%蘆布若爾，0.3%膽酸鹽)緩沖液以膽酸鈉置換聲布若爾。用Ni-C(20mMHEPESpH8,0.01MNaCl，5mMp-ME,1%膽酸鹽，200mM咪唑)洗脫Gp^2。將洗脫液加樣到預(yù)先用QA(20mMHEPES，pH8，5mMp-ME，0.7%CHAPS，1mMEDTA)平衡過的HITRAPTMQ(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)柱上，。用梯度的QB(QA+1.0MNaCl)洗脫GplY2。含有GplY2的部分用SDS-PAGE分析并匯集。用串聯(lián)的SEPHADEX75:SEPHADEX200柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)進(jìn)行凝膠過濾，柱子預(yù)先用GF+CHAPS(20mMHEPES,pH8，150mMNaCl,10mMp-ME，1mMEDTA,0.7%CHAPS)緩沖液平衡。純化產(chǎn)率通常為每升細(xì)胞培養(yǎng)物1mg的4吏用成熟的方法合成S1GK肽(Ser-Ile-Gly-Lys-Ala-Phe-Lys-IIe-Leu-Gly-Tyr隱Pro-Asp畫Tyr-Asp;SEQIDNO:2)。肽的末端沒有經(jīng)過修飾；在VYDACC4半制備柱上通過反相HPLC色譜法進(jìn)行純化。實(shí)施例3:晶體學(xué)將過量1.5摩爾的肽SIGK加入到GplY2中，用于結(jié)晶的Gp,y2.SIGK復(fù)合體的濃度是7mg/mL。利用等體積(2jiL)的蛋白質(zhì)和結(jié)晶溶液(15-17%PEG4000，100mMHEPES,pH7.5，0.01-0.05M醋酸鈉，10%甘油)，通過在20。C下進(jìn)行蒸氣擴(kuò)散培養(yǎng)晶體。晶體的直徑在一周以內(nèi)達(dá)到150〃附x50//附x20〃柳。晶體用15%甘油進(jìn)行冷凍防護(hù)后在液氮中冷凍。Gj5r/2.SIGK的天然結(jié)晶用先進(jìn)光源(AdvancedLightSource,ALS)光束線8.2.1和8.2.2(Berkeley,CA)和先進(jìn)光子源(AdvancedPhotonSource,APS)光子束線BM-19(Chicago,IL)進(jìn)行篩選。從ALS8.2.2獲得的數(shù)據(jù)集用來確定結(jié)構(gòu)。篩選了100個以上的晶體，用3于確定結(jié)構(gòu)的衍射限制在7A至2.7人的數(shù)據(jù)集。用HKL2000軟件包(OtwinowskiandMinor(1997)In:Af^oA/五"zy附o/ogj;，Vol.276:307-326)對衍射數(shù)據(jù)建立索引、整合和標(biāo)度(表4)。晶體的空間群為P2,2A。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>該終模型中包括Gp,的340個殘基中的2-340號殘基，Gy2的68個殘基中的7-52號，SIGK的15個殘基中的1-13號和37個水分子。'括號中數(shù)字表示最高分辨率骨架，2.8-2.7A。2Rsym=Sh&|Ii(h)■<1(h)>|/2h&Ii(h),其中Ii(h)和〈1(h)>分別為第i個和反射h強(qiáng)度的平均測量值。3該終模型中包括Gp,的340個殘基中的2-340號殘基、Gy2的68個殘基中的7-52號和SIGK的15個殘基中的1-13號。4Rwork=Sh||F。(h)|■lFc(h)||/Eh|F。(h)|,其中F。(h)和Fc(h)分別為結(jié)構(gòu)因子的觀測值和計(jì)算值。在最后計(jì)算R-因子的時候沒有用1M的閾值。5Rfree是從由隨機(jī)選擇的8%的數(shù)據(jù)組成的反射測試集獲得的R-因子。6位于N-端的B-因子大于80A2，包括Gp,的2-41殘基和GY2的7-13殘基。利用禾呈序PHASER(Storoni，etal.(2004)」c似CVjs似〃ogADfi,V/.CVWtf〃ogr.60:432-8;Read(2001)爿c似OjW"〃o^;7)B/o/.OjWtf//ogr.57:1373-82)，通過分子置換方法解析GPm.SIGK復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。Gp^2'GRK2復(fù)合體(IOMW，100%的序列一致性)中的Gp"2的等價(jià)物被用作搜索模型。利用CNS1.1版本(Adams，etal.(1997)iVoc.7Vf^/.JcflA5"c/.C/5^494:5018-23;Briinger，etal.(1998)Oj^似〃^m/^/m5"e",》w2>54:卯5-921)中的最大似然法使目標(biāo)最小化進(jìn)行晶體的主體精修以后，使用模擬退火、Powell最小化和B因子精修聯(lián)合對模型進(jìn)行進(jìn)一步的修正。經(jīng)過相位修正獲得的含oA-權(quán)的2Fo-Fc電子密度圖顯示出SIGK肽的十個殘基的清晰的主鏈密度，并且?guī)讉€S1GK肽的殘基的側(cè)鏈密度也可辨認(rèn)。后續(xù)的模型構(gòu)建用O(Jones,etal.(1991)Oj5^〃ognz/7/r/cflj47:110-119)冗成，接著用CNS進(jìn)行模擬退火、Powell最小化和B因子精修。PROCHECK(Laskowski,etal.(1993)/.」/7//.CV"似〃ogm//^26:283-291)分析表明所有殘基表現(xiàn)為主鏈構(gòu)象大部分傾向于或額外允許cp,\|/空間的區(qū)域(表4)。各結(jié)構(gòu)間的表面可及性、GP^2.SIGK接觸和RMSD的計(jì)算是用CNS組件中的程序?qū)崿F(xiàn)的。實(shí)施例4:生物素化的Gp^2(b-PY)和b-Py突變體的構(gòu)建和部分純化野生型和Gj5i突變體由在GJ^的氨基末端上游的賴氨酸處編碼生物素化位點(diǎn)的桿狀病毒載體PDW464產(chǎn)生(Goubaeva,etai.(2003)見上文)。突變體通過標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案的重疊延伸PCR產(chǎn)生。野生型和突變型的G(5,的構(gòu)建體由具有20個氨基酸的生物素受體肽(BAP)序列構(gòu)成，所述序列與大鼠G^亞基上的氨基端內(nèi)嵌融合。當(dāng)在Sf9細(xì)胞中共表達(dá)生物素全酶合成酶(BirA)時，在體內(nèi)Gp,亞基的BAP中的特異賴氨酸受體殘基以共價(jià)的形式生物素化。利用這個方法，每升Sf9昆蟲細(xì)胞中可以獲得純化的蛋白質(zhì)中的1-2mg蛋白質(zhì)。因?yàn)槭删wELISA測定中4吏用的蛋白質(zhì)量為45ng，一次純化的蛋白質(zhì)就足以進(jìn)行10,000至30,000次結(jié)合測定。按照生產(chǎn)商的4吏用說明書(GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD)，通過BAC-TO-BAC⑧系統(tǒng)產(chǎn)生桿狀病毒。用0.5mL的編碼(His)6-Go^的桿狀病毒、4mL的Gh病毒和4mL的野生型或突變的病毒三次感染Sf9細(xì)胞(200mL)。用所述的經(jīng)改動的成熟方法(KozasaandGilman(1995)見上文)在感染后的60小時純化二聚體。細(xì)胞沉淀物在4mL的裂解緩沖液(50mLHEPES，pH8.0、3mMMgCl2、10mM卩畫巰基乙醇、lmMEDTA、100mMNaCl、10pMGDP和蛋白酶抑制劑)中經(jīng)過三個液氮凍融循環(huán)過程裂解。用1%的膽酸鈉溶解膜，經(jīng)過20分鐘的100,000g超速離心使之澄清，將其稀釋到含0.5%的,布若爾的緩沖液中，與Ni-NTA樹脂混合。經(jīng)過充分沖洗后，在室溫下將珠粒與含有的50mMMgCl2、10mMNaF、10nMAlCl3、1%膽酸鹽和5mM咪唑的緩沖液混合從而使Gp^2亞基從其結(jié)合的Gau上洗脫，洗脫持續(xù)1小時。b-PY和b-Py突變體的濃度用比較免疫印跡法和化學(xué)發(fā)光法分析。用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，并用HRP-中性鏈親和素(Pierce,Rockford，IL)檢測?；瘜W(xué)發(fā)光信號用EPI-CHEMIITM暗房系統(tǒng)(UVPBioimagingSystems,Upland,CA)測量。洗脫的b-(3y二聚體的濃度通過與至少經(jīng)過兩次凝膠分離而完全純化的100%生物素化的G(5j2的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較測得。實(shí)施例5:b-(3y結(jié)合測定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行噬菌體ELISA測定以評估肽與野生型和突變型的b-(5y的結(jié)合(SmrckaandScott(2002)E7i^v附o/.344:557-76)。簡述如下，將l//g的抗生物素蛋白鏈霉素固定在96-孔板上，4。C過夜。用100//L含有2%牛血清白蛋白(BSA)的Tris緩沖生理鹽水(TBS)在4。C下1小時對各孔進(jìn)行封閉，然后用lxTBS/0.5%TWEEN⑧洗滌三次。每個孔中加入40nL含25nMbG卩^2的TBS/0.5%TWEEN,并在4。C下孵育1.5小時。洗滌各孔，然后加入1xl06至lxl01G個噬菌體顆粒，4。C下酵育3個小時。然后用TBS/0.5%TWEEN⑧洗滌各孔六次后，加入40jiL的1:5000稀釋度的抗-M13的抗體(Pharmacia,Uppsala,Sweden),并在室溫下孵育1個小時。洗滌各孔后，加入40nL2，2'-連氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)并在405nm的波長下進(jìn)行比色反應(yīng)的監(jiān)測。在每次讀數(shù)時減去非特異性結(jié)合。從部分純化的b-(5Y亞基得到信號與從完全純化的b-PY亞基得到的信號類似。對GdirGPo^結(jié)合的阻斷效應(yīng)的評估是在存在或不存在SIGK的條件下，同時向50pM固定化的b-p丫中加入200pM的FITC-Gai并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Ghosh，etal.(2003)見上文；Sarvazyan,etal.(1998)/.5,》/.C&附.273:7934-40)，用流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)合到珠粒上的FITC-Gai的量。實(shí)施例6:GPn^SIGK復(fù)合體的結(jié)構(gòu)除非特別說明，以"s"為首字母的氨基酸殘基都表示SIGK殘基。GP，是一個p-螺旋槳結(jié)構(gòu)，包括7個4股p折疊("槳葉片")和N-端的一個與Gy2有廣泛相互作用的伸展的螺旋。每個折疊都包含通過各種長度的環(huán)相連的WD-40重復(fù)單元。GPi的2-340號殘基^皮包括在模型之中。貫穿于的核心的B因子小于40A2。8因子>60A2的殘基存在于三個環(huán)區(qū)二號片中的Lysl27-Ser136、四號片中的Arg214-Met217和連接六號片和七號片的環(huán)中的Ser265-Ile269。Gy2形成一個螺旋，包括Asn24-Lys29殘基形成的一個扭結(jié)和起始于His44殘基的螺管結(jié)構(gòu)。Gh分子內(nèi)部的平均B因子為44A2。對于Gh的N-端7個殘基和C-端16個殘基或Gy2的C-端的異戊二烯基脂質(zhì)修飾都沒有觀察到電子密度。S1GK形成了一個被10號位置上的甘氨酸中斷的a螺旋結(jié)構(gòu)。C-端的三個殘基形成一個伸展的結(jié)構(gòu)從G(3,分子中伸展出來，該伸展結(jié)構(gòu)被.sPro12和sAspl3與對稱相關(guān)的分子中的Thr47和Lys337的晶體接觸所支持。SIGK的N-(sSerl、slle2)和C-端(sGlylO-sAsp13)殘基的B因子大于50A2，其他所有殘基的B因子在30-5012之間。殘基1-13的主鏈原子的電子密度界限清楚；不與GPi相接觸的三個SIGK的側(cè)鏈(slle2、sLys7和sAspl3)的電子云密度混亂。該肽跨過的"頂"面進(jìn)行結(jié)合，并被掩蓋于97012的總的溶劑可及的表面區(qū)域中。該肽不與GY2亞基相接觸，而G^亞基是與隆凸的"底"表面相結(jié)合的。與SIGK接觸的Gp,表面分為兩個區(qū)域一個Gp,上與該肽的N-端相互作用的酸性區(qū)域和一個與該肽的C-端相互作用較大的非極性區(qū)域?？傊?，借助于P-螺旋槳的7個槳葉片中的6個片，13個G^殘基直接與SIGK相接觸(表5)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>變成甘氨酸使得IQo降低13倍。將slle2突變成丙氨酸使得肽的IC50P條低4倍，將sSerl突變成丙氨酸對IC5。沒有影響(Scott，etal.(2001)見上文)。SIGK.GP^2的結(jié)構(gòu)表明，sSerl的主鏈和sIle2、sLys4和sAla5的側(cè)鏈與Gp的多個殘基相接觸，從而可以對這些突變數(shù)據(jù)進(jìn)行解釋。為了測定GP^2.SIGK界面上觀察到的的殘基對復(fù)合體的結(jié)合能的貢獻(xiàn)，^:用了兩種方法。第一種方法用ELISA測定法測量固定4匕的GP^2亞基與展示SIGK序列的噬菌體結(jié)合(表6)。然后使ELISA結(jié)合數(shù)據(jù)與S1GK作為Gp^2與Goii,相結(jié)合的竟?fàn)幰蜃拥腎Cs。值相關(guān)聯(lián)(表7)。然后用包含G(^亞基突變的Gp^2異源二聚體進(jìn)行兩個測定。在N-端結(jié)合表面上，的G(5,的Asn230突變成丙氨酸使得Gp^2對肽的親和性減小10倍(表6)。G(5，殘基Asp186、Metl88、Tyrl45和Leull7單一突變成丙氨酸也導(dǎo)致Gp,y2二聚體對S1GK的親和性顯著地降低(表6)。Asp228或Asp246被置換為丙氨酸的Gp,突變體無法與Gy2形成二聚體因此不作分析。然而，Asp228被置換為絲氨酸，則僅使對SIGK的親和性稍有降低(表6)。因此，形成N-端SIGK結(jié)合界面的許多GP,殘基對結(jié)合能的貢獻(xiàn)都很大。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>與SIGK肽結(jié)合的氨基酸被逐個地突變成丙氨酸(或者Asp246突變成絲氨酸)，用噬菌體ELISA測定與肽的結(jié)合。將固定化的b-pY與展示SIGK肽的噬菌體共孵育。用a-噬菌體抗體檢測噬菌體的結(jié)合；原始數(shù)據(jù)為405nm下的吸光度。所示數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的三次重復(fù)測量數(shù)據(jù)的平均士SD。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>存在代表性的Gpt亞基突變體的條件下，SIGK參與FITC-GauPr/2相互作用中的竟?fàn)?。SIGK和FITC-Gai,同時加入附有野生型或突變的b-py蛋白的鏈親合素的珠子中，結(jié)合到珠子上的FITC-Gai,的量用流式細(xì)胞儀檢測。表中數(shù)據(jù)是三次檢測的平均值+/-代表性實(shí)馬全的標(biāo)準(zhǔn)差。兩次(Metl88A)或三次(野生型、Arg314A、Trp332A)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。對所選擇的具有較寬范圍內(nèi)的各SIGK結(jié)合親和力的突變體進(jìn)行兩次測定，對兩次測定進(jìn)行的比較表明了失去50%的親和性的同時ICso提高5倍、失去75%的親和性的同時ICso提高10倍、失去90%的親和性的同時ICso有20倍的改變、失去98%的親和性的同時ICso有50倍的改變。IC5()值如下野生型=0.47//M、Arg314A=1.5"M、Trp332A=9;/M和Metl88A=22//M。結(jié)合的第二區(qū)域涉及SIGK的C-端的大部分殘基(sAla5-sGly11)，這些殘基填充G^的一個較大的疏水性的口袋。這個口袋長llA，從七號片的Trp332到二號片的Metl88。的8個殘基直接與SIGK的C-端表面接觸，并且還有兩個的殘基協(xié)助這些殘基直接參與與SIGK的相互作用。與N-端界面的sLys4相互作用的Metl88，也在sLeu8的側(cè)鏈的接觸的距離內(nèi)。SIGK的sAla5、sLeu8和sLeu9殘基通過范德華力相互作用力與Lys57的烷基、Leul17、Metl01、Trp99和Tyr59相互作用。Val100的主鏈上的氧與sLeu9側(cè)鏈相作用。Trp99的吲哚亞胺與sTyrll的鞋基之間形成氫4走，Trp332的側(cè)鏈與slle8的主鏈氧和sGly10的Ca相接觸。Lys57和Arg314的側(cè)鏈位于Trp332的任一面并協(xié)助其結(jié)合位點(diǎn)的定向。Arg314與Trp332形成氫鍵，Lys57與Gln75上的氮原子形成氫鍵，進(jìn)一步穩(wěn)定G^上的相互作用面。該肽的丙氨酸掃描數(shù)據(jù)(Scott，etal.(2001)見上文；Goubaeva，etal.(2003)見上文)驗(yàn)證了這些結(jié)構(gòu)上的觀測結(jié)果。將slle8、sLeu9或sGly10突變成丙氨酸使得抑制PLC激活的ICs。值分別增加40倍(從5nM到200nM)、60倍和12倍(Scott,etal.(2001)見上文)。sLeu9的同樣的突變也阻斷RASM細(xì)胞中SIRK增強(qiáng)ERKl/2磷酸化的能力(Goubaeva，etal.(2003)見上文)。構(gòu)成SIGK的C-端結(jié)合表面的的氨基酸的突變削弱了對SIGK肽的親和力，盡管程度各不相同。Leul17、Metl88或Trp332突變成丙氨酸幾乎完全消除了SIGK的結(jié)合；Lys57、Tyr59、Metl01和Arg314的突變的效果要弱(表6和表8)。Trp99的突變導(dǎo)致親和力降低4倍。這里給出的所有突變(即變成丙氨酸)以及其對SIGK結(jié)合親和力的影響的小結(jié)在表8中列出。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>考慮到N-端和C-端SIGK結(jié)合界面的所有數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)所測SIGK肽的15個殘基中的7個殘基和12個GP殘基中的IO個殘基對界面的結(jié)合能的貢獻(xiàn)顯著，與結(jié)構(gòu)模型十分一致。Gh在G(5^2.SIGK復(fù)合體上的結(jié)合表面在SIGK結(jié)合后沒有顯著變化。Gp^ySIGK復(fù)合體和沒有形成復(fù)合體的Gp"2異源二聚體(1TBG(Sondek，etal.(1996)7V"379:369-74);Val40-Asn340,僅Ca)的G(5,的核心殘基之間的RMSD為0.88A。然而，Trp99、Tyr59、Asp228、Leul17和MetlOl的側(cè)鏈可以為配合SIGK而旋轉(zhuǎn)，從而使這些殘基中的原子產(chǎn)生的相對于其在未形成復(fù)合體的中的位置的最大移位分別為4.0A、3.6A、2.9A、2.8A和2.3A。SIGK結(jié)合表面上的殘基的B因子接近于復(fù)合體的整體B因子的平均值。然而，與SIGK結(jié)合以后Trp99的B因子值降低2倍，通過比較兩個結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)化的B因子即可表明這一點(diǎn)。在該分析中，SIGK的結(jié)合不會使G卩為了調(diào)整各種轉(zhuǎn)變而產(chǎn)生大的構(gòu)象變化或紊亂。SIGK'GP^2復(fù)合體可以和另外5種有蛋白質(zhì)靶標(biāo)的GP^2復(fù)合體比較GPor2.Gai!異源三聚體(1GG2)(Wall,etal.(1995)見上文；Wall,etal.(1998)見上文)和GPm.Gat,i異源三聚體(1GOT)(Lambright,etal.(1996)見上文)、G(5^.磷轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白復(fù)合體(1AOR和2TRC)(Loew,etal.(1998)見上文；Gaudet,etal.(1996)見上文)和GPr/2.GRK2復(fù)合體(IOMV)(Lodowski，etal.(2003)見上文)。由具有每種上述結(jié)構(gòu)的Gp^2.SIGK復(fù)合體的疊加得到GPi的殘基40-340的平均RMS偏差小于1.0A(僅Ca)。除了GPm.磷轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白復(fù)合體中的幾個殘基以外，GpY異源二聚體不會為了結(jié)合蛋白質(zhì)靶標(biāo)而進(jìn)行顯著的結(jié)構(gòu)重排，它在G(5^2.SIGK結(jié)構(gòu)中的情況也是一樣。實(shí)施例7:通過流式細(xì)胞術(shù)測定a-pY相互作用才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sarvazyan，etal.(1998)見上文)制備熒光素標(biāo)記的Gau(Fau)。被用來測定肽對Ga-G^相互作用的影響的測定方法包括竟?fàn)帨y定和解離測定(Ghosh,etal.(2003)見上文)。簡述如下，對于基于竟?fàn)幍臏y定，將100pM的Fan和標(biāo)明濃度的肽加到固定在每毫升105珠粒上的50pM的b-Gp^2中，在室溫下孵育30分鐘以達(dá)到平衡。然后，珠子結(jié)合的熒光用BDBiosciencesFACSCALIBURTM流式細(xì)胞儀記錄。用GraphPadPrism4對數(shù)據(jù)做背景熒光校正并與S形的劑量響應(yīng)曲線擬合。為了測量FaM從b-Gp,Y2上的解離，將100pM的Fo^在室溫下與50pM固定化的b-Gp^2孵育15-20分鐘。結(jié)合的Fajl亞基的熒光被測量，然后加入過量200倍的沒有被標(biāo)記的Gau或肽，在既定的時間測量仍然結(jié)合在珠粒上的Fau的量。實(shí)施例8:蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的分子識別已經(jīng)證明與SIGK肽結(jié)合的界面分成兩大類相互作用；一個與該肽的疏水核心(氨基酸8-10，Ile-Leu-Gly)相接觸，C-末端結(jié)合界面和一個與該肽的N-末端(主要是Lys4)相連的N-末端界面，由此確定了識別該肽的分子基礎(chǔ)。因此，的公共結(jié)合表面的氨基酸被逐個地置換為丙氨酸，以確定哪些氨基酸對G(5a2與九種不同的SIGK肽衍生物的相互作用是最至關(guān)重要的(表9)。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>*帶下劃線的殘基表示接觸n-末端的賴氨酸殘基和疏水核心的殘基。選擇這九個肽是為了代表以前鑒定的肽的不同的一致組(見ScottetaL(2001)見上文；表9)，并對一致組內(nèi)或一致組間的結(jié)合特征進(jìn)行比較。展示所述肽的噬菌體與野生型Gp^2的結(jié)合所發(fā)出的ELISA信號是不同的，但是處于相似的區(qū)間內(nèi)(相對于噬菌體3.14的25%-100%的結(jié)合)。如本文所公開，通過對在基于溶液的測定中肽的行為結(jié)果進(jìn)行比較，ELISA測定得到的結(jié)合信號與親和性的喪失被關(guān)聯(lián)。例如，ELISA中一個表現(xiàn)出結(jié)合性喪失80%的突變體，同時它在溶液中肽親和性有相應(yīng)的IO倍的改變。出于本文7>開的目的，任4可將結(jié)合性降低至低于野生型結(jié)合性的20%以下的置換被認(rèn)為是該肽的關(guān)鍵性結(jié)合接觸。該分析所得數(shù)據(jù)示于表IO。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>野生型或丙氨酸替代的生物素化Gpr/2亞基被固定在抗生物素蛋白鏈霉素包被的96-孔板上，然后加入噬菌體。噬菌體結(jié)合用本文所述評估。針對噬菌體對該板的非特異性結(jié)合進(jìn)行數(shù)據(jù)校正，數(shù)據(jù)用野生型結(jié)合百分比表示。所示數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的兩次重復(fù)測定的平均值士SD。意外的是，所述肽的每一種使用了SIGK的結(jié)合界面中的不同的氨基酸組合以實(shí)現(xiàn)其特定的相互作用。在所述肽之中一個主要的特征是在C-末端的界面中強(qiáng)烈地需要Trp332。Lys57、Tyr59和Leul17也在這個界面內(nèi)，通常對肽的結(jié)合貢獻(xiàn)很大，雖然在有些情況下它們的作用不是絕對必需。其余的氨基酸對每種肽的結(jié)合有更為多樣的作用。例如，SIGK對Trp99僅有最小的需求，而Ser-Cys-Lys-Arg-Thr-Lys-Ala-Gln-Ile-Leu-Leu-Ala-Pro-Cys-Thr(Cl;SEQIDNO:7)的結(jié)合絕對需要Trp99。對于Tyrl45也存在這種相反的情況，SIGK的結(jié)合絕對需要Tyrl45，而Ser-Cys-Lys-Arg-Thr-Lys-Ala-Gln-Ile-Leu-Leu-Ala-Pro-Cys-Thr(Cl;SEQIDNO:7)的結(jié)合則不受該突變的影響。SIGK的N-末端與G卩亞基的相互作用是通過兩個主要的接觸實(shí)現(xiàn)的sSerl與卩Aspl86和(5Tyrl45殘基的相互作用；以及sLys4與卩Metl88通過范德華力相互作用，與|3Asn230、卩Asp246和卩Asp228通過氫鍵或電荷相互作用進(jìn)行相互作用。在本文使用的表達(dá)系統(tǒng)中，Asp228Ala和Asp246Ala不與y形成二聚體，并且無法^皮純化；然而Asp246Ser則被表達(dá)和純化。通常，第I、II和IV組中的肽基本上需要與N-末端區(qū)域結(jié)合，這一點(diǎn)可通過Metl88Ala和Asp246Ser突變體的結(jié)合性完全喪失(除SIGK之外)和對Asn230的廣泛需要反映出來。第I、II和IV組中的肽具有一個保守的基序，其中一個賴氨酸與一個疏水核心基序間隔3個氨基酸(見表9)。SIGK中的該基序提供了在單a-螺旋轉(zhuǎn)角中與N-末端結(jié)合表面相互作用的賴氨酸和與C-末端相互作用的Ile-Leu-Gly基序之間的合適間隔距離。其他一些肽被認(rèn)為采用了相似的a-螺旋結(jié)構(gòu)，這使這個間隔至關(guān)重要。第III組的肽結(jié)合C-末端相互作用區(qū)域，但是缺少對Metl88的需要，并且對Asn230和Asp246的需要極少，這說明它們與p的相互作用并不使用N-末端的結(jié)合表面。與SIGK沒有明顯直接結(jié)合的兩個氨基酸Arg314和His311也被分析。Arg314的置換導(dǎo)致SIGK結(jié)合的降低程度不大；然而，對于其他肽Arg314是絕對需要，這表明這些肽可能與該氨基酸直接相互作用。His311完全位于SIGK肽結(jié)合位點(diǎn)外，因?yàn)樗赡軈⑴c(iy亞基的構(gòu)象變化(Gaudet，etal.(1996)見上文；Loew，etal.(1998)見上文)也4皮突變。His311的咪唑側(cè)鏈距離Arg314的胍基氮的距離是13A，而Arg314是和任何肽都明顯相互作用的最近的氨基酸。His311不太可能與來自展示衍生肽的噬菌體的氨基酸有直接的相互作用。然而，將His311突變成丙氨酸對各種肽的結(jié)合的影響各異。被His311A影響結(jié)合的肽的結(jié)合也需要Arg314,這個作用可能由于ArgM4的位置的改變。已經(jīng)證明，預(yù)計(jì)在Ga-GPy界面結(jié)合的兩種肽pARK-ct肽(氨基酸643-670)和QEHA阻斷異源三聚體的形成，但是不能促進(jìn)異源三聚體的解聚(Ghosh，etal.(2003)見上文)。GRK2(|3ARK)-G(5y復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)顯示與pARK-ct肽相互作用的表面和SIGK—Ga-開關(guān)II結(jié)合位點(diǎn)部分地重合(Lambright，etal.(1996)見上文；Wall,etal.(1995)見上文；Lodowski，etal.(2003)見上文)。具體而言，疏水口袋內(nèi)的氨基酸Trp99、Trp332和Try59在所有三個結(jié)構(gòu)中是共同的相互作用位點(diǎn)。SIGK肽和a開關(guān)II有一個賴氨酸殘基占據(jù)Gp上幾乎相同的位置。雖然pARK-ct肽在相似位置上有一個賴氨酸殘基，但是相互作用的幾何學(xué)和性質(zhì)是不同的。PARK僅與Asp228相互作用，而SIGK和Ga與Asp228、Asp246、Asn230和Metl88相互作用。基于這個差異，確定在該界面上的SIGK的特異相互作用是否對促進(jìn)解聚是至關(guān)重要的。為了檢測亞基解聚，使用了來自噬菌體展示篩選的另一種肽SCAR肽。N-末端相互作用界面內(nèi)與SIGK的sLys4接觸的氨基酸Asn230、Asp246和Metl88對結(jié)合SCAR并不重要。SCAR缺少在相對于疏水核心基序的正確位置上的賴氨酸殘基，所述正確位置為能達(dá)到賴氨酸結(jié)合的N-末端表面的位置(表9)。因此，SCAR不能促進(jìn)亞基解聚。SIGK和SCAR兩者都能和Gdi竟?fàn)幣cGPm的結(jié)合，IC50分別是0.5和1.7jiM。然而，與SIGK肽不同，飽和濃度的SCAR肽不能促進(jìn)已經(jīng)形成的異源三聚體的解聚。濃度最高達(dá)160fiM(飽和濃度的四倍)的SCAR沒有引起解聚。SCAR沒有促進(jìn)異源三聚體解聚的能力不是因?yàn)槠涞徒Y(jié)合親和性，因?yàn)镾IRK具有相似的親和性并且促進(jìn)解聚。這些結(jié)果表明與N-末端界面結(jié)合的肽對加速異源三聚體的解聚時必需的。為了更加直接地評估與N-末端肽結(jié)合界面結(jié)合的肽的重要性，SIRK的sLys4殘基被突變成丙氨酸，以去除與N-末端結(jié)合口袋的關(guān)鍵性接觸。對于阻斷Ga-Gpy相互作用，該肽的親和性比SIRK顯著降低(1(:5()=60〃1\1對比1.4〃M);然而，在高濃度時它阻斷的水平接近于SIRK的阻斷水平。雖然能阻斷Gcx-GPy的相互作用，但SIRK(Lys4Ala)并不能加速異源三聚體的解聚。相對于固有的解聚速度，SIRK(Lys4Ala)的Fa表觀解聚速率明顯降低。這可能是因?yàn)镾IRK(Lys4Ala)是低親和阻斷劑，并且對抑制Fau的再結(jié)合沒有效果。為了證實(shí)SIRK(Lys4Ala)的低親和性不是其不具有加速解聚的能力的原因，對一個與SIRK(Lys4Ala)有可比擬的親和性的肽即SIRK(GlylOAla)(IC5G~80pM)進(jìn)行測試。該肽含有Lys4但Ala置換了位置10上的Gly，因此SIRK(GlylOAla)保持了與N-末端界面的結(jié)合，但由于與C-末端區(qū)域的相互作用降低而減小了親和性。雖然具有對G(3y的低親和性，但SIRK(GlylOAla)在高濃度時阻斷異源三聚體形成，也還是能加速異源三聚體的解聚。SIGK在異源三聚體的Ga亞基的開關(guān)II域占據(jù)的區(qū)域結(jié)合G^。異源三聚體的晶體結(jié)構(gòu)顯示Ga的開關(guān)界面(包含開關(guān)I和開關(guān)II)通過多個接觸掩蓋Gp的約1，800A(Lambright，etal.(1996)見上文；Wall.eta!.(1995)見上文)；然而，該界面上的p亞基氨基酸的突變對a亞基結(jié)合的作用(近似于Ga-GPy相互作用的Kd)并沒有通過直接的結(jié)合測定測量。GTP結(jié)合后開關(guān)I和開關(guān)II產(chǎn)生較大的構(gòu)象變化，這些變化被認(rèn)為介導(dǎo)了異源三聚體的解聚。本文公開的Gp!亞基突變體從昆蟲細(xì)胞分離而來，與GY2和六-組氨酸標(biāo)記的Gai,形成復(fù)合體，這說明從晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測的亞基之間上述接觸中的許多并不是每個都對Ga亞基結(jié)合都至關(guān)重要。為了確定哪些氨基酸對肽提高解聚的速率常數(shù)的能力有貢獻(xiàn)，測量Fail與每個獨(dú)立的b-Pa2置換突變體解聚的速率常數(shù)(k。ff)。野生型的固有解聚速率是0.123s-l，與以前的測量十分一致(Sarvazyan，etal.(1998)丄fi/o/.C7^附.273:7934-7940)。所有這些突變的數(shù)據(jù)在表11中顯示。表11<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>"四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SD。弁與野生型比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p〈0.05)，用單因素ANOVA和獨(dú)立線性對比確定。卞koft.無法測量，因?yàn)镕-ai的顯著的穩(wěn)定結(jié)合無法被檢測。這些結(jié)果顯示在測試的12個突變體中，Trp99Ala、Leull7Ala和Trp332Ala與野生型有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，伴有k。ff相對較小程度的提高。另一方面，雖然可以基于6HisGai結(jié)合來純化Asp246Ser(但從大量培養(yǎng)只能得到很低產(chǎn)量)，但是在流式細(xì)胞術(shù)測定中使用的低濃度使得Asp246Ser不能在該測定中穩(wěn)定地結(jié)合F-au。這表明與Asp246的相互作用對穩(wěn)定的Ga亞基相互作用至關(guān)重要，但在主要為疏水性的C-末端界面中各獨(dú)立的相互作用并沒有那么重要。實(shí)施例9:小分子庫篩選噬菌體ELISA測定被用來確定計(jì)算機(jī)篩選方法鑒定出的小分子是否能與GPy蛋白質(zhì)相互作用表面相互作用。按照成熟的方法應(yīng)用展示SIGK肽的噬菌體(Scott，etal.(2001)見上文；SmrckaandScott(2002)見上文)。篩選是基于包含GPy亞基和噬菌體的孔的吸光度(OD)的減小。在每張板中有三個孔中包含陽性對照，所述陽性對照與包括b-卩y亞基、SIGK-噬菌體和適量的載體結(jié)合。三個背景孔中不含(Vy亞基。如本文公開的，生物素化的G(5Y亞基被固定在包被有抗生物素蛋白鏈霉素的96-孔板的表面，隨后加入展示Gp，結(jié)合肽的噬菌體，并在存在和不存在測試化合物的情況下用抗-噬菌體抗體檢測結(jié)合。實(shí)施例10:抑制嗜中性粒細(xì)胞中的G^信號傳導(dǎo)Ca"流用分化的HL-60嗜中性粒細(xì)胞培養(yǎng)物(0.2x106細(xì)胞/mL)的兩個35mL培養(yǎng)物測量。細(xì)胞在DMSO(1.2。/。)中培養(yǎng)三天，用HSS洗滌，用2mL的HBSS重新懸浮細(xì)胞，濃度為7x106細(xì)胞/mL。生長培養(yǎng)基中加入DMSO誘導(dǎo)這些細(xì)胞分化成形態(tài)和功能上的成熟中性粒細(xì)胞(Collins,etal.(1978)TV",/.」ow/.5W.75:2458;Collins,etal.(1979)/Exp.149:969)。嗜中性粒細(xì)胞凈皮預(yù)加載一種熒光的〔32+-敏感性指示劑fura-2(1nM)(Suh，etal.(1996)/C7^附.271:32753)45分鐘，用HBSS洗滌并用2mL的無指示劑HBSS重新懸浮細(xì)胞。將每140//L等份試樣的細(xì)胞中加至總體積為2mL的HBSS中。通過340和380nm處的雙激發(fā)和510nm處的發(fā)射得到熒光率。在建立了穩(wěn)定的基線之后，加入DMSO或者NSC119910并孵育5分鐘。隨后，加入fMLP或者ATP激動劑以激活Ca"從細(xì)胞內(nèi)貯庫中釋放。權(quán)利要求1.一種對可調(diào)節(jié)G蛋白的至少一種活性的試劑進(jìn)行鑒定的方法，包括使G蛋白β亞基與一種待測試劑相接觸，并確定所述試劑是否與所述β亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基相互作用，從而鑒定一種可調(diào)節(jié)所述G蛋白的至少一種活性的試劑。2.—種試劑，所述試劑根據(jù)權(quán)利要求1中的方法鑒定。3.—種用于鑒定一種試劑的方法，所述試劑可與所述p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基結(jié)合，所述方法包括在存在一種肽的條件下，使G蛋白p亞基與一種待測試劑相接觸，所述肽可與p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基結(jié)合；并且確定所述試劑是否抑制所述肽對所述p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基的結(jié)合，從而鑒定一種可與所述p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基結(jié)合的試劑。4.一種試劑，所述試劑根據(jù)權(quán)利要求3的方法鑒定。5.—種用于鑒定一種試劑的試劑盒，所述試劑可與所述p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基結(jié)合，所述試劑盒包含一個SIGK肽或SIGK肽書f生物。6.—種用于調(diào)節(jié)G蛋白的至少一種活性的方法，包括使G蛋白與有效量的一種試劑接觸，所述試劑可與所述G蛋白p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基相互作用，從而調(diào)節(jié)所述G蛋白的至少一種活性。7.—種預(yù)防或治療一種疾病或病癥的方法，所述疾病或病癥與至少一種G蛋白(5y亞基活性有關(guān)，所述方法包括對患有與至少一種G蛋白pY亞基活性有關(guān)的疾病或病癥的患者或具有該患病風(fēng)險(xiǎn)的患者給予有效量的一種試劑——所述試劑可與所述G蛋白p亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的至少一個氨基酸殘基相互作用——從而調(diào)節(jié)所述G蛋白的至少一種活性，由此預(yù)防或治療與至少一種G蛋白pY亞基活性有關(guān)的疾病或病癥。全文摘要本發(fā)明涉及對與G蛋白β亞基的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的特異氨基酸殘基結(jié)合的試劑進(jìn)行鑒定的方法。還提供了根據(jù)本發(fā)明的測定而鑒定出的化合物或復(fù)合物以及使用該化合物或復(fù)合物調(diào)節(jié)G蛋白的至少一種活性的方法。文檔編號A61K38/00GK101171022SQ200680015546公開日2008年4月30日申請日期2006年3月7日優(yōu)先權(quán)日2005年3月7日發(fā)明者A·V·斯馬卡,J·方特,T·博納斯申請人:羅徹斯特大學(xué)