專(zhuān)利名稱(chēng)：抗纖連蛋白ed-b和白細(xì)胞介素12的抗體l19的融合蛋白的制作方法
抗纖連蛋白ED"B和白細(xì)旨素12的抗體L19的融合蛋白望*。本發(fā)明特別涉及用于治療用途的IL12與抗體分子間的綴^，所述的 治療用途詢(xún)制病理性的血管生成，包拾治療癌癥及其它腫瘤、狄濕關(guān)節(jié)炎、 糖尿病'1^L網(wǎng)膜病、4^H目^肉退^^血管瘤。異二聚體細(xì)胞因子白細(xì)^t-12 (IL12)^t^細(xì)J^疫的關(guān)鍵^H林，具 有有效抗癌和^##活性[4-6]。它目前(2005年春幻jt^用于治療癌^^傳染 病的II期的臨床，中測(cè)試。IL12主要怍用于T和NK細(xì)胞，刺激它們的活性 和干擾素-Y (IFN-Y)的分泌m。然而，正:4^牛多其它的細(xì)胞因子相同，重組 的人IL12的施用與嚴(yán)重毒l^f目關(guān)，甚錄1 Hg/ kg /Ail樹(shù)氐的劑量下[8， 9]， 卩J^了其作為抗癌藥物的研發(fā)。向腫瘤5T^fe向遞送IL12可以用于提髙細(xì)胞因子的治療指數(shù)。 Lexigen的科學(xué)家已經(jīng)描述了細(xì)胞因子例如IL2和IL12與免疫i^蛋白的融 合以特異l^Mte向細(xì)胞因子[17， 49-51]。然而，作為M明的發(fā)明人，我們相 信這樣的途4賄局限性。我們意^f'j IgG"細(xì)胞因子l^^實(shí)際上是多功能蛋白 質(zhì)，并且因此除了^^結(jié)紳細(xì)胞因子洽l^卜，這些基于IgG的融錯(cuò)白質(zhì)能 夠激活4H^并且與Fc受糾目互作用。我們認(rèn)為，il^IgG"細(xì)胞因子l:^的不 良特性，因?yàn)榧?xì)胞因子可淑皮帶到攜帶有Fc受體的細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞、嗜中 性白細(xì)齡天然^W另細(xì)胞附近，因而fJ^腫瘤把向并且引起非特異性的細(xì)艇 化。我們iMHU缺少Fc的^^^^會(huì)更理想,:HM單鏈Fv脅片段(scFv)，而不^4^免^li^蛋白。我們先前在癌癥^^物模型體內(nèi)已經(jīng)證明了 ，通過(guò)#^編碼鼠細(xì)胞因 子IL12("sclL12 ")的p40和p35亞基的單鏈多肽與人單鏈Fv抗體片段 L19 ("scFv(L19)")融合，能夠J^M高IL12的治療潛力。已經(jīng)證明，ScFv(L19) 能夠在癌癥患者體內(nèi)選棒I^Mt瘤把向[16]。 L19特異,合纖連蛋白同種型 B-FN1的ED"B結(jié)構(gòu)域，其是4;0^斤周知的血管生^f封己[14， 25]。 EI^B是在 B-FN同種型內(nèi)發(fā)現(xiàn)的91個(gè)^J^的額外結(jié)構(gòu)域并iL在小鼠、大鼠、兔子、狗和人中是相同的。B-FN積f^E攻擊性肺瘤和經(jīng)歷血管生成的其它組織內(nèi)的新生血 管性結(jié)構(gòu)，如增生期的子宮內(nèi)膜和病理狀況下的一些眼結(jié)構(gòu)周?chē)?，但是在正?的^AiE織內(nèi)未檢測(cè)到[1-3]。在小鼠體內(nèi)，融^白sclL12-scFv(L19)^L出的治療指數(shù)i^i4高于融合 至具有無(wú)關(guān)特異It的scFv的sclL12,以;^重組的鼠IL12。這些實(shí)聰，清楚地證 明了基于抗體的細(xì)胞因子融M白的潛力是用于改善IL12治療潛力的途徑 [15]。這些結(jié)果的治療潛力是相當(dāng)大的。由于多種原因，在腫瘤血管7jc平上IL12的耙向，例如使用L19是有治療益 處的。第一，肺瘤新生血管比腫瘤細(xì)胞更易接近靜務(wù)條藥的治療劑，這有助于 避免與實(shí)體腫瘤的隙間高刷目關(guān)的問(wèn)題[io],第二，血管生成(新的^j6l管從已 存在的血管上的生影是多數(shù)攻擊性執(zhí)腫瘤的特征[ll]'將IL12乾向至新生 血管應(yīng)當(dāng)允許多種不同腫瘤類(lèi)型的免疫治療。第三，IL12顯示出脈管生成活 性，i^i通過(guò)它的下^N^IP-10賦予的[12， 13]。我們已經(jīng)廣i^9f究了 sclL12-scFv(L19)的腫瘤乾向性能，以及已經(jīng)融合 至另一微瘤細(xì)胞因子IL2的scFv(L19) (" scFv(L19)-IL2 ")的性能[18]。在 帶有腫瘤的小鼠體內(nèi)ScFv(L19)-IL2顯示出優(yōu)異的腫瘤乾向性能，靜脈注射后 24小時(shí)腫瘤:血液與胂瘤器官之比高達(dá)30 : 1。相反，^目同的動(dòng)物模型中 sclL12-scFv(L19)的腫瘤把向能力較弱，在24小時(shí)時(shí)腫瘤血液與腫瘤器官 之tbit常比10:l還差，并且具有録的腫瘤肝臟與胂瘤秋比[15],不過(guò) 與l:fe^白sclL12-scFv(HyHEL10)相比，這些乾向結(jié)果仍然是優(yōu)異的，特異于 4^溶菌酶，鍵小鼠中缺乏^^特異性i^'J.已經(jīng)證明了當(dāng)通itA的IgE的CH4結(jié)構(gòu)域使scFv (L19) 二聚化時(shí)，構(gòu)皿 脅結(jié)構(gòu)，楊為"小免疫蛋白"或SIP, scFv(L19)的腫瘤把向特性得到改善。 SIP(L19)的肺瘤把向棒性先前e^t描述[21〗。本發(fā)明基于這樣的工作，作為發(fā)明人的我們比較了 IL12與scFv(L19)的三 種綴合物的肺瘤把向能力，每種具有不同形式的細(xì)胞因子和/或不同形式的抗 體，并JL^m過(guò)以特殊的方式^綴合物的形式能夠改善sclL12-scFv (L19) 的腫瘤把向能力。我們測(cè)試的一種形狄sclL12-scFv(L19)，在圖1A中說(shuō)明。該綴^顯 示出中度的腫瘤把向能力，與財(cái)絲中的發(fā)SeA""^的，另 一種形式是利用以上提到的二聚的SIP(L19)構(gòu)建體創(chuàng)造 sclL12-SIP(L19)同型二聚體，在圖1B中說(shuō)明。然而，盡管J賄技樣明利用 SIP形式能夠改善L19的腫瘤耙向特性,但是我們沒(méi)有M^到該綴^的提高的 腫瘤攝取。另一種形U IL12 p40與p35亞基的雜二聚體，其中每個(gè)亞基融合至 scFv(L19),形成scFv(L19)-p35 / p40-scFv(L19)雜二聚體，如圖1C說(shuō)明的。 利用這樣的異二聚體形式，我們得到了該綴合物的腫瘤才聶^^方面的明顯的改善。因此，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了新的抗體-IL12l:fe^白形式，由通過(guò)IL12的p40 和p35亞J^異二聚^M匕的兩個(gè)scFv片段組成，保持了全部的IL12活性并皿 示出;W的胂瘤把向能力。這些結(jié)^TM的治療學(xué)意義，用于改善IL12對(duì)腫瘤以; Ut病理'J4j6L管生 成的其它部位的乾向性，例如用于治療M濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病'1 網(wǎng)膜病、年 斜目^/L肉退^^血管瘤。本發(fā)明的用途^3U^伸到IL12與scFv(L19)的融合， 而JUr彭，J其它特異峰合成員和其它藥物和物質(zhì)間的4繊。例如，除了與IL12 亞基4繊的scFv(L19),可以用特異li結(jié)合成員，如對(duì)腫瘤相關(guān)^^、特異的其它 片段例如^^蛋白-C同種型構(gòu)建綴^，并JL^)于腫瘤把向和癌癥治療。 更廣泛的牽連還包括^t其它應(yīng)用，涉及體內(nèi)物質(zhì)的把向，包4棘斷方法以及 疾病及其它病理狀況的預(yù)防和治療，在Vh方面，本發(fā)明涉及新的綴*、生產(chǎn)它們的方法、編碼該綴*或 其成分的核酸、含有該綴合物的藥物組合物，以及該綴#在治療方法中的應(yīng) 用。在一個(gè)方面，本發(fā)明是包含具有第4第二亞基的蛋白的綴，，其中第 4第二亞基分別綴合于特異It^合成員上。該蛋白通常是二聚的，M的是異二聚的，并且典型地包含生物活性劑或 藥物，通常為治療或診斷劑。因此，該綴^通常具有以下形式[特異lt^合成員]-[第一亞基]-[第二亞基〗-[特異峰合成員] 特異^合成員通常是^^^"， to為單鏈Fv(scFv)。 ^E^發(fā)明中單鏈 Fv(scFv)^^襯是特別to的，原因在于它們的尺寸小，這提供了體內(nèi)翻 該綴合物的生SJi^治療上的優(yōu)勢(shì)，jHi^卜，scFv缺少Fc區(qū)域，潛^減少了抗獨(dú)特'lit^并且樣小了 j傳活^^目關(guān)的不良特性以及與Fc受體的相互作用， 這些可能會(huì)PiUl肺瘤靶向性并且導(dǎo)致非特異性細(xì)胞活化。因此，綴合物的M的形U:[Scf v]—[第一亞基]-[第二亞基]—[Scf v]可選擇地，特異)^合成員可以是單結(jié)構(gòu)域旨，和/或M片段。以下更 詳細(xì)itM笛述了特異峰合成員和^^f"。綴録可以是或可以包^li^白，即多肽，該多肽是#^產(chǎn)物，來(lái)自于 兩個(gè)或多個(gè)基因或核酸編碼序列l(wèi):k^入一^Hf放閱讀框(ORF)的融^^。兩個(gè)基 因或ORF的融合^Ji產(chǎn)物可以通itAfc接頭(短的為2-20， M的為2-15，個(gè)氨 ^g^Jj^伸H腺在一個(gè)實(shí)施方案中，肽接頭是6-絲序列GSADCG(SEQID NO: 15)。融錯(cuò)白可以包^t號(hào)財(cái)列，通常位于特異麟合成員和亞基的上 游(5')。^^發(fā)明的綴#內(nèi)，第一^第二亞M常是連接的，例如它們可以以共 ^h^接，例M過(guò)一個(gè)或多個(gè)"^傲蛋白可以絲聚的(例如二聚的，to的 為異二聚的)，并JLS聚體形式可以自然M生，以及綴*內(nèi)的第一第二亞 基可以因此以它們的自然方式fetb^接。本發(fā)明因此允許在綴合物內(nèi)^^)和保 持蛋白的自然形式。iii^了構(gòu)建或^D藥物的單敏體的^^r需要，以錄 大化綴*內(nèi)##藥物的4^活性的能力的，需要。jW^卜，亞基間的4^it it^許在寡聚物內(nèi)第""^第二亞斜合(例如二聚化)允許方虧Jt^建和纟錄綴 絲，因此，第 第二亞基可以典型脅自綴合于特異性結(jié)合成員上，形成 一對(duì)通iti^S^合的特齊鵬合成員-亞錢(qián)建體(例如雜二聚體)。在一4S^ 的實(shí)施方案中，第一亞U1合于特異'I^合成員作為第一融錯(cuò)白，并JL^二 亞J^^特異lt^合成員作為第^iU^白，優(yōu)選的是，綴^具有的襯量為250 kDa或更小，更魅的是200 kDa、 150 kDa、 125 kDa、 120 kDa或115 kDa或更小(即Mr為或低于250 000、 200 000、 150 000 、 125 000、 120 000、或115 000)。這可以是實(shí)際測(cè)定的^i:(糖基 4t^者沒(méi)有糖基似，或^^^于例:ft^^^^(有或，通常沒(méi)有)^^l-4b^用的預(yù) 期M量的估計(jì)值。尺寸相對(duì)較小的綴^可提高它穿it^^只和到達(dá)目標(biāo)位置 (例如血管生成、腫瘤或疾病的位X)的能力，因錄高了它的治療功效并且減 少了所需劑量，然而仍然已實(shí)現(xiàn)綴^與把的多價(jià)(通常為二價(jià))結(jié)合。通常，綴合物的使用目的來(lái)選擇蛋白和特異性結(jié)合成員。在一^H^的實(shí)施方案中，蛋白是IL12。正如以上所討輛，IL12適用于治療癌癥，抑制腫瘤生###，以;sj臺(tái)療病理'tiik管生^目關(guān)的其它病癥。綴絲內(nèi)一個(gè)或關(guān)的#^,例如位i^^生性生^V或血管生成的位置的才朽說(shuō)合。！^卜M成分可以是贅生性生^/a管生成的才射己，因?yàn)?些過(guò)程期間細(xì)J^卜M被 重塑。一個(gè)實(shí)例是纖連蛋白的B-FN同種型，如上所說(shuō)明的，其包含額外結(jié)構(gòu)域 ED"B。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員伏選特異地與纖連蛋白同種型B-FN的EI>_B結(jié) 合。特異鵬合成員可以具有包含L19的VHCDR1(SEQIDN0: 25)、 VHCDR2(SEQ ID NO: 26)和/或VH CDR3 (SEQ ID NO: 27)序列和/或L19的VL CDR1 (SEQ ID NO: 28)、 VL CDR2 (SEQ ID NO: 29)和/或VL CDR(SEQ ID NO: 30)序列的^J^序列。 例如，特異4錄合成員可以是scFv，財(cái)VH結(jié)構(gòu)域，^MJ^列包含L19 的VH CDR1、 VH CDR2和/或VH CDR3，以及VL結(jié)構(gòu)域，^tJ^列包含L19 的VL CDR1、 VL CDR2和/或VL CDR3。特異14#合成員可以包含VH結(jié)構(gòu)域，其 ^KJ^序列與如SEQ ID NO: 22所示的L19 VH結(jié)構(gòu)域的^tj^序列有至少60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或100%序列同一性，和/或包含VL結(jié)構(gòu)域， ^tJ^列與如犯Q ID NO: 23所示的L19 VL結(jié)構(gòu)域的^J^列有至少60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90°/。、 95%或100%序列同一性。M的特異It^合成 員是scFv(L19)，其包含L19VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDN0: 22)和L19 VL結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 23)。在一^N^的實(shí)財(cái)案中，特異性結(jié)合成員是^T"tJ^列SEQID N0: 5(圖10)的scFv(L19)。另一實(shí)例;I^JII:蛋白"C(TnC)，其以不同的同種型存在.在癌^i只內(nèi)包^^額 外結(jié)構(gòu)域的TnC》b^JE常^J只內(nèi)的TnC 4itit/"泛，特別是包賴(lài)構(gòu)域C的同 贈(zèng)(cTN"C) [33]。因此，4^明的綴絲內(nèi)特異鵬合成員可以特異地與癌 纟1^相關(guān)的4JH:蛋白"C同種型，特別是cTN-C結(jié)合.特異l!i^合成員可以是具 有如SEQ ID NO: 21 (圖ll)所示序列的TN11 scFv[33]。在本發(fā)明的綴合物內(nèi)特異性結(jié)合成員作為選擇可以結(jié)合其它腫瘤相關(guān)抗 原，即在腫瘤釈免內(nèi)(如在腫瘤細(xì)ilfcJi)》b^Jt常細(xì)自免內(nèi)(如在非腫瘤細(xì)^Ji)經(jīng)洲絲。通常，綴絲內(nèi)兩*異性結(jié)合成員是相同的，或者至少對(duì)于相同的靶、 絲錄贈(zèng)是特異的。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，綴^包含已綴合于并且位于兩個(gè)特異〖錄合成員，絲的是scFv(L19)間的人IL12異二聚體；其中 異二聚^^有第一 (通常是p40)亞絲第二 (通常是p35)亞基 第一或p40亞^^合于第一#異性結(jié)合成員作為第一融^1"白； 第4 p35亞J^合于第4異f^合成員作為第二l^f"白。 如上所述，第""^第二亞基典型^JW^接的，例如^^t^i接的。 ^i^，第一或p40亞基的N-^與特異^^合成員融合，即在融^白和編碼它的核酸中亞基位于特異戰(zhàn)合成員的上游。在該形式中，p40的N-末端可能因此是游離的(融合)，被認(rèn)為i^:大化了它的活性。 &，第^^p35亞基的C-^與特異l^合成員融合，即在融M白和編碼它的核酸中亞基位于特異性結(jié)合成員的下游。這可以增強(qiáng)融M白的表達(dá)，因?yàn)樵撎貏?wù)勝合成員，特別是財(cái)上游N-絲信號(hào)肽，可以容易^4Jt并且因jtb^許l:^白的高^(guò)4ii。 I第一I^^白具有如SEQ ID NO: 1所示的p40-scFv(L19)的M酸序列。^i^L，第二il!^蛋白具有如SEQ IDNO: 2所示的scFv(L19)-p35的本發(fā)明的綴r^可以用任何可用的方法生產(chǎn)，如利用重組4支術(shù)，例如逸過(guò) 作為融^f"白^Ji^^的^或部分。例如，可以按照以下方法生產(chǎn)綴^b，其&^r:^Ji包含第一亞^^特異l^合成員的第一融M白； ^Ji包含第二iE^特異f錄合成員的第二融^I"白；以及將第一^第二錄m^"^。通常，該方法^^^J^^純化笫"-^第^^^白質(zhì)。 通常，表ii^含有編碼l:^蛋白的核酸的宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，例:W養(yǎng)的真 核細(xì)胞如冊(cè)K或CHO細(xì)胞，或細(xì)菌細(xì)胞如;^桿菌，因而^Ji可以^0l"養(yǎng)這 樣的宿主細(xì)胞，如果第—第二ili^白勤目同的細(xì)胞(例如用編艦兩種齡蛋白的核酸共轉(zhuǎn)染的或含有該核酸的細(xì)胞內(nèi)狄，sa^的異二聚^^寡聚化則可以在細(xì)胞內(nèi)j^或者a細(xì)胞中純化融M白期間;^。在其它情況下，第一和第二融^白質(zhì)可以被單獨(dú)地(例如在不同的細(xì)胞內(nèi))絲，然后H^在一 起(組合)，從而第""^第二亞基異二聚^^者另外iiy^合。將亞基^^""^可以;^i動(dòng)的或被動(dòng)的過(guò)程。^^可以包括將第一第 二融^^白暴露于或置于第一和第二亞基能被偶^L-^的條件中(例如締合 或寡聚化/異二聚化)。4^1可以包括亞基間J^嫩的形成，或者另一^^鍵 的形成。^^如^^危鍵的形成可以在非還原的IHt下發(fā)生，并且因此4^:可以包括將第一第二融M白暴露于非i^^的IHt下。才^本發(fā)明表ii^^f"白和生產(chǎn)綴^的的^dt^法在以下的實(shí)例中被詳細(xì) 脅出。作為另外的步驟，該方法可以包括將綴#配制到藥物組合物中。逸逸常涉;sj^化綴^^并且將其與生理學(xué)可接受的載體組合'藥物組^b在以下^Jt詳細(xì)麵述。編碼綴絲和它的部分(例如編碼融妙白)的核^^楊^^發(fā)明的一 部分。在一個(gè)方面本發(fā)明;liH^，包含包^^碼融合蛋白的核苷^列的第一核*于，其中融^白包^#異 '1±#合成員和第一蛋白質(zhì)亞基和包^碼融^^白的核苷^列的第4^^，其中融^白包^#異 -1±#合成員和第二蛋白質(zhì)亞基。核^t可以,特務(wù)I^合成員和亞基間的肽接頭，以致于在iH^f"白 中特異性結(jié)合成員與亞Ufit^接頭相連接，可以被編碼的M融合蛋白、亞 基、特異性結(jié)合成員械頭4^文的其它地^^L^詳細(xì)麟t在她的實(shí)施 方案中第-"^第二亞基分別是IL12異二聚體亞基(典型的是p40和p35亞勤， 并且m的特異鵬合成員是scFv，特別是scFv(L19),在一個(gè)實(shí)施方案中第 一核^^編^ SEQ ID NO: 1所示的IL12p40"ScFv(L19)的^J^序列和/ 或第4^^^^口 SEQ ID N0: 2所示的scFv (L19)-IL12p35的^J^序列。核^t可以是載體，例如是適于核苷辦列狄的質(zhì)粒。因此，第4 第^fe^^可以^一和第二載體。通常，核苷酸序列可,'li^與調(diào)節(jié)元 ^ft^如用于轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子連接，第4第ji^^^可以被包含在宿主細(xì)胞內(nèi)，其可以;l^)核^^共轉(zhuǎn)ii染的細(xì)M者這種細(xì)胞的后代。含有核*子的細(xì)|$^^^發(fā)明的一部分，特別是M細(xì)胞例如HEK和CH0細(xì)胞，或者細(xì)菌細(xì)胞例如;U^桿菌'核g達(dá)后，融^"白可以通itilL基4^^形^^發(fā)明的綴合物，如本文其 它地方所描述的。才娥本發(fā)明的綴合物可以用于治療人或動(dòng)物體的方法，如治療患者(典型地 是人患者)的疾病或病癥的方法(其可以包括預(yù)防性治療)，包括對(duì)患者施用該綴 她用綴合物可治療的病癥包括癌癥、其它腫瘤^^生性病癥。綴#可以被 用于抑制血管生成并且因此治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病'制見(jiàn)網(wǎng)膜病、年斜目關(guān) 肌肉退化、血管瘤和腫瘤，包括癌癥。治療可以包鄉(xiāng)防性治療。綴*也可 以在診斷方法，例如血管生成的靶向和診斷中施用，其可能與任何上述病斜目關(guān)。才娘綴"^內(nèi)包賴(lài)蛋白治療'liil診斷性試劑的自然'M以及特異性結(jié)合 成員的特異lt，也可以診wr治療其它的疾病和病癥。因此，本發(fā)明的更進(jìn)一步的方面提供的治療方法，包M用本發(fā)明的綴合 物，包^1種綴*的藥物組#，和這樣的4^i物在用于治療病M疾病的 藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，例如在制造藥物或藥物組合物的方法中的應(yīng)用，包4封^] 生理學(xué)可接受的載^M形劑配制該綴，。才Mt本發(fā)明，提供的組絲可以向患者施用。to的是以"治療有效量"施 用，i^A以顯示對(duì)患者的好處。這樣的好^bl^碼可以改善至少一種癥狀。施用的實(shí)際量，以;sufe用的速率和時(shí)間過(guò)程將取決于所治療病癥的'M和嚴(yán)重程度。治療的處方，例如劑量的確定等，在"fit^Jk^其它醫(yī)生的職責(zé)范圍內(nèi)。 旨的適宜劑量^M^^/^的[26， 27]。4^發(fā)明的^^ ，包括那些含有^W^結(jié)^^構(gòu)域的綴^b，可以通過(guò) ^^適合施用的途^t需要治療的患者祐用，通常通it^Ajk^p/或直接^(guān)A 被治療的位置，例如肺瘤或肺瘤維管結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確的劑#它的施用頻率取決于 許多因素，治療的途徑、^療區(qū)域的位置和尺寸(例如腫瘤)、脅的確切性 質(zhì)(例如scFv襯)，以及綴"^中含有的檢測(cè)^i^其它襯的'l!Mt組*可以單4^用或與其它治療相結(jié)合，^:，冶療的病癥同時(shí)M 連續(xù)g用。其它治療可以包^fe用適合劑量的^緩解藥物如非甾族的抗炎 藥物(例如阿斯匹林、樸熱息痛、布^^或酮^)iU^，J如嗎啡，或抗催吐劑。因J^Mt本發(fā)明的、以及#^本發(fā)明使用的藥物組*,除活性成分(綴合物)以外可以包含藥學(xué)上可接受的賦形劑、栽體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或^4頁(yè)域賴(lài) 技術(shù)人員所熟知的其它材料。這樣的材料應(yīng)該a豢的并且將不應(yīng)干擾活性成 分的功效。載體或其它材料的確切仗貧取決于給藥途徑，其可口服，或通過(guò)注 射，例^#脈注射。為了靜脈內(nèi)注射，或在痛辨位的注射，活性成分將是胃 腸外可接受的水 形式，其是無(wú)熱原的并且具有適宜的pH值、等滲)^^急定 性。在本發(fā)明的綴*中，蛋白通常包含重^t產(chǎn)的第"^第二多M基，亞 基可以被糖基化，并JLil^^基化的程度和M可以通過(guò)選棒菱宜的宿主細(xì)胞 綠制，在其中表紐基。蛋白可以包含生物活性劑，即影響給予該活性劑的 目標(biāo)生物體的結(jié)構(gòu)或功能。通常，蛋白包^斷或治療劑。例如，它可以包含 用#斷、預(yù)防或治療疾病或病理學(xué)病癥的物質(zhì)。蛋白可以包^^如用i^斷的才^ieiy朽己試劑，在本發(fā)明的上下文中蛋白通常包舍治療物質(zhì)用于治療或預(yù) 防病理學(xué)病癥，特別是血管生成，例如癌#其它腫瘤、狄濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病,船見(jiàn)網(wǎng)膜病、"W^目B肉退^^血管瘤的治療。例如它可以包含毒素、酶^Jt疫^(guò)H^如細(xì)胞因子。蛋白可以A^然或重組白細(xì)^H"-12(IL12)。用于本發(fā)明的IL12可以來(lái)源于^^r動(dòng)物，例如人、儲(chǔ)動(dòng)物(例如大鼠，小^)、馬、奶牛、豬、綿羊、狗等等。在用于M人的綴合物中人的IL12是他逸的。IL12是作為由40 kDa (p40) 亞# 35 kDa (p35)亞^iBL^的天^"在的異二聚^^蛋白，亞基的實(shí)際^1:可 以有變化，例如當(dāng)在不同的樹(shù)中表達(dá)時(shí)，并JL^:于蛋白是否^t基化以及 糖基4bl^式。術(shù)語(yǔ)"p40 "和"p35"因此并不意pM該亞基分別M精確的40和 35 kDa ^t。反之，這些術(shù)iS^iM^定和區(qū)別IL12的這兩種異二聚體亞基， 這可以根提它們的JU^列更準(zhǔn)確地確定。異二聚體IL12包含第一第二多 綠基，*^別與人IL12的p40亞絲p35亞基同源i^目同.典型地，IL12 的第一錄包賴(lài)J(J^列與如SEQ ID NO: 3所示的人的ILH亞基p40的 ^J^序列有至少60%、 65% 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或100%序列同一 性。典型地，IL12的第二亞基包^^^J^序列與如SEQIDN0: 4所示的人的 IL12亞基p35的^J^序列有至少60 6、 65% 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或100°/。序列同一性。在本發(fā)明的綴^^中的IL121橫IL12的生物活性，例如 具有作為活化的T和M細(xì)胞的生長(zhǎng)因子的能力，增強(qiáng)NK/淋巴因子激活的殺傷 細(xì)胞的溶解活性，通過(guò)使PMBC休目M'J激IFN-Y的產(chǎn)生，抑制血管生成(例々叇 過(guò)下i^HUP-10)，和/或抑制腫瘤生#/或#^多。特異^#合成員是一對(duì)^"元件，具有相互的結(jié)M異It。 一對(duì)特異的結(jié) 合成員可以K然來(lái)源的或完全或部分itk^成生產(chǎn)，該對(duì)W的一個(gè)元件在其 表面上具有區(qū)域，或空腔，它特異麟合至并因此互補(bǔ)于該對(duì)襯的另一元件 的特殊的立^^極'l^誠(chéng)。因此該對(duì)元件具有;^^異f!i^合的特性。特異性結(jié)^^成員通常包^^具有^^結(jié)^i點(diǎn)的^"。例如，特異l^合成 員可以是^^襯或含有^^結(jié)^i點(diǎn)的非^^蛋白。^^、結(jié)合點(diǎn)可以通it4[29: 30， 31]或者i^蛋一白支架內(nèi)的環(huán)上隨M剛或突變^liJ^JJlt賦予 對(duì)期望乾的結(jié)^ft異It。蛋白中用于X^呈化新的結(jié)合點(diǎn)的支架已經(jīng)被詳細(xì)地綜 述[31]。用于^^以物的蛋白支架已經(jīng)被/>^[32],包輛蛋白質(zhì)(^^^以 物)含有纖連蛋白類(lèi)型III結(jié)構(gòu)域,具有至少一個(gè)隨^.可^-^或多種CDR i^v其中的適宜支架，例如一組HCDR，可以通it^疫球蛋白基因絲的^^T結(jié) 構(gòu),件提供。支架可以是人的或者非人的蛋白。非^^蛋白支架的優(yōu)勢(shì)在于在支架W內(nèi)可以提供^^結(jié)^i點(diǎn)，該襯 至少比有些抗體分子小和/或易于生產(chǎn)。特異It^合成員小的尺寸可以賦予有用 的生理特性:WiA細(xì)胞，^fji且織^^者到達(dá)其它結(jié)構(gòu)內(nèi)的把點(diǎn)，或者結(jié) 合至目標(biāo)4^^蛋白魏內(nèi)的能力，非抗體蛋白支架內(nèi)抗源結(jié)合點(diǎn)的使用綜^[34]中。典型的是^穩(wěn)定骨 架和一個(gè)或多個(gè)可變環(huán)的蛋白質(zhì)，其中環(huán)或多個(gè)環(huán)的^J^列是特異的或者 隨機(jī)突變的，來(lái)創(chuàng)造^^結(jié)棘點(diǎn)，其具有結(jié)合目標(biāo)抗原的特異性。這樣的蛋 白質(zhì)^^妙色葡萄球菌(S. aureus)的蛋白A、鐵^it蛋白、四連蛋白、纖連 蛋白(例如第10個(gè)纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)詢(xún)和脂籠蛋白的IgG結(jié)^構(gòu)域，其它 途徑^#^成"微跳"(Selecore GmbH)，其以財(cái)襯內(nèi)^6I;的環(huán)肽小蛋白 質(zhì)為基礎(chǔ)。^^主意，歸CDR能夠^iL架如纖連蛋白或細(xì)胞色素B攜帶[29， 30， 31], 用于攜帶4^發(fā)明的CDR或-"^E CDR的結(jié)構(gòu)他逸的是#的重#^^序列或者它們的實(shí)質(zhì)部分，其中CDR或一組CDR位于自然JLt的由重排免疫球蛋白基因 編碼的VH和VL M可變結(jié)構(gòu)域的CDR或一組CDR的相應(yīng)位置，免疫球蛋白可 變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和位置可以參考Kabat等[35]及其更新來(lái)確定，#也可用國(guó) 際互聯(lián)網(wǎng)(http : / / immuno.bme.nwu.edu或者利用任何搜索引擎搜索"Kabat ")。脅襯狄疫球蛋白，或者狄然的或者是部^k^完4^^處產(chǎn)的。 術(shù)語(yǔ)也涵蓋^^r含有^^f、結(jié)^i點(diǎn)的多AUil蛋白。財(cái)可能，利用單克絲其它脅以及寸狄重組DM ^M^生產(chǎn)其它的淋 或嵌"子，仍##原始#的特異性。這樣的技術(shù)可以涉及將編碼M的免 疫球蛋白可變區(qū)或者CDRs的DM導(dǎo)入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)、或恒定區(qū)加框 架區(qū)[37， 38， 39].產(chǎn)生抗體的雜^l或其它細(xì)胞可以經(jīng)歷遺傳突變或者其它 改變，可以 或可以不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)^#異性。因?yàn)镸能夠用很多方式修飾，術(shù)語(yǔ)"^^^""應(yīng)該被認(rèn)為是涵蓋了任何 具有所需特異性的^#^^結(jié)綠點(diǎn)的特異性結(jié)合成員或物質(zhì)，因此，術(shù)語(yǔ)涵 蓋了M片段以及衍生物，包^f封可含有^^f結(jié)^i點(diǎn)的多肽，無(wú)論K然的或者K全或部分合成的。因此也包括含有與另一多JlUi合的扭i^原結(jié) *點(diǎn)，或等效物的嵌^^"。嵌合^的克1^^^1//^的[40， 41〗。跳Xif呈領(lǐng)域可用的更進(jìn)一步的^^使得可以分離人的和人源^^,例 如，如先前所描述的能夠制iiA的雜^1[36]。噬菌體展示，另一產(chǎn)生特異性 結(jié)合成員的確定凈1^已經(jīng)被詳細(xì)描述[36， 42].小鼠^^基因M活并^1人的^^基因替換而且保留小！^它完整的免 疫系^^^轉(zhuǎn)基因小鼠食,于分離人的M[43]。合成^^f"可以通it4^合成的并且插Ait宜的^Ji^體內(nèi)的寡聚核苷 g因來(lái)創(chuàng)造[44， 45]。已録示，^h脅片段能夠?qū)崿F(xiàn)結(jié)合^^的功能。.由于其小的尺寸并且 最小^^與其它^^受體(例如Fc受體)相互作用，脅片段艦的;LML明 的綴合物'特別M的是單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)m過(guò) 肽M連接，允許兩個(gè)結(jié)構(gòu)^^^^^結(jié)合點(diǎn)[46, 47]。通iti^接VH和VL 結(jié)構(gòu)域的^M^的摻入，scFv可以被穩(wěn)定化[48〗，另^t小的^^結(jié)合M片^idAb(結(jié)構(gòu)域^W，即^^重M^的可變區(qū)[28]。 VH dAb自然^A^^駝中(例如駱駝、美洲駝)并且可以用目標(biāo)vR 原免疫駱駝，分離^f、特異的B細(xì)胞并且直接從單個(gè)的B細(xì)胞中克隆dAb基因 來(lái)生產(chǎn)。dAb也可以在細(xì)^l"養(yǎng)物中生產(chǎn)。它們的小尺寸，^的溶解度以及j顯單個(gè)結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)^^成員，特別^1單個(gè)結(jié)構(gòu)域的M如dAb,可以用 于本發(fā)明中，并且可以從例如Do咖ntis、 Phylos、 Pieris和Aff ibody商業(yè)上 買(mǎi)到。^^結(jié)^f立點(diǎn)^子的"^分，其結(jié)合到并且互補(bǔ)于目標(biāo)抗原的4^P或部 分。在:ii^襯中它被稱(chēng)為^^^結(jié)^f立點(diǎn)，并且包絲異艇合到和互補(bǔ) 于目標(biāo)抗原的4^P或部分的^^部分。其中抗源很大時(shí)，M可以?xún)H^it合到 抗原的特定部分，該部^f皮稱(chēng)為抗源^^位。抗/^^結(jié)合f立點(diǎn)可以通過(guò)一個(gè)或 多個(gè)^^可變結(jié)構(gòu)^€供。 的，^^^結(jié)純點(diǎn)包含^^^可變區(qū)(VL) 和旨重^^T變區(qū)(VH)。術(shù)語(yǔ)"特異的"可以用于指一種情況，其中特異f^合酉。寸中的一個(gè)元件不 會(huì)顯示出與它的特異性結(jié)合S沐(S)以外的任何分子的顯著結(jié)合。術(shù)語(yǔ)^Lit用 于，例如^f、結(jié)^f立點(diǎn)對(duì)特殊的表位是特異的，許多^^、攜帶該表位，在該種 情況下攜帶有^^結(jié)合位點(diǎn)的特異性結(jié)合成員能夠與攜帶該表位的不同抗原相 結(jié)合'L19 ^A的重組M，對(duì)纖連蛋白同種型B-FN的ED"B結(jié)構(gòu)^1特異的。 這種^^它的序列ei4先1^"描述[20]。 L19的單鏈Fv也已被描述，并且優(yōu) ^k^A4^發(fā)明的綴絲內(nèi)。ScFv (L19)是含有L19 VH結(jié)構(gòu)# L19 VL結(jié)構(gòu)域 的scFv，其中VH和VL通it^接頭序列連接在一個(gè)多肽鏈中。VH結(jié)構(gòu)域含有VH CDR1、 CDR2和CDR3序列，并且VL結(jié)構(gòu)域含有VL CDR1 、 CDR2和CDR3序列，如 圖IO所示，L19 CDR序列是VH CDR1 SFSMS SEQ ID NO: 25VH CDR2 SISGSSGTTYYADSVKG SEQ ID NO: 26VH CDR3 PFPYFDY SEQ ID NO: 27VL CDR1 RASQSVSSSFLA SEQ ID NO: 28VL CDR2 YASSRAT SEQ ID NO: 29VL CDR3 QQTGRIPPT SEQ ID NO: 30VH結(jié)構(gòu)域可以具有如SEQ ID NO: 22所示的^J^序列，并且VL結(jié)構(gòu)域 可以具有如SEQ ID NO: 23所示的^tj^f列(圖10)。 VH和VL結(jié)構(gòu)^常通 ita接頭連接，如12個(gè)絲的絲SEQIDN0: 24(圖10)。 to的，scFv(L19) 具有如SEQ ID NO: 5所示的^iJ^序列。


圖1(A)顯示的是sclL12-scFv(L19); (B)顯示的是sclL12-SIP(L19)同型 二聚體；(C)顯示的是p40"ScFv (L19) / scFv (L19)-p35異二聚體。圖2(A)顯示的是^ii原的和非還原條降下sclL12-scFv(L19)l:^蛋白的 SDS-PAGE分析；(B)顯示的W然糾下顯示為二聚體的sclL12-scFv (L19)融 ^"i"白的^^i;慮^^布。圖3顯示了用體內(nèi)分布M"測(cè)定的sclL12-scFv(L19)體內(nèi)乾向性。積累量 以(A)4和(B)24h后每ii且織的:;iA劑t/。表示(。/。n) / g)。 ^C^性的組織是(從 左Jj&):腫瘤、脾、肝臟、肺、心臟、腸、iL^和腎。圖4(A)顯示的是&原的和非i^f、務(wù)降下sclL14-SIP(L19)融M白的 SDS-PAGE分析；(B)顯示的;1^然##下顯示為二聚體的sclL14-scFv (L19)融 M白的^^^慮^^布。圖5顯示的^1體內(nèi)分布" "測(cè)定的sclL12-SIP(L19)體內(nèi)耙向性以及積 累量以(A)4和(B)24h后每克組織的注入劑i^表示W(wǎng)lD / g)。代^j法的紐3只是腫瘤、脾、肝臟、肺、心臟、腸、Jfi^腎' 圖6(A)顯示的是扭原的和非i^f、條件下p40-scFv(L19)/ scFv(U9)-p35融合蛋白的SDS-PAGE分析；(B)顯示的是天然條件下顯示為二聚體的 p40-scFv (L19) / scFv (L19) -p35 Isfe^白的^^i;應(yīng)^^布。圖7顯示的;|^1體內(nèi)分布" *測(cè)定的p4(HscFv (L19) / scFv (L19) -p35體內(nèi) 把向性以》J 、累量以(A) 4和(B) 24h后"^iia織的注/^劑J^^^示(%ID / gh代 表性的^UR是(^iJ^):腫瘤、脾、肝臟、肺、心臟、腸、jfc^t和腎。圖8顯示了^liJ^列SBQ ID NO: 1。從N到C絲，序列含有(i) 信號(hào)敗(ii) 人的IL12 p40亞基(SEQ ID恥3的虛線(xiàn)下劃線(xiàn)所示的)；(iii) 肽絲卿ID NO: 15);(iv) scFv(L19) (SEQ ID NO: 5下劃線(xiàn)所示的);和(v) myc;即信號(hào)肽-人p40-接頭-L19iyc。在我們所^^的編>6 齡列中，myc標(biāo) 簽后接三*止密財(cái)。圖9顯示了^J^f列SEQ ID NO: 2。序列含有，從N到C賴(lài)(i) 信號(hào)眠(ii) scFv(L19) (SEQ ID NO: 5的下劃線(xiàn)所示);(iii) 肽接頭(SEQ ID NO: 15);(iv) 人的IL12 p35亞基(SEQ ID NO: 4的虛線(xiàn)下劃線(xiàn)所示)；和(v) 6His-終；即信號(hào)肽-L19-接頭-人p35-6xHis。在我們所使用的編g^列中， 六個(gè)組^^接三^Hf止密^f"。圖10顯示scFv(L19)的^J^列(SEQ ID NO: 5)。 VH和VL結(jié)構(gòu)^^皮單 獨(dú)顯示(分別為SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 23)。在VH和VL結(jié)構(gòu)域中CDR1 2 和3序列均為下劃線(xiàn)所示。VH和VL結(jié)構(gòu)m過(guò)12個(gè)殘JJi接頭序列分開(kāi)，(SEQ ID NO: 24)。圖11顯示抗^Jt蛋白"C scFv TN 11的^J^列(SEQ ID NO: 21)。 本發(fā)明的方面和M實(shí)施方案將在以下^^I^^^Ni兌明。 實(shí)施例^^i!E我們描述IL12-L19綴M三種不同形式的生產(chǎn)和特征，證明^EjH^ 求的形式的體內(nèi)把向m^^l!i。分別說(shuō)明在圖1 A、 B和C中的三種形式是sclL12-scFv(L19)、 sclL12-SIP (L19)同型二聚# p4(hscFv (L19) / scFv (L19)-p35異二聚體。描錄圖1 A中的sclL12-scFv(L19)是sclL12和scFv(L19)的ili^白。 由于每^f"有單一scFv:^^結(jié)^:點(diǎn)，綴^因jtbi^^。圖1 B描述的sclL12-SIP(L19)同型二聚^^是兩種iH^白的同型二聚體， 每個(gè)融^f"白分別含有sclL12、 scFv(L19)和人IgE的CH4結(jié)構(gòu)域，綴^^通過(guò) 兩個(gè)CH4結(jié)構(gòu)域間的二iMt^^接實(shí)^聚化，形成微M或SIP結(jié)構(gòu)，由于每 個(gè)分子中存在兩個(gè)scFv (L19)抗源結(jié)械泉，綴^的因此是二價(jià)的.圖1 C中說(shuō)明的p40"ScFv(L19)/ scFv(L19)—p35異二聚體是兩個(gè)不同的融 ^白的異二聚體。第"nlfe^蛋白含有人IL12p40亞基，通過(guò)6個(gè)^J^的肽18接頭GSADGG與scFv(L19)的N絲融合(SEQ ID NO: 15)。第二融^白含有 scFv (L19)，通過(guò)6個(gè)^J^的肽接頭GSADGG與人IL12 p35亞基的N輛融合 (SEQIDN0: 15)。該兩種融M白通過(guò)p40和p35亞基間的J^iiL^^接來(lái)實(shí)現(xiàn) 異二聚化，形^^異二^^體p40-scFv(L19)/ scFv(L19)-p35。由于每個(gè)襯存在 兩個(gè)scFv (L19) ^f、結(jié)^^立點(diǎn)，該綴*是二價(jià)的。 沒(méi)有FLAG標(biāo)蒼的sclL12-scFv (L19)因?yàn)橄惹懊枋鯷15]的原始融合蛋白使用C-末端FLAG標(biāo)簽來(lái)克隆(" sclL12-scFv(L19)-FLAG ")，我們應(yīng)該考慮剖這樣的可能l"生，含有酪狄的FLAG 標(biāo)善可能使得在體內(nèi)分布微中存在假象。當(dāng)?shù)鞍字械睦野彼醝fc^H射己時(shí)， FLAG標(biāo)蒼的溶劑暴露的酪#^也可以被>^匕。FUG標(biāo)各可以后;JME體內(nèi)蛋白水 解。為了^W究該I:^白的肺瘤乾向特性，我們克隆和M了沒(méi)有FLAG #^的sclL12—scFv(L19)l:fe^白。sclL12-scFv (L19)的克1^表達(dá)以含有sclL12-scFv(L19)-FLAG[15]基因的pCH33載體作模板，擴(kuò)增 sclL12-scFv(L19)的DNA片段。PCR^H^] sp40backEco引物(5 ' ccg gaattc atg tgt cct cag aag cta ace atc 3 ') (SEQ ID NO: 6)，其用p40的內(nèi)源分 泌序列退火并且在它的5 '端添加核酸內(nèi)切酶EcoRI限制性位點(diǎn)，以及 U9stopNotfor引物(5 ' ttt tcc ttt t gcggccgc cta tea tea ttt gat ttc cac ctt ggt ccc 3 0 (SEQ ID NO: 7)， sclL12-L19融妙白的3 '端添加三* 止密碼子并^添加核酸內(nèi)切酶Notl的限制性位點(diǎn)，并且因M失FLAG標(biāo)簽， 利用栽體的EcoRl和Notl限制性位點(diǎn)，將DM片^隆入哺乳動(dòng)物細(xì)I^^U^ 體pcDNA3.1(+)栽體(Invitrogen, Basel,瑞士)內(nèi)。用該載,染HEK 293細(xì)胞并^G418(500jig/ ml)存在下選g定的轉(zhuǎn) 染子。通過(guò)ELISA法篩i^Ji^M"白的抗G418細(xì)胞克隆，^f捐Aif連蛋白的 重組ED"B結(jié)構(gòu)域作為抗原。如先前e^述的[19， 20],利用^色i普法it^^ ;i^^l&^養(yǎng)基中^^l^"白并M4iC下過(guò)^t析MjL。 Isfe^白在-20"C 下以等^#可分量冷凍'在SDS-PAGE上在還原的和非i^M下以;M" Superdex S-200柱(Amersham Pharmacia Biotech) Ji^天然^Ht下通過(guò)FPLC 凝膠過(guò)濾分析sclL12-scFv(L19)融合蛋白的大小。與單體的原始 sclL12-scFv(L19)-FLAG l:l^白不同，大約三分之一的IL12—L19蛋白級(jí)^iiE明是二聚體。sclL12-scFv(L19)的^f^征用體內(nèi)分布實(shí)^"測(cè)定沒(méi)有FLAG標(biāo)l的sclL12-scFv(L19)的體內(nèi)乾向性。 因此用FPLC ^^過(guò)濾法過(guò)S叩erdex S-200柱純化融^f"白的單^l分。級(jí)分 純化后立即^^匕并且^A^攜帶鼠畸胎癌肺瘤的129SvEv免疫活性小鼠。注射4 和24小時(shí)后殺死小鼠，稱(chēng)重器官并且計(jì)I^W性。代表性器官和肺瘤內(nèi)的積累 量以每克組織的;^^劑量的%4示(%10 / g)(圖3)。 24小時(shí)后沒(méi)有X!L^到在腫 瘤位置有積累。因jt誠(chéng)們認(rèn)為flag標(biāo)各沒(méi)有干擾體內(nèi)分布結(jié)果。sclL12—SIP(L19)同型二聚體已經(jīng)證明了當(dāng)^ft助于人的IgE的CH4結(jié)構(gòu)域?qū)cFv(L19)二^^^，構(gòu)成 微^^結(jié)構(gòu)，也稱(chēng)為"小的免疫蛋白"或SIP， scFv(L19)的腫瘤乾向',得到改 善.SIP(U9)的腫瘤靶向特性先前已被描述[21]。因此，我們構(gòu)建了 sclL12-SIP(L19)的同型二聚體，測(cè)試該形^i否也改善了 IL12對(duì)腫瘤的把向 性。我們構(gòu)建sclL12 SIP(L19)融^S"白，通過(guò)將人的IgE免疫球蛋白的CH4 結(jié)構(gòu)域l:fe^在sclL12-scFv (L19) -FLAG融合蛋白的c-末端[22]。 sclL12-L19-SIP同型二聚體的克隆和^J^將CH4結(jié)構(gòu)域^^至sclL12-L19片段的c-末端是通過(guò)一輪PCR并且將PCR 片段插入已含CH4結(jié)構(gòu)域的載體中來(lái)完成。從含有sclL12-scFv (L19)-FLAG基因的pCH33載體中擴(kuò)增sclL12 scFv(L19) 片段[15]'改換限制性位點(diǎn)，^^引物sp40backHind(5' ccgta aagctt atg tgt cct cag aag cta acc atc 3 ') (SEQ ID NO: 8)，該引物在p40分泌序列的5 ' 端ii^并且將EcoRl更妙Hindill限制性位點(diǎn)，以及引物L(fēng)WforAgelBsp(5 ' tgt ggg accggt ttt gat ttc cac ctt ggt ccc 3 0 (SEQ D NO: 9)，其在3 ' 端狄，除掉FLAG;^f且導(dǎo)入Agel限制性位點(diǎn)，提供BspEl的格l4^。 一^gj^接了 ， Agel / BspEl限制性位點(diǎn)與BspEl就;^#是可^|.這一步是必 需的因?yàn)閟clL12序列含有BspEl限制性位點(diǎn)?，F(xiàn)在使用核酸內(nèi)切酶Hindlll 和BspEl將片^隆入Ci^有CH4結(jié)構(gòu)域并在它的5 '絲含有BspEl P艮制性位 點(diǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞pcDNA3.1 (+)^ii^體Ul〗。sclL12-SIP(L19)的轉(zhuǎn)染、^ii^純^^照以上所述的sclL12-scFv(L19)融M白的方法進(jìn)行。也是在SDS-PAGE上在還原的和非iE^務(wù)降下以;ML Superdex S-200 ^Ji^天然糾下通過(guò)FPLC ^Mi^慮，分析IL12-SIP (L19)融 M白的大小(圖4)。sclL12-SIP(L19)同型二^^的特征sclL12-SIP(L19)在第二步蛋白過(guò)S叩erdex S-200^^it^ii^^化并 且收集后立即輻射^f匕二聚體級(jí)分。標(biāo)記蛋白注入攜帶F9鼠畸胎癌肺瘤的 129SvEv免疫活性小鼠。注射4和24小時(shí)后殺死小鼠，稱(chēng)重器官并且計(jì)lfc^ 性強(qiáng)度。^性器官和腫瘤內(nèi)的積累量以每克組織的注入劑量的%表示(%10 / g)(圖5)。盡管sclL12-SIP(L19)蛋白在BIAcore中顯示出改善的ED~B結(jié)合活 性，但未淑Jl^到提高了肺瘤攝取并ilJt瘤攝取仍粉艮差。p40-scFv (L19) /scFv (L19) -p35異二聚體p40-scFv(L19)/ scFv(L19)-p35異二聚體由兩個(gè)亞基組成。 一個(gè)含有 scFv(L19)片段，融合至IL12的p35亞基的N-末端(scFv(L19)-p35)。在第二個(gè) 中，IL12的p40亞Ui合至scFv(L19)的N—絲(p40-scFv(L19))。然后通過(guò) p40和p35間的二石克鍵用融合蛋白質(zhì)構(gòu)建異二聚體p40-scFv(L19)/ scFv(L19)-p35。該異二聚體抗體-細(xì)胞因子融合蛋白綴合物在非糖基化時(shí)預(yù)計(jì)的大小為 114 kD。由于不同的糖基4^態(tài)和不同的糖基化方式，#^綴#所要在其中 ^Ji的物種不同，綴合物的M量可以有變化。,沒(méi)有W^后的糖基化的DM 序列長(zhǎng)度，融合蛋白質(zhì)的理論大小是p40-U9為65 kDa， L19-p35為49 kDa以 及異二聚體p機(jī)19 / L19-p35為114 kDa,p40-scFv (L19) /scFv (L19) -p35的克lt^狄兩個(gè)亞基p40-scFv(L19)和scFv(L19)-p35分別克隆入兩個(gè)不同的載體， 第-Hv^有用于檢測(cè)的myc標(biāo)簽以;S^^^有用于檢測(cè)的his標(biāo)簽。組^^線(xiàn)含有編碼sclL12-scFv(L19)-FLAG蛋白的基因的pCH33載體[15〗 和含有編碼SIP(L19)片段的基因的pLB載體[21]作為模板，PCR生產(chǎn) p40"ScFv(L19)inyc片段。朋pCH33作;^L^建含有p40"lp^l第一片段A, PCRA^MM第一引物HindSp40back(5 ' ccc aagctt atg tgt cct cag aag cta acc atc 3 0 (SEQ ID NO: 10)，該引物與IL12的p40亞基的分泌序列i^C并 在5 ';W引入核酸內(nèi)切酶Hindlll限制性位點(diǎn)以朋第二引物Sp40HaLifor(5'acc tec ate age get tec gga teg gac cct gca gg 3 ') (SEQ ID NO: 1 1), 該引物與p40的3 '端退火,并添加1分接頭(GSADGG)用于融合至第二片段B。 利用才飄pLB在兩輪PCR中構(gòu)建提供scFv(L19)部分的片段B， 4M第一引物 LinkLWback(5 , gga age get gat gga ggt gag gtg cag ctg ttg gag tc 3 ,)卿 ID NO: 12)，該引物與scFvL19的5 '末端退火并添加一lp分接頭(GSADGG) (SEQ ID NO: 15)以;S^二引物L(fēng)WmycstoBamfor (5 ' att cag ate etc ttc tga gat gag ttt ttg ttc ttt gat ttc cac ctt ggt ccc ttg 3 0 (SEQ ID NO: 13),該引 物與scFv(L19)的3 '端退火并且添加C-末端myc標(biāo)簽。該片段使用引物 LinkLWback和第三引物mycstoBamfor在第二輪PCR完成，第三引物 mycstoBamfor (5 ' cgc ggatcc eta tea tea att cag ate etc ttc tga gat gag ttt 3 0 (SEQ ID NO: 14)在片段B的5 '端添加3 >Hf止密碼子和BamHl限制進(jìn)行PCR，通耕性接頭GSADGG將p40片^li合至脅片段scFv(L19)的N-末 端，產(chǎn)生片段p40"GSADGG"L19iyc。然后利用Hindlll和BamHl作為P艮制性位 點(diǎn)將該片^jt隆入哺乳動(dòng)物^i^體pcDNA3.1+ / Hygro， ^^^潮霉素抗性用于 選擇。用該載^^染CHO細(xì)胞并且用潮霉素選樹(shù)t、定的轉(zhuǎn)染子(500ng/ ml)。 用ELISA法^^J重組體ED~B作為抗原篩選陽(yáng)性克I^MM^J抗myc M用于檢 測(cè)。扇Ji蛋白并iUtii^前描述[19， 20]的抗原親和色鐠法>^^|#^養(yǎng)基 中純化，在4"C下透析過(guò)M鹽。該l^"白在-20X:下以等^^可^i:冷凍， SDS PAGE大小分析顯^H亥蛋白的大約5W為不同形式的^tJ^SiN^大約50% 的同型二^^[23]。^fei且^^^)相同的質(zhì)粒pCH33和pLB作為模板PCR生產(chǎn)scFv (L19) -p35-Hi s 片段。與scFv(L19)部^j"應(yīng)的第一片段C以pLB為^L^J建，，第一引物 EcoLonSL19back(5 ' ccg gaattc get tgt cga cca tgg get g 3 0 (SEQ ID NO: 16)，與scFvl-19的分泌序列i^并在它的5 '絲引入核酸內(nèi)切酶EcoRl的限 制性位點(diǎn)以及第二引物L(fēng)19HaLifor(5 ' acc tec ate age get tec ttt gat ttc cac ctt ggt ccc 3 0 (SEQ ID NO: 17)，與scFv(L19)的3 '端狄，引入一 部分接頭(GSADGG)。含有P35部^第二片段D以pCH33為觀(guān)用兩輪PCR構(gòu) 建，^J l第一引物HaUp35back(5 ' gga age get gat gga ggt agg gtc att cca gtc tct gga 3 0 (SEQ ID NO: 18)，與穩(wěn)定的p35亞基5 '端i^并在它的5 '末端添加"-^分接頭(GSADGG)以^二引物p35hisfor (5 ' gtg atg gtg atg atg atg ggc gga get cag ata gcc 3 ') (SEQ ID NO: 19)，與p35亞基的3 '端退 火并添加his標(biāo)簽。在第二輪PCR將3個(gè)終止密碼子和Notl P艮制性位點(diǎn)添加至 片段D的3'端，使用引物HaLip35back和第三引物p35hisstoNotlfor(5' ttt tec ttt t gcggccgc eta tea tea gtg atg gtg atg atg atg ggc 3 ,) (SEQ ID NO: 20)。雞將p35細(xì)胞因子亞絲過(guò)PCR融合至scFv(L19)片段的C一;M^， 組合使用引物 EcoLonSLWback 和 p35hisstoNotlfor 生產(chǎn) L19 L19"GSADGG~p35-his。5 ^^f^I EcoRl和Notl限制性位點(diǎn)將該片^SjL隆入pcDNA 3.1哺乳動(dòng)物表ii^體，提情霉素抗性。轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞并JJD G418(500 jug/ ml)選糊!定的轉(zhuǎn)染子。通過(guò)ELISA法篩錄iili錯(cuò)白的拔l!i克隆轉(zhuǎn)染 細(xì)胞，^^人的重組EDB作為^^和^i且^^脅用于檢測(cè)。如前所述[19， 20] 通過(guò)親和色語(yǔ)法過(guò)^^^細(xì)，#^養(yǎng)基中純化融合蛋白，在4"下透析過(guò)夜 脫鹽。SDS PAGE分析顯示表ii^mil的并JU^^H玄蛋白是由轉(zhuǎn)、二聚#高 錄聚體城。然后同時(shí)用編碼scFv(L19)-p35和p40"ScFv(L19)的兩個(gè)載^^轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞。用G418(500iag/ml)和潮霉素(500Mg/ml)選擇含有兩種l^蛋白的 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。使用作為抗原的重組EDB和抗myc抗體以及:^L^^^，用ELISA 法篩i!4達(dá)兩種融合蛋白的細(xì)胞。在第一步驟如先前描述[19， 20]利用親和色 i普法過(guò)ED"B ^^^fc化l^蛋白質(zhì)并且在4X:下透析過(guò)^jL。然后在第二步 驟中通過(guò)HisTrap HP 1 ml Ni2+柱(Amersham Biosciences)純化該第一級(jí)分，洗 除沒(méi)有被束綽于異二聚體(p40"ScFv(L19)/ scFv(L19)-p35)內(nèi)的游離 p40-scFv(L19)片段，為了|&#，向蛋白中加入0.1%的-說(shuō)80,然后以等^ ##蛋白冷凍于-80"' SDS PAGE分析顯示，在非ii^條件下，該蛋白是兩種糖基化狀態(tài)的二聚體以;M^原狀態(tài)下，該蛋白是兩種不同大小的異源牟沐， 其中p40~L19單體呈現(xiàn)兩種不同的糖基化狀態(tài)。利用Superdex S-200 ;tii^行凝 膠it^,，證明該蛋白在自脈態(tài)下是純的二聚體(圖6)。 p40"ScFv(L19)/scFv(L19)-p35的^iE通過(guò)已^M匕的異二聚體蛋白的IL12活性判喊I:1^白是否JE^折疊和 IL-12洽hiitiiii行T細(xì)j^殖分析來(lái)判斷[24],簡(jiǎn)言之，用^J1MJ!&^裂劑(植物血細(xì)艦集素(PHA)和IL-2)培糾眠的AJf周jk^[細(xì)胞(PBMC) 3天， 并且隨后用融合蛋白或商業(yè)上可買(mǎi)到的、重組的、鼠的IL-12(R & D Systems Europe Ltd, Abingdon United Kingdom)的系列稀#"液作為標(biāo)>1^養(yǎng)。|5|^用 [3H]胸腺^^^A測(cè)量增殖。用在Superdex S-200柱上FPLC皿過(guò)濾的已純化的和放射'f4^典化的 p40—scFv(L19)/scFv(L19)-p35進(jìn)行體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)。才科2^白; iA攜帶F9鼠畸 胎癌腫瘤的129SvEv免疫活性小鼠。注射4和24小時(shí)后殺死小鼠，稱(chēng)重器官并 且計(jì)toW性。代^4性器官和腫瘤內(nèi)的積累量以每克組織的注入劑量的%表示 (%ID / g)。我們^JU異二聚體形式，實(shí)現(xiàn)了在24小時(shí)的腫瘤攝取量幾乎為 10% (圖7)。參考文獻(xiàn)所有引用的M文獻(xiàn)特此引A^文作為參考。1. 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權(quán)利要求
1. 一種包含具有第一和第二亞基的異二聚體蛋白的綴合物，其中所述的第一和第二亞基各自綴合于單鏈Fv(scFv)，并且其中所述的異二聚體蛋白含有治療或診斷劑。
2. 才娥;M'漆求1的綴合物,其中所述的第一亞^^合于scFv作為第一融 M白，而所述的第二亞^^合于scFv作為第二融^白。
3. 才N^U'J要求1或^5U'漆求2的綴合物，其中所述的異二聚體蛋白的第 卡第二亞糾ii^克鍵"M^接。
4. #^擬'漆求1至3的^-項(xiàng)的綴賴(lài)，其中所述的異二聚體蛋白是 IL12。
5. 才娥前述^"^'J^求的綴^的，其中所述的綴^具有250， 000或更 低的襯量'
6. 才N^K矛J^求5的綴*，其中所述的綴^;具有的襯量為150， 000 或更小。
7. 才^^M'J^求6的綴合物，其中所述的綴*具有的分子量為120， 000 或更小。
8. 才Nt前述^-^'J^求的綴^的，其中所述的兩個(gè)scFv是相同的。
9. #*|jM'JJN^ 1至8的綴合物，包>^_合于并位于兩個(gè)scFv之間的人的 IL12異二聚體；其中IL12異二聚^^r有第-"^第二亞^; 所述的第一亞^i^合于scFv作為第一融合蛋白；而 所述的第二亞J^合于scFv作為第二l:fc^白。
10. 才^l^;M'J^求9的綴*,其中所述的第一l:fe^白絲如SEQ ID NO: 1所示的^J^序列。
11. 才N^5U'J^求9或^'J^求10的綴^^，其中所述的第二l:^f"白具 有如SEQ ID NO: 2所示的^iJ^序列。
12. #4t |3u'JJN^ 1至9的fr"項(xiàng)的綴合物，其中一個(gè)或兩個(gè)scFv特異地 結(jié)合于與贊生'1^ ^/#管生^目關(guān)的^卜^成分。
13. 根據(jù)擬'漆求12的綴#，其中該成分是纖連蛋白ED"B。
14. 才^^M'J^求13的綴*，其中該scFv是具有VH結(jié)構(gòu)# VL結(jié)構(gòu)域 的scFv(L19)，所述VH結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO: 25、 SEQIDN0: 26和SEQIDNO: 27的^J^序列，所述VL結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO: 28、 SBQ ID NO NO : 29和 SEQ ID NO: 30的^l^^列。
15. 才^^WJ^求14的綴合物，其中scFv是具有如SEQ ID NO: 5所示的 ^Jj^列的scFv(L19)。
16. 才娘權(quán)矛澳求12的綴合物，其中該成分;IA腱蛋白"C同種型。
17. 根據(jù);M'J要求16的綴合物，其中scFv是具有如SEQIDNO: 21所示的 ^J^^列的scFv(TN11)。
18. 生產(chǎn)^^;M'J^求4至17的任一項(xiàng)的綴#的方法，包括 表ii^ 第^^l^白質(zhì)；和 將第-^第二亞基^^以形成異二聚體蛋白。
19. 才娥 M，J要求18的方法，包括在含有編碼兩種融^I"白的核酸的細(xì)胞 內(nèi)^Ji^""^第二融^I"白'
20. 才^t^U'J^求18或W，J^求19的方法，更i^一步包:fe將所述的綴^^ 配制成藥物組絲。
21. —種組*,包含含有編碼融M白的核苷^/f列的第一核酸^，其中該融M白包含 scFv和異二聚體蛋白的第一亞基以及含有編碼融合蛋白的核苷酸序列的第1酸分子，其中該融^白包含 scFv和異二聚體蛋白的第二亞基。
22. 推據(jù)^f'J^求21的組合物，其中scFv :ftwM'J^求12至17的^-~項(xiàng)中 所定義。
23. 才IUfjM'漆求21或^U'決求22的組*，其中所述的第一iia^是IL12 p40亞Jj^;S^斤述的第二亞基是IL12 p35亞基。
24. ;fm^，j^求21、 22或23的^-"項(xiàng)的組^，其中所述的第-^第二核^^U^""^第二栽體。
25. 一含有:iM5U'J^求21至24的^-項(xiàng)中所定義的第"""^笫J1^^^的宿主細(xì)胞。
26. "-^t藥物組^，其包^WM'決求1至17的—項(xiàng)的綴^。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1至17的任一項(xiàng)的綴合物，其用于通過(guò)療法治療人氛動(dòng)物。
28. 根據(jù)權(quán)利要求10至17的任一項(xiàng)的綴在制造用于抑制患者中血管生成和贅生性生長(zhǎng)的藥物中的應(yīng)用。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28的應(yīng)用，其中所述藥物用于治療腫瘤、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、 糖尿病性視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)肌肉退化或血管瘤。
30. —種抑制患者體內(nèi)贅生性生絲/或血管生成的方法，包括對(duì)患者施用根據(jù)權(quán)利要求10至17的任一項(xiàng)的綴合物。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30的方法，包通過(guò)抑制血管生成來(lái)治療腫瘤、類(lèi)風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)肌肉退化或血管瘤。
全文摘要
用于將治療或診斷劑或藥物靶向至體內(nèi)細(xì)胞或組織，例如贅生性生長(zhǎng)或血管生成的綴合物。綴合物在體內(nèi)診斷或治療上的應(yīng)用例如抑制腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移，抑制血管生成和/或治療癌癥。綴合物包含為寡聚蛋白質(zhì)例如異二聚體蛋白形式的治療或診斷劑，其中蛋白的第一和第二亞基各自綴合于特異性結(jié)合成員例如抗體片段如scFv。寡聚物的亞基可以綴合于特異性結(jié)合成員作為融合蛋白。綴合物可以包含具有兩個(gè)亞基的IL-12異二聚體，每個(gè)亞基與scFv L19或TN11融合，以將IL 12靶向至與贅生性生長(zhǎng)和血管生成相關(guān)的胞外基質(zhì)成分。
文檔編號(hào)A61P19/02GK101258162SQ200680015804
公開(kāi)日2008年9月3日 申請(qǐng)日期2006年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月11日
發(fā)明者C·哈林, D·尼里, V·加弗納 申請(qǐng)人:菲羅根股份公司