專利名稱：：非蛋白穩(wěn)定的梭菌毒素藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及梭菌毒素藥物組合物。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及含有非蛋白賦形劑的梭菌毒素藥物組合物，所述非蛋白賦形劑的作用是使存在于藥物組合物中的梭菌毒素(例如肉毒毒素)穩(wěn)定。
背景技術(shù)：
：藥物組合物是一種如下的制劑，它含有至少一種活性成分(例如梭菌毒素)，還含有例如一種或多種賦形劑、緩沖劑、載體、穩(wěn)定劑、防腐劑和/或填充劑，并且適用于向患者給藥以達(dá)到期望的診斷結(jié)果或治療效果。本文中公開(kāi)的藥物組合物具有診斷、治療和/或研究的用途。為達(dá)到穩(wěn)定儲(chǔ)存和處理方便，藥物組合物可以被制成凍干的(即冷凍千燥的)或真空干燥的粉劑，該粉劑可在向患者給藥前用適合的液體復(fù)水，例如用生理鹽水或水復(fù)水。另外，該藥物組合物可被制成水溶液或懸浮液。藥物組合物可以含有具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的活性成分。不幸的是，蛋白質(zhì)活性成分非常難于穩(wěn)定(即維持在一種生物活性損失最小的狀態(tài))，因此導(dǎo)致含蛋白質(zhì)的藥物組合物在制備、復(fù)水(如需要)期間和使用前的保存期內(nèi)損失蛋白質(zhì)和/或損失蛋白質(zhì)的活性。穩(wěn)定性的問(wèn)題是由于蛋白質(zhì)變性、降解、二聚化和/或聚合而發(fā)生。多種賦形劑，例如白蛋白和明膠，已被用于嘗試并穩(wěn)定存在于藥物組合物中的活性成分，并已獲得不同程度的成功。此外，例如乙醇之類的防凍劑已被用于減少在凍干法的冷凍條件下的蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)賦形劑多種蛋白質(zhì)，例如白蛋白和明膠已被用于穩(wěn)定存在于一種藥物組合物中的肉毒毒素。白蛋白是小且大量的血漿蛋白質(zhì)。人血清白蛋白的分子量約為69千道爾頓(kD)，已被作為非活性成分用于藥物組合物中，并在其中作為存在于藥物組合物中的某些蛋白質(zhì)活性成分的大載體(bulkcarrier)和穩(wěn)、定劑。白蛋白在藥物組合物中的穩(wěn)定功能可體現(xiàn)在藥物組合物的多步制備中和之后的所制備藥物組合物的復(fù)水時(shí)。因此，白蛋白可通過(guò)以下方式賦予藥物組合物中具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的活性成分穩(wěn)定性例如(1)降低蛋白質(zhì)活性成分與表面(例如實(shí)驗(yàn)玻璃器皿、導(dǎo)管的表面)、藥物組合物復(fù)水的藥水瓶和用于注射藥物組合物的注射器內(nèi)表面間的粘著力(通常被稱為"粘性，，)。蛋白質(zhì)活性成分粘附到表面會(huì)導(dǎo)致活性成分的損失和剩余蛋白質(zhì)活性成分的變性，兩者都會(huì)降低存在于藥物組合物中的活性成分的總活性，以及；(2)降低在制備活性成分的低稀釋溶液時(shí)發(fā)生的活性成分的變性。除了能夠使藥物組合物中的蛋白質(zhì)活性成分穩(wěn)定以外，人血清白蛋白在注射入病人體內(nèi)時(shí)還具有通?？珊雎悦庖咴缘膬?yōu)點(diǎn)。一種具致過(guò)敏反應(yīng)和;或抗藥性的/生，使得含有免疫原性組分的藥物組合物可能難以治愈所要治療的疾病或障礙。重組白蛋白曾被提出作為肉毒毒素藥物組合物中的穩(wěn)定劑。因此，已出版的申請(qǐng)?zhí)枮?0030118598(Hunt)的美國(guó)專利申請(qǐng)中公開(kāi)了多種賦形劑一例如重組白蛋白、膠原蛋白或淀粉一用于穩(wěn)定存在于藥物組合物中的肉毒毒素的用途。膠原蛋白是哺乳動(dòng)物中最豐富的蛋白質(zhì)，約占體內(nèi)所有蛋白質(zhì)的四分之一，并且是結(jié)締組織(例如皮膚、韌帶和腱)的主要組分。天然的膠原蛋白是三個(gè)高分子量蛋白質(zhì)的三螺旋。組成膠原蛋白螺旋的三條蛋白質(zhì)鏈的每一條都含有多于1400個(gè)氨基酸。在人體中已識(shí)別出至少二十五種不同類型的膠原蛋白。膠原蛋白在美容學(xué)上已被用作治療皮膚輪廓問(wèn)題的一種填充材料，例如用于平滑笑紋和皺紋，眉間紋、眼角紋和嘴唇上下的細(xì)小的垂直紋。膠原蛋白還可用于平滑某些術(shù)后外傷或痤瘡疤痕，以及病毒痘痕、例如水痘痘痕。為達(dá)到這些目的，膠原蛋白被注射進(jìn)真皮以墊尚皮狹。明膠可通過(guò)膠原蛋白的水解得到。明膠已被用于一些蛋白質(zhì)活性成分藥物組合物中作為白蛋白的替代物。值得注意的是，明膠是一種來(lái)源于動(dòng)物的蛋白質(zhì)，因此具有與人血清白蛋白相同的潛在的易感染性風(fēng)險(xiǎn)。中國(guó)專利CN1215084中討論了由天然明膠(一種膠原蛋白水解物)、動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)、葡聚糖和蔗糖制得的無(wú)白蛋白的A型肉毒毒素。美國(guó)專利No.6，087，327中還公開(kāi)了一種由天然明膠制得的A型和B型肉毒毒素的組合物。不幸的是，雖然已知蛋白質(zhì)賦形劑例如白蛋白或明膠具有穩(wěn)定作用，但是在藥物組合物中使用它們具有明顯的缺陷。例如白蛋白和明膠價(jià)格昂貴且越來(lái)越難以獲得。此外，當(dāng)用血液制品或來(lái)源于動(dòng)物的產(chǎn)品(例如白蛋白和明膠)向患者給藥時(shí)，會(huì)使患者處于獲得血液傳播的病原菌或感染劑的潛在風(fēng)險(xiǎn)中。因此，已知存在這樣的可能性，即在藥物組合物中含有來(lái)源于動(dòng)物的蛋白質(zhì)賦形劑會(huì)導(dǎo)致不慎將感染成分摻入藥物組合物。例如，已經(jīng)報(bào)道過(guò)使用人血清白蛋白會(huì)將朊病毒傳到藥物組合物中。朊病毒是一種具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的感染顆粒，它被假設(shè)是由產(chǎn)生正常蛋白質(zhì)的相同核酸序列產(chǎn)生的異常構(gòu)型的同種型。也有進(jìn)一步假設(shè)認(rèn)為感染性存在于翻譯后水平上正常同種型蛋白質(zhì)對(duì)朊病毒同種型的"募集反應(yīng)(recruitmentreaction)"中。顯然，正常的內(nèi)生細(xì)胞蛋白質(zhì)被誘導(dǎo)而錯(cuò)誤折疊成一個(gè)致病的朊病毒構(gòu)型。因此，人們期望能夠找到一種適合的可用于使存在于肉毒毒素藥物組合物中的肉毒毒素穩(wěn)定的賦形劑。優(yōu)選地，所述肉毒毒素穩(wěn)定劑不是來(lái)源于動(dòng)物(即哺乳動(dòng)物)源的蛋白質(zhì)。肉毒毒素梭狀芽孢桿菌屬("M"/V/w/z7)根據(jù)形態(tài)和功能分類包括有127個(gè)以上的菌種。革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌肉毒梭菌(67ay"/V/w/z/^^//77z/yz/)產(chǎn)生強(qiáng)力的多肽神經(jīng)毒素——肉毒毒素，它引起人或動(dòng)物的神經(jīng)性麻痹疾病，稱為肉毒中毒。肉毒梭菌及其芽孢通常存在于土壤中，并且該細(xì)菌能生長(zhǎng)在家庭罐頭工廠未適當(dāng)消毒和封口的食物容器內(nèi)，這是許多肉毒中毒病例的原因。肉毒中毒現(xiàn)象通常出現(xiàn)在食用肉毒梭菌培養(yǎng)物或芽孢污染的食物后18到36小時(shí)。肉毒毒素能毫無(wú)削弱地明顯穿過(guò)腸道壁并攻擊外周運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。肉毒毒素中毒的癥狀逐漸從行走、吞咽、說(shuō)話困難發(fā)展到呼吸肌麻痹和死亡。A型肉毒毒素是人類所知最致命的天然生物毒素。A型肉毒毒素(純化的神經(jīng)毒素復(fù)合物)對(duì)小鼠的LDso約是50皮克。有趣的是，在摩爾單位基礎(chǔ)上，A型肉毒毒素的致死力比白喉強(qiáng)18億倍，比氰化鈉強(qiáng)6億倍，比眼鏡蛇毒素強(qiáng)約3000萬(wàn)倍，比霍亂強(qiáng)約1200萬(wàn)倍。Singh，Cr/〃ca/J577ec"Aa"er/a//Vofe//77bu./751，NaturalToxinsII的63至84頁(yè)(第四章)，B.R.Singhetal.主編，PlenumPress,NewYork(1976)(其中才吏正了所稱的A型肉毒毒素的LD5。為0.3ng等于1U的說(shuō)法，因?yàn)閷?shí)際上1U約等于0.05ngBOTOX)。肉毒毒素一個(gè)單位(U)的定義是腹膜內(nèi)注射每只重18到20克的雌性SwissWebster小鼠得到的LD5。。也就是說(shuō)，一單位的肉毒毒素是殺死一組雌性SwissWebster小鼠中的50%所用的肉毒毒素的量。七種通常在免疫學(xué)上不同的肉毒神經(jīng)毒素已經(jīng)被鑒定，它們分別是血清型為A、B、d、D、E、F和G的肉毒神經(jīng)毒素，每種都通過(guò)與類型特異性抗體的中和來(lái)辨別。肉毒毒素的不同血清型在感染的動(dòng)物種類和所引起的麻痹的嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間方面有所不同。例如，已經(jīng)證實(shí)，通過(guò)用在大鼠中產(chǎn)生麻痹的速率測(cè)得，A型肉毒毒素比B型肉毒毒素強(qiáng)500倍。另外，B型肉毒毒素已經(jīng)被證實(shí)在劑量為480U/kg時(shí)對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物是無(wú)毒的，而這個(gè)劑量是A型肉毒毒素在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的LDs。的12倍。顯然，肉毒毒素以高親和力與膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元結(jié)合，被轉(zhuǎn)移至神經(jīng)元并阻斷乙酰膽堿的突觸前釋放。肉毒毒素在臨床上已用于治療以骨骼肌機(jī)能亢進(jìn)為特征的神經(jīng)肌肉障礙。A型肉毒毒素在1989年被美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)治療十二歲以上患者的自發(fā)性瞼痙攣、斜視和偏側(cè)面肌痙攣。外周注射(即肌內(nèi)或皮下注射)A型肉毒毒素的臨床效果通常在注射一星期內(nèi)可觀察到，且通常在注射后幾小時(shí)內(nèi)可觀察到。單次肌內(nèi)注射A型肉毒毒素引起的典型的癥狀緩解(即弛緩的肌肉麻痹)的持續(xù)時(shí)間可為約三個(gè)月至約六個(gè)月。盡管所有的肉毒毒素血清型在神經(jīng)肌肉接頭處明顯抑制神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放，但它們是通過(guò)影響不同的神經(jīng)分泌蛋白和/或在不同的位點(diǎn)裂解這些蛋白而實(shí)現(xiàn)的。肉毒毒素A是一種鋅內(nèi)肽酶，它可以特異性地水解細(xì)胞內(nèi)嚢泡相關(guān)蛋白SNAP-25的肽鍵。E型肉毒毒素也裂解該25千道爾頓(kD)的突觸體相關(guān)蛋白(SNAP-25)，但是與A型肉毒毒素相比，它靶向該蛋白內(nèi)的不同的氨基酸序列。B、D、F和G型肉毒毒素作用于嚢泡相關(guān)蛋白(VAMP,也叫突觸小泡蛋白)，不同的血清型裂解該蛋白的不同位點(diǎn)。最后，已經(jīng)表明d型肉毒毒素裂解突觸融合蛋白和SNAP-25。這些作用機(jī)制的不同可能影響不同的肉毒毒素血清型的相對(duì)效能和/或作用持續(xù)時(shí)間。無(wú)論何種血清型，毒素中毒的分子機(jī)制似乎是相似的并且包括至少三個(gè)步驟或階段。在這個(gè)過(guò)程的第一步中，毒素通過(guò)重鏈即H鏈與細(xì)胞表面受體間的特異性相互作用與靶神經(jīng)元的突觸前膜結(jié)合；對(duì)每種血清型的肉毒毒素以及對(duì)破傷風(fēng)毒素來(lái)說(shuō)，該受體被認(rèn)為是不同的。H鏈的羧基末端區(qū)段即Hc似乎在毒素對(duì)細(xì)胞表面的靶向作用中很重要。在第二步中，毒素穿過(guò)中毒細(xì)胞的質(zhì)膜。首先細(xì)胞通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將毒素吞噬并形成含有該毒素的內(nèi)含體。然后毒素離開(kāi)內(nèi)含體，進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。這最后一步被認(rèn)為是通過(guò)H鏈的氨基末端區(qū)段即Hjv介導(dǎo)的，Hn在pH約5.5或更低時(shí)引發(fā)毒素的構(gòu)象變化。已知內(nèi)含體具有能降低內(nèi)含體內(nèi)pH的質(zhì)子泵。構(gòu)象的變化暴露了毒素中的疏水殘基，這就使毒素得以插入內(nèi)含體膜中。然后毒素通過(guò)內(nèi)含體膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中。肉毒毒素活性機(jī)制的最后一步似乎參與還原連接H鏈和L鏈的二硫鍵。肉毒毒素和破傷風(fēng)毒素的整個(gè)毒性都包含在全毒素的L鏈上；1^鏈?zhǔn)且环N鋅(211++)內(nèi)肽酶，它能夠選擇性地裂解蛋白，這些蛋白對(duì)于識(shí)別含有神經(jīng)遞質(zhì)的嚢泡，將其?？吭谫|(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)表面，以及將嚢泡與質(zhì)膜融合都是必要的。破傷風(fēng)神經(jīng)毒素和B、D、F、G型肉毒毒素引起一種突觸體膜蛋白，即突觸小泡蛋白(也叫嚢泡相關(guān)膜蛋白(VAMP))的降解。這些裂解作用中的任何一種都能除去大多存在于突觸嚢泡的細(xì)胞質(zhì)表面的VAMP。每種毒素特異地裂解不同的鍵。對(duì)于七種已知的肉毒毒素血清型來(lái)說(shuō)，肉毒毒素蛋白分子的分子量大約為150kD。肉毒毒素以復(fù)合物形式由梭狀芽孢桿菌釋放，所述復(fù)合物包含150kD的肉毒毒素蛋白分子和與之結(jié)合的非毒素蛋白。因此，梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生900kD、500kD和300kD形式的A型肉毒毒素復(fù)合物。B和d型肉毒毒素明顯是僅以500kD的復(fù)合物產(chǎn)生的。D型肉毒毒素是以300kD和500kD形式的復(fù)合物產(chǎn)生的。最后，E和F型肉毒毒素是僅以約300kD的復(fù)合物產(chǎn)生。這些復(fù)合物(即分子量大于約150kD)被認(rèn)為含有非毒素血凝素蛋白和非毒素與無(wú)毒性非血凝素蛋白。這兩種非毒素蛋白(它們與肉毒毒素分子一起構(gòu)成有關(guān)的神經(jīng)毒素復(fù)合物)可能起到為肉毒毒素分子防止變性而提供穩(wěn)定性，并且保護(hù)毒素在被攝取時(shí)抵抗消化酸的作用。此外，也可能較大(比約150kD分子量大)的肉毒毒素復(fù)合物會(huì)減慢肉毒毒素從肌內(nèi)注射肉毒毒素復(fù)合物的位點(diǎn)擴(kuò)散速率。通過(guò)pH7.3時(shí)用血紅細(xì)胞處理毒素復(fù)合物可將毒素復(fù)合物分解成毒素蛋白和血凝素蛋白。毒素蛋白在血凝素蛋白除去時(shí)非常不穩(wěn)定。所有血清型的肉毒毒素最初都是由肉毒梭菌合成為非活性單鏈蛋白形式，這些蛋白須經(jīng)蛋白酶裂解和切割形成神經(jīng)活性形式。產(chǎn)生A和G血清型肉毒毒素的菌林具有內(nèi)源性蛋白酶，因此A和G血清型可以從細(xì)菌培養(yǎng)物中主要以其活性形式回收。相反，d、D和E血清型肉毒毒素是由非蛋白水解菌林合成的，所以從培養(yǎng)物中回收時(shí)通常沒(méi)有活性。B和F血清型可由蛋白水解菌林和非蛋白水解菌抹產(chǎn)生，因此可以以活性形式或者非活性形式回收。然而，即使是產(chǎn)生例如B血清型肉毒毒素的蛋白水解菌林，也只裂解所產(chǎn)生的毒素的一部分。此，已知的B型肉毒毒素比A型肉毒毒素效力明顯要低，這很可能歸因于例如B型肉毒毒素的任何制劑都有一定比例是非活性形式的。臨床制劑中非活性肉毒毒素分子的存在增加了制劑的總蛋白栽量(proteinload)，而不增加臨床功效，其中蛋白載量又與抗原性增加有關(guān)。另外已知，在同樣的肌內(nèi)注射劑量水平上，B型肉毒毒素的活性持續(xù)時(shí)間比A型肉毒毒素短，效力也較A型弱。體外研究已經(jīng)表明肉毒毒素能抑制陽(yáng)離子鉀離子誘導(dǎo)的乙酰膽堿和去曱腎上腺素從腦干組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)物中釋放。另外，已報(bào)導(dǎo)肉毒毒素能抑制脊髓神經(jīng)元原代培養(yǎng)物中的甘氨酸和谷氨酸的誘發(fā)釋放，而且在腦突觸小體制備物中肉毒毒素能抑制以下每一種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放乙酰膽堿、多巴胺、去曱腎上腺素、CGRP和谷氨酸。高質(zhì)量結(jié)晶A型肉毒毒素可由肉毒梭菌HallA林產(chǎn)生，其特征為>3xl07U/mg，A26。/A278小于0.60，凝膠電泳呈現(xiàn)出獨(dú)特的條帶樣式。結(jié)晶A型肉毒毒素用已知的Schantz方法獲得，如Shantz，E.J.:etal，Properi7e51a/7dwseoZ"^o/"w7i/7"歷fdi/a/7^^^力e/"i^/cro6/a/7yewrofo1//751//7il/ecf/c//7e,MicrobiolRev.56:80-99(1992)戶斤述。通常，A型肉毒毒素復(fù)合物可從在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的A型肉毒梭菌的厭氧發(fā)酵中分離純化?？梢酝ㄟ^(guò)硫酸沉淀和超微過(guò)濾(ultramicrofiltration)濃縮收獲粗毒素。可通過(guò)將酸性沉淀物溶解在氯化鈞中實(shí)施純化。毒素即可用冷乙醇沉淀。沉淀物可被溶解在磷酸鈉緩沖液中并離心。干燥后可獲得約900kD的結(jié)晶A型肉毒毒素復(fù)合物，它的特異性效力為3x107LD5。U/mg或者更高。這種已知的方法還可用來(lái)分離出非毒素蛋白以獲得純?nèi)舛径舅?，例如純化的A型肉毒毒素，分子量約150kD，特異性效力為l-2x108LD5。U/mg或者更高；純化的B型肉毒毒素，分子量約156kD,特異性效力為l-2x108LD5。U/mg或者更高；以及純化的F型肉毒毒素，分子量約155kD，特異性效力為1-2xl07LDs。U/mg或者更高。肉毒毒素和肉毒毒素復(fù)合物可從例如ListBiologicalLaboratories,Inc.,Campbell,California^theCentreforAppliedMicrobiologyandResearch,PortonDown，U.K.;Wako(Osaka,Japan),以及SigmaChemicalsofStLouis,Missouri獲得。市售的含有肉毒毒素的藥物組合物包括BOTOX(A型肉毒毒素神經(jīng)毒素與人血清白蛋白和氯化鈉的復(fù)合物，由Allergan，Inc.,Irvine,Ca1ifornia以每瓶100單位的凍干粉末形式提供，使用前用0.9%氯化鈉溶液復(fù)水)、Dysport(制劑中A型梭狀肉毒桿菌毒素血細(xì)胞凝集素與人血清白蛋白和乳糖復(fù)合，由IpsenLimited,Berkshire,U.K.提供，為粉末，使用前用0.9%氯化鈉溶液復(fù)水)和MyoBloc(—種可注射的溶液，包括B型肉毒毒素、人血清白蛋白、號(hào)多白酸4內(nèi)以及氣4匕4內(nèi)，pH纟々5.6，可由SolsticeNeurosciences，Inc.,SouthSanFrancisco,Ca1ifornia獲得)。A型肉毒毒素在治療多種臨床疾病上的成功引起了人們對(duì)其它肉毒毒素血清型的興趣。此外，純的肉毒毒素已被用于治療人類。例如，見(jiàn)KohlA.等，Co邁/7a"'so/o/",力ee/7"e"60&///7〃邁Zo7/z爿(^ofoz^^」y/t力t力e力/g力/y一i^r/Z7ef//jei/rc^ox2'/j(^T2〃7//zf力eex,e/7so/"fl7^7,or"yi76rep^銜5"c/e/e51/，MovDisord2000;15(Suppl3):165。因此，可以-使用純的肉毒毒素制備藥物組合物。已知A型肉毒毒素在pH4-6.8的稀釋的水溶液中可溶。pH大于約7時(shí)，起穩(wěn)定作用的非毒性蛋白從神經(jīng)毒素上解離，導(dǎo)致毒性的緩'f曼喪失，尤其是當(dāng)pH與溫度升高時(shí)。SchantzE.J.等，戶re/;ara〃0/7a/dc力aracfer/za6o/w///w/zfox//fjT7"3^尸0,力y/za/"e"歷e77,(具體在第44-45頁(yè)),Jankovic，J.等TherapywithBotulinumToxin，MarcelDekker,Inc(1994)的第三章。2002年7月31日授^又的歐洲專利EP1112082("Stable1iquidformulationsofbotuli畫(huà)toxin，，)中要求保護(hù)一種穩(wěn)定的液體藥物肉毒毒素制劑，該制劑中含有緩沖劑(pH5-6)和肉毒毒素，其中該毒素制劑以液體形式在溫度為0-10C時(shí)至少穩(wěn)定一年，或者在溫度為10-30C時(shí)至少穩(wěn)定6個(gè)月。這種肉毒毒素藥物制劑(它的一個(gè)實(shí)施方案由SolsticeNeurosciences,Inc.,SanDiego，California以商品名MyoBloc⑧或NeuroBloc⑧出售)以液體溶液的形式制備(不實(shí)施凍干法或真空干燥)，不需要在使用前復(fù)水。1996年4月30曰授權(quán)的名稱為"PharmaceuticalCompositionofBotulinumNeurotoxinandMethodofPreparation"的美國(guó)專利5,512,547(Johnson等人)中要求保護(hù)一種純的A型肉毒毒素制劑，該制劑中包括白蛋白和海藻糖，37'C下可穩(wěn)定儲(chǔ)存。1998年5月26日授權(quán)的美國(guó)專利5,756,468(Johnson等人)("Pharmaceutica1CompositionsofBotulinumToxinorBotulinumNeurotoxinandMethodofPreparation")要求保護(hù)一種凍干的肉毒毒素制劑，該肉毒毒素制劑包括硫代烷基、白蛋白和海藻糖，可在25'C至42'C之間穩(wěn)定儲(chǔ)存。1997年12月9曰授權(quán)的題為"PharmaceuticalCompositionContainingBotulinumBComplex"的美國(guó)專利5，696，077(Johnson等人)要求保護(hù)一種冷凍干燥的、不含氯化鈉的B型肉毒毒素復(fù)合物制劑，它包括B型復(fù)合物和蛋白質(zhì)賦形劑。GoodnoughM.C.等人的〃ozo尸6o"7/"〃2zzfor//7爿c^T//7g/yo/7力i7/zaZ7o/，ApplEnvironMicrobiol1992;58(10):3426-3428，以及Good畫(huà)ghM.C.等人的Wec歸r7"OTe-J6c^w///a/fd///"<9//o『//7g/7o/7，AcsSymposiumSeries1994;567(-):193-203中公開(kāi)的。中國(guó)專利申請(qǐng)CN1215084A中討論了一種與動(dòng)物來(lái)源的蛋白一明膠一起配制的不含白蛋白的A型肉毒毒素。美國(guó)專利No.6，087,327中也公開(kāi)了一種A型和B型肉毒毒素與明膠一起配制的組合物。因此，這些制劑并不能消除傳遞源于動(dòng)物蛋白的或伴隨的感染要素的風(fēng)險(xiǎn)。已有報(bào)道BoNt/A已被用于多種臨床情況，包括如下(1)每次肌內(nèi)注射(多塊肌肉)約75-125單位的B0T0X③、治療頸部肌張力失常；(2)每次肌內(nèi)注射5-10單位BOTOX③治療眉間紋(額頭皺紋)(向降眉間肌肌內(nèi)注射5單位，以及向每塊鈹眉肌肌內(nèi)注射10單位)；(3)脊柱內(nèi)注射恥骨直腸肌約30-80單位的80丁0叉@治療^更秘、；(4)通過(guò)每塊肌肉大約1-5單位的801(^@肌內(nèi)注射上眼瞼的側(cè)面瞼板前眼輪匝肌和下眼瞼側(cè)面瞼板前眼輪匝肌，治療瞼痙攣。(5)眼外肌肌內(nèi)注射約1-5單位B0T0X⑧治療斜視，注射用量根據(jù)待注射的肌肉的大小和所需的肌肉麻痹程度(即所需矯正的屈光度)而改變。(6)對(duì)如下五個(gè)不同的上肢屈肌進(jìn)行8011(^@肌內(nèi)注射治療中風(fēng)后的上肢肌痙攣購(gòu)l'lAllergan,InC.,ofIrvine.California,商品名為BOTOX(a)跖深屈肌7.5U到30U(b)跖淺屈肌7.5U到30U(c)尺側(cè)腕屈肌10U到40U(d)橈側(cè)腕屈肌15U到60U(e)肱二頭肌50U到200U。以上所示的五種肌肉每種都在同一療程注射，所以通過(guò)肌內(nèi)注射，在每個(gè)療程患者上肢屈肌得到了90U到36OU的BOTOX。(7)顱骨膜注射(對(duì)稱地注入眉間肌、額間肌和顳肌)25U的B0T0X⑧治療偏頭痛，當(dāng)以在25U注射后三個(gè)月內(nèi)偏頭痛發(fā)生的頻率、最大嚴(yán)重程度、所伴隨的嘔吐以及急性藥物的使用情況等標(biāo)準(zhǔn)的下降來(lái)衡量時(shí)，已證實(shí)與運(yùn)載體相比具有非常有益的偏頭痛的預(yù)防治療效果。據(jù)悉，A型肉毒毒素具有最長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月的效果0i/ro/7ea/7/.Aez/ro/d^r6(Supp4):Sill-S1150:1999),并且在某些情況下長(zhǎng)達(dá)27個(gè)月。見(jiàn)r力e109:1344—1346:1999。然而通常Botox⑧肌內(nèi)注射典型持續(xù)時(shí)間大約為3到4個(gè)月。A型肉毒毒素在治療多種臨床疾病上的成功，引起了人們對(duì)其它肉毒毒素血清型的興趣。此外，純的肉毒毒素已用于治療人類。例如，見(jiàn)KohlA.等，6V/z7/7ar/510/7/"力ee/7"ecf6o/"i////z〃/z/for//j6y^w/^力f力e^/^"A/_r_/7wr//7e^//7ewro/"CLr//7("A7^^/J//7f力eex/f"e刀5"ord/^7for"/z6reF/.s/zmsc/efe^，MovDisord2000;15(Suppl3):165。因此，可以使用純的肉毒毒素制備藥物組合物。由于表面變性、加熱和堿性環(huán)境的原因，肉毒毒素分子(約150kD)與諸如A型毒素復(fù)合物的肉毒毒素復(fù)合物(約300至900kD)也極易變性。滅活的毒素形成可能具有免疫原性的類毒素蛋白質(zhì)。所得的抗體會(huì)使患者對(duì)毒素注射具有抵抗力。同多數(shù)酶一樣，肉毒毒素(所述毒素為細(xì)胞內(nèi)肽酶)的生物活性依賴于，或者至少部分依賴于其三維構(gòu)象。因此，A型肉毒毒素經(jīng)加熱、各種化學(xué)物質(zhì)的表面拉伸和表面干燥而失去毒性。此外已知，除非有合適的穩(wěn)定劑存在，否則將通過(guò)已知的培養(yǎng)、發(fā)酵和純化獲得的毒素復(fù)合物稀釋至很低的毒素濃度來(lái)用于制備藥物組合物，會(huì)導(dǎo)致毒素的快速脫毒。將毫克量的毒素稀釋到每毫升含納克量的溶液中存在很大的困難，因?yàn)樵谌绱藦?qiáng)烈的稀釋中特異的毒性會(huì)迅速損失。由于毒素可能在制成含毒素的藥物組合物后數(shù)月或數(shù)年使用，因此毒素須用穩(wěn)定劑穩(wěn)定。至今唯一成功用于此目的的穩(wěn)定劑是源于動(dòng)物的人血清白蛋白和明膠。市售的含肉毒毒素的藥物組合物是以商品名B0T0X⑧出售的(獲自Allergan，Inc.，Irvine,California)。B0T0X⑧由純4t的A型肉毒毒素復(fù)合物、人血清白蛋白和氯化鈉組成，包裝成滅菌的真空干燥的形式。A型肉毒毒素由生長(zhǎng)于含N-Z胺和酵母提取物的培養(yǎng)基中的肉毒梭菌Hall林培養(yǎng)物制得。A型肉毒毒素復(fù)合物通過(guò)一系列酸沉淀從培養(yǎng)物溶液中純化成一種結(jié)晶復(fù)合物，該結(jié)晶復(fù)合物由高分子量活性毒素蛋白和相關(guān)血凝素蛋白組成。該結(jié)晶復(fù)合物被重新溶解在含有鹽水和白蛋白的溶液中，并在真空干燥前過(guò)濾除菌(0.2微米)。肌內(nèi)注射前807(^@可用滅菌的不含防腐劑的鹽水復(fù)水。每瓶B0T^T含有約100單位(U)的A型肉毒梭菌毒素復(fù)合物、0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化鈉，以無(wú)菌真空干燥且不含防腐劑的形式存在。使用不含防腐劑的滅菌生理鹽水(0.9%氯化鈉注射液)，通過(guò)在適當(dāng)尺寸的注射器內(nèi)汲取合適量的稀釋劑，復(fù)水真空干燥的B0T0X。由于B0T0X⑧會(huì)因起泡或者類似地劇烈攪拌變性，所以應(yīng)將稀釋劑溫和地注射小瓶?jī)?nèi)。出于無(wú)菌的考慮，最好應(yīng)在801*0乂@復(fù)水后四小時(shí)內(nèi)給藥。在這四小時(shí)內(nèi)復(fù)水的BOTOX⑧儲(chǔ)存在約2。C到8'C的水箱中。復(fù)水的BOTOX是澄清無(wú)色的，且不含微粒物質(zhì)。真空干燥的產(chǎn)品應(yīng)儲(chǔ)存在-5'C或低于-5。C的冷凍柜內(nèi)。已有報(bào)道適合的代替人血清白蛋白作為肉毒毒素穩(wěn)定劑的替代物可以是另一種蛋白質(zhì)或低分子量(非蛋白質(zhì))的化合物。Carpender等人,//zfei"act/ons57a6i7/z//2g爿^f/f/yeswi^力ilrofe//7s"〃r//7g尸reeze-r力a^2'/7^"<2/^/尸reeze—Z^2./^"，InternationalSymposiumonBiologicalProductFreeze—DryingandFormulation,1990年10月24-26日；Karger(1992)，225-239。許多通常用作藥物組合物中的載體和填充劑的物質(zhì)已被證明不適于用作非蛋白賦形劑來(lái)使存在于藥物組合物中的肉毒毒素穩(wěn)定。例如，已發(fā)現(xiàn)二糖纖維二糖不適于用作肉毒毒素的穩(wěn)定劑。因此，已知與僅含人血清白蛋白的A型肉毒毒素凍干后的毒性(>75/至>90%的恢復(fù)率)相比，使用纖維二糖與白蛋白和氯化鈉一起作為賦形劑，會(huì)導(dǎo)致含有這些賦形劑的結(jié)晶A型肉毒毒素凍干后的毒性降低很多(10%的恢復(fù)率)。Goodnough等人，i7a6/7/za"0^///7"邁7bj//77]p7e爿"wr//7gZyo/力/7/zaf/'o/，App&Envir.Micro.58(10)3426-3428(1992)。此外，包括多糖的糖類通常是較差的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。因此可知，如果蛋白制劑含有糖類(例如葡萄糖或葡萄糖的聚合物)或碳水化合物，則含有蛋白活性成分的藥物組合物從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)是不穩(wěn)定的，因?yàn)橐阎捎谄咸烟呛推咸烟蔷酆衔锏倪€原性，蛋白質(zhì)和葡萄糖可相互作用并進(jìn)行已闡明的4每拉德反應(yīng)(Maillardreaction)。在例如通過(guò)降低濕度或使用非還原性的糖以便阻止這種蛋白質(zhì)-糖類反應(yīng)方面已做出很多工作，但大部分是不成功的。重要的是，梅拉德反應(yīng)的降解途徑會(huì)導(dǎo)致蛋白活性成分在療效上的不足。因此，含有蛋白和還原性糖類、碳水化合物或糖(例如葡萄糖聚合物)的藥物制劑在本質(zhì)上是不穩(wěn)定的，并且不能在不嚴(yán)重?fù)p失活性成分蛋白質(zhì)的所需生物活性的條件下長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存。分子量極高的多糖(淀粉)，例如羥乙基淀粉，曾被提議作為肉毒毒素的穩(wěn)定劑存在于肉毒毒素藥物組合物中。例如，見(jiàn)2005年4月27日授^又的歐洲專利EP1253932。值得注意的是，白蛋白或明膠在藥物組合物中有效地作為蛋白活性成分的穩(wěn)定劑起作用的一個(gè)原因在于作為蛋白質(zhì)，這些穩(wěn)定劑在藥物組合物中不與蛋白質(zhì)活性成分進(jìn)行梅拉德反應(yīng)。因此，人們希望在其他蛋白質(zhì)中找到和尋找這類蛋白質(zhì)賦形劑的替代物，用于使肉毒毒素藥物組合物中的肉毒毒素穩(wěn)定。肉毒毒素的特性及其形成合適的藥物組合物的制劑限制、阻止了尋找含有的肉毒毒素的藥物組合物中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑替代物，并使其變得棘手。下面是這些特性中的四個(gè)例子。首先，肉毒毒素在用于添加入藥物制劑中時(shí)是偏大的蛋白質(zhì)(A型肉毒毒素復(fù)合物的分子量為900kD)，因此其本質(zhì)上是脆弱且易發(fā)生變化的。相對(duì)于較小、較不復(fù)雜的蛋白質(zhì)，毒素復(fù)合物的大小使其更脆弱且更易發(fā)生變化，因此，如果要維持毒素的穩(wěn)定性，則會(huì)使得制劑和操作變得困難。因此，肉毒毒素穩(wěn)定劑必須能夠與毒素以這樣的方式相互作用，即不使毒素分子變性、斷裂或以其他方式去毒性，或?qū)е露舅貜?fù)合物中的非毒性蛋白質(zhì)解離。其次，由于肉毒毒素是已知的最致命的生物物質(zhì)，因此在配制含有肉毒毒素的藥物組合物的所有步驟中都需要極好的安全性、精確性和準(zhǔn)確性。因此，肉毒毒素的穩(wěn)定劑本身不應(yīng)是有毒的或難于處理的，以免加劇現(xiàn)有的配制含有肉毒毒素的藥物組合物時(shí)需要的極苛刻的條件。第三，由于肉毒毒素是第一個(gè)被(FDA在1989年)批準(zhǔn)的用于治療人類疾病的注射用微生物毒素，因此，應(yīng)開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證用于培養(yǎng)，批量生產(chǎn)、配制藥物和使用肉毒毒素的專門(mén)步驟。重要的考慮因素是毒素的純度和注射劑量。必須通過(guò)培養(yǎng)和純化進(jìn)行制備，這樣肉毒毒素才不會(huì)暴露在任何可能污染終產(chǎn)物(即使是痕量的)并引起病人不良反應(yīng)的物質(zhì)中。這些限制要求在沒(méi)有使用動(dòng)物肉制品的簡(jiǎn)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且采用不涉及合成溶劑或樹(shù)脂的方法純化。使用酶、多種交換劑例如色譜柱中的交換劑和合成溶劑制備毒素會(huì)引入污染物，因此它們被排除在優(yōu)選的配制步驟以外。另外，A型肉毒毒素在溫度高于40。C時(shí)很容易變性，當(dāng)在空氣/液體界面處形成氣泡時(shí)也會(huì)失去毒性，并在氮?dú)饣蚨趸即嬖跁r(shí)變性。第四，使A型肉毒毒素穩(wěn)定非常困難，因?yàn)锳型肉毒毒素由約150kD的毒素分子與約750kD的非毒素蛋白質(zhì)分子以非共價(jià)結(jié)合的形式組成。非毒素蛋白質(zhì)分子被認(rèn)為可保持毒性所依賴的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)或有助于其穩(wěn)定。適用于使非蛋白質(zhì)或偏小的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的方法或?qū)嶒?yàn)步驟并不適于用在使肉毒毒素復(fù)合物(例如900kD的A型肉毒毒素復(fù)合物)穩(wěn)定中存在的固有問(wèn)題。因此，雖然在pH3.5至6.8之間A型毒素與非毒素蛋白質(zhì)非共價(jià)結(jié)合在一起，但在微堿性條件下(pH>7.1)，極易變化的毒素從毒素復(fù)合物中釋放。如前文所提到的，純的肉毒毒素(即150kD分子)已被提議作為藥物組合物的活性成分。根據(jù)上面提出的肉毒毒素的獨(dú)特性質(zhì)和要求，找到一種用于替代含有肉毒毒素的藥物組合物中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的合適的非蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的可能性幾乎接近于零。本發(fā)明之前，已知只有來(lái)源于動(dòng)物的蛋白質(zhì)、人血清白蛋白和明膠作為存在于藥物組合物中的肉毒毒素的合適穩(wěn)定劑具有實(shí)用性。因此，已知白蛋白本身或與一種或多種附加物質(zhì)(例如磷酸鈉或擰檬酸鈉)一起可以在A型肉毒毒素凍干后恢復(fù)較高的毒性。不幸的是，如前文中已提到的，作為一種混合的血制品，人血清白蛋白在用于藥物組合物中時(shí)會(huì)(至少潛在地會(huì))攜帶引發(fā)傳染或疾病的因素。事實(shí)上，任何動(dòng)物制品或蛋白質(zhì)(例如人血清白蛋白或明膠)在注射入患者時(shí)都可能潛在地含有致熱源或其他會(huì)引起不利反應(yīng)的物質(zhì)。因此，需要的是一種梭菌毒素藥物組合物，其中的梭菌毒素(例如肉毒毒素)被一種非蛋白賦形劑穩(wěn)定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明滿足了這種需求并提供了一種由非蛋白賦形劑穩(wěn)定的肉毒毒素藥物組合物。定義下面提到的用于本文中的詞語(yǔ)或術(shù)語(yǔ)具有以下定義。"約"是指用其定義的項(xiàng)目、參數(shù)或術(shù)語(yǔ)包括所述的項(xiàng)目、參數(shù)或術(shù)語(yǔ)之上或之下增加或減少10%的范圍。"給藥(administration)"或"給藥(toadminister)，，是指向受試者供給(即給予)藥物組合物的步驟。本文中公開(kāi)的藥物組合物是通過(guò)例如肌內(nèi)給藥(i.m.)、真皮內(nèi)給藥、皮下給藥、鞘內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)(i.p.)給藥、局部(經(jīng)皮)給藥和植入(即緩釋裝置例如聚合植入物或微型滲透泵的植入)給藥方式"局部給藥"。"不含動(dòng)物蛋白，，是指不存在來(lái)源于血液的、混合血液的(bloodpooled)和其他來(lái)源于動(dòng)物的制品或化合物。"動(dòng)物"是指哺乳動(dòng)物(例如人類)、鳥(niǎo)類、爬行動(dòng)物、魚(yú)類、昆蟲(chóng)、蜘蛛或其他動(dòng)物物種。"動(dòng)物"排除了微生物，例如細(xì)菌。因此，本發(fā)明范圍中的不含動(dòng)物蛋白的藥物組合物中可以含有梭菌神經(jīng)毒素。例如，不含動(dòng)物蛋白的藥物組合物是指大體上不含、基本上不含或完全不含來(lái)源于血清的白蛋白、明膠和其他動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)例如免疫球蛋白的藥物組合物。不含動(dòng)物蛋白的藥物組合物的一個(gè)例子是包括肉毒毒素(作為活性成分)和適合的作為穩(wěn)定劑或賦形劑的多糖的藥物組合物或由上述兩者組成的藥物組合物。"肉毒毒素"是指由肉毒梭菌產(chǎn)生的神經(jīng)毒素和由非梭菌菌種由重組的方式產(chǎn)生的肉毒毒素(或其重鏈或輕鏈)。本文中使用的短語(yǔ)"肉毒毒素"包括肉毒毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。本文中使用的肉毒毒素還包括肉毒毒素復(fù)合物(即300、600和900kD的復(fù)合物)和純化的肉毒毒素(即約150kD)。"純化的肉毒毒素，，的定義是與包括形成肉毒毒素復(fù)合物的蛋白質(zhì)在內(nèi)的其他蛋白質(zhì)相分離或大體相分離的肉毒毒素。純化的肉毒毒素純度可高于95%，優(yōu)選高于99%。肉毒C2和C3細(xì)胞毒素不是神經(jīng)毒素，被排除在本發(fā)明的范圍之外。"梭菌神經(jīng)毒素"是指由例如肉毒梭菌(C/oymV/咖60"http:///7M7)、酪酸梭桿菌(6"0^r/c"yz7)或巴氏梭菌(6Vo""V/咖^era〃/)之類的梭菌產(chǎn)生的或天然存在其中的神經(jīng)毒素，以及由非梭菌菌種以重組的方式產(chǎn)生的梭菌神經(jīng)毒素。"完全不含"(即術(shù)語(yǔ)"由......組成")是指在所使用的儀器和方法的檢測(cè)范圍內(nèi)，物質(zhì)不能被檢測(cè)到或不能確定其存在。"基本不含"(或"基本由......組成")是指只能檢測(cè)到痕量的物質(zhì)。"修飾的肉毒毒素，，是指這樣一種肉毒毒素，與天然的肉毒毒素相比，它的氨基酸中的至少一個(gè)缺失、被修飾或置換。此外，修飾的肉毒毒素可以是由重組的方式生產(chǎn)的神經(jīng)毒素，或由重組的方式生產(chǎn)出的神經(jīng)毒素的衍生物或片段。修飾的肉毒毒素保留了天然肉毒毒素的至少一種生物活性，例如，與肉毒毒素受體結(jié)合的能力，或是抑制從神經(jīng)元中釋放神經(jīng)遞質(zhì)的能力。修飾的肉毒毒素的一個(gè)例子是這樣一種肉毒毒素它具有來(lái)源于一種肉毒毒素血清型(例如血清型A)的輕鏈和來(lái)源于不同肉毒毒素血清型(例如血清型B)的重鏈。修飾的肉毒毒素的另一個(gè)例子是與神經(jīng)遞質(zhì)(例如P物質(zhì))偶聯(lián)的肉毒毒素。"藥物組合物"是指一種制劑，其中的活性成分可以是梭菌神經(jīng)毒素，例如肉毒毒素。詞語(yǔ)"制劑"是指在藥物組合物中除了梭菌神經(jīng)毒素活性成分以外至少還有一種另外的成分。因此，藥物組合物是適用于向受試者(例如病人)診斷或治療給藥(即通過(guò)肌內(nèi)注射或皮下注射或通過(guò)插入補(bǔ)給物或植入物)的制劑。所述的藥物組合物可以是如下形式凍干或真空干燥的狀態(tài)；用鹽水或水復(fù)水凍干或真空干燥的藥物組合物后形成的溶液；或不需要復(fù)水的溶液。神經(jīng)毒素活性成分可以是肉毒毒素血清型A、B、d、D、E、F或G中的一種或者是破傷風(fēng)毒素，所有這些都可由梭菌天然產(chǎn)生。如所述的，藥物組合物可以是液體或固體，例如真空干燥的固體。藥物組合物的組成成分可以被包括在單一的組合物中(即除了任何所需的復(fù)水液體外，全部的組成成分在藥物組合物的初始化合時(shí)就已存在)，或是作為兩組分體系，例如用稀釋劑(例如鹽水)復(fù)水真空干燥的組合物，該稀釋劑中含有不存在于藥物組合物的原始化合過(guò)程中的成分。兩組分體系提供的優(yōu)點(diǎn)在于允許加入一些成分，這些成分不能與兩組分體系的第一組分在足夠長(zhǎng)保質(zhì)期內(nèi)共存。例如，復(fù)水用的載體或稀釋劑可含有防腐劑，它在使用期間內(nèi)，例如在一星期的冷藏期內(nèi)能提供足夠的抑制微生物生長(zhǎng)的保護(hù)，但它不存在于兩年的冷凍期內(nèi)，因?yàn)樵诖似陂g內(nèi)它可能會(huì)使毒素降解。其他可能不能與梭菌毒素或其他成分長(zhǎng)期共存的成分也可通過(guò)這種方式加入；即在即將使用的時(shí)候被加入第二載體(即復(fù)水液體)。"穩(wěn)定劑"(或"主要穩(wěn)定劑，，)是一種幫助保存或維持蛋白質(zhì)(例如梭菌神經(jīng)毒素，例如肉毒毒素)的生物結(jié)構(gòu)(即三維構(gòu)象)和/或生物活性的化學(xué)試劑。本文中使用的穩(wěn)定劑是非蛋白質(zhì)。主要穩(wěn)定劑可以是一種合成的試劑，它不會(huì)在接受含有該主要穩(wěn)定劑的組合物的受試者體內(nèi)產(chǎn)生免疫原性應(yīng)答(或產(chǎn)生一種減弱的免疫反應(yīng))。藥物組合物中還可含有附加的穩(wěn)定劑。這些附加的穩(wěn)定劑或次要穩(wěn)定劑可以單獨(dú)使用或與主要穩(wěn)定劑結(jié)合使用。次要穩(wěn)定劑的例子包括但不限于非氧化的氨基酸衍生物(例如色氨酸衍生物，例如N-乙酰基-色氨酸("NAT"))、辛酸鹽(即辛酸鈉)、聚山梨醇酯(即P80)、氨基酸和例如鋅離子的二價(jià)金屬陽(yáng)離子。藥物組合物還可包括防腐劑，例如苯曱醇、苯曱酸、苯酚、對(duì)羥基苯曱酸酯和山梨酸。"使穩(wěn)定(stabilizing)"、"使穩(wěn)定(stabilizes)"或"穩(wěn)定性(stabilization)"是指在使藥物活性成分("PAI")穩(wěn)定或向PAI提供穩(wěn)定性的化合物的存在下，PAI保留了至少20%并最高達(dá)100%的生物活性(可通過(guò)體內(nèi)LDs?；駿D5。測(cè)量測(cè)得的效力或毒性評(píng)估)。在以下情況下，存在于復(fù)水的藥物組合物或藥物組合物水溶液中的肉毒毒素(在使PAI穩(wěn)定或向PAI提供穩(wěn)定性的化合物的存在下)具有生物活性肉毒毒素被加入藥物組合物前所具有的效力或毒性的約20%以上且最高達(dá)約100%的效力或毒性，這些情況例如(l)從本體溶液或儲(chǔ)存溶液制備系列稀釋液時(shí)，或(2)當(dāng)用鹽水或水復(fù)水凍干的或真空干燥的含有肉毒毒素的藥物組合物時(shí)，該藥物組合物在約-2。C或-2'C以下儲(chǔ)存了約6個(gè)月至4年，或(3)對(duì)于在約2'C至約8r下儲(chǔ)存了6個(gè)月至4年的含有肉毒毒素的藥物組合物的水溶液。"基本不含"是指以低于藥物組合物重量的1%的水平存在。"治療用制劑，，是指一種可用于治療并由此減輕障礙或疾病，例如以外周肌肉的機(jī)能亢進(jìn)(即痙攣狀態(tài))為特征的障礙或疾病的制劑。肉毒毒素可以是肉毒毒素復(fù)合物形式(即約300kD至約900kD的復(fù)合物形式，復(fù)合物的大小依賴于具體的肉毒毒素血清型)，或肉毒毒素可以是純的或純化的肉毒毒素形式(即約150kD的肉毒毒素分子形式)。本文中公開(kāi)的藥物組合物在復(fù)水或注射時(shí)的pH值介于約5至7.3之間。本發(fā)明的實(shí)施可使用含有A型肉毒毒素的組合物。在本發(fā)明其他的實(shí)施方案中，實(shí)施前述的方法時(shí)可4吏用含有B型肉毒毒素的組合物。在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，實(shí)施本發(fā)明時(shí)可使用含有多種肉毒毒素血清型例如選自肉毒毒素血清型A、B、d、D、E、F和G的肉毒毒素血清型的組合物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中可使用純化的肉毒毒素。在其他實(shí)施方案中可使用修飾的肉毒毒素。在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，前述的方法中使用的組合物可通過(guò)肌內(nèi)方式向患者給藥。在其他實(shí)施方案中，該組合物可通過(guò)皮下和/或鞘內(nèi)給藥。本發(fā)明包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素和聚乙烯吡咯烷酮。所述肉毒毒素是具有生物活性的肉毒毒素，并且所述肉毒毒素選自肉毒毒素A、B、C、D、E、F和G型。優(yōu)選地，所述肉毒毒素為A型肉毒毒素。存在于藥物組合物中的聚乙烯吡咯烷酮的功能就是使肉毒毒素穩(wěn)定。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素，以及每約IOO單位的肉毒毒素約5克至約20克的聚乙烯吡咯烷酮。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素和聚乙烯吡咯烷酮，其中該肉毒毒素不是由蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定的，并且其中該肉毒毒素的效力至少為其理論最大效力的約40%。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素和聚乙烯吡咯烷酮，其中該肉毒毒素不是由蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定的，并且其中該肉毒毒素的效力至少為其理論最大效力的約50%。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素、聚乙烯吡咯烷酮和二糖，其中該肉毒毒素不是由蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定的，并且其中該肉毒毒素的效力至少為其理論最大效力的約40°/。。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素、聚乙烯吡咯烷酮和二糖，其中該肉毒毒素不是由蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定的，并且其中該肉毒毒素的效力至少為其理論最大效力的約50%。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素、聚乙烯吡咯烷酮和二糖，其中該肉毒毒素不是由蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定的，并且其中該肉毒毒素的效力至少為其理論最大效力的約60%。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素、聚乙烯吡咯烷酮和二糖，其中該肉毒毒素不是由蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定的，并且其中該肉毒毒素的效力至少為其理論最大效力的約70%。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇，其中該肉毒毒素不是由蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定的，并且其中該肉毒毒素的效力至少為其理論最大效力的約40%。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素，其中該肉毒毒素不是由蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定的；選自第一種單糖、第一種二糖、第一種三糖和由第一種單糖還原所得的第一種醇的化合物；以及選自聚乙二醇、第二種單糖、第二種二糖、第二種三糖、金屬、第二種醇和氨基酸的化合物，其中所述第二種單糖、所述第二種二糖和所述第二種三糖分別不同于所述第一種單糖、所述第一種二糖和所述第一種三糖，其中該肉毒毒素的效力至少為其理論最大效力的約40%。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素，其中該肉毒毒素不是由蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定的；聚乙二醇；以及選自單糖、二糖、三糖、金屬、醇和氨基酸的化合物；其中該肉毒毒素的效力至少為其理論最大效力的約20°/。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素，其中該肉毒毒素不是由蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定的；聚乙二醇；以及選自單糖、二糖、三糖、金屬、醇和氨基酸的化合物；其中該肉毒毒素的效力至少為其理論最大效力的約30%。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素，其中該肉毒毒素不是由蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定的；聚乙二醇；以及選自單糖、二糖、三糖、金屬、醇和氨基酸的化合物；其中該肉毒毒素的效力至少為其理論最大效力的約40%。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素，其中該肉毒毒素不是由蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定的；聚乙二醇；以及選自單糖、二糖、三糖、金屬、醇和氨基酸的化合物；其中該肉毒毒素的效力至少為其理論最大效力的約50%。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素，其中該肉毒毒素不是由蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定的；聚乙二醇；以及選自單糖、二糖、三糖、金屬、醇和氨基酸的化合物；其中該肉毒毒素的效力至少為其理論最大效力的約60%。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括(或由其組成或基本由其組成)肉毒毒素，其中該肉毒毒素不是由蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定的；聚乙二醇；以及選自單糖、二糖、三糖、金屬、醇和氨基酸的化合物；其中該肉毒毒素的效力至少為其理論最大效力的約70%。具體實(shí)施例方式本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即含有被穩(wěn)定的梭菌毒素的梭菌毒素藥物組合物可通過(guò)使用非蛋白賦形劑作為梭菌毒素的主要穩(wěn)定劑制備。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)梭菌毒素藥物組合物中的蛋白質(zhì)賦形劑(例如白蛋白或明膠)的適合替代物可以是非蛋白化合物。本發(fā)明中使用的非蛋白賦形劑可通過(guò)以下方式賦予存在于藥物組合物中的神經(jīng)毒素活性成分例如肉毒毒素穩(wěn)定性(1)降低肉毒毒素與表面(例如實(shí)驗(yàn)玻璃器皿、導(dǎo)管的表面)、復(fù)水藥物組合物的藥水瓶和用于注射藥物組合物的注射器的內(nèi)表面之間的粘著力(通常被稱為"粘性")。肉毒毒素對(duì)表面的粘著力會(huì)導(dǎo)致肉毒毒素?fù)p失和剩余肉毒毒素的變性，兩者都會(huì)降低存在于藥物組合物中的肉毒毒素的毒性。(2)減少肉毒毒素的變性和/或肉毒毒素從存在于肉毒毒素復(fù)合物中的其他非毒素蛋白質(zhì)上的解離，這種變性和/或解離活性的出現(xiàn)是由于存在于藥物組合物(即凍干或真空干燥前)和復(fù)水的藥物組合物中的肉毒毒素的低稀釋度。(3)降低肉毒毒素在pH和濃度顯著改變時(shí)的損失(即由于變性或與復(fù)合物中的非毒素蛋白質(zhì)解離所致)，所述pH和濃度的顯著改變會(huì)在藥物組合物的制備、加工和復(fù)水時(shí)發(fā)生。由本文中公開(kāi)的非蛋白穩(wěn)定劑提供的三類肉毒毒素的穩(wěn)定作用在藥物組合物的注射前保存和維持了肉毒毒素的天然毒性。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可包括多種肉毒毒素血清型。也就是說(shuō)，該組合物可含有兩種或多種不同的肉毒毒素血清型。例如，一種組合物可含有肉毒毒素血清型A和B。在另一實(shí)施方案中，一種組合物可包括肉毒毒素血清型A和E。使用肉毒毒素血清型的組合可以允許護(hù)理人員根據(jù)待治療的狀況定制方案以達(dá)到所需效果。在本發(fā)明附加的實(shí)施方案中，該組合物可包括修飾的肉毒毒素。修飾的肉毒毒素優(yōu)選地抑制神經(jīng)遞質(zhì)從神經(jīng)元的釋放，但可能比天然的肉毒毒素有更強(qiáng)或更弱的效力，或者可能比天然的肉毒毒素有更強(qiáng)或更弱的生物學(xué)作用。由于本發(fā)明的組合物可用于對(duì)動(dòng)物進(jìn)行相對(duì)長(zhǎng)期的治療，所以該組合物可以較純的形式提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物是藥用級(jí)。在某些實(shí)施方案中，梭菌毒素的純度高于95%。在附加的實(shí)施方案中，梭菌毒素的純度高于99%。本發(fā)明還包括向稀釋劑或制劑自身中加入防腐劑，以獲得更長(zhǎng)的儲(chǔ)存期。優(yōu)選的防腐劑為含苯曱醇的防腐鹽水。本發(fā)明的藥物組合物可使用常規(guī)的給藥模式給藥。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，該組合物通過(guò)肌內(nèi)注射或皮下注射給予受試者。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可通過(guò)鞘內(nèi)給藥。此外，本發(fā)明的組合物可以和一種或多種止痛劑或麻醉劑一起給藥。本發(fā)明組合物的最有效的給藥方式和給藥方案依賴于待治療病癥的類型、嚴(yán)重程度和病因，動(dòng)物的健康狀況及對(duì)治療的響應(yīng)情況，以及主治醫(yī)生的判斷。因此，應(yīng)調(diào)整所述方法和組合物的劑量以適合個(gè)體受試者。通過(guò)舉例的方式，而不是限制的方式，優(yōu)選通過(guò)肌內(nèi)方式給予本發(fā)明的組合物，以減少肌肉痙攣。本發(fā)明還包括一種含有肉毒毒素和膠原、用于治療多種病癥的藥物組合物，其中肉毒毒素的作用是使肌肉麻痹，膠原的作用是提供一種皮膚填充物。含有其他肉毒毒素血清型的組合物可含有不同劑量的肉毒毒素。例如，組合物提供的B型肉毒毒素的劑量可大于組合物中含有的A型肉毒毒素的劑量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，B型肉毒毒素的給藥量在約1U/kg至150U/kg之間。B型肉毒毒素的給藥量還可最高達(dá)20，000U(如上文中所述的針對(duì)小鼠的單位)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，E型或F型肉毒毒素的給藥量濃度約為0.1U/kg至150U/kg之間。此外，在含有多于一種類型的肉毒毒素的組合物中，所提供的每種類型肉毒毒素的劑量可比單一肉毒毒素血清型通常所使用中的劑量相對(duì)較少。那么肉毒毒素血清型的組合可提供適合程度和持續(xù)時(shí)長(zhǎng)的麻痹作用，但不會(huì)增加神經(jīng)毒素的擴(kuò)散(例如，見(jiàn)美國(guó)專利No.6,087，327)。實(shí)施例如下的實(shí)施例提出了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但不是要限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，使用公知的小鼠半數(shù)致死劑量測(cè)定法("MLD50"測(cè)定法)確定肉毒毒素的效力。根據(jù)情況的不同，"效力"可以指肉毒毒素恢復(fù)的效力或者肉毒毒素凍干前的效力?；謴?fù)的效力是復(fù)水效力、恢復(fù)效力和復(fù)水時(shí)效力的同義詞。MLD50測(cè)定法提供了確定肉毒毒素效力的方法(以其小鼠半數(shù)致死劑量或"LD50，，衡量)。因此，一單位(U)的肉毒毒素被定義為腹膜內(nèi)注射時(shí)殺死一組雌性SwissWeber小鼠的50°/。(即LD5)的肉毒毒素的量，這些小鼠在檢測(cè)開(kāi)始時(shí)每只重17-22克。MLD50測(cè)定法是測(cè)量復(fù)水的肉毒毒素或者復(fù)水的肉毒毒素制劑的效力的有效方法。每只小鼠保持仰臥姿勢(shì)且頭部向下傾斜，并向其右下腹部以約30度角的方向腹膜內(nèi)注射幾種肉毒毒素的系列稀釋液(用生理鹽水稀釋)中的一種，注射時(shí)使用25至27號(hào)，3/8"至5/8"的針頭。在接下來(lái)的72小時(shí)內(nèi)記錄每種稀釋液引起的死亡率。至少應(yīng)制備六種1.33劑量間隔的稀釋液，并且通常每個(gè)劑量組使用十只動(dòng)物(因此采用60只小鼠)。同時(shí)進(jìn)行兩種參照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)(采用另外60只小鼠)。配制稀釋液，使得最濃的稀釋液在被注射的小鼠中產(chǎn)生至少80%的死亡率，最稀的稀釋液在被注射的小鼠中產(chǎn)生不高于20%的死亡率。至少應(yīng)有四種稀釋液落入死亡率的單調(diào)遞減區(qū)間中。單調(diào)遞減區(qū)間以不低于80%的死亡率開(kāi)始。在四種或更多的單調(diào)遞減的死亡率中，最大的兩個(gè)死亡率和最小的兩個(gè)死亡率必須是遞減的(即不相等的)。在注射后三天的觀察期內(nèi)有50%小鼠死亡的稀釋液被定義為含有1單位(1U)肉毒毒素的稀釋液。已開(kāi)發(fā)出優(yōu)化的MLD50測(cè)定法，該測(cè)定法使用較少(五種而不是六種)的稀釋液(1.15劑量間隔)，并且每種被測(cè)稀釋液使用較少(六只而不是十只)的小鼠。實(shí)施例1含有人血清白蛋白的肉毒毒素藥物組合物(現(xiàn)有技術(shù))從肉毒梭菌Hall林的培養(yǎng)物中得到A型肉毒毒素復(fù)合物，所述的肉毒梭菌Hall抹生長(zhǎng)在含有N-Z胺和酵母提取物的培養(yǎng)基中。A型肉毒復(fù)合物經(jīng)一系列酸沉淀從培養(yǎng)物溶液中純化成結(jié)晶型復(fù)合物，該復(fù)合物由高分子量的活性毒素蛋白和結(jié)合的血凝素蛋白組成。然后將該結(jié)晶型復(fù)合物在含有鹽水和白蛋白的溶液中復(fù)水，并在真空干燥前過(guò)濾除菌(0.2微米)。注射前將真空干燥的組合物用無(wú)菌、無(wú)防腐劑的鹽水復(fù)水。每瓶真空干燥的組合物含有約IOO單位(U)的A型肉毒梭菌毒素復(fù)合物、0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化鈉，為無(wú)菌真空干燥形式，不含防腐劑。這種藥物組合物以商品名B0TW^在市場(chǎng)上出售，每瓶IOO單位，注射前用鹽水復(fù)水。實(shí)施例2非蛋白穩(wěn)定的肉毒毒素制劑使用一種或多種不同的非蛋白穩(wěn)定賦形劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)制備多種肉毒毒素制劑。所有制劑都以同樣的方法化合、凍干、復(fù)水并測(cè)定效力，并在每種制劑中使用相同類型的肉毒毒素，所不同的是(expectthat)，每種制劑由一種或多種不同的非蛋白賦形劑制備，或者由存在于肉毒毒素制劑中的不同量的一種或多種非蛋白賦形劑制備。這些實(shí)驗(yàn)中制得的制劑中(單獨(dú)或聯(lián)合)使用的非蛋白賦形劑包括聚乙烯吡咯烷酮(也被稱為聚維酮，例如Kollidon17)、各種二糖(例如乳糖和海藻糖)、三糖(例如棉子糖)、多糖(例如菊糖)、醇(例如通過(guò)還原單糖〔例如果糖〕所得的醇，或者甘露醇)、金屬(例如鋅)、氨基酸(例如甘氨酸)以及聚乙二醇(例如poloxamer188和/或PEG3350)。由于蛋白質(zhì)是聚氨基酸，所以在本文提出的制劑中使用一種或多種單個(gè)的氨基酸不會(huì)向這些制劑中引入蛋白質(zhì)賦形劑。該實(shí)施例中公開(kāi)的制劑是通過(guò)如下步驟來(lái)制備的，首先向注射用滅菌水中加入指定量的一種或多種非蛋白賦形劑來(lái)形成溶液。然后向該溶液中加入100至200單位的A型肉毒毒素復(fù)合物(所述A型肉毒毒素復(fù)合物通過(guò)厭氧發(fā)酵肉毒梭菌Hall抹，隨后純化釋放至和取自發(fā)酵培養(yǎng)基中的肉毒毒素來(lái)獲得，例如，參見(jiàn)上述實(shí)施例1和SchantzE.J.等人，/ewrofd//7^/z/ed/c/zze,MicrobiolRev1992Mar;56(1):80—99)，由此形成肉毒毒素制劑，也可用同義詞稱為肉毒毒素藥物組合物，或簡(jiǎn)稱為制劑。所使用的肉毒毒素在凍干前的效力由小鼠LD50測(cè)定法確定，然后向溶液中加入肉毒毒素，并且為IOO單位至200單位之間。然后將該制劑凍干(或冷凍干燥或真空干燥)，并隨后用生理鹽水復(fù)水。存在于復(fù)水制劑中的肉毒毒素的恢復(fù)效力也由相同的小鼠LD50測(cè)定法確定。表1至表5中"恢復(fù)％"是指復(fù)水后的肉毒毒素的效力(因此也稱為"恢復(fù)效力")，表示為凍干前的制劑中肉毒毒素效力的百分比。因此，例如，恢復(fù)％為60%時(shí)即表示復(fù)水后的肉毒毒素的效力占凍干前的肉毒毒素效力的6oy。。理論上恢復(fù)效力的最大值是i00。/。。恢復(fù)值％通過(guò)立即復(fù)水凍干后的制劑獲得。表1至6給出了本實(shí)施例中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，本實(shí)施例中的制劑如上述的方法制備。表l具有單一非蛋白賦形劑且無(wú)恢復(fù)效力的肉毒毒素制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>賦形劑量(mg)恢復(fù)％1.Kollidon175482.薩don1710523.Kollidon1720394.乳酸10155-乳酸5035表3具有兩種非蛋白賦形劑且無(wú)恢復(fù)效力的肉毒毒素制劑量l(mg)量2(rag)恢復(fù)%0.50.50500.50100500.50.50500.500.55010050500.0000050500.00000505500505055005010500.105105050.050505.50050500505055005010500.10510505005050550015001500.1500賦形劑l1.麵don172.Ko"idon173.Kollidon17—4.Kollidon175-Kollidon176.Kollidon177.Kollidon178.蔗糖19.蔗糖20-蔗糖21-蔗糖22.蔗糖23.蔗糖24.蔗糖25-蔗糖26.蔗||27.蔗糖28.ZnCI29.ZnCI30.ZnCIZnCIPEG3350蔗糖蔗糖ZnCIZnCIZnCI海藻糖海藻糖海藻糖甘氨酸甘氨酸甘氨酸ZnCIZnCIZnCI海藻糖海藻糖海藻糖甘氨酸甘氨酸甘氨酸醇醇醇醇、ir醇醇醇醇醇露露露露露露露露露露甘甘甘甘甘甘甘甘甘甘91111111112^酸酸酸糖糖糖糖a賦乳乳乳蔗蔗蔗蔗_5<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>23.蔗糖甘露醇50502424-甘露8|PEG335050502625.甘露醉PEG33505053026.甘露醇蔗糖505029Poloxamsr27.甘露醇188505033Poloxamer28.甘露醇18850、35Poloxamer29.甘露醇18855030PolOX3ITl6r30.蔗糖188505059Poloxamsr31.處糖1885054332.蔗糖Poloxamer1885505533.蔗糖PEG335050504434.蔗糖PEG33505054135.蔗糖PEG33505503536.Poloxamer18837.PEG335038.Poloxamer188的.Poloxamer18840.Poloxamer18841.Poloxamer18842.Poloxsmer18843.海藻糖44-海藻糖PEG3350PEG33505055504136表5示出使用肉毒毒素制劑的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述肉毒毒素制劑含有兩種非蛋白賦形劑，具有或沒(méi)有特定緩沖劑。在以下時(shí)間測(cè)量肉毒毒素的效力(l)凍干后立即復(fù)水("初始效力")，以及；(2)凍干后，在兩種不同儲(chǔ)存條件(-40。C或20°C)的一種條件下儲(chǔ)存三個(gè)月后復(fù)水。表5的結(jié)果表明，除非用檸檬酸鹽緩沖液配制，否則含有PVP非蛋白賦形劑的肉毒毒素藥物組合物不具有顯著的室溫穩(wěn)定性。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)即使在相同的pH值下，磷酸鹽緩沖液也不能向這種制劑提供所需室溫穩(wěn)定性。表5含有兩種非蛋白賦形劑的肉毒毒素制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表6示出使用肉毒毒素制劑的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述肉毒毒素制劑含有三種非蛋白賦形劑、具有或沒(méi)有特定緩沖劑。肉毒毒素的效力在凍干后立即復(fù)水測(cè)定("初始效力")。表6的結(jié)果表明，肉毒毒素藥物組合物可通過(guò)在同一制劑中使用三種非蛋白賦形劑來(lái)穩(wěn)定，并且在制劑中使用檸檬酸鹽緩沖劑改善初始效力。還制備了由其他三種不同的非蛋白賦形劑穩(wěn)定的肉毒毒素藥物組合物，并且恢復(fù)的效力很顯著。表6含有三種非蛋白賦形劑的肉毒毒素制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>10mM檸檬酸鹽(pH5.5)由這些實(shí)驗(yàn)中得到的發(fā)現(xiàn)如下1.使用特定濃度的單一非蛋白賦形劑一聚乙烯吡咯烷酮(例如Kollidon17)—制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表1的1-4行)。2.使用不同的特定濃度的單一非蛋白賦形劑一聚乙烯吡咯烷酮(例如Kol1idon17)—制備的肉毒毒素制劑能顯示出39%至52%的恢復(fù)效力(見(jiàn)表2的1-3行)。根據(jù)上述第1條，這一點(diǎn)是令人驚奇和意想不到的發(fā)現(xiàn)。3.使用兩種不同的非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是聚乙烯吡咯烷酮(例如Kollidon17)—制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表3的l-7行)。4.使用兩種不同的非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是聚乙烯吡咯烷酮(例如Kollidon17)—制備的肉毒毒素制劑能顯示出高達(dá)65%的恢復(fù)效力(見(jiàn)表4的1-18行)。根據(jù)上述第l和第3條，這一點(diǎn)是令人驚奇和意想不到的發(fā)現(xiàn)。5.使用特定濃度的單一非蛋白賦形劑一二糖(例如乳糖)一制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表1的第5行)。6.使用不同的特定濃度的單一非蛋白賦形劑一二糖(例如乳糖)一制備的肉毒毒素制劑能顯示出15%至35%的恢復(fù)效力(見(jiàn)表2的4-5行)。根據(jù)上述第5條，這一點(diǎn)是令人驚奇和意想不到的發(fā)現(xiàn)。7.使用兩種不同的非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是二糖(例如乳糖)一制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表3的1-3行)。8.使用兩種不同的非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是二糖(例如乳糖)一制備的肉毒毒素制劑能顯示出高達(dá)65%的恢復(fù)效力(見(jiàn)表4的1-8行和19-22行)。根據(jù)上述第5和第7條，這一點(diǎn)是令人驚奇和意想不到的發(fā)現(xiàn)。9.使用單一非蛋白賦形劑一二糖(例如蔗糖)一制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表1的第6-10行)。10.使用兩種不同的非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是二糖(例如蔗糖)一制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表3的第4-8、11-12和19-27行)。11.使用兩種不同的非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是二糖(例如蔗糖)一制備的肉毒毒素制劑能顯示出高達(dá)59%的恢復(fù)效力(見(jiàn)表4的9-17、20、23、26和30-354亍)。根據(jù)上述第9和10條，這一點(diǎn)是令人驚奇和意想不到的發(fā)現(xiàn)。12.使用單一的非蛋白賦形劑一氨基酸(例如甘氨酸)一制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表l的第ll-13行)。13.使用兩種不同的非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是氨基酸(例如甘氨酸)_制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表3的第19-21、28-30、38、42-44和46-48行)。14.使用不同特定濃度的兩種不同非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是氨基酸(例如甘氨酸)一制備的肉毒毒素制劑能顯示出高達(dá)33%的恢復(fù)效力(見(jiàn)表4的第38-39行)。根據(jù)上述第12-13條，這一點(diǎn)是令人驚奇和意想不到的發(fā)現(xiàn)。15.使用單一的非蛋白賦形劑一金屬(例如鋅)一制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表l的第14-16行)。16.使用兩種不同的非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是金屬(例如鋅)_制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表3的第8-9、13-15、22-24和28-37行)。17.使用不同的特定濃度的兩種不同的非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是金屬(例如鋅)一制備的肉毒毒素制劑能顯示出高達(dá)38。/。的恢復(fù)效力(見(jiàn)表4的第21和36-37行)。根據(jù)上述15-16條，這一點(diǎn)是令人驚奇和意想不到的發(fā)現(xiàn)。18.使用單一的非蛋白賦形劑一醇(例如甘露醇)一制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表l的第17-19行)。19.使用兩種不同的非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是醇(例如甘露醇)一制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表3的第9_18行)。20.使用不同的特定濃度的兩種不同的非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是醇(例如甘露醇)一制備的肉毒毒素制劑能顯示出高達(dá)35%的恢復(fù)效力(見(jiàn)表4的第22-29行)。根據(jù)上述第17-18條，這一點(diǎn)是令人驚奇和意想不到的發(fā)現(xiàn)。21.使用單一的非蛋白賦形劑一二糖(例如海藻糖)一制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表l的第23-25行)。22.使用兩種不同的非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是二糖(例如海藻糖)_制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表3的第16-18、25-27、33-35和42-45行)。23.使用不同特定濃度的兩種不同的非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是二糖(例如海藻糖)一制備的肉毒毒素制劑能顯示出高達(dá)75°/的恢復(fù)效力(見(jiàn)表4的第40-44行)。根據(jù)上述第21-22條，這一點(diǎn)是令人驚奇和意想不到的發(fā)現(xiàn)。24.使用單一的非蛋白賦形劑一聚乙二醇(例如PEG3350或poloxamer188)—制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表l的第29-30行)。25.使用兩種不同的非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是聚乙二醇(例如PEG3350或poloxamer188)—制備的肉毒毒素制劑未能顯示出恢復(fù)的效力(見(jiàn)表3的第10、31-32、36-41和45-48行)。26.使用不同的特定濃度的兩種不同的非蛋白賦形劑一其中一種非蛋白賦形劑是聚乙二醇(例如PEG3350或poloxamer188)—制備的肉毒毒素制劑能顯示出高達(dá)75%的恢復(fù)效力(見(jiàn)表4的第18-19、24-25和27-44行)。才艮據(jù)上述的第24-25條，這一點(diǎn)是令人驚奇和意想不到的發(fā)現(xiàn)。27.當(dāng)非蛋白穩(wěn)定劑乳糖和聚乙烯吡咯烷酮("PVP")(即Kollidon17)用作存在于肉毒毒素藥物組合物中的肉毒毒素的非蛋白穩(wěn)定劑時(shí)，它們各自提供了顯著的恢復(fù)效力(見(jiàn)表2)。28.當(dāng)乳糖和PVP都被用作同一肉毒毒素藥物組合物的非蛋白穩(wěn)定劑時(shí)，與乳糖和PVP分別用作非蛋白穩(wěn)定劑時(shí)觀察到的恢復(fù)的效力相比，恢復(fù)的效力有所增加(例如，見(jiàn)表4第1-8行)。29.當(dāng)將乳糖和/或PVP與一種或多種其他上述的的非蛋白賦形劑一起使用時(shí)，(存在于復(fù)水的肉毒毒素藥物組合物中的肉毒毒素的)恢復(fù)的效力有所提高(分別見(jiàn)表4中第19-22行和表4中的第9-18行)。30.即使在這其中的每一種非蛋白賦形劑單獨(dú)用作肉毒毒素藥物組合物中的肉毒毒素的非蛋白穩(wěn)定劑時(shí)不能獲得恢復(fù)效力的情況下，賦形劑(作為存在于復(fù)水的肉毒毒素藥物組合物中的肉毒毒素的非蛋白穩(wěn)定劑時(shí))的某些組合的使用也會(huì)提供顯著的恢復(fù)效力，例如，比較(1)表1第1-4行以及表1第6-10行與表4第9-17行；以及(2)表1第23-25行以及表1第29行與表4第43-44行。31.恢復(fù)效力有時(shí)取決于存在于肉毒毒素藥物組合物中的非蛋白穩(wěn)定劑的濃度。32.加入緩沖劑可增加恢復(fù)效力和儲(chǔ)存的穩(wěn)定性。每種穩(wěn)定劑產(chǎn)生這種效果的能力不同。緩沖劑的作用是獲得最佳的pH，維持最佳的pH，以及在一些情況下(例如檸檬酸鹽)防止氧化。從這些實(shí)驗(yàn)中得出的普遍結(jié)論包括以下觀察結(jié)果(a)存在于肉毒毒素藥物組合物中的肉毒毒素可通過(guò)將該組合物與兩種或多種常見(jiàn)的非蛋白賦形劑一起配制而穩(wěn)定(且顯示出具有良好的恢復(fù)效力)。(b)在不存在任何其他非蛋白穩(wěn)定劑的情況下，聚乙烯吡咯烷酮(例如K0llid0nl7)和二糖(例如乳糖)可作為肉毒毒素制劑中的非蛋白穩(wěn)定劑(賦形劑)起作用。(c)使用一種或多種相同的非蛋白穩(wěn)定劑時(shí)，恢復(fù)的效力可取決于肉毒毒素制劑中所使用的一種或多種非蛋白穩(wěn)定劑的比例和/或濃度。(d)某些非蛋白穩(wěn)定劑(例如聚乙烯吡咯烷酮〔例如Kollidon17〕和二糖〔例如乳糖〕)一起使用時(shí)，不僅可使肉毒毒素制劑中的肉毒毒素穩(wěn)定，還可提供增強(qiáng)的穩(wěn)定性，這可由復(fù)水制劑的更高的恢復(fù)效力確定。(e)普遍使用的藥物賦形劑(例如聚乙烯吡咯烷酮、乳糖、蔗糖等)在用作穩(wěn)定劑時(shí)不起作用，或以特定濃度使用時(shí)，僅僅作為非蛋白肉毒毒素制劑中的肉毒毒素的穩(wěn)定劑。聚乙烯吡咯烷酮(例如Kollidon17)和二糖(例如乳糖)。(f)當(dāng)許多賦形劑與聚乙烯吡咯烷酮(例如Kollidon17)或二糖(例如乳糖)結(jié)合時(shí)，它們起作用或者作為非蛋白肉毒毒素制劑中的肉毒毒素的更好穩(wěn)定劑起作用。(g)雖然特定的PVP"Kollidon17"被用于所制備的多種肉毒毒素制劑中，但其他PVP也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。(h)雖然特定的poloxamer"poloxamer188"^皮用于所制備的多種肉毒毒素制劑中，但其他poloxamer也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。(i)已發(fā)現(xiàn)表面活性劑聚山梨醇酯(吐溫)替代poloxamerl88使用，并具有相似的結(jié)果?？捎糜诒景l(fā)明范圍內(nèi)的肉毒毒素藥物組合物的其他非蛋白賦形劑包括抗氧化劑，例如丁化羥基曱苯(BHT)和丁基化羥基苯曱醚(BHA)，以及氨基酸，例如半胱氨酸和曱硫氨酸。凍干的肉毒毒素制劑可用鹽水、水或常規(guī)的稀釋劑復(fù)水以在復(fù)水或者注射后影響性能。實(shí)施例3肉毒毒素藥物組合物的用途一位48歲的男性被診斷患有肌肉痙攣病癥，例如頸部肌力障礙(cervicaldystonia)。將約10—3U/kg至約35U/kg的含有乳糖和PVP的A型肉毒毒素藥物組合物制劑通過(guò)肌內(nèi)注射給患者。在1-7天內(nèi)肌肉痙攣病癥的癥狀得到緩解，并且癥狀的緩解可持續(xù)至少約2個(gè)月至約6個(gè)月。本文中公開(kāi)的本發(fā)明藥物組合物具有很多優(yōu)點(diǎn)，包括以下1.制備得到的藥物組合物不含有任何血制品例如白蛋白，因此不含有任何血制品的感染成分，例如朊病毒。2.該藥物組合物具有與現(xiàn)有的藥物組合物相當(dāng)?shù)幕蜉^之更好的毒素效力的穩(wěn)定性和高的恢復(fù)％。3.降低的毒性，由肌內(nèi)給藥或靜脈內(nèi)給藥評(píng)估。4.降低的抗原性。本文中引用了多篇出版物、專利和/或參考資料，其內(nèi)容通過(guò)引用完整地納入本i兌明書(shū)。雖然本發(fā)明詳細(xì)地描述了某些優(yōu)選方法，但是在本發(fā)明范圍內(nèi)的其他實(shí)施方案、形式和改進(jìn)也是可行的。例如，各種穩(wěn)定用多糖和氨基酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，以下斥又利要求的主旨和范圍不應(yīng)^皮限于對(duì)上述優(yōu)選的實(shí)施方案的說(shuō)明之中。權(quán)利要求1.一種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，以及；(b)聚乙烯吡咯烷酮。2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中該肉毒毒素是具有生物活性的肉毒毒素。3.權(quán)利要求l的藥物組合物，其中該肉毒毒素選自A、B、C、D、E、F和G型肉毒毒素。4.權(quán)利要求l的藥物組合物，其中該肉毒毒素是一種A型肉毒毒素。5.權(quán)利要求l的藥物組合物，其中所述聚乙烯吡咯烷酮的功能是使肉毒毒素穩(wěn)定。6.—種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，以及；(b)對(duì)應(yīng)于每約IOO單位的所述肉毒毒素有約5克至約20克聚乙烯P比咯烷酮。7.—種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，其中該肉毒毒素未被蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定，以及；(b)聚乙烯吡咯烷酮，其中所述肉毒毒素的效力至少約為所述肉毒毒素理論最大效力的40%。8.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中該肉毒毒素是具有生物活性的肉毒毒素。9.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中該肉毒毒素選自A、B、C、D、E、F和G型肉毒毒素。10.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中該肉毒毒素是A型肉毒毒素。11.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述聚乙烯吡咯烷酮的功能是使肉毒毒素穩(wěn)定。12.—種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，其中該肉毒毒素未被蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定，以及；(b)聚乙烯吡咯烷酮，其中該肉毒毒素的效力至少約為該肉毒毒素理論最大效力的50%。13.—種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，其中該肉毒毒素未被蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定，(b)聚乙烯吡咯烷酮，以及；(c)二糖，其中該肉毒毒素的效力至少約為該肉毒毒素理論最大效力的40%。14.權(quán)利要求13的藥物組合物，其中該肉毒毒素選自A、B、C、D、E、F和G型肉毒毒素。15.權(quán)利要求13的藥物組合物，其中該肉毒毒素是A型肉毒毒素。16.—種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，其中該肉毒毒素未被蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定，(b)聚乙烯吡咯烷酮，以及；(c)二糖，其中該肉毒毒素的效力至少約為該肉毒毒素理論最大效力的50%。17.—種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，其中該肉毒毒素未被蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定，(b)聚乙烯吡咯烷酮，以及；(c)二糖，其中該肉毒毒素的效力至少約為該肉毒毒素理論最大效力的60°/。。18.—種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，其中該肉毒毒素未被蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定，(b)聚乙烯吡咯烷酮，以及；(c)二糖，其中該肉毒毒素的效力至少約為該肉毒毒素理論最大效力的70%。19.一種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，其中該肉毒毒素未被蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定，(b)聚乙烯吡咯烷酮，以及；(c)聚乙二醇，其中該肉毒毒素的效力至少約為該肉毒毒素理論最大效力的40%。20.—種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，其中該肉毒毒素未被蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定，(b)選自第一種單糖、第一種二糖、第一種三糖和由所述第一種單糖還原所得的第一種醇的化合物，以及；(c)選自聚乙二醇、第二種單糖、第二種二糖、第二種三糖、金屬、第二種醇和氨基酸的化合物，其中所述第二種單糖、所述第二種二糖和所述第二種三糖分別不同于所述第一種單糖、所述第一種二糖和所述第一種三糖，其中該肉毒毒素的效力至少約為該肉毒毒素理論最大效力的40%。21.—種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，其中該肉毒毒素未被蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定，(b)聚乙二醇，以及；(c)選自單糖、二糖、三糖、金屬、醇和氨基酸的化合物，其中該肉毒毒素的效力至少約為該肉毒毒素理論最大效力的20%。22.—種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，其中該肉毒毒素未被蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定，(b)聚乙二醇，以及；(c)選自單糖、二糖、三糖、金屬、醇和氨基酸的化合物，其中該肉毒毒素的效力至少約為該肉毒毒素理論最大效力的30%。23.—種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，其中該肉毒毒素未被蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定，(b)聚乙二醇，以及；(c)選自單糖、二糖、三糖、金屬、醇和氨基酸的化合物，其中該肉毒毒素的效力至少約為該肉毒毒素理論最大效力的40%。24.—種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，其中該肉毒毒素未被蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定，(b)聚乙二醇，以及；(c)選自單糖、二糖、三糖、金屬、醇和氨基酸的化合物，其中該肉毒毒素的效力至少約為該肉毒毒素理論最大效力的50%。25.—種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，其中該肉毒毒素未被蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定，(b)聚乙二醇，以及；(c)選自單糖、二糖、三糖、金屬、醇和氨基酸的化合物，其中該肉毒毒素的效力至少約為該肉毒毒素理論最大效力的60%。26.—種藥物組合物，包括(a)肉毒毒素，其中該肉毒毒素未被蛋白質(zhì)賦形劑穩(wěn)定，(b)聚乙二醇，以及；(c)選自單糖、二糖、三糖、金屬、醇和氨基酸的化合物，其中該肉毒毒素的效力至少約為該肉毒毒素理論最大效力的70%。全文摘要一種梭菌毒素藥物組合物，包括諸如肉毒毒素的梭菌毒素，其中存在于藥物組合物中的梭菌毒素被非蛋白賦形劑穩(wěn)定，所述的賦形劑例如聚乙烯吡咯烷酮、二糖、三糖、多糖、醇、金屬、氨基酸、表面活性劑和/或聚乙二醇。文檔編號(hào)A61K9/00GK101175478SQ200680016404公開(kāi)日2008年5月7日申請(qǐng)日期2006年10月4日優(yōu)先權(quán)日2005年10月6日發(fā)明者T·J·亨特申請(qǐng)人:阿勒根公司