專利名稱：組織或細(xì)胞固定劑與一種或多種光活性醌族化合物，尤其是金絲桃素、竹紅菌甲素和竹紅 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織或細(xì)胞固定劑和一種或多種光活性醌族化合物的溶液 組合或試劑盒組合。
本發(fā)明還涉及一種細(xì)胞或組織的標(biāo)記方法，該方法使用一種或多種光活 性醌族化合物，其中，所述細(xì)胞或組織與組織或細(xì)胞固定劑接觸的同時(shí)或隨 后被所述光活性醌族化合物標(biāo)記。
背景技術(shù)：
光活性醌族化合物尤其包括多環(huán)醌，例如金絲桃素(hypericin)、竹紅 菌甲素(hypocrellinA)、竹紅菌乙素(hypocrellinB)或它們的衍生物。
"衍生物"是指化學(xué)修飾的化合物，其中，修飾被認(rèn)為是化學(xué)領(lǐng)域的技 術(shù)人員的常規(guī)手段，如酸的酯化或酰胺化；引入保護(hù)基團(tuán)，如對(duì)醇或硫醇引 入芐基，對(duì)胺引入叔丁氧基羰基。
竹紅菌甲素(1H-環(huán)庚[ghi]茈-5，11 -二酮，l-乙?；?2,3-二氫-2，6,12-三羥 基-4，8，9，13-四甲氧基-2-甲基-,順式)和竹紅菌乙素(1H-環(huán)庚[ghi]茈-5，12-二 酮，3-乙?；?6,ll-二羥基-4,8，9,13-四甲氧基-2-甲基)是從真菌竹小肉座菌 (/fy/ oc廠e〃a Z am6wae )禾口竹黃菌(》S7 'ra/<3 Z7awZmw'co/a) 分罔的酉昆。
C 0
竹紅菌甲素
竹紅菌乙素
這些色素與光線療法結(jié)合使用以治療各種皮膚疾病。最近，已確定它們 的抗病毒的特性，并發(fā)現(xiàn)在光動(dòng)力治療癌癥中，這些醌是很強(qiáng)的光敏劑 (Hirayama等,1997; Zhang等，1998)。
在甲醇中檢測熒光最大吸收波長和最大發(fā)射波長，竹紅菌甲素的分別是 463nm和600nm，竹紅菌乙素的分別是459nm和616nm。
金絲桃素的化學(xué)式是1，3，4，6,8,13-六羥基-10,11- 二甲基菲并 (1,10,9，8,opqra)芘-7,14-二酮
金絲桃素是從金絲桃屬(//3//^n'c"wgem^ )植物中分離出的天然色素， 它是很強(qiáng)的蛋白激酶C的選擇性抑制劑。
金絲桃素具有廣泛的藥物特性，它具有抗菌或抗病毒活性，抗腫瘤活性
和誘導(dǎo)凋亡。金絲桃素的光敏性很早就為人所知，并被用作抗抑郁藥(金絲 桃屬植物)組合物的一部分。
金絲桃素是熒光分子，在乙醇中測定的最大吸收波長和最大發(fā)射波長分
別為591nm和594nm。
已表明灌注在膀胱中的金絲桃素選擇性地積聚在膀胱上皮癌細(xì)胞中。這 個(gè)特性與其光敏性和熒光特性相關(guān)，并使許多研究組提出了采用體外(exv/w) 熒光細(xì)胞診斷癌癥(Olivo等，2003a;01ivo等，2003b; Pytel和Schmeller, 2002)。還提出了使用金絲桃素對(duì)膀胱癌損傷進(jìn)行光動(dòng)力治療(Kamuhabwa 等，2004)。這些方法涉及在患者的膀胱中體內(nèi)注入金絲桃素。
眾所周知金絲桃素是能結(jié)合到細(xì)胞膜脂雙層中的親脂分子。該結(jié)合的精 確機(jī)制還不清楚，但是推測該結(jié)合涉及主動(dòng)運(yùn)輸。因此，到目前為止，金絲 桃素僅用于活細(xì)胞中。
到目前為止，人們認(rèn)為必需在活細(xì)胞中才能用金絲桃素進(jìn)行標(biāo)記，例如， 在含金絲桃素的溶液中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)或者將金絲桃素與分離不久的 細(xì)胞或組織臨時(shí)接觸，以便金絲桃素能被活細(xì)胞結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容
與所有的預(yù)料相反的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與固定劑混合的金絲桃素能被懸 浮在固定劑和金絲桃素的混合液中的腫瘤細(xì)胞非常迅速地結(jié)合，即使這些細(xì) 胞通過與固定劑接觸而被殺死。金絲桃素被活細(xì)胞或死細(xì)胞同等有效地固定 的證據(jù)為使用金絲桃素和更普遍地使用光活性醌族化合物進(jìn)行細(xì)胞或組織 標(biāo)記提供了新的可能性。
固定是意在殺死細(xì)胞以便最大可能地按照它們被發(fā)現(xiàn)時(shí)的活著的狀態(tài) 保存的操作。如果不進(jìn)行固定，則存在自溶的風(fēng)險(xiǎn)。最好的固定劑是那些作 用迅速且產(chǎn)生的次級(jí)修飾或作用最小的固定劑，所述的次級(jí)修飾或作用可能 造成細(xì)胞內(nèi)部形態(tài)的非常不真實(shí)的跡象。
因此，通過在用細(xì)胞或組織固定劑固定細(xì)胞的同時(shí)或之后采用一種或多種光活性醌族化合物尤其是金絲桃素進(jìn)行標(biāo)記，可以在任何時(shí)候?qū)?xì)胞或組 織進(jìn)行研究，而不必將細(xì)胞保持在活的狀態(tài)。
此外還表明，當(dāng)將腫瘤細(xì)胞懸浮在含微摩爾的金絲桃素的固定劑溶液中 時(shí)，金絲桃素對(duì)細(xì)胞的親和力使幾乎所有的金絲桃素都被細(xì)胞結(jié)合。由于細(xì) 胞懸浮液的液相實(shí)際上不再含金絲桃素，因此可以不洗滌細(xì)胞懸浮液而直接 分析細(xì)胞(形態(tài)和/或熒光發(fā)射分析)。因此，這種特性使細(xì)胞/組織的制備和 細(xì)胞的分析可以自動(dòng)化。
因此，本發(fā)明涉及含有組織或細(xì)胞固定劑和一種或多種光活性醌族化合 物的溶液。優(yōu)選地，光活性醌族化合物選自由金絲桃素、竹紅菌甲素和竹紅 菌乙素所組成的組中。更優(yōu)選地，本發(fā)明組合物含有組織或細(xì)胞固定劑和金 絲桃素，或者由組織或細(xì)胞固定劑和金絲桃素組成。
"組織或細(xì)胞固定劑"或"組織或細(xì)胞固定液"意指通常用于組織或細(xì) 胞分析以對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行固定的溶液。細(xì)胞固定劑的實(shí)例包括基于乙醇、
甲醇或聚乙二醇(PEG)的固定劑。組織固定劑的實(shí)例包括基于甲醛的固定劑， 如10%的純甲醛溶液("純甲醛"對(duì)應(yīng)于40%的甲醛水溶液， 一般為可以商 購的"甲醛(formol)")、甲醛/NaCl溶液(例如，通過將10ml的純甲醛， 0.9g的NaCl和90ml的水混合而組成)、甲醛/乙酸溶液(例如，100ml的純 甲醛，50ml冰醋酸和850ml的水)、醇布英防腐液(或Duboscq Brazil;例 如，250ml純甲醛，70ml冰醋酸，5g苦味酸和680ml 7(^的乙醇)。固定劑 的其它實(shí)例包括醇/甲醛/乙酸固定劑(20ml純甲醛，50ml冰醋酸，750ml無 水乙醇和180ml水)或基于氯化鋅的固定劑(10%的甲醛，10-50g/l的氯化 鋅和5%的乙酸或9g/1的NaCl，并選擇性地含有75%的無水醇)。
根據(jù)本發(fā)明的溶液有利地含有l(wèi)-20微摩/毫升、優(yōu)選1-15微摩/毫升、更 優(yōu)選l-10微摩/毫升和進(jìn)一步優(yōu)選1-2微摩/毫升的光活性醌族化合物。
本發(fā)明還涉及含有組織或細(xì)胞固定劑和一種或多種光活性醌族化合物
的試劑盒。優(yōu)選地，所述光活性醌族化合物選自由金絲桃素、竹紅菌甲素和 竹紅菌乙素所組成的組中。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒更優(yōu)選含有組織或細(xì)胞固定 劑和金絲桃素。本發(fā)明的試劑盒還可以選擇性地含有合適的洗滌緩沖液、使 用指南、或者任何其它溶液或合適的設(shè)備。
本發(fā)明還涉及一種對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行體外(6X V/W)標(biāo)記的方法，該方法
使用一種或多種光活性醌族化合物。該方法包括以下步驟
a) 將細(xì)胞或組織樣品與組織或細(xì)胞固定液接觸；
b) 同時(shí)或隨后將細(xì)胞或組織樣品與含有一種或多種光活性醌族化合物 的溶液接觸，接觸的時(shí)間足以使細(xì)胞或組織結(jié)合所述光活性醌族化合
物；禾口
c) 選擇性地，對(duì)細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行洗漆。
含有光活性醌族化合物的溶液優(yōu)選為組織或細(xì)胞固定液。步驟a)和步驟 b)同時(shí)進(jìn)行。細(xì)胞懸浮液的固定時(shí)間非常短(大約幾分鐘)，組織樣品的固 定時(shí)間大約為一小時(shí)。光活性醌族化合物尤其是金絲桃素被懸浮液中的細(xì)胞 結(jié)合， 一般需要1到2小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明的方法，光活性醌族化合物的結(jié)合 時(shí)間和細(xì)胞或組織的固定時(shí)間的不同確保，在細(xì)胞已經(jīng)被固定也就是說細(xì)胞 已經(jīng)死亡時(shí)，光活性醌族化合物被結(jié)合。
優(yōu)選地，所述光活性醌族化合物選自由金絲桃素、竹紅菌甲素和竹紅菌 乙素所組成的組中。本發(fā)明的方法更優(yōu)選用金絲桃素對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行體外 標(biāo)記。
所述細(xì)胞或組織優(yōu)選為腫瘤細(xì)胞或疑似腫瘤細(xì)胞。因此，所述細(xì)胞或組 織樣品可通過從被懷疑患有癌癥并需要表明存在腫瘤細(xì)胞的患者身上分離 或活組織切片而獲得。所述樣品也可以是從已經(jīng)被診斷為癌癥并通過檢測被 癌細(xì)胞結(jié)合的金絲桃素在一段時(shí)間內(nèi)的進(jìn)展而評(píng)價(jià)治療效果的患者獲取。
所述細(xì)胞或組織可來源于任何器官，例如，子宮、肝臟、胃、肺、食管、
膀胱、前列腺和乳房等。細(xì)胞樣品可以是，例如液體樣品，如尿、腹水、胸
膜液或胸包液(periodic liquid);涂片，例如子宮頸的涂片、陰道的涂片、 外陰的(vulvar)涂片或食道的涂片；乳腺的分泌物或器官穿刺，例如，淺腺如 乳房、甲狀腺和腮腺，或者深層器官，例如腎、肝臟、卵巢等。組織樣品可 以是活組織切片或者全部或部分切除的任何器官。
患者可以是動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，例如人、嚙齒動(dòng)物、狗或貓?；颊邇?yōu) 選是人。
本發(fā)明還涉及含有組織或細(xì)胞固定劑和一種或多種光活性醌族化合物 的溶液在診斷癌癥或發(fā)育異常或者監(jiān)控治療或癌癥的治療效果中的應(yīng)用。
更具體地，本發(fā)明提供了一種診斷癌癥或發(fā)育不良的方法，其中，按照 上述方法用一種或多種光活性醌族化合物對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行標(biāo)記，其中存在 被光活性醌族化合物標(biāo)記的細(xì)胞或組織則表明存在腫瘤細(xì)胞或發(fā)育不良的 細(xì)胞。優(yōu)選地，所述光活性醌族化合物選自由金絲桃素、竹紅菌甲素和竹紅 菌乙素所組成的組中。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，診斷癌癥或發(fā)育不良的方法包括以下步驟
a) 將細(xì)胞或組織樣品與組織或細(xì)胞固定液接觸；
b) 同時(shí)或隨后將細(xì)胞或組織樣品與含有金絲桃素的溶液接觸，接觸的時(shí)
間足以使細(xì)胞或組織結(jié)合金絲桃素；
c) 選擇性地，對(duì)細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行洗滌；和
d) 檢測是否存在被金絲桃素標(biāo)記的細(xì)胞或組織；
其中，存在被金絲桃素標(biāo)記的細(xì)胞或組織則表明存在腫瘤細(xì)胞或發(fā)育不良。 使用光活性醌族化合物標(biāo)記細(xì)胞或組織的檢測可以通過測定細(xì)胞或組 織發(fā)射的熒光而容易地進(jìn)行，尤其是在金絲桃素、竹紅菌甲素和竹紅菌乙素
的600nm區(qū)域。
結(jié)果表明金絲桃素對(duì)特定的腫瘤細(xì)胞具有高親和力，所述腫瘤細(xì)胞具有
優(yōu)先核周定位，而對(duì)正常細(xì)胞對(duì)細(xì)胞膜區(qū)域內(nèi)的核周定位的親和力很低。
因此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，至少步驟d)且優(yōu)選所有步驟自動(dòng)進(jìn)行，
以便實(shí)現(xiàn)樣品的自動(dòng)篩選。
優(yōu)選地檢測細(xì)胞的核周標(biāo)記。
具體實(shí)施例方式
在下述非限制性的實(shí)施例中將更詳細(xì)地說明本發(fā)明。
實(shí)施例
實(shí)施例1
在陪替氏培養(yǎng)皿中培養(yǎng)人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(glioblastoma)細(xì)胞。
在實(shí)驗(yàn)前4小時(shí)，將2微摩/毫升金絲桃素懸浮在Sakomano細(xì)胞固定劑 溶液中。含有金絲桃素的該固定劑溶液避光放置。
將所述成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞置于以金絲桃素為基礎(chǔ)而制得的固定劑溶液 中，直接固定一小時(shí)。
采用顯微分光光度計(jì)進(jìn)行比較試驗(yàn)，以比較相同的活的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì) 胞和固定的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的熒光強(qiáng)度水平和熒光光譜質(zhì)量，所述活的成 膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞以相同的濃度在含金絲桃素的Sakomano細(xì)胞固定劑溶液中 孵育一小時(shí)。
結(jié)果表明活細(xì)胞和固定的細(xì)胞的熒光光譜能完全重合，熒光強(qiáng)度是相同的。
實(shí)施例2
將子宮頸的表皮馬氏(malphigian)腫瘤細(xì)胞系(海拉細(xì)胞)培養(yǎng)在陪 替氏培養(yǎng)皿中。然后用Sakomano細(xì)胞固定劑固定細(xì)胞，其中，Sakomano 細(xì)胞固定劑中含有來源于子宮頸涂片的正常上皮細(xì)胞，以證明在含有幾種正
常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液中，金絲桃素對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和力。
將2pm/ml金絲桃素懸浮在己固定的細(xì)胞懸浮液中，避光放置一小時(shí)。
采用顯微分光光度計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，以比較懸浮液中的不同細(xì)胞的熒光強(qiáng)度 水平和熒光光譜質(zhì)量，所述不同細(xì)胞以相同的濃度在含金絲桃素的 Sakomano細(xì)胞固定劑溶液中孵育一小時(shí)。
結(jié)果表明金絲桃素對(duì)具有特定優(yōu)先核周定位的腫瘤海拉細(xì)胞具有高親 和力，而正常細(xì)胞只在細(xì)胞膜區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)出很低的核周定位親和力。
因此，具有特定標(biāo)記的細(xì)胞可以采用自動(dòng)識(shí)別裝置進(jìn)行檢測。因此，可 以設(shè)想自動(dòng)篩選細(xì)胞樣品和尤其是子宮頸涂片以僅僅選擇病理細(xì)胞分布。
參考文獻(xiàn)
Hirayama J., et al. (1997) Photoinactivation of virus infectivity by hypocrellin A ; Photochem. Photobiol. 66, 697
Kamuhabwa A， Agostinis P， Ahmed B， Landuyt W, van Cleynenbreugel B, van Poppel H， de Witte P. (2004) Hypericin as a potential phototherapeutic agent in superficial transitional cell carcinoma of the bladder, Photochem Photobiol Sci. ; 3(8):772-80. Epub 2004 Apr 2.
Olivo M， Lau W, Manivasager V, Bhuvaneswari R, Wei Z， Soo KC， Cheng C， Tan PH. (2003b) Novel photodynamic diagnosis of bladder cancer: ex vivo fluorescence cytology using hypericin, lnt J Oncol. ; 23(6):1501-4.
Olivo M， Lau W， Manivasager V, Tan PH, Soo KC, Cheng C. (2003a) Macro-microscopic fluorescence of human bladder cancer using hypericin fluorescence cystoscopy and laser confocal microscopy, lnt J Oncol.; 23(4):983-90. Pytel A， Schmeller N. (2002) New aspect of photodynamic diagnosis of bladder tumors: fluorescence cytology. Urology. ; 59(2):216-9.
Zhang J., et al.; (1998) Photodynamic effects of hypocrellin A on three human malignant cell lines by inducing apoptotic cell death J. Photochem. Photobiol. B. 43, 10權(quán)利要求
1、一種用于對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行標(biāo)記的溶液，該溶液含有組織或細(xì)胞固定劑和一種或多種光活性醌族化合物，所述光活性醌族化合物選自由金絲桃素、竹紅菌甲素和竹紅菌乙素所組成的組中。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶液，該溶液含有1-20 pmol/ml的所述光活性 醌族化合物。
3、 根據(jù)之前任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的溶液，該溶液含有組織或細(xì)胞固定 劑和金絲桃素。
4、 一種試劑盒，該試劑盒含有組織或細(xì)胞固定劑和一種或多種光活性醌 族化合物，所述光活性醌族化合物選自由金絲桃素、竹紅菌甲素和竹紅菌乙 素所組成的組中。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，該試劑盒含有組織或細(xì)胞固定劑和金 絲桃素。
6、 一種細(xì)胞或組織的體外標(biāo)記方法，該方法使用一種或多種光活性醌族 化合物，該方法包括以下步驟a) 將細(xì)胞或組織樣品與組織或細(xì)胞固定液接觸；b) 同時(shí)或隨后將細(xì)胞或組織樣品與含有一種或多種光活性醌族化合物 的溶液接觸，接觸的時(shí)間足以使細(xì)胞或組織結(jié)合所述光活性醌族化合物，所 述光活性醌族化合物選自由金絲桃素、竹紅菌甲素和竹紅菌乙素所組成的組中；禾口c) 選擇性地，對(duì)細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行洗滌。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述含有一種或多種光活性醌族 化合物的溶液為組織或細(xì)胞固定液，步驟a)和b)同時(shí)進(jìn)行。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中，所述細(xì)胞或組織由金絲桃素 標(biāo)記。
9、 根據(jù)權(quán)利要求6至8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞或組織 樣品來源于被懷疑患有癌癥的患者。
10、 根據(jù)權(quán)利要求6至9中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞樣品 為液體樣品、涂片、乳腺分泌物或器官穿刺。
11、 根據(jù)權(quán)利要求6至10中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述組織樣品 為活組織切片、或者全部或部分切除的器官。
12、 權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的溶液在體外診斷癌癥或發(fā)育不良、 或者監(jiān)控癌癥治療的治療效果中的應(yīng)用。
13、 一種體外診斷癌癥或發(fā)育不良的方法，該方法包括以下步驟a) 將細(xì)胞或組織樣品與組織或細(xì)胞固定液接觸；b) 同時(shí)或隨后將所述細(xì)胞或組織樣品與含有一種或多種光活性醌族化 合物的溶液接觸，接觸的時(shí)間足以使細(xì)胞或組織結(jié)合所述光活性醌族化合 物，所述光活性醌族化合物選自由金絲桃素、竹紅菌甲素和竹紅菌乙素所組 成的組中；c) 選擇性地，對(duì)所述細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行洗滌；和d) 檢測是否存在由所述光活性醌族化合物標(biāo)記的細(xì)胞或組織；其中，存在由光活性醌族化合物標(biāo)記的細(xì)胞或組織則表明存在癌癥或發(fā) 育不良。
14、 根據(jù)權(quán)利要求13所述的體外診斷癌癥或發(fā)育不良的方法，該方法包 括以下步驟a) 將細(xì)胞或組織樣品與組織或細(xì)胞固定液接觸；b) 同時(shí)或隨后將所述細(xì)胞或組織樣品與含有金絲桃素的溶液接觸，接 觸的時(shí)間足以使細(xì)胞或組織結(jié)合金絲桃素；c) 選擇性地，對(duì)所述細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行洗滌；和d) 檢測是否存在由金絲桃素標(biāo)記的細(xì)胞或組織；其中，存在由金絲桃素標(biāo)記的細(xì)胞或組織則表明存在癌癥或發(fā)育不良。
15、 根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中，至少步驟d)自動(dòng)進(jìn)行。
16、 根據(jù)權(quán)利要求13-15中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，檢測核周標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及組織或細(xì)胞固定液和一種或多種光活性醌族化合物(尤其是金絲桃素、竹紅菌甲素和/或竹紅菌乙素)的溶液組合或試劑盒組合。本發(fā)明還涉及采用一種或多種光活性醌族化合物對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行標(biāo)記的方法，其中，細(xì)胞或組織與組織或細(xì)胞固定液接觸的同時(shí)或隨后被光活性醌族化合物標(biāo)記。
文檔編號(hào)A61K35/76GK101180067SQ200680017501
公開日2008年5月14日 申請日期2006年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月7日
發(fā)明者E·佩爾蒂埃 申請人:諾維茨公司