專利名稱：用于治療hpv誘導的上皮內(nèi)瘤樣病變的方法和手段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學領(lǐng)域，特別是HPV感染和腫瘤性疾病的免疫調(diào) 節(jié)、免疫療法和預防的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
高風險人乳頭瘤病毒(HPV)的肛殖道感染非常常見(1-3)，引起 肛門、直腸、陰莖、外陰、陰道和宮頸等區(qū)域內(nèi)、區(qū)域上和/或區(qū)域 周圍的損害。幸運地，被感染的多數(shù)患者清除了所述感染(4、 5)。高 風險HPV (主要是HPV16)的持續(xù)感染可以引起肛殖道的瘤樣病變， 其中宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)和宮頸癌是最著名的(6、7)。HPV16 感染還可以引起a)稱作外陰上皮內(nèi)瘤樣病變(VIN)的外陰慢性皮 膚病(8-10)、 b)稱作肛門上皮內(nèi)瘤樣病變(AIN)的肛門慢性皮膚 病、c)稱作VAIN的陰道慢性皮膚病、和d)稱作PIN的陰莖慢性皮膚 病。與通?？梢酝ㄟ^清除患病區(qū)域進行有效治療的CIN不同，這些疾 病中的其他疾病具有經(jīng)過標準治療后的高復發(fā)率的慢性特征 (11-13)。
已將引起炎癥反應的免疫調(diào)節(jié)劑應用于VIN的治療。特別地，已 經(jīng)將咪喹莫特療法作為治療VIN的一個替代方法提出。咪喹莫特的化 學名為l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺。這一免疫應答調(diào) 節(jié)劑通過天然免疫系統(tǒng)的Toll樣受體發(fā)揮作用，導致促炎細胞因子中 的干擾素大量分泌。最近，有證據(jù)表明咪喹莫特也具有直接的抗腫瘤 細胞的促凋亡活性(14-16)。局部施用保持了外陰的解剖學和功能， 而患病皮膚的外科切除或消融可能是大面積的且可能破壞原有形狀，
并可能帶來嚴重的性心理障礙。臨床成功率有所不同，估計在30-87% (17-21)。
HPV16早期抗原E2、 E6和E7屬于HPV感染的上皮中表達的第一 批蛋白質(zhì)。先前針對這些早期抗原的HPV-特異性T細胞免疫性的研究 表明，針對這些早期抗原的l型(IFN力T細胞記憶可以在大多數(shù)健康 的性活躍個體中檢測到，但在HPV16誘導的宮頸瘤樣病變患者中很弱 或沒有(22-24)。結(jié)合早前關(guān)于CD4+T細胞在保護免于進行性HPV感 染中的功能的報道(綜述于文獻25中)，事實證明針對HPV16早期抗原 的004+ 1型T細胞應答可以在保護免于進行性HPV16誘導的疾病中 發(fā)揮重要功能。
因此，本發(fā)明的目的是提供用于治療病毒誘導的肛殖道上皮內(nèi)瘤 樣病變(例如VIN、 CIN、 VAIN、 PIN和AIN)的改進的方法和手段。
發(fā)明概述
本發(fā)明的目的通過檢査患者是否產(chǎn)生針對病毒早期抗原的免疫 應答得以實現(xiàn)。本發(fā)明證實了HPV-特異性T細胞免疫性對使用引起局 部炎癥的免疫調(diào)節(jié)劑(例如TLR激活化合物如咪喹莫特)進行治療的 成功或失敗的決定性作用。本說明書對重度VIN患者中的HPV16-特異 性004+ T細胞應答的程度和細胞因子極化提供了詳細分析。本發(fā)明 證實將免疫系統(tǒng)持續(xù)暴露給HPV病毒蛋白質(zhì)能夠在大約一半的患者 中誘導干擾素Y(IFN力T細胞免疫性。重要的是，這些l型(IFN力T細 胞應答的存在與使用免疫調(diào)節(jié)劑(例如在該實施例中所使用的咪喹 莫特)進行治療的有利的臨床療效有關(guān)。本發(fā)明的結(jié)論是對于使用引 起局部炎癥的免疫調(diào)節(jié)劑進行有效治療而言，應當首先測定針對HPV 早期抗原的免疫應答。如果不存在所述免疫應答，則可以通過本領(lǐng)域 中的已知方法產(chǎn)生針對HPV早期抗原的免疫應答，以獲得使用弓I起局 部炎癥反應的免疫調(diào)節(jié)化合物進行治療的最佳效果。由于免疫調(diào)節(jié)劑
例如咪喹莫特的使用被證明在不具有針對病毒早期抗原的004+ T細 胞應答的個體中的效力更低或無效，可以首先用藥物對這類患者進行 治療以引發(fā)針對病毒抗原的T細胞應答。如果這還不足以成功，優(yōu)選 通過其他更有效的方式對難治個體進行治療，例如患病皮膚的外科切 除或消融或其他藥物治療。此外，使用引起局部炎癥的免疫調(diào)節(jié)劑進 行治療的負面副作用(例如發(fā)癢、灼熱和疼痛)在這些化合物和/或組 合物的效力更低或無效的患者中可以避免，因為這些患者缺乏針對病 毒早期抗原的免疫應答。
發(fā)明詳述
在第一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種治療患有肛殖道上皮內(nèi)
瘤樣病變的患者的方法，至少包括以下步驟
i) 測定所述患者是否具有對病毒抗原的T細胞反應性；以及
ii) 隨后，對在步驟i)中針對HPV抗原的T細胞反應性的評分為陽 性的患者，使用引發(fā)局部炎癥的免疫調(diào)節(jié)化合物對所述瘤樣病變進行 局部治療。
可以利用標準檢測在血液樣本和來自血液樣本的分離的細胞上
對病毒抗原，尤其是對HPV早期抗原，更特別的是對來自高風險型 (例如HPV16、 HPV18和HPV33)的HPV E2、 E6和E7蛋白質(zhì)的T細胞 反應性進行測定，所述標準檢測例如是本說明書實施例部分和/或WO 02/070006 (并入本發(fā)明作為參考)中所描述的檢測方^^、 T細胞增殖 檢觀ij、 IFNy ELISPOT檢測、細胞因子多重檢測或ELISA檢測。特別地， 產(chǎn)生IFNY的CD4十T細胞應答(1型T細胞應答)在本發(fā)明中被證實對
于使用免疫調(diào)節(jié)劑對肛殖道上皮內(nèi)瘤樣病變的局部治療是非常有利 的。針對病毒早期抗原或結(jié)合于11型目<:分子上的表位的004+免疫
應答尤其有利。本發(fā)明的一部分是專職抗原呈遞細胞(例如樹突狀細 胞、巨噬細胞和NK細胞)的激活，這對于引發(fā)針對肛殖區(qū)病毒感染
細胞和/或瘤樣病變的有效局部炎癥反應是有用的。
應答于1型目(:結(jié)合病毒表位的008+細胞毒性T細胞應答，可以 進一步加強針對HPV感染細胞，尤其是肛殖區(qū)瘤樣病變中的HPV感染 細胞的有效免疫應答。
優(yōu)選地，通過施用免疫調(diào)節(jié)化合物，優(yōu)選能誘導局部炎癥和/或 引發(fā)局部炎癥反應的免疫調(diào)節(jié)化合物，在本發(fā)明的方法中誘導免疫應 答或局部炎癥。最優(yōu)選地，本發(fā)明中所使用的免疫調(diào)節(jié)化合物或組合 物能夠經(jīng)Toll樣受體(TLR)包括例如TLR 1- IO很好地激活天然免疫 系統(tǒng)。能夠激活TLR受體及其變體和衍生物的化合物可以用于誘導局 部炎癥反應，這在現(xiàn)有技術(shù)中已有充分記載(參考文獻51)。 TLR1可 以通過細菌脂蛋白及其乙酰化形式激活，TLR2可以額外地通過革蘭 氏陽性細菌糖脂、LPS、 LPA、 LTA、菌毛、外膜蛋白、來自細菌或 宿主的熱激蛋白、和分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖激活。TLR3可以通 過dsRNA、尤其是病毒來源的dsRNA，或通過化合物poly(I:C)激活。 TLR4可以通過革蘭氏陰性LPS、 LTA、來自宿主或細菌來源的熱激蛋 白、病毒衣殼或包膜蛋白、紫杉醇或其衍生物、含透明質(zhì)酸的寡糖和 纖連蛋白激活。TLR5可以通過細菌鞭毛或鞭毛蛋白激活。TLR6可以 通過分枝桿菌脂蛋白和B組鏈球菌熱不穩(wěn)定可溶性因子(GBS-F)或 葡萄球菌調(diào)控蛋白(modulins)激活。TLR7可以通過咪唑并喹啉 (imidazoquinolines)激活。TLR9可以通過未甲基化CpG DNA或染色 質(zhì)-IgG復合物激活。
特別地，TLR3、 TLR7和TLR9在介導針對病毒感染的天然免疫應 答中發(fā)揮重要功能，并且能夠激活這些受體的化合物尤其優(yōu)選用于本 發(fā)明的局部治療方法及組合物或藥物中。特別優(yōu)選的化合物包含但不 限于dsRNA、 poly(I:C)、觸發(fā)TLR3和TLR9受體的未甲基化CpG DNA。 最優(yōu)選地，將TLR7激活化合物用于本發(fā)明中，所述化合物例如包含 咪唑并喹啉(如咪喹莫特禾l]/或R-848/瑞西莫特)、洛索立賓(7-烯丙基 -8-氧化鳥苷)和溴皮立明(2-氨基-5-烯丙基-8-氧化鳥苷)，這些化合 物被證實具有有效的免疫刺激活性和抗病毒活性并能夠誘導促炎細 胞因子例如IFN-a、 TNF-a、 IL-6和/或IL-12。
其他可用于本發(fā)明的方法及藥物組合物或藥物中以刺激或進一 步加強局部炎癥反應的化合物包括作為炎癥途徑的成員的趨化因子 和細胞因子。實例有I型干擾素(干擾素a和P)和細胞因子(IL-1、 TNF-a、 IL-6、 IL-8 (CXCL8)和IL-12)和/或趨化因子(CXCL-1、 2、 3、 7、 8、 10、 12、 13, CCL-2、 3、 4、 5、 11、 18、 20、 27， XCL-1 禾口CX3CL-1)。
本發(fā)明的治療方法及藥物組合物特別適于治療由病毒感染，尤其 是由人乳頭瘤病毒(HPV)感染，更特別的是由高風險型HPV (包括 HPV-16、 18、 31、 33、 3，、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59和68)感染 所誘導的肛殖道上皮內(nèi)瘤樣病變。但是，在這些上皮區(qū)域由于免疫系 統(tǒng)的保護失敗而發(fā)生的由細菌(分枝桿菌)、真菌和/或其他病毒(例 如皰疹病毒(HSV-1、 HSV-2)、 HIV禾卩/或巨細胞病毒(CMV))導致的 其他感染或共感染，也可以通過本發(fā)明的方法和藥物得到成功治療。 本發(fā)明適于治療任何可被HPV、 HSV和CMV病毒(共)感染的哺乳動
物，尤其適用于人類對象和/或患者。
待用本發(fā)明的方法和藥物進行治療的瘤樣病變可以是任何HPV
誘導的瘤樣病變，所述瘤樣病變優(yōu)選發(fā)生在上皮組織中、肛殖區(qū)和/ 或肛殖道，包括外陰、陰道、宮頸、陰莖、陰囊、肛門和直腸。待治 療的腫瘤性疾病包括各種程度的宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN I、 II和 III)、各種程度的外陰上皮內(nèi)瘤樣病變(VIN I、 II和III)、陰道上皮內(nèi) 瘤樣病變(VAIN)和肛門上皮內(nèi)瘤樣病變(AIN)。在肛殖區(qū)和/或肛 殖道患有病毒誘導的瘤樣病變(例如但不限于陰莖上皮內(nèi)瘤樣病變 (PIN)和肛門上皮內(nèi)瘤樣病變(AIN))的男性患者也同樣可以根據(jù)本 發(fā)明進行治療。
在本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方式中，包括(從頭)引發(fā)或加強
(預先存在的)針對病毒感染的免疫應答的步驟。T細胞應答，尤其是 CD4+ T細胞應答，被證實對于本發(fā)明的方法特別有利。因此，可以 通過現(xiàn)有技術(shù)中各種已知的免疫學或接種的方法產(chǎn)生、促進、延長或 加強這種T細胞應答?？梢葬槍σ换蚨喾N病毒抗原，尤其是HPV早期 抗原，產(chǎn)生或加強免疫應答，盡管也可以使用來自其他病毒的抗原和 細菌(分枝桿菌)抗原或甚至進行組合使用。特別優(yōu)選使用選自來自 高風險性的HPV早期蛋白E2、 E6和E7中的一或多種HPV早期抗原。 本申請的發(fā)明人已經(jīng)通過IFNy ELISPOT檢測鑒定到許多能夠誘導T 細胞應答的CTL表位和T輔助細胞表位(WO 02/070006)。優(yōu)選使用特 定長度的肽，其長度足以避免直接結(jié)合到MHC槽中。需要對更長的 肽進行加工，所述肽優(yōu)選長度超過約12個氨基酸，更優(yōu)選約15、 18 個氨基酸，最優(yōu)選22-45個氨基酸；且這些肽足夠大，可以被專職抗 原呈遞細胞(例如樹突狀細胞)所攝取并在其中進行加工。包含來自 HPV16 E7蛋白的肽的優(yōu)選表位包含SEQ ID NO. 1的第1-22位、第31-52 位、第41-62位、第43-77位、第51-72位和第77-98位氨基酸片段。包 含來自HPV16 E2蛋白的肽的優(yōu)選表位包含SEQ ID N0.2的第31-75 位、第91-20位、第151-195位、第271-300位、第286-315位、第301-330 位、第316-345位和第331-365位氨基酸片段。包含來自HPV16 E6蛋白 的肽的優(yōu)選表位包含SEQ IDNO.3的第31-52位、第81-102位、第91-112 位、第1U-132位、第121-158位和第131-152位氨基酸片段。適當?shù)碾?以及其中包含的病毒表位的選擇不取決于待治療的患者的HLA類型， 但是將取決于其攜帶的特定的病毒感染。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易 地找到這些HPV16肽的氨基酸片段，并用它們替換來自其他高風險或 高同源性HPV類型的對應的肽。
施用病毒抗原以引犮T細胞應答，尤其是引發(fā)004+ T細胞應答， 可以與施用CD40受體和/或4-l-BB受體激活化合物或激動劑聯(lián)合進
行。這可以選自已知的化合物，例如WO 03/084999中所記載的這些 受體和/或(激動性)抗體的各種天然或合成配體或其片段和衍生物， 以通過樹突細胞的活化加強和/或延長肽接種的免疫應答，這將有助 于建立局部炎癥反應。
典型地，在測定是否存在針對病毒抗原的。04+ T細胞應答之前
或之后，根據(jù)本發(fā)明對肛殖道上皮內(nèi)病變患者的治療可以首先施用抗 原。這例如可以包括注射高風險HPVE2、 E6和/或E7中的一或多種， 所述抗原優(yōu)選包含具有如上所描述的表位的肽，所述抗原可以單獨施 用或在包含各種己知佐劑的不同的藥物組合物中施用。優(yōu)選地，使用 產(chǎn)生強烈的HPV早期抗原特異性T細胞(優(yōu)選1型004+ T細胞)應答
的接種方案，所述應答尤其與干擾素Y的抗原特異性產(chǎn)生有關(guān)。接種 方案和佐劑的使用是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，可以通過在線PubMed數(shù)據(jù) 庫中報道的文獻容易地獲得，還例如可以在Current Protocols in Immunology (Wiley Interspience 2004)中找到。在T細胞應答(包括強 烈的CD4十T細胞應答)最強烈時，通常發(fā)生在最后一次接種后約l-2 周(但不限于這一時期)，在待治療的病變上或病變里局部施用一或多 種免疫調(diào)節(jié)劑。所述免疫調(diào)節(jié)劑，優(yōu)選說明書前面部分所描述的炎癥 誘導劑，可以通過熟練醫(yī)師所已知的各種方法進行局部施用。例如可 以通過使用軟膏或乳劑進行施用，或通過透皮貼劑施用，或可以注射 到待治療的上皮內(nèi)病變里或病變周圍或病變附近。之后，每隔一定間 隔局部施用所述免疫調(diào)節(jié)劑以維持局部炎癥反應，直至所述病變消 失。任選地，在該治療期間可以施用激發(fā)劑量的病毒抗原以延長或加 強T細胞應答，并改善治療的臨床結(jié)果?；蛘撸庖哒{(diào)節(jié)劑或優(yōu)選炎 癥誘導劑的局部施用在免疫/接種程序之前和/或期間和域之后發(fā)生。 本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明的治療方法中的新的藥物。藥物的配 制、施用的途徑以及藥學上可接受的賦形劑的使用是本領(lǐng)域中已知和 慣用的，如在Remington; The Science and Practice of Pharmacy, 21nd
Edition 2005， University of Sciences in Philadelphia中所描述的。因此， 本發(fā)明的藥物組合物和藥物可以包含粘合劑例如乳糖、纖維素及其衍 生物、聚乙烯吡咯垸酮(PVP)、濕潤劑、崩解促進劑、潤滑劑、崩解 劑、淀粉及其衍生物、糖增溶劑、免疫刺激佐劑或其他的賦形劑。本 發(fā)明提供了配制和制備用于治療患者的肛殖區(qū)上皮內(nèi)瘤樣病變和/或 這些上皮的感染的新的藥物和/或藥物制劑的方法和手段，所述患者 針對病毒抗原(例如HPV、 CMV和HSV抗原，特別是高風險HPV早期 抗原)的T細胞應答評分為陽性。根據(jù)本發(fā)明的藥物包含作為活性成 分的、能夠誘導局部炎癥反應的免疫調(diào)節(jié)化合物，優(yōu)選能夠激活TLR l-10的ToIl樣受體激活化合物，最優(yōu)選TLR-3、 TLR-7和/或TLR-9激活 化合物。非常適用于本發(fā)明的藥物組合物和藥物中的TLR激活化合物 包括細菌脂蛋白及其乙?；问?、細菌糖脂、細菌外膜蛋白、細菌熱 激蛋白、細菌鞭毛或鞭毛蛋白、菌毛、B組鏈球菌熱不穩(wěn)定可溶性因 子(GBS-F)、葡萄球菌調(diào)控蛋白、革蘭氏陽性LPS或脂質(zhì)A、 LTA、 革蘭氏陰性LPS或LTA、分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖、分枝桿菌脂蛋 白、未甲基化CpGDNA、.染色質(zhì)-IgG復合物、dsRNA、 poly(I:C)、病 毒衣殼或包膜蛋白、紫杉醇或其衍生物、含透明質(zhì)酸的寡糖、纖連蛋 白、咪唑并喹啉和來自宿主生物體的熱激蛋白。優(yōu)選dsRNA、 poly(I:C)、未甲基化CpGDNA以及其他觸發(fā)TLR3和TLR9的物質(zhì)。最 優(yōu)選使用TLR7激活化合物，例如但不限于咪唑并喹啉(如咪喹莫特 和/或R-848/瑞西莫特)、洛索立賓(7-烯丙基-8-氧化鳥苷)和溴皮立明 (2-氨基-5-烯丙基-8-氧化鳥苷)、及其衍生物和同系物。咪唑并喹啉是 最優(yōu)選的用于本發(fā)明的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以任選地包含一或多種能進一步刺 激局部炎癥反應的化合物，例如參與炎癥反應途徑或炎癥級聯(lián)反應的 趨化因子和細胞因子。實例有I型干擾素(a和p)和細胞因子(IL-1、 TNF-a、 IL-6、 IL-8 (CXCL8)和IL-12)或趨化因子(CXCL-1、 2、 3、 7、 8、 10、 12、 13， CCL-2、 3、 4、 5、 11、 18、 20、 27， XCL畫1和 CX3CL-1)。同樣有利地，也可以將能夠刺激原位生成這些細胞因子 和趨化因子的物質(zhì)和化合物混合至本發(fā)明的藥物組合物和藥物中。
在本發(fā)明的另一個實施方式中提供了一種試劑盒，其包含選自以 下組分的一或多種組分，優(yōu)選至少兩種組分
免疫調(diào)節(jié)劑，優(yōu)選炎癥誘導劑；
能進一步剌激局部炎癥反應的化合物或組合物，包括趨化因子和 /或細胞因子；
包含HPV衍生肽的HPV疫苗；禾口/或 用于檢測針對HPV的細胞免疫應答的HPV肽和試劑。
定義
上皮內(nèi)瘤樣病變是癌變前的細胞生長，是不典型增生(Dysplasia) 的同義詞。宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(縮寫為"CIN")是由性傳播病毒 (例如低或高風險人乳頭瘤病毒)引起的宮頸病變。CIN也稱作宮頸不 典型增生(Cervical Dysplasia)。根據(jù)嚴重程度，CIN被分為I、 II或III 級。其被認為是一種癌變前的異常。最輕度形式的CIN， CINI級，很 少發(fā)展為癌癥。更嚴重^式的CIN， CIN II級和CIN III級，如果沒有 得到充分治療有可能發(fā)展成惡性腫瘤。外陰上皮內(nèi)瘤樣病變(VIN) 在外陰皮膚中存在異常細胞。其可以同時存在于外陰皮膚中的一個或 幾個區(qū)域。與CIN類似，VIN也存在3個不同的嚴重程度或階段。VAIN 代表陰道上皮內(nèi)瘤樣病變，其是陰道中類似的瘤樣病變。
男性上皮內(nèi)瘤樣病變包括陰莖上皮內(nèi)瘤樣病變(PIN)。陰莖上皮 內(nèi)瘤樣病變是一種罕見的陰莖外表層(表皮)癌變前疾病。其也稱作 凱臘型增殖性紅斑、陰莖博溫氏病、陰莖鱗狀上皮細胞原位癌或 P.I.N。病變通常發(fā)生在龜頭或包皮內(nèi)側(cè)，且?guī)缀蹩偸窃谖锤钸^包皮的 男性中發(fā)現(xiàn)。如果不進行治療，有10-30%的病例發(fā)展成侵入性陰莖鱗
狀上皮細胞癌。超過50歲的未割過包皮的男性中的大多數(shù)存在患陰莖 上皮內(nèi)瘤樣病變的風險，盡管該疾病可以罕見地在更年輕的男性中發(fā) 生。陰莖上皮內(nèi)瘤樣病變與人乳頭瘤病毒(HPV)的慢性感染、生殖 器疣的原因以及藥物或疾病的免疫抑制有關(guān)。
肛門上皮內(nèi)瘤樣病變(AIN)在男性和女性中均有發(fā)生，并被認 為是肛門鱗狀上皮細胞癌的前身。其發(fā)病率在高風險人群特別是感染 人免疫缺陷病毒(HIV)的人群中正在增加。盡管不排除其他病毒的 感染或共感染的作用，AIN的病因?qū)W與人乳頭瘤病毒無規(guī)律地相聯(lián) 系。至今還沒有用于AIN的標準處理手段，這主要是因為在診斷和治 療上都存在困難。已經(jīng)嘗試了多種治療選擇，但成功率不盡相同。外 科手術(shù)伴有明顯的復發(fā)率，尤其是在HIV陽性患者中。
上皮內(nèi)瘤樣病變也稱作鱗狀上皮內(nèi)病變，其分別與VIN、 CIN、 PIN、 VAIN、或者I期或II-m期AIN相似，也有低度和高度的形式之分。


圖1A:用一整套衍生自HPV16E2、 E6和E7的肽池，在短期增殖 測定(short-term proliferation assays)中對分離自20位與高度HPV16 相關(guān)的VIN患者的新鮮外周血單核細胞進行檢測。當8個檢測孔中有 2 6個孔的增殖(cpm)、超出對照組(僅有培養(yǎng)基)孔的平均增殖+3x SD，則應答被評分為昭'跌;所有檢測孔相對于對照組孔的平均刺激 指數(shù)2 3。將由回憶抗原的混合物組成的記憶應答混合物(MRM)用 作陽性對照。評分為陽性的應答的刺激指數(shù)被示出。
圖1B:通過流式微珠陣列(cytometric bead array)分析圖1A中示 出的陽性增殖應答的上清液中是否存在IFNY、腫瘤壞死因子a、 IL-2、 IL-4、 IL-5和IL-10。圖中所示設計用于6種所測量的細胞因子；實心 正方形代表抗原特異性細胞因子產(chǎn)量。截斷值基于不同細胞因子的標 準曲線(IFNy為50 pg/ml，剩下的其他細胞因子為IO pg/ml)?？乖?br> 異性細胞因子產(chǎn)量被定義為在截斷水平之上并>2x培養(yǎng)基對照組濃 度的細胞因子濃度。
圖2A和圖2B: 2位典型的高度VIN患者(#2，左側(cè)，和#10，右側(cè)) 中的人乳頭瘤病毒16型特異性產(chǎn)IFNY T細胞應答。在第0周(咪喹莫 特治療前)、第8周(咪喹莫特治療期間)和第16周(咪喹莫特治療后) 出現(xiàn)T細胞應答。局部施用含有5%咪喹莫特的乳劑不會導致加強的系 統(tǒng)性HPV16特異性T細胞應答。注意到T細胞應答的大小在不同的時 間點上輕微變化。圖中示出了培養(yǎng)基對照組或存在于E2、 E6和E7池 中的肽所誘導的斑點/100，000個PBMC的平均數(shù)+ SE。將記憶應答混 合物(MRM)用作陽性對照。圖2C和圖2D:預先存在HPV16特異性1 型T輔助細胞應答的患者在經(jīng)咪喹莫特治療后的客觀臨床反應。圖中 顯示了一個典型的實例。圖2C是弁5患者在咪喹莫特治療前經(jīng)活組織檢 査所證實的VIN3病變；圖2D是經(jīng)過16周治療后，#5患者相同的外陰 區(qū)域。
圖3:顯示了在17位用咪喹莫特進行治療的VIN患者中對HPV16 VLP的隨時間的IgG和IgA反應性。每位患者檢測至少兩個血清樣品。 在第0周(咪喹莫特治療前)、第8周(咪喹莫特治療期間)和第16周 (咪喹莫特治療后)出現(xiàn)血清學應答。OD值表示成陽性應答的中位數(shù)士 SD。 OD值通過扣除背景應答值和年幼兒童血清的平均OD值進行計 算。
實施例
方法和材料 患者
從荷蘭學術(shù)醫(yī)學中心婦科以及萊頓和伊拉茲瑪斯大學醫(yī)學中心 征募29位患有高度VIN的婦女(年齡范圍在24-73歲；中值年齡47歲)。 按平均數(shù)計算，這些患者被診斷為在參與該項研究之前已患有VIN3
5.4年(范圍從6個月至15年)。18位婦女在參與研究之前進行過VIN3 的治療(外科切除、激光治療或咪喹莫特治療(#21、 24、 27))。
對這29位患者中的17位(年齡范圍在29-60歲；中值年齡43歲)用 5%咪喹莫特乳劑進行實驗治療。要求這些患者在外陰上的感染區(qū)域 每周過夜施用該乳劑兩次，最多施用16周。為了分析咪喹莫特治療對 HPV16特異性免疫應答的影響，在咪喹莫特治療開始前(T=0)、治療 8周后(T=8)以及治療結(jié)束時(T=16)收集系列血液和血清樣品。在 治療開始時、治療8周后和16周后，通過直接測量和照相記錄評定外 陰病變。將臨床應答定義為完全應答(CR)、 l型部分應答(PR1，通 過病變直徑減少76-99%定義)、2型部分應答(PR2，通過病變直徑減 少26-75%定義)或無臨床應答。
從29位婦女中的20位分離外周血單核細胞(PBMC)，并直接進行 使用以分析HPV16特異性增殖性T細胞反應性。在這20位婦女中，有8 位患者也已參與了咪喹莫特研究。在6個病例中，在咪喹莫特研究結(jié) 束后3個月(#1)， 4個月(#10)、 10個月(#5)至超過l年(#12、 13和15) 進行采血；在另2個病例(#2,4)中，在治療開始后4周內(nèi)進行采血。 收集血清以研究是否存在病毒樣顆粒(VLP) Ll特異性抗體。
如先前所記載的那樣(26)，通過GP5+Z6+PCR繼以反向線點雜交 分析測定所有患者的HPV類型。研究設計得到了醫(yī)學倫理委員會的核 準，且全體婦女給出了書面知情同意書。
抗原
將一組涵蓋全部HPV16 E2、 E6和E7蛋白的肽用于T細胞增殖檢 觀U。 E2肽由具有15個氨基酸重疊的22種30mer肽和長度為35個氨基酸 的羧基末端肽組成。對于T細胞增殖檢測，將E2肽、E6蛋白的32mer 肽、以及具有14個氨基酸重疊的E7蛋白的35mer肽用于每池兩種肽的 池中。對于IFNYELISPOT檢測，所使用的肽涵蓋HPV16 E2、 E6和E7
蛋白，并由E2 30mer月太(22)以及15種E6和9種E7重疊的22mer肽的免 疫原性最強的區(qū)域組成。如先前所記載的那樣合成和溶解所述肽 (27)。肽池用兩種肽所覆蓋的蛋白質(zhì)區(qū)域中的第一個和最后一個氨基 酸表示(例如E21-45，殘.基1-30和16-4527)。將由破傷風類毒素(終濃 度0.75 limus flocculentius/ml;國家公眾衛(wèi)生和環(huán)境研究所，Bilthoven， 荷蘭)、結(jié)核分枝桿菌超聲裂解產(chǎn)物(2.5嗎/ml;由荷蘭阿姆斯特丹的 皇家熱帶研究院P. Klatser博士惠贈)和白色念珠菌(Candida albicans) (0.005%， HALAllergenen實驗室，哈勒姆，荷蘭)組成的記憶應答混 合物(MRM)用作陽性對照。
短期T細胞增殖檢測
用12池衍生自HPV16 E2的30mer肽、4池E6 32mer肽禾口2池E7 35mer肽(每池由兩種重疊肽組成)溫育新鮮分離的PBMC。將PBMC 以1.5 x 10S個細胞/ L的密度接種到于125pl添加了10。/。自體血清的 ISCOVE's培養(yǎng)基(BioWhittaker)中的U形底96孔板(Costar， Cambridge, MA)中。以10嗎/ml/肽的濃度添加衍生自HPV16 E2、 E6和E7的肽。 將單獨的培養(yǎng)基用作陰性對照，將MRM(1:50稀釋)用作陽性對照。 對于每一個肽池，溫育8個平行的微量細胞培養(yǎng)物。在溫育后的第6 天取5(Hil來自微量細胞培養(yǎng)物的上清液，并儲存于-20。C直至進行細 胞因子分析。在第7天，通過[3H]-胸腺嘧啶核苷摻入法測量肽特異性 增殖。當2 75%的檢測孔的增殖超出僅含有培養(yǎng)基對照組孔的平均增 殖+3x SD，則培養(yǎng)物被評分為陽性；剌激指數(shù)(定義為所有檢測孔的 平均值/對照組孔的平均值)2 3 (22)。
與HPV16特異性增殖應答有關(guān)的細胞因子的分析
利用流式微珠陣列(CBA) (Becton Dickinson)測定短期增殖檢 測的上清液中的細胞因子。這一技術(shù)允許對6種不同的Thl和Th2細胞
因子(IFNy、腫瘤壞死因子ot、白細胞介素(IL)-2、 IL-4、 IL-10和IL畫10) 進行同吋檢測。流式微珠陣列根據(jù)廠商說明進行。截斷值基于不同細 胞因子的標準曲線(IFNy為100 pg/ml，剩下的其他細胞因子為IO pg/ml)?？乖禺愋约毎蜃赢a(chǎn)量被定義為在截斷水平之上并>2x 培養(yǎng)基對照組濃度的細胞因子濃度(23， 28)。
通過IF腳Elispot分析HPV16特異性T細胞反應性
如先前所記載的那樣(29， 30)，利用ELISPOT對存在于用咪喹莫 特進行治療的17位患者的外周血中的產(chǎn)生IFNY的HPV特異性T細胞的 數(shù)量進行定量。簡單地說，在存在或缺少所標示的HPV16E2、 E6和 E7肽池的情況下，溶解、洗滌PBMC，并將其以2xl(^個細胞/孔的密 度接種到于lml富含10。/。人AB血清的IMDM(Bio Whittaker, Verviers， Belgium)中的24孔板(Costar， Cambridge, MA)中。在4-5肽的池中， 以5pg/ml/肽的濃度使用肽。將通過其在蛋白質(zhì)中的第一個和最后一個 氨基酸表示的肽用于以下池中E2-I: l畫30、16-45、31-60、46-75; E2-II: 61-90、 76-105、 91-120、 106-135; E2-III: 121-150、 136-165、 151-180、 166-195; E2-IV: 271-300、-286-315、 301-330、 316-345、 331-365; E6-I: 1-22、 11-32、 21-42、 31-52; E6畫II: 41-62、 51-72、 61-82、 71-92; E6陽III: 81-102、91-112、 101-122、 111-132; E6-IV: 111-132、 121-142、 131-152、 137-158; E7-I: 1-22、 11-32、 21-42、 31-52; E7-II: 41-62、 51-72、 61-82、 71-92、 77-98。于37。C溫育4天后，收獲、洗滌PBMC，并將其以105 個細胞/孔的密度接種到以IFNY捕捉抗體(Mabtech AB， Nacha，瑞典) 包被的Multiscreen 96孔板(Millipore， Etten-Leur,荷蘭)中的100jil富 含10% FCS的IMDM中，共4個復孔。根據(jù)廠商的說明(Mabtech)進 行進一步的抗體溫育和ELISPOT。用全自動計算機輔助圖像分析系統(tǒng) (Bio Sys)對斑點計數(shù)。從實驗孔的平均斑點數(shù)中扣除培養(yǎng)基對照組 的平均斑點數(shù)+ 2x SD對特異性斑點進行計數(shù)，假定培養(yǎng)基對照組孔
的平均斑點數(shù)或<10或>10且平均數(shù)的標準差<20%。當特異性T 細胞頻率2 1A0,000且至少2 2x背景時，認為抗原特異性T細胞頻率 增加(30)。背景斑點數(shù)為2.6士2.2(平均值士SD)，只有一個除外(#23: 51士10個斑點)。
HPV16VLPELISA
為了檢測血清中的HPV16特異性抗體，使用了Kimbauer et al先前 所描述的ELISA方法(31)。檢測每一個血清樣品針對HPV16病毒樣顆 粒(VLP，桿狀病毒表達'的包含L1蛋白的衣殼)以及針對牛乳頭瘤病 毒(BPV)衣殼的反應性，后者通過用0.1M碳酸鹽緩沖液進行處理而 打斷以用作陰性對照。VLP和BPV均由J. Dillner教授博士 (LUNDS University,瑞典)慷慨提供。檢測患者的HPV16特異性IgG禾nigA。檢 測一組健康兒童(n=8，平均年齡7.3歲，年齡范圍4.3-14.1歲)的血清 以測定背景反應性。對于HPV16Ll-VLPIgG型應答，使用0.230的截 斷OD值(平均OD-0.060;范圍-0.056 - 0.150;平均值+2 x標準差 =0.230)。對于IgA型應答，使用0.215的截斷OD值(平均00=0.189; 范圍0.171 -0.205)。
統(tǒng)計分析
利用Fisher's exact test進行與細胞因子的產(chǎn)生相關(guān)的HPV16特異 性增殖應答的統(tǒng)計學分析。將Fisher's exact test (雙尾)用于分析對咪 喹莫特治療的臨床應答的HPV特異性免疫性。利用Graphpad Instat軟 件(版本3.0)進行統(tǒng)計學分析。
實施例l
由于頻繁進行治療，高度VIN患者中的HPV16特異性細胞及體液 應答構(gòu)成了HPV誘導的疾病的一個獨特方面，但感染卻反復存在。發(fā)
現(xiàn)HPV16是最常見的。為了更深入地了解在VIN中針對HPV16的 CD4+ T細胞應答，本發(fā)明申請人對一組20位患有與HPV16有關(guān)的高 度VIN的婦女中的HPV16 E2、 E6和E7特異性增殖性T細胞應答的大 小、特異性和功能性做圖。
在短期增殖檢測中，用衍生自HPV16蛋白E2、 E6和E7的肽以及 共同回憶抗原的混合物(MRM)刺激分離自VIN患者的PBMC。本發(fā) 明申請人先前己經(jīng)指明這一檢測是為了測定004+ T細胞應答(23)。 在10/20的患者中檢測到針對E2和/或E6的HPV16特異性增殖性T細胞 應答(圖1A)。在5/20的患者中檢測到E7特異性應答。分析這些T細胞 培養(yǎng)物的上清液中是否存在1型和2型細胞因子，結(jié)果揭示在8/20的患 者中分泌Thl細胞因子IFNY。在一些患者中，偶爾檢測到TNFct、 IL-5 和IL-10的產(chǎn)生(圖1B)。盡管增殖應答的整體頻率與先前發(fā)現(xiàn)的宮頸 癌患者的整體頻率相似，在這些VIN患者中產(chǎn)生與IFNY相關(guān)的HPV特 異性T細胞應答的患者數(shù)更多(分別為8/20和4/17， (23))。
除T細胞免疫外，利用HPV16 L1-VLP作為抗原通過ELISA在28 位VIN患者中測量對HPV16的體液應答?？傮w上，分別在28位患者中 的25位(89%)和28位患者中的13位(46%)中檢測到HPV16 L1-VLP IgG和IgA抗體(表l)。根據(jù)OD值，HPV16 Ll-VLP特異性IgG應答超 過IgA的應答(表l)。通常，當患者呈現(xiàn)相對高水平的HPV16特異性 IgG時，檢測到HPV16特異性IgA應答。如果IgG OD值20.5，樣品中 11/19(58%)含有HPV16Ll特異性IgA;而當IgG水平<0.5時，僅2/9 的樣品呈IgA血清反應陽性。
總之，在絕大多數(shù)患者中檢測到了HPV16 Ll特異性體液免疫， 而僅在大約一半的測試患者中檢測到與IFNY有關(guān)的HPV16 E2、 E6和/ 或E7特異性1型T細胞反應性。
實施例2
HPV16特異性免疫與基于咪喹莫特免疫調(diào)節(jié)治療的更有利的臨 床應答有關(guān)。
對HPV16特異性增殖的分析表明，大量的增殖性T細胞應答與 IFNy的生成有關(guān)。為了檢測這些HPV 16特異性1型T細胞應答在用免疫 調(diào)節(jié)劑咪喹莫特進行治療的成功或失敗中的作用，本發(fā)明申請人在一 組高度HPV16+VIN患者中研究了這一免疫應答。在治療之前(丁=0)、 治療期間(丁=8)、以及治療之后分離PBMC，并將其存儲于液氮中。通 過IFNy ELISPOT分析針對HPV16肽E2、 E6和E7的HPV特異性T細胞 反應性。該方法是對冷凍材料進行抗原特異性1型T細胞反應性分析的 靈敏方法(32， 33)。這些患者中有3位在參與本研究的當年己進行過咪 喹莫特治療(表2， # 21、 24和27)。在這17位患者中有15位呈HPV16 陽性。通過IFNYELISPOT，在15位患者中的8位檢測到預先存在的與 IFNY有關(guān)的T細胞應答OM))。在5/15的患者中，檢測到針對E2的 HPV16特異性T細胞反應性，而4/15的患者呈現(xiàn)針對E6的應答(表2)。 這些患者中沒有表現(xiàn)出預先存在的針對HPV16 E7的T細胞應答。在兩 個病例中，沒有獲得丁=0樣品，在PBMC中的反應從T二8顯示(表2， #1和22)。
盡管對于一些患者而言不能獲得兩個重復樣品中的其中一個 (#5、 13、 27、 28)，顯然不能夠檢測到咪喹莫特對HPV16特異性T細 胞數(shù)的直接影響。沒有患者在經(jīng)咪喹莫特治療后檢測到HPV16特異性 T細胞的明顯增加(圖2a、圖2b)。 一些病患者在參與本研究之前已進 行過咪喹莫特治療，然而重復治療并不會導致HPV16特異性T細胞的 增加(表2， #21和24)。同樣，當用咪喹莫特對患者進行治療時，HPV16 VLP特異性IgG和IgA應答并沒有過度變化(圖3)。
17位受治療的婦女中有13位(76%)對咪喹莫特治療呈現(xiàn)明顯的 臨床應答，表現(xiàn)為她們的病變的大小減小76-100。/。(CR或PRl，表2、
圖2c和圖2d)。 3位患者外陰疾病的患病區(qū)域沒有減小，l位婦女經(jīng)治 療后僅顯示出最小的改善。
重要的是，當把^^16+患者組(n=15)分為具有或不具有HPV 特異性Thl免疫應答的患者時，全部8位具有HPV特異性免疫應答的患 者對咪喹莫特治療呈現(xiàn)完全臨床應答或接近完全臨床應答(CR或PR1) (表2)。相反，不具有HPV特異性免疫應答的患者較不可能表現(xiàn)出這 樣的臨床改善(p = 0.03，雙側(cè)Fisher's exacttest)。
概言之，慢性病毒抗原暴露可以在VIN3患者中誘導針對HPV16 早期抗原￡2、￡6或￡7的1型〇04+ T細胞免疫。這些通過IFNYELISPOT 檢測到的HPV16特異性Thl細胞的存在，即使不是咪喹莫特誘導的 VIN病變的消退所必需的，也確實增加了產(chǎn)生強烈臨床應答的可能 性。Ll特異性體液反應性的存在與咪喹莫特誘導的消退無關(guān)。
參考文獻
1. Burk RD， Kelly P， Feldman J， et al. Declining prevalence of cervicovaginal human papillomavirus infection with age is independent of other risk factors. Sex Transm Dis 1996; 23:333-41.
2. Koutsky L. Epidemiology of genital human papillomavirus infection. Am J Med 1997;102:3-8.
3. Schiffman M， Kjaer SK. Chapter 2: Natural history of anogenital human papillomavirus infection and neoplasia. J Natl Cancer Inst Monogr 2003 ;14-9.
4. Evander M, Edlund K， Gustafsson A， et al. Human papillomavirus infection is transient in young women: a population-based cohort study. J Infect Dis 1995;171:1026-30.
5. Ho GY， Bie腿n R， Beardsley L, Chang CJ, Burk RD. Natural history of cervicovaginal papillomavirus infection in young women. N Engl J Med 1998;338:423-8.
6. Remmink AJ， Walboomers JM， Helmerhorst TJ, et al. The presence of persistent high-risk HPV genotypes in dysplastic cervical lesions is associated with progressive disease: natural history up to 36 months. IntJ Cancer 1995;61:306-11.
7. Kjaer SK， van den Brule AJ， Paull Q et al. Type specific persistence of high risk human papillomavirus (HPV) as indicator of high grade cervical squamous intraepithelial lesions in young women: population based prospective follow up study. BMJ 2002;325:572.
8. van Beurden M， ten Kate FJ， Smits HL， et al. Multifocal vulvar intraepithelial neoplasia grade III and multicentric lower genital tract neoplasia is associated with transcriptionally active human papillomavirus. Cancer 1995;75:2879-84.
9. Buscema J， Naghashfar Z, Sawada E， Daniel R, Woodruff JD， Shah K. The predominance of human papillomavirus type 16 in vulvar neoplasia. Obstet Gynecol 1988;71:601-6.
10. Hording U， Junge J， Poulsen H, Lundvall F. Vulvar intraepithelial neoplasia III: a viral disease of undetermined progressive potential. Gynecol Oncol 1995;56:276-9.
11. Sykes P， Smith N，' McCormick P, Frizelle FA. High-grade vulvar intraepithelial neoplasia (VIN 3): a retrospective analysis of patient characteristics, management, outcome and relationship to squamous cell carcinoma of the vulva 1989-1999. Aust N Z J Obstet Gynaecol 2002;42:69-74.
12. Andreasson B， Bock JE. Intraepithelial neoplasia in the vulvar region. Gynecol Oncol 1985;21:300-5.
13. Rettenmaier MA, Berman ML, DiSaia PJ. Skinning vulvectomy for the treatment of multifocal vulvar intraepithelial neoplasia. Obstet Gynecol 1987;69:247-50.
14. Schon MP and Schon M. Immune modulation and apoptosis induction: two sides of the antitumoral activity of imiquimod. Apoptosis 2004;9:291-8.
15. Geisse J, Caro I， Lindholm J, et al. Imiquimod 5% cream for the treatment of superficial basal cell carcinoma: results from two phase III, randomized, vehicle-controlled studies. Am Acad Dermatol 2004;50:722-33.
16. Sauder DN. Imiquimod: modes of action. Br J Dermatol 2003;149 Suppl 66:5-8.
17. Stanley MA. Imiquimod and the imidazoquinolones: mechanism of action and therapeutic potential. Clin Exp Dermatol 2002;27:571-7. 18. Marchitelli C, Secco G Perrotta M， Lugones L, Pesce R, Testa R. Treatment of bowenoid and basaloid vulvar intraepithelial neoplasia 2/3 with imiquimod 5% cream. J Reprod Med 2004;49:876-82.
19. Todd RW, Etherington IJ， Luesley DM. The effects of 5% imiquimod cream on high-grade vulvar intraepithelial neoplasia. Gynecol Oncol 2002;85:67-70.
20. van Seters M, Fons Q van Beurden M. Imiquimod in the treatment of multifocal vulvar intraepithelial neoplasia 2/3. Results of a pilot study. J Reprod Med 2002;47:701-5.
21. Wendling J, Saiag P, Berville-Levy S, Bourgault-Villada I, Clerici T， Moyal-Barracco M. Treatment of undifferentiated vulvar intraepithelial neoplasia with 5% imiquimod cream: a prospective study of 12 cases. Arch Dermatol 2004;140:1220-24.
22. de Jong A, van der Burg SH， Kwappenberg KM, et al. Frequent detection of human papillomavirus 16 E2-specific T-helper immunity in healthy subjects. Cancer Res 2002;62:472-9.
23. de Jong A， van Poelgeest MI， van der Hulst JM， et al. Human papillomavirus type 16-positive cervical cancer is associated with impaired CD4+ T-cell immunity against early antigens E2 and E6. Cancer Res 2004;64:5449-55.
24. Welters MJ， de Jong A， van den Eeden SJ， et al， Frequent display of human papillomavirus type 16 E6-specific memory T-helper cells in the healthy population as witness of previous viral encounter. Cancer Res 2003;63:636-41.
25. Palefsky JM， Holly EA. Chapter 6: Immunosuppression and co-infection with HIV. J Natl Cancer Inst Monogr 2003;41-6.
26. van den Brule AJ， Pol R， Fransen-Daalmeijer N, Schouls LM,
MeijerCJ, Snijders PJ. GP5+/6+ PCR followed by reverse line blot analysis enables rapid and high-throughput identification of human papillomavirus genotypes. J Clin Microbiol 2002;40(3):779-87.
27. van der Burg SH， Kwappenberg KM, Geluk A， et al. Identification of a conserved universal Th epitope in HIV-l reverse transcriptase that is processed and presented to HIV隱specific CD4+ T-cells by at least four unrelated HLA-DR molecules. J Immunol 1999;162:152-60.
28. van der Burg SH， Menon AQ Redeker A， et al. Magnitude and polarization of P53-specific T-helper immunity in connection to leukocyte infiltration of colorectal tumors. Int J Cancer 2003;107:425-33.
29. de Jong A， O'Neill T， Khan AY， et al. Enhancement of human papillomavirus (HPV) type 16 E6 and E7-specific T-cell immunity in healthy volunteers through vaccination with TA-CIN, an HPV 16 L2E7E6 fusion protein vaccine. Vaccine 2002;20:3456-64.
30. van der Burg SH， Ressing ME， Kwappenberg KM, et al. Natural T-helper immunity against human papillomavirus type 16 (HPV 16) E7-derived peptide epitopes in patients with HPV16-positive cervical lesions: identification of 3 human leukocyte antigen class II- restricted epitopes. Int J Cancer 2001;91:612-18.
31. Kimbauer R, Hubbert NL, Wheeler CM, Becker TM, Lowy DR， Schiller JT. A vims-like particle enzyme-linked immunosorbent assay detects serum antibodies in a majority of women infected with human papillomavirus type 16. J Natl Cancer Inst 1994;86:494-9.
32. Baldwin PJ， van der Burg SH, Boswell CM， et al. Vaccinia-expressed human papillomavirus 16 and 18 e6 and e7 as a therapeutic vaccination for vulvar and vaginal intraepithelial neoplasia.
Clin Cancer Res 2003;9:5205-13.
33. Smyth LJ， van Poelgeest MI, Davidson EJ, et al. Immunological responses in women with human papillomavirus type 16 (HPV-16)-associated anogenital intraepithelial neoplasia induced by heterologous prime-boost HPV-16 oncogene vaccination. Clin Cancer Res 2004;10:2954-61.
34. Todd RW， Roberts S， Mann CH， Luesley DM, Gallimore PH, Steele JC. Human papillomavirus (HPV) type 16-specific CD8+ T-cell responses in women with high grade vulvar intraepithelial neoplasia, Int J Cancer 2004;108:857-62.
35. Davidson EJ， Sehf P, Faulkner RL, et al. Human papillomavirus type 16 E2- and LI-specific serological and T-cell responses in women with vulvar intraepithelial neoplasia. J Gen Virol 2003;84:2089-97.
36. Todd RW， Steele JC, Etherington I， Luesley DM. Detection of CD8+ T-cell responses to human papillomavirus type 16 antigens in women using imiquimod as a treatment for high-grade vulvar intraepithelial neoplasia. Gynecol Oncol 2004;92:167-74.
37. Bontkes HJ， de Gruijl TD, van den Muysenberg AJ, et al. Human papillomavirus type 16 E6/E7-specific cytotoxic T lymphocytes in women with cervical neoplasia. Int J Cancer 2000;88:92-8.
38. Ressing ME， van Driel WJ， Celis E， et al. Occasional memory cytotoxic T-cell responses of patients with human papillomavirus type 16-positive cervical lesions against a human leukocyte antigen-A *0201-restricted E7_encoded epitope. Cancer Res 1996;56:582-8.
39. Nimako M， Fiander AN， Wilkinson GW, Borysiewicz LK, Man S. Human papillomavirus-specific cytotoxic T lymphocytes in patients with cervical intraepithelial neoplasia grade III. Cancer Res
1997;57:4855-61.
40. Youde SJ， Dunbar PR， Evans EM， et al. Use of fluorogenic histocompatibility leukocyte antigen-A^0201/HPV 16 E7 peptide complexes to isolate rare human cytotoxic T-lymphocyte漏recognizing endogenous human papillomavirus antigens. Cancer Res 2000;60:365-71.
41. Gul N， Ganesan R， Luesley DM. Characterizing T-cell response in low-grade and high-grade vulvar intraepithelial neoplasia, study of CD3， CD4 and CDS expressions. Gynecol Oncol 2004;94:48-53.
42. Abdel-Hady ES， Martin-Hirsch P， Duggan-Keen M， et al. Immunological and viral factors associated with the response of vulvar intraepithelial neoplasia to photodynamic therapy. Cancer Res 2001;61:192-6.
43. Davidson EJ， Boswell CM, Sehr P, et al. Immunological and clinical responses in women with vulvar intraepithelial neoplasia vaccinated with a vaccinia virus encoding human papillomavirus 16/18 oncoproteins. Cancer R_es 2003;63:6032-41.
44. Mota F， Rayment N, Chong S, Singer A， Chain B. The antigen-presenting environment in normal and human papillomavirus (HPV)-related premalignant cervical epithelium. Clin Exp Immunol 1999;116:33-40.
45. Giannini SL， Hubert P， Doyen J, Boniver J, Delvenne P. Influence of the mucosal epithelium microenvironment on Langerhans cells: implications for the development of squamous intraepithelial lesions of the cervix. Int J Cancer 2002;97:654-9.
46. Pao CC， Lin CY， Yao DS， Tseng CJ. Differential expression of cytokine genes in cervical cancer tissues. Biochem Biophys Res Commun 1995;214:1146-51.
47. Matsumoto K, Leggatt GR, Zhong J， et al. Impaired antigen presentation and effectiveness of combined active/passive immunotherapy for epithelial tumors. J Natl Cancer Inst 2004;96:1611-19.
48. van Mierlo GJ， Boonman ZF， Dumortier HM, et al. Activation of dendritic cells that cross-present tumor-derived antigen licenses CD8+ CTL to cause tumor eradication. J Immunol 2004;173:6753-59.
49. Villada IB， Barracco MM, Ziol M， et al. Spontaneous regression of grade 3 vulvar intraepithelial neoplasia associated with human papillomavirus-16-specific CD4(+) and CD8(+) T-cell responses. Cancer Res 2004;64:8761-66.
50. Davidson EJ， Faulkner RL， Sehr P， et al. Effect of TA-CIN (HPV 16 L2E6E7) booster immunisation in vulvar intraepithelial neoplasia patients previously vaccinated with TA-HPV (vaccinia virus encoding HPV 16/18 E6E7). Vaccine 2004;22:2722-9.
51. Shizuo Akiro, Hiroaki Hemmi， Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family, Immunology Letters (85) 2003 p85-95.
權(quán)利要求
1.能夠誘導局部炎癥的免疫調(diào)節(jié)化合物在制備用于治療患者中肛殖區(qū)上皮內(nèi)瘤樣病變的藥物中的應用，所述患者針對HPV病毒抗原的CD4+T細胞應答評分為陽性。
2. 權(quán)利要求2的應用，其中所述患者針對HPV早期抗原的CD4+T 細胞應答評分為陽性。
3. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的應用，其中所述患者針對選自 HPVE2、 E6和E7蛋白的^^早期抗原的004+T細胞應答評分為陽 性。
4. 權(quán)利要求l-3中任一項的應用，其中所述化合物為Toll樣受體激 活化合物。
5. 權(quán)利要求4的應用，其中所述化合物選自以下一組細菌脂 蛋白及其乙?；问?、細菌糖脂、細菌外膜蛋白、細菌熱激蛋白、細 菌鞭毛或鞭毛蛋白、菌毛、B組鏈球菌熱不穩(wěn)定可溶性因子(GBS-F)、 葡萄球菌調(diào)控蛋白、革蘭氏陽性LPS或脂質(zhì)A、 LTA、革蘭氏陰性LPS 或LTA、分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖、分枝桿菌脂蛋白、未甲基化CpG DNA、染色質(zhì)-IgG復合物、dsRNA、 poly(I:C)、病毒衣殼或包膜蛋白、 紫杉醇或其衍生物、含透明質(zhì)酸的寡糖、纖連蛋白、咪唑并喹啉和來 自宿主的熱激蛋白。
6. 權(quán)利要求5的應用，其中所述化合物是TLR-7激活化合物。
7. 權(quán)利要求6的應用、其中所述化合物選自以下一組咪喹莫特、 Rm/瑞西莫特、洛索立賓和溴皮立明。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的應用，其中所述瘤樣病變是外 陰上皮內(nèi)瘤樣病變(VIN)。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的應用，進一步包括使用選自以 下一組的直接參與炎癥途徑的化合物干擾素、細胞因子和趨化因子。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的應用，其中所述患者是在對患 者施用所述藥物之前或期間已經(jīng)主動產(chǎn)生針對HPV早期抗原的T細胞 應答的患者。
11. 權(quán)利要求10的應用，其中已通過施用12-45個氨基酸長度的包 含HPV早期抗原序列的肽產(chǎn)生所述T細胞應答，所述HPV早期抗原序 列選自HPVE2、 E6或E7序列。
12. 權(quán)利要求10或11的應用，其中所述肽選自以下一組包含T細 胞表位且能夠引發(fā)INFY應答的肽SEQ ID No.l的氨基酸片段l-22、 31-52、 41-62、 43-77、 51-72和77-98; SEQ ID No.2的氨基酸片段31-75、 91-120、 151-195、 271-300、 286-315、 301-330、 316-345和331-365; 以及SEQ ID No.3的氨基酸片段31-52、 81-102、 91-112、 111-132、 121-158和131畫152。
13. 權(quán)利要求10-12寧任一項的應用，進一步包括施用CD40受體 激活分子。
14. 權(quán)利要求10-13中任一項的應用，進一步包括施用4-lBB受體 激活分子。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于治療病毒誘導的肛殖道上皮內(nèi)瘤樣病變(例如HPV誘導的外陰、宮頸、陰道、陰莖及肛門上皮內(nèi)瘤樣病變(VIN、CIN、VAIN、PIN和AIN))的改進的方法和手段。本發(fā)明提供了治療患有肛殖道上皮內(nèi)瘤樣病變的患者的方法，所述方法至少包括以下步驟首先測定所述患者是否具有對病毒早期抗原(尤其是高風險型HPV抗原)的T細胞反應性；如果對所述患者的T細胞反應性(優(yōu)選針對HPV早期抗原的CD4+應答)的評分為陽性，隨后用引發(fā)局部炎癥的免疫調(diào)節(jié)化合物對所述瘤樣病變進行局部治療。本發(fā)明還包括在用能夠引發(fā)局部炎癥反應的免疫調(diào)節(jié)化合物進行治療之前或期間，誘導或進一步刺激抗HPV抗原的細胞免疫應答的方法和手段。
文檔編號A61K31/4745GK101189014SQ200680018561
公開日2008年5月28日 申請日期2006年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月27日
發(fā)明者C·J·M·邁利夫, R·奧夫林加, S·H·范德布爾格, T·J·M·赫爾默霍斯特 申請人:萊頓大學醫(yī)學中心