專利名稱：：螺石烯醇治療線粒體紊亂的應(yīng)用的制作方法螺石烯醇治療線粒體紊亂的應(yīng)用相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2005年4月1日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序號(hào)60/667,229和2005年7月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序號(hào)60/697,518的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)通過引用結(jié)合于本文。發(fā)明背景線粒體是存在于除紅細(xì)胞外的每一個(gè)體細(xì)胞中的獨(dú)特的腔室，并且負(fù)責(zé)通過氧化磷酸化作用產(chǎn)生超過90%的用于肌體維持生命和支持生長(zhǎng)所需的能量。當(dāng)線粒體呼吸鏈衰竭，細(xì)胞的能量水平迅速降低，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和器官功能損害。取決于所涉及的器官，線粒體生理功能的損害涉及神經(jīng)退行性疾病和紊亂。這些疾病和紊亂包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病和紊亂，如阿爾茨海默氏病和帕金森氏病，以及那些侵害外周神經(jīng)的疾病和紊亂，諸如肌肉紊亂(肌病)和多種腎、肝和呼吸紊亂。根據(jù)線粒體紊亂的嚴(yán)重程度不同，疾病的嚴(yán)重程度可介于輕度和死亡之間。不管線粒體衰竭是否是所經(jīng)歷的疾病的原因或結(jié)果，保護(hù)呼吸功能以恢復(fù)受損的生理功能是至關(guān)重要的。此外，線粒體呼吸功能的維護(hù)對(duì)于需要成功移植的組織的保存也是重要的。對(duì)于基因基礎(chǔ)上的線粒體病還沒有治愈方法，但是治療可幫助減輕癥狀或延緩或預(yù)防疾病的發(fā)展(M.Zeviani等，Sra/w;127:2153(2004))。治療對(duì)于每個(gè)病人來說是個(gè)性化的，依據(jù)紊亂的性質(zhì)和嚴(yán)重程度的不同而異，雖然這些治標(biāo)的治療將不逆轉(zhuǎn)業(yè)已持續(xù)存在的損害。然而，當(dāng)前正在評(píng)估一些實(shí)驗(yàn)策略，包括基因療法和藥物介入。一個(gè)策略包括經(jīng)由蛋白質(zhì)輸入機(jī)(importmachinery)將修飾的基因或基因產(chǎn)品導(dǎo)入線粒體內(nèi)(G.Manfredi等，Ge""，30:394(2002)),并通過序列特異性反基因組的(antigenomic)肽-核酸抑制突變體mtDNA的復(fù)制(R.W.Taylor等，15:212(1997))。這些手段還沒有用于臨床。在經(jīng)過挑選的、孤立的肌病病例中，通過使用肌毒性(myotoxic)藥物，控制肌肉纖維損害和通過無突變的衛(wèi)星細(xì)胞再生，獲得異質(zhì)性突變體荷載的減少(W.Irwin等，J說o/.Qem.,:2T7:2221(2002))。然而，該療法在五個(gè)患有進(jìn)行性外眼肌麻痹(PEO)的病人中對(duì)于改善上瞼下垂是無效的。肌酸是合成磷酸肌酸的底物并且是肌肉、心臟和腦中的最為豐富的能量?jī)?chǔ)存化合物。81個(gè)患有多種神經(jīng)肌肉紊亂的病人(包括17個(gè)患有線粒體病)的開i文試-驗(yàn)顯示，缺血性等長(zhǎng)收縮握力(isometrichandgripstrength)和非缺血性等長(zhǎng)背屈4E力(dorsiflexiontorque)顯著改善。然而，另一個(gè)在16個(gè)患有慢性PEO或線粒體肌病的病人的安慰劑對(duì)照、雙盲、隨機(jī)交叉試-瞼中，對(duì)運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)、眼睛運(yùn)動(dòng)或日常生活活動(dòng)并沒有發(fā)現(xiàn)顯著的效應(yīng)(P.F.Chimery等，爿m.丄Ge恥f,106:94(2001))?？傊?，這些資料提示，在某些但不是所有的線粒體病中，肌酸可能是有效的。雖然在mtDNA-相關(guān)的線粒體病中，輔酶Q10是無效的(N.Bresolin等，J.Wewra/.Sc/,100:70(1990)),但其導(dǎo)致在"主要的，，CoQ10缺乏的明顯的改善。艾地苯醌，較短鏈的輔酶Q10的類似物，似乎對(duì)改善弗里德希氏共濟(jì)失調(diào)中的肥厚性心肌病有效(P.Rustin等，L朋c",354:477(1999);C.Mariotti等，Wewra/ogv,60:1676(2003》。因此，存在對(duì)治療線粒體紊亂包括線粒體病的方法的持續(xù)需求。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供治療罹患不是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)病變的線粒體紊亂或受其威脅的哺乳動(dòng)物例如人的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物有效量的式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中RpR2、R4、R7、R、R!2和R,s各自獨(dú)立為氬、任選插入-NR'畫、-O-、-S-、-SO誦、-S02-、-0-S02-、-S02-0-、-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-(3(0)~^11'-或-:^11'-(3(0)-的(<31-(38)烷基；羥基、N(R')2、羧基、氧代或磺酸，Rg為羥基、(C廣C8)烷氧基、(&-(322)烷基C02或R'02C(CH2)2-8C02-，其中(C廣C22)烷基或(CH2)2-8可任選包含1-2個(gè)CI^CH單元、l-2個(gè)OH和/或l-2個(gè)環(huán)氧取代基、甲苯-4-磺酰基氧基或苯曱酰氧基；R6、R8、R9、R10、R13、R14、1116和1117各自獨(dú)立為氫、(C廣C8)烷基、羥基(C廣Cs)烷基、(C,-Cs)烷氧基或羥基；和X為O、S、S(O)或N(R')、N(Ac)或N(曱苯-4-磺?；趸?，，.其中每一R'獨(dú)立為H、(&《8)烷基、苯基或千基。1116和/或1117優(yōu)選為CH3。烷基優(yōu)選為(CVC8)烷基。因此，本發(fā)明包括治療罹患線粒體紊亂或受到所述紊亂威脅的患者的治療方法，其中所述紊亂不是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)病變，所述方法包括給予患者有效量的式(II)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中RpR2、R4、R7、R、R,2和R,5各自獨(dú)立為氫、((^8)烷基、羥基、氨基、羧基、氧代、磺酸，或任選插入-NH-、-N(((VC8)烷基)畫、-o-、-s-、-so-、-so2-、-o-so2-、-so2-o-、-c(o)-、-c(o)-O-、-O-C(O)-、-0;0)-服'-或-服'-0:0)-的(。1-(^)烷基，其中R'為H或(C廣C8)烷基；113為羥基、(C陽C6)烷基C02-、H02C(CH2)2C02-、甲苯-4-磺?；趸虮綍貂Ｑ趸?；R6、R8、R9、R1Q、1113和1114各自獨(dú)立為氫、(C廣C8)烷基、羥基(C廣C8)烷基、(C廣C8)烷氧基或羥基；和X為O、N(H)、N(Ac)或N(甲苯-4-磺?；趸?。如在以下詳述中所討論的，螺石烯醇(spirostenols),特別是5,6位未取代的螺石烯醇如(22S，2SS)-(20S)-螺甾-5-烯-3(3-基己酸酯(spirost-5-en-3p-ylhexanoate),為天然存在于菊三七(Qv"wra7."/謹(jǐn)'ca)(菊科(a他raceae))中的22i-輕基膽甾醇衍生物，其可提供新的治療策略，即通過直接靶向線粒體呼吸鏈以及其靶向?qū)€粒體有毒性的Ap起作用。(22&255)-(205)-螺甾-5-烯-3(3-基己酸酯還消除氧化磷酸化作用誘導(dǎo)的解偶聯(lián)和增強(qiáng)環(huán)胞菌素A(線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換孔的有效阻滯劑)的作用，提示對(duì)膜滲透性轉(zhuǎn)換孔起作用。線粒體紊亂，包括線粒體病，并不被認(rèn)為是CNS神經(jīng)病變并且可采用現(xiàn)有方法治療，所述線粒體紊亂包括眼晴色素性;視網(wǎng)膜炎、視覺神經(jīng)萎縮；肌肉眼外肌功能紊亂(上瞼下垂、獲得性斜視、眼肌麻痹)、肌肉挫傷綜合征(骨筋月菱室綜合征(compartmentsyndrome));藥物副作用所致的線粒體功能不全(即，高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法，HAART);月幾病；心臟心臟病突發(fā)(heartstroke)、心臟病發(fā)作(heartattack)、心臟疾患(heartconditions)、心臟病、心月幾病和藥物副作用所致的任何心臟線粒體功能不全(即，HAART、mega-HAART、抗癌藥物如蒽環(huán)類(anthracyclins));肝肝細(xì)胞功能不全；腎和內(nèi)分泌系統(tǒng)腎小管病變、糖尿?。缓秃粑蓙y。本發(fā)明還提供新的式I或II化合物和組合物，諸如包含與藥學(xué)上可接受的載體組合的有效量的式I和/或II化合物的藥用組合物。附圖簡(jiǎn)述圖1通過監(jiān)測(cè)大鼠腦線粒體中的呼吸系數(shù)的演變，評(píng)估遞增濃度的SP-233(10至100pM)對(duì)線粒體呼吸鏈的作用。該線粒體呼吸系數(shù)(MRC)為V3/V4。V4為基礎(chǔ)02消耗，V3為加ADP(ATP產(chǎn)物)后的02消耗。調(diào)節(jié)線粒體濃度至0.4mg蛋白質(zhì)/ml。值得注意的是，SP-233的濃度低至10pM時(shí)，與對(duì)照阻比較，引起MRC降低50%(p<0.001)。結(jié)果以均值士SD表示；由ANOVA,隨后通過Dunnett，s沖全驗(yàn)進(jìn)行組間比較。圖2(a):SP-233對(duì)大鼠腦線粒體中CCCP-1起的氧化磷酸化解偶聯(lián)的作用。為了評(píng)估SP-233對(duì)CCCP-引起的氧化磷酸化解偶聯(lián)的作用，加入蘋果酸鹽/谷氨酸鹽之前，將線粒體片段于37。C在SP-233的存在下孵育3min,接著1min后加入CCCP。暴露于解偶聯(lián)劑CCCP(1pM)增加02消耗至基礎(chǔ)值的150%(p<0.01)，此變化反映氧消耗的增加。在所有被測(cè)試的濃度(甚至是1pM)，SP-233消除CCCP的代謝作用(p〈0.001)。該SP-233對(duì)"解偶聯(lián)"的抑制作用與降低02消耗至基礎(chǔ)水平的60-65%有關(guān)并且是非濃度-依賴的，(b):SP-233對(duì)CsA-引起的缺氧的作用。缺氧由加入CsA(1μM)至浴泡(bathing)線粒體的培養(yǎng)基中引起。該試驗(yàn)通過在存在CsA和缺乏SP-233下加入ADP作對(duì)照。首先加入SP-233或其溶々某，并且使孵育4爭(zhēng)續(xù)1.5min,之后輕緩加入CsA。然后，1.5min后加入底物蘋果酸鹽/谷氨酸鹽和2.5min后加入ADP。暴露于SP-233不抑制由CsA引起的MRC的下降，而相反，CsA的作用以濃度-依賴的方式增強(qiáng)。結(jié)果以均值士SD表示；由ANOVA,隨后通過Dunnett's檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。圖3新鮮的和老化的Apw2對(duì)大鼠腦線粒體的線粒體呼吸系數(shù)的作用。加入底物蘋果酸鹽/谷氨酸鹽之前，在APm2的存在下將殘粒體于37。C孵育1.5min。加入蘋果酸鹽/谷氨酸鹽1min后加入ADP。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)省略ADP作對(duì)照。即使是在0.1pM的低濃度下，AP,^顯著降低MRC。新鮮的淀粉樣肽對(duì)MCR的作用比老化形式的更加顯著，其各自降低MRC為55_63%和43-53%。結(jié)果以均值士SD表示；由ANOVA,隨后通過Dunnett，s檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。圖4SP-233對(duì)由新鮮的或老化的APw2引起的大鼠腦線粒體中的線粒體呼吸系數(shù)的改變作用。于37。C下，在SP-233的存在下將線粒體孵育3mm和在新鮮制備的(a)或老化的(b)A(3M2的存在下醉育l.Smin,隨后加入蘋果酸鹽/谷氨酸鹽。加入底物蘋果酸鹽/谷氨酸鹽lmin后加入ADP。在沒有ADP下進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)作對(duì)照，了解SP-233對(duì)APm2的作用。(a):與對(duì)照組比較，新鮮的A(3^使MRC降低71%且該作用由SP-233部分抑制。觀察到用最低濃度的SP-233最有效的作用，其使MRC恢復(fù)至對(duì)照值的39%(38.56±0.34對(duì)28.93士1.75,p<0.01)。(b):與對(duì)照值比較，老化的APw使MRC降低51%,但SP-233不防止該作用。結(jié)果以均值士SD表示；由ANOVA,隨后通過Dunnett's才全馬全進(jìn)4亍組間比灃交。圖5在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中SP-233對(duì)抗APM2-引起的毒性的保護(hù)作用的評(píng)估。用APm2(0.1、1和10pM)或溶媒并且是在存在或缺乏SP-233(1^M)下孵育SK-N-AS神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞72h后，采用MTT分析評(píng)估Ap的細(xì)胞毒性。SP-2"(1^M)預(yù)防由三個(gè)ApM2濃度引起的神經(jīng)毒性。結(jié)果以均值士SD表示；由ANOVA,隨后通過Dunnett's^H全進(jìn)4亍組間比哞交。用A(3M2處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞顯示出強(qiáng)的免疫反應(yīng)性(其與線粒體呼吸鏈復(fù)合體II共定位(co-localized),表示八^.42存在于線粒體內(nèi))。用SP-233處理消除APM2的免疫反應(yīng)性，表示其可能阻止A(3m2進(jìn)入線粒體。圖6SP-233對(duì)線粒體呼吸的作用。螺石烯醇衍生物(22i,25i^20a-螺甾-S-烯-鄧-基己酸酯(SP-"3)的化學(xué)式示于(a)中。通過監(jiān)測(cè)分離的大鼠腦線粒體的呼吸系數(shù)的演變，評(píng)估遞增濃度的SP-233(1aM至100pM)對(duì)線粒體呼吸鏈的作用，其示于(b)中。該線粒體呼吸系數(shù)(MRC)定義為V3/V4，其中V4為基礎(chǔ)〇2消耗和V3為加入ADP(ATP產(chǎn)生)后的02消耗。調(diào)節(jié)線粒體濃度至0.4mg蛋白質(zhì)/ml。注意SP-233的濃度低至1M時(shí)，與對(duì)照阻比較，引起MRC降低40%(p<0.001)。結(jié)果以三份獨(dú)立進(jìn)行的重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值±SD表示。圖7SP-233對(duì)CCCP-引起的氧化磷酸化解偶聯(lián)和對(duì)CsA-引起的缺氧的作用，(a)為了評(píng)估SP-233對(duì)CCCP-引起的氧化磷酸化解偶聯(lián)的作用，加入蘋果酸鹽/谷氨酸鹽之前，將線粒體片段于37。C在SP-233的存在下孵育3min。1min后加入CCCP。暴露于解偶聯(lián)劑1pMCCCP增加02消耗至基礎(chǔ)值的150%(p<0.01)。在所有被測(cè)試的濃度，SP-233消除CCCP的代謝作用(p〈0.001)。SP隱233對(duì)"解偶聯(lián)"的抑制作用與降低02消耗至基礎(chǔ)水平的60-65%有關(guān)并且是非濃度-依賴的。(b)缺氧由加入1inMCsA至浴泡線粒體的培養(yǎng)基中引起。作為對(duì)照，在存在CsA和缺乏SP-233下加入ADP。首先加入SP-233或其溶媒，并且使孵育持續(xù)l.5min,之后輕緩加入CsA。1.5min后加入底物蘋果酸鹽/谷氨酸鹽和2.5min后加入ADP。暴露于SP-233不抑制由CsA引起的MRC的下降。相反，CsA的作用以濃度-依賴的方式增強(qiáng)。結(jié)果以三份獨(dú)立進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的均值±SD表示。圖8新鮮的或老化的APM2對(duì)大鼠腦線粒體中的線粒體呼吸系數(shù)的作用。在加入底物蘋果酸鹽/谷氨酸鹽之前，于37。C下，在A(V42的存在下將線粒體孵育1.5min。加入蘋果酸鹽/谷氨酸鹽1min后加入ADP。在這些實(shí)驗(yàn)的醉育混合物中省略了ADP。即使是在0.1pM的濃度下，Apw2顯著降低MRC。新鮮的淀粉樣肽對(duì)MCR的作用比老化形式的作用更加顯著，各自使MRC下降55-63%和43-53%。結(jié)果以三份獨(dú)立進(jìn)行的重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值士SD表示。圖9SP-233對(duì)由新鮮的或老化的Af3M2引起的MRC的變化的作用。在加入蘋果酸鹽/谷氨酸鹽之前，于37。C下，在SP-233的存在下將線粒體孵育3min和在新鮮制備的(a)或老化的(b)ApM2的存在下孵育l.Smin。加入蘋果酸鹽/谷氨酸鹽1min后加入ADP。對(duì)照反應(yīng)在缺乏ADP下進(jìn)行。與對(duì)照組比較，新鮮的A(3m2使MRC降低71%且該作用由SP-233部分抑制。觀察到用最低濃度的SP-233試驗(yàn)具有最有效的作用，其使MRC恢復(fù)至對(duì)照值的39%(38.56±0.34對(duì)28.93±1.75,p<0.001)。與對(duì)照值比較，老化的APm2使MRC降低51%,但SP-233不防止該作用。結(jié)果以三份獨(dú)立進(jìn)行的重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值士SD表示。圖10在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，SP-233對(duì)抗A(3^2-引起的毒性的保護(hù)作用的評(píng)估。用ApM2(0.1、1和10iliM)或溶媒并且是在存在或缺乏SP-233(1^M)下，孵育SK-N-AS培養(yǎng)物72h后，采用MTT分析評(píng)估AP的細(xì)胞毒性。結(jié)果以三份獨(dú)立進(jìn)行的重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值士SD表示。圖11SP-233對(duì)ApM2在SK-N-AS人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的線粒體攝取的作用的共聚焦顯微分析。攝自健康、未受傷的(對(duì)照)細(xì)胞的典型圖象示于(al-4)。這些培養(yǎng)物沒有接受任何APw2或SP-233。攝自用A(3m210處理3個(gè)小時(shí)的SK-N-AS細(xì)胞的典型圖象示于(bl-4)。取自用ApW210pM和SP-2331pM處理3個(gè)小時(shí)的SK-N-AS細(xì)胞的典型圖象示于(cl-4)。細(xì)胞用DAPI核復(fù)染劑染色(al、bl和cl)并對(duì)A(V42標(biāo)記(FITC;a2、b2和c2)和復(fù)合體II70-kDa亞單位(德州紅；a3、b3和c3)。合并的圖象示于a4、b4和c4。用Ap,^2處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞顯示強(qiáng)的與線粒體呼吸鏈(b4)復(fù)合體II共定位的免疫反應(yīng)性(b2),以及用SP-233處理消除A(3M2的免疫反應(yīng)性(c2)。圖12在SK-N-AS細(xì)胞中，SP-233對(duì)抗線粒體復(fù)合體抑制劑的神經(jīng)保護(hù)作用。在加入SP-233或其溶劑后1個(gè)小時(shí)，將五種不同的線粒體毒素加入SK-N-AS培養(yǎng)物中。在進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)之前，在缺乏或存在SP-233下，將魚藤酮、丙二酸鹽和黏p塞唑菌醇(myxothiazol)孵育24個(gè)小時(shí)。對(duì)于KCN和寡霉素的孵育期為6個(gè)小時(shí)。結(jié)果以三份獨(dú)立進(jìn)行的重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值士SD表示。與不用SP-233處理的培養(yǎng)物比一支，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。圖13SP-233對(duì)SK-N-AS神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)抗PAO的神經(jīng)保護(hù)作用。向培養(yǎng)基中加入SP-233或其溶劑1個(gè)小時(shí)后，加入PAO。在進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)之前，使培養(yǎng)基在缺乏或存在SP-233下于PAO中印孚育24個(gè)小時(shí)。結(jié)果以三份獨(dú)立進(jìn)行的重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值士SD表示。與不用SP-233處理的細(xì)胞比較，**p<0.01。圖14SP-233對(duì)FCCP-引起的SK-N-AS細(xì)胞中的線粒體呼吸鏈的解偶聯(lián)的作用。向SK-N-AS培養(yǎng)物中加入SP-233或其溶劑1個(gè)小時(shí)后，力o入FCCP。在進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)之前，使培養(yǎng)物在缺乏或存在SP-233下于FCCP中孵育24個(gè)小時(shí)。結(jié)果以三份獨(dú)立進(jìn)行的重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值土SD表示。與不用SP-233處理的細(xì)胞比較，**p<0,01。圖15由SP-233草巴向的線粒體位點(diǎn)的示意性表示。用綠色箭頭指出由SPJ"靶向的呼吸鏈的要素。虛線箭頭表示弱的神經(jīng)保護(hù)作用和實(shí)線綠色箭頭表示強(qiáng)的保護(hù)作用。觀察到最顯著的對(duì)抗KCN(復(fù)合體IV的抑制劑)、寡霉素(復(fù)合體V的抑制劑)和PAO(MPT的促進(jìn)劑)的作用。發(fā)明詳述如下文討論的，線粒體呼吸鏈損害已經(jīng)廣泛地被描述與阿爾茨海默氏病(AD)相關(guān)，并且已有報(bào)告A(3M2使線粒體呼吸鏈解偶聯(lián)和促使線粒體的膜滲透性轉(zhuǎn)換(MPT)孔開啟，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。已有報(bào)告螺石烯醇(22&255)-(2(XS)-螺甾巧-烯-鄧-基己酸酯(SP-233)通過與肽結(jié)合并使肽失活保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)抗APm2毒性。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即SP-233的保護(hù)作用也導(dǎo)致對(duì)線粒體功能的保護(hù)。已發(fā)現(xiàn)皮摩爾(微樣么摩爾)濃度的APw2通過由SP-233部分逆轉(zhuǎn)的保護(hù)作用，降低大鼠前腦分離的線粒體中的線粒體呼吸系數(shù)。該SP-233的保護(hù)作用很可能是由其直接靶向呼吸鏈以及其靶向A(3m2所致。SP-233還消除由氰化羰基3-氯代苯基腙(carbonylcyanide3-chlorophenymydrazone,CCCP)引起的氧化磷酸化解偶聯(lián)和增強(qiáng)環(huán)胞菌素A(線粒體MPT孔的有效阻滯劑)的作用，提示對(duì)MPT有作用。SP-233的這些特性將可對(duì)其神經(jīng)保護(hù)作用有貢獻(xiàn)，因?yàn)楹粑湹慕馀悸?lián)和線粒體MPT孔的開啟是兩個(gè)可被APw2觸發(fā)的有害的事件。使用人SK-N-AS神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，采用共聚焦顯樣i分析，還觀察到，ApM2在線粒體基質(zhì)中積聚和SP-233將ApM2從基質(zhì)中完全清除。這些結(jié)果表明，將APw2和SP-2"對(duì)人神經(jīng)細(xì)胞的線粒體功能發(fā)揮直接作用并且SP-233(當(dāng)與淀粉樣肽一起存在于孵育混合物中時(shí))可保護(hù)這些細(xì)胞以對(duì)抗Ap-引起的毒性。共同地，這些結(jié)果表明ApM2可通過其直接靶向Ap，對(duì)線粒體功能發(fā)揮直接毒性作用和SP-233發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用，從而保護(hù)呼吸鏈和提供一組用于治療線粒體病和紊亂(而不是AD和其它CNS神經(jīng)病變)的化合物。及病癥，其中線粒體紊亂或功能不全在起病時(shí)的癥狀、進(jìn)程和/或后果中起作用。后者病癥包括神經(jīng)退行性疾病諸如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、多發(fā)性硬化癥或肌萎縮側(cè)索硬化以及由中風(fēng)、腦缺血和其它腦和脊索損傷引起的神經(jīng)元死亡。已有報(bào)告包括(22S,25S)-(20S)-螺甾-5-烯-3-基己酸酯的螺石烯醇用于對(duì)抗A-引起的神經(jīng)毒性和它們有效用于AD治療(L.Lecanu等，Steroids,69:1(2004)),并且為公布的PCT申請(qǐng)WO/03/077869的主題。之前未知(22S,25S)-(20S)誦螺甾-5-烯-3-基己酸酯對(duì)于保護(hù)線粒體對(duì)抗多種應(yīng)激物的應(yīng)用及其在治療多種線粒體病中的應(yīng)用。線粒體病或線粒體肌病是一組4曼襲線粒體的疾病，也干擾肌肉功能。這組疾病包括Kearns-Sayre綜合征、Leigh's綜合征、線粒體DNA缺失綜合征(MDS)、線粒體腦肌病、乳酸酸中毒和卒中樣發(fā)作(MELAS)、伴破碎紅纖維的肌陣攣癲癇癥(MERFF)、線粒體神經(jīng)胃腸道腦肌病(MNGIE)、神經(jīng)病變、共濟(jì)失調(diào)和色素性視網(wǎng)膜炎(NARP)和進(jìn)行性外眼肌麻痹(PEO)。線粒體肌病的癥狀包括肌肉軟弱或運(yùn)動(dòng)失耐(exerciseintolerance)、心力衰竭(心肌病)或節(jié)律紊亂、癡呆、運(yùn)動(dòng)障礙、卒中樣發(fā)作、耳聾、失明、眼瞼下垂、眼晴運(yùn)動(dòng)受限、嘔吐和癲癇發(fā)作。這些紊亂的預(yù)后的嚴(yán)重程度在進(jìn)行性虛弱至死亡的范圍內(nèi)。因而，線粒體紊亂可包括眼睛的紊亂，諸如視神經(jīng)萎縮、上瞼下垂、獲得性stabimus和眼肌麻痹。線粒體功能不全可由肌肉挫傷綜合征(或骨筋膜室綜合征(compartmentsyndrome))、藥物治療的副作用諸如HAART和涉及損害心臟的藥物(如蒽環(huán)類)的抗-癌癥療法、肝細(xì)胞功能不全、內(nèi)分泌性腎小管病變和呼吸紊亂引起。大多數(shù)線粒體肌病在20歲之前發(fā)生并且常常在開始時(shí)伴有運(yùn)動(dòng)失耐或肌肉軟弱。在身體活動(dòng)期間，肌肉可變得容易疲勞或軟弱。肌肉痙攣雖罕見，但可發(fā)生。惡心、頭痛和呼吸困難也與這些紊亂有關(guān)。如在本文使用的術(shù)語"治療"或"處理"指在患者中與涉及線粒體疾病或紊亂有關(guān)的紊亂或疾病的任何治療，其包括，但不限于在可易患所述紊亂或疾病，但尚未被診斷患有所述紊亂或疾病的患者中預(yù)防發(fā)生該紊亂或疾?。灰种扑鑫蓙y或疾病，例如，使該紊亂或疾病的發(fā)展滯留；緩解所述紊亂或疾病，例如，使該紊亂或疾病消退；或消除由所述疾病或紊亂引起的病癥，例如，使該疾病或紊亂的癥狀停止。如在本文中使用的，"線粒體紊亂"或"線粒體病"意指包括所有在本文^Hf的紊亂。本方法還可被用于預(yù)防或減輕體外如在等候或進(jìn)^^移植中的器官或組織中的線粒體紊亂。涉及在患者中與線粒體疾病或紊亂有關(guān)的術(shù)語"預(yù)防"或"防止"，指如果沒有發(fā)生所述疾病或紊亂，則沒有疾病或紊亂的發(fā)展，或如果已經(jīng)發(fā)生所述疾病或紊亂，而該紊亂或疾病沒有進(jìn)一步的發(fā)展，或無為邏輯上可見的疾病的征候的癥狀。優(yōu)選的立體異構(gòu)體是3&以及和135，還有205、和其中碳骨架的編號(hào)與在螺石烯-3-醇中的編號(hào)一致。因而，優(yōu)選的式(I或n)化合物為(22&255)-(205)-螺甾-5-烯-3P-基己酸酯(SP233)。注意，除非另有所指，示于式(I)或(II)中的碳原子為氫所飽和。除非另有定義，每一術(shù)語"烷基，，、前綴"烷"(如在烷氧基中)和后綴"-烷基"(如在羥基烷基中)指直鏈(如，丁基)或支鏈(如，異丁基)的C,-8烴鏈。亞烷基、亞烯基、亞炔基分別指二價(jià)CL8烷基(如亞乙基)、烯烴基和炔烴基。優(yōu)選，烷基為(C,-Q)烷基，諸如丁基、己基、甲基、乙基、丙基或異丙基。術(shù)語"烷基"包括環(huán)烷基、(環(huán)烷基)烷基和烷基(環(huán)烷基)烷基。術(shù)語"烯基"同樣地包括含l-2個(gè)CHNCH單元的烷基，以及相應(yīng)的環(huán)烯基部分。具體地，(C廣Q)烷基可為曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔-丁基、戊基、3_戊基、庚基或辛基；(CVC8)環(huán)烷基可為單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)的且包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、雙環(huán)[2.2.2]辛烷基或降水片基(norbomyl),以及多種碎烴和類碎結(jié)構(gòu)。(CVQ)環(huán)烷基(C廣C2)烷基包括前述的環(huán)烷基和可為環(huán)丙基甲基、環(huán)丁基曱基、環(huán)戊基曱基、環(huán)己基曱基、2-環(huán)丙基乙基、2-環(huán)丁基乙基、2-環(huán)戊基乙基或2-環(huán)己基乙基。雜環(huán)烷基包括這樣的環(huán)烷基，其中環(huán)烷基環(huán)系統(tǒng)為單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)的并任選包含1-2個(gè)S、非過氧化的O或N(R')以及4-8個(gè)環(huán)碳原子；諸如嗎啉基、哌啶基、哌。秦基、茚滿基、1,3-二p塞烷-2-基等。任何環(huán)烷基或雜環(huán)烷基環(huán)系統(tǒng)任選包含1-3個(gè)雙鍵或環(huán)氧部分和任選被1-3個(gè)OH、(C廣C6)烷?；趸?CO)、(C廣Q)烷基或(cvc6)炔基取代。(c廣C8)烷氧基可為曱氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、仲-丁氧基、戊氧基、3-戊氧基或己氧基；(C2-Q)烯基可為乙烯基、烯丙基、l-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、l-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3_己烯基、4-己烯基或5-己烯基；羥基(C廣Q)烷基或羥基(C廣C8)烷氧基可為被1或2個(gè)OH基團(tuán)取代的烷基，諸如被l或2個(gè)OH基團(tuán)取代的烷基諸如雍基曱基、l-羥基乙基、2-羥基乙基、l-羥基丙基、2-羥基丙基、3-羥基丙基、l-羥基丁基、4-羥基丁基、3,4-二羥基丁基、l-羥基戊基、5-羥基戊基、1-羥基己基或6-羥基己基；(C,-C22)烷基C02-可為乙酸基、丙酰氧基、丁酰氧基、異丁酰氧基、戊酰氧基或己酰氧基，或(。8-(322)。02-可表現(xiàn)為天然存在的脂肪酸的殘基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，1^。和/或1112為CH3。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，R^和Rn為CHg。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，Rp112和/或1112可為H或OH。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RpR2、R4、R6、R7、R8、R9、RR12、R!4和R'5為H。R2可為(C廠C22)烷基C02-，包括(CVC22)烷基CCV或(CrC6)烷基C02-，或可為OH或0(C廣C8)烷基或H02C(CH2)2C02-。X可為O或NR'，包括NH或NAc。Rs也可為OR23,其中1123為可去除的羥基-保護(hù)基團(tuán)諸如曱苯磺?；?、曱磺酰基、三(C廣Q)烷基曱硅烷基、THP、Eto(Et)、千基、苯曱酰氧基羰基等?；衔锏?33-((38-(:22)脂肪酸酯(其中。3為羥基取代的)也包括在本發(fā)明內(nèi)，其中脂肪酸優(yōu)選為天然產(chǎn)生的。表1.<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在給藥治療與受損的線粒體功能相關(guān)的疾病之前，可將有效量的本發(fā)明有效化合物與藥學(xué)上可接受的載體配制形成藥用組合物。"有效量"或"藥理學(xué)上的有效量，，指需要對(duì)被治療患者賦予治療作用的化合物的量。動(dòng)物和人的劑量相互關(guān)系(基于每平方米體表面積毫克數(shù))由Freireich等，CancerChemotherRep皿，219(1966)描述。體表面積可由患者的身高和體重近似測(cè)定。參見，如，ScientificTables,GeigyPharmaceuticals,Ardley,NewYork,1970,537。有效劑量可基于發(fā)現(xiàn)對(duì)抑制Ap的毒性或另外的保護(hù)線粒體有效的本化合物的體外濃度。下面公開用于治療神經(jīng)細(xì)胞系模型的本化合物的劑量。如本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所公認(rèn)的，有效劑量也依據(jù)給藥途徑、賦形劑的使用和任選共同給予的其它治療劑的不同而異?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方法如，用于測(cè)定LD5。(群體50%致死劑量)和ED5()(群體50%有效治療劑量)，測(cè)定活性成分的毒性和治療功效。毒性和治療作用之間的劑量比率為治療指數(shù)并且可用比率LD5。/ED5。表達(dá)。表現(xiàn)大的治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。當(dāng)可使用表現(xiàn)出毒性副作用的化合物時(shí)，必須小心設(shè)計(jì)使這樣的化合物靶向受侵襲組織的傳遞系統(tǒng)，以使對(duì)非感染細(xì)胞的潛在損害降至最小，從而減少其副作用。包括在所述方法中的本發(fā)明的藥劑盒、組合藥物和藥用組合物為所描述化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽的晶型(如，多晶形物)、對(duì)映體形式、異構(gòu)體形式和互變異構(gòu)體。作為例證性的藥學(xué)上可接受的鹽從以下酸制備曱酸、乙酸、丙酸、丁二酸、羥基乙酸、葡糖酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、葡糖醛酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯曱酸、鄰氨基苯曱酸、曱磺酸、硬脂酸、水楊酸、對(duì)-鞋基苯曱酸、苯基乙酸、扁桃酸、樸酸、曱烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、泛酸、甲苯磺酸、2-羥基乙烷磺酸、對(duì)氨基苯磺酸、環(huán)己基氨基磺酸、瓊脂酸(algenic)、b-羥基酪酸、半乳糖二酸和半乳糖醛酸。術(shù)語"前藥"指由通過在體內(nèi)代謝過程轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生藥理作用的藥物或化合物(活性部分)。前藥通常被認(rèn)為是藥物前體，在給予患者并且在隨后的吸收后，經(jīng)由某些過程，諸如代謝過程轉(zhuǎn)化為活性或更具活性的種類。由轉(zhuǎn)化過程得來的其它產(chǎn)物易于被身體處置。前藥通常具有存在于前藥上的致使其更少活性和/或賦予藥物溶解性或某些其它特性的化學(xué)基團(tuán)，諸如酯基或?；?。一旦所述化學(xué)基團(tuán)從前藥裂解出來，會(huì)產(chǎn)生更具活性的藥物?？蓪⑶八幵O(shè)計(jì)為可逆的藥物衍生物并用作修飾物以增強(qiáng)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至具特定位點(diǎn)的組織。目前前藥的設(shè)計(jì)已經(jīng)有效增加治療化合物的水溶性，所述化合物用于耙向水為主要溶劑的區(qū)域。例如，F(xiàn)edorak.等.Am.J.Physiol,269，G"0-218(199S)描述了地塞米松-p-D-葡萄糖醛酸化物。McLoed,等，Gastroenterol—106，405-413(1994)描述了地塞米松-丁二酸鹽-右旋糖苷。Hochhaus,等，Biomed.Chrom.，6,283-286(1992)描述了地塞米松-21-磺基苯甲酸鈉和地塞米松-21-異煙酸酯。還有，J.Larsen和H.Bundgaard,Int.JPharmaceutics:21，87(1987)描述N-酰基磺胺作為有效的前藥衍生物的評(píng)價(jià)。J.Larsen等，Int.J.PhaTmace"ti'cs」41,103(1988)描述N-曱基磺胺作為有效的前藥衍生物的評(píng)價(jià)。還在例如，Sinlmla等—.T.Pharm.Sci:64.181-210(1975)中描述前藥。前藥還在通合成的中間體。例如,參見,IT.Harrison.CompendiumofOrganicSyntheticMethods:Wiley-Interscience(1971),用于相互轉(zhuǎn)換螺石烯醇取代基的方法。術(shù)語"衍生物"指通過一個(gè)原子、分子或基團(tuán)被另一個(gè)原子、分子或基團(tuán)置換或取代，而從另一個(gè)類似結(jié)構(gòu)的化合物產(chǎn)生的化合物。例如，化合物的氬原子可被烷基、?；?、氨基等取代產(chǎn)生該化合物的》t生物。"血漿濃度"指物質(zhì)在血漿或血清中的濃度。"藥物吸收，，或"吸收"指從給藥部位向體循環(huán)例如，進(jìn)入患者的血流的運(yùn)動(dòng)過程。"生物利用度"指活性部分(藥物或代謝物)吸收進(jìn)體循環(huán)中并且在體內(nèi)的藥物作用部位變得可用的程度。"代謝"指藥物在體內(nèi)的化學(xué)轉(zhuǎn)化過程。"藥效學(xué)，，指確定觀察到的與作用部位的藥物濃度有關(guān)的生物學(xué)反應(yīng)的因素。"藥物代謝動(dòng)力學(xué)"指確定達(dá)到和保持作用部位的藥物濃度的因素。"血漿半衰期，，指血漿藥物濃度從其最高濃度衰減50%所需的時(shí)間。本公開中所用的術(shù)語"約"意為"近似"并且包括將在相關(guān)領(lǐng)域的實(shí)踐中出現(xiàn)的參數(shù)中的變量。作為例證性的術(shù)語"約"的使用指劑量在所指范圍之外，也可是有效和安全的，并且這樣的劑量也納入本權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。術(shù)語"可檢測(cè)的血清濃度，，意為給藥后吸收進(jìn)入血流的治療劑的血清濃度(具體以每ml、每dl或每1血清所含的mg、ng或ng治療劑來檢測(cè))。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"用于形容本文，意為所修飾的名詞適合用于藥物產(chǎn)品中。藥學(xué)上可接受的鹽包括金屬離子和有機(jī)離子。更優(yōu)逸的金屬離子包括，但不限于適當(dāng)?shù)膲A金屬(Ia族)鹽離子、堿土金屬(IIa族)鹽離子和其它生理學(xué)上可接受的金屬離子。作為實(shí)例的離子包括通常價(jià)的鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅。優(yōu)選的有機(jī)離子包括質(zhì)子化的叔胺和季銨陽離子，部分包括三曱胺、二乙胺、N,N'-二千基乙二胺、氯代普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、葡曱胺(N-曱基葡糖胺)和普魯卡因。作為實(shí)例的藥學(xué)上可接受的酸包括且不限于鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸、甲烷磺酸、乙酸、甲酸、酒石酸、順丁烯二酸、蘋果酸、檸檬酸、異檸檬酸、丁二酸、乳酸、葡糖酸、葡糖醛酸、丙酮酸、草乙酸、反丁烯二酸、丙酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸等。通常以藥用組合物的形式給予本發(fā)明組合物?？赏ㄟ^任何適當(dāng)?shù)耐緩浇o予這些組合物，所述途徑包括，但不限于口服、鼻祠(nasogastric)、直腸、透皮、胃腸夕卜(例如，皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、骨髓內(nèi)和皮內(nèi)注射或通過輸注技術(shù)給予)、鼻內(nèi)、透粘膜、才直入、陰道內(nèi)、局部、口頰和舌下。這樣的制劑可常規(guī)包含緩沖劑、防腐劑、滲透促進(jìn)劑、可適配的載體和其它治療性或非-治療性成分。本發(fā)明還包括使用含與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合的一個(gè)或更多個(gè)式I或II化合物的藥用組合物的方法。如在本文使用的術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"或"藥學(xué)上可接受的賦形劑，，包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這樣的介質(zhì)和試劑的對(duì)于不可吸收物質(zhì)的應(yīng)用為本領(lǐng)域所熟悉。除了達(dá)到任何常規(guī)介質(zhì)和試劑與組合物不適配的程度之外，其應(yīng)用是預(yù)期的。附加的活性成分也可摻入組合物中。在制備本發(fā)明組合物中，組合物可與藥學(xué)上可接受的賦形劑混合，經(jīng)賦形劑稀釋或用這樣的可形成膠嚢、小袋或其它容器的載體包嚢?？捎糜谥苽浔景l(fā)明組合物的載體材料為那些在制藥中任何常規(guī)使用的賦形劑并且應(yīng)該基于與活性藥物的適配性和想要的劑型的釋放特性來選擇。以下選擇例證性的藥用賦形劑作為實(shí)例(a)粘合劑諸如阿拉伯樹膠、褐藻酸及其鹽、纖維素衍生物、曱基纖維素、雍基乙基纖維素、羥基丙基纖維素、硅酸鋁鎂、聚乙二醇、樹膠、多聚糖酸(polysaccharideacids)、膨潤(rùn)土、雍基丙基甲基纖維素、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮/乙烯乙酸酯共聚物、交聯(lián)聚維酮、聚維酮、聚甲基丙烯酸酯、羥基丙基甲基纖維素、輕基丙基纖維素、淀粉、預(yù)膠化淀粉、乙基纖維素、黃蓍膠、糊精、環(huán)糊精、微晶纖維素、蔗糖或葡萄糖等。(b)崩解劑諸如淀粉、預(yù)膠化玉米淀粉、預(yù)膠化淀粉、纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素、乙醇酸淀粉鈉、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧曱纖維素鈉(croscarmellose)、^斂晶纖維素、藻酸鉤、藻酸鈉的復(fù)合體、粘土、褐藻酸鹽、樹膠或乙醇酸淀粉鈉和用于制備片劑的任何崩解劑。(c)填充劑諸如乳糖、碳酸鈣、磷酸鈣、磷酸氬鉤、硫酸釣、微晶纖維素、纖維素粉劑、葡萄糖、葡萄糖結(jié)合劑(dextrates)、右旋糖苷、淀粉、預(yù)膠化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化鈉、聚乙二醇等。(d)表面活性劑諸如十二烷基硫酸鈉、山梨醇酐單油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯、聚山梨醇酯、polaxomers、膽汁鹽類、單硬脂酸甘油酯、普朗尼克(PluronicTM)系列(BASF)等。(e)增溶劑諸如檸檬酸、丁二酸、反丁烯二酸、蘋果酸、酒石酸、順丁烯二酸、戊二酸、碳酸氫鈉和碳酸鈉等。(f)穩(wěn)定劑諸如任何抗氧化劑、緩沖劑，或也可使用酸等。(g)潤(rùn)滑劑諸如硬脂S臾鎂、氫氧化鈣、滑石粉、硬脂酰反丁烯二酸鈉、氫化植物油、>使脂酸、behapate甘油酯、硬脂酸4美、》更脂酸4丐和硬脂酸鈉、硬脂酸、滑石粉、石蠟、硼酸、苯曱酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉、DL-亮氨酸、聚乙二醇、油酸鈉或十二烷基^e克酸鈉等。(h)潤(rùn)濕劑諸如油酸、單硬脂酸甘油酯、山梨醇酐單油酸酯、山梨醇酐單十二酸酯、三乙醇胺油酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐單十二酸酯、油酸鈉或十二烷基硫酸鈉等。(i)稀釋劑諸如乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、-微晶纖維素、磷酸氬釣、蔗糖-基質(zhì)稀釋劑、糖粉、一元硫酸釣單7jc合物、硫酸鈣二水合物、乳酸鈣三水合物、葡萄糖結(jié)合劑、肌醇、谷物水解固形物、直鏈淀粉、粉末纖維素、碳酸鈣、甘氨酸或膨潤(rùn)土等。(i)抗-粘附劑或助流劑諸如滑石粉、玉米淀粉、DL-亮氨酸、十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸鈉等。(k)藥學(xué)上可接受的載體包括阿拉伯樹膠、明膠、膠體二氧化硅、丙三醇磷酸鈣、乳酸鈣、麥芽糊精、丙三醇、硅酸鎂、酪蛋白酸鈉、大豆卵磷脂、氯化鈉、磷酸三鈣、磷酸二鉀、硬脂酰乳酸鈉、角叉菜膠、單甘油酯、甘油二酯或預(yù)膠化淀粉等。還有，藥物制劑在例如Remington'sTheScienceandPracticeofPharmacy(2000)中討論。對(duì)藥物制劑的另外的討論可在Liberman,H.A.和Lachman,L.,Eds.,PharmaceuticalDosageForms,MarcelDecker,NewYork,N.Y.,1980中發(fā)現(xiàn)。含本發(fā)明組合物的片劑或顆粒劑可為薄膜包衣或腸溶包衣的。除了用于人的治療之外，本發(fā)明還用于其它患者包括獸醫(yī)動(dòng)物、爬蟲類動(dòng)物、鳥類、外來動(dòng)物和家畜，包括哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物等。哺乳動(dòng)物包括靈長(zhǎng)類動(dòng)物，例如，猴子或狐猴、馬、狗、豬或貓。嚙齒動(dòng)物包括大鼠、小鼠、+>鼠或豚鼠。在指定給予線粒體毒性抑制劑時(shí)，本發(fā)明藥用組合物是有用的。相信這些組合物將特別對(duì)線粒體病的治療有效。為了治療神經(jīng)退行性紊亂/線粒體紊亂，可用本發(fā)明藥用組合物，以足夠引起治療反應(yīng)如，減少藥物-引起的線粒體毒性的量，提供一定劑量的本發(fā)明化合物，例如，約5ng至約1000mg或約100ng至約600mg或約1mg至約500mg或約20mg至約400mg的劑量。具體給藥的有效量范圍將在約0.0001mg/kg至1500mg/kg,更優(yōu)選從1至1000mg/kg，更優(yōu)選從約1至150mg/kg體重和最優(yōu)選約50至100mg/kg體重?？梢悦刻煲恢良s四次劑量給藥或以每天多次劑量給藥以引起治療作用。作為例證性的本發(fā)明組合物的劑量單位具體可包含，例如，約5ng、50ng、100ng、500ng、1mg、10mg、20mg、40mg、80mg、100mg、125mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1000mg的本發(fā)明化合物?？蛇x擇劑型提供想要的給藥頻率用以達(dá)到特定的劑量。治療病癥或紊亂所給予的組合物的單位劑型的量和給藥方案，依據(jù)多種因素包括患者的年齡、體重、性別和病情、病癥或紊亂的嚴(yán)重程度、給藥的途徑和頻率，并且如所熟知的可差異很大。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，以有效量給予患者組合物，即以本發(fā)明化合物在患者血清中一段時(shí)間達(dá)到產(chǎn)生想要的治療作用的有效治療劑量的量給予組合物。作為例證，在空腹成人(一般空腹至少IO個(gè)小時(shí))中，給予組合物自從給予組合物后約5分鐘在患者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的有效治療劑量。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在給予患者組合物約10分鐘時(shí)在患者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的有效治療劑量。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在自給予患者組合物約20分鐘時(shí)在患者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的有效治療劑量。在本發(fā)明的還一個(gè)實(shí)施方案中，在自給予患者組合物約30分鐘時(shí)在患者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的有效治療劑量。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，在自給予患者組合物約40分鐘時(shí)在患者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的有效治療劑量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，自從給予患者組合物約20分鐘至約12個(gè)小時(shí)，在患者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的有效治療劑量。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在自給予患者組合物約20分鐘至約6個(gè)小時(shí)，在患者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的有效治療劑量。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，在自給予患者組合物約20分鐘至約2個(gè)小時(shí)，在患者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的有效治療劑量。在本發(fā)明的還一個(gè)實(shí)施方案中，在自給予患者組合物約40分鐘至約2個(gè)小時(shí)，在患者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的有效治療劑量。和在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，在自給予患者組合物約40分鐘至約1個(gè)小時(shí)，在患者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的有效治療劑量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，以適合提供本發(fā)明化合物一半最大劑量的血清濃度的劑量給予本發(fā)明組合物。作為例證，在給予本發(fā)明組合物后在患者中達(dá)到約0.01至約1000nM，或約0.1至約750nM,或約1至約500iiM,或約20至約1000nM,或約100至約500nM,或約200至約400nM的血清濃度。本發(fā)明預(yù)期的組合物在給藥后約5分鐘至約24個(gè)小時(shí)的時(shí)間間隔提供治療作用，如果想要，能夠一天一次或一天兩次給藥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，以適合提供具有以下半數(shù)最大劑量的劑量的平均血清濃度的本發(fā)明化合物給予組合物，即在給予患者組合物后約10、20、30或40分鐘，患者體內(nèi)達(dá)到至少約1|Lig/ml，或至少約5pg/ml,或至少約10pg/ml，或至少約50|tig/ml，或至少約100pg/ml，或至少約500pg/ml或至少約1000]ug/ml。產(chǎn)生治療作用的必需的治療藥物的量，可基于例如，藥物進(jìn)入血清的吸收率、藥物的生物利用度和治療所述紊亂的效力經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定。然而，應(yīng)該明白，本發(fā)明治療藥物的針對(duì)任何具體患者的特定劑量水平，依賴于多種因素包括所使用的特定化合物的活性、患者(包括，例如，不論患者是處于空腹或已經(jīng)進(jìn)食的狀態(tài))的年齡、體重、健康狀況、性別和飲食、給藥次數(shù)、排泄速率、藥物組合以及被治療的具體紊亂的嚴(yán)重程度和給藥形式。一般可經(jīng)滴定測(cè)定治療劑量使其達(dá)最佳安全和功效。典型地，得自體內(nèi)和/或體外試驗(yàn)的劑量-效應(yīng)關(guān)系最初可對(duì)給予患者適當(dāng)劑量提供有用的的指導(dǎo)。動(dòng)物模型的研究通?？捎糜谥笇?dǎo)有關(guān)依照本發(fā)明治療胃腸紊亂或疾病的有效劑量。應(yīng)該理解，根據(jù)治療方案，給予的劑量將依賴于多種因素，包括給予的具體藥物、給藥途徑、具體患者的病情等。一般而言，希望給予有效達(dá)到與體外一段時(shí)間發(fā)現(xiàn)有效產(chǎn)生治療作用的濃度相當(dāng)?shù)难逅降幕衔锏牧?。因此，在發(fā)現(xiàn)化合物證明在例如，半數(shù)最大有效劑量200nM時(shí)具有體外活性時(shí)，人們將期望給予在體內(nèi)一段時(shí)間有效提供約200nM濃度的半數(shù)最大有效劑量的藥物的量，該量產(chǎn)生想要的治療作用，例如，治療與高p-淀粉體誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性有關(guān)的紊亂和其它如選自由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員適當(dāng)檢測(cè)的適應(yīng)癥。這些參數(shù)的確定將在本領(lǐng)域?qū)I(yè)技能之內(nèi)。這些情況將為本領(lǐng)域所熟悉并在標(biāo)準(zhǔn)教科書中有描述。為了檢測(cè)和確定進(jìn)入患者的有效量的本發(fā)明化合物，可使用標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)檢測(cè)本發(fā)明化合物血清濃度。本發(fā)明構(gòu)思的組合物在給予患者約30分鐘至約24個(gè)小時(shí)的時(shí)間間隔提供治療作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物在約30分鐘后提供這樣的治療作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物提供治療作用超過約24個(gè)小時(shí)，使得有可能一天一次給藥以改善患者的依從性。也可將另一個(gè)適應(yīng)癥為治療或預(yù)防線粒體病的藥物，例如，肌酸酐與本方法、藥劑盒和組合物聯(lián)合應(yīng)用("聯(lián)合療法")。當(dāng)與本發(fā)明聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，即在聯(lián)合療法中，可實(shí)現(xiàn)相加的或協(xié)同作用，這樣可減少或消除許多(如果不是全部)不必要的副作用。這些藥物的減少副作用的特性通常歸因于，例如，需要達(dá)到聯(lián)合給藥的治療作用而降低的劑量。詞組"聯(lián)合療法"包括給予本發(fā)明組合物并聯(lián)合給予另一個(gè)適應(yīng)癥為治療或預(yù)防患者線粒體紊亂的藥物，作為特定治療方案的一的共同作用中提供有益的作用。所迷聯(lián)合應(yīng)用的有益作用包括，但不限于由治療藥物的聯(lián)合導(dǎo)致的藥代動(dòng)力學(xué)或藥效學(xué)的共同作用。這些治療藥物的聯(lián)合給予通常在一個(gè)限定的時(shí)間段(通常依據(jù)所選擇的聯(lián)合，基本同時(shí)、幾分鐘、幾小時(shí)、幾天、幾周、幾月或幾年)內(nèi)進(jìn)行。"聯(lián)合療法"一般不意欲包括給予兩個(gè)或更多個(gè)這些治療藥物作為分開的單一療法方案，而這些治療藥物偶然地和任意地導(dǎo)致本發(fā)明的聯(lián)合。"聯(lián)合療法"意欲包括以序貫的方式給予這些治療藥物，即在不同時(shí)間給予每一個(gè)治療劑，以及以幾乎同時(shí)的方式給予這些治療藥物或至少兩個(gè)治療藥物。例如，通過給予患者具有規(guī)定比例的每一治療藥物的單一片劑或膠嚢劑或在多個(gè)單一膠嚢劑或片劑中的每一治療藥物，可實(shí)現(xiàn)幾乎同時(shí)的給藥。序貫或幾乎同時(shí)給予每一治療藥物可通過任何適當(dāng)?shù)耐緩綄?shí)現(xiàn)?？赏ㄟ^口服或鼻飼法給予本發(fā)明組合物，而其它聯(lián)合應(yīng)用的治療劑可通過任何適合于具體藥物的途徑給予，包括，但不限于口服途徑、經(jīng)皮途徑、靜脈內(nèi)途徑、肌肉內(nèi)途徑或通過粘膜組織直接吸收的途徑。例如，可通過口服或鼻飼法給予本發(fā)明組合物，以及可通過口服或經(jīng)皮給予聯(lián)合應(yīng)用的治療劑。給予治療藥物的順序并不非常嚴(yán)格。"聯(lián)合療法"還可包括給予如上描述的治療藥物再聯(lián)合給予其它生物活性成分，例如，但不限于止痛劑，以及聯(lián)合非藥物療法，例如，但不限于手術(shù)治療。構(gòu)成聯(lián)合療法的治療化合物可為意欲基本同時(shí)給予的組合劑型或分開的劑型。構(gòu)成聯(lián)合療法的治療化合物也可與通過要求兩步給藥方案的任一治療化合物序貫地給予。因而，給藥方案可要求治療化合物與隔開一段時(shí)間給予的、分開的活性藥物序貫給藥。多次給藥步驟之間的時(shí)間間隔可從，例如幾分鐘至數(shù)個(gè)小時(shí)至幾天，這取決于每一治療化合物的特性諸如效能、溶解度、生物利用度、血漿半衰期和治療化合物的動(dòng)力學(xué)特性，以及依賴于食物攝取的作用和患者的年齡和病況。目標(biāo)分子濃度的24小時(shí)生理節(jié)奏的差異也可決定最佳的劑量時(shí)間間隔。聯(lián)合療法的治療化合物不論是同時(shí)、基本同時(shí)或是序貫給予，可涉及這樣的給藥方案，所述方案要求通過口服途徑給予一種治療化合物并且通過例如，口服途徑、經(jīng)皮途徑、靜脈途徑、肌肉途徑或通過粘膜組織直接吸收的途徑給予另一種治療化合物。不論給予聯(lián)合療法的治療化合物是通過口服、吸入噴霧、直腸、局部、口頰、舌下或是胃腸外途徑(例如，皮下、肌肉內(nèi)、靜脈和皮內(nèi)注射)，分開或是一起給予，每一個(gè)這樣的治療化合物將包含在適合的有藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或其它制劑成分的藥用制劑中。對(duì)于口服給藥，藥用組合物可含需要量的式(I)或(II)化合物并且為例如，片劑、硬或軟膠嚢劑、錠劑、扁嚢劑、口含片(troche)、可分散的粉劑、顆粒劑、懸浮劑、酏劑、溶液劑或任何其它相當(dāng)適合于口服給藥的形式。作為例證，這樣的藥用組合物可被制備成含預(yù)定量的活性化合物的離散劑量單位的形式，諸如片劑或膠嚢劑。這樣的口服劑型還可包括，例如，緩沖劑。另外可用腸溶包衣制備片劑、丸劑等。適合于口頰或舌下給藥的藥用組合物包括錠劑(lozenges)和軟錠劑(pastilles)，前者包含于芳香基質(zhì)諸如蔗糖和阿拉伯樹膠或黃蓍膠中的活性化合物，而后者包含于惰性基質(zhì)諸如諸如明膠和丙三醇或嚴(yán)糖和阿拉伯樹膠中的活性化合物。用于口服給藥的液體劑型可包括藥學(xué)上可接受的乳劑、溶液劑、懸浮劑、糖漿劑和酏劑，其含常用于本領(lǐng)域的稀釋劑諸如水。這樣的組合物也可包括，例如，潤(rùn)濕劑、乳化劑和助懸劑和甜味劑、矯味劑和芳香劑。適合的液體劑型的實(shí)例包括，但不限于水溶液劑，其包含活性化合物和(3-環(huán)糊精或P-環(huán)糊精的水溶性衍生物如磺丁醚(3-環(huán)糊精、庚基-2,6-二-0-曱基-P-環(huán)糊精、羥基丙基-(3-環(huán)糊精和二甲基-P-環(huán)糊精。也可通過注射(靜脈、肌肉、皮下)給予本發(fā)明藥用組合物。這樣的可注射的組合物可使用，例如，鹽水、葡萄糖或水作為適合的載體物質(zhì)。如果需要，可用適合的酸、堿或緩沖劑調(diào)節(jié)組合物的pH值。適合的膨脹劑(bulking)、分散劑、潤(rùn)濕劑或助懸劑，包括甘露醇和聚乙二醇(如PEG400)也可包含在組合物之內(nèi)。適合于胃腸外的組合物也可包含在注射小瓶中的凍干的活性化合物?？稍谧⑸淝凹尤胨芤?容解該組合物。可以栓劑等形式給予藥用組合物。這樣的直腸用制劑優(yōu)選含總量例如，約0.075至約75%w/w或約0.2至約40%w/w或約0.4至約15Q/。w/w的活性化合物。載體物質(zhì)諸如可可脂、可可油(theobromaoil)和其它油和聚乙二醇栓劑基質(zhì)可用于這樣的組合物。如果需要，也可使用其它載體物質(zhì)諸如包衣材料(例如，鞋基丙基曱基纖維素薄膜包衣)和崩解劑(例如，交聯(lián)羧曱纖維素鈉和交聯(lián)聚維酮)。在膠質(zhì)藥物傳遞系統(tǒng)諸如脂質(zhì)體、《斂乳劑和巨乳劑中，本化合物可呈游離狀或包封入凝』交嚢中?？赏ㄟ^任何適合的制藥方法制備這些藥用組合物，所述方法包括將本發(fā)明活性化合物與一種或多種載體物質(zhì)混合的步驟?？傊兔芮械鼗旌?，然后，如果需要，成型成產(chǎn)品。例如，可通過將所述化合物的粉末或顆粒，任選與一種或多種輔助成分一起壓制或模制來制備片劑?？赏ㄟ^將自由流動(dòng)的形式，諸如粉未或顆粒狀化合物，任選與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑和/或表面活性劑/分散劑混合，在適合的機(jī)器上壓制，制備壓制片劑?？赏ㄟ^將用惰性液體稀釋劑濕潤(rùn)粉末化合物，在適合的機(jī)器上模壓，制備模制片劑。也可用常規(guī)包衣材料諸如OpadryTM白色YS-1-18027A(或另一個(gè)顏色)對(duì)本發(fā)明的片劑進(jìn)行包衣，且包衣的重量部分可為總包衣片重的約3%?？赏ㄟ^使用本領(lǐng)域已知的方法，配制本發(fā)明組合物，以便在給予患者后提供快速、持續(xù)或延緩釋放的組合物。當(dāng)賦形劑用作稀釋劑時(shí)，其可為固體、半固體或液體物質(zhì)，其原子活性成分的溶媒、載體或介質(zhì)。因而，組合物可為片劑、咀嚼片劑、丸劑、粉劑、錠劑、袋裝劑(sachets)、扁嚢劑cachets、酏劑、懸浮劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、氣霧劑(如固體或在液體介質(zhì)中)、軟和硬明膠膠嚢和滅菌包裝的粉劑的形式。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，制備過程可采用以下一種方法或幾種方法的組合，所述方法包括(l)干混，(2)直接壓制，(3)磨粉，(4)干法或非水制粒，(5)濕法制?；?6)熔化(fusion)。Lachman等，TheoryandPracticeofIndustrialPharmacy(1986)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過使本發(fā)明治療劑與藥用賦形劑混合，形成含治療藥物和賦形劑的均勻混合物的固體預(yù)制劑組合物，制備固體組合物，例如片劑。當(dāng)提及這些預(yù)制劑組合物為均勻的時(shí)，其意為治療劑在整個(gè)組合物中均勻地分散，這樣組合物可易于再等分成有效的單位劑型，諸如片劑、丸劑和膠嚢劑。然后將該固體預(yù)制劑再細(xì)分成本文所描述的類型的單位劑型。壓制片劑為通過壓制含活性成分和選擇有助于加工和改善產(chǎn)物特性的賦形劑的配方而制備的固體劑型。術(shù)語"壓制片劑，，一般指用于口服攝取的素片、未經(jīng)包衣的片劑，通過單一壓制或通過預(yù)壓法輕壓(pre-compactiontapping)后再經(jīng)最纟冬壓制制備?？蓪?duì)本發(fā)明的片劑或丸劑進(jìn)行包衣或進(jìn)行其它混合，以提供給予延長(zhǎng)效應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)的劑型。例如，片劑或丸劑可包含內(nèi)層劑量和外層劑量成分，后者為對(duì)前者進(jìn)行的包衣的形式。多種物質(zhì)可用于這樣的腸溶層或包衣，包括許多聚合酸和聚合酸與這樣的物質(zhì)如紫膠、十六醇和乙酸纖維素的混合物。應(yīng)用長(zhǎng)期持續(xù)釋放植入劑，可適合于在需要連續(xù)給予本發(fā)明組合物的患者中治療線粒體紊亂。如在本文使用的"長(zhǎng)期，，釋放，是指植入劑經(jīng)構(gòu)建和安排以傳遞治療水平的活性成分至少30天，優(yōu)選60天。長(zhǎng)期持續(xù)釋放的植入劑為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉，并且包括以上描述的一些釋放系統(tǒng)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用于治療線粒體紊亂的化合物以含有一種或多種本發(fā)明治療化合物的藥劑盒或包裝物的形式呈現(xiàn)。這些本發(fā)明治療化合物可以藥劑盒或包裝件的形式包裝，其中的每小時(shí)、每天、每周或每月(或其它周期)的劑量被安排用于適當(dāng)序貫地或同時(shí)給藥。本發(fā)明還提供含大量分別包裝的、適合于連續(xù)每天給藥的劑量單位的藥劑盒或包裝物，其中每一劑量單位包括至少一種本發(fā)明治療化合物。該藥物傳遞系統(tǒng)可用于使給予任何多種本發(fā)明治療化合物的實(shí)施方案容易。在一個(gè)實(shí)施方案中，該系統(tǒng)含大量每天或每周給藥的劑量。所述藥劑盒或包裝物也可含用于聯(lián)合療法中以使劑型的適當(dāng)給藥容易的藥物。藥劑盒或包裝物也包括針對(duì)患者的一套使用說明書。本發(fā)明將通過參考以下詳細(xì)的實(shí)施例作進(jìn)一步描述，其中用到以下縮寫AChEI，乙酰膽堿酯酶抑制劑；AP，(3-淀粉樣蛋白肽；ADDLs,淀粉樣蛋白衍化的彌散性配體；ANT,腺。票呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶；APP,淀粉樣蛋白前體蛋白；CCCP,3-氯代苯基腙羰基氰化物；FCCP，對(duì)-三氟曱氧基苯基腙羰基氰化物；CsA,環(huán)胞菌素A;MPT，膜滲透性轉(zhuǎn)換；MRC，線粒體呼吸系數(shù)；PAO,苯基氧化砷；SP-233,(22S,25S)-(20S)-螺甾-5-烯-3p-基己酸酯；SP-233，(22R,25R)隱(20a)-螺甾_5-烯-鄧-基己酸酯。線粒體滲透性轉(zhuǎn)換(MPT)可進(jìn)一步定義為非特異性增加發(fā)生在不利條件下的線粒體內(nèi)膜的滲透性，諸如增加線粒體基質(zhì)或氧化應(yīng)激時(shí)的線粒體Ca"含量并且引起線粒體內(nèi)膜中的非特異性孔("大型通道")的裝配(開啟)，導(dǎo)致線粒體膜電位缺失、線粒體呼吸解偶聯(lián)和細(xì)胞能量衰竭，所有這些可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。實(shí)施例1.使用SP-233保護(hù)線粒體功能A.材料和方法1.材料AU太購自AmericanPeptideCompany(Sunnyvale,CA，USA)并儲(chǔ)存于-80。C?？?復(fù)合體II抗體購自MolecularProbes(Eugene,OR,USA)和抗A(3M2抗體來自SignetLaboratories(Dedham,MA,USA)。螺石烯醇，(22S,25S)-(20S)-螺甾-5-烯-3p-基己酸酯(SP-233)購自Interbioscreen(Moscow,Russia)。環(huán)胞菌素A(CsA)和3畫IU戈苯基腙羰基氰化物(CCCP)得自Sigma(St.Louis，MO,USA)。Dulbecco's極限必需培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和SK-N-AS人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞購自ATCC(Manassas,VA,USA)。2.線粒體分離方法使用體重230-280g雄性Long-Evans大鼠。將鼠斬首后，迅速取出大腦并在冰上在含6ml分離緩沖液(于4。C下，TRIS20mM,蔗糖250mM,KC140mM,EGTA2mM,牛血清白蛋白1mg/ml;pH7.2)的Potter-Elvejhem勻漿器(Eurostar，IKA-Verke，Staufen,Germany)中勻漿。將勻漿于2000xg離心8min，以去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞核。將含線粒體的上清液于12000xg離心10min。將沉淀物懸浮于300nl的呼吸緩沖液(D-甘露醇300mM,KC110mM,KH2P0410mM,MgCl25mM;pH7.2，于37。C)中。該沉淀物高度富集線粒體(Zini等1996)。用Lowry等1951的方法測(cè)定線粒體懸浮液中的蛋白質(zhì)濃度。3.不同溶液的制備用新鮮的蒸餾水再配制A(3M2溶液以提供500pM的濃度。ApM2用作新鮮的再配制液或?yàn)橛?。C孵育溶液48h進(jìn)行"老化"后的聚集形式。用前將兩種溶液用呼吸緩沖液(見上述)稀釋，然后以想要的濃度直接加入線粒體中。在實(shí)驗(yàn)中用神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行(見下述)，僅使用新鮮的再配制的ApM2溶液。首先將SP-233、CCCP和CsA溶解于N,N-二曱基曱酰胺(DMF)，然后用新鮮的蒸餾水稀釋。4.監(jiān)測(cè)線粒體呼吸采用連接PC(Compaq,PIII400MHz)的Oxytherm(Hansatech,Norfolk,UK)研究線粒體功能。將Oxytherm的37°C恒溫脬育室連接至鉑-銀Clarck電極用于02檢測(cè)。在存在或缺乏CCCP(氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑)或CsA(MPT孔的抑制劑)下，監(jiān)測(cè)在ADP(ATP的前體)的存在下作為線粒體功能和生存能力的標(biāo)記的02消耗。02消耗的檢測(cè)允許計(jì)算線粒體呼吸系數(shù)(MRC),其為^/￥4。￥4為基礎(chǔ)02消耗，V3為加入ADP(ATP產(chǎn)生)后的〇2消耗。通過監(jiān)測(cè)MRC的演變，評(píng)估遞增濃度的SP-233(1pM至1nM)對(duì)線粒體呼吸鏈的作用。使用呼吸緩沖劑將線粒體濃度調(diào)節(jié)至0.4mg蛋白質(zhì)/ml。通過加入蘋果酸鹽/谷氨酸鹽作為呼吸鏈的復(fù)合體I的底物激活線粒體。狀態(tài)2為線粒體氧消耗的基線速率。當(dāng)通過加入ADP啟動(dòng)ATP合成時(shí)，氧消耗的速率顯著地增加達(dá)到狀態(tài)3。當(dāng)ADP的供應(yīng)缺失時(shí)，02消耗的速率回到基線(狀態(tài)2)，即被稱為狀態(tài)4(Chance和Williams1956)。每一實(shí)-瞼的對(duì)照對(duì)應(yīng)于ADP存在下的基礎(chǔ)呼吸。5.SP-233對(duì)CCCP-引起的氧化磷酸化解偶聯(lián)的作用加入CCCP(1^M)使呼吸鏈反應(yīng)解偶聯(lián)并增加02消耗。為了評(píng)估SP-233對(duì)CCCP-引起的解偶聯(lián)作用，于37°C下，將線粒體片段在SP-2"的存在下孵育3min，之后加入蘋果酸鹽/谷氨酸鹽，接著1min后力口入CCCP。6.SP-233對(duì)CsA-引起的缺氧作用的評(píng)估通過加入CsA(l^iM)至浴養(yǎng)線粒體的將育培養(yǎng)基(Zim等1996)中引起缺氧。通過在存在CsA和缺乏SP-233下加入ADP進(jìn)行該對(duì)照試驗(yàn)。如上所描述的，首先加入SP-233或其溶媒并進(jìn)行醉育1.5min,隨后加入CsA。然后，1.5min后加入底物蘋果酸鹽/谷氨酸鹽，2.5min后加入ADP。7.SP-233對(duì)抗A(3w2-引起的線粒體功能不全的保護(hù)作用的評(píng)估于37。C,使SP-233存在于孵育混合物中3min和Af^中1.5mm，隨后加入底物蘋果酸鹽/谷氨酸鹽。加入蘋果酸鹽/谷氨酸鹽1min后加入ADP。SP-233對(duì)ApM2的作用的對(duì)照實(shí)驗(yàn)與在缺乏ADP時(shí)實(shí)施的實(shí)驗(yàn)一樣。8.SP-233在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中對(duì)抗APk引起的毒性的保護(hù)作用的評(píng)估將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-AS細(xì)胞接種于含10%FBS的DMEM的96-孔板(7x104個(gè)細(xì)胞/孔)中，并于5%0)2和95%濕度下培養(yǎng)。然后加入ApM2(0.1、1和10^M)或其溶媒并使孵育在存在或缺乏SP-233(1^M)下持續(xù)72h。使用溴化3-(4,5-二曱基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鏡(MTT)分析(Trevigen,Gaithersburg,MD)評(píng)估A(3的細(xì)胞毒性。9.人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞線粒體攝取APw2的免疫細(xì)胞化學(xué)分析將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-AS細(xì)胞接種于13-mm直徑蓋玻片(20,000個(gè)細(xì)胞/蓋玻片)上并于37。C，5%C02,于含10。/。FBS的DMEM中孵育過夜。然后加入APm2(10hM)或其溶媒，并在存在或缺乏SP-233(1)iM)下持續(xù)孵育3h。為評(píng)估線粒體對(duì)A(3M2的攝取，使用對(duì)抗線粒體呼吸鏈的復(fù)合體II產(chǎn)生的抗-氧化磷酸化(OxPhos)復(fù)合體II70-kDa亞單位小鼠單克隆抗體(MolecularProbes,Eugene,OR,USA)和對(duì)抗ApM2的氨基酸殘基33-42產(chǎn)生的兔多克隆抗體(SignetLaboratories,Dedham，MA,USA),進(jìn)4t共4立性(co-localization)研究。將神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞用磷酸-緩沖鹽水(PBS)1X洗滌，于-20。C用曱醇固定和用PBS1X漂洗。然后用含10%驢血清的PBS1X封閉細(xì)胞30min,然后于4°C用對(duì)抗復(fù)合體II(1/200)產(chǎn)生的第一初級(jí)抗體于含1.5%驢血清和0.01。/o三硝基甲苯(Triton)X100的PBS1X溶液中孵育24h。用PBS1X洗滌該制備物3次后，加入1/200倍稀釋的驢抗-小鼠藍(lán)光石威性蕊香紅(rhodamine)標(biāo)記的次級(jí)抗體(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA,USA)并于室溫下持續(xù)孵育2h。然后按照相同的方案使用1/500倍稀釋的對(duì)抗AP"2的氨基酸33-42產(chǎn)生的初級(jí)抗體。使用以熒光標(biāo)記物AlexaFluor488(MolecularProbes,Eugene,OR,USA)標(biāo)記的驢-抗-兔次級(jí)抗體顯示陽性染色。然后用含4'，6-二脒基-2-苯基吲咮-2-鹽酸鹽(DAPI)的水性封片劑(VectorLaboratories.Burlingame,CA,USA)將蓋玻片封片。使用OlympusFluoviewBX61激光掃描顯孩t鏡拍攝共焦圖像。10.統(tǒng)計(jì)分析對(duì)于每次實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果用均值士SD表示。由ANOVA后作Dunnett's沖企-瞼進(jìn)4亍組間比專交。b.結(jié)果1.sp-233對(duì)線粒體呼吸控制的作用于10、30和100pM的濃度研究SP-233。與對(duì)照組比津交，于低至10pM的濃度下，SP-233引起大鼠腦線粒體MRC具顯著意義的50。/o降低(p〈0.001)(圖1)。雖然由多種濃度的SP-233產(chǎn)生的作用差異不顯著，但結(jié)果并不傾向于顯示濃度-效應(yīng)關(guān)系，因?yàn)镸RC在10-100pM濃度范圍內(nèi)呈進(jìn)行性降低。2.SP-233對(duì)CCCP-或CsA-引起的線粒體呼吸系數(shù)修正的作用解偶聯(lián)劑CCCP于1增加大鼠腦線粒體02消耗至基礎(chǔ)值的150%(p<0.01)(圖2a)。所有測(cè)試濃度的SP-233(1-1000pM)完全抑制CCCP的該代謝作用(p<0.001)。由SP-233產(chǎn)生的抑制CCCP-引起的解偶聯(lián)與降低02消耗值至基礎(chǔ)水平的60-65%有關(guān)并且是非濃度-依賴的。SP-233不抵消由CsA引起的MRC降低，而相反，它以濃度-依賴的方式增強(qiáng)CsA的該作用(圖2b)。3.新鮮的和老化的Ap,—42對(duì)線粒體呼吸系數(shù)的作用A(3w2顯著性地降低大鼠腦線粒體的MRC,即使其存在的濃度低至0.1pM(圖3)。采用新鮮的淀粉樣肽的這種作用比老化的形式更加顯著，其抑制作用分別為55-63%和43-53%。此差異可顯示非-聚集形式的ApM2比老化的聚集形式的肽更大程度地滲透進(jìn)入線粒體。4.SP-233對(duì)新鮮的和老化的A(3l42引起的幾粒體呼吸系數(shù)的修正的作用與對(duì)照組比較，新鮮的APw使MRC降低71。/。并且該作用被SP-233部分抑制(圖4a)。于測(cè)試的最低濃度的SP-233(1pM),MRC恢復(fù)至對(duì)照值的約40%,并且與單用APw2所得的值比較，MRC顯著性地增加(28.93士1.75對(duì)38.56±0.34,p<0.001)。與對(duì)照組比較，老化的A(^42使MRC降低51%，但SP-233不顯著性地預(yù)防該作用(圖4b)。5.SP-233對(duì)42-引起的對(duì)SK-N-AS人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的毒性的作用圖5顯示SP-233對(duì)ApM2引起的SK-N-AS細(xì)胞活力降低的作用。SP-2331]LiM預(yù)防由所用的A(3!-42的三個(gè)濃度引起的神經(jīng)毒性，其分別降低19%、26%和28%(p<0.01)。6.SP-233對(duì)APw進(jìn)入SK-N-AS人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞線粒體的作用用APw2處理的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞顯示強(qiáng)的與線粒體呼吸鏈的復(fù)合體II共定位的免疫反應(yīng)性，提供AfVc進(jìn)入線粒體并且存在于線粒體內(nèi)的證據(jù)。用SP-233處理消除APw2免疫反應(yīng)性，表明其阻斷A(3M2進(jìn)入細(xì)胞和線粒體。C.討論已熟知AD以認(rèn)知過程的進(jìn)行性損傷和記憶喪失為臨床特征。很早以來，該疾病的"記憶(mnesic)"方面已涉及中樞膽堿能通路的退化，反映為突觸乙酰膽堿(ACh)濃度的降低。因而，藥物開發(fā)研究主要集中在使腦中ACh水平恢復(fù)并且導(dǎo)致乙酰膽i成酯酶抑制劑(AChEIs)的開發(fā)，他克林為這類化合物的原型。然而，不論臨床資料如何有希望，他克林的有益作用適度，并且不論以利伐斯的明(rivastigmine)、力口蘭他敏和多奈口底齊(donepezil)為代表的新一代AChEIs的開發(fā)，與他克林比較，他們延遲AD患者癥狀的發(fā)生的時(shí)間并未縮短。這種短的(l年或2年)延遲在更快進(jìn)展的AD癥狀中(Tariot和Winblad,2001;Waldemar等2001;Grossberg等2004)，盡管對(duì)于患者以及其親屬很珍貴，但很可能由于膽堿能神經(jīng)的進(jìn)行性退化，因而限制了AChEIs的應(yīng)用。然而，近期在565個(gè)居住在社區(qū)的輕微至中度AD患者中實(shí)施的研究顯示，多奈哌齊并非是經(jīng)濟(jì)有效的，其利益低于最低限度的相應(yīng)閾值(Courtney等2004)。因?yàn)锳D藥物開發(fā)沒有取得重大進(jìn)展，即使是N-甲基-D-天冬氨酸鹽(NMDA)受(Livingston和Katona2004)，仍有開發(fā)比AChEIs更加有效的藥物的急切需求。僅針對(duì)家族性疾病的早期發(fā)作形式的AD的病因進(jìn)行了充分的論證，該病涉及APP,衰老蛋白(presenilin)-l或衰老蛋白-2基因的突變。相反，代表所有AD約95%病例的AD遲發(fā)性散發(fā)形式的原因尚待確定。出現(xiàn)許多學(xué)說并且其中有提議認(rèn)為，由于線粒體損害和氧化損害的能量衰竭可能是AD的起因(Schulz等1997;Beal,2000)。有證據(jù)顯示AD病因?qū)W涉及線粒體功能不全，與之相關(guān)的是，近期發(fā)現(xiàn)SP-233(—種天然存在的螺石烯醇)可保護(hù)神經(jīng)元PC12細(xì)胞對(duì)抗ApM2-引起的神經(jīng)毒性(Lecanu等2004),此至丈使發(fā)明人檢查SP-233恢復(fù)因暴露于ApM2所削弱的分離的線粒體的功能的能力?？傊景l(fā)現(xiàn)指出SP-233具有影響與A(3有關(guān)的基本機(jī)制的潛在性，并且其已經(jīng)涉及AD的發(fā)病機(jī)理。過去十年中，A(3對(duì)線粒體功能的作用已有廣泛的研究，并且這些研究產(chǎn)生的資料已經(jīng)指出該肽的可導(dǎo)致線粒體功能不全的多種作用。已經(jīng)顯示在神經(jīng)元線粒體中A(3m2和片段AP25-35抑制呼吸和激活關(guān)鍵酶，諸如丁二酸脫氬酶、a-酮戊二酸脫氬酶、丙酮酸脫氫酶和細(xì)胞色素氧化酶(Kaneko等1995;Casley等2002a)。也有報(bào)道，在暴露于Ap25_35的神經(jīng)元線粒體中，發(fā)生呼吸鏈的不同復(fù)合體的抑制作用(Pereira等1998;Canevari等1999;Casley等2002b)并且該相同的月大片段促進(jìn)與MPT有關(guān)的孑L-開啟(Moreira等2001;Moreira等2002;Bachurin等2003)。呈現(xiàn)在本文中的上述結(jié)果還顯示，如MRC降低所顯示的，A|3M2抑制大鼠腦線粒體的線粒體呼吸，并且用低至0.1pM的A(V^濃度的新鮮制備的和老化形式的肽兩者均發(fā)生該抑制作用(見圖3)。用新鮮的形式具有更顯著的抑制作用，這可能是由于A(3m2的多聚形式，比起單體形式或低聚形式諸如ADDLs，將會(huì)較小程度地跨越線粒體膜，因此這些單體或低聚形式更可能對(duì)呼吸鏈發(fā)4軍其有害作用并且事實(shí)上更具毒性。還有，缺乏SP-233對(duì)經(jīng)受老化的/聚集形式的A(3,.42的線粒體的保護(hù)作用(見圖4)可能是由于SP-233不能夠以結(jié)合單體形式的同樣方式結(jié)合淀粉樣肽的聚集形式。SP-233能部分預(yù)防由新鮮制備的A(3M2引起的MRC的降低和保護(hù)線粒體功能，使之前的資料得以證實(shí)，該資料資料顯示SP-233對(duì)暴露于的PC12細(xì)胞的ATP合成的恢復(fù)作用(Lecami等2004)。因?yàn)镾P-233在非常低的濃度(皮摩爾范圍)具有活性，其作用機(jī)制可能酸酐相對(duì)特異性的。本資料還確認(rèn)新近的結(jié)果，所述結(jié)果顯示SP-233通過結(jié)合肽的單體形式和抑制神經(jīng)毒性低聚體ADDLs的形成，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞以對(duì)抗A(3M2神經(jīng)毒性(Lecanu等2004)。在顯示A(5M2與呼吸鏈的復(fù)合體II共定位中，在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞上施行的共聚焦顯艱i分析指出，Apw2可跨越細(xì)胞和線粒體兩者的膜。當(dāng)SP-233和A(3M2都存在于孵育培養(yǎng)基中時(shí)，相應(yīng)于淀粉樣肽的免疫化學(xué)染色完全被抑制并且SP-233的這種"清除"作用伴有MRC的部分恢復(fù)。此外，SP-233雖然是部分地，預(yù)防AP^2對(duì)相同的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的神經(jīng)毒性作用。該結(jié)果具有特別意義，因?yàn)榻诘慕Y(jié)果已經(jīng)指出，淀粉樣沉積存在于死后AD腦的錐形皮質(zhì)神經(jīng)元的線粒體中(Fernandez-Vizarra等2004)。這些組織學(xué)特性已被描述為疾病進(jìn)展中非常早期的事件，其在雙螺旋纖維(filaments)形成之前出現(xiàn)并導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。SP-233對(duì)A(3M2的結(jié)合和"清除，，作用已經(jīng)確定之后，研究了SP-233對(duì)線粒體的直接作用可導(dǎo)致額外的對(duì)抗Af3M2的保護(hù)作用的可能性。在這點(diǎn)上，之前已獲證明，A(M足進(jìn)腦線粒體中的MPT孔的開啟，導(dǎo)致線粒體功能損害，并且該作用被CsA消除(Moreira等2001;Bachurin等2003;Abramov等2004)。本實(shí)驗(yàn)顯示如同CsA—樣，SP-233使MRC降低。SP-233還增強(qiáng)CsA的作用，提示其具有CsA-樣特性并因而抑制MPT孔的開啟，可有利于其對(duì)抗APk引起的殘粒體功能不全的保護(hù)作用。SP-233還能消除由CCCP引起的氧化磷酸化解偶聯(lián)(見圖2a)。已經(jīng)顯示，APw2破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)(Kremer等2001;Rodrigues等2001)并且在AD腦中線粒體膜的流動(dòng)性可發(fā)生變化(Mecocci等，1996),兩個(gè)現(xiàn)象均導(dǎo)致線粒體解偶聯(lián)。因此，盡管SP-233的"再偶聯(lián)(reco邵Ung)"作用尚未能完全闡明，其可對(duì)本文描述的線粒體功能的恢復(fù)作出貢獻(xiàn)。此外，SP-233的清除作用(假定涉及其對(duì)MPT孔的調(diào)制)及其再偶聯(lián)作用的聯(lián)合將可解釋為何SP-233于低至1pM的濃度下抵消Ap^的作用。實(shí)施例2.螺石烯醇(22R，25R)-20a-螺甾-5-烯-3(3-基己酸酯阻斷神經(jīng)元細(xì)胞中線粒體攝取Ap和預(yù)防AP-引起的線粒體功能損害A.材料和方法1.材料ApM2肽購自AmericanPeptideCompany(Sunnyvale,CA)。抗-復(fù)合體II抗體購自MolecularProbes(Eugene，OR)和抗-Ap,.42抗體來自SignetLaboratories(Dedham,MA)。螺石烯醇(SP-233)購自Interbioscreen(Moscow,Russia)。環(huán)胞菌素A(CsA)、3-氯^f戈苯基腙(CCCP)黢基氰化物、對(duì)-三氟甲氧基-苯基腙羰基氰化物(FCCP)、魚藤酮、丙二酸鹽、粘噻唑(myxothiazol)、氰化鉀(KCN)、寡霉素和苯基氧化砷(PAO)得自Sigma(StLouis，MO)。Dulbecco's極限必需培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和SK-N-AS人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞購自ATCC(Manassas,VA)。2.線粒體片段的分離為了分離線粒體片段，將體重230-350g的大鼠斬首，迅速取出大腦并在水上在含6ml水冷的分離緩沖液(TRIS20mM,蔗糖250mM,KCl40mM，EGTA2mM,牛血清白蛋白1mg/ml;pH7.2)的Potter-Elvejhem勻漿器(Eurostar,IKA-Verke，Staufen,Germany)中勻漿。于4。C將勻漿于2000xg離心8min，以去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞核。于4。C將含線粒體的上清液于12000xg離心10min。將沉淀懸浮于300jxl的呼吸緩沖液(D-甘露醇300mM,KCl10mM,KH2P0410mM,MgCl25mM;pH7.2，于37。C)中。該沉淀高度富集線粒體(Zini等1996)。用Lowry的方法測(cè)定線粒體懸浮液中的蛋白質(zhì)濃度。3.測(cè)定線粒體呼吸采用連接PC(Compaq,PIII400MHz)的Oxytherm(Hansatech,Norfolk,UK)測(cè)定線粒體功能。將Oxytherm的37°C恒溫孵育室連接至鉑-銀Clarek電極用于02檢測(cè)。使用02消耗作為在ADP(ATP的前體)的存在下，以及在存在或缺乏CCCP(氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑)或CsA(膜滲透性轉(zhuǎn)換孔的抑制劑)下線粒體呼吸的標(biāo)記。02消耗的檢測(cè)允許計(jì)算線粒體呼吸系數(shù)(MRC),定義為V3A^，其中V4為基礎(chǔ)02消耗，V3為加入ADP(ATP產(chǎn)生)后的02消耗。使用呼吸緩沖劑將線粒體終濃度調(diào)節(jié)至0.4mg蛋白質(zhì)/ml。通過加入呼吸鏈的復(fù)合體I的底物的蘋果酸鹽/谷氨酸鹽激活線粒體。定義狀態(tài)2為線粒體氧消耗的基線速率。當(dāng)通過加入ADP啟動(dòng)ATP合成時(shí)，氧消耗的速率顯著地增加達(dá)到狀態(tài)3。當(dāng)ADP的供應(yīng)缺失時(shí)，02消耗的速率回到基線(狀態(tài)2),即被稱為狀態(tài)4(Chance和Williams1956)。所有對(duì)呼吸的實(shí)驗(yàn)性處理的影響均與基線呼吸或在僅存在ADP下的線粒體呼吸作比較。為了測(cè)試SP-233對(duì)由CCCP引起的線粒體功能不全的作用，于37°C,將分離的線粒體于SP-233中孵育3min,之后加入蘋果酸鹽/谷氨酸鹽。一分鐘后，力口入CCCP。為了測(cè)試SP-233對(duì)由CsA引起的線粒體功能不全的作用，在加入CsA之前，將分離的線粒體于SP-233中孵育1.5min,1.5min后加入蘋果酸鹽/谷氨酸鹽和2.5min后加入ADP。最后，為了測(cè)試SP-233對(duì)APM2-引起的線粒體功能不全的影響，于37°C，將線粒體片段于SP-233中孵育3min和于A(3M2中將育1.5min,隨后加入蘋果酸鹽/谷氨酸鹽。在加入蘋果酸鹽/谷氨酸鹽1min后加入ADP。在所有實(shí)驗(yàn)中，將SP-233、CCCP和CsA首先溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后用新鮮的蒸餾水稀釋。在這些實(shí)驗(yàn)中使用的APw經(jīng)用新鮮的蒸餾水再配制為濃度500mM。APw2用作新鮮再配制液或在使該溶液于4。C孵育48h"老化，，后以聚集形式存在。使用前用呼吸緩沖劑稀釋該兩種溶液，然后直接加入至線粒體中達(dá)到所需的濃度。4.細(xì)胞培養(yǎng)將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-AS細(xì)胞接種于含10%FBS的DMEM的96-孔板(7x104個(gè)細(xì)胞/孔)中，并于5%C02和95%濕度中培養(yǎng)。以以下不同濃度的SP-233的存在或不存在下處理培養(yǎng)物ApM2(0.1、1和10mM)、魚藤酮(50nM)、丙二酸鹽(100mM)、粘p塞唑(0.3^M)、KCN(12mM)、寡霉素(0,5昭/ml)、FCCP(3^M)和PAO(0.25jiiM)。按照制備商(Trevigen，Gaithersburg，MD)的說明書，使用溴化3-(4,5-二曱基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鏡(MTT)分析檢測(cè)細(xì)胞活性。為了進(jìn)行涉及APw2的實(shí)驗(yàn)，在用1^MA(3m2或不用ApM2處理(insult)72小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞活力。僅使用新鮮再配制的ApM2溶液。為了進(jìn)行涉及線粒體毒素(魚藤酮、丙二酸鹽、粘噻唑、KCN和寡霉素)的實(shí)驗(yàn)，在存在或缺乏l,3，10，30或100)iMAPM2下處理6或24個(gè)小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞活力。加入線粒體毒素至培養(yǎng)物1小時(shí)之前加入SP-23！3。為了進(jìn)行包括FCCP和PAO的實(shí)驗(yàn)，在加入FCCP或PAO之前一個(gè)小時(shí)，用或不用l至100^M范圍內(nèi)遞增濃度的SP-233孵育平行細(xì)胞培養(yǎng)物。24小時(shí)后評(píng)估細(xì)胞活力。首先將FCCP，魚藤酮、丙二酸鹽、粘p塞唑、KCN、寡霉素和PAO均溶解于乙醇中作為貯備液，之后用培養(yǎng)基稀釋達(dá)到指定的終濃度。培養(yǎng)基中的乙醇百分率為0.09%。5.A(V42的免疫化學(xué)分析將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-AS細(xì)胞接種于13-mm直徑蓋玻片(20,000個(gè)細(xì)胞/蓋玻片)上并于37°C,5%C02，于含10。/oFBS的DMEM中孵育過夜。然后在存在或缺乏SP-233(1pM)下，用A|3M2(10liM)或其溶媒孵育培養(yǎng)物3h。為了評(píng)估線粒體對(duì)A[^2的攝取，使用由對(duì)抗線粒體呼吸鏈的復(fù)合體II產(chǎn)生的抗-氧化磷酸化(OxPhos)復(fù)合體II70-kDa亞單位小鼠單克隆抗體(MolecularProbes,Eugene,OR)和對(duì)抗A(3M2的氨基酸殘基33-42產(chǎn)生的兔多克隆抗體(SignetLaboratories,Dedham,MA),進(jìn)行共位性研究。將神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)月包用磷酸-緩沖鹽水(PBS)洗滌，于-20。C用甲醇固定和用PBS漂洗。然后用含10。/。驢血清的PBS封閉細(xì)胞30min,然后于4。C用對(duì)抗復(fù)合體II(l:200于含1.5%驢血清和0.01%TritonX100的PBS中)產(chǎn)生的抗體孵育24h。然后用PBS洗滌細(xì)胞，用驢抗-小鼠藍(lán)光堿性蔬香紅才示i己的次級(jí)4元體(l:200;JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA)于室溫下孵育2h。然后使用對(duì)抗ApM2的氨基酸33-42(l:500)產(chǎn)生的抗體和以焚光標(biāo)i己物AlexaFluor488(MolecularProbes,Eugene,OR)標(biāo)記的驢-抗-兔次級(jí)抗體，接著進(jìn)行相同的序列步驟。用含4',6-二脒基-2-苯基卩引咮-2-鹽酸鹽(DAPI;VectorLaboratories,Burlingame,CA)的水性封片劑將蓋玻片封片。使用OlympusFluoviewBX61激光掃描顯4敬鏡攝取共焦圖像。6.統(tǒng)計(jì)分析所有結(jié)果以均值士SD表示。采用差異分析(ANOVA)，隨后用Dunnett's檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P值<0.05被認(rèn)為具有顯著性。B.結(jié)果1.SP-233對(duì)CCCP-或CsA-引起的線粒體呼吸變化的作用首先，通過監(jiān)測(cè)MRC的演變，評(píng)估SP-233于濃度范圍1fM至100pM對(duì)線粒體呼吸的作用(圖6)。遞增濃度的SP-233導(dǎo)致MRC進(jìn)行性降低。與對(duì)照組比較，于濃度低至lnM時(shí)，SP-233引起的大鼠腦線粒體的MRC的顯著降低(p<0.001;圖6b)。SP-233濃度于10pM或高于10pM時(shí)，引起MRC降低50。/。。CCCP使氧化磷酸化解偶聯(lián)和增加02消耗。如圖7a所示，1^iMCCCP增加大鼠腦線粒體02消耗至基礎(chǔ)值的150%(p<0.01)。1-1000pM范圍濃度的SP-2"完全消除該作用(全部均為p<0,001)，并且在所有這些濃度的SP-2"存在下，CCCP-引起的解偶聯(lián)的抑制作用與02消耗值降低至基礎(chǔ)水平的60七5%有關(guān)。低氧由加入1pMCsA至浴養(yǎng)線粒體的培養(yǎng)基引起(Zini等1996)。SP-233不抵消由CsA引起的MRC降低。相反，其以濃度-依賴的方式增強(qiáng)該作用(圖7b)。2.SP-233對(duì)由新鮮的和老化的Apw2引起的線粒體呼吸變化的作用將APw2加入至分離的線粒體中，甚至0.1pM濃度的A卩M2顯著性地降低MRC(圖8)。采用新鮮的淀粉樣肽比用老化形式的肽，該作用更加顯著；前者的抑制作用比后者約大10%。可以推測(cè)，非-聚集形式的APm2比老化的、聚集形式的肽更大程度地滲透進(jìn)入線粒體內(nèi)。如圖9a所示，將新鮮的Ap"2加入至分離的線粒體導(dǎo)致MRC降低至對(duì)照值的71%，并且該降低被SP-233部分逆轉(zhuǎn)。經(jīng)測(cè)試最低濃度的SP-233(1pM),MRC恢復(fù)至對(duì)照值的約39%。與單用A(V"所得的值比較，MRC顯著性地增加(28.93士1.75對(duì)38.56±0.34，p<0.001)。與對(duì)照組比較，老化的A(3m2使MRC降低51%,但SP-233不顯著性地影響該老化的APM2引起的MRC的變化(圖9b)。3.SP-233對(duì)A卩k引起的對(duì)SK-N-AS人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的毒性的作用圖10顯示SP-233對(duì)在SK-N-AS細(xì)胞中Ap^-引起的神經(jīng)毒性的作用。在所有三個(gè)APw2測(cè)試濃度的存在下，加入1SP-2！33導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著增加。SP-233分別降低由0.1、1和10iliMAPm2引起的神經(jīng)毒性的19%(p<0.01,與單用APw2比較)、26%(p<0.01)和28%&<0.01)。4.SP-233對(duì)Af^2進(jìn)入SK-N-AS細(xì)胞線粒體的作用圖11顯示SK-N-AS人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中DAPI染色(al、bl和cl)、APM2的免疫熒光標(biāo)記(a2、b2和c2)和復(fù)合體II70-kDa亞單位免疫熒光標(biāo)記(a3、b3和c3)的典型圖像。合并的(Merged)圖像示于圖a4、b4和c4。用A(3M2處理的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞顯示強(qiáng)的ApM2免疫反應(yīng)性(圖11b2),其與線粒體呼吸鏈復(fù)合體II的標(biāo)記共定位(圖11b4)，提供ApM2進(jìn)入線粒體并且存在于線粒體內(nèi)的證據(jù)。APm2免疫反應(yīng)性在SP-233的存在下消除(圖Uc2),提示SP-233阻斷ApM2進(jìn)入細(xì)胞和線粒體內(nèi)。5.在sk-n-as細(xì)胞中sp-233對(duì)抗線粒體復(fù)合體抑制劑的神經(jīng)保護(hù)作用SP-233并不顯示任何對(duì)抗線粒體呼吸鏈的復(fù)合體I、II和III抑制劑的神經(jīng)保護(hù)作用(圖12a,b和c)。SP-233于1|iM濃度顯著性地對(duì)抗魚藤酮和100SP-233顯著性地對(duì)抗粘噻唑(myxoyhiazol)(兩者p〈0,05)。盡管該保護(hù)作用是顯著的，但在這兩個(gè)例子中的作用的量值小。作為對(duì)照，SP-233表現(xiàn)出顯著的對(duì)抗由復(fù)合體IV抑制劑KCN和復(fù)合體V抑制劑寡霉素引起的毒性的有益作用(圖12d和12e)。低濃度的SP-233(1、3和10inM)有效對(duì)抗KCN;而高劑量(30和100^M)沒有提供有益作用。SP-233對(duì)抗寡霉素的保護(hù)作用是劑量-依賴的，雖然10SP-233沒有證明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著意義的神經(jīng)保護(hù)作用。這些數(shù)據(jù)證明SP-233保護(hù)SK-N-AS細(xì)胞對(duì)抗復(fù)合體IV和V的抑制作用。6.sp-233對(duì)sk-N-as細(xì)胞中的pao和fccp的神經(jīng)保護(hù)作用腺。票呤核苦酸轉(zhuǎn)位酶(ANT)為位于線粒體內(nèi)膜的通道蛋白質(zhì)，在生理?xiàng)l件下，以1:1的比率輸出ATP和輸入ADP。PAO抑制ANT,促進(jìn)滲透性轉(zhuǎn)換孔的開啟，導(dǎo)致凋亡。一微摩爾SP-233減少PAO對(duì)SK-N-AS神經(jīng)元細(xì)胞的毒性作用的25%(圖13,p<0.01)。大于1mM濃度的SP-233與任何神經(jīng)保護(hù)作用無關(guān)。此外，當(dāng)給予的濃度為100pM時(shí)，SP-233對(duì)FCCP-引起的呼吸鏈的解偶聯(lián)表現(xiàn)出小的，但是顯著的(p〈0.01)作用(圖14)。c.討論AD以認(rèn)知過程的進(jìn)行性損傷和記憶喪失為臨床特征。很早以來，該疾病的"記憶(mnesic)"方面與中樞膽義威能通路的退化有關(guān)，反映為突觸乙酰膽堿濃度(ACh)的降低。因而，藥物研究集中在使腦中ACh水平恢復(fù)。且因此導(dǎo)致乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEIs)的開發(fā)。雖然這些藥物對(duì)于AD病人和他們的護(hù)理人員是沒有價(jià)值的，但是AchEIs是僅于有限的一段時(shí)期減緩疾病進(jìn)程而并不終止其發(fā)展的對(duì)癥治療藥物(Tariot和Winblad,2001;Waldemar等2001;Grossberg等2004)。即使N-甲基-D-天冬氨酸鹽(NMDA)受體拮抗劑美金剛胺近期已經(jīng)獲準(zhǔn)治療中度至重度AD(Livingston和Katona2004),仍然迫切需要針對(duì)AD病因的新的藥物和新的治療策略。AD疾病的家族、早期發(fā)作形式的病因?qū)W已得到充分證明，其涉及APP(衰老蛋白-1或衰老蛋白-2)基因的突變。相反，代表所有AD約95%病例的AD的遲發(fā)性散發(fā)形式的原因尚待確定。出現(xiàn)許多理論并且其中一些理論已提出歸因于線粒體損害和氧化損害的能量衰竭可能是AD的起因(Schulz等1997;Beal,2000)。這種線粒體功能不全的理論，與近期的發(fā)現(xiàn)即螺石烯醇衍生物，SP-233,可保護(hù)神經(jīng)元PC12細(xì)胞對(duì)抗A(3M2-《|起的神經(jīng)毒性(Lecanu等2004)—起，導(dǎo)致檢查SP-233是否能夠恢復(fù)暴露于A^M2的分離的線粒體的功能。本文提供的結(jié)果證明，在分離的大鼠腦線粒體中和在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，SP-233均可保護(hù)線粒體功能對(duì)抗APw2的毒性作用。這些觀察提示SP-233具有影響與Ap-引起的神經(jīng)毒性有關(guān)的基本機(jī)制的可能性，并且其已經(jīng)涉及AD的發(fā)病機(jī)理。過去十年中，A(3對(duì)線粒體功能的作用已有廣泛的研究，并且這些研究產(chǎn)生的資料指出該肽可導(dǎo)致線粒體功能不全的多種作用。已經(jīng)顯示在神經(jīng)元線粒體中APM2和片段Ap2^5抑制呼吸和激活關(guān)鍵酶，i者如丁二酸脫氫酶、a-酮戊二酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶和細(xì)月包色素氧化酶(Kaneko等1995;Casley等2002a)。也有報(bào)道，在暴露于A(325.35的神經(jīng)元線粒體中，呼吸鏈復(fù)合體的抑制作用(Pereira等1999;Canevari等1999;Casley等2002b),并且該相同的肽片段促進(jìn)與MPT有關(guān)的孑L-開啟(Moreira等2001;Moreira等2002;Bachurin等2003)。此外，呈現(xiàn)在本文的結(jié)果顯示，如同MRC降低所顯示的，APm2抑制大鼠腦線粒體的線粒體呼吸。并且，該抑制作用發(fā)生于對(duì)用新鮮制備的和老化形式的肽兩者的低至0.1pM的Ap,42濃度的反應(yīng)中。可能是，用新鮮的形式具有更顯著的抑制作用，因?yàn)锳(3M2的多聚體形式，比起單體形式或低聚形式諸如ADDLs,將會(huì)較小程度地跨越線粒體膜，因此這些單體或低聚形式更可能對(duì)呼吸鏈發(fā)揮其有害作用并且事實(shí)上更具毒性。還有，缺乏由SP-233對(duì)暴露于老化的/聚集形式的APw2的線粒體的保護(hù)可能是由于SP-233不能以結(jié)合單體形式的同樣方式結(jié)合淀粉樣肽的聚集形式。有意義的是，SP-233能部分預(yù)防由新鮮制備的ApM2引起的MRC的降低，使之前的顯示SP-233對(duì)暴露于A(3m2的PC12細(xì)胞的ATP合成的恢復(fù)作用(Lecanu等2004)的結(jié)果得到證實(shí)。SP-233在非常低的濃度起作用的結(jié)果提示，其作用機(jī)制可能是相對(duì)特異性的。本文描述的資料還確認(rèn)新近的結(jié)果，所迷結(jié)果顯示SP-233通過結(jié)合肽的單體形式和抑制神經(jīng)毒性低聚體ADDLs的形成來保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)抗APM2的神經(jīng)毒性(Lecanu等2004)。在顯示A&M2與呼吸鏈的復(fù)合體II共定位中，在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞上施行的共聚焦顯^t分析指出，APM2可跨越細(xì)胞外膜和線粒體膜兩者。當(dāng)SP-233和A卩m2都存在于孵育培養(yǎng)基中時(shí)，淀粉樣肽標(biāo)記被消除，并且SP-233的這種"清除"作用伴有MRC的部分恢復(fù)。此外，SP-2"部分預(yù)防APw2對(duì)相同的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的神經(jīng)毒性作用。該結(jié)果具有特別意義，因?yàn)榻诘慕Y(jié)果顯示，淀粉樣沉積存在于死后AD腦的錐形皮質(zhì)神經(jīng)元的線粒體中(Femandez-Vizarra等2004)。這些組織學(xué)特性已被描述為疾病進(jìn)展中非常早期的事件，其在雙螺旋纖維形成之前出現(xiàn)并導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。在此基礎(chǔ)上，如在本文描述的，SP-233使ApM2失活，可使SP-233用于AD治療的理由更充分(Lecanu等2004)。SP-233對(duì)APw2的結(jié)合和"清除"作用已經(jīng)確定之后，檢驗(yàn)了SP-233對(duì)線粒體的直接作用可導(dǎo)致額外的對(duì)抗ApM2的保護(hù)作用的可能性。在這點(diǎn)上，已經(jīng)顯示，Ap促進(jìn)腦線粒體中的MPT孔的開啟，導(dǎo)致線粒體功能損害，并且該作用被CsA消除(Moreira等2001;Bachurin等2003;Abramov等2004)。本實(shí)驗(yàn)揭示，如同CsA—樣，SP-233降低MRC。SP-233還增強(qiáng)CsA的作用，提示其可能具有CsA-樣特性。即其可抑制MPT孔的開啟，其可有助于對(duì)抗ApK引起的線粒體功能不全的保護(hù)作用。SP-233的對(duì)抗PAO(—種已知促進(jìn)MPT的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶抑制劑)的保護(hù)作用支持該假設(shè)(Korge等，2001)。因而，SP-233于1的濃度下，使神經(jīng)元細(xì)胞活力恢復(fù)25%;然而，較高濃度的SP-233與保護(hù)作用無關(guān)。SP-233對(duì)MPT-關(guān)聯(lián)的孔開啟的作用可經(jīng)由直接和/或間接作用(如，通過其插入線粒體膜后的變構(gòu)修飾)發(fā)生。在分離的線粒體中和在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，SP-233還能消除由CCCP引起的氧化磷酸化解偶聯(lián)。已經(jīng)顯示，A(3M2破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)(Kremer等2001;Rodrigues等2001)并且AD腦中線粒體膜的流動(dòng)性可發(fā)生變化(Mecocci等，1996);兩個(gè)現(xiàn)象均導(dǎo)致線粒體解偶聯(lián)。因此，盡管SP-233的"再偶聯(lián)"作用尚未能完全闡明，其可對(duì)本文描述的線粒體功能的恢復(fù)作出貢獻(xiàn)。此外，SP-233的清除作用(推測(cè)涉及其對(duì)MPT孔的調(diào)節(jié))及其再偶聯(lián)作用的聯(lián)合將可解釋為何SP-233能于低至1pM的濃度下抵消AJ^42的作用。為了試圖確定SP-233在線粒體呼吸鏈中的其它的標(biāo)粑，已經(jīng)證明，SP-233能保護(hù)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)抗復(fù)合體I、III、IV和V的抑制劑，但不對(duì)抗復(fù)合體II的抑制劑(圖15)。在復(fù)合體III和IV中觀察到最顯著的作用，雖然SP-233于1和100的濃度下也表現(xiàn)出分別對(duì)抗魚藤酮和粘噻唑-引起的毒性的小的但是顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。對(duì)抗KCN和寡霉素恢復(fù)細(xì)胞生存力的量值與對(duì)抗A(5M2的量值的比較提示，復(fù)合體IV和V為淀粉樣肽-引起的線粒體功能損害的主要目標(biāo)。這些結(jié)果證實(shí)了之前的發(fā)現(xiàn)，即顯示片段人|325-35抑制分離的腦線粒體中的復(fù)合體IV(Canevari等，1999)。然而，與所述資料形成對(duì)照的是，相同的作者報(bào)告Ap25.35對(duì)呼吸鏈的其它復(fù)合體沒有作用。該明顯差異可被解釋為所使用的淀粉樣蛋白種類的差異，并且由此產(chǎn)生關(guān)于A(325_35和A(3M2在神經(jīng)病理學(xué)中的作用的問題。大多數(shù)獨(dú)自基于抑制AChE)具有嚴(yán)重的局限性，迫切需要開發(fā)更加有效的藥物。本文報(bào)告的小分子SP-233,之前已經(jīng)顯示其通過阻止ADDLs的形成而抑制A(3K引起的神經(jīng)毒性，保護(hù)腦線粒體對(duì)抗暴露于A(3M2的有害作用。SP-233的神經(jīng)保護(hù)作用的潛在的分子機(jī)制可能是，至少部分是由于其"清除"ApM2，其"抗-解偶聯(lián)"作用，其針對(duì)線粒體復(fù)合體IV和V的保護(hù)作用及其抑制MPT孔開啟的能力。總之，本文提供的資料已經(jīng)證實(shí)和擴(kuò)展了之前的發(fā)現(xiàn)，即顯示SP-233具有抗-淀粉樣蛋白特性，并且它們把線粒體和呼吸鏈作為Apw2和SP-233的直接靶標(biāo)。參者書目AbramovA.Y.,Cane曹iL.andDuchenM.R.(2004)Beta-amyloidpeptidesinducemitochondrialdysfunctionandoxidativestressinastrocytesanddeathofneuronsthroughactivationofNADPHoxidase.</.臉M簡(jiǎn)c,..24,565-575.BachurinS.O.,ShevtsovaE.P.,KireevaE.G.,OxenkmgG.F.andSablinS.O.(2003)Mitochondriaasatargetforneurotoxinsandneuroprotectiveagents(作為神經(jīng)毒素和神經(jīng)保護(hù)劑的耙標(biāo)的線粒體).j朋.AT.Jcad993,334-344.BealM.F.(1992)DoesimpairmentofenergymetabolismresultinexcitotoxicneuronaldeathinneurodegenerativediseaseX肌vVewra/.31:119-130.BealM.F.(2000)Energeticsinthepathogenesisofneurodegenerativediseases.7"m血臉wroy"'.23,298-304.BusciglioJ.，PelsmanA.,WongC,PiginoG.,YuanM.,MoriH.andYanknerB.A.(2002)AlteredmetabolismoftheamyloidbetaprecursorproteinisassociatedwithmitochondrialdysfunctioninDown'ssyndrome,臉w脂33，677-688.CanevariL.,ClarkJ.B.andBatesT.E.(1999)p曙amyloidfragment25-35selectivelydecreasescomplexIVactivityinisolatedmitochondria.F腳放457,131-134.CasleyC.S.,CanevariL.,LandJ.M.,ClarkJ.B.和SharpeMA.(2002a)P-淀:粉抑制整合的線粒體呼吸和關(guān)鍵酶活性.J.A^wrac/zem.80,91-100.CasleyC.S.,LandJ.M.,SharpeM.A.,ClarkJ.B.,DuchenM.R.andCanevariL.(2002b)Beta-amyloidfragment25-35causesmitochondrialdysfunctioninprimarycorticalneurons.A^ww6/o/.10,258-267.CourtneyC,FarrellD.,GrayR.etal.;AD2000CollaborativeGroup.(2004)Long-termdonepeziltreatmentin565patientswithAlzheimer'sdisease(AD2000):randomiseddouble-blindtrial.363,2105-2115.EckertG.P.,WoodW.G.andMullerW.E.(2001)Effectsofagingand(3-amyloidonthepropertiesofbrainsynapticandmitochondrialmembranes.J.臉wra/.7>朋柳.108,1051-1064.Fernandez-VizarraP.,FernandezA.P.,Castro-BiancoS.,SerranoJ.,BenturaM.L.,Martinez-MurilloR.,MartinezA.andRodrigoJ.(2004)Intra-andextracellularApandPHFinclinicallyevaluatedcasesofAlzheimer'sdisease.///Wo/,///5to/a決o/.19,823-844.GrossbergG.,IrwinP.,SatlinA.,MesenbrinkP.andSpiegelR.(2004)RivastigmineinAlzheimerdisease:efficacyovertwoyears.J.勿c編廠少12,420-431.KanekoL,YamadaN.,SakurabaY.,KamenosonoM.andTutumiS.(1995)Suppressionofmitochondrialsuccinatedehydrogenase,aprimarytargetofbeta-amyloid,anditsderivativerecemizedatSerresidue.J.臉腳c/2亂65,2585-2593.KimS.H.，VlkolinskyR.,CairnsN.andLubecG.(2000)DecreasedlevelsofcomplexIIIcoreprotein1andcomplexVbetachaininbrainsfrompatientswithAlzheimer'sdiseaseandDownsyndrome.Ce仏L,/eSc/57,1810-1816.KremerJ.J.,SklanskyD.J.，MurphyR.M.(2001)Profileofchangesinlipidbilayerstructurecausedbybeta-amyloidpeptide.Biochemistry40,8563-8571.KroemerG.和ReedJ.C.(2000)線粒體控制細(xì)胞死亡。A^.A/ed.6:513-519.LecanuL,YaoW.,Teper'G.L,YaoZ.X.，GreesonJ.andPapadopoulosV.(2004)dentificationofnaturallyoccurringspirostenolspreventingbeta-amyloid-inducedneurotoxicity.5tero/cfe69,1-16.LivingstonG.andKatonaC.(2004)TheplaceofmemantineinthetreatmentofAlzheimer'sdisease:anumberneededtotreatanalysis,/wf.丄Gen旨.尸^c/2/"/7^y19,919.LowryO.H.,RosebroughN.J.,FairA.L.andRandallR.J.(1951)Proteinmeasurementwiththefolinphenolreagent.丄S/o/.CTew.93,265-275.LustbaderJ.W.,Ciri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xué)上可接受的載體。22.權(quán)利要求1-21中任何一項(xiàng)的方法，其中所述線粒體紊亂為線粒體病。23.權(quán)利要求1-21中任何一項(xiàng)的方法，其中所述線粒體紊亂為肌病。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述肌病為心肌病。25權(quán)利要求1-21中任何一項(xiàng)的方法，其中所述線粒體紊亂為腎小管病變。26.權(quán)利要求1-21中任何一項(xiàng)的方法，其中所述線粒體紊亂由骨筋膜室綜合征或肌肉挫傷綜合征引起。27.權(quán)利要求1-21中任何一項(xiàng)的方法，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)病變選自全腦和局灶性缺血性或出血性中風(fēng)、頭外傷、脊髓損傷、低氧引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷、由心臟驟停或新生兒呼吸窘迫引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷、癲癇癥、焦慮癥、脊髓損害、ALS、阿爾茨海默氏病、杭廷頓氏舞蹈病和帕金森氏病。28.—種藥用組合物，它包含與藥學(xué)上可接受的賦形劑組合的有效治療量的至少一種式(I)或(n)化合物。29.式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于治療線粒體病或線粒體紊亂的藥物中的應(yīng)用，所述線粒體病或線粒體紊亂不是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)病變其中R,、R2、R4、R7、Rn、Ru和Ru各自獨(dú)立為氬、任選插入-NR'-、-O-、-S-、-SO-、-S02-、-0-S02-、-S02-0-、醒C(O)-、-C(O)-O-、-o-c(o)-、-0;0)-服'國(guó)或-服'-0:0)-的(0:1-(:8)烷基；羥基、n(r')2、羧基、氧代或磺酸，Rg為羥基、(c廣C8)烷氧基、(cvQ2)烷基co2或R'02C(CH2)2.8C02-，其中(C廣C22)烷基或(CH2)2-8可任選包含1-2個(gè)CH-CH單元、l-2個(gè)0H和/或l-2個(gè)環(huán)氧取代基、曱苯-4-磺?；趸虮郊柞Ｑ趸籖6、R8、R9、R1()、R13、RI4、1116和1117各自獨(dú)立為氬、(C廣Q)烷基、羥基(C廣C8)烷基、(C廣C8)烷氧基或羥基；和X為O、S、S(O)或N(R')、N(Ac)或N(曱苯-4-磺?；趸?；其中每一R'獨(dú)立為H、(C廣Cs)烷基、苯基或千基。30.式(II)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于治療線粒體病或線粒體紊亂的藥物中的應(yīng)用，所述線粒體病或線粒體紊亂不是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)病變<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中R!、R2、R4、R7、R、Ru和Ru各自獨(dú)立為氫、(CVQ)烷基、羥基、氨基、羧基、氧代、磺酸，或任選插入-麗-、-N((CVC8)烷基)畫、-o-、-s-、隱so-、-so2-、-o-so2-、-so2-o-、-c(o)-、-c(o)-O-、-O-C(O)-、-CCCO-NR'^^-KR'-CCO^^CVCs^^^,其中R'為H或(C廣C8)烷基；113為羥基、(C廣Q)烷基C(V、H02C(CH2)2C02-、曱苯-4-磺?；趸虮考柞Ｑ趸?；R6、R8、R9、R,。、1113和1114各自獨(dú)立為氫、(CVQ)烷基、羥基(C廣C8)烷基、(&-(38)烷氧基或羥基；和X為O、N(H)、N(Ac)或N(曱苯-4-磺酰基氧基)。31.權(quán)利要求29或30的應(yīng)用，其中所述藥物包含生理學(xué)上可接受的載體。全文摘要本發(fā)明涉及用于治療、預(yù)防線粒體紊亂或線粒體病或與線粒體紊亂或線粒體病有關(guān)的癥狀或降低其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法和組合物。文檔編號(hào)A61K31/58GK101227911SQ200680018809公開日2008年7月23日申請(qǐng)日期2006年3月31日優(yōu)先權(quán)日2005年4月1日發(fā)明者J·格里森,L·勒卡努,L·蒂爾門特,V·帕帕多普洛斯,W·姚申請(qǐng)人:薩馬里坦藥品公司;喬治敦大學(xué)