專利名稱：產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素疫苗的制作方法
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發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及包含產(chǎn)氣莢膜梭菌類型α類毒素、其抗原片段、α毒素的滅活抗原片段及其任何組合的疫苗。本發(fā)明還涉及用這些疫苗來(lái)保護(hù)動(dòng)物以免感染梭菌疾病的使用方法。本發(fā)明也涉及這些疫苗的制備方法。
背景 產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)是土壤、腐爛有機(jī)質(zhì)中天然存在的厭氧細(xì)菌，并且是包括人類在內(nèi)的動(dòng)物正常腸道菌群(gutflora)的組成部分。產(chǎn)氣莢膜梭菌也是在有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的家畜中發(fā)現(xiàn)的眾多梭菌疾病的病原體。產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生多種導(dǎo)致動(dòng)物病理作用的毒素，包括α毒素、β毒素、β2毒素、ε毒素、θ毒素、μ毒素、δ毒素、ι毒素、κ毒素和λ毒素。此外，產(chǎn)氣莢膜梭菌編碼其它可導(dǎo)致病理作用的生物活性物質(zhì)，包括透明質(zhì)酸酶、酸性磷酸酶、蛋白酶、膠原蛋白酶、硫酸酯酶和神經(jīng)氨酸酶。
根據(jù)特定細(xì)菌所產(chǎn)生的毒素譜，將產(chǎn)氣莢膜梭菌不同菌株命名為A至E生物型[Justin等，Biochemistry 416253-6262(2002)；McDonel，PHARMACOLOGY OF BACTERIAL TOXINS；F Dorner和J Drews(編著)Pergamon Press，Oxford(1986)]。最初這樣的分型是根據(jù)小鼠或豚鼠的血清學(xué)中和測(cè)定。最近，分子分型方法采用以編碼產(chǎn)氣莢膜梭菌的眾多毒素之一的遺傳序列為目標(biāo)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
已經(jīng)知道，馬的腸內(nèi)梭菌病與腸道中高濃度產(chǎn)氣莢膜梭菌A型相關(guān)?；疾〉鸟R具有大量水樣腹瀉和高死亡率。也已知道產(chǎn)氣莢膜梭菌A型與仔豬和架子豬的腸疾病相關(guān)，癥狀包括輕度壞死性腸炎和絨毛萎縮[Songer，Clin.Micro.Rev，9(2)216-234(1996)]。
由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的梭菌疾病的特征在于小腸內(nèi)具有融合性纖維蛋白壞死性病變(“土耳其毛巾”(Turkish towel))的良好育肥的鳥(niǎo)類突然死亡(腸形式(enteric forms))，和/或肝臟內(nèi)具有膽管肝炎或纖維蛋白樣壞死的產(chǎn)氣莢膜梭菌相關(guān)性肝炎。患病的鳥(niǎo)經(jīng)歷精神委頓、腹瀉和脫水的快速進(jìn)程。死亡率在2％至50％范圍內(nèi)。肝病變?cè)斐蛇m于屠宰的家畜的肉不能食用。
壞死性腸炎(NE)就是由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的梭菌腸疾病的一個(gè)實(shí)例，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)后果。盡管該病在火雞或籠養(yǎng)產(chǎn)蛋雞中已有報(bào)導(dǎo)，但該病在2-10周齡的平飼法飼養(yǎng)的肉用雞中尤為常見(jiàn)。壞死性腸炎通常在家禽中發(fā)生，或者作為繼發(fā)病，或者在正常腸道微生物菌群被改變而導(dǎo)致致病性產(chǎn)氣莢膜梭菌異常增殖的情況下發(fā)病。亞臨床壞死性腸炎的發(fā)病率尚未知道，因?yàn)椴≡顑H可通過(guò)尸體剖檢才能觀察到。然而，已有報(bào)導(dǎo)認(rèn)為飼料轉(zhuǎn)化率不佳和體重下降就是由亞臨床疾病引起的[Lovland和Kadhusdal，Avian Path.3073-81(2001)]。在自然暴發(fā)和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭卸家饓乃佬阅c炎的誘發(fā)因素包括(a)球蟲(chóng)病，(b)寄生幼蟲(chóng)的遷移，(c)喂食高含量魚(yú)粉或小麥，和(d)免疫抑制性疾病。此外，按照以下方法可實(shí)驗(yàn)性重現(xiàn)壞死性腸炎(i)給動(dòng)物提供被產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的飼料，(ii)采用口服或填喂至嗉囊方式給予動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)體培養(yǎng)物(vegetatiVe culture)，或(iii)經(jīng)十二指腸給予動(dòng)物無(wú)細(xì)菌的粗制毒素的肉湯培養(yǎng)物。
產(chǎn)氣莢膜梭菌A型或C型是引起禽壞死性腸炎的兩種生物型，其中α毒素是所檢測(cè)到的最常見(jiàn)毒素[Wages和Opengart，NecroticEnteritis.第781-785頁(yè)，載于Disease of Poultry，第11版，(Saif等編著)，Iowa State Press，Ames，IA(2003)]。事實(shí)上，從42只感染A型的雞中得到的產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株中，有超過(guò)90％產(chǎn)生致死α毒素，并產(chǎn)生唾液酸酶及θ和μ毒素[Daube等，AJVR 54496-501(1996)]。此外，已在患有壞死性腸炎的雞中鑒定出由產(chǎn)氣莢膜梭菌A型所產(chǎn)生的腸毒素，該腸毒素可在腸道疾病中起作用[Niilo，Can.J.Comp.Med.42357-363(1978)]。
最近，已報(bào)導(dǎo)產(chǎn)氣莢膜梭菌A型或C型可編碼cpb2基因[Gilbert等，Gene 20356-73(1997)]并表達(dá)其產(chǎn)物，即β2毒素。已在豬中觀察到β2毒素的表達(dá)與新生幼畜腸炎間的高度相關(guān)性[Bueschel等，VetMicro 94121-129(2003)]。也已認(rèn)為β2毒素是馬和牛的腸炎致病因子。Bueschel等(出處同上)還報(bào)導(dǎo)他們所獲得的3020株產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株中有37.2％編碼β2毒素，在所檢查的產(chǎn)氣莢膜梭菌A型中，35.1％編碼β2毒素。在鳥(niǎo)類產(chǎn)氣莢膜梭菌A型野生分離株的有限樣本(n＝5)中，發(fā)現(xiàn)≈35％是cpb2基因型呈陽(yáng)性，而且其中的40％也表達(dá)β2毒素。此外，采用PCR，Engstrom等[Vet Micro 94225-235(2003)]發(fā)現(xiàn)，得自患有肝炎的雞的產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株中有12％也為cpb2陽(yáng)性。已經(jīng)知道產(chǎn)氣莢膜梭菌A型的腸毒素也是雞的致病因素，在經(jīng)結(jié)扎的腸環(huán)模型中導(dǎo)致流體積聚[Niilo，Appl.Micro.28889-891(1974)]。
目前，防治產(chǎn)氣莢膜梭菌的工作依賴于衛(wèi)生措施以及在動(dòng)物飼料中添加抗生素。疾病的梭菌組分對(duì)抗生素反應(yīng)良好，通常會(huì)被抗生素飼料添加劑和離子載體性藥物、抗球蟲(chóng)藥物所抑制。然而，抗生素成本高，而且人們對(duì)細(xì)菌抗藥性增加的相關(guān)問(wèn)題越來(lái)越關(guān)注。
因?yàn)樵S多產(chǎn)氣莢膜梭菌相關(guān)性疾病發(fā)展迅速且通常會(huì)致命，所以家畜的疫苗接種也已成為重要的防治措施。例如，美國(guó)專利第4,292,307號(hào)中定義了一種“通用”多價(jià)疫苗，由產(chǎn)氣莢膜梭菌A型、B型和D型的類毒素制備，并且還包括水腫梭菌(Cl.oedematiens)和敗毒梭菌(Cl.septicum)的類毒素。此外，市售疫苗通常是多價(jià)疫苗，由滅活細(xì)胞、毒素或這兩者組合而成[參見(jiàn)Songer，Clin.Micro.Rev，9(2)216-234(1996)]。
對(duì)雌性家畜進(jìn)行疫苗接種也可引起對(duì)其隨后出生的后代的被動(dòng)保護(hù)作用。哺乳動(dòng)物新生幼仔抗致病性梭菌感染的被動(dòng)保護(hù)作用，依賴于以初乳抗體形式的特異性抗體的轉(zhuǎn)移。例如，Smith和Matsuoka[Am.J.Vet.Res.2091-93(1959)]用滅活疫苗接種懷孕綿羊，并報(bào)導(dǎo)羔羊針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素的經(jīng)母體誘導(dǎo)的保護(hù)作用。幼小哺乳動(dòng)物的被動(dòng)免疫通常會(huì)持續(xù)2-3周[Songer，Clin.Micro.Rev，9(2)216-234(1996)]。
與哺乳動(dòng)物幼畜相反，鳥(niǎo)類被動(dòng)免疫具有幾個(gè)明顯缺點(diǎn)，最突出的就是完全沒(méi)有得自乳汁的母體抗體。盡管被動(dòng)免疫僅僅是所觀察到的相關(guān)性的一種可能解釋，但是Heier等[Avian Diseases45724-732(2001)]的確報(bào)導(dǎo)過(guò)，在具有較高效價(jià)的抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的天然存在的特異性母體抗體的挪威(Norwegian)肉用禽群中，雞存活率顯著高于具有低效價(jià)的所述禽群的雞存活率。此外，與未接種疫苗的母雞后代相比，Lovland等[Avian Pathology 33(1)83-92(2004)]所報(bào)導(dǎo)的結(jié)果與已接種基于產(chǎn)氣莢膜梭菌A型或C型類毒素的疫苗的母雞后代的適度被動(dòng)保護(hù)一致。
迄今為止，抗產(chǎn)氣莢膜梭菌的商業(yè)重要保護(hù)作用似乎難以達(dá)到，除非接種物中存在針對(duì)大多數(shù)(如果不是全部的話)產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生的致病組分的母體抗體。例如，用不含腸毒素的產(chǎn)品對(duì)母畜進(jìn)行疫苗接種僅給仔豬提供部分保護(hù)，母山羊的抗ε毒素抗體保護(hù)其不死于毒血癥，但并不針對(duì)小腸結(jié)腸炎[Songer，Clin.Micro.Rev，9(2)216-234(1996)]。
事實(shí)上，盡管擁有關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌各種生物型及其相應(yīng)毒素和有害生物活性物質(zhì)的大量數(shù)據(jù)列表，但對(duì)農(nóng)民而言，食用動(dòng)物的梭菌疾病仍是重大經(jīng)濟(jì)難題。因此，需要提供針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病作用而保護(hù)家畜的其它手段。更具體地講，仍然需要給家禽提供針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的安全有效的疫苗。此外，需要提供針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的簡(jiǎn)單疫苗，該疫苗可給予雌性動(dòng)物(尤其是可生育和/或懷孕雌性家畜)，以被動(dòng)保護(hù)其后代。
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發(fā)明概述 本發(fā)明提供針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的疫苗，所述疫苗包含作為抗原的產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素，和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素的抗原片段，和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的滅活抗原片段、和/或其任何組合。本發(fā)明還提供基本上由作為抗原的單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型α類毒素，和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素的抗原片段，和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的滅活抗原片段，和/或其任何組合組成的疫苗。
優(yōu)選一至兩劑、每劑0.25-0.6ml的本發(fā)明疫苗足以誘導(dǎo)已接種該疫苗的動(dòng)物(例如雞)的每毫升抗血清中抗α毒素抗體有至少四抗毒素單位(A.U.)。在此類型的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)已接種疫苗的動(dòng)物的每毫升抗血清中抗α毒素抗體的抗毒素單位(A.U.)進(jìn)行測(cè)定，是在免疫后6-7周進(jìn)行。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，單劑疫苗足以誘導(dǎo)已接種疫苗的動(dòng)物的每毫升抗血清中抗α毒素抗體有至少四抗毒素單位(A.U.)，而在一個(gè)替代實(shí)施方案中，兩劑疫苗是必需的。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原的總結(jié)合力單位(Total Combining Power unit，TCP)為≥2。
在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，動(dòng)物為鳥(niǎo)類。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類為雞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類為火雞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌A型細(xì)胞，例如產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α類毒素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌C型細(xì)胞，例如產(chǎn)氣莢膜梭菌C型α毒素的滅活抗原片段。在又一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌B型。在再一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌D型。在又一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌E型。在再一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗包含來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌亞型的抗原。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗包含作為單一產(chǎn)氣莢膜梭菌型抗原的抗原，前提條件是疫苗中僅存在單一產(chǎn)氣莢膜梭菌型抗原。在此類型的一個(gè)具體實(shí)施方案中，產(chǎn)氣莢膜梭菌為A型。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，產(chǎn)氣莢膜梭菌為C型。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是α類毒素。在此類型的一個(gè)具體實(shí)施方案中，α類毒素包含在產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素上清液中。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，疫苗包含單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型(A型)的α類毒素上清液。
在本發(fā)明的一種疫苗中，抗原是由產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞天然編碼的α毒素的α類毒素。在本發(fā)明的另一疫苗中，抗原是重組多肽，即由已進(jìn)行遺傳操作的基因所編碼的重組多肽。在此類型的一個(gè)實(shí)施方案中，重組多肽為α類毒素，其中相應(yīng)α毒素的酶區(qū)域已經(jīng)遺傳去除或改變，但保留了一個(gè)或多個(gè)抗原表位。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗原在完整細(xì)胞制劑中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原在無(wú)細(xì)胞制劑中。在又一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素上清液中的α類毒素。在此類型的一個(gè)具體實(shí)施方案中，產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素上清液也是無(wú)細(xì)胞制劑。
在本發(fā)明的另一方面，疫苗也可含多種抗原，當(dāng)將所述抗原給予動(dòng)物受試者時(shí)會(huì)產(chǎn)生多種特異性的抗體。并非所有這些抗體必需具有針對(duì)疾病的保護(hù)性。在此類型的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述抗原也來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌。因此，本發(fā)明的疫苗可含有各種其它活性或滅活致病因素以及α類毒素。因此，根據(jù)本發(fā)明，可將α類毒素與其它梭菌和非梭菌細(xì)胞、類毒素和提取物以及α毒素的滅活抗原片段組合在一起。
本發(fā)明一種這樣的多價(jià)疫苗包含產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素，和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素的抗原片段，和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的滅活抗原片段，和/或其任何組合，并且還包含病毒抗原和/或細(xì)菌抗原和/或寄生蟲(chóng)抗原。在此類型的一個(gè)具體實(shí)施方案中，該抗原的病毒來(lái)源是傳染性法氏囊病病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原的病毒來(lái)源是傳染性支氣管炎病毒。在又一個(gè)實(shí)施方案中，抗原的病毒來(lái)源是呼腸孤病毒。在再一個(gè)實(shí)施方案中，抗原的病毒來(lái)源是新城疫病毒。在又一個(gè)實(shí)施方案中，抗原的細(xì)菌來(lái)源是大腸桿菌(E.coli)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，抗原的細(xì)菌來(lái)源是沙門氏菌屬(Salmonella)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，抗原的細(xì)菌來(lái)源是彎曲桿菌屬(Campylobacter)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，抗原的寄生蟲(chóng)來(lái)源是艾美球蟲(chóng)屬(Eimeria)。在此類型的一個(gè)具體實(shí)施方案中，疫苗所用的抗原是艾美球蟲(chóng)裂殖子、艾美球蟲(chóng)卵囊或其混合物的部分。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，寄生蟲(chóng)的天然宿主是鳥(niǎo)類。在此類型的一個(gè)具體實(shí)施方案中，寄生蟲(chóng)是艾美球蟲(chóng)屬，該寄生蟲(chóng)的天然宿主是雞。
本發(fā)明的多價(jià)疫苗也可包含一種或多種以下抗原產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌ι毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌κ毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌λ毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌θ毒素、索氏梭菌(C.sordellii)出血毒素、索氏梭菌致死毒素、艱難梭菌(C.difficile)A毒素、艱難梭菌B毒素、敗毒梭菌(C.septicum)α毒素、諾氏梭菌(C.novyi)α毒素和諾氏梭菌β毒素。
在一種具體的本發(fā)明多價(jià)疫苗中，疫苗包含產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素，和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素的抗原片段，和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的滅活抗原片段，和/或其任何組合，而且還包含來(lái)自傳染性法氏囊病病毒、和/或傳染性支氣管炎病毒和/或呼腸孤病毒、和/或新城疫病毒的一種或多種病毒抗原，和/或來(lái)自大腸桿菌、和/或沙門氏菌屬、和/或彎曲桿菌屬的細(xì)菌抗原，和/或來(lái)自艾美球蟲(chóng)屬的寄生蟲(chóng)抗原。
在一個(gè)替代實(shí)施方案中，本發(fā)明的多價(jià)疫苗基本上由單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型α類毒素，和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素的抗原片段，和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的滅活抗原片段，和/或其任何組合組成。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，疫苗還含有如本文所提供的病毒抗原和/或細(xì)菌抗原和/或寄生蟲(chóng)抗原。
本發(fā)明的疫苗也可包含佐劑。一種常用動(dòng)物佐劑是氫氧化鋁佐劑。替代性佐劑可由油包水乳劑以及抗原組成。在此類型的一種具體疫苗中，按70％油相和30％水相制備油包水乳劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑尤其不是氫氧化鋁佐劑。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，將包含非氫氧化鋁佐劑的疫苗給予家禽。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，疫苗包含產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素、佐劑和一種或多種得自病毒、細(xì)菌和/或細(xì)菌提取物的保護(hù)性抗原，所述保護(hù)性抗原可以是重組抗原或天然抗原。
另一方面，本發(fā)明提供通過(guò)用本發(fā)明疫苗免疫鳥(niǎo)類以給鳥(niǎo)類提供主動(dòng)免疫的方法。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用于這種主動(dòng)免疫的疫苗劑量為約0.05ml至約0.1ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類為火雞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類為雞。在再一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類為雉。本發(fā)明也提供將本發(fā)明多價(jià)疫苗給予鳥(niǎo)類以保護(hù)其抵抗多種疾病的方法。
本發(fā)明也提供給雌性動(dòng)物(例如懷孕雌性動(dòng)物)后代提供被動(dòng)免疫的方法，所述方法包括在雌性動(dòng)物后代出生之前將本發(fā)明疫苗給予雌性動(dòng)物(例如母的動(dòng)物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，雌性動(dòng)物為鳥(niǎo)類，在該雌性鳥(niǎo)類產(chǎn)下含有后代的卵之前將疫苗給予該雌性鳥(niǎo)類。按此方式對(duì)其后代提供被動(dòng)免疫。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類為雞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類為火雞。在再一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類為雉。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述方法對(duì)已接種疫苗的動(dòng)物的后代提供針對(duì)梭菌疾病的被動(dòng)免疫。在一個(gè)這樣的方法中，梭菌疾病是梭菌腸病。在該類型的一個(gè)具體方法中，梭菌腸病是壞死性腸炎。在另一個(gè)這樣的方法中，梭菌疾病是膽管肝炎。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法給已接種疫苗的動(dòng)物的后代提供針對(duì)梭菌疾病的被動(dòng)免疫，以及提供針對(duì)壞疽性皮炎、敗血癥和/或肝炎的保護(hù)作用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，給雌性動(dòng)物后代提供被動(dòng)免疫的方法，包括給予雌性動(dòng)物多價(jià)疫苗以保護(hù)其后代抵抗多種疾病。在此類型的一個(gè)具體實(shí)施方案中，雌性動(dòng)物在家禽家族中，而且其后代得到針對(duì)多種家禽疾病的保護(hù)性。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，給雌性動(dòng)物后代提供被動(dòng)免疫的劑量為每劑約0.25ml疫苗。在另一個(gè)實(shí)施方案中，劑量為每劑約0.4ml疫苗。在再一個(gè)實(shí)施方案中，劑量為每劑約0.6ml疫苗。在以下說(shuō)明性實(shí)施方案中，劑量為每劑約0.5ml疫苗。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素疫苗的制備方法。一種這樣的方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞，以產(chǎn)生一定數(shù)量的培養(yǎng)細(xì)胞，使培養(yǎng)細(xì)胞將產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。隨后通過(guò)滅活所分泌的α毒素，制備產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素。從培養(yǎng)基中去除大部分培養(yǎng)細(xì)胞，形成產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素上清液。在該方法的一個(gè)具體實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素上清液的濃度，使其足以誘導(dǎo)已接種一劑或兩劑、每劑0.25-0.6ml疫苗的動(dòng)物(例如雞)的每毫升抗血清中抗α毒素抗體有至少四抗毒素單位(A.U.)。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，濃縮過(guò)程包括針對(duì)緩沖液的滲濾，以去除低分子量污染物。
本發(fā)明產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素疫苗的制備方法還可包括將產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素上清液與佐劑混合。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素上清液在油包水乳劑中進(jìn)行混合。在此類型的一個(gè)具體實(shí)施方案中，按70％油相和30％水相制備油包水乳劑。
該方法所采用的產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞可來(lái)自單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型細(xì)胞。在此類型的一個(gè)具體實(shí)施方案中，單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型細(xì)胞是產(chǎn)氣莢膜梭菌A型細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型細(xì)胞是產(chǎn)氣莢膜梭菌C型細(xì)胞。
根據(jù)下面的發(fā)明詳述，可更好地理解本發(fā)明的這些方面和其它方面。
發(fā)明詳述 本發(fā)明提供針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的獨(dú)特疫苗，這些疫苗能安全有效地預(yù)防動(dòng)物梭菌疾病。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將本發(fā)明疫苗給予雌性動(dòng)物受試者，導(dǎo)致雌性動(dòng)物免疫并產(chǎn)生抗體，這些抗體可被動(dòng)轉(zhuǎn)移至其隨后出生的后代。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含最小量的特異性單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型的α類毒素的疫苗，該疫苗有效針對(duì)有害的產(chǎn)氣莢膜梭菌感染。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，疫苗包含本發(fā)明α類毒素與藥學(xué)上可接受的佐劑的安全和免疫學(xué)上有效的組合。
本發(fā)明的疫苗可用于保護(hù)動(dòng)物以抵抗產(chǎn)氣莢膜梭菌起作用的任何病癥或疾病。這類疾病包括梭菌疾病。在此類型的一個(gè)實(shí)施方案中，梭菌疾病是梭菌腸疾病。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供對(duì)預(yù)防家禽的稱為壞死性腸炎的梭菌腸病有效的疫苗。本發(fā)明的疫苗也可預(yù)防其它疾病綜合征，包括但不限于梭菌相關(guān)性肝炎、膽管肝炎和壞疽性皮炎。
本發(fā)明公開(kāi)了包含特異性的最小量的得自單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型的α類毒素(即具有特異性的最小TCP)的疫苗，所述疫苗保護(hù)已接種疫苗的雌性動(dòng)物受試者的后代以免患?jí)乃佬阅c炎等梭菌疾病，而無(wú)論任何其它致死毒素是否因攻擊產(chǎn)氣莢膜梭菌而表達(dá)。本發(fā)明還公開(kāi)了引起已接種疫苗的雌性動(dòng)物的特異性最小量抗α毒素反應(yīng)的疫苗，該疫苗也保護(hù)已接種疫苗的雌性動(dòng)物的后代以免感染梭菌疾病，無(wú)論天然存在的產(chǎn)氣莢膜梭菌是否表達(dá)任何其它致死毒素。也可將本發(fā)明疫苗與可接受的佐劑一起給予。
如下舉例說(shuō)明，出乎意料的是，用來(lái)自表達(dá)α毒素而非相應(yīng)β2毒素的滅活產(chǎn)氣莢膜梭菌A型分離株的疫苗給母雞接種，導(dǎo)致三周齡后代雞具有針對(duì)同時(shí)表達(dá)α毒素和β2毒素的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株攻擊的被動(dòng)免疫。迄今為止，尚無(wú)針對(duì)這兩種獨(dú)特毒素的交叉保護(hù)的證據(jù)。因此，本發(fā)明提供能夠刺激特異性最小量的抗α毒素的相對(duì)簡(jiǎn)單的疫苗，并因此保護(hù)動(dòng)物以免感染梭菌疾病(例如壞死性腸炎)，而不管產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊菌株所表達(dá)的其它毒素如何。
事實(shí)上，盡管已證明產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的多種毒素和其它生物活性蛋白對(duì)動(dòng)物具有致病作用，而且文獻(xiàn)中關(guān)于這類不同毒素和其它蛋白質(zhì)對(duì)壞死性腸炎的病理學(xué)作用也有多個(gè)引證，但是本文公開(kāi)的獨(dú)特疫苗給已接種疫苗的肉用母雞提供針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的重要免疫反應(yīng)，并對(duì)其隨后出生的后代提供被動(dòng)免疫。
盡管本發(fā)明完全獨(dú)立于任何理論或模型，但本文所提供的結(jié)果與產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素作為必需和充分保護(hù)動(dòng)物抗壞死性腸炎的抗原組分是一致的。盡管β毒素、β2毒素和腸毒素對(duì)壞死性腸炎病理至關(guān)重要，但本文所提供的結(jié)果與α類毒素作為壞死性腸炎疫苗中必需僅有的類毒素是一致的。此外，由于α毒素通常在A型菌株中產(chǎn)量最高，所以產(chǎn)氣莢膜梭菌A型菌株尤其可用作產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的來(lái)源。然而，也已成功地使用其它產(chǎn)氣莢膜梭菌類型，尤其是當(dāng)已經(jīng)采用遺傳修飾以增加這些其它類型的α毒素產(chǎn)生水平時(shí)。
本文中所用的以下術(shù)語(yǔ)具有以下闡明的定義本文所用的“保護(hù)性抗原”是使已接種疫苗的動(dòng)物和/或其后代產(chǎn)生抗感染和/或疾病的保護(hù)性特異性抗體的抗原。含有該保護(hù)性抗原的疫苗稱為“免疫學(xué)有效”疫苗。
對(duì)于特定蛋白質(zhì)而言，本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗原片段”是具有抗原性的蛋白質(zhì)片段。例如，α毒素或α類毒素的抗原片段是具有抗原性的α毒素或α類毒素的片段。本文所用的α毒素或α類毒素的抗原片段可分別為α毒素或α類毒素的任何片段，包括從全長(zhǎng)蛋白質(zhì)中丟失小至單個(gè)氨基酸的大片段。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，α毒素或α類毒素的抗原片段含有介于6至120個(gè)氨基酸殘基。此外，給定α毒素的抗原片段可從重組來(lái)源獲取，從天然來(lái)源分離的蛋白質(zhì)中獲取或通過(guò)化學(xué)合成獲得。此外，可在α毒素、α類毒素或其片段的蛋白水解消化后獲得抗原片段，通過(guò)重組體表達(dá)獲得抗原片段，或者通過(guò)從頭合成(例如肽合成)而產(chǎn)生抗原片段。
本文所用的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的“滅活抗原片段”是保留至少一個(gè)抗原表位的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗原片段，但并不擁有使其有害的α毒素的充分催化活性?？蓡为?dú)使用這樣的滅活抗原片段，或者可將其摻入融合蛋白中。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“α類毒素”是指任何滅活α毒素(例如滅活全長(zhǎng)α毒素)，但并不以任何方式限制自滅活α毒素產(chǎn)生α類毒素的具體方法。這類滅活方法包括(i)修飾完整蛋白質(zhì)的化學(xué)方法，例如甲醛或戊二醛處理；(ii)加熱等物理方法；(iii)改變蛋白質(zhì)的酶學(xué)方法，例如將毒素剪切成片段的蛋白酶；(iv)重組方法，例如對(duì)α毒素基因進(jìn)行遺傳操作以去除或改變蛋白質(zhì)的酶區(qū)域，但保留一個(gè)或多個(gè)抗原表位(參見(jiàn)例如US 5,817,317，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容都通過(guò)引用結(jié)合到本文中)；和/或上述的任何或所有方法的組合。
本文所用的術(shù)語(yǔ)產(chǎn)氣莢膜梭菌“α類毒素上清液”是包含滅活產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的溶液，其中已去除至少大部分產(chǎn)生毒素的細(xì)胞(即去除70％以上的細(xì)胞，而在一個(gè)具體實(shí)施方案中，去除90％以上的細(xì)胞)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，已添加和/或培養(yǎng)/生長(zhǎng)于培養(yǎng)基中的產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞已經(jīng)將滅活產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素分泌到培養(yǎng)基中，再將其滅活。在另一個(gè)實(shí)施方案中，滅活產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素包括與細(xì)胞締合的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素，已通過(guò)細(xì)胞溶解將其釋放，再滅活?！唉令惗舅厣锨逡骸钡闹苽浞椒ú⒉灰馕吨抻趶娜芤褐腥コ?xì)胞或細(xì)胞碎片的任何具體方法，包括離心、柱色譜、超濾等。
本文所用的“無(wú)細(xì)胞”溶液是已從培養(yǎng)物中去除90％以上細(xì)胞的溶液?！盁o(wú)細(xì)胞”溶液的制備方法并不意味著限于從溶液中去除細(xì)胞或細(xì)胞碎片的任何具體方法，包括離心、柱色譜、超濾等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型”是指一種產(chǎn)氣莢膜梭菌類型(例如A型或B型或C型等)，而不是多種類型(例如A型和B型和C型)。因此，包含“單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型”的α類毒素的細(xì)胞、上清液、組合物、制劑、疫苗等是含有僅來(lái)自一種特定產(chǎn)氣莢膜梭菌類型的α類毒素且不含來(lái)自任何其它產(chǎn)氣莢膜梭菌類型的α類毒素的細(xì)胞、上清液、組合物、制劑、疫苗等。另一方面，這樣的細(xì)胞、上清液、組合物、制劑、疫苗等可含有其它非α類毒素組分，包括其它產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素和/或佐劑和/或免疫刺激物等。
本文所用的每毫升抗血清中抗α毒素抗體的“抗毒素單位”即“A.U.”與“抗α毒素中和測(cè)試”單位即“TNT”單位可互換使用，根據(jù)小鼠生物測(cè)定中血清中和α毒素的毒性效應(yīng)的能力來(lái)定義。在該測(cè)定中，將由國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)[歐洲藥典(EU Pharmacopoeia)5.0.01/20050088，第803-804頁(yè)]建立的已知量的α毒素與來(lái)自已接種疫苗的動(dòng)物的血清的連續(xù)稀釋液混合。在室溫下將該混合物孵育一小時(shí)，再經(jīng)靜脈內(nèi)注射至小鼠體內(nèi)。如果毒素被血清完全中和，則小鼠將會(huì)存活，否則就會(huì)死亡。求出抗毒素單位或效價(jià)，等于中和毒素的血清的最高稀釋度的倒數(shù)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“總結(jié)合力”縮寫為“TCP”，按照Batty[Toxin-Antitoxin Assay，Methods in Microbiology，第8章，第5A卷(1971)，JR Norris和DW Ribbons編著]的描述來(lái)定義。在此測(cè)定中，將一定體積的α類毒素上清液與已知量的抗毒素單位接觸。在提供合適培養(yǎng)時(shí)期以使抗毒素與α類毒素結(jié)合之后(例如在室溫下一小時(shí))，添加已知量的α毒素。再給予殘余的游離抗毒素合適時(shí)期以使其與α毒素結(jié)合(例如在室溫下一小時(shí))。然后根據(jù)向溶液中添加底物以測(cè)定α毒素的酶活性，求出游離α毒素的量。合適底物包括紅細(xì)胞(尤其是綿羊紅細(xì)胞)和卵磷脂。隨后可通過(guò)根據(jù)所求出的酶活性的數(shù)量計(jì)算，求出α類毒素的數(shù)量。測(cè)定液中含有的α類毒素量越大，則該測(cè)定所測(cè)得的酶活性的量也越高。
術(shù)語(yǔ)“類型”和“生物型”可在本文中互換使用，是指根據(jù)各種毒素基因表達(dá)的產(chǎn)氣莢膜梭菌的具體表型。根據(jù)四種主要毒素(α、β、ε和ι)的產(chǎn)生，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行分型。產(chǎn)氣莢膜梭菌A型產(chǎn)生α毒素；B型產(chǎn)生α、β和ε毒素；C型產(chǎn)生α和β毒素；D型產(chǎn)生α和ε毒素；E型產(chǎn)生α和ι毒素。已經(jīng)描述了多達(dá)17種的產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素。根據(jù)某些或所有其它梭菌毒素和/或酶的產(chǎn)生，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌生物型進(jìn)行分類。例如，產(chǎn)氣莢膜梭菌A型的產(chǎn)腸毒素的致病型除產(chǎn)生α毒素之外，還可產(chǎn)生θ和μ毒素。
本文所用的多價(jià)疫苗是包含兩種或兩種以上不同抗原的疫苗。在此類型的一個(gè)具體實(shí)施方案中，多價(jià)疫苗刺激接受者的免疫系統(tǒng)針對(duì)兩種或兩種以上不同病原體。
術(shù)語(yǔ)“佐劑”和“免疫刺激物”可在本文中互換使用，定義為一種或多種引起免疫系統(tǒng)刺激的物質(zhì)。在此情況下，用佐劑來(lái)增強(qiáng)針對(duì)一種或多種疫苗抗原的免疫反應(yīng)?？稍诮o予疫苗之前、與疫苗組合、或在給予疫苗之后，將佐劑給予目標(biāo)動(dòng)物。本發(fā)明的佐劑可從任何多種來(lái)源獲得，包括從天然來(lái)源、重組來(lái)源獲得和/或經(jīng)化學(xué)合成獲得等。用作佐劑的化合物實(shí)例包括但不限于鋁化合物、可代謝和不可代謝的油、嵌段聚合物、ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)、維生素和礦物質(zhì)(包括但不限于維生素E、維生素A、硒和維生素B12)、Quil A(皂苷(saponin))和CARBOPOL_。有時(shí)已被具體稱為免疫刺激物的佐劑的其它實(shí)例包括細(xì)菌和真菌細(xì)胞壁組分(例如脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞壁酰肽、β-1，3/1，6-葡聚糖)、植物來(lái)源的各種復(fù)合碳水化合物(例如聚糖、乙?；事毒厶?acemannan))、動(dòng)物來(lái)源的各種蛋白質(zhì)和肽(例如激素、細(xì)胞因子、共刺激因子)和病毒及其它來(lái)源獲得的新核酸(例如雙鏈RNA、CpG)。此外，上述物質(zhì)的任何數(shù)量的組合可提供佐劑效應(yīng)，因此可構(gòu)成本發(fā)明的佐劑。
本文所用的“抗α毒素”是與α毒素結(jié)合的抗體(單克隆或多克隆)。α毒素的抗體可通過(guò)如上所述的TNT測(cè)定來(lái)檢測(cè)?；蛘撸赏ㄟ^(guò)它們對(duì)α毒素溶血效應(yīng)的阻斷能力來(lái)測(cè)定抗體。在溶血抑制測(cè)定中，將足以催化給定的綿羊紅細(xì)胞制劑完全溶解的已知量α毒素與血清的連續(xù)稀釋液混合，再在36±2℃孵育一小時(shí)。然后將所得混合物與0.5％綿羊紅細(xì)胞一起在36±2℃孵育三小時(shí)。當(dāng)抗體與α毒素結(jié)合時(shí)，該毒素不能使紅細(xì)胞溶血。根據(jù)導(dǎo)致無(wú)溶血的血清的最高稀釋度的倒數(shù)求出效價(jià)。在類似測(cè)定中，可通過(guò)測(cè)定阻斷卵磷脂的酶促切割的抗血清的最高稀釋度，來(lái)求出抗體與α毒素結(jié)合以抑制磷脂酶活性的能力。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”與術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”可互換使用，并且還包括肽。因此，本文所用的多肽是兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸通過(guò)肽鍵連接在一起的多聚體。本發(fā)明的多肽包括天然存在的蛋白質(zhì)；重組蛋白；經(jīng)化學(xué)合成的蛋白質(zhì)；任何天然存在、重組或經(jīng)化學(xué)合成的蛋白質(zhì)的片段；以及包含任何天然存在、重組和/或經(jīng)化學(xué)合成的蛋白質(zhì)和/或其任何片段的融合蛋白。術(shù)語(yǔ)多肽優(yōu)選用于表示包含20個(gè)或20個(gè)以上氨基酸殘基通過(guò)肽鍵連接在一起的多聚體，而術(shù)語(yǔ)肽則用于表示包含2-20個(gè)氨基酸殘基通過(guò)肽鍵連接在一起的多聚體。
本文所用的“異源核苷酸序列”是通過(guò)重組方法添加到編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(例如本發(fā)明α毒素)或編碼其片段(例如滅活抗原片段)的核苷酸序列中以形成并非自然界天然形成的核酸的核苷酸序列。這類核酸可編碼融合蛋白。此外，本文所用的異源核苷酸序列不一定是單一的毗鄰核苷酸序列，而可包括多個(gè)已與編碼本發(fā)明多肽或其部分的核苷酸序列組合的非毗鄰核苷酸序列。異源核苷酸序列可包含非編碼序列，包括限制位點(diǎn)、調(diào)節(jié)位點(diǎn)、啟動(dòng)子等。在再一個(gè)實(shí)施方案中，異源核苷酸可用作檢測(cè)本發(fā)明核苷酸序列的手段。本發(fā)明提供異源核苷酸序列，當(dāng)與編碼本發(fā)明多肽或其片段的核苷酸序列組合時(shí)，該異源核苷酸序列對(duì)編碼本發(fā)明的所有融合蛋白而言是必需且充分的。
本文所用的“基本上”由單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型α類毒素和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素的抗原片段、和/或相應(yīng)α毒素的滅活抗原片段組成的疫苗，是含有免疫學(xué)有效量的單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型α類毒素和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素的抗原片段、和/或相應(yīng)α毒素的滅活抗原片段以預(yù)防梭菌疾病的疫苗，但該疫苗不合免疫學(xué)有效量的任何其它已知預(yù)防梭菌疾病的抗原(例如另一產(chǎn)氣莢膜梭菌抗原)或替代的產(chǎn)氣莢膜梭菌類型α毒素、α類毒素或其片段。這類疫苗還可包括與其它疾病有關(guān)的抗原，例如來(lái)自傳染性法氏囊病病毒、呼腸孤病毒和新城疫病毒的病毒抗原；來(lái)自大腸桿菌、沙門氏菌屬和彎曲桿菌屬的細(xì)菌抗原；和例如來(lái)自艾美球蟲(chóng)屬的寄生蟲(chóng)抗原。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“約”當(dāng)用于特定劑量值時(shí)表示該劑量值是在指示值的20％內(nèi)，例如，約0.5ml的劑量可包括介于0.4ml-0.6ml間的劑量。
產(chǎn)氣莢膜梭菌A型的分離 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株(例如產(chǎn)氣莢膜梭菌A型)可從感染動(dòng)物的糞便樣本和/或腸道刮取樣本中獲得。這些樣本/刮取樣本可在血瓊脂板上劃線，在35±1℃厭氧條件下培養(yǎng)24-48小時(shí)，再單獨(dú)挑取類似產(chǎn)氣莢膜梭菌A型的菌落。為了證實(shí)它們就是產(chǎn)氣莢膜梭菌A型分離株，進(jìn)一步測(cè)定所選菌落的特征性產(chǎn)氣莢膜梭菌A型生化特性，包括遺傳組成。
分離株中α毒素基因的存在可經(jīng)遺傳分析(例如PCR)測(cè)定。通過(guò)使用卵黃的測(cè)定中卵磷脂酶活性和/或由采用綿羊紅細(xì)胞的溶血測(cè)定來(lái)顯示α毒素的表達(dá)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，在本發(fā)明疫苗的制備中使用表達(dá)高水平α毒素的產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株。所選產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株可在營(yíng)養(yǎng)肉湯中厭氧條件下培養(yǎng)4-24小時(shí)。培養(yǎng)物可用例如福爾馬林滅活，濃縮并摻混到該疫苗中。
產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素 α毒素-α毒素由所有類型的產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生。α毒素是裂解卵磷脂生成磷酸膽堿和甘油二酯的多功能磷脂酶C。當(dāng)經(jīng)靜脈內(nèi)給藥時(shí)，已知α毒素對(duì)小鼠致死。α毒素也能明顯溶血。然而，紅細(xì)胞的敏感性按紅細(xì)胞來(lái)源的動(dòng)物物種的不同而有很大差異。α毒素也引起血小板聚集，血小板、白血球和其它體細(xì)胞溶解，以及導(dǎo)致血管通透性增加。
β毒素-β毒素由產(chǎn)氣莢膜梭菌B型和C型產(chǎn)生。β毒素是腸道炎癥和粘膜的大量損失、以及腸運(yùn)動(dòng)抑制的原因。β毒素是分子量為35kDa的蛋白質(zhì)，對(duì)蛋白水解酶(例如胰蛋白酶)遠(yuǎn)比其它產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素更為敏感。已報(bào)導(dǎo)β毒素對(duì)動(dòng)物致死，其中小鼠最為敏感而雞最不敏感。
β2毒素-β2毒素是新近發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素。盡管β2毒素與β毒素名稱相似，但兩者氨基酸序列并無(wú)同源性。文獻(xiàn)已顯示β2毒素與某些動(dòng)物壞死性腸炎之間的高度相關(guān)性[Garmory等，Epidemiol.Infect.12461-67(2000)，Herho1z等，J.Clin.Morco，二月358-361(1999)]。β2毒素的分子量為28kDa。已發(fā)現(xiàn)β2毒素對(duì)小鼠致死，對(duì)某些細(xì)胞系有細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)細(xì)胞變圓并溶解而不影響肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架[Manteca等，Vet.Microb.86191-202(2002)，Schotte等，J.VetMed B 51423-416(2004)，Gilbert等，Gene 20365-73(1997)]。
腸毒素-腸毒素通常由產(chǎn)氣莢膜梭菌A型菌株產(chǎn)生。傳統(tǒng)上腸毒素的存在用于區(qū)分腸疾病相關(guān)性菌株和組織氣性壞疽相關(guān)性菌株。引起氣性壞疽的菌株通常沒(méi)有腸毒素。腸毒素是分子量為34kDa的熱敏蛋白。對(duì)小鼠的致死劑量約為10微克。腸毒素最初的作用是在宿主細(xì)胞中形成孔洞，繼而改變細(xì)胞通透性，抑制大分子合成，破壞細(xì)胞骨架，最終導(dǎo)致溶解[參見(jiàn)Songer，Clin.Micro.Rev，9(2)216-234(1996)]。腸毒素導(dǎo)致腸道細(xì)胞凈運(yùn)輸?shù)哪孓D(zhuǎn)。
ε毒素-ε毒素由產(chǎn)氣莢膜梭菌B型和D型產(chǎn)生。ε毒素是以前毒素形式分泌的，由內(nèi)源胰蛋白酶轉(zhuǎn)化為強(qiáng)效的神經(jīng)毒素。當(dāng)經(jīng)靜脈內(nèi)給予時(shí)，ε毒素可使小鼠快速致死。ε毒素對(duì)神經(jīng)組織具有高親和力，具有引起血管通透性的作用。ε毒素也引起腸壁通透性，使大分子(包括ε毒素自身)進(jìn)入血流。隨后ε毒素通過(guò)血流流向腦部，在此破壞滲透平衡。這樣的腦部滲透平衡的破壞導(dǎo)致在患病動(dòng)物死亡之前所見(jiàn)的神經(jīng)學(xué)癥狀。
κ毒素-κ毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌A型、D型、E型以及某些B型和C型所產(chǎn)生的膠原水解酶。K毒素的分子量為80kDa，對(duì)小鼠致死。小鼠經(jīng)靜脈內(nèi)注射K毒素，因肺部大量出血而在一小時(shí)內(nèi)死亡。
θ毒素-大部分產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株都產(chǎn)生θ毒素。θ毒素是74kDa蛋白質(zhì)，是在血瓊脂板上菌落周圍形成可見(jiàn)溶血透明帶的原因。純化θ毒素可使小鼠快速致死，在數(shù)分鐘內(nèi)導(dǎo)致死亡。θ毒素被某些甾體抑制，其中膽固醇是最有效的抑制劑。
被動(dòng)免疫 本發(fā)明包括由最小量的本發(fā)明抗原(例如α類毒素)的安全和免疫學(xué)有效的制劑組成的疫苗，該疫苗用于對(duì)非人類雌性動(dòng)物進(jìn)行疫苗接種，尤其是對(duì)可生育和/或懷孕雌性動(dòng)物，它們隨后可將該疫苗的效應(yīng)轉(zhuǎn)移給其新生動(dòng)物。從母體至后代的這類免疫轉(zhuǎn)移稱為“被動(dòng)免疫”。被動(dòng)免疫尤其可通過(guò)吮食初乳(例如在哺乳動(dòng)物中發(fā)生)或從卵黃中將抗體吸收至血流中(如在家禽中發(fā)生)來(lái)完成。此外，如本文所公開(kāi)，家禽可吸收卵內(nèi)(in ovo)抗體，導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)抗體水平升高。
如本文所示，將特定量的抗α毒素被動(dòng)轉(zhuǎn)移至新生動(dòng)物可保護(hù)新生動(dòng)物抵抗烈性產(chǎn)氣莢膜梭菌的攻擊。如下文所公開(kāi)，保護(hù)程度完全并非如迄今所預(yù)期的那樣，據(jù)信腸道必須經(jīng)過(guò)抗體浴(bathed withantibody)，以便顯著保護(hù)以抵抗口服產(chǎn)氣莢膜梭菌A型的攻擊。同樣，相當(dāng)令人驚訝的是，在通過(guò)新生哺乳動(dòng)物的初乳攝取與卵中母體抗體的吸收的粘膜免疫性的母體抗體轉(zhuǎn)移之間存在相關(guān)性。如下文在雞中所證明的那樣，卵內(nèi)抗α毒素抗體被吸收至血流中。此外，本發(fā)明公開(kāi)了在母雞血流中誘導(dǎo)的特異性、最小量的確定抗α毒素抗體效價(jià)，足以保護(hù)母雞的經(jīng)疫苗接種后代以免在其后代出生后數(shù)周內(nèi)遭受產(chǎn)氣莢膜梭菌A型攻擊。
主動(dòng)免疫性 本發(fā)明包括對(duì)雛雞(例如肉用仔雞)和/或火雞雛進(jìn)行疫苗接種，以提供針對(duì)壞死性腸炎、壞死性皮炎和壞疽性皮炎的主動(dòng)免疫。在雛雞和/或火雞雛的生命早期進(jìn)行疫苗接種，用單劑或兩劑疫苗在約一日齡或略長(zhǎng)(在生命第一周之內(nèi))時(shí)進(jìn)行接種。達(dá)到主動(dòng)免疫目的的合適疫苗劑量可在約0.05ml至約0.5ml范圍內(nèi)變化。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，疫苗劑量為約0.05ml至約0.1ml。
細(xì)胞培養(yǎng) 產(chǎn)氣莢膜梭菌在生長(zhǎng)期將α毒素分泌到培養(yǎng)基中。在滅活并從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中去除至少大部分細(xì)胞之后，所得溶液稱為α類毒素上清液。通常去除細(xì)胞以盡量減少疫苗中的外源抗原，否則會(huì)促進(jìn)反應(yīng)性并降低免疫應(yīng)答。然而，也存在少量與細(xì)胞締合的α毒素。因此，α毒素抗原可來(lái)自細(xì)胞和/或濃縮或非濃縮形式的培養(yǎng)基。
產(chǎn)氣莢膜梭菌可在燒瓶、瓶、壺或機(jī)械發(fā)酵罐等任何適當(dāng)容器中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間可監(jiān)控發(fā)酵，以便在α毒素產(chǎn)量達(dá)到峰值時(shí)收獲發(fā)酵物。典型方法包括親和色譜、凝膠電泳(PHAST系統(tǒng)等)、免疫測(cè)定、溶血素和卵磷脂酶活性測(cè)定?？捎眉兹?0.1-2.0％)或甲醛與加熱的組合來(lái)滅活細(xì)胞培養(yǎng)液或細(xì)胞提取物。通常用于蛋白質(zhì)變性并可使用的其它化學(xué)試劑包括但不限于戊二醛、苯酚、各種去垢劑(例如Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS))和醇類。滅活期間可監(jiān)控殘留的甲醛水平，以保持最佳水平而不高于或低于類毒素化水平。測(cè)定游離甲醛的典型方法見(jiàn)歐洲藥典(01/200520418)或9 CFR(113.100)。類似方法可用于測(cè)定其它類型的毒素滅活劑。在某些實(shí)例中，可有意使α毒素處于低于類毒素化條件下，以便盡量減少對(duì)產(chǎn)生抗毒素至關(guān)重要的表位變性，接著在該方法的稍后時(shí)間里為脫毒而進(jìn)一步處理。也可使用能夠滅活毒素的其它合適化學(xué)或生物試劑，例如戊二醛、苯酚、各種去垢劑(例如Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS))和醇類。
在任何其它加工之前，可將所得α類毒素貯存一段時(shí)期，而沒(méi)有有害作用。通常最佳貯存條件是在2-8℃。然而，滅活梭菌類毒素極為穩(wěn)定，也可在更高溫度下貯存。對(duì)超過(guò)6個(gè)月的貯存期和高于8℃的貯存溫度而言，最好通過(guò)總結(jié)合力測(cè)試(TCP)或其它類似的免疫學(xué)測(cè)定，重新測(cè)定類毒素的功效以確定類毒素的免疫原性穩(wěn)定性。
可通過(guò)離心和/或過(guò)濾從滅活培養(yǎng)基中去除細(xì)胞，獲得類毒素上清液。去除細(xì)胞的作用是降低由細(xì)胞組分導(dǎo)致的組織反應(yīng)性，而且從制劑中去除外源抗原有助于免疫反應(yīng)集中于疫苗的類毒素組分。
可通過(guò)超濾(優(yōu)選使用不大于30,000分子量截止值的超濾膜)或凍干等任何多種手段來(lái)濃縮滅活培養(yǎng)基。濃縮方法可包括針對(duì)水溶液(例如磷酸緩沖鹽溶液)的滲濾，以從制劑中去除低分子量污染物。可一次或多次用甲醛和/或加熱重新處理濃縮流體，直至合適測(cè)定表明該流體無(wú)殘留毒性。這樣的測(cè)定包括小鼠生物測(cè)定，即給小鼠注射流體并觀察流體對(duì)小鼠的作用；或者測(cè)定溶血素活性或卵磷脂酶活性等。
在混合之前可能要調(diào)節(jié)溶液pH，以確保與佐劑結(jié)合、與油乳化和/或溶液穩(wěn)定性最佳。α毒素的等電點(diǎn)(pI)約為5.5[Smith等，ThePathogenic Anaerobic Bacteria，(第3版) Charles Thomas Publishers，第116頁(yè)(1984)]。類毒素溶液的pH調(diào)節(jié)可改變蛋白質(zhì)上的凈電荷，這有利于增強(qiáng)與某些佐劑(例如鋁佐劑)的結(jié)合。也可將pH調(diào)節(jié)至在延長(zhǎng)貯藏期后增加α類毒素穩(wěn)定性的水平。例如，蛋白質(zhì)在其pI下更可能從溶液中沉淀下來(lái)，但通常在此值以上或以下1pH單位下穩(wěn)定。
本發(fā)明多肽的編碼核酸 可將編碼本發(fā)明多肽的核酸(例如cDNA)用于產(chǎn)生表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)和/或抗原(例如α毒素)的重組細(xì)菌宿主細(xì)胞?？墒惯@樣的重組宿主細(xì)胞滅活，也就是說(shuō)，將其轉(zhuǎn)化為菌苗，用于免疫原組合物，例如疫苗。
此外，獲得和/或構(gòu)建編碼本發(fā)明多肽的核酸(包括編碼本發(fā)明α毒素或其滅活抗原片段的核酸)可有助于產(chǎn)生α毒素、α類毒素或其片段。α毒素、α類毒素和/或兩者任一的抗原片段可用于制備本發(fā)明的某些疫苗。
因此，本發(fā)明包括允許本發(fā)明蛋白質(zhì)和/或抗原片段表達(dá)和分離的核酸構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于本發(fā)明這一方面的抗原的所述核酸序列及相應(yīng)重組蛋白序列。下文提供可用于本發(fā)明疫苗的抗原小樣品，及其GenBank檢索號(hào)和公開(kāi)其氨基酸序列的科學(xué)論文。
可用于疫苗的抗原實(shí)例 1這些論文中提供的序列通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
1這些論文中提供的序列通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明疫苗所用的蛋白質(zhì)抗原的編碼核酸還可含有異源核苷酸序列。為了在宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明重組蛋白，可構(gòu)建包含相應(yīng)cDNA的表達(dá)載體。因此本發(fā)明包括含有編碼本發(fā)明重組蛋白(包括其變異體)的核酸的表達(dá)載體。
由于核苷酸編碼序列具有簡(jiǎn)并性，所以可將編碼與本發(fā)明多肽的編碼核酸所編碼的氨基酸序列基本上相同的其它核苷酸序列用于本發(fā)明的實(shí)施中。這些包括但不限于等位基因、來(lái)自其它菌株的同源基因、和/或通過(guò)編碼序列內(nèi)同一氨基酸殘基的不同密碼子取代而改變的核苷酸序列，由此產(chǎn)生沉默改變。也包括含有本發(fā)明表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。一種常用宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
已經(jīng)描述了克隆cDNA及表達(dá)其相應(yīng)重組蛋白的通用方法[參見(jiàn)Sambrook和Russell，Molecular Cloning，A laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor L.I.(2000)]。
此外，可將本領(lǐng)域已知的任何誘變技術(shù)用于修飾本發(fā)明的天然α毒素，所述技術(shù)包括但不限于體外定點(diǎn)誘變[Hutchinson等，J.Biol.Chem.，2536551(1978)；Zoller和Smith，DNA，3479-488(1984)；Oliphant等，Gene，44177(1986)；Hutchinson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83710(1986)；Wang和Malcolm，BioTechniques 26680-682(1999)，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容全都通過(guò)引用結(jié)合到本文中]。TAB@接頭(Pharmacia)等的使用和PCR技術(shù)也可用于定點(diǎn)誘變[參見(jiàn)Higuchi，″Using PCR to Engineer DNA″，載于PCR TechnologyPrinciples andApplications for DNA Amplification，H.Erlich編著，Stockton Press，第6章，第61-70頁(yè)(1989)]。
本發(fā)明的多肽 本發(fā)明包括分離和/或重組多肽，包括本發(fā)明的α毒素和α類毒素、其菌株變異體、其滅活抗原片段及其融合蛋白。此外，本發(fā)明也包括含有已改變序列的多肽，其中用功能等同的氨基酸殘基來(lái)取代野生型氨基酸序列內(nèi)的氨基酸殘基，導(dǎo)致保守氨基酸取代。
例如，序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可被功能等同、極性相似的其它氨基酸取代，導(dǎo)致沉默變更。序列內(nèi)的氨基酸取代可選自該氨基酸所屬家族的其它成員。
例如，非極性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)的氨基酸包括精氨酸和賴氨酸。帶負(fù)電荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
尤其優(yōu)選的保守氨基酸交換為 (a)Lys交換Arg或反之亦然，以保持正電荷； (b)Glu交換Asp或反之亦然，以保持負(fù)電荷； (c)Ser交換Thr或反之亦然，以保持游離-OH； (d)Gin交換Asn或反之亦然，以保持游離NH2；和 (e)Ile交換Leu或交換Val或反之亦然，因?yàn)槎际谴笾碌韧氖杷被帷?br> 本發(fā)明的所有多肽(包括抗原片段)可作為融合蛋白的組成部分。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，融合多肽在原核細(xì)胞中表達(dá)。例如，可將該融合蛋白用于增強(qiáng)抗原或其片段的抗原性，用于降低或去除其毒性而不消除其抗原性，或用于分離本發(fā)明的抗原。在后一情況下，可通過(guò)使用與抗原融合的蛋白質(zhì)/多肽有特異性的親和柱，以便分離融合蛋白。這樣的融合蛋白包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)融合蛋白、FLAG標(biāo)記融合蛋白或聚組氨酸標(biāo)記融合蛋白。Ser-Gly接頭等特異性接頭序列也可作為該融合蛋白的組成部分。
事實(shí)上，融合多肽的表達(dá)可促進(jìn)穩(wěn)定表達(dá)和/或允許根據(jù)融合配偶體的特性進(jìn)行純化。因此，本發(fā)明重組多肽的純化可通過(guò)使用具有親和力標(biāo)記的融合蛋白而簡(jiǎn)化。例如，GST與綴合在固相支持基質(zhì)上的谷胱甘肽結(jié)合，MBP與麥芽糖基質(zhì)結(jié)合，而聚組氨酸與Ni-螯合支持基質(zhì)螯合[參見(jiàn)Hochuli等，Biotechnology 61321-1325(1998)]。
可用合適緩沖劑或通過(guò)用蛋白酶處理從特定基質(zhì)上洗脫融合蛋白，該蛋白酶對(duì)已遺傳操作而介于例如α毒素與其融合配偶體間的切割位點(diǎn)具有特異性?；蛘撸蓪ⅵ炼舅嘏c綠色熒光蛋白等標(biāo)記蛋白結(jié)合[Waldo等，Nature Biotech.17691-695(1999)；美國(guó)專利第5,625,048號(hào)和WO97/26333，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中]。
或者，可將其它柱色譜步驟(例如凝膠過(guò)濾、離子交換、親和色譜等)用于純化本發(fā)明的天然或重組多肽(見(jiàn)下文)。在許多情況下，這樣的柱色譜步驟采用高效液相色譜或類似方法來(lái)代替更為經(jīng)典的基于重力的方法。
此外，本發(fā)明的多肽(包括α毒素及其滅活抗原片段)可通過(guò)化學(xué)合成[參見(jiàn)例如Synthetic PeptidesA User′s Guide，W.H.Freeman & Co.，New York，N.Y.，第382頁(yè)，Grant編著(1992)]。
多肽純化的通用程序 一般而言，本發(fā)明多肽的起始純化步驟可包括鹽溶或鹽析，例如硫酸銨分級(jí)分離；溶劑排阻分級(jí)分離(例如乙醇沉淀)。此外，高速超速離心可單獨(dú)使用或與其它提取技術(shù)結(jié)合使用。
通常良好的二次分離或純化步驟包括使用磷酸鈣凝膠、羥基磷灰石的固相吸收，或固相結(jié)合?？赏ㄟ^(guò)用陰離子交換劑(例如二乙氨基乙基(DEAE)SEPHADEX或二乙氨基乙基纖維素，或二乙基[2-羥丙基]氨基乙基(QAE)SEPHADEX或二乙基[2-羥丙基]氨基乙基纖維素)；或者用陽(yáng)離子交換劑(例如羧甲基(CM)SEPHADEX或羧甲基纖維素，或磺酸基丙基(SP)SEPHADEX或磺酸基丙基纖維素)的離子鍵合來(lái)進(jìn)行固相結(jié)合。固相結(jié)合的替代方法包括利用疏水相互作用，例如使用固相支持體(例如苯基瓊脂糖凝膠)和高鹽緩沖劑；親和力結(jié)合免疫結(jié)合，使用例如與活化支持體結(jié)合的α毒素抗體。其它固相支持體包括含有特定染料或凝集素等的固相支持體。
常在純化過(guò)程結(jié)束時(shí)使用的其它固相支持體技術(shù)依賴于尺寸排阻，例如SEPHADEX和SEPHAROSE凝膠?；蛘?，可采用使用尺寸排阻膜濾器的加壓或離心膜技術(shù)。這兩種方法通常串聯(lián)使用。
固相支持體分離通常用低速離心或通過(guò)柱色譜分批進(jìn)行。高效液相色譜(HPLC)(包括FPLC等相關(guān)技術(shù))是進(jìn)行液相色譜的目前最常用手段。也可借助于低速離心來(lái)完成尺寸排阻技術(shù)。此外，可采用尺寸滲透技術(shù)，例如凝膠電泳技術(shù)。通常在管、平板中或通過(guò)毛細(xì)管電泳實(shí)施這些技術(shù)。
幾乎所有涉及多肽純化的步驟都采用緩沖溶液。除非另有說(shuō)明，否則通常使用25-100mM的緩沖鹽濃度。低濃度緩沖劑通常是指5-25mM濃度。高濃度緩沖劑通常是指介于0.1-2.0M濃度間的緩沖劑濃度。典型緩沖劑可從大多數(shù)生化目錄購(gòu)得，包括經(jīng)典緩沖劑，例如三羥甲基氨基甲烷(Tris)、焦磷酸鹽、單磷酸鹽和二磷酸鹽及Good緩沖劑，例如Mes、Hepes、Mops、Tricine和Ches[Good等，Biochemistry，5467(1966)；Good和Izawa，Meth.Enzymol.，24B53(1972)；Fergunson和Good，Anal.Biochem.，104300(1980)]。
實(shí)施所有這些技術(shù)的材料可購(gòu)自多個(gè)商業(yè)來(lái)源，例如在Missouri，St.Louis的Sigma Chemical Company。
疫苗組分 產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素在具體實(shí)施方案中，動(dòng)物疫苗最好是含有保護(hù)動(dòng)物免患?jí)乃佬阅c炎所需的最小量的α類毒素。下文所示的特定條件下該水平經(jīng)測(cè)定為每劑2總結(jié)合力單位(TCP)。根據(jù)內(nèi)標(biāo)設(shè)定TCP單位[Batty，Toxin-Antitoxin Assay，Methods in Microbiology，第8章，第5A卷(1971)JR Norris和DW Ribbons編著]，本發(fā)明疫苗容易混合以具有所需功效。如果疫苗還包含免疫刺激物，則甚至在這些條件下都可使用小于2 TCP單位。在任何情況下，優(yōu)選該疫苗誘導(dǎo)每毫升動(dòng)物血清中有四個(gè)以上的抗毒素單位。
定量測(cè)定α類毒素通常需要定量測(cè)定α類毒素以確保該疫苗包含優(yōu)化水平。一種定量測(cè)定類毒素的常規(guī)方法采用總結(jié)合力(TCP)測(cè)定。在此測(cè)定中，使指定體積的α類毒素上清液與已知量的抗毒素單位接觸。在提供合適培養(yǎng)時(shí)間以使抗毒素與α類毒素結(jié)合之后(例如0.5-2小時(shí))，添加已知量的α毒素。隨后給予合適時(shí)間使殘余游離抗毒素與α毒素結(jié)合。隨后通過(guò)向溶液中添加α毒素的磷脂酶C活性的底物，測(cè)定游離α毒素含量。合適底物包括紅細(xì)胞(尤其是綿羊紅細(xì)胞)和卵磷脂。隨后可通過(guò)基于磷脂酶C活性的量的計(jì)算，定量測(cè)定α類毒素。測(cè)定液中α毒素含量越多，則該測(cè)定中所檢測(cè)的磷脂酶C活性的量越大?；蛘?，可在不測(cè)定磷脂酶C活性的情況下進(jìn)行測(cè)定，例如可使用任何競(jìng)爭(zhēng)性抗體結(jié)合分析，包括結(jié)合色譜步驟、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或通過(guò)Biacore儀器等的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析。
其它抗原梭菌疾病通常作為混合感染而發(fā)生，因此添加其它梭菌類毒素可進(jìn)一步減少病理及臨床癥狀。來(lái)自已知引起胃腸炎的有機(jī)體的其它梭菌類毒素(包括來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌的梭菌類毒素)的非限制性實(shí)例包括產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素、β2毒素、θ毒素、ε毒素、腸毒素、κ毒素、λ毒素和ι毒素；索氏梭菌出血毒素(HT)和致死毒素(LT)；艱難梭菌A毒素和B毒素；敗毒梭菌α毒素；以及諾氏梭菌α(A)毒素和β(B)毒素，可將它們添加到本發(fā)明疫苗中以增加抗混合感染的功效。
本發(fā)明的疫苗也可包括來(lái)自其它細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲(chóng)的抗原。這些抗原包括其它毒素或類毒素；細(xì)菌和/或細(xì)菌提取物；真菌和/或真菌提取物；病毒和/或病毒蛋白；和/或寄生蟲(chóng)或來(lái)自寄生蟲(chóng)的蛋白質(zhì)。來(lái)自本文所提供的來(lái)源的合適病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)抗原是本領(lǐng)域眾所周知的。
細(xì)菌有機(jī)體的非限制性實(shí)例為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、彎曲桿菌(Camplobacter spp.)、巴斯德氏菌(Pasteurella spp.)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)、鏈球菌(Streptococcus spp.)、腸球菌(Enterococcus spp.)、衣原體、丹毒(Erysipelas spp.)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、博德特氏菌屬(Bordetella)和鳥(niǎo)桿菌屬(Ornithobacterium)。
相關(guān)毒素的非限制性實(shí)例為革蘭氏陰性菌脂多糖(LPS)，已知它增強(qiáng)疫苗的免疫反應(yīng)并因此提高針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素和霉菌毒素的抗毒素的產(chǎn)生。
合適病毒的非限制性實(shí)例為冠狀病毒(Coronavirus)、輪狀病毒(Rotavirus)、星狀病毒(Astrovirus)、類腸道病毒的病毒(Enteroviruslikevirus)、環(huán)狀病毒(Torovirus)、腺病毒(Adenovirus)、呼腸孤病毒(Reovirus)、雙RNA病毒(Birnavirus)、皰疹病毒(Herpesvims)、副粘病毒(Paramyxovirus)、小核糖核酸病毒(Picornavirus)、馬立克氏病病毒(Mareks Disease Virus)、出血性腸炎病毒(Hemorrhagic Enteritis Virus)和新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)。
寄生蟲(chóng)的非限制性實(shí)例為球蟲(chóng)(Coccidia)(例如艾美球蟲(chóng)(Eimeria sp.))和隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidia)，[參見(jiàn)US 2004/0018215A1，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中]。
佐劑 佐劑也可用于改善免疫應(yīng)答和/或增加疫苗制劑的穩(wěn)定性。通常將佐劑描述為免疫系統(tǒng)的非特異性刺激物，但它也可用于靶向免疫系統(tǒng)的特異性臂(arm)?？蓪⒁环N或多種具有該活性的化合物添加到疫苗中。因此，具體的本發(fā)明疫苗還包含佐劑?？捎米髯魟┑幕衔锏膶?shí)例包括但不限于鋁化合物(例如氫氧化鋁)、可代謝和不可代謝的油、礦物油(包括二縮甘露醇油酸酯衍生物/礦物油溶液)(例如MONTANIDE ISA 70，Seppic SA，F(xiàn)rance)和輕質(zhì)礦物油(例如DRAKEOL 6VR)、嵌段聚合物、ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)、維生素和礦物質(zhì)(包括但不限于維生素E、維生素A、硒和維生素B12)以及CARBOPOL_。
有時(shí)稱為免疫刺激物的佐劑的其它合適實(shí)例包括但不限于細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，趨化因子，來(lái)自淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，來(lái)自淋巴器官的細(xì)胞，細(xì)胞制劑和/或來(lái)自植物、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)的提取物(金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或脂多糖制劑)或促分裂原。
通常將佐劑與本發(fā)明抗原同時(shí)給藥。然而，也可在疫苗接種之前兩周的時(shí)期內(nèi)和/或在疫苗接種之后的一段時(shí)期內(nèi)給予佐劑，也就是說(shuō)，只要抗原(例如α類毒素)保持在組織中即可。
疫苗的制備 也提供本發(fā)明疫苗的制備方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗包含本發(fā)明抗原(例如單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型的α類毒素上清液)與藥學(xué)上可接受的佐劑的安全而免疫學(xué)有效的組合。α類毒素的量可定為每劑疫苗含有至少2總結(jié)合力(TCP)單位?？蓾饪sα類毒素上清液以盡量減小所需劑量的體積，以獲得已接種疫苗的動(dòng)物的每毫升抗血清中有至少4.0抗毒素單位(A.U.)。添加其它藥學(xué)上可接受的免疫調(diào)節(jié)劑可使TCP需求降至每劑2單位以下，只要疫苗接種仍能使已接種疫苗的動(dòng)物的每毫升抗血清中抗α毒素抗體有必需的4.0 A.U.即可。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)例如但不限于濃縮/超濾、色譜和離心等技術(shù)，從α類毒素上清液進(jìn)一步純化產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素。
疫苗的給予 可按以下方式給予疫苗液體制劑、乳劑、干粉和/或在噴霧中通過(guò)任何胃腸外途徑、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、通過(guò)劃痕、皮下、肌內(nèi)或通過(guò)粘膜途徑(例如口服、鼻內(nèi))接種、作為氣溶膠、通過(guò)滴眼劑、通過(guò)卵內(nèi)給藥、或作為凍干粉末植入。
動(dòng)物受試者 術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物受試者”指能夠被致病菌感染的動(dòng)物物種，在一個(gè)具體實(shí)施方案中包括人類。合適的動(dòng)物受試者也包括野生動(dòng)物、家畜(例如為了獲取肉、乳、油、蛋、毛皮、皮革、羽毛和/或羊毛而飼養(yǎng)的家畜)、馱畜、研究用動(dòng)物、伴侶動(dòng)物，以及在動(dòng)物園、野生棲息地和/或馬戲團(tuán)中飼養(yǎng)的動(dòng)物。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的動(dòng)物受試者為“食用”動(dòng)物。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“食用”動(dòng)物應(yīng)理解為包括為了由人類和/或其它動(dòng)物直接消費(fèi)(例如火雞、肉用雞)或?yàn)榱丝上M(fèi)(例如乳牛、產(chǎn)蛋母雞等)而繁殖的所有動(dòng)物。這些動(dòng)物的非限制性實(shí)例包括鳥(niǎo)類，例如家禽(即雞、火雞、鵝、鴨、鴕鳥(niǎo)等)、牛(bovine)(例如牛(cattle)、乳牛、水牛)、羊(例如山羊或綿羊)、豬(porcine)(例如家豬(swine)、公豬(hog)、仔豬(pig))和馬(equine)(例如馬(horse))等。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物受試者為伴侶動(dòng)物。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“伴侶”動(dòng)物應(yīng)理解為包括貓、狗(犬)、兔、馬、嚙齒類動(dòng)物(例如豚鼠、松鼠、大鼠、小鼠、沙鼠和倉(cāng)鼠)、靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如猴)和鳥(niǎo)類(例如鴿(pigeon)、鳩(dove)、鸚鵡(parrot)、長(zhǎng)尾鸚鵡(parakeet)、金剛鸚鵡(macaw)、金絲雀等)。
也可包括其它動(dòng)物以便受益于本發(fā)明疫苗，包括有袋類(例如袋鼠)、爬行類(例如飼養(yǎng)海龜)、獵鳥(niǎo)、天鵝、平胸類鳥(niǎo)以及其它經(jīng)濟(jì)上重要的家畜。
以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，不得視為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例 實(shí)施例1 在通過(guò)皮下途徑進(jìn)行疫苗接種的肉用母雞中的疫苗功效 概述 使用包含單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型α類毒素(A型)的疫苗通過(guò)皮下途徑對(duì)肉用母雞進(jìn)行疫苗接種，導(dǎo)致(i)已接種疫苗的肉用母雞中的免疫原性反應(yīng)，(ii)已接種疫苗肉用母雞的卵中明顯的抗α類毒素抗體，和(iii)對(duì)已接種疫苗的肉用母雞的隨后出生后代的被動(dòng)保護(hù)。
材料 產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α類毒素如下制備產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α類毒素在厭氧條件下，在大規(guī)模發(fā)酵罐(5000L)中，于37℃±2℃溫度培養(yǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌A型培養(yǎng)物。發(fā)酵期間添加氫氧化鈉以維持pH為7.8±2。發(fā)酵期間也添加碳水化合物(糊精)(最多1％重量/體積)以促進(jìn)生長(zhǎng)。讓培養(yǎng)物生長(zhǎng)3-6小時(shí)。生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)，向發(fā)酵罐內(nèi)添加甲醛溶液至終水平不超過(guò)0.5％。離心去除細(xì)胞，所得上清液用孔徑范圍為0.25-2.0μm的深層濾器過(guò)濾。在此過(guò)程中，將溫度保持在5℃±3℃。然后，將滅活培養(yǎng)物上清液滲濾，用不大于20,000分子量截止值的濾器進(jìn)行超濾，將上清液濃縮10-30倍。濃縮上清液貯存在2-8℃，用于隨后摻合到疫苗中。在摻合之前，通過(guò)使用上述結(jié)合力測(cè)試(TCP)來(lái)測(cè)定濃縮上清液的效力。各批類毒素的效力均采用TCP單位/毫升。
疫苗將包含滅活產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α類毒素的上清液混合制成每毫升油包水乳劑含有4結(jié)合力單位(TCP)。該乳劑按70％油相和30％水相制成。
油相制備如下 礦物油 89.20％ 司盤(Span)8010.00％ 苯甲醇 0.75％ 三乙醇胺0.05％ 水相制備如下 產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α類毒素+鹽水88％ 33％吐溫(Tween)80/鹽水溶液12％ 將總共30％水相緩慢加入到70％油相中，用Silverson均漿器乳化。(也可使用其它聯(lián)機(jī)均漿器)。勻漿時(shí)間視乳劑體積而定，并根據(jù)乳劑在37℃至少三天的粘度、粒度和穩(wěn)定性來(lái)確定。向水相加入慶大霉素以使終濃度達(dá)到30μg/ml連續(xù)體積。向水相加入硫柳汞(Thimerosol)以使終濃度達(dá)到0.01％連續(xù)體積。
疫苗接種用每劑0.5ml的摻合疫苗經(jīng)皮下對(duì)第一年產(chǎn)蛋母雞進(jìn)行疫苗接種。在14周齡給予第一劑疫苗，在20周齡給予第二劑量。用每劑含有1TCP的上述摻合疫苗對(duì)20只肉用第一年產(chǎn)蛋母雞進(jìn)行疫苗接種。用每劑含有2TCP的上述摻合疫苗對(duì)第二組20只肉用第一年產(chǎn)蛋母雞進(jìn)行疫苗接種。將第三組20只肉用第一年產(chǎn)蛋母雞作為對(duì)照，未對(duì)其進(jìn)行疫苗接種。將總共2-3只公雞與各組第一年產(chǎn)蛋母雞混養(yǎng)以產(chǎn)生受精卵。
被動(dòng)免疫性 從32、52和65周齡的已接種疫苗和對(duì)照母雞中收集雞蛋。將這些蛋所孵化的后代雞用于評(píng)價(jià)被動(dòng)保護(hù)作用，見(jiàn)表1。
表1 在各時(shí)間點(diǎn)所用的后代雞數(shù)目 最初兩周用未加藥的高蛋白膳食喂養(yǎng)雞，隨后在試驗(yàn)剩余時(shí)間內(nèi)改為正常喂養(yǎng)。用同時(shí)表達(dá)α毒素和β2毒素的烈性產(chǎn)氣莢膜梭菌A型對(duì)各雞進(jìn)行口服攻擊。在3ml劑量中，攻擊劑量含有每毫升6.3×107至6.3×108菌落形成單位。在18或19日齡開(kāi)始對(duì)雞連續(xù)攻擊3天。在攻擊最后一天后的兩天，處死雞，并檢查壞死性腸炎病變。后代雞的效力結(jié)果單獨(dú)列于表2-4，表示個(gè)體雞的母親的疫苗接種狀態(tài)，以及按照以下等級(jí)量表評(píng)價(jià)的壞死性腸炎病變的程度(如果有的話)。表2表示來(lái)自32周齡母雞的后代雞，表3表示來(lái)自52周齡母雞的后代雞，表4表示來(lái)自65周齡母雞的后代雞。表5顯示來(lái)自已接種每劑2TCP疫苗的母雞的后代雞的中位數(shù)評(píng)分。如表所示，相對(duì)于未接種疫苗母雞的后代而言，已接種疫苗母雞的后代顯著受到保護(hù)能抵抗所給予的細(xì)菌攻擊。
壞死性腸炎(NE)病變的等級(jí)量表 0＝小腸內(nèi)沒(méi)有壞死性腸炎總體病變(gross lesion)；腸的彈性正常(打開(kāi)后卷回其自身上)。
1＝腸壁薄而松弛(腸打開(kāi)時(shí)保持平整，但不卷回至正常位置)；粘膜上有過(guò)量或增稠的粘液覆蓋，或者粘膜(mucosa)的病灶或多病灶輕微變紅，或者漿膜管(serosal vessel)充血。
2＝腸壁上單一或少量多病灶區(qū)域紅腫；腸粘膜上單一或少量多病灶區(qū)域潰瘍或壞死。
3＝腸粘膜的廣泛多病灶區(qū)域的壞死和潰瘍±粘膜表面上顯著出血或纖維蛋白層或壞死碎片(土耳其毛巾狀外觀)。
4＝死亡動(dòng)物的壞死性腸炎總體病變?cè)u(píng)分為2以上。
表2 32周齡母雞的個(gè)體后代雞的壞死性腸炎病變?cè)u(píng)分 表3 52周齡母雞的個(gè)體后代雞的壞死性腸炎病變?cè)u(píng)分 表4 65周齡母雞的個(gè)體后代雞的的壞死性腸炎病變?cè)u(píng)分 表5 已接種2 TCP劑量疫苗母雞的后代雞的中位數(shù)評(píng)分 母雞后代的中位數(shù)壞死性腸類病變?cè)u(píng)分 抗體效價(jià) 血清從33和78周齡母雞采血樣。在室溫下，讓血液凝結(jié)2-4小時(shí)，離心后獲得血清。血清貯存在-10℃或更低溫度下直至測(cè)定抗體效價(jià)。針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的抗體效價(jià)通過(guò)使用連續(xù)稀釋和綿羊紅細(xì)胞的溶血抑制測(cè)定評(píng)價(jià)如下在V形底微量滴定板中制備各試驗(yàn)樣品的連續(xù)稀釋液(兩倍)。向含有樣品稀釋液的各孔中加入已知量的α毒素。然后，這些滴定板于36±2℃孵育一小時(shí)，使得自血清的抗體與_毒素結(jié)合。在此孵育后，向孔中添加0.5％綿羊紅細(xì)胞液，這些滴定板于36℃±2℃孵育三小時(shí)，使未結(jié)合的α毒素溶解紅細(xì)胞。隨后檢查這些滴定板是否無(wú)溶血。顯示無(wú)溶血的試驗(yàn)樣品的最高稀釋度的倒數(shù)被認(rèn)為是終點(diǎn)?？贵w效價(jià)見(jiàn)表6-8。
卵黃處理卵黃，測(cè)定抗體效價(jià)。簡(jiǎn)而言之，分離卵黃，與市售提取緩沖劑(Promega EGGstract System，Promega目錄號(hào)G1531和G2610，Madison，Wisconsin)混合。提取之后，獲得IgY沉淀，隨后用磷酸緩沖鹽溶液重懸浮至卵黃的原體積。合并至少5個(gè)蛋的卵黃提取物，使用如上所述的用于血清的溶血抑制(HI)測(cè)定來(lái)測(cè)定抗體效價(jià)。按照該方法，對(duì)40、52和64周齡產(chǎn)蛋雞的蛋中所收集的卵黃進(jìn)行抗體效價(jià)評(píng)價(jià)。卵黃的抗體效價(jià)見(jiàn)表9。
表6 33周齡個(gè)體母雞血清中針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α毒素的抗體效價(jià) *為了計(jì)算幾何平均值，將小于2的數(shù)值當(dāng)作1 表7 78周齡個(gè)體母雞血清中針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α毒素的抗體效價(jià) *為了計(jì)算幾何平均值，將小于2的數(shù)值當(dāng)作1 表8 不同時(shí)間點(diǎn)母雞血清中的幾何平均溶血抑制效價(jià) 表9 不同時(shí)間點(diǎn)收集母雞的卵黃溶血抑制效價(jià) 實(shí)施例2 經(jīng)肌內(nèi)途徑接種肉用母雞的疫苗功效 概述 使用包含單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型α類毒素(A型)的疫苗，經(jīng)肌肉途徑給肉用母雞接種，也會(huì)導(dǎo)致(i)已接種疫苗的肉用母雞中的免疫原性反應(yīng)，(ii)已接種疫苗的肉用母雞的蛋中明顯的抗α類毒素抗體，和(iii)對(duì)已接種疫苗的肉用母雞隨后出生后代的被動(dòng)保護(hù)。
被動(dòng)免疫 用兩劑0.5ml上述實(shí)施例1的疫苗(含2TCP)給總共14只肉用第一年產(chǎn)蛋母雞肌內(nèi)接種。將另一組40只第一年產(chǎn)蛋母雞用作對(duì)照。如上所述，將3只公雞與各組第一年產(chǎn)蛋母雞混養(yǎng)。在10周齡給予第一劑疫苗，在23周齡給予第二劑。在32周齡收集母雞的雞蛋并進(jìn)行孵化，以確定在實(shí)驗(yàn)性產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊之后后代雞的被動(dòng)保護(hù)。
表10顯示已接種疫苗母雞和對(duì)照母雞的后代雞的壞死性腸炎發(fā)病率以及按照以上實(shí)施例1的等級(jí)量表所確定的其相應(yīng)病變的中位數(shù)評(píng)分。表11顯示個(gè)體后代雞的壞死性腸炎病變的中位數(shù)評(píng)分。表12列出個(gè)體后代雞的抗產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α毒素的抗體效價(jià)，而表13提供自32周齡的已接種疫苗母雞和對(duì)照母雞收集的雞蛋的卵黃抗體效價(jià)。
表10 發(fā)病率和壞死性腸炎病變 表11 32周齡母雞的個(gè)體后代雞的壞死性腸炎病變?cè)u(píng)分 表12 35周齡個(gè)體母雞的血清抗體效價(jià)2 2按照以上實(shí)施例1所述的溶血抑制測(cè)定所測(cè)量的產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α毒素的抗體。
3為了計(jì)算幾何平均值，將小于2的數(shù)值當(dāng)作1。
表13 從32周齡母雞所收集的卵黃的抗體效價(jià) 實(shí)施例3 經(jīng)皮下途徑接種SPF白色來(lái)亨(leghorn)小母雞的血清學(xué)抗體效價(jià) 對(duì)皮下接種以上實(shí)施例1的疫苗(含1、2或3 TCP)的SPF白色來(lái)亨小母雞體內(nèi)抗體效價(jià)進(jìn)行評(píng)價(jià)。小母雞在15周齡用0.5ml疫苗進(jìn)行接種，初次接種后4周給予加強(qiáng)劑量。加強(qiáng)接種后6周采血樣。按照以上實(shí)施例1所述的溶血抑制測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)各個(gè)體鳥(niǎo)血清的抗體效價(jià)。
表14 針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α毒素的個(gè)體小母雞血清抗體效價(jià) *為測(cè)定幾何平均效價(jià)，將小于2的效價(jià)當(dāng)作1 對(duì)自25周齡白色來(lái)亨產(chǎn)蛋雞收集的雞蛋的抗體效價(jià)進(jìn)行溶血抑制效價(jià)評(píng)價(jià)。結(jié)果見(jiàn)表15。
表15 針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α毒素的合并卵黃抗體效價(jià) 對(duì)白色來(lái)亨母雞合并血清的毒素中和效價(jià)(TNT)測(cè)定 用小鼠評(píng)價(jià)母雞合并血清中針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α毒素的抗毒素效價(jià)。采用美國(guó)農(nóng)業(yè)部動(dòng)植物衛(wèi)生檢疫局聯(lián)邦法典匯編(Code ofFederal Regulations，Animal and Plant Health Inspection Service，Department of Agriculture)所述方法，測(cè)定合并血清的抗毒素效價(jià)。用于測(cè)定抗毒素的方法類似于現(xiàn)行9 CFR§113.111(c)，只是使用α毒素和抗毒素試劑代替β毒素和抗毒素。以下檢測(cè)試劑用于測(cè)定抗毒素效價(jià) 1)產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α抗毒素IRP 426(得自Center forVeterinary Biologics，USDA)。
2)產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α毒素IRP 446(得自Center for VeterinaryBiologics，USDA)。
簡(jiǎn)而言之，將稀釋標(biāo)準(zhǔn)抗毒素或血清與已知量的標(biāo)準(zhǔn)α毒素混合。隨后給小鼠注射該混合物，測(cè)定未中和毒素的存在。再在生物測(cè)定中通過(guò)測(cè)定保護(hù)小鼠免于死亡的標(biāo)準(zhǔn)或試驗(yàn)血清稀釋度，來(lái)評(píng)價(jià)已知量的標(biāo)準(zhǔn)α抗毒素對(duì)毒素活性作用的比較。白色來(lái)亨小母雞合并血清的抗毒素效價(jià)見(jiàn)下表16。
表16 已接種疫苗小母雞和對(duì)照小母雞的毒素中和效價(jià)(TNT) 實(shí)施例4 經(jīng)肌內(nèi)途徑接種的SPF白色來(lái)亨小母雞的血清學(xué)抗體效價(jià) 對(duì)使用以上實(shí)施例1的疫苗(含1、2或3 TCP)進(jìn)行兩次肌內(nèi)接種的SPF白色來(lái)亨小母雞進(jìn)行抗體效價(jià)評(píng)價(jià)。小母雞在10周齡用0.5ml疫苗進(jìn)行接種，初次接種后4周給予加強(qiáng)劑量。加強(qiáng)接種后7周采血樣。按照以上實(shí)施例1所述的溶血抑制測(cè)定，評(píng)價(jià)個(gè)體小母雞血清的抗體效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)下表17和表18。
表17 針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α毒素的個(gè)體小母雞血清抗體效價(jià) *為了測(cè)定幾何平均效價(jià)，將大于2的效價(jià)當(dāng)作1 使用以上實(shí)施例3所述的程序來(lái)評(píng)估母雞合并血清的毒素中和效價(jià)(TNT)，結(jié)果見(jiàn)下表18。
表18 已接種疫苗小母雞和對(duì)照小母雞的毒素中和效價(jià)(TNT) 按照以上實(shí)施例1所述，對(duì)自25周齡白色來(lái)亨產(chǎn)蛋雞收集的雞蛋的抗體效價(jià)進(jìn)行溶血抑制效價(jià)評(píng)價(jià)。結(jié)果概述于下表19。
表19 針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α毒素的合并卵黃抗體效價(jià) 實(shí)施例5 豬多價(jià)和單價(jià)產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素疫苗的比較 概述 描述了通過(guò)使用本發(fā)明產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α類毒素疫苗接種懷孕經(jīng)產(chǎn)母豬(sow)/初產(chǎn)母豬(gilt)而給新生仔豬提供被動(dòng)保護(hù)的方法。結(jié)果表明經(jīng)產(chǎn)母豬抗體應(yīng)答可通過(guò)初乳轉(zhuǎn)移給仔豬。
材料 產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α類毒素按照以上實(shí)施例1所述，制備產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α類毒素。
疫苗可將本發(fā)明疫苗與含有＞2總結(jié)合力單位的滅活產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α類毒素混合。可將該疫苗與本文公開(kāi)的任何佐劑混合，所述佐劑包括含有礦物油、植物油(花生油、大豆油)、角鯊烯、角鯊?fù)楹推渌纱x油類的水包油乳劑。皂苷(Seponin)、CARBOPOL_和含鋁佐劑(氫氧化鋁、磷酸鋁)等其它佐劑也可用于疫苗制備。疫苗還可含其它抗原，包括大腸桿菌(K88、K99、987P、1型)、來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌的類毒素和/或來(lái)自包括艱難梭菌、輪狀病毒和/或隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporedia)等其它致病菌在內(nèi)的類毒素。
給藥 懷孕初產(chǎn)母豬/經(jīng)產(chǎn)母豬在產(chǎn)仔豬之前經(jīng)肌內(nèi)或皮下途徑接種疫苗，以便通過(guò)吮食初乳給新生仔豬提供被動(dòng)保護(hù)。
結(jié)果 在32周齡仔豬中進(jìn)行三種疫苗的比較研究 疫苗#1與含有4 TCP產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α類毒素的氫氧化鋁 佐劑混合，每劑2ml。
疫苗#2與4 TCP產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α類毒素、大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、大腸桿菌987P、大腸桿菌1型和產(chǎn)氣莢膜梭菌C型β類毒素混合，每劑2ml。
疫苗#3制備成不含產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α類毒素、但含有大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、大腸桿菌987P、大腸桿菌1型和產(chǎn)氣莢膜梭菌C型β類毒素的安慰劑(placebo)疫苗，每劑2ml。
用2ml疫苗#1對(duì)第一組10只仔豬進(jìn)行肌內(nèi)接種。用2ml疫苗#2對(duì)第二組10只仔豬進(jìn)行肌內(nèi)接種。用2ml疫苗#3對(duì)第三組7只仔豬進(jìn)行接種。初次接種后20天給予2ml的加強(qiáng)劑量。初次接種(第0天)、加強(qiáng)接種后20天(第40天)及加強(qiáng)接種后41天(第61天)時(shí)采血樣。隨后按照以上實(shí)施例1所述的溶血抑制測(cè)定，評(píng)價(jià)血清樣品中針對(duì)α毒素的抗體效價(jià)。三種疫苗的結(jié)果分別獨(dú)立示于表20-22。
表20 單價(jià)產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α類毒素疫苗 表21 產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α類毒素與大腸桿菌- 產(chǎn)氣莢膜梭菌C型β類毒素的聯(lián)合疫苗 表22 大腸桿菌-產(chǎn)氣莢膜梭菌C型β類毒素 實(shí)施例6 已接種疫苗經(jīng)產(chǎn)母豬的合并血清的毒素中和效價(jià)(TNT)測(cè)定 將四只懷孕經(jīng)產(chǎn)母豬平均分為兩個(gè)處理組。一組經(jīng)肌內(nèi)途徑接種2.0ml疫苗(在2ml劑量以上實(shí)施例5的疫苗#1中含有4 TCP)。另一組為未接種的對(duì)照。這些經(jīng)產(chǎn)母豬在產(chǎn)仔豬前大約6-7周進(jìn)行疫苗接種，3周后給予加強(qiáng)劑量。在疫苗接種之前以及恰好在產(chǎn)仔豬之前采血樣。表23顯示使用以上實(shí)施例3所述的毒素中和測(cè)定(TNT)，評(píng)價(jià)血清樣品中針對(duì)α毒素的抗毒素效價(jià)。
表23 TNT效價(jià) 本發(fā)明的范圍并不受本文所述的具體實(shí)施方案的限制。事實(shí)上，根據(jù)上文描述，除本文所述之外，本發(fā)明的各種修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。這些修改將會(huì)落入所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
還應(yīng)理解對(duì)核酸或多肽所給出的所有堿基大小或氨基酸大小、以及所有分子量或分子質(zhì)量值均為近似值，都是為了描述的目的而提供。本文引用的各種出版物的公開(kāi)內(nèi)容都通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
權(quán)利要求
1.一種疫苗，其包含選自以下的抗原產(chǎn)氣莢膜梭菌(ClostridiumPerfringens)α類毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素的抗原片段、產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的滅活抗原片段及其任何組合；
其中一至兩劑、每劑0.25-0.6ml的所述疫苗足以誘導(dǎo)已接種所述疫苗的雞的每毫升抗血清中抗α毒素抗體有至少四抗毒素單位(A.U.)。
2.權(quán)利要求1的疫苗，其中所述抗原是無(wú)細(xì)胞制劑。
3.權(quán)利要求1的疫苗，其中所述抗原是產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素上清液中的α類毒素。
4.權(quán)利要求1的疫苗，其中所述抗原是重組多肽。
5.權(quán)利要求1的疫苗，其中所述抗原的TCP≥2。
6.權(quán)利要求1的疫苗，其中所述抗原選自產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α類毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌C型α類毒素。
7.權(quán)利要求1的疫苗，所述疫苗還包含佐劑。
8.權(quán)利要求7的疫苗，其中油包水乳劑包含所述抗原和佐劑。
9.權(quán)利要求8的疫苗，其中按70％油相和30％水相制備所述油包水乳劑。
10.權(quán)利要求1的疫苗，其中所述抗原是產(chǎn)氣莢膜梭菌類型α類毒素；前提條件是所述疫苗中僅存在單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型α類毒素。
11.權(quán)利要求10的疫苗，其中所述α類毒素包含在產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素上清液中。
12.權(quán)利要求1的疫苗，所述疫苗是還包含一種或多種以下毒素的多價(jià)疫苗產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌ι毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌κ毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌λ毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌θ毒素、索氏梭菌(Clostridium sordellii)出血毒素、索氏梭菌致死毒素、艱難梭菌(Clostridium difficile)A毒素、艱難梭菌B毒素、敗毒梭菌(Clostridiumsepticum)α毒素、諾氏梭菌(Clostridium novyi)α毒素和諾氏梭菌β毒素。
13.權(quán)利要求12的疫苗，其中所述多價(jià)疫苗還包含一種或多種病毒抗原、一種或多種細(xì)菌抗原和一種或多種寄生蟲(chóng)抗原；
其中所述一種或多種病毒抗原來(lái)自一個(gè)或多個(gè)以下來(lái)源傳染性法氏囊病病毒、傳染性支氣管炎病毒、呼腸孤病毒和新城疫病毒；
其中所述一種或多種細(xì)菌抗原來(lái)自一個(gè)或多個(gè)以下來(lái)源大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌屬(Salmonella)和彎曲桿菌屬(Campylobacter)；和
其中所述一種或多種寄生蟲(chóng)抗原來(lái)自艾美球蟲(chóng)屬(Eimeria)。
14.權(quán)利要求1的疫苗，所述疫苗是還包含一種或多種其它抗原的多價(jià)疫苗；
其中所述其它抗原來(lái)自一個(gè)或多個(gè)以下來(lái)源傳染性法氏囊病病毒、傳染性支氣管炎病毒、呼腸孤病毒、新城疫病毒、大腸桿菌、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬和艾美球蟲(chóng)屬。
15.一種基本上由選自以下的抗原組成的疫苗單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型α類毒素、α類毒素的抗原片段、單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型α毒素的滅活抗原片段及其任何組合；
其中所述單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型α類毒素與所述單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型α毒素的滅活抗原片段是同一類型；和
其中一至兩劑、每劑0.25-0.6ml的所述疫苗足以誘導(dǎo)已接種所述疫苗的雞的每毫升抗血清中抗α毒素抗體有至少四抗毒素單位(A.U.)。
16.一種給雌性鳥(niǎo)類的后代提供針對(duì)多種家禽疾病的被動(dòng)免疫的方法，所述方法包括在雌性鳥(niǎo)類產(chǎn)下包含后代的蛋之前將權(quán)利要求13的疫苗給予所述雌性鳥(niǎo)類；其中所述后代獲得針對(duì)多種疾病的被動(dòng)免疫。
17.一種給雌性鳥(niǎo)類的后代提供針對(duì)梭菌疾病的被動(dòng)免疫的方法，所述方法包括在雌性鳥(niǎo)類產(chǎn)下包含后代的蛋之前將權(quán)利要求1的疫苗給予所述雌性鳥(niǎo)類；其中所述后代獲得針對(duì)梭菌疾病的被動(dòng)免疫。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述鳥(niǎo)類是雞或火雞。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述梭菌疾病是梭菌腸疾病。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述梭菌腸疾病是壞死性腸炎。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述梭菌疾病選自膽管肝炎、壞疽性皮炎和蜂窩織炎。
22.一種制備產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素疫苗的方法，所述方法包括
(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞，以產(chǎn)生一定量的培養(yǎng)細(xì)胞；其中所述量的培養(yǎng)細(xì)胞將產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中；
(b)滅活所分泌的α毒素，產(chǎn)生產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素；
(c)自所述培養(yǎng)基去除大部分所述量的培養(yǎng)細(xì)胞，以形成產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素上清液；和
(d)調(diào)節(jié)所述產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素上清液的濃度，使其足以誘導(dǎo)已接種一劑或兩劑、每劑0.25-0.6ml所述疫苗的鳥(niǎo)類的每毫升抗血清中抗α毒素抗體有至少四抗毒素單位(A.U.)。
23.權(quán)利要求22的方法，所述方法還包括將該產(chǎn)氣莢膜梭菌α類毒素上清液與油包水乳劑混合。
24.權(quán)利要求23的方法，其中按70％油相和30％水相制備所述油包水乳劑。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞是單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型細(xì)胞。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述單一產(chǎn)氣莢膜梭菌類型細(xì)胞選自產(chǎn)氣莢膜梭菌A型細(xì)胞和產(chǎn)氣莢膜梭菌C型細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明描述包含產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)類型α類毒素、其抗原片段、產(chǎn)氣莢膜梭菌類型α毒素的滅活抗原片段、或其任何組合的疫苗。本發(fā)明還描述用這些疫苗來(lái)保護(hù)動(dòng)物以免感染梭菌疾病的使用方法。本發(fā)明也描述這些疫苗的制備方法。
文檔編號(hào)A61K39/08GK101198352SQ200680021810
公開(kāi)日2008年6月11日 申請(qǐng)日期2006年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月18日
發(fā)明者H·杰雅帕, K·傲康諾 申請(qǐng)人:謝爾英·普勞有限公司