專利名稱：：促紅細(xì)胞生成素受體肽制劑和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及為促紅細(xì)胞生成素受體(EPO-R)激動(dòng)劑的肽化合物。本發(fā)明也涉及使用此類肽化合物治療與血紅細(xì)胞生產(chǎn)不足或缺陷相關(guān)的疾病的治療方法。也提供了包含本發(fā)明的肽化合物的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：促紅細(xì)胞生成素(EPO)是165個(gè)氨基酸、分子量大約34千道爾頓(kD)、并且第24、38、83和126位氨基酸為優(yōu)選的糖基化位點(diǎn)的糖蛋白激素。其最初產(chǎn)生為具23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽的前體蛋白質(zhì)。EPO可以以三種形式存在a、p和脫唾液酸的。a和(5形式雖然在其糖類組分上略有不同，但具有相同的潛能、生物活性和分子量。脫唾液酸形式為移去了末端糖(唾液酸)的a或|5形式。已經(jīng)報(bào)道了編碼EPO的DNA序列[Lin的美國(guó)專利號(hào)4，703，008。EPO刺激紅細(xì)胞前體細(xì)胞的有絲分裂和分化，并因此保證紅細(xì)胞的產(chǎn)生。當(dāng)為含氧量低的條件時(shí)，其在腎中產(chǎn)生。在EPO誘導(dǎo)的紅細(xì)胞前體細(xì)胞分化期間，誘導(dǎo)合成珠蛋白，刺激合成血紅素復(fù)合體，并增加鐵蛋白受體數(shù)量。這些變化使細(xì)胞吸收更多鐵，并合成在成熟的紅細(xì)胞中結(jié)合氧的功能性血紅蛋白。因此，紅細(xì)胞及其血紅蛋白在為身體供氧中起重要作用。這些變化通過EPO和在紅細(xì)胞前體細(xì)胞的細(xì)胞表面上的適當(dāng)受體相互作用而啟動(dòng)[見，例如Graber和Krantz(1978)Aim.Rev.Med.29.51-66。當(dāng)身體處于健康狀態(tài)時(shí)，組織從現(xiàn)有數(shù)量的紅細(xì)胞接收足夠的氧合，EPO以非常低的濃度存在于血漿中。這種正常的低濃^X夠刺激由于衰老正常損失的紅細(xì)胞的替換。當(dāng)循環(huán)中血細(xì)胞運(yùn)輸?shù)难鯗p少時(shí)，在低氧條件下，循環(huán)中的EPO數(shù)量增加。低氧可以例如由于出血導(dǎo)致的相當(dāng)量的血損失、由于過渡暴露于輻射導(dǎo)致的血紅細(xì)胞破壞、由于高海拔或長(zhǎng)時(shí)間昏迷導(dǎo)致的氧攝入下降或者多種形式的貧血產(chǎn)生。應(yīng)答該含氧量低的壓力，提高的EPO水平通過刺激類紅細(xì)胞祖先細(xì)胞的增殖來增加血紅細(xì)胞的產(chǎn)生。當(dāng)循環(huán)中的血紅細(xì)胞數(shù)量大于正常組織氧需求所需要的數(shù)量時(shí)，循環(huán)中的EPO水平下降。因?yàn)镋PO在血紅細(xì)胞形成過程中是必需的，所以這種激素可能在診斷和治療具有低的或缺陷性血紅細(xì)胞產(chǎn)生特征的血液疾病中有用。最近的研究提供了研發(fā)對(duì)多種疾病狀態(tài)、疾病和血液異常狀態(tài)有效的EPO療法的基礎(chǔ)，其中所述的疾病狀態(tài)、疾病和血液異常包括p-地中海貧血見Vedovato等人(1984)Acta.Haematol.71:211-213]、嚢性纖維化[見Vichinsky等人(1984)J.Pediatric105:15-21、妊娠和月經(jīng)疾病[見Cotes等人(193)Brit.J.Ostet.Gyneacol.90:304-311]、早產(chǎn)兒早期貧血(earlyanemiaofprematurity)[見Haga等人(1983)ActaPediatr.Scand.72;827-831、脊髓損傷[見Claus-Walker等人(1984)Arch.Phys.Med.Rehabil.65:370-374、宇宙飛行所致疾病(spaceflight)[見Dunn等人(1984)Eur.J.Appl.Physiol.52:178-182、急性血損失[見Miller等人(1982)Brit.J.Haematol.52:545-5卯、衰老[見Udupa等人(1984)J.Lab.Clin.Med.103:574-580和581-588以及Lipschitz等人(l983)Blood63:502-5091、多種伴隨著異常紅細(xì)胞生成的肺瘤疾病狀態(tài)[見Dainiak等人(1983)Cancer5:1101-1106和Schwartz等人(1983)Otolaryngol.109:269-272、以及腎機(jī)能不全[見Eschbach等人(1987)N.Eng.J.Med.316:73-78。已經(jīng)表征了純化的、勻質(zhì)的EPO的特征[Hewick的美國(guó)專利號(hào)4，677，195。純化、克隆并表達(dá)了編碼EPO的DNA序列，以產(chǎn)生具有與天然EPO相同生物化學(xué)性質(zhì)和免疫性質(zhì)的重組多肽。也產(chǎn)生了具有與天然EPO上相同寡糖的重組EPO分子見Sasaki等人(1987)J.Biol.Chem.262:12059-12076。EPO的生物學(xué)效應(yīng)部分通過與細(xì)胞膜結(jié)合的受體相互作用來介導(dǎo)。最初使用從小鼠脾分離的未成熟類紅細(xì)胞的研究表明，EPO結(jié)合性細(xì)胞表面蛋白質(zhì)包含兩個(gè)分別具有大約85,000道爾頓和100,000道爾頓分子量的多肽[Sawyer等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:36卯-3694。計(jì)算EPO結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量為平均每細(xì)胞表面800-1000個(gè)。在這些結(jié)合位點(diǎn)中，大約300個(gè)以大約90pM(皮摩爾)的Kd結(jié)合EPO,而其余的以降低的親和性大約570pM結(jié)合EPO[Sawyer等人(1987)J.Biol.Chem.262:5554-5562。獨(dú)立的研究表明，從注射了弗羅德白血病病毒的貧血性株(FVA)的小鼠制備的EPO應(yīng)答性脾成紅血細(xì)胞具有總計(jì)大約400個(gè)Kd值分別為大約100pM和800pM的高親和性和低親和性EPO結(jié)合位點(diǎn)[LandschuIz等人(1989)Blood73:1476-1486。隨后的工作表明，兩種形式的EPO受體(EPO-R)由單一基因編碼。這個(gè)基因已經(jīng)被克隆[見，例如Jones等人(19卯)Blood76,31-35、Noguchi等人(1991)Blood78:2548-2556、Maouche等人(1991)Blood78:2557-2563。例如，D'Andrea等人的PCT公開號(hào)WO卯/08822中描述了鼠和人EPO-R蛋白質(zhì)的DNA序列和編碼的肽序列。目前的模型表明，EPO和EPO-R的結(jié)合導(dǎo)致兩個(gè)EPO-R分子的二聚化和激活，進(jìn)而導(dǎo)致隨后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟[見，例如Watowich等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:2140-2144?？寺〉腅PO-R基因的可獲得性促進(jìn)了對(duì)這個(gè)重要受體的激動(dòng)劑和拮抗劑的探索。重組的受體蛋白質(zhì)的可獲得性使得可以在多種隨機(jī)和半隨機(jī)的肽多樣性產(chǎn)生系統(tǒng)中研究受體-配體的相互作用。這些系統(tǒng)包括"質(zhì)粒上的肽"系統(tǒng)[美國(guó)專利號(hào)6，270，170中所述、"噬菌體上的肽"系統(tǒng)[美國(guó)專利號(hào)5，432，018和Cwirla等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378-6382中所述j、"編碼的合成性文庫(kù)"(ESL)系統(tǒng)1992年9月16日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)946,239中所述I、以及"很大規(guī)模固定化多6聚體合成，，系統(tǒng)[美國(guó)專利號(hào)5,143,854、PCT公開號(hào)90/15070、Fodor等人(1991)Science251:767-773、Dower和Fodor(1991)Ann.Rep.Med.Chem.26:271-180以及美國(guó)專利號(hào)5,424,186中所述。至少一定程度上與EPO-R相互作用的肽已經(jīng)得到鑒定，并且在例如美國(guó)專利號(hào)5，773，569、5,830,851、和Wrighton等人的5,986,047、Wrighton等人的PCT公開號(hào)WO96/40749;美國(guó)專利號(hào)5,767,078以及Johnson和Zivin的PCT公開號(hào)96/40772、Balu的PCT公開號(hào)WO01/38342、以及Smith-Swintosky等人的WO01/91780中進(jìn)行了描述。具體而言，已鑒定出一組包含肽基序的肽，其中的成員結(jié)合EPO-R、并刺激EPO依賴性的細(xì)胞增殖。然而，迄今鑒定的包舍基序的肽在體外以大約20納摩爾(nM)至大約250nM的EC50值刺激EPO依賴性細(xì)胞增殖。因此，需要20nM至250nM的肽濃度來刺激由EPO刺激的最大細(xì)胞增殖的50%細(xì)胞增殖。此夕卜，其它結(jié)合EPO受體的肽及其構(gòu)建體在2003年5月12日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/470,244、60/470,245和60/469,993中描述、在2004年11月11日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/627,432和60/627,433中、2004年5月12日申請(qǐng)的美國(guó)非臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)10/844,968中、在2004年5月12日申請(qǐng)、并分別以WO2004/101611和WO2004/101606>^開的國(guó)際申請(qǐng)系列號(hào):PCT/US2004/14886和PCT/US2004/014889中進(jìn)行了描述。這些申請(qǐng)每一個(gè)在此處都以其整體引入作為參考。既然EPO-R激動(dòng)劑對(duì)這個(gè)受體介導(dǎo)的重要生物學(xué)性質(zhì)的研究和對(duì)疾病治療都有非常大的潛能，所以仍然需要鑒定具有增強(qiáng)的潛能和活性的肽EPO-R激動(dòng)劑。本發(fā)明提供了該類化合物。在這個(gè)部分和整個(gè)說明書中對(duì)所引參考文獻(xiàn)的引用和/或討論僅提供用來闡述本發(fā)明，并且不承認(rèn)任何該參考文獻(xiàn)為本發(fā)明的"現(xiàn)有技術(shù)，，。發(fā)明概述本發(fā)明提供了為顯著增強(qiáng)潛能和活性的EPO-R激動(dòng)劑的新型肽化合物。這些肽化合物為具有氨基酸序列7(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK(SEQIDNO:l)的肽單體的同型二聚體或具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(l誦nal)VCQPLR(MeG)K(SEQIDNO:2)的肽單體的同型二聚體、具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)(SEQIDNO:3)的肽單體的同型二聚體，其中每個(gè)氨基酸都以標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫表述，"(AcG)"為N-乙酰甘氨酸，"(l-nal)"為l-萘丙氨酸，并且"(MeG)"為N-甲基甘氨酸(也已知為肌氨酸)。肽二聚體的每個(gè)肽單體包含在單體的半胱氨酸殘基之間的分子內(nèi)二硫鍵。肽單體可以通過共價(jià)連接至支化的叔酰胺接頭而二聚化。叔酰胺接頭可以描述為dO畫CH2-X-CH2-C20-其中X為NCO-(CH2)2-I^H-;接頭的C1與第一肽單體C末端的賴氨酸殘基的s-氨基形成酰胺鍵;接頭的d與第二肽單體C末端的賴氨酸殘基的￡-氨基形成酰胺鍵；并且X的N1通過氨基甲酸酯鍵或酰胺鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分，其中PEG具有大約20，000至大約40,000道爾頓的分子量(術(shù)語"大約"表明制備PEG時(shí)，一些分子比所述分子量大，一些分子的分子量則小)。當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體具有氨基^列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK(SEQIDNO:1)、并且接頭的!^通過氨基甲酸酯鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下80(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR-NHJJ_nh2nh(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR-HNy~NH2I-10當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體具有氨基^列(AcG)GLYACHMGPIT(l畫nal)VCQPLRK(SEQIDNO:1)、并且接頭的]^通過酰胺鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)V^QPLR-NHjl_NH2ONH、，0丫。ONH(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR—HN^-NH2當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體具有M^列(AcG)GLYAC麗GPIT(l-naI)VCQPLR(MeG)K(SEQIDNO:2)、并且接頭的W通過氨基甲酸酯鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體具有M^列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQIDNO:2)、并且接頭的N"通過酰胺鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下肽單體也可以通過共價(jià)連接至支化的叔酰胺接頭而二聚化。叔酰胺接頭可以描述為其中X為NCO-(CH2)2-NH-C30-、接頭的C1與第一肽單體C末端的賴氨酸殘基的￡-氨基形成酰胺鍵；接頭的C2與第二肽單體C末端的賴氨酸殘基的s-氨基形成酰胺鍵。本發(fā)明的肽二聚體進(jìn)一步包含下列結(jié)構(gòu)的間隔物部分-N^HKCHA-C^H-N2!!-其中，間隔物的C"共價(jià)結(jié)合于X的C3;間隔物的W通過氨基甲酸酯或酰(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)—HN'C丄0-CH2-X-CH2畫C'0胺鍵共價(jià)連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分；并且間隔物的]^2通過#^甲酸酯或酰胺鍵共價(jià)連接至活化的PEG部分，其中PEG具有大約10,000至大約50，000道爾頓的分子量(術(shù)語"大約"表示制備PEG時(shí)，一些分子比所述分子量大，一些分子的分子量則小)。每個(gè)PEG部分可以分別為IO，OOO道爾頓(10kD)、20kD、30kD、40kD或50kD。當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體具有M^列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK(SEQIDNO:1)、并且間隔物的]>^和]\2都通過氨基甲酸酯鍵共價(jià)連接至活化的PEG部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下在優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩個(gè)肽單體的C末端賴氨酸都為L(zhǎng)-賴氨酸。此夕卜,本領(lǐng)域技術(shù)人員理解上述兩個(gè)線性PEG部分通過賴氨酸結(jié)合的化學(xué)結(jié)構(gòu)(例如，mPEG2-Lys-NHS或mPEG2-Lysinol-NPC)，其也優(yōu)選地為L(zhǎng)國(guó)賴氨酸，并且產(chǎn)生下列立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>^備選地，一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基可以為D-賴氨酸，產(chǎn)生本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易理解的備選立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體都具有M^列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK(SEQIDNO:1)、并且間隔物的W和]^都通過酰胺鍵共價(jià)連接至活化的PEG部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下、dlHMGPIT(l-nal)V(!;iO(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR-NHjL^H2NH、》0n/PEGYJ。Y10-50K(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR—HN^r-NH2I-10卵O另外，這個(gè)化合物中的賴氨酸分子都優(yōu)選地為L(zhǎng)-賴氨酸，產(chǎn)生下列立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。(AcG)GLYA(!;HMGPIT(l-Nal)V(!;QPLR-NH^^叫NH、，0丫ONH(AcG)GLYACHMGPIT(l-Nal)VCQPLR—HN\~叫1-1OHN丫PEG滅O備選地，一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基可以為D-賴氨酸，產(chǎn)生本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易理解的備選立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體具有M^列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQIDNO:2)、并且間隔物的N1和P^都通過氨基曱酸酯鍵共價(jià)連接至活化的PEG部分、其中Y為氨基甲酸酯基時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下:(AcG)GLYAd服GPIT(l-nal)VeQPLR(MeG)~NH.(AcG)GLYACHMGPIT(l-加l)VCQPLR(MeG)"HN優(yōu)選地，連接這個(gè)分子中的肽單體和線性PEG部分的賴氨酸殘基都為L(zhǎng)-賴氨酸，產(chǎn)生下列立體化學(xué)結(jié)構(gòu)備選地，一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基可以為D-賴氨酸，產(chǎn)生本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易理解的備選立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體具有氨基i^列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQIDNO:2)、并且間隔物的W和W都通過酰胺鍵共價(jià)連接至活化的PEG部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下(AcG)GtYACHMGPIT(l-Nal)VCQPLR(MeG)-HN'(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)—HNy~NH2I-1o優(yōu)選地，連接這個(gè)分子中的肽單體和線性PEG部分的賴氨酸殘基都為L(zhǎng)-賴氨酸，產(chǎn)生下列立體化學(xué)結(jié)構(gòu)在其它實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基可以是D-賴氨酸，產(chǎn)生本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可輕易理解的備選立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。肽單體也可以通過連接至賴氨酸接頭而二聚化，其中一個(gè)狀單體在其C末端連接至賴氨酸的s-氨基，并且第二肽單體在其C末端連接至賴氨酸的a-#J^。本發(fā)明的肽二聚體進(jìn)一步包含下列結(jié)構(gòu)的間隔物部分在一末端，間隔物的W通過酰胺鍵連接至賴氨酸接頭的氣基碳。在相反的末端，間隔物的]^通過M甲酸酯鍵或酰胺鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分，其中PEG具有大約20,000至大約40,000道爾頓的分子量(術(shù)語"大約"表示制備PEG時(shí)，一些分子比所述分子量大，一些分子的(AcG)GLYACHMGPIT(l-Nal)VCQPLR(MeG)~HN\~NH:I-10分子量則小)。當(dāng)間隔物通過氨基甲酸酯鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物(SEQIDNO:3)可以表示如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>當(dāng)間隔物通過酰胺鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物(SEQIDNO:3)可以表示如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>本發(fā)明進(jìn)一步提供用該類肽化合物治療多種醫(yī)學(xué)病癥的方法。方法包括通過向患者施用治療有效量的一種上述化合物來治療患有促紅細(xì)胞生成素缺乏或低的或缺陷性血紅細(xì)胞群體特征的疾病。在一些實(shí)施方案中，疾病為終末期腎衰竭或透析、伴隨AIDS的貧血、自身免疫疾病或惡性胂瘤、p-地中海貧血、嚢性纖維化、早產(chǎn)兒早期貧血、伴隨慢性炎癥病癥的貧血、脊髓損傷、急性血損失、衰老或伴隨異常紅細(xì)胞生成的胂瘤疾病狀態(tài)。此外，在一些實(shí)施方案中，疾病為腎衰竭或透析，并且治療有效量為每千克患者體重0.025-0.2毫克化合物的劑量。在其它實(shí)施方案中，疾病為腎衰竭或透析，并且治療有效量為每千克患者體重0.05-0.1毫克化合物的劑量。在一些實(shí)施方案中，疾病為伴隨腫瘤的貧血，并且治療有效量為每千克患者體重0.075-0.5毫克化合物的劑量。在其它實(shí)施方案中，疾病為伴隨腫瘤的貧血，并且治療有效量為每千克患者體重0.2-0.4毫克化合物的劑量。治療有效量可以每3至4周施用一次。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含該類肽化合物的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，PEG具有大約20,000道爾頓的分子量。在其它實(shí)施方案中，藥物組合物包含任意一種上述化合物和可藥用載體。發(fā)明詳述定義肽中的氨基酸殘基簡(jiǎn)寫如下苯丙氨酸為Phe或F、亮氨酸為L(zhǎng)eu或L、異亮氨酸為lie或I、甲硫氨酸為Met或M、纈氨酸為Val或V、絲氨酸為Ser或S、脯氨酸為Pro或P、蘇氨酸為Thr或T、丙氨酸為Ala或A、酪氨酸為Tyr或Y、組氨酸為His或H、谷氨酰胺為Gin或Q、天冬酰胺為Asn或N、賴氨酸為L(zhǎng)ys或K、天冬氨酸為Asp或D、谷氨酸為GIu或E、半胱氨酸為Cys或C、色氨酸為Trp或W、精氨酸為Arg或R以及甘氨酸為GIy或G。肽中的非常規(guī)氨基酸簡(jiǎn)寫如下l-萘基丙氨酸為l-nal或Np、N-甲基甘氨酸(也已知為肌氨酸)為MeG或Sc以及乙酰化甘氨酸(N-乙酰甘氨酸)為AcG。如本文所用，術(shù)語"多肽"或"蛋白質(zhì)"指的是ct氨基酸通過酰胺鍵連接在一起的M酸單體的聚合物。因此，多肽至少兩個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)，并且通常更長(zhǎng)。一般而言，術(shù)語"肽"指的是僅一些氨基酸殘基長(zhǎng)的多肽。本發(fā)明新型的EPO-R激動(dòng)劑肽優(yōu)選不長(zhǎng)于大約50個(gè)氨基酸殘基。它們更優(yōu)選長(zhǎng)大約17至大約40個(gè)氨基酸殘基。相比肽，多肽可以包含任意數(shù)量的氨基酸殘基。因此，術(shù)語多肽包括肽和更長(zhǎng)的M^列。如本文所用，短語"可藥用的"指的是當(dāng)施用于人時(shí)"通常認(rèn)為安全的"、例如生理上可耐受、并且一般不產(chǎn)生過敏性或相似不適反應(yīng)例如胃不適、頭暈等的分子物質(zhì)和組合物。優(yōu)選地，如本文所用，術(shù)語"可藥用的"表示經(jīng)聯(lián)邦或國(guó)家政府管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或者為美國(guó)藥典或其它通常認(rèn)可的藥典上列出的用于動(dòng)物、并且尤其是人的。術(shù)語"載體"指的是與化合物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或運(yùn)載體。該類藥物載體可以是無菌液體例如水和油，其中包括那些石油、動(dòng)物、蔬菜或合成來源的無菌液體，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。優(yōu)選采用水或含水溶液鹽溶液和含水葡萄糖和丙三醇溶液作為載體，尤其是用于可注射溶液的載體。E.W.Martin在"Remington'sPharmaceuticalSciences"中描述了適當(dāng)?shù)乃幬镙d體。如本文所用，術(shù)語"激動(dòng)劑"指的是與其互補(bǔ)的生物學(xué)活性受體結(jié)合并激活生物學(xué)活性受體從而引發(fā)受體中的生物學(xué)反應(yīng)或者增強(qiáng)受體現(xiàn)有生物學(xué)活性的生物活性配體。為EPO-R激動(dòng)劑的新型肽本發(fā)明提供了顯著增強(qiáng)了效力和活性的EPO-R激動(dòng)劑的新型肽化合物。這些肽化合物為具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK(SEQIDNO:l)的肽單體的同型二聚體或具有氨基,列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQIDNO:2)的肽單體的同型二聚體，其中每個(gè)氨基酸以標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫表示，"(AcG)"為N-乙酰甘氨酸、"(l-nal)"為1-萘基丙氛酸、并且"(MeG)"為N-甲基甘氨酸(也已知為肌氨酸)。肽二聚體的每個(gè)肽單體包含在單體的半胱氨酸之間的分子內(nèi)二硫鍵。該類單體圖示如下(acg)glya(Wpit(i婦(!;qplrk或(Acg)glya畫pit(i-加i)，q認(rèn)和卿腳o:,)(AcG)GLYAilMGPIT(l-nal)viQPL寧eG)K或闊GLYA畫PIT(l-nal)V(pQPLR(MeG)K(SEQIDN0:2)這些單體的肽二聚體化來提供具增強(qiáng)的EPO-R激動(dòng)劑活性的肽二聚體。接頭(u)部分為支化的叔酰胺，其通過同時(shí)連接至每個(gè)單體c末端的賴氨酸殘基而橋接兩個(gè)肽單體的C末端。叔酰胺接頭可以描述為-CiO-CHrXCH^O-其中X為NCO-(CH2)2-N1!!-;接頭的C1與第一肽單體的C末端賴氨酸殘基的E-氨基形成酰胺鍵;接頭的C"與第二肽單體的C末端賴氨酸殘基的氨基形成酰胺鍵；并且X的N1通過氨基甲酸酯鍵或酰胺鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分，其中PEG具有大約20,000至大約40,000道爾頓的分子量(術(shù)語"大約"表示制備PEG時(shí)，一些分子比所述分子量大，一些分子的分子量則小)。叔酰胺接頭也可以描述為-CO-CHrX-CHrC^O-其中X為NCO-(CH2)2-NH-C30-;接頭的C1與第一肽單體C末端賴氨酸殘基的s-氨基形成酰胺鍵；并且接頭的C2與第二肽單體C末端賴氨酸殘基的s-氨基形成酰胺鍵。本發(fā)明的肽二聚體進(jìn)一步包含下列結(jié)構(gòu)的間隔物部分-NiBKCH^C^H-N2!!-其中間隔物的C"共價(jià)鍵合于X的C、間隔物的W通過氨基甲酸酯鍵或酰胺鍵共價(jià)連接至活化的PEG部分；并且間隔物的N2通過氨基曱酸酯鍵或酰胺鍵共價(jià)連接至活化的P:EG部分，其中PEG具有大約10,000至大約60,000道爾頓的分子量(術(shù)語"大約"表示制備PEG時(shí)，一些分子比所述分子量大，一些分子的分子量則小)。因此，本發(fā)明的新型肽也可包含PEG部分，其通過氨基甲酸酯鍵或酰胺鍵共價(jià)連接至肽二聚體的叔酰胺接頭。PEG為可藥用的水溶性聚合物。用于本發(fā)明的PEG可以是線性、無分支、具有大約20千道爾頓(20K)至大約60千道爾頓分子量的PEG(術(shù)語"大約"表示制備PEG時(shí)，一些分子比所述分子量大，一些分子的分子量則小)。最優(yōu)選地，PEG具有大約30K至大約40K的分子量。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于下列考慮選擇目的聚合物大小，例如目的劑量、循環(huán)時(shí)間、蛋白酶解抵抗力、任意對(duì)生物學(xué)活性的效果、操作筒便性、抗原性程度或者缺乏抗原性以及PEG對(duì)治療性肽其它已知的的效果。本發(fā)明的肽、肽二聚體和其它基于肽的分子可以使用多種化學(xué)方法中的任意一種連接至水溶性聚合物(例如PEG)，以將水溶性聚合物連接于分子的受體結(jié)合部分(例如，肽+間隔物)。一般的實(shí)施方案采用單個(gè)連接接點(diǎn)來進(jìn)行水溶性聚合物與受體結(jié)合部分的共價(jià)連接，但在備選實(shí)施方案中使用多個(gè)連接接點(diǎn)，其中當(dāng)不同種類的水溶性聚合物在不同的連接接點(diǎn)連接至受體結(jié)合部分時(shí)包括進(jìn)一步的變化，其可包括與間隔物和/或與一條或兩條肽鏈的共價(jià)連接接點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，二聚體或更高等級(jí)的多聚體包含不同種類的肽鏈(即異源二聚體或其它異源多聚體)。作為實(shí)例，并且不作為限制，二聚體可以包含具有PEG連接接點(diǎn)的第一肽鏈和缺乏PEG連接接點(diǎn)或使用與第一肽鏈不同的連接化學(xué)的第二肽鏈，并且在一些變化方案中，間隔物可以包含或缺乏PEG連接接點(diǎn)，并且如果所述間隔物被PEG化，那么其可以使用不同于第一和/或第二肽鏈的鍵化學(xué)作用。備選的實(shí)施方案采用連接至受體結(jié)合部分和不同的水溶性聚合物(例如糖類)的間隔物部分的peg，其中所述的水溶性聚合物結(jié)合至分子的肽部分的一個(gè)氨基酸的側(cè)鏈上。很多種類的聚乙二醇(PEG)可以用來進(jìn)行受體結(jié)合部分(肽+間隔物)的PEG化。基本上任何適當(dāng)?shù)幕钚訮EG試劑都可以使用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，活性peg試劑在與受體結(jié)合部分結(jié)合后導(dǎo)致形成氨基甲酸酯鍵或酰胺鍵。適當(dāng)?shù)幕钚訮EG種類包括但不限于那些在NOF公司(YebisuGardenPlaceTower,20-3Ebisu4-chome，Shibuya畫ku，Tokyo150-6019)的藥物遞送系統(tǒng)目錄和NektarTherapeutics(490DiscoveryDrive,Huntsville,Alabama35806)的分子操作目錄(2003)上有售的PEG種類。例如，并且不作為限制，在多種實(shí)施方案中通常優(yōu)選下列PEG試劑mPEG2畫NHS、mPEG2-ALD、多-ArmPEG、mPEG(MAL)2、mPEG2(MAL)、mPEG-NH2、mPEG-SPA、mPEG-SBA、mPEG-硫酯、mPEG-二酯、mPEG匪BTC、mPEG-ButyrALD、mPEG畫ACET、異功能性PEG(NH2-PEG-COOH、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG國(guó)NHS、NHS-PEG-VS、NHS-PEG-MAL)、PEG丙烯酸酯(ACRL-PEG-NHS)、PEG-磷酉旨(例如，mPEG-DSPE)、SUNBRITE系列的多臂PEG,其中包括由本領(lǐng)域技術(shù)人所選化學(xué)作用激活的基于丙三醇的PEG的GL系列、任意SUNBRITE激活的PEG(包括但不限于J^-PEG、p-NP-PEG、Tresyl-PEG、醛PEG、縮醛-PEG、^J^-PEG、巰基-PEG、馬來酰亞胺-PEG、羥基-PEG-胺、氨基-PEG-COOH、羥基-PEG-醛、羧酸酐型PEG、功能性PEG-磷酯、以及性PEG。本發(fā)明的新型肽也可以包含通過氨基曱酸酯鍵或酰胺鍵共價(jià)連接至間隔物部分的2個(gè)PEG部分，其中間隔物部分共價(jià)鍵合于肽二聚體的叔酰胺接頭。在本發(fā)明此類實(shí)施方案中使用的兩個(gè)PEG部分中的每一個(gè)都可以是線性的，并且可以在單一連接點(diǎn)連接在一起。每個(gè)PEG部分優(yōu)選具有大約10千道爾頓(10K)至大約60K的分子量(術(shù)語"大約"表示在制備PEG時(shí)，一些分子可以比所述分子量大，一些分子則小)。尤其優(yōu)選線性的PEG部分。更加優(yōu)選地，兩個(gè)PEG部分每一個(gè)都具有大約20K至大約40K的分子量，并且仍然更加優(yōu)選介于大約20K至大約40K之間。仍然更加優(yōu)選兩個(gè)PEG部分的每一個(gè)都具有大約20K的分子量。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于下列考慮選擇目的聚合物大小，其中所述考慮如目的劑量、循環(huán)時(shí)間、蛋白水解作用的抵抗力、如果有的話，任意的生物活性效果、操作簡(jiǎn)便性、抗原性程度或者缺乏抗原性、以及PEG對(duì)治療肽其它已知的效果。本發(fā)明也包含肽激動(dòng)劑，其為具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)(SEQIDNO:3)的肽單體的同型二聚體，其中每個(gè)氨基酸以標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫表示，"(AcG)"為N-乙酰甘氨酸、"(l-nal)"為l-萘基丙氨酸、并且"(MeG)"為N-甲基甘氨酸(也已知為肌氨酸)。肽二聚體的每個(gè)肽單體在單體的半胱氨酸殘基之間包含分子內(nèi)的二硫鍵。此類單體可以圖示地表示如下,、"J~T,~~TT^丄'(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)(AcG)GLYAd;HMGPIT(l-nal)V6QPLR(MeG)或I_乂I、'(SEQ1DN0:3)這些單體的肽二聚化提供具增強(qiáng)的EPO-R激動(dòng)劑活性的肽二聚體。接頭(LK)部分為賴氨酸殘基，其通過同時(shí)連接至每個(gè)單體的C末端M酸而橋接兩個(gè)肽單體的C末端。一個(gè)肽單體在其C末端連接至賴氨酸的￡-氨基，第二肽單體在其C末端連接至賴氨酸的(x-氨基。例如，二聚體在結(jié)構(gòu)上可以示例為如式I所示，并概述為如式n所示20式I式II<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>在式I和式n中，]\2代表賴氨酸￡-氨基的氮原子，并且Ni代表賴氨酸a-氨基的氮原子。本發(fā)明的肽二聚體進(jìn)一步包含下列結(jié)構(gòu)的間隔物部分在一末端，間隔物的W通過酰胺鍵連接至賴氨酸接頭的a^碳上。在相反的末端，間隔物的]\2通過氨基甲酸酯鍵或酰胺鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分，其中所述的PEG具有大約10,000至大約60,000道爾頓的分子量(術(shù)語"大約，，表示在制備PEG時(shí)，一些分子比所述分子量大，一些分子則比所述分子量小)。更加優(yōu)選地，PEG具有大約20，000-40，000道爾頓的分子量。因此，本發(fā)明的新型肽也包含共價(jià)連接至肽二聚體的PEG部分。PEG為可藥用的水溶性聚合物。本發(fā)明所用PEG可以是線性、無分枝、具有大約20千道爾頓(20K)至大約60K(術(shù)語"大約，，表示在制備PEG時(shí)，一些分子比所述分子量大，一些分子則比所述分子量小)分子量的PEG。最優(yōu)選地，PEG具有大約20K至大約40K的分子量，并且仍然更優(yōu)選大約30K至大約40K的分子量。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于下列考慮選擇目的聚合物大小，其中所迷考慮如目的劑量、循環(huán)時(shí)間、對(duì)蛋白水解作用的抵抗力、如果有的話對(duì)生物活性的效果、操作簡(jiǎn)便性、抗原性程度或者缺乏抗原性、以及PEG對(duì)治療肽的其它已知效果。當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體都具有M^列(AcG)GLYACHMGPIT(l畫nal)VCQPLRK(SEQIDNO:1)、并且接頭的Nt通過氨基甲酸酯鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體都具有氨基^列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK(SEQIDNO:1)、并且接頭的Ni通過酰胺鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體都具有M,列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQIDNO:2)、并且接頭的W通過氨基甲酸酯鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下(AcG)GLYAd;HMGPIT(l-加l)V(l:QPLR(MeG)-NHI_NH2NH(AcG)GLYA(^HMGPIT(l-加l)VCQPLR(MeG)-HN,^"NH2-1o眠'p0、VnA—NH'O-PEG2(M0K當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體都具有氨基*列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQIDNO:2)、并且接'頭的W通過酰胺鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下(AcG)GLYAcWGPIT(l-nal)viQPLRCMeG)-NH.2_鵬NH、，0《J。NH(AcG)GLYA(^HMGPIT(l-nal)VCQPL寧eG)—HN'y~MH2-1O本發(fā)明優(yōu)選的肽二聚體包括但不限于<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>(AcG)GLYA(!:HMGPIT(l-nal)viQPLR(MeG)-NH^_朋2NH、，0丫go(AcG)GLYA(pHMGPIT(l-nal)V9QPLR(MeG)—HN'"^-NH2NH(AcG)GLYA(!;HMGPIT(l-nal)V(!;QPLR(MeG)-NHJLnh20丫OONH(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)_HNy~NH2I-10(AcG)GLYA(W[GPrr(l-nal)Wx3PLR(MeG)-NH^1_順2ONH,0NH(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)-HNy~NH2'細(xì)'O-PEG40K(SEQIDNO:2)(SEQIDNO:2)(SEQIDNO:2)(AcG)GLYAcWGPIT(l-nal)V<!;QPLR(MeG)-NHi^_NH20。l人V0TNH(AcG)GLYACHMGPIT(l-加l)VCQPLR(MeG)-HN"^Y"NH21-1o(AcG)GLYA(!:HMGPIT(l-nal)V(!:QPLR(MeG)-NH^^^j^2"。l人ov0T(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)-HN^^NH21-1o(AcG)GLYA(!;HMGPlT(l掘)V古Q]PLR(MeG)-NH^^uj2V0TNH(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPL寧eG)-HN^^-NH21-1o(SEQIDNO:2)(SEQIDNO:2)(SEQIDNO:2)當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體都具有M^列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK(SEQIDNO:1)、并且間隔物的N'和N2都通過氨基甲酸酯鍵共價(jià)連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分時(shí),本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下(AcG)GLYA(!HMGPIT(l-nal)viQPLR-NH￡<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體都具有氨基紗列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK(SEQIDNO:1)、并且間隔物的N1和1\2都通過酰胺鍵共價(jià)連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體都具有餘斷列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQIDNO:2)、并且間隔物的N'和N2都通過氨基甲酸酯鍵共價(jià)連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下I-12(AcG)GLYAC服GPIT(l-nal)V(iQPLR(MeG)~NHjL朋2麗^0O0OyO-PEG10.50K.NHf(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)~HNy~NH2I-10當(dāng)同型二聚體的每個(gè)單體都具有^&*列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQIDNO:2)、并且間隔物的N1和]\2都通過酰胺鍵共價(jià)連接至活化的PEG部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物可以表示如下(AcG)GLYACHMGP即-nal)V(iQPLR(MeG)~nhJLnh20、、h、、w^^nhYhn^peg翻k怖I(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)-HN^-NH2I-1o本發(fā)明優(yōu)選的肽二聚體包括但不限于<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>(AcG)GLYA(!HMGPIT(l-nal)V(!:QPLR-NHJJ_nh2順^QOOyPEG鵬h、、(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR—HN^-NH2I-10YHNPEG2()K-NHJO(AcG)GLYA(iHMGPIT(l-加l)V古QFLR—NH、JL-mh2順v^0八—O、/PEG30KYS。(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR—HN^-NH2I-10YHIMPEG30KO(AcG)GLYA(l;HMGPIT(l-nal)viQPLR-NH^|1~冊(cè)2O，。。。,EG艦(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR-HN^~NH2I-10YHNPEG40KNHITO<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>當(dāng)間隔物通過氨基甲酸酯鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物(SEQIDNO:3)可以表示如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>當(dāng)間隔物通過酰胺鍵連接至活化的聚乙二醇(PEG)部分時(shí)，本發(fā)明的新型肽化合物(SEQIDNO:3)可以表示如下<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>(SEQE)NO:3)(SEQEDNO:3)二十種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸例如a，ct-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、以及其它非常規(guī)氨基酸也可以是本發(fā)明化合物的適當(dāng)組分。非常規(guī)氨基酸的實(shí)例包括但不限于P-丙氨酸、3-吡梵基丙氨酸、4-羥基脯氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-甲基氨基酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲?；琢虬彼?、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、正亮氨酸、以及其它類似的氨基酸和亞氨基酸。其它修飾也是可能的，其中包括氨基末端的修飾、末端的修飾、用非常規(guī)M酸替換一個(gè)或多個(gè)天然存在的遺傳編碼的氨基酸、一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基側(cè)鏈的修飾、肽的磷酸化等。物連接。該類延伸物可以是天然編碼的肽序列，其任選地含有或者基本不含有非天然存在的序列；延伸物可以包括任意添加、刪除、點(diǎn)突變或其它序列修飾、或者本領(lǐng)域技術(shù)人員期望的組合。例如，并且不作為限制，天然存在的序列可以為全長(zhǎng)或部分長(zhǎng)度，并且可以包括氨基酸替換來提供糖類、PEG、其它聚合物等通過側(cè)鏈結(jié)合的連接位點(diǎn)。在一個(gè)變化方案中，氨基酸替換導(dǎo)致序列人源化來使得與人免疫系統(tǒng)相容。提供所有類型的融合蛋白質(zhì)，其中包括與本發(fā)明EPO-R激活序列毗連或鄰近的免疫球蛋白序列，其中含有或不含有非免疫球蛋白間隔序列。一種類型的實(shí)施方案為用EPO-R激活序列替換了重鏈和/或輕鏈可變(V)區(qū)的免疫球蛋白鏈。38本發(fā)明肽化合物的制備農(nóng)時(shí)合成本發(fā)明的肽可以通過本領(lǐng)域已知的經(jīng)典方法制備。這些標(biāo)準(zhǔn)方法包括專用固相合成、局部固相合成法、片段縮合、經(jīng)典的溶液合成以及重組DNA技術(shù)[見，例如MerrifieldJ.Am.Chem.Soc.196385:2149。在一實(shí)施方案中，分別合成肽二聚體的肽單體，并在合成后二聚化。在另一實(shí)施方案中，二聚體的肽單體由其C末端通過支化的叔酰胺接頭Lk部分連接，其中所述的u部分具有能夠作為肽合成起始位點(diǎn)的兩個(gè)官能團(tuán)和能結(jié)合至另一分子部分(例如可以存在于固體支持物的表面)的第三官能團(tuán)(例如羧基或氨基)。在這種情況中，兩個(gè)肽單體可以以變化的固相合成技術(shù)直接在接頭LK部分的兩個(gè)活性氮基團(tuán)上合成。該合成可以是依次的或同時(shí)的。在另一實(shí)施方案中，兩個(gè)肽單體可以以變化的固相合成技術(shù)直接在接頭LK部分的兩個(gè)活性氮基團(tuán)上合成。該合成可以是依次的或同時(shí)的。在這個(gè)實(shí)施方案中，使用的賴氨酸接頭(LK)部分具有兩個(gè)能作為肽合成起始位點(diǎn)的氛基、以及第三個(gè)能結(jié)合至另一分子部分(例如，可以存在于固相支持物的表面)的官能團(tuán)(例如賴氨酸的羧基、或者賴氨酸酰胺的氣基、其中已將氣基轉(zhuǎn)變成酰胺-CONH2的賴氨酸殘基)。當(dāng)在接頭上進(jìn)行二聚體肽鏈的相繼合成時(shí)，用兩個(gè)不同的可正交移去的胺保護(hù)基團(tuán)對(duì)接頭分子上的兩個(gè)胺功能基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)。受保護(hù)的接頭通過接頭的第三個(gè)官能團(tuán)與固相支持物偶聯(lián)。移去第一個(gè)胺保護(hù)基團(tuán)，并在第一個(gè)脫保護(hù)的胺部分上合成二聚體的第一個(gè)肽。然后，移去第二個(gè)胺保護(hù)基團(tuán)，并在第二個(gè)脫保護(hù)的胺部分上合成二聚體的第二個(gè)肽。例如，接頭的第一個(gè)氨基部分可以用Alloc保護(hù)，并且第二個(gè)用Fmoc保護(hù)。在這種情況中，可將Fmoc基團(tuán)(而非Alloc基團(tuán))通過用溫和的堿[例如在二甲基甲酰胺(DMF)中的20%哌啶處理移去，并合成第一條肽鏈。然后用適當(dāng)試劑[例如Pd(PPh3)/4-甲基嗎啉和氯仿移去Alloc基團(tuán)并合成第二條肽鏈。注意，當(dāng)使用不同的用于半胱氨酸的巰基保護(hù)基團(tuán)來控制二石克鍵形成(如下文所述)時(shí)，即使二聚體肽鏈的最終氨基酸序列相同，也必須使用這項(xiàng)技術(shù)。當(dāng)在接頭上同時(shí)合成二聚體的肽鏈時(shí)，用相同的可移去的胺保護(hù)基團(tuán)保護(hù)接頭分子的兩個(gè)胺官能團(tuán)。受保護(hù)的接頭通過接頭的第三個(gè)官能團(tuán)與固體支持物偶聯(lián)。在這種情況中，接頭的兩個(gè)受保護(hù)的官能團(tuán)同時(shí)脫保護(hù)，并且同時(shí)在脫保護(hù)的胺上合成兩條肽鏈。注意，使用這項(xiàng)技術(shù)，二聚體肽鏈的序列將相同，并且用于半胱氨酸殘基的巰基保護(hù)基團(tuán)也都相同。優(yōu)選的肽合成方法為固相合成。固相肽合成法為本領(lǐng)域熟知[見，例如Stewart固相肽合成(FreemanandCo.:SanFrancisco)1969;NovabiochemCorp的2002/2003總目錄，美國(guó)圣地亞哥；GoodmanSynthesisofPeptidesandPeptidomimetics(Houben-Weyl，Stuttgart)2002。在固相合成中，合成一般用a-氨基保護(hù)的樹脂從肽的C末端開始。適當(dāng)?shù)钠鹗嘉镔|(zhì)可以例如通過將所需的a-氨基酸連接至氯甲基化的樹脂、羥甲基樹脂、聚苯乙烯樹脂、二苯甲基胺樹脂等進(jìn)行制備。一種該氯甲基化樹脂為BioRadLaboratories(Richmond,CA)以商品名BIO-BEADSSX-I出售的氯甲基化樹脂。羥甲基樹脂的制備已有描述(Bodonszky等人(1966)Chem.Ind.London38:1597)。二苯甲基胺(BHA)樹脂已有描述PiettaandMarshall(1970)Chem.Commun.650，并且氬氯化物形式可自BeckmanInstruments,Inc.(PaloAlto，CA)商業(yè)獲得。例如，a-氨基保護(hù)的氣基酸可以根據(jù)Gisin(1973)Helv.Chim.Acta56:1467所述的方法借助于碳酸氬銫催化劑偶聯(lián)至氯曱基化樹脂。最初的偶聯(lián)之后，例如在室溫下用在有機(jī)溶劑中的三氟醋酸(TFA)或鹽酸(HC1)溶液移去a-M保護(hù)基團(tuán)。此后，緊接著將a-M保護(hù)的氨基酸偶聯(lián)至延長(zhǎng)的結(jié)合支持物的肽鏈。a-氨基保護(hù)基團(tuán)為那些已知在肽分步合成領(lǐng)域中有用的基團(tuán)，其中包括?；愋偷谋Ｗo(hù)基團(tuán)(例如甲酰基、三氟乙?；?、乙酰基)、芳香的氨基甲酸乙酯類型的保護(hù)基團(tuán)[例如苯甲氧基羰基(Cbz)和取代的Cbz]、脂肪族氨基甲酸乙酯保護(hù)基團(tuán)[例如叔丁氧羰基(Boc)、異丙氧羰基、環(huán)己氧羰基、以及烷基類型的保護(hù)基團(tuán)(例如節(jié)基、三苯甲基)、芴基甲氧羰基(Fmoc)、烯丙氧羰基(Alloc)、和l-(4，4-二曱基-2，6-二氧代環(huán)己-l-亞基)乙基(Dde)。側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)(一般為醚、酯、三苯曱基、PMC等)在偶聯(lián)期間保持完整，并且在氨基末端保護(hù)基團(tuán)脫保護(hù)期間或偶聯(lián)期間不被分開。側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)必須是在完成最終肽合成后、并且在不改變靶肽的反應(yīng)條件下可移去的。Tyr的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)包括四氫吡喃基、叔丁基、三苯甲基、爺基、Cbz、Z-Br-Cbz和2，5-二氯爺基。Asp的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)包括爺基、2，6-二氯爺基、曱基、乙基和環(huán)己基。Thr和Ser的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)包括乙?；?、苯甲?；?、三苯甲基、四氫吡喃基、節(jié)基、2，6-二氯節(jié)基和Cbz。Arg的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)包括硝基、甲苯磺?；?Tos)、Cbz、金剛烷氧基羰基菜?；酋；?Mts)、2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?Pbf)、4-甲氧i-2，3，6-三曱基-苯磺?；?Mtr)或Boc。Lys的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)包括Cbz、2-氯代節(jié)氧羰基(2-Cl-Cbz)、2-溴代節(jié)氧j^(2-Br-Cbz)、Tos或Boc。移去a-氨基保護(hù)基團(tuán)之后，對(duì)剩余的受保護(hù)氬基酸以預(yù)期次序逐步進(jìn)行偶聯(lián)。每個(gè)受保護(hù)的氨基酸通常用適當(dāng)?shù)聂然罨瘎┮匀哆^量進(jìn)行反應(yīng)，其中所述的羧基活化劑例如在溶液例如二氯甲烷(CH2Cl2)、N-甲基p比咯烷酮、二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物中的2-(lH-苯并三唑-l-基)-l,1，3,3四甲基脲每t六氟磷酸鹽(HBTU)或二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。完成目的M酸序列之后，將目的肽通過用試劑例如三氟醋酸(TFA)或氟化氫(HF)處理來從樹脂支持物上脫偶聯(lián)，其中所述試劑不僅從樹脂上切割肽，而且切割所有殘余的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。當(dāng)使用氯甲基化的樹脂時(shí)，氟化氫處理導(dǎo)致形成游離的肽酸。當(dāng)使用二苯甲基胺樹脂時(shí)，氟化氬處理直接產(chǎn)生游離的肽酰胺。備選地，當(dāng)釆用氯甲基化的樹脂時(shí)，側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo(hù)的肽可以通過用氨處理肽樹脂來脫偶聯(lián)，進(jìn)而產(chǎn)生目的側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo(hù)的酰胺，或通過用烷基胺處理，產(chǎn)生側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo(hù)的烷基酰胺或二烷基酰胺。然后以通常方式通過用氟化氫處理移去側(cè)鏈保護(hù)，產(chǎn)生游離的酰胺、烷基酰胺或二烷基酰胺。在制備本發(fā)明的酯時(shí)，釆用用來制備肽酸的樹脂，并用堿和適當(dāng)?shù)拇?例如甲醇)切割側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo(hù)的肽。然后以通常方式通過用氟化氫處理移去側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)來獲得預(yù)期的酯。這些方法也可以用來合成在本發(fā)明任意化合物的一個(gè)、兩個(gè)或多個(gè)位置進(jìn)行了非20個(gè)天然存在的遺傳編碼氨基酸的M酸替代的肽。可以替代入本發(fā)明肽的合成性氨基酸包括但不限于N-甲基、L-羥丙基、L-3，4-二羥苯基丙氨酰、5氨基酸例如L-6-羥基賴氨酰和D-S-曱基丙氨酰、L-a-甲基丙氨酰、p氨基酸和異喹啉基。D-氨基酸和非天然存在的合成性氨基酸也可以摻入本發(fā)明的肽中。庶發(fā)謬也可以修飾本發(fā)明肽化合物的氣基和/或氯基末端來產(chǎn)生本發(fā)明的其它化合物。例如，將氨基末端用乙酸或其卣代衍生物例如a-氯乙酸、a-溴乙酸或a-碘乙酸乙?；?。可以將20個(gè)遺傳編碼的氨基酸(或立體異構(gòu)的D氨基酸)的天然存在側(cè)鏈替換為其它側(cè)鏈，例如用例如烷基、低級(jí)烷基、環(huán)狀的4、5、6至7元烷基、酰胺、酰胺低級(jí)烷基、酰胺二(低級(jí)烷基)、低級(jí)烷氧基、羥基、羧基及其低級(jí)酯衍生物、以及用4、5、6至7元雜環(huán)的基團(tuán)替換。具體而言，可以采用其中將脯氨酸殘基的環(huán)大小從5元變?yōu)?、6或7元的脯氨酸類似物。環(huán)狀基團(tuán)可以是飽和或不飽和的，并且如果是不飽和的話，可以是芳香的或非芳香的。雜環(huán)基團(tuán)優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)氮、氧和/或硫雜原子。該類基團(tuán)的實(shí)例包括呋咱基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪哇啉基、異噻唑基、異噁哇基、嗎啉基(例如嗎啉代)、噁唑基、哌溱基(例如l-嗛溱基)、哌1！^(例如l-哌咬基、哌咬子基)、吡喃基、吡喚基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、峻溱基、吡咬基、嘧咬基、吡p各烷基(例如l-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡p各基、瘞二哇基、蓬唑基、瘞吩基、硫代嗎啉基(例如硫代嗎啉代)和三喳基。這些雜環(huán)基團(tuán)可以是取代或非取代的。當(dāng)基團(tuán)被取代時(shí)，取代基可以是烷基、烷氧基、鹵素、氧、或取代或取代的苯基。可以輕易地通過磷酸化和其它方法修飾肽[例如Hruby等人(1990)BiochemJ.268:249-262所述]。型。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，有多種技術(shù)可以用來構(gòu)建具有與前述肽化合物相同或類似的預(yù)期生物活性、但在溶解性、穩(wěn)定性以及對(duì)水解作用和蛋白水解作用的敏感性上具有比前述化合物更加優(yōu)良的性質(zhì)的化合物見Morgan和Gainor(1989)Ann.Rep.Med.Chem.24:243-252]。這些才支術(shù)包括用由磷酸鹽、酰胺化物、氨基甲酸酯、磺酰胺、仲胺和N-甲基氨基酸組成的主鏈替換肽主鏈。二磁鍵邦賴'本發(fā)明的化合物包含兩個(gè)分子內(nèi)二疏鍵。該二硫鍵可以通過氧化每個(gè)肽單體的半胱氨酸殘基來形成。在一實(shí)施方案中，通過選擇有效優(yōu)化形成預(yù)期異構(gòu)體的氧化劑類型和濃度來對(duì)半胱氨酸鍵的形成進(jìn)行控制。例如，當(dāng)氧化劑為DMSO或碘(I2)時(shí)，優(yōu)先(于形成分子間的二石克鍵)完成肽二聚體的氧化作用來形成兩個(gè)分子內(nèi)的二石克鍵(每條肽鏈上一個(gè))。在其它實(shí)施方案中，半胱氨酸鍵的形成通過在肽合成期間選擇性地使用巰基保護(hù)基團(tuán)來控制。例如，當(dāng)期望含有兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵的二聚體時(shí)，將第一個(gè)單體肽鏈合成為核心序列的兩個(gè)半胱氨酸殘基受第一個(gè)巰基保護(hù)基團(tuán)[例如三苯甲基(Trt)、烯丙氧基羰基(Alloc)和l-(4，4-二甲基-2，6-二氧代環(huán)己-l-亞基)乙基(Dde)等保護(hù)，然后將第二個(gè)單體肽合成為核心序列的兩個(gè)半胱氨酸殘基受不同于第一種巰基保護(hù)基團(tuán)的第二種巰基保護(hù)基團(tuán)[例如乙酰氨基甲基(Acm)、叔丁基(tBu)等保護(hù)。此后，移去第一個(gè)巰基保護(hù)基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)第一個(gè)單體的二硫環(huán)化，然后移去第二個(gè)巰基保護(hù)基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)第二個(gè)單體的二硫環(huán)化。這項(xiàng)發(fā)明的其它實(shí)施方案提供了這些二硫化衍生物的類似物，其中一個(gè)硫用CH2基團(tuán)或者硫的其它isotere進(jìn)行了替換。這些類似物可以自本發(fā)明的化合物進(jìn)行制備，其中每個(gè)肽單體包含至少一個(gè)C或通過用本領(lǐng)域已知方法見例如，Barker等人(1992)J.Med.Chem.35:2040-2048以及Or等人(1991)J.Org.Chem.56:3146-3149進(jìn)行的分子內(nèi)或分子間替換來替換第二個(gè)C殘基的高半胱氨酸殘基和a-氨基個(gè)丁酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易地理解，這種替換也可以用a-M個(gè)丁酸和高半胱氨酸的其它同系物進(jìn)行。除了上述環(huán)化策略外，也可以采用其它非二石克化肽環(huán)化策略。該類備選的環(huán)化策略包括例如酰胺環(huán)化策略和那些涉及形成石克-醚鍵的策略。因此，本發(fā)明的化合物可以呈現(xiàn)為含分子內(nèi)酰胺鍵或分子內(nèi)硫-醚鍵的環(huán)化形式。例如，肽可以合成為其中核心序列的一個(gè)半胱氨酸用賴氨酸替代、并且第二個(gè)半胱氨酸用谷氨酸替代。此后，通過這兩個(gè)殘基側(cè)鏈之間的酰胺鍵形成環(huán)狀單體。備選地，可以將肽合成為其中核心序列的一個(gè)半胱氨酸被替換為賴氨酸(或絲氨酸)。然后通過賴氨酸(或絲氨酸)殘基的側(cè)鏈和核心序列的第二個(gè)半胱氨酸殘基之間的硫-醚鍵形成環(huán)狀單體。如此地，除了二硫化環(huán)化策略外，酰胺環(huán)化策略和硫-醚環(huán)化策略都可以輕易地用來環(huán)化本發(fā)明的化合物。備選地，肽的M末端可以用a-取代的乙酸封端，其中所述的a-取代基為離去基團(tuán)，例如a-卣代乙酸，例如a-氯代乙酸、a-溴代乙酸或a-石典代乙酸。添*爻必^炎凝J^凝興肽單體可以通過支化的叔酰胺接頭部分二聚化。在一實(shí)施方案中，接頭在肽合成期間摻入肽。例如，當(dāng)接頭U部分包含兩個(gè)能夠作為肽合成起始位點(diǎn)的官能團(tuán)以及一個(gè)或多個(gè)能結(jié)合至一個(gè)或多個(gè)其它分子部分的其它官能團(tuán)(例如羧基或氨基)時(shí)，可以將接頭連接至固體支持物。此后，以變化的固相合成技術(shù)直接在接頭LK部分的兩個(gè)活性氮基團(tuán)上合成兩個(gè)肽單體。在備選的實(shí)施方案中，接頭可以在肽合成之后連接至肽二聚體的兩個(gè)肽單體。該連接可以通過本領(lǐng)域熟知的方法完成。在一實(shí)施方案中，接頭包含兩個(gè)適合連接至合成的肽單體的目標(biāo)官能團(tuán)的官能團(tuán)。例如，包含兩一個(gè)的目標(biāo)賴氨酸側(cè)鏈胺基反應(yīng),偶聯(lián)至叔酰胺接頭，A*-dO-CH2畫X-CH2-C20-B*其中X為NCO-(CH2)2-NH-Y,并且Y為適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)例如叔丁氧羰基(Boc)保護(hù)基團(tuán)；入*為用來將接頭的C1連接至第一肽單體C末端賴氨酸殘基的s-氨基的適當(dāng)官能團(tuán)例如N-氧基琥珀酰亞胺，并且8*為用來將接頭的d連接至第二肽單體C末端賴氨酸殘基的s-氨基的適當(dāng)官能團(tuán)，例如N-氧基琥珀酰亞胺。此外，例如，肽單體可以化學(xué)偶聯(lián)至叔酰胺接頭，A*-C，OCH2曙X國(guó)CH2畫C20-B*其中X為NCO-(CH2)2-NH-C30，人*為用來將接頭的C1連接至第一肽單體C末端賴氨酸殘基的￡-氨基的適當(dāng)官能團(tuán)，例如N-氧基琥珀酰亞胺；并且8*為用來將接頭的d連接至第二肽單體C末端賴氨酸殘基的s-氨基的適當(dāng)官能團(tuán)，例如N-氧基琥珀酰亞胺；并且叔酰胺接頭化學(xué)結(jié)合至間隔物部分，Y-NH-(CH2)4C4H-NH-Y其中X的C^共價(jià)鍵合至間隔物的C45并且Y為適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)，例如叔丁氧羰基(Boc)保護(hù)基團(tuán)。添血艦?zāi)d肽單體可以通過賴氨酸接頭LK部分二聚化。在一實(shí)施方案中，賴氨酸接頭在肽合成期間摻入肽。例如，當(dāng)賴氨酸接頭LK部分包含兩個(gè)能夠作為肽合成起始位點(diǎn)的官能團(tuán)以及第三個(gè)能夠結(jié)合至另一分子部分的官能團(tuán)(例如氛基或氬基)時(shí)，接頭可以被連接至固體支持物。此后，可以以變化的固相合成技術(shù)直接在賴氨酸接頭LK部分的兩個(gè)活性氮基團(tuán)上合成兩個(gè)肽單體。在其中肽二聚體通過賴氨酸接頭LK部分二聚化的備選實(shí)施方案中，所述接頭可以在肽合成之后連接至肽二聚體的兩個(gè)肽單體。該連接可以通過本領(lǐng)域熟知的方法完成。在一實(shí)施方案中，接頭包含至少兩個(gè)適合連接至合成的肽單體的目標(biāo)官能團(tuán)的官能團(tuán)。例如，賴氨酸的兩個(gè)游離胺基可以與兩個(gè)肽單體中每一個(gè)肽單體c末端的皿反應(yīng)。添*/巧腐參本發(fā)明的肽化合物進(jìn)一步包含間隔物部分。在一實(shí)施方案中，間隔物可在肽合成期間摻入肽。例如，當(dāng)間隔物含有游離氨基以及第二個(gè)能結(jié)合至另一分子部分的官能團(tuán)(例如g或氨基)時(shí)，間隔物可以被連接至固體支持物。在一實(shí)施方案中，含有兩個(gè)官能團(tuán)的間隔物首先通過第一個(gè)官能團(tuán)偶聯(lián)至固體支持物上。接下來，將具有兩個(gè)能作為肽合成起始位點(diǎn)的官能團(tuán)和第三個(gè)能結(jié)合至另一分子部分的官能團(tuán)(例如羧基或氨基)的賴氨酸接頭LK部分通過間隔物的第二個(gè)官能團(tuán)和接頭的第三個(gè)官能團(tuán)綴合至間隔物。此后，可以以變化的固相合成技術(shù)直接在接頭LK部分的兩個(gè)活性氮基團(tuán)上合成兩個(gè)肽單體。例如，偶聯(lián)了具游離胺基的間隔物的固體支持物可以通過接頭的游離M與賴氨酸接頭反應(yīng)。在備選的實(shí)施方案中，間隔物可以在肽合成之后綴合至肽二聚體。該綴合可以通過本領(lǐng)域熟知的方法完成。在一實(shí)施方案中，接頭含有至少一個(gè)適合連接至所合成肽的目標(biāo)官能團(tuán)的官能團(tuán)。例如，具游離胺基的間隔物可以與肽的C末端g反應(yīng)。在另一實(shí)例中，具游離氣基的接頭可以與賴氨酸酰胺的游離胺基反應(yīng)。褒乙二寧#迷接近年來，水溶性聚合物例如聚乙二醇(PEG)已經(jīng)用于具重要治療和診斷意義的肽的共價(jià)修飾。認(rèn)為此類聚合物的連接增強(qiáng)生物學(xué)活性、延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間、降低免疫原性、增加水溶性、以及增強(qiáng)對(duì)蛋白酶消化的抵抗力。例如，已經(jīng)報(bào)道，PEG共價(jià)連接至治療性多肽例如白細(xì)胞介素[Knauf等人(1988)J.Biol.Chem.263;15064;Tsutsumi等人(1995)J.ControlledRelease33:447)、干擾素(Kita等人(19卯)DrugDes.Delivery6:157)、過氧化氬酶(Abuchowski等人(1977)J.Biol.Chem.252:582)、超氧化物歧化酶(Beauchamp等人(1983)Anal.Biochem.131:25)以及腺苷脫氨酶(Chen等人(1981)Biochim.Bi叩hy.ActaM0:293)延長(zhǎng)了它們?cè)隗w內(nèi)的半衰期、和/或降寸氐了它們的免疫原性和抗原性。本發(fā)明的肽化合物可以包含聚乙二醇(PEG)部分，其通過氨基甲酸酯鍵或酰胺鍵共價(jià)連接至肽二聚體的支化叔酰胺接頭或間隔物。用于本發(fā)明的PEG的實(shí)例是線性、無分支、具有大約20千道爾頓(20K)至大約40K(術(shù)語"大約"表示在制備PEG時(shí)，一些分子比所述分子量大，一些分子則比所述分子量小)分子量的PEG。優(yōu)選地，PEG具有大約30K至大約40K的分子量。用于本發(fā)明的PEG的另一實(shí)例是線性、具有大約10K至大約60K(術(shù)語"大約"表示在制備PEG時(shí)，一些分子比所述分子量大，一些分子則比所述分子量小)分子量的PEG。優(yōu)選地，PEG具有大約20K至大約40K的分子量。更加優(yōu)選地，PEG具有大約20K的分子量。下文描述了PEG共價(jià)連接(PEG化)的方法。這些示例性描述不用作限制。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，在本領(lǐng)域中已很好地建立了多種進(jìn)行大范圍PEG共價(jià)連接的方法。因此，通過本領(lǐng)域已知的多種連接方法中的任意一種方法使PEG連接的肽化合物都包含在本發(fā)明中。例如，PEG可以通過活化的PEG分子可結(jié)合的活性基團(tuán)(例如游離的氣基或氣基)而共價(jià)結(jié)合至接頭。PEG分子可以用具不同活性部分的甲氧基化PEG("mPEG")連接至氨基。此類聚合物包括mPEG-琥珀酰亞胺基丁二酸酯、mPEG-琥珀酰亞胺基碳酸酯、mPEG-亞酰胺化物、mPEG-4-硝基苯基碳酸酯以及mPEG-氰尿酰氯。相似地，PEG分子可以使用具游離胺基的甲氧基化PEG(mPEG-NH2)來連接至g。在一些實(shí)施方案中，接頭或間隔物含有末端氨基(即定位于間隔物的末端)。這個(gè)末端氨基可以與適當(dāng)活化的PEG分子例如mPEG-對(duì)硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)反應(yīng)來形成穩(wěn)定共價(jià)的氨基甲酸酯鍵。備選地，這個(gè)末端氨基可以與適當(dāng)活化的PEG分子例如含有活性的N-羥基-琥珀酰亞胺(NHS)基團(tuán)的mPEG-琥珀酰亞胺基丁酸酯(mPEG-SBA)或mPEG-琥珀酰亞胺基丙酸酯(mPEG-SPA)反應(yīng)來產(chǎn)生穩(wěn)定共價(jià)的氨基曱酸酯鍵。在其它實(shí)施方案中，接頭活性基團(tuán)含有的羧基能在適當(dāng)反應(yīng)條件下被激活而與含胺的PEG分子形成共價(jià)鍵。適當(dāng)?shù)腜EG分子包括mPEG-NH2，并且適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件包括碳二亞胺介導(dǎo)的酰胺形成等。EPO-R激動(dòng)劑活性測(cè)試體外的竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)試對(duì)測(cè)試肽與EPO竟?fàn)幗Y(jié)合EPO-R的能力進(jìn)行定量。例如(見，例如美國(guó)專利5，773，569中所述)，可在大腸桿菌中重組產(chǎn)生人EPO-R的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(EPO結(jié)合蛋白質(zhì)，EBP),并將重組的蛋白質(zhì)偶聯(lián)至固體支持物例如微滴定血或合成的珠子[例如PierceChemicalCo.(Rockford，IL)的Sulfolink珠子l。然后將固定的EBP與標(biāo)記的重組EPO或與標(biāo)記的重組EPO和測(cè)試肽孵育。該實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)試肽釆取連續(xù)稀釋。用未加入測(cè)試肽的測(cè)試點(diǎn)定義結(jié)合EBP的總EPO。對(duì)于包含測(cè)試肽的反應(yīng)，對(duì)結(jié)合的EPO量進(jìn)行定量，并表達(dá)為相對(duì)對(duì)照(總量=100%)結(jié)合的百分?jǐn)?shù)。將這些值相對(duì)肽濃度作圖。IC50值定義為將EPO與EBP的結(jié)合降低50%(即50°/。抑制EPO結(jié)合)的測(cè)試肽濃度。不同的體外竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)試檢測(cè)作為兩種珠子接近的函數(shù)所產(chǎn)生的光信號(hào)，其中所述的兩種珠子為綴合EPO的珠子和綴合EPO-R的珠子。珠子的接近由EPO和EPO-R的結(jié)合產(chǎn)生。竟?fàn)嶦PO結(jié)合EPO-R的測(cè)試肽阻止這種結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致光發(fā)射的下降。將導(dǎo)致光發(fā)射下降50%的測(cè)試肽濃度定義為IC50值。本發(fā)明的肽非常有效地竟?fàn)嶦PO與EPO-R的結(jié)合。這種增強(qiáng)的功能用它們?cè)谙喈?dāng)?shù)偷碾臐舛纫种艵PO結(jié)合(即它們具有非常低的IC50值)的能力來表示。本發(fā)明特異結(jié)合EPO受體的單體和二聚體的肽EPO-R激動(dòng)劑的生物活性和潛能可以用體外基于細(xì)胞的功能測(cè)試來檢測(cè)。一個(gè)測(cè)試基于表itAEPO-R并且進(jìn)一步轉(zhuǎn)染了fos啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體的鼠前B細(xì)胞系。在暴露于EPO或另一EPO-R激動(dòng)劑后，該細(xì)胞應(yīng)答合成螢光素酶。螢光素酶在加入其底物螢光素后導(dǎo)致光發(fā)射。因此，在該細(xì)胞中EPO-R的活化水平可以通過測(cè)定螢光素酶活性來定量。測(cè)試肽的活性通過向細(xì)胞中加入連續(xù)稀釋的測(cè)試肽、然后孵育4小時(shí)來測(cè)定。孵育之后，向細(xì)胞加入螢光素底物，并測(cè)試光的發(fā)射。將導(dǎo)致光最大發(fā)射值一半的測(cè)試肽濃度記錄為EC50。在這項(xiàng)測(cè)試中，本發(fā)明的肽表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的促進(jìn)EPO-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴的螢光素酶表達(dá)的能力。這種增強(qiáng)的功能通過其在相當(dāng)?shù)偷碾臐舛犬a(chǎn)生最大螢光素酶活性的一半的能力(即它們具有非常低的EC50值)來表示。這項(xiàng)測(cè)試是評(píng)價(jià)本發(fā)明EPO-R激動(dòng)劑肽的潛能和活性的優(yōu)選方法。另一測(cè)試可以用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了EPO-R的FDC-P1/ER細(xì)胞[Dexter等人(1980)J.Exp.Med.152:1036-1047來進(jìn)行，其中所述的細(xì)胞為已充分表征的非轉(zhuǎn)化的鼠骨髓衍生的細(xì)胞系。這些細(xì)胞呈現(xiàn)EPO依賴性增殖。在一個(gè)此種該測(cè)試中，將細(xì)胞在存在必需生長(zhǎng)因子(見，例如美國(guó)專利5，773，569中所述)下生長(zhǎng)至半穩(wěn)定密度。然后將細(xì)胞在PBS中洗滌，并在無生長(zhǎng)因子的全培養(yǎng)基中々幾餓16-24小時(shí)。測(cè)定細(xì)胞生存力(例如通過臺(tái)盼藍(lán)染色)之后，用母液(在無生長(zhǎng)因子的全培養(yǎng)基中)制成大約每50nL105個(gè)細(xì)胞。在96孔組織培養(yǎng)板中將待測(cè)試的肽EPO-R激動(dòng)劑化合物(一般為與噬菌體結(jié)合或其它結(jié)合或固定的肽相反的游離溶液相肽)的連續(xù)稀釋物制成每孔終體積50jiL。向每孔中加入細(xì)胞(50fiL)，并將細(xì)胞孵育24-48小時(shí)，此時(shí)陰性對(duì)照應(yīng)該死亡或休眠。然后通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)測(cè)定細(xì)胞增殖，其中所述技術(shù)例如測(cè)試作為細(xì)胞增殖指標(biāo)的H、胸苷摻入的MTT測(cè)試見Mosmann(1983)J.Immunol.Methods65:55-63。在EPO-R表達(dá)細(xì)胞系和親本的非表達(dá)細(xì)胞系中都對(duì)肽進(jìn)行評(píng)估。將測(cè)試肽產(chǎn)生細(xì)胞增殖最大值一半所必需的濃度記錄為EC50。在這個(gè)測(cè)試中，本發(fā)明的肽表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的促進(jìn)EPO依賴的細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。這種增強(qiáng)的功能通過它們?cè)谙喈?dāng)?shù)偷碾臐舛犬a(chǎn)生最大細(xì)胞增殖刺激活性一半的能力(即它們具有非常低的EC50值)來表示。這個(gè)測(cè)試是評(píng)估本發(fā)明的EPO-R激動(dòng)劑肽的潛能和活性的優(yōu)選方法。在另一測(cè)試中，將細(xì)胞在補(bǔ)充了EPO的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至穩(wěn)定期，收集，然后在無EPO的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)18小時(shí)。將細(xì)胞分成等細(xì)胞密度的三組。一組不加入因子(陰性對(duì)照)，一組加EPO(陽性對(duì)照)，且實(shí)驗(yàn)組加入測(cè)試肽。然后在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行收集、固定、并用DNA結(jié)合的熒光染料(例如捵化丙啶或Hoechst染料，兩者Sigma均有售)染色。然后例如用FACS掃描流式細(xì)I包儀測(cè)定熒光。然后，例如用CeIEFIT軟件(BectonDickinson)的SOBR模型測(cè)定細(xì)胞周期每個(gè)時(shí)期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。用(通過作為增加的DNA含量指示物的增加的熒光而測(cè)定)。相似的測(cè)試可以用FDCP-1[見，例如Dexter等人(1980)J.Exp.Med.152:1036-1047j或TF曙l[Kitamura等人(1989)Blood73:375-380細(xì)胞系進(jìn)行。FDCP-1是生長(zhǎng)因子依賴性鼠多潛能的原始造血祖細(xì)胞系，當(dāng)補(bǔ)充WEHI-3條件培養(yǎng)基(包含IL-3的培養(yǎng)基，ATCC編號(hào)TIB-68)時(shí)，其能增殖，但不能分化。對(duì)于該類實(shí)驗(yàn)，對(duì)FDCP-1細(xì)胞系轉(zhuǎn)染人或鼠EPO-R來分別產(chǎn)生在存在EPO時(shí)能增殖但不能分化的FDCP-l-hEPO-R或FDCP-l-mEPO-R細(xì)胞系。也可以用EPO依賴性細(xì)胞系TF-1來測(cè)定肽EPO-R激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞增殖的效果。又在另一測(cè)試中，可以采用Krystal(1983)Exp.Hematol11:649-660中所述的基于H、胸苷摻入脾細(xì)胞的微陣列的方法來確定本發(fā)明化合物作為EPO激動(dòng)劑的能力。簡(jiǎn)而言之，對(duì)B6C3Ft小鼠每天注射苯肼(60mg/kg),注射兩天。在第三天，取出脾細(xì)胞并用MTT測(cè)試法確定其在24小時(shí)期間的增殖能力。在促紅細(xì)胞生成素應(yīng)答的細(xì)胞系中EPO與EPO-R的結(jié)合i秀導(dǎo)受體和多種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化，其中所述的蛋白質(zhì)包括Shc、vav和JAK2激酶。因此，另一體外測(cè)試檢測(cè)本發(fā)明肽誘導(dǎo)EPO-R和下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的能力。通過上述結(jié)合和增殖測(cè)試鑒定的活性肽引起的磷酸化模式與促紅細(xì)胞生成素應(yīng)答的細(xì)胞中EPO引起的模式幾乎完全相同。對(duì)于這項(xiàng)測(cè)試，將FDC-P1/ER細(xì)胞[Dexter等人(1980)JExpMed152:1036-47維持在補(bǔ)充了EPO的培養(yǎng)基中，并生長(zhǎng)至穩(wěn)定期。然后在無EPO的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細(xì)胞24小時(shí)。然后將確定數(shù)目的這類細(xì)胞在37。C與測(cè)試肽孵育大約10分鐘。具EPO的細(xì)胞對(duì)照樣品也進(jìn)行每項(xiàng)測(cè)試。然后將處理的細(xì)胞通過離心收集，重懸在SDS裂解緩沖液中，并進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。將在凝膠中電泳移動(dòng)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，并通過標(biāo)準(zhǔn)免疫技術(shù)顯示印跡上含磷酸酪氨酸的蛋白質(zhì)。例如，印跡可以用抗磷酸酪氨酸的抗體(例如UpstateBiotechnology,Inc.的小鼠抗磷酸酪氨酸IgG)探測(cè)、洗滌、然后用二抗[例如1<^1^經(jīng)33^&PerryLaboratories,Inc.(Washington,DC)過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG探測(cè)。此后，通過包括色度、化學(xué)發(fā)光或熒光檢測(cè)在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)顯示含磷酸酪氨酸的蛋白質(zhì)。例如，用Amersham的ECLWestern印跡系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)試。另一可以用來評(píng)估本發(fā)明肽活性的基于細(xì)胞的體外測(cè)試為使用鼠骨髓或人外周血細(xì)胞的集落測(cè)試。鼠骨髓可從小鼠股骨獲得，而人外周血樣品從健康受體獲得。在外周血的情況中，先例如通過Fieoll-Hypaque梯度離心[StemCellTechnologies,Inc.(Vancouver,Canada)I^yuk液中分離單核細(xì)胞。對(duì)于這個(gè)測(cè)試，對(duì)有核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)來確定原始樣品中有核細(xì)胞的數(shù)量和濃度。將確定數(shù)量的細(xì)胞按照廠商說明書在甲基纖維素膜上鋪板[StemCellTechnologies,Inc.(Vancouver,Canada)]。實(shí)驗(yàn)組用測(cè)試肽處理，陽性對(duì)照組用EPO處理，并且陰性對(duì)照組不進(jìn)行處理。然后在確定的孵育期通常為10天和18天之后計(jì)數(shù)每組生長(zhǎng)的集落的數(shù)目。活性肽將促進(jìn)集落形成。在Greenberger等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:2931-2935(EPO-dependenthematopoieticprogenitorcellline)、Quelle和Wojchowski(1991)J.Biol.Chem.266:609-614(proteintyrosinephosphorylationinB6SUt,EPcells)、Dusanter-Fourt等人(1992)J.Biol.Chem.287:10670-10678(tyrosinephosphorylationofEPO畫receptorinhumanEPO-responsivecells)、Quelle等人(1992)J.Biol.Chem.267:17055-17060(tyrosinephosphorylationofacytosolicprotein,pp100,inF.DC-ERcells)、Worthington等人(1987)Exp.Hematol.15:85-92(colorimetricassayforhemoglobin)、Kaiho和Miuno(1985)Anal.Biochem.149:117-120(detectionofhemoglobinwith2，7-diaminofluorene)、Patel等人(1992)J.Biol.Chem.267:21300-21302(expressionofc-myb)、W她uhn等人(1993)Cell74:227-236(associationandtyrosinephosphorylationofJAK2)、Leonard等人(1993)Blood82:1071-1079(expressionofGATAtranscriptionfactors)以及Ando等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:9571-9575(regulationofGitransitionbycyclingD2andD3)中公開了其它可以用來顯示本發(fā)明化合物活性的體外生物學(xué)測(cè)試。已經(jīng)才艮道，由MolecularDevicesCorp.i殳計(jì)的已知為Microphysiometer的裝置成功地用于測(cè)試激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)多種受體的效果。這種裝置的基礎(chǔ)是測(cè)試響應(yīng)受體活化后細(xì)胞外介質(zhì)的酸化率的改變。一種能用來評(píng)估測(cè)試肽潛能的體內(nèi)功能測(cè)試是紅細(xì)胞增多的低氧小鼠生物測(cè)試。對(duì)于這項(xiàng)測(cè)試，對(duì)小鼠進(jìn)行幾天變化的條件周期。在這個(gè)周期中，小鼠在低壓條件期間和環(huán)境壓力條件期間之間變化。此后，在施用測(cè)試樣品之前將小鼠維持在環(huán)境壓力2-3天。將測(cè)試肽樣品或者陽性對(duì)照小鼠情況下的EPO標(biāo)準(zhǔn)品皮下注射入受調(diào)節(jié)過的小鼠。兩天之后施用i文射性標(biāo)記的離子(例如外Fe),并在施用放射性標(biāo)記的鐵兩天后釆:IUL液樣品。然后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定每個(gè)血液樣品的血細(xì)胞比容和放射性。來自注射了活性測(cè)試肽的小鼠的血液樣品將比未接受測(cè)試肽或EPO的小鼠顯示更大的放射性(由于紅細(xì)胞血紅蛋白結(jié)合Fe59)。另一可以用來評(píng)估測(cè)試肽潛能的體內(nèi)功能測(cè)試是網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)試。對(duì)于這項(xiàng)測(cè)試，連續(xù)三天對(duì)正常未作處理的小鼠皮下注射EPO或測(cè)試肽。在第三天，也向小鼠腹膜內(nèi)注射葡聚糖鐵。在第五天，從小鼠收集血液樣品。通過瘞喳橙染色和流式細(xì)胞儀分析(網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)程序)測(cè)定血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(％)。此外，手動(dòng)測(cè)定血細(xì)胞比容。校正的網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)用下列公式確定%網(wǎng)織紅細(xì)胞校正的-%網(wǎng)織紅細(xì)胞觀察的X(血細(xì)胞比容個(gè)體的/血細(xì)胞比《正常的)活性的測(cè)試化合物將顯示相比未接受測(cè)試肽或EPO的小鼠增加的％網(wǎng)織紅細(xì)胞校正的水平。本發(fā)明的EPO-R激動(dòng)劑肽的用途本發(fā)明的肽化合物作為在體外理解EPO生物學(xué)作用的工具非常有用，其中包括評(píng)估許多認(rèn)為影響EPO產(chǎn)生和EPO與EPO-R結(jié)合的因子以及被EPO產(chǎn)生和EPO與EPO-R結(jié)合影響的因子(例如EPO/EPO-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/受體激活的機(jī)制)。本發(fā)明肽也在研發(fā)其它結(jié)合EPO-R的化合物中有用，因?yàn)楸景l(fā)明的化合物提供了重要的促進(jìn)研發(fā)的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系的信此外，基于它們結(jié)合EPO-R的能力，本發(fā)明的肽能夠用作檢測(cè)活細(xì)胞上、固定的細(xì)胞上、生物學(xué)液體中、組織勻漿中、純化的天然生物學(xué)材料等中的EPO-R的試劑。例如，通過標(biāo)記此類肽，可以鑒定在其表面上具有EPO-R的細(xì)胞。此外，基于其結(jié)合EPO-R的能力，本發(fā)明的肽可以用于原位染色、FACS(熒光激活的細(xì)胞分選)分析、Western印跡、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試)等等。此外，基于其結(jié)合EPO-R的能力，本發(fā)明的肽可以用于受體純化或純化在細(xì)胞表面(或在透化處理的細(xì)胞內(nèi)部)表達(dá)EPO-R的細(xì)胞。本發(fā)明的肽也可以用作多種醫(yī)學(xué)研究和診斷目的的商業(yè)試劑。此類用途包括但不限于(l)在多種功能測(cè)試中作為定量候選的EPO-R激動(dòng)劑活性的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的用途；(2)在隨機(jī)肽篩選即在尋找EPO-R肽配體新家族中作為阻斷試劑的用途，肽可以用來阻斷本發(fā)明EPO肽的回收；(3)在與EPO-R共結(jié)晶中的用途，即可以形成結(jié)合至EPO-R的本發(fā)明肽的晶體，使得能夠通過X射線結(jié)晶學(xué)確定受體/肽的結(jié)構(gòu)；(4)測(cè)定紅細(xì)胞前體細(xì)胞通過啟動(dòng)分化而誘導(dǎo)珠蛋白合成和血紅素復(fù)合體合成的能力的用途、以及增加鐵蛋白受體數(shù)量的用途；(5)維持EPO-依賴性細(xì)胞系例如FDCP-l-mEPO-R和TF-1細(xì)胞系的增殖和生長(zhǎng)的用途；(6)涉及用放射性發(fā)色團(tuán)標(biāo)記本發(fā)明肽的用途；以及(7)其它研究和診斷應(yīng)用，其中EPO-R優(yōu)選為活化的，或者此種活化方便地校準(zhǔn)已知量的EPO-R激動(dòng)劑等。此外，在本發(fā)明的另一方面，提供了治療和制備藥物的方法。可以將本發(fā)明的肽化合物施用至包括人在內(nèi)的溫血?jiǎng)游飦碓隗w內(nèi)模擬EPO與EPO-R的結(jié)合。因此，本發(fā)明包含治療性治療與EPO缺陷相關(guān)的疾病的方法，其中所述方法包括施用足以在體內(nèi)刺激EPO-R、并因此減輕與EPO缺陷相關(guān)的癥狀的量的本發(fā)明肽。例如，本發(fā)明的肽在治療腎功能不足和/或末期腎衰竭/透析、與AIDS相關(guān)的貧血、與慢性炎癥疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和慢性腸炎)相關(guān)的貧血以及自身免疫疾病，以及在外科手術(shù)前增加患者的血紅細(xì)胞數(shù)量中發(fā)現(xiàn)有用。其它可通過施用本發(fā)明肽治療的疾病狀態(tài)、疾病和血液異常病癥包括p-地中海貧血、嚢性纖維化、妊娠和月經(jīng)性疾病、早產(chǎn)兒早期貧血、脊髓損傷、宇宙飛行所致疾病、急性血液損失、衰老、中風(fēng)、局部缺血(CNS局部缺血和心局部缺血)、以及多種伴隨異常紅細(xì)胞生成的腫瘤疾病。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽化合物可以用來治療不具有低或缺陷的血紅細(xì)胞特征的疾病，例如在輸液前的預(yù)處理。此外，施用本發(fā)明的化合物可以使流血時(shí)間縮短，并因此在患者外科手術(shù)前施用或者在指示預(yù)計(jì)發(fā)生流血中發(fā)現(xiàn)有用。此外，本發(fā)明的化合物在活化巨核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有用。由于已經(jīng)表明EPO對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有促有絲分裂和趨化性作用、并且對(duì)中樞膽堿能神經(jīng)元有作用[見，例如Amagnostou等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:5978-5982和Konishi等人(1993)BrainRes.609:29-35，所以這項(xiàng)發(fā)明的化合物也在治療多種血管疾病中發(fā)現(xiàn)有用，例如促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)側(cè)枝冠狀血管(例如那些在心肌梗塞后出現(xiàn)的血管)的生長(zhǎng)、創(chuàng)傷治療以及血管移植后的治療。這項(xiàng)發(fā)明的化合物也在治療多種神經(jīng)性疾病中發(fā)現(xiàn)有用，其中所述疾病通常以低的乙酰膽堿絕對(duì)水平或者與其它神經(jīng)活性物質(zhì)例如神經(jīng)遞質(zhì)相比低的乙酰膽堿相對(duì)水平作為特征。藥物組合物此外，在本發(fā)明的另一方面，提供了上述EPO-R激動(dòng)劑肽化合物的藥物組合物。通過施用此類組合物緩和或調(diào)節(jié)的病癥包括上文所述的那些病癥。此類藥物組合物可以通過經(jīng)口的、腸胃外的(肌內(nèi)的、自內(nèi)的、靜脈內(nèi)的(IV)或皮下的注射)、經(jīng)皮的(被動(dòng)或者使用離子電滲療法或電穿孔法)、經(jīng)黏膜的(鼻的、陰道的、直腸的或舌下的)給藥途徑或使用可生物蝕解的嵌入體進(jìn)行施用，并且可以制劑成適合每種施用途徑的劑型。一般而言，本發(fā)明包含的藥物組合物包含有效量的本發(fā)明EPO-R激動(dòng)劑肽或衍生產(chǎn)物、以及可藥用稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。此類組合物包括多種緩沖物成分(例如Tris-HCl、醋酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強(qiáng)度的稀釋劑、添加劑例如去污劑和增溶劑(例如吐溫20、吐溫80、聚山梨酸酯80)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氬鈉)、T方腐劑(例如硫柳汞、節(jié)醇)和增容物質(zhì)(例如乳糖、甘露醇)、摻入聚合化合物微粒制劑或脂質(zhì)體的物質(zhì)，其中所述聚合化合物例如聚乳酸、聚羥乙酸等。也可以使用透明質(zhì)酸(hylauronicacid)。此類組合物可以影響本發(fā)明蛋白質(zhì)和衍生物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放率和體內(nèi)清除率。見，例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版(1990，MackPublishingCo"Easton，PA18042)1435-1712頁，其在此處引入作為參考。組合物可以制備成液體形式，或者干粉(例如冷凍干燥的)形式。經(jīng)口遽這本文考慮的用途為通常在Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版19卯(MackPublishingCo.EastonPA18042)89章中描述的經(jīng)口的固體劑型，其中所述文獻(xiàn)在此處引入作為參考。固體劑型包括片劑、膠嚢劑、丸劑、糖錠劑或錠劑、扁嚢劑、小丸劑、粉末劑或顆粒劑。此外，脂質(zhì)體或類蛋白膠嚢化可以用來制劑本組合物(例如美國(guó)專利號(hào)4,925,673中報(bào)道的類蛋白小球體)。可以使用脂質(zhì)體的膠嚢化，并且可以用多種聚合物衍生脂質(zhì)體(例如美國(guó)專利號(hào)5,013,556)。在由G.S.Banker和CT.Rhodes編輯的ModernPharmaceutics第10章，1979中Marshall,K給出了進(jìn)行治療的可能固體劑型的描述，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。一般而言，制劑包括EPO-R激動(dòng)劑肽(或其化學(xué)修飾形式)和提供針對(duì)胃環(huán)境的防護(hù)的惰性成份，并且在腸中釋放生物活性物質(zhì)。本文還考慮的用途為經(jīng)口施用的液體劑型，包括可藥用的乳劑、溶液劑、懸浮液和糖漿劑(其可含有其它組分，包括惰性稀釋劑)、佐劑例如濕潤(rùn)劑、乳化劑和懸浮劑、以及甜化劑、調(diào)味劑和加香劑?？梢詫?duì)肽進(jìn)行化學(xué)修飾以便有效地經(jīng)口遞送衍生物。一般而言，考慮的化學(xué)修^飾為將至少一個(gè)部分連接至組分分子本身，其中所述部分允許(a)抑制蛋白水解作用、以及(b)從胃或腸中吸收進(jìn)入血流。也預(yù)期組分的總體穩(wěn)定性增加，并且在身體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間增加。如上所述，對(duì)于藥物用途，PEG化是優(yōu)選的化學(xué)修飾?？梢允褂玫钠渌糠职ū?、乙二醇和丙二醇的共聚體、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚脯氨酸、聚-l，3-二氧戊烷和聚-l，3，6-tioxocane[見，例如Abuchowski和Davis(1981)"SolublePolymer-EnzymeAdducts，"在Hocenberg和Roberts編輯的EnzymesasDrugs—書中(AViIey-Interscience:NewYork,NY)pp.367-383;以及Newmark等人(1982)J.Appl.Biochem.4:185-189。對(duì)于經(jīng)口制劑，釋放位置可以是胃、小腸(十二指腸、空腸或回腸)或大腸。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有不在胃中溶解、但在十二指腸或腸的其它位置釋》文物質(zhì)的可用制劑。優(yōu)選地，通過保護(hù)肽(或^f汙生物)或通過遠(yuǎn)離胃環(huán)境例如在腸中釋放肽(或衍生物)來避免釋放對(duì)胃環(huán)境的有害作用。為了保證充分的胃抗性，至少pH5.0不能通透的包衣是必需的。更加常見的用作腸包衣的惰性成份的實(shí)例為偏苯三酸乙酸纖維素(CAT)、羥丙基甲基纖維素鄰苯二曱酸酯(HPMCP)、HPMCP50、HPMCP55、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸乙烯酯(PVAP)、EudragitL30:D、Aquateric、醋酸鄰苯二甲酸纖維素(CAP)、EudragitL、EudragitS和Shellac。也可以在片劑上使用一種包衣或包衣的混合物，其中所述一種包衣或包衣混合物不是用來針對(duì)胃進(jìn)行防護(hù)的。這可以包括糖包衣或者使片劑更容易吞咽的包衣。膠嚢可以由遞送干治療物(即粉末)的硬殼(例如明膠)組成，對(duì)于液體形式則可以使用軟明膠殼。扁嚢劑的外殼材料可以是稠淀粉或其它可食用的紙。對(duì)于丸劑、錠劑、成型的片劑或片劑研磨劑，可以使用濕潤(rùn)集塊技術(shù)(moistmassingtechnique)。肽(或衍生物)可以以細(xì)小的多微粒包括在制劑中，在顆粒劑或片劑中為大約lmm顆粒大小。進(jìn)行膠嚢施用的物質(zhì)的制劑也可以為粉末、輕度壓縮的栓劑或者甚至是片劑。這些治療劑可以通過壓縮制備。也可以包括著色劑和/或調(diào)味劑。例如，可以對(duì)肽(或衍生物)進(jìn)行制劑(例如通過脂質(zhì)體或小球體膠嚢化)，然后進(jìn)一步在其中包含可食用的產(chǎn)物，例如包含著色劑和調(diào)味劑的冷藏飲料?？梢杂枚栊晕镔|(zhì)稀釋或增加肽(或衍生物)的體積。這些稀釋劑包括糖類，尤其是甘露醇、a-乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。一些無機(jī)鹽也可以用作填充劑，其中包括三磷酸鉤、碳酸鎂和氯化鈉。一些商品化的稀釋劑為Fast-Flo、Emdex、STA-Rxl500、Emcompress和Avicell。在治療性制劑中崩解劑可以包含入固體劑型。用作崩解劑的物質(zhì)包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的市售崩解劑Explotab。淀粉甘醇酸鈉、Amberlite、羧甲基纖維素納、ultramylopectin、海藻酸鈉、明膠、橙皮、酸性羧甲基纖維素、天然海綿和皂土都可以使用。崩解劑也可以是不可溶的陽離子交換樹脂。粉末性樹膠可以用作崩解劑和粘合劑，并且可以包括粉末性樹膠例如瓊脂、Karaya和西黃蓍膠。海藻酸及其鈉鹽也可以用作崩解劑。粘合劑可以用來將肽(或衍生物)維持在一起而形成硬的片劑，并且包括來自天然產(chǎn)物例如阿拉伯膠、西黃蓍膠、淀粉和明膠的物質(zhì)。其它物質(zhì)包括曱基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)和羧曱基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)都可以用在含醇的溶液中來?；?或衍生物)。肽(或衍生物)的制劑中可以包括抗磨擦劑來防止制劑過程中的粘附?？梢允褂脻?rùn)滑劑作為肽(或衍生物)和模具壁之間的層，并且這些潤(rùn)滑劑可以包括但不限于硬脂酸(包括其鎂鹽和鉤鹽)、聚四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、植物油和蠟。也可以用可溶性潤(rùn)滑劑，例如十二烷基疏酸鈉、十二烷基碌L酸鎂、多種分子量的聚乙二醇、Carbowax4000和6000?？杉尤胩岣咧苿┻^程中藥物流動(dòng)性、并且在壓縮過程中幫助重排的助流劑。助流劑包括淀粉、滑石、氧化硅和水合的硅鋁化合物。為了幫助將肽(或f汴生物)溶解入含水的環(huán)境，可以加入表面活性劑來作為濕潤(rùn)劑。表面活性劑包括陰離子去污劑例如十二烷基硫酸鈉、琥珀酸二辛酯磺酸鈉和二辛基碘酸鈉。可以使用陽離子去污劑，并且可包括苯扎氯銨(benzalkoniumchloride)或苯索氯銨?？砂ㄔ谥苿┲凶鳛楸砻婊钚詣┑臐撛诘姆请x子去污劑名單為L(zhǎng)auromacrogol400、硬脂酸40聚烴氧基酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油IO、50和60、單硬脂酸甘油酯、聚山梨酸酯20、40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。制劑中。'--'、、5'-"-'、可以期望受控釋放的經(jīng)口制劑?？梢詫㈦?或衍生物)摻入允許通過擴(kuò)散或?yàn)V取機(jī)制而釋放的惰性基質(zhì)中，例如樹膠中。也可以在制劑中摻入緩慢降解的基質(zhì)。一些腸道包衣也具有延遲釋放的效果。另外一種受控釋放的形式為通過基于Oros治療系統(tǒng)(AlzaCorp.)的方法，即將藥物封裝在半滲透膜中，其中所述半透膜允許水進(jìn)入，并由于滲透效果將藥物通過單一小孔推出來。其它的包衣可以用于制劑。這些包括多種可應(yīng)用在包衣鍋中的糖。肽(或衍生物)也可以以膜包衣片劑給出，并將在這種情況中使用的材料分為兩組。第一組為非腸道性材料，并且包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、甲基羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚維酮和聚乙二醇。第二組由鄰苯二甲酸的常見酯的腸道材料組成。也可以使用材料的混合物來提供最適的膜包衣。膜包被可以在包衣鍋或流化床中或通過壓縮包衣進(jìn)行。應(yīng)用于腸胃外施用的根據(jù)本發(fā)明的制劑包括無菌含水或不含水的溶液、懸浮液或乳劑。非含水的溶劑或載體的實(shí)例為丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油和玉米油、明膠、和可注射的有機(jī)酯例如油酸乙酯。此類劑型也可以含有佐劑例如防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和分軟劑。它們可以通過例如經(jīng)細(xì)菌阻留性過濾器過濾、通過將滅菌劑摻入組合物、通過照射組合物、或者通過加熱組合物來進(jìn)行滅菌。它們也可以在使用前用無菌水或一些其它無菌可注射的介質(zhì)來制造。j廯減厲道遽送進(jìn)行直腸或陰道施用的組合物優(yōu)選栓劑，其中所述栓劑除了活性物質(zhì)外還可以包含賦形劑例如可可黃油或栓劑蠟。用于鼻或舌下施用的組合物也可以用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)賦形劑制備。經(jīng)單遽這本文也考慮經(jīng)肺遞送EPO-R的激動(dòng)劑肽(或其衍生物)。將肽(或其衍生物)在吸入時(shí)遞送至哺乳動(dòng)物肺，并經(jīng)過肺上皮襯細(xì)胞進(jìn)入血流[見，例如Adjei等人(1990)PharmaceuticalResearch7:565-569;Adjei等人(1990)Int.J.Pharmaceutics63:135-144醋酸柳培林(leuprolideacetate);Braquet等人(1989)J.CardiovascularPharmacology13(sup5):143-146內(nèi)皮素-l(endothelin-l);Hubbard等人(1989)AnnalsofInternalMedicine,Vol.里，pp.206-212,(al-抗胰蛋白酶(al-antitrypsin));Smith等人(1989)J.Clin.Invest.84:1145-1146(a-l醒蛋白酶)；Oswein等人(1990)"AerosolizationofProteins",ProceedingsofSymposiumonRespiratoryDrugDeliveryIIKeystone,Colorado(重組人生長(zhǎng)激素)；Debs等人(1988)J.Immunol.140:3482-3488(y-干擾素和a-腫瘤壞死因子);以及Plate等人的美國(guó)專利號(hào)5，284,656(粒細(xì)胞集落刺激因子)。Wong等人在美國(guó)專利號(hào)5，451，569中描述了進(jìn)行全身作用的經(jīng)肺遞送藥物的方法和組合物。在實(shí)踐本發(fā)明中考慮了使用大范圍的設(shè)計(jì)用來經(jīng)肺遞送治療性產(chǎn)物的機(jī)械裝置，其中包括但不限于噴霧器、計(jì)量的劑量p及入器以及粉末吸入器，其中所述這些裝置都為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。一些適合應(yīng)用這項(xiàng)發(fā)明的商品化裝置的特定實(shí)例是Ultravent噴霧器(MallinckrodtInc.,St.Louis,MO)、AcornII噴霧器(MarquestMedicalProducts,Englewood,CO)、Ventolin計(jì)量的劑量吸入器(GlaxoInc"ResearchTrianglePark,NC)以及Spinhaler粉末吸入器(FisonsCorp.,Bedford,MA)。所有此類裝置都需要使用適于分配肽(或衍生物)的制劑。一般而言，每種制劑對(duì)所用裝置類型都是特異的，并且除了在治療中使用的常見稀釋劑、佐劑和/或載體外還可涉及使用適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)物質(zhì)。此外，也考慮了使用脂質(zhì)體、微膠嚢或微球體、包含物復(fù)合體或其它類型的載體。也可以根據(jù)化學(xué)修飾的類型或所用裝置的類型將化學(xué)修飾的肽制備于不同的制劑中。適合使用噴霧器(噴射或超聲的)的制劑一般包含以每毫升溶液大約0.1-25mg生物活性蛋白質(zhì)的濃度溶于水的肽(或衍生物)。制劑也可包括緩沖劑和簡(jiǎn)單的糖(例如用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)和調(diào)節(jié)滲透壓)。噴霧制劑也可以含有表面活性劑來降低或防止由于形成煙霧劑時(shí)溶液霧化造成的表面誘導(dǎo)的肽(或衍生物)聚集。使用計(jì)量劑量的吸入器裝置的制劑通常包含細(xì)小分開的粉末，其中所述粉末含有在表面活性劑協(xié)助下懸浮在推進(jìn)劑中的肽(或衍生物)。為這個(gè)目的所采用的推進(jìn)劑可以是任意常規(guī)的物質(zhì)，例如含氯氟經(jīng)、氬化含氯氟經(jīng)(hydrochlorofluorocarbon)、氬氟烴(hydrofluorocarbon)或經(jīng)類,其包括三氯氟甲烷、二氟二氯甲烷、二氯四氟甲烷、和l,l，l，2-四氟乙烷或其組合物。適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┌ㄊ嚼娲既退狨ズ痛蠖沽字Ｄ憠A。油酸也可以用作表面活性劑。用于自粉末吸入器分配的制劑包含細(xì)小分開的含有肽(或衍生物)的干粉，并且也可以包括促進(jìn)粉末從裝置分配的量例如制劑重量50-卯％的增容劑，例如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露醇。為了最有效地遞送至遠(yuǎn)端的肺,肽(或衍生物)應(yīng)當(dāng)最有利地制劑成平均顆粒大小低于10mm(或微米)、最優(yōu)選0.5-5mm的顆粒形式。也考慮了經(jīng)鼻遞送EPO-R的激動(dòng)劑肽(或衍生物)。經(jīng)鼻的遞送允許在將治療性產(chǎn)物施用至鼻后直接傳送至血流，而不需要在肺中沉積產(chǎn)物。經(jīng)鼻遞送的制劑包括那些包含葡聚糖或環(huán)葡聚糖的制劑。使用本發(fā)明的肽時(shí)也考慮了其它用來促進(jìn)經(jīng)鼻遞送的穿透增強(qiáng)劑(如2003年12月17日提交的國(guó)際專利公開號(hào)WO2004056314中所述，其在此處以整體引入作為參考)。對(duì)于所有肽化合物，隨著進(jìn)一步研究的進(jìn)行，出現(xiàn)了關(guān)于在多種患者中治療多種病癥的適當(dāng)劑量水平的信息，并且普通技術(shù)人員能在考慮治療內(nèi)容、年齡以及受體總體健康而確定適當(dāng)劑量。所選劑量取決于預(yù)期的治療效果、給藥途徑和預(yù)期的治療持續(xù)時(shí)間。一般向哺乳動(dòng)物每天施用0.001-10mg/kg體重的劑量水平。一般而言，靜脈注射或輸注的劑量更低一些。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的任意一種肽都可以用來治療患透析前或透析期間腎衰竭的個(gè)體(透析前或透析患者)。在這個(gè)實(shí)施方案中的治療劑量范圍可以為0.025-0.2毫克(mg)化合物每1千克(kg)個(gè)體體重(0.025-0.2mg/kg)。更加具體地，優(yōu)選0.05-0.1mg/kg的劑量范圍。此夕卜，醫(yī)生開始時(shí)可以使用以0.025mg/kg起始的漸升的劑量，然后對(duì)每個(gè)正治療的個(gè)體以其個(gè)體的血紅蛋白反應(yīng)為基礎(chǔ)逐步增加大約0.025mg/kg的劑量。因此，醫(yī)生可以對(duì)每位個(gè)體調(diào)整劑量直至達(dá)到足夠的血紅蛋白反應(yīng)。在個(gè)體為透析前或透析患者的情況中，足夠的血紅蛋白反應(yīng)將大約獲得正常的血紅蛋白水平(14-15g/dL)或醫(yī)生確定的另一血紅蛋白水平。在這個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)計(jì)每位單獨(dú)的透析前或透析患者的藥理學(xué)有效劑量(PAD)為0.067-0.075mg/kg。這個(gè)實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)預(yù)計(jì)是對(duì)每位個(gè)體患者每三至四周一次的較低劑量頻率，而非其它當(dāng)前紅細(xì)胞生成刺激劑(ESA)情況中的每周一次?？梢允褂迷S多給藥途徑(如上文所述的經(jīng)口的、IV等)。對(duì)透析患者優(yōu)選的給藥途徑是經(jīng)靜脈的。對(duì)透析前患者優(yōu)選的給藥途徑是經(jīng)皮下的。在其它一些實(shí)施方案中，上述化合物中的一種化合物可以用來治療患伴隨惡性腫瘤的貧血的個(gè)體(腫瘤患者)。在這個(gè)實(shí)施方案中的治療劑量范圍預(yù)計(jì)為透析前或透析患者的三至五倍(即0.075-0.5mg/kg)。更加具體而言，優(yōu)選0.2-0.4mg/kg的劑量范圍。如上文，治療肺瘤患者的醫(yī)生可以逐步增加劑量，以0.075mg/kg起始，并以0.075mg/kg的增量增加直至獲得足夠的血紅蛋白反應(yīng)。預(yù)計(jì)每位單獨(dú)的腫瘤患者的PAD為大約0.25mg/kg。同樣，預(yù)計(jì)具有對(duì)每位獨(dú)立患者每三至四周施用一次的較低頻率劑量的優(yōu)點(diǎn)。此外，對(duì)腫瘤患者的其他優(yōu)點(diǎn)是可在化學(xué)療法之前(例如提前3-5天)施用或者與化學(xué)療法共施用來在網(wǎng)織紅蛋白刺激和血紅蛋白增加之間的延遲期防止血紅蛋白降低。可以使用許多給藥途徑(如上文所述的經(jīng)口的、IV等，如上所述)。對(duì)胂瘤患者，皮下施用是優(yōu)選的給藥途徑。用來治療透析前、透析或腫瘤患者的優(yōu)選化合物包括下文顯示的那些化合物。,氨基曱酸酯鍵合、無肌氨酸、并且在PEG分子量的范圍內(nèi)(此處顯示SEQIDNO:1):氬基曱酸酯鍵合、無肌氨酸、并且具優(yōu)選的PEG分子量(此處顯示SEQIDNO:1):(AcG)GLYA(WGPIT(l-Nal)W;QPLR-NH^^麗2W1\O丫'O、乂O—PEG,'10KY"0-PEG10KO(AcG)GLYA^^(i掘)VCQPLR^HnYnH2(AcG)GLYA(WGPIT(l-Nal)V(!;QPLR-NH^^冊(cè)2丄、'N怖NH/)Y00OvO-PEG20K、"兒a義，THN丫O-PEG20KO(AcG)GLYA9HMGPIT(l-Nal)VCQPLR-HN^V"NH,I-1&「<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>(AcG)GLYACHMGPIT(l-Nal)VCQPLR—HNY"順:1-10氨基甲酸酯鍵合、具肌氨酸、并且在PEG分子量的范圍內(nèi)(此處顯示IDNO:2):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>氨基甲酸酯鍵合、具肌氨酸、并且具優(yōu)選的PEG分子量(此處顯示SEQIDNO:2):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>fe胺鍵合、無肌氨酸、并且在PEG分子量的范圍內(nèi)(此處顯示SEQIDNO:(AcG)GLYA(WGPIT(l-Nal)viQPLR-NH^^"NH2(AcG)GLYACHMGPIT(l-Nal)VCQPLR-HN'Y"冊(cè)2I-1o酰胺鍵合、無肌氨酸、并且具優(yōu)選的PEG分子量(此處顯示SEQIDNO:1):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage69</formula>(AcG)GLYAHMGPIT(l-Nal)VCQPLR—HN^pNH2-^-^O酰胺鍵合、具肌氨酸、并且在PEG分子量的范圍內(nèi)(此處顯示SEQIDNO:2):_<formula>formulaseeoriginaldocumentpage69</formula>L合、具肌氨酸、以及優(yōu)選的PEG分子量(此處顯示SEQIDNO:2)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage70</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage71</formula>本發(fā)明的肽(或其^t生物)可以與一種或多種其它的活性成分或藥;組合物聯(lián)合施用。實(shí)施例本發(fā)明接下來通過下列實(shí)施例進(jìn)行描述。然而，無論在說明書哪個(gè)位置的這些以及其它實(shí)施例都僅為示例性的，并且不限制本發(fā)明或其任意例證形式的范圍和意義。同樣，本發(fā)明不限于本文所述的任何特定優(yōu)選實(shí)施方案。事實(shí)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本說明后清楚本發(fā)明的許多改進(jìn)和變化，并且可以不偏離其主旨和范圍進(jìn)行上述改進(jìn)和變化。因此，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求書的條款以及權(quán)利要求書賦予的等同物的全部范圍限制。實(shí)施例1:通過固相合成法合成EPO-R激動(dòng)劑肽二聚體步驟1-合成Cbz-TAP:將在無水DCM(100ml)中的含商業(yè)可獲得的二胺(AldrichChemicalCo.的"TAP")(10g，67.47mmol)的溶液冷卻至0°C。通過滴液漏斗在6-7小時(shí)期間緩慢加入在無水DCM(50ml)中的氯甲酸千酯(4.82ml，33.7mmol)溶液，將反應(yīng)混合物的溫度一直維持在(TC，然后允許升溫至室溫(-25t:)。再過16小時(shí)，在真空下移去DCM,并在3NHC1和醚之間分配殘余物。收集含水層，用50。/。含水NaOH中和至pH8-9，并用乙酸乙酯提取。將乙酸乙酯層經(jīng)無水Na2S04干燥，然后再真空下濃縮來提供粗的單-Cbz-TAP(5g，大約50%的產(chǎn)率)。下一步反應(yīng)使用這個(gè)化合物，而不進(jìn)行任何進(jìn)一步的純化。步驟2-合成Cbz-TAP-Boc:向劇烈攪拌的在己烷(25ml)中的Cbz-TAP(5g，17.7mmol)懸浮液中加入Boc20(3.86g，17.7mmo1)，并在RT持續(xù)攪拌過夜。將反應(yīng)混合物用DCM(25ml)稀釋，并用10W含水的檸檬酸(2X)、水(2X)和鹽水洗滌。將有機(jī)層經(jīng)無水Na2S04干燥，并在真空下濃縮。粗產(chǎn)物(產(chǎn)率5g)直接用于下一步的反應(yīng)。步驟3-合成Boc-TAP:將前面反應(yīng)的粗產(chǎn)物溶解在甲醇(25ml)中，并在存在碳上5。/。Pd(5。/。w/W)下在球嚢壓力(balloonpressure)下氫化16小時(shí)。過濾混合物，用甲醇洗滌，并在真空下濃縮濾液來提供粗的H-TAP-Boc產(chǎn)物(產(chǎn)率3.7g)。步驟1-3后Boc-TAP的總的大約產(chǎn)率為44%(基于所用Cbz-Cl的量計(jì)算)。步驟4-合成TentaGel-接頭在20mLDMF中將TentaGd溴化物(2.5g，0.48mmol/g，購(gòu)自RappPolymere，德國(guó))、酚型接頭(5當(dāng)量)和K2C03(5當(dāng)量)在70。C加熱14小時(shí)。冷卻至室溫之后，洗滌(0.1NHC1、水、ACN、DMF、MeOH)樹脂，并干燥來給出琥珀色的樹脂。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage73</formula>步驟5-合成TentaGel-接頭-TAP(Boc):在1:1的MeOH-THF混合物中混合2.5mg上述樹脂、H-TAP-Boc(1.5mg，5當(dāng)量)和冰醋酸(34jJ，5當(dāng)量)，并振蕩過夜。向這個(gè)混合物中加入在THF中的1M氰基硼氫化鈉(5當(dāng)量)溶液，并再振蕩7小時(shí)。將樹脂過濾、洗滌(DMF、THF、O.lNHCl、'水、MeOH)并干燥。將少量樹脂用在DCM中的Bz-Cl和DIEA苯曱?；?0%的TFA-DCM切割，并通過LCMS和HPLC確認(rèn)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage73</formula>步驟6-合成TentaGel-接頭-TAP-Lys:用活化的Fmoc-Lys(Fmoc)-OH溶液(用以0.5M溶于DMF的5當(dāng)量^J^酸和5當(dāng)量HATU，隨后加入10當(dāng)量DIEA制備)處理上述樹脂，并輕搖14小時(shí)。洗滌樹脂(DMF、THF、DCM、MeOH)、并干燥樹脂來產(chǎn)生受保護(hù)的樹脂。殘余的胺基通過用在DCM中的10%乙酸酐、20%吡，定的溶液處理樹脂2Q分鐘來進(jìn)行封端，隨后如上洗滌。Fmoc基團(tuán)通過在DMF中的30。/o派咬中輕搖樹脂20分鐘來移去，隨后洗滌(DMF、THF、DCM、MeOH)并千燥。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage73</formula>步驟7-合成TentaGel-接頭-TAP-Lys(肽)2:對(duì)上述樹脂重復(fù)下列循環(huán)來同時(shí)構(gòu)建兩條肽鏈，其中所述重復(fù)循環(huán)為用HBTU/HOBt活化作用進(jìn)行Fmoc-氬基酸偶聯(lián)和用派咬移去Fmoc。這可以在AppliedBiosystems,Inc.有售的ABI433自動(dòng)肽合成儀上方便地進(jìn)行。在最后的Fmoc移去之后，將末端胺基用在DMF中的乙酸酐(10當(dāng)量)和DIEA(20當(dāng)量)?；?0分鐘，然后如上進(jìn)行洗滌。HOK丄肽步驟8-自樹脂切割將上述樹脂在室溫下在TFA(82.5%)、苯酚(5%)、乙二硫醇(2.5%)、水(5%)和苯硫基甲烷(5%)的溶液中懸浮3小時(shí)。也可以使用備選的切割性混合物例如TFA(95%)、水(2.5%)和三異丙基珪烷(2.5%)。將TFA溶液冷卻至5。C、并傾入Et20中來沉淀肽。減壓下過濾并干燥來給出預(yù)期的肽。通過用裝備了C18柱的制備HPLC純化來提供純肽。肽-AcHOW丄肽-AcAc-肽一NHTFAAc-肽一NH步驟9-氧化肽來形成分子內(nèi)的二硫鍵將肽二聚體溶解在20%的DMSO/水(1mg肽干重/mL)中，并在室溫放置36小時(shí)。通過將反應(yīng)混合物上樣至C18HPLC柱(WatersDelta-PakC18，15孩i米顆粒大小，300埃孔大小，40mmx200mm長(zhǎng))、然后以5-95%ACN的線性ACN/7JC/0.01%TFA梯度在40分鐘期間純化肽。冷凍干燥包含預(yù)期肽的級(jí)分提供松散的白色(fluffywhite)固體。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula>DMF中的活化的PEG種類(購(gòu)自NOFCorp.Japan的mPEG-NPC)混合來提供清亮的溶液。5分鐘后，向上述溶液中加入4當(dāng)量的DIEA。在環(huán)境溫度攪拌混合物14小時(shí)，然后用C18反相HPLC進(jìn)行純化。PEG化的肽的結(jié)構(gòu)通過MALDI質(zhì)鐠確認(rèn)。也通過下文概述的陽離子交換層析對(duì)純化的肽進(jìn)行純化。下圖顯示使用SEQIDNO:3的mPEG-NPCPEG化。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula>遞迎瘋凝鍵的/^G^,將肽二聚體與1.5當(dāng)量(基于摩爾計(jì)算)在無水DMF中的1當(dāng)量活化的PEG種類(購(gòu)自ShearwaterCorp,USA的PEG-SPA-NHS)混合來提供清亮的溶液。5分鐘后，向上述溶液中加入10當(dāng)量的DIEA。在環(huán)境溫度攪拌混合物2小時(shí)，然后用C18反相HPLC進(jìn)行純化。PEG化的肽的結(jié)構(gòu)通過MALDI質(zhì)譜確認(rèn)。也通過下文概述的陽離子交換層析對(duì)純化的肽進(jìn)行純化。下圖顯示使用SEQIDNO:3的PEG-SPA-NHSPEG化。步獴//-庠子^換趟^:對(duì)幾種交換載體調(diào)查了其從未反應(yīng)的(或水解了的)PEG分離上述肽-PEG綴合物的能力、以及其保留起始的二聚體肽的能力。將離子交換樹脂(2-3g)加載入lcm柱，隨后轉(zhuǎn)變?yōu)殁c形式(將0.2NNaOH加載至柱，直至洗出液pH為14,大約5個(gè)柱體積)，然后轉(zhuǎn)變?yōu)闅湫问?用0.1NHCl或0.1MHOAc洗脫，直至與洗出液匹配的裝載pH，大約5個(gè)柱體積)，隨后用25%ACN/水洗滌直至pH為6。將綴合前的肽或肽-PEG綴合物溶解在25%的ACN/水(10mg/mL)中，并用TFA將pH調(diào)整為<3，然后加載至柱。在用2-3個(gè)柱體積的25%ACN/水洗滌并收集5mL級(jí)分之后，通過用在25%ACN/K中的0.1MNH4OAc洗滌來將肽從柱上釋放下來，再次收集5mL級(jí)分。通過HPLC分析來顯示那些級(jí)分含有預(yù)期的肽。用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)的分析表明，當(dāng)肽保留在柱上、并用NH40Ac溶液洗脫(通常介于級(jí)分4和10之間)時(shí)，沒有觀察到非綴合的PEG污染。當(dāng)肽在最初的洗滌緩沖液(通常為最初的兩個(gè)級(jí)分)中洗脫時(shí)，沒有觀察不到預(yù)期的PEG綴合物和過量的PEG的分離。下列柱成功地保留了肽和肽-PEG綴合物這兩者，并且成功地從非綴合肽中純化肽-PEG綴合物。表l:離子交換樹脂(AcG)GLYAfcHMGPIT(l-加l)VCQPLR(MeG).(AcG)GLYACHViGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)-HN'PEG-SPA-NHSDIEA,DMF<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>步驟2-合成Boc-TAP:如實(shí)施例1的步驟1-3合成Boc-TAP。步驟3-偶聯(lián)(Cbz)2Lys和Boc-TAP:在標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)條件下偶聯(lián)(Cbz)2-Lys和Boc畫TAP來獲得(Cbz)2-Lys-TAP-Boc。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>步驟4-Lys-TAP-Boc:將上述反應(yīng)的粗產(chǎn)物溶解在曱醇(25ml)中，并在球嚢壓力(balloonpressure)下在存在碳上5%Pd(5%w/W)時(shí)氫化16小時(shí)。過濾混合物、用甲醇洗滌，并在真空中濃縮濾液來提供粗的Lys-TAP-Boc產(chǎn)物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>步驟5-通過片段縮合合成肽單體通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成肽單體序列的四個(gè)肽片段。然后對(duì)這些部分受保護(hù)的片段進(jìn)行兩輪獨(dú)立的偶聯(lián)。在第一輪中，N末端一半的單體通過偶聯(lián)兩個(gè)肽片段形成，而C末端一半的單體通過偶聯(lián)另外兩個(gè)肽片段形成。在第二輪偶聯(lián)中，偶聯(lián)N末端和C末端的兩半來形成完全受保護(hù)的單體。然后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)單體進(jìn)行OBn-脫保護(hù)。S(Acm)(AcG)-G-L-y-A-OHFmoc-C-H-M-G-OHOlfiuTrt(SEQIDNO:5)(SEQIDN0:6)l偶聯(lián)S(Acm〉(AcG)-G-L-Y"A-C-H-M-G-OHOffluTrt(SEQIDNO:9)S(Acm)Fmoc-P-I-f-(l-nal)-V-C-Cjl-P-OHH2N-L-，(MeG)-OBnOffiuTrtPbf(SEQIDNO:7)(SEQIDNO:8)T偶聯(lián)S(Acm)卞-(l曙nal)-V-C-卞P-L-lj:-(MeG)-OBnIO氾uTrtPbfL偶聯(lián)(SEQIDNO:10)Fmoc-P-I-]f(A咖)S(Acm)(AcG)-G-L-Y-A-C--M-G-P-I-Tj-(l-nal)-V隱(!:-Q-P-L-R-(MeG)-OBnO氾uTrto但uTrt4bf(SEQIDNO:11)J^保護(hù)OBn(Acm)S(Acm)(AcG)-G-L-X-A-C--M-G-P-I-Tj-(l-nal)-V濕(!;-Q-P-L-R-(MeG)-OHOtBuTrtotBuTrtPbf(SEQIDNO:12)步嚴(yán)6-處必妖卓琳4多成》f/^的二碗1^:然后用碘化物氧化OBn-脫保護(hù)的縮合的肽單體(SEQIDNO:12)來在單體的Acm-保護(hù)的半胱氨酸殘基之間形成分子內(nèi)二石克鍵。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage79</formula>#樑7-摔L"UP-fi"偶聯(lián)i真化的OB"應(yīng)^^的卓琳^多成庶二果沐,'在標(biāo)準(zhǔn)條件下將Lys-TAP-Boc偶聯(lián)至兩倍摩爾過量的氧化的OBii脫保護(hù)的單體來形成肽二聚體。然后在標(biāo)準(zhǔn)條件下對(duì)肽二聚體進(jìn)行脫保護(hù)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage79</formula>,潔《-戶五G1必應(yīng)沐^辨二,謬.'然后如實(shí)施例1的步驟10所述對(duì)脫保護(hù)的肽二聚體進(jìn)行PEG化。步凝9-庠子it^磁必,然后如實(shí)施例1的步驟ll所述對(duì)PEG化的肽二聚體進(jìn)行純化。實(shí)施例3:體外活性測(cè)試這個(gè)實(shí)施例描述了多種體外用來評(píng)估本發(fā)明EPO-R激動(dòng)劑肽的活性和效能的檢測(cè)法。這些測(cè)試的結(jié)果證明這項(xiàng)發(fā)明的新型肽結(jié)合EPO-R,并激活EPO-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，這些測(cè)試的結(jié)果表明，新型肽組合物呈現(xiàn)比以前描述的EPO模擬肽令人吃驚的增加的EPO-R結(jié)合親和性和生物學(xué)活性。根據(jù)實(shí)施例1或?qū)嵤├?中提供的方法制備了EPO-R激動(dòng)劑肽二聚體。用一系列體外活性測(cè)試評(píng)估了這些肽二聚體的效能，其中所述體外活性測(cè)試包括報(bào)告測(cè)試(reporterassay)、增殖測(cè)試、竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)試和C/BFU-e測(cè)試。下文進(jìn)一步詳細(xì)描述這四項(xiàng)測(cè)試。表2中概述了這些體外活性測(cè)試的結(jié)果。L孩普辦試這項(xiàng)測(cè)試以從鼠前B細(xì)胞系衍生的報(bào)告細(xì)胞Baf3/EpoR/GCSFRfos/lux作為基礎(chǔ)。這種報(bào)告細(xì)胞系表達(dá)包含人EPO受體的細(xì)胞外部分至人GCSF受體的細(xì)胞內(nèi)部分的嵌合受體。進(jìn)一步向這個(gè)細(xì)胞系轉(zhuǎn)染fos啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體。通過加入紅細(xì)胞生成劑激活這種嵌合受體，導(dǎo)致螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)，并因此在加入螢光素酶底物螢光素后導(dǎo)致光的產(chǎn)生。因此，在該類細(xì)胞中EPO-R的活化水平可以通過測(cè)定螢光素酶活性來定量。在補(bǔ)充了10%胎牛血清(FBS;Hydone)、10%WEHI-3上清(WEHI-3細(xì)胞培養(yǎng)物的上清，ATCC#TIB-68)和青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)Baf3/EpoR/GCSFRfos/lux細(xì)胞。于測(cè)試前的大約18小時(shí)，通過將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充了10%FBS和0.1%WEHI-3上清的DMEM/F12培養(yǎng)基中饑餓它們。在測(cè)試當(dāng)天，將細(xì)胞用補(bǔ)充了10%FBS(無WEHI-3上清)的DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌一次，然后以1xio6個(gè)細(xì)胞/mL在存在已知濃度的測(cè)試肽或以EPO(R&DSystemsInc.,Minneapolis,MN)作為陽性對(duì)照的、補(bǔ)充了10%FBS(無WEHI-3上清)的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在這項(xiàng)測(cè)試中檢測(cè)連續(xù)稀釋的測(cè)試肽。將測(cè)試板在37。C、5%的C02大氣中孵育4小時(shí)，之后向每孔中加入螢光素(Steady-GIo;Promega，Madison，WI)。孵育5分鐘之后，在PackardTopcount光度計(jì)(PackardInstrumentCo"DownersGrove,IU.)上檢測(cè)光發(fā)射。將光計(jì)數(shù)相對(duì)測(cè)試肽濃度作圖，并用GraphPad軟件進(jìn)行分析。將產(chǎn)生最大值一半的光發(fā)射的測(cè)試肽濃度記錄為EC50[見表2:報(bào)告EC50。2微滿這項(xiàng)測(cè)試基于鼠前B細(xì)胞系Baf3,經(jīng)轉(zhuǎn)染來表達(dá)人EPO-R。所得細(xì)胞系BaF3/GaI4/Elk/EPOR的增殖依賴于EPO-R活化。細(xì)胞增殖的程度用MTT定量，其中MTT測(cè)試中的信號(hào)與活細(xì)胞的數(shù)量成比例。在旋轉(zhuǎn)燒瓶中將BaF3/Gal4/Elk/EPOR細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充了10%FBS(Hyclone)和2%WEHI畫3上清(ATCC#TIB-68)的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)中。在旋轉(zhuǎn)燒瓶中將培養(yǎng)的細(xì)胞以lxl(^個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞密度在補(bǔ)充了10%FBS和0.1%WEHI-3上清的DMEM/F12培養(yǎng)基中饑餓過夜。然后將饑餓的細(xì)胞用Dulbecco's:PBS(Gibco)洗滌兩次，并在補(bǔ)充了10%FBS(無WEHI-3上清)的DMEM/F12中懸浮成1x106個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞密度。然后取50nL等份(50，000個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞懸液在96孔測(cè)試板中一式三傷"故置。向96孔測(cè)試板中加入50jiL等份在補(bǔ)充了10%FBS(無WEHI-3上清I)的DMEM/F12培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋的受試EPO模擬肽、或50nLEPO(R&DSystemsInc.,Minneapolis,MN)或Aranesp(阿法達(dá)貝汀(darbepoeitinalpha)，Amgen商品化的ERO-R激動(dòng)劑)(最終孔體積為100nL)。例如，可以測(cè)試12個(gè)不同稀釋物，其中測(cè)試肽(或?qū)φ誆PO肽)的終濃度在810pM至0.0045pM的范圍。然后將鋪板的細(xì)胞在37"C孵育48小時(shí)。接下來，向每個(gè)培養(yǎng)亞孔中加入10jiLMTT(RocheDiagnostics),然后孵育4小時(shí)。然后通過加入10%SDS+0.01NHCl終止反應(yīng)。然后將平板在37'C孵育過夜。然后通過分光光度法測(cè)定每孔在595nm波長(zhǎng)處的吸光度。將吸光度讀數(shù)對(duì)測(cè)試肽濃度繪圖，并用GraphPad軟件計(jì)算EC50。將導(dǎo)致最大吸光度一半的測(cè)試肽濃度記錄為EC50[見表2:增殖EC50。3.f爭(zhēng)遂潛合-試釆用測(cè)試來進(jìn)行竟?fàn)幮越Y(jié)合計(jì)算，在所述測(cè)試中光信號(hào)的產(chǎn)生是作為如下兩種珠子的接近作用的函數(shù)具生物素化的EPO-R結(jié)合肽示蹤物的鏈親和素供體珠子和結(jié)合EPO-R的受體珠子。光通過非放射性能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生，其中第一個(gè)珠子在照射后釋放單線態(tài)氧，并且接觸釋放的單線態(tài)氧導(dǎo)致第二個(gè)珠子發(fā)射光。這些珠子集合均有售(Packard)。珠子的接近通過EPO-R結(jié)合肽示蹤物結(jié)合EPO-R產(chǎn)生。與EPO-R結(jié)合肽示蹤物竟?fàn)幗Y(jié)合EPO-R的測(cè)試肽阻止這種結(jié)合，從而導(dǎo)致光發(fā)射下降。更加具體而言，所述方法如下向384孔板的孔中加入4nL連續(xù)稀釋的受試EPO-R激動(dòng)劑肽、或陽性或陰性對(duì)照。然后以2fiL/孔加入受體/珠子混合物。受體珠子混合物由15jiL5mg/ml的鏈親和素供體珠子(Packard)、15jiL5mg/ml的單克隆抗體abl79(這種抗體識(shí)別包含在重組EPO-R中的人胎盤堿性磷酸酶蛋白的部分)、A蛋白包被的受體珠子(A蛋白將結(jié)合abl79抗體；Packard)、112.5fiL1:6.6稀釋的重組EPO-R(在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中以融合了包含abl79靶表位的人胎盤堿性磷酸酶蛋白的一部分的融合蛋白產(chǎn)生)和607.5jiLAlphaquest緩沖液(40mMHEPES，pH7.4;1mMMgCl2;0.1%BSA，0.05%吐溫20)組成。輕彈混合。以2jiL/孔加入生物素化的EPO-R結(jié)合肽示蹤物(30nM終濃度)。肽示蹤物為EPO-R結(jié)合肽(見表"報(bào)告EC50(pM)"),根據(jù)實(shí)施例1中所述方法用序列生物素-GGLYACHMGPITWVCQPLRG(SEQIDNO:4)制備。肽示蹤物生物素墨gglya(!;hmgpitwvc!qplrg、離心1分鐘混合。用PackardTopSeal密封平板，并用箔錫紙包裹。在室溫孵育過夜。18小時(shí)后用AlphaQuest讀數(shù)儀(Packard)讀取光發(fā)射。將光發(fā)射對(duì)肽濃度作圖，并用GraphPad或Excel分析。將導(dǎo)致光發(fā)射相比無測(cè)試肽時(shí)觀察的光發(fā)射下降50%的測(cè)試肽濃度記錄為IC50[見表2:AQIC50J。《C/B/77-e都試EPO-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激骨髓干細(xì)胞分化成為增殖的血紅細(xì)胞前體。這項(xiàng)測(cè)試檢測(cè)測(cè)試肽刺激來自原代人骨髓多能干細(xì)胞的血紅細(xì)胞前體增殖和分化的能力。對(duì)于這項(xiàng)測(cè)試，在補(bǔ)充了10%FBS(Hyclone)的IMDM培養(yǎng)基(Gibco)中連續(xù)稀釋測(cè)試肽。然后將這些連續(xù)稀釋液或陽性對(duì)照EPO肽加入到甲基纖維素中來產(chǎn)生1.5mL的終體積。然后徹底渦旋甲基纖維素和肽混合物。解凍等份(100,000個(gè)細(xì)胞/mL)的人骨髓衍生的CD34+細(xì)胞(Poietics/Cambrex)。在50mL試管中將解凍的細(xì)胞輕輕地加入到0.1mL1mg/ml的DNA酶(StemCells)中。接下來，向細(xì)胞輕輕加入40-50mLIMDM培養(yǎng)基前10mL培養(yǎng)基沿著50mL試管側(cè)壁逐滴加入，然后將剩余體積的培養(yǎng)基沿著試管側(cè)壁緩慢加入。然后將細(xì)胞以900轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，并通過輕輕吸取小心移去培養(yǎng)基。將細(xì)胞重懸于lml的IMDM培養(yǎng)基中，并在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器載玻片上計(jì)數(shù)每亳升的細(xì)胞密度(以10fiL等份的細(xì)胞懸液置于載玻片上，并且細(xì)胞密度為平均計(jì)數(shù)xlO，000個(gè)細(xì)胞/ml)。然后將細(xì)胞在IMDM培養(yǎng)基中稀釋至15,000個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度。然后每1.5mL甲基纖維素和肽樣品中加入IOOnL稀釋的細(xì)胞(測(cè)試培養(yǎng)基中最終的細(xì)胞濃度為1000個(gè)細(xì)胞/mL)，并渦旋混合物。使混合物中的氣泡消失，然后用鈍頭針吸取lmL。將0.25raL從每個(gè)樣品中吸取的混合物加入到24孔板(Falconbrand)4孔的每個(gè)孔中。在濕的培養(yǎng)箱中在37°C、5%C02下孵育鋪板的混合物14天。用相差顯微鏡(5x-10x物鏡，最終放大倍數(shù)100x)計(jì)數(shù)存在的類紅細(xì)胞集落。將形成的集落數(shù)目為最大值的90%(相比EPO陽性對(duì)照觀察到的集落數(shù)目)的測(cè)試肽濃度記錄為EC90[見表2:C/BFU-eEC90。5.放身遂銘沐力爭(zhēng)'^潛合^試也可以用備選的放射性配體竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)試來測(cè)定本發(fā)明肽的IC50值。這項(xiàng)測(cè)試檢測(cè)"5l-EPO與EPOr的結(jié)合。優(yōu)選根據(jù)下列示例性方案進(jìn)行測(cè)試A辦重組人EPOR/Fc嵌合體身份重組人EPOR/Fc嵌合體*供應(yīng)商R&DSystems(Minneapolis,MN，US)目錄號(hào)963-ER*批號(hào)EOK033071貯存4°C硤化重組人促紅細(xì)胞生成素身份(3[1251]碘酪氨酰)促紅細(xì)胞生成素，人重組體，高比活性，370kBq,10MCi*供應(yīng)商AmershamBiosciences(Piscataway，NJ，US)目錄號(hào)IM219-10nCi批號(hào)貯存4°CG蛋白瓊脂糖身份G蛋白瓊脂糖4快速流動(dòng)*供應(yīng)商AmershamBiosciences(Piscataway，NJ，US)目錄號(hào)17-0618-01批號(hào)貯存4X:測(cè)試緩沖液磷酸緩沖鹽水(PBS)，pH7.4，含有0.1。/。牛血清白蛋白和0.1%疊氮鈉貯存4。CJ5.確定^"適^愛沐;^度。將一管50jig冷凍干燥的與人IgGl的Fc部分融合的重組EPOr細(xì)胞84外結(jié)構(gòu)域在1mL測(cè)試緩沖液中重新構(gòu)建。為了確定在測(cè)試中受體正確的使用量，在12x75mm的聚丙烯測(cè)試管中將100jiL該受體制備物的連續(xù)稀釋物與大約20,000cpm的200pL碘化的重組人促紅細(xì)胞生成素(usi-EPO)合并。將試管蓋上蓋子，并在LabQuake旋轉(zhuǎn)振蕩器上于4匸輕輕混合過夜。第二天，向每管中加入50nL5(T/o的G蛋白瓊脂糖懸浮液。然后在4C孵育試管2小時(shí)，輕輕混合。然后將試管以4000轉(zhuǎn)/分鐘(3297xG)離心來沉淀G蛋白瓊脂糖。小心移出并棄去上清。用lmL4X:的測(cè)試緩沖液洗滌3次之后，在WallacWizardY計(jì)數(shù)器中對(duì)沉淀進(jìn)行計(jì)數(shù)。然后分析結(jié)果，并計(jì)算達(dá)到最大結(jié)合值的50%所需的稀釋度。為了測(cè)定肽I的IC5。，在12x75mm的聚丙烯測(cè)試管中將100jiL肽的連續(xù)稀釋物與100nL重組的促紅細(xì)胞生成素受體(100pg/管)混合。然后向每管中加入100nL碟化的重組人促紅細(xì)胞生成素(^I-EPO)，并將試管蓋上蓋子，在4。C輕輕混合過夜。第二天，如上所述定量結(jié)合的125I-EPO。分析結(jié)果，并用GraphPadSoftware,Inc.(SanDiego，CA)的GraphpadPrism4.0版計(jì)算ICs。值。對(duì)每個(gè)測(cè)試肽重復(fù)測(cè)試兩次或多次，總計(jì)3次或多次重復(fù)測(cè)定:ic50。<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>實(shí)施例4:體內(nèi)活性測(cè)試這個(gè)實(shí)施例描述了多種用來評(píng)估本發(fā)明的EPO-R激動(dòng)劑肽的活性和效力的測(cè)試。EPO-R激動(dòng)劑肽二聚體根據(jù)實(shí)施例1或?qū)嵤├?中提供的方法制備。這些肽單體和二聚體的體內(nèi)活性用一系列測(cè)試進(jìn)行評(píng)估，其中包括紅紅細(xì)胞增多的低氧小鼠(polycythemicexhypoxicmouse)生物測(cè)試和網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)試。這兩個(gè)測(cè)試在下文做進(jìn)一步描述。7.血*^增,#瓶歲'/、處^參灣試在由Cotes和Bangham(1961)，Nature191:1065-1067所述方法改進(jìn)的紅細(xì)胞增多的低氧小鼠生物測(cè)試中測(cè)定測(cè)試肽的體內(nèi)活性。這項(xiàng)測(cè)試檢測(cè)測(cè)試肽作為EPO模擬物發(fā)揮作用即激活EPO-R并誘導(dǎo)新的血紅細(xì)胞合成的能力。血紅細(xì)胞的合成基于摻入合成的血紅細(xì)胞血紅蛋白中的放射標(biāo)記的鐵來定量。將BDF1小鼠在周圍環(huán)境馴化7-10天。測(cè)定所有動(dòng)物的體重，并且不使用低體重動(dòng)物(<15g)。在低壓室中對(duì)小鼠進(jìn)行總共14天的連續(xù)條件循環(huán)。每24小時(shí)的循環(huán)由18小時(shí)0.40±0.02%的大氣壓和6小時(shí)的環(huán)境壓力組成。在條件循環(huán)之后，于給藥之前將小鼠再在環(huán)境壓力維持72小時(shí)。在PBS+0.1%BSA載體(PBS/BSA)中稀釋測(cè)試肽或重組人EPO標(biāo)準(zhǔn)品。先在二甲基亞砜(DMSO)中溶解肽單體母液。陰性對(duì)照組包括一組僅注射PBS/BSA的小鼠、以及一組注射l。/oDMSO的小鼠。每個(gè)劑量組包含10只小鼠。對(duì)小鼠皮下(頸背)注射0.5mL適當(dāng)樣品。注射樣品48小時(shí)之后，對(duì)小鼠腹膜內(nèi)注射0.2mlFe59(Dupont,NEN)，達(dá)到大約0.75nCi/小鼠的劑量。在施用Fe5924小時(shí)之后測(cè)定小鼠體重，并在施用Fe5948小時(shí)之后處死小鼠。通過心臟穿刺收集每只動(dòng)物的血液，并測(cè)定血細(xì)胞比容(肝素用作抗凝血?jiǎng)?。用PackardY計(jì)數(shù)器分析每個(gè)血液樣品(0.2ml)的Fe"摻入。將非應(yīng)答小鼠(即那些放射摻入低于陰性對(duì)照組的小鼠)排除出適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)組。也排除血細(xì)胞比容值低于陰性對(duì)照組53%的小鼠。結(jié)果從每個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量10只動(dòng)物的集合中獲得。計(jì)算每組摻入血液樣品的平均放射性數(shù)量[每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)1。對(duì)正常的BDF1小鼠連續(xù)三天施用(0.5mL，皮下注射)EPO對(duì)照或測(cè)試肽。第三天，還對(duì)小鼠施用(O.lmL，腹膜內(nèi)注射)鐵葡聚糖(100mg/ml)。第五天，用C02麻痹小鼠，并通過心臟穿刺取血。通過瘞哇橙染色和流式細(xì)J!^[義分析(網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)程序)測(cè)定每個(gè)血液樣品的網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(％)。手動(dòng)測(cè)定血細(xì)胞比容。校正的網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)用下列公式確定%網(wǎng)織紅細(xì)胞啦正的=%網(wǎng)織紅細(xì)胞觀察的X(血細(xì)胞比容個(gè)體的/血細(xì)胞比l正常的)3.益濕浙試對(duì)正常的CD1小鼠每周一次經(jīng)快速靜脈內(nèi)團(tuán)注(bolusintravenousinjections)施用EPO陽性對(duì)照、測(cè)試肽或載體，共四次。通過改變制劑中活性化合物的濃度來測(cè)試陽性對(duì)照和測(cè)試肽劑量(表達(dá)為mg/kg)的范圍。注射的體積為5ml/kg。載體對(duì)照組包含12只動(dòng)物，而剩余劑量組每組為8只小鼠。記錄每天的生存和每周的體重。在第1天(對(duì)載體對(duì)照小鼠)、以及第15天和第29天(4只小鼠/組/天)對(duì)給藥的小鼠禁食，然后吸入異氟烷麻醉，并通過心臟或腹部大動(dòng)脈穿刺收集定期的血液樣品。將血液轉(zhuǎn)移到Vaciitainer⑧牌試管。優(yōu)選的抗凝血?jiǎng)橐叶匪囊宜?EDTA)。使用本領(lǐng)域熟知的自動(dòng)化臨床分析器(例如Coulter,Inc.制造的儀器)檢測(cè)血紅細(xì)胞合成和生理性質(zhì)例如血細(xì)胞比容(Hct)、血紅蛋白(Hgb)和總紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)來評(píng)估血液樣品的終點(diǎn)。實(shí)施例5:合成具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK(SEQIDNO:l)的肽單體的EPO-R激動(dòng)劑肽同型二聚體步凝/-合成'庶卓沐；肽單體用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc化學(xué)法在ABI431A肽合成儀上用TG-RAM樹脂(0.18mmol/gRappPolymere,德國(guó))合成。為了合成具酰胺化的羧基末端的肽單體，用82.5。/。TFA、5%水、6.25%苯甲醚、6.25%乙二硫醇來從樹脂切割完全組裝的肽。將脫保護(hù)的產(chǎn)物從樹脂濾出，并用二乙醚沉淀。徹底干燥之后，產(chǎn)物通過C18反相高壓液相層析儀純化，使用了在0.1%三氟醋酸中的乙腈/水的梯度。肽的結(jié)構(gòu)通過電噴霧質(zhì)鐠確認(rèn)。將肽以1mg/mL的濃度溶解在1:1的DMSO:水的溶液中來影響二硫化物的形成。產(chǎn)物通過C18反相高壓液相層析儀純化，使用了在0.1%三氟醋酸中的乙腈/水的梯度。肽單體示例如下(AcG)GLYA!cHMGPrr(l-nal)vl:QPLRK-NH2(犯qjpNQ.^,嚴(yán)2-^Sst^^游遂凝興.'室溫下向在100mLDCM中的亞氨乙酸二乙酯(IO.Og，52.8mmol)和Boc-P-丙氨酸(10.0g,52.8mmol)的溶液中在10分鐘期間加入二異丙基碳二亞胺(8.0mL，51.1mmol)。在添加期間反應(yīng)混合物升溫-10度，然后在20分鐘期間冷卻回室溫。攪拌反應(yīng)混合物過夜，并濾去沉淀的二異丙脲。減壓下移去溶劑來產(chǎn)生膠，并將殘余物溶解在乙酸乙酯中，并再次過濾移去額外沉淀的尿素。將有^l4目i文入分液漏斗，洗滌(飽和的NaHC03,鹽水，0.5NHC1，鹽水)，干燥(MgS04)，過濾，并減壓下濃縮來提供無色油狀的二酯產(chǎn)物。將二酯置于1:1的MeOH:THF(100mL)混合物中，并向其中加入水(25mL)，然后加入NaOH(5g，125mmol)。pH測(cè)定為〉10。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物2小時(shí)，然后用6NHC1酸化為pH1。用NaCl飽和7JC相，并用乙酸乙酯提取4次。(鹽水)洗滌合并的有機(jī)相、干燥(MgSOj、并減壓下濃縮來產(chǎn)生白色的半固體。將固體溶解在50mLDCM中，并向其中加入300mL己烷來產(chǎn)生白色漿狀物。減壓下移除溶劑來提供白色固體的二酸(14.7g，兩步產(chǎn)率91.5%)。向在20mLDMF中的二酸(1g,3.29mmol)溶液中加入N-羥基琥珀酰亞胺(770mg，6.69mmol)、二異丙基碳二亞胺(l.OOmL，6.38mmol)和4-二甲基^feJ^p比，定(3mg，0.02mmo1)。攪拌反應(yīng)混合物過夜，并減壓下移去溶劑。將殘余物置于乙酸乙酯中，并過濾移去沉淀的脲。將有積一目》文入分液漏斗、洗滌(飽和的NaHC03,鹽水，0.5NHC1，鹽水)、干燥(MgS04)、過濾、并減壓下濃縮來提供白色固體的二-NHS酯產(chǎn)物(1.12g，產(chǎn)率68%)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage90</formula>步耀3-擰三^雜^凝興偶袞i應(yīng)卓舉,為了偶聯(lián)至接頭，在無水DMF中混合2當(dāng)量的肽和l當(dāng)量的三功能性接頭來產(chǎn)生清澈溶液，2分鐘之后加入5當(dāng)量的DIEA。在環(huán)境溫度攪拌混合物14小時(shí)。減壓下移去溶劑，并將粗產(chǎn)物于DCM中的80%TFA中溶解30分鐘來移去Boc基團(tuán)，然后用C18反相HPLC進(jìn)行純化。二聚體的結(jié)構(gòu)用電噴霧質(zhì)鐠確認(rèn)。這個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)將接頭連接至每個(gè)單體的賴氨酸殘基s-氨基的氮原子。該過程用SEQIDNO:1顯示如下。(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK-NH2O《。0o,NHBoc'N一?！穣DMF,D正A(AcG)GLYAfHMGPrr(l-nal)VCQPLR-NH0NH2NH、"、N。YNHBoc(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR-HN^-NH20TFA(AcG)GLYApHMGPrr(l-nal)VCQPLR-NHONH2NH、入0廁NH2(AcG)GLYACHMGPrr(l-nal)VCQPLR—HN^"NH2O,凝^P五G必庶二炎琳遞過減差f凝凝鍵^i^G在無水DMF中混合肽二聚體和等量(基于摩爾計(jì)算)的活化的PEG種類(購(gòu)自NOFCorp.Japan的mPEG-NPC)來提供清澈溶液。5分鐘后，向上述溶液中加入4當(dāng)量的DIEA。于環(huán)境溫度攪拌混合物14小時(shí)，然后用C18反相HPLC純化。PEG化的肽的結(jié)構(gòu)通過MALDI質(zhì)譜確認(rèn)。也通過下文概述的陽離子交換層析對(duì)純化的肽進(jìn)行純化。下圖用SEQIDNO:1顯示mPEG-NPCPEG化。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage92</formula>(AcG)GLYAHMGPET(l-nal)VCQPLR—HN^~NH2-1o遞迎教麼鍵^i^G^;在無水DMF中混合肽二聚體和等量(基于摩爾計(jì)算)的活化的PEG種類(購(gòu)自ShearwaterCorp，USA的PEG-SPA-NHS)來提供清澈溶液。5分鐘后，向上述溶液中加入IO當(dāng)量的DIEA。在環(huán)境溫度攪拌混合物2小時(shí)，然后用C18反相HPLC純化。PEG化的肽的結(jié)構(gòu)通過MALDI質(zhì)鐠確認(rèn)。也通過下文概述的陽離子交換層析對(duì)純化的肽進(jìn)行純化。下圖用SEQIDNO:1顯示PEG-SPA-NHSPEG化。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage93</formula>,凝5:-農(nóng)#離于艾^^^.'調(diào)查了幾種交換載體從未反應(yīng)的(或水解了的)PEG分離上述肽-PEG綴合物的能力、以及其保留起始的二聚體肽的能力。將離子交換樹脂(2-3g)加載入lcm柱，隨后轉(zhuǎn)變?yōu)殁c形式(向柱加載0.2~&011，直至洗出液pH為14，大約5個(gè)柱體積)，然后轉(zhuǎn)變?yōu)闅湫问?用0.1NHCl或0.1MHOAc洗脫，直至與洗出液匹配的裝載pH,大約5個(gè)柱體積)，隨后用25%ACN/水洗滌直至pH為6。將綴合前的肽或肽-PEG綴合物溶解在25%的ACN/水中(10mg/mL)，并將pH用TFA調(diào)整為<3，然后加載至柱。在用2-3個(gè)柱體積的25%ACN/水洗滌并收集5mL級(jí)分之后，將肽用在25%ACN/水中的0.1MNH4OAc洗滌來從柱上釋放下來，再次收集5mL級(jí)分。通過HPLC分析來顯示哪些級(jí)分含有預(yù)期的肽。用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)的分析表明，當(dāng)肽保留在柱上、并用NH40Ac溶液洗脫(通常介于級(jí)分4和10之間)時(shí)，沒有觀察到非綴合的PEG污染。當(dāng)肽在最初的洗滌緩沖液(通常為最初的兩個(gè)級(jí)分)中洗脫時(shí)，沒有觀察到預(yù)期的PEG綴合物和過量的PEG的分離。下列柱成功地保留了肽和肽-PEG綴合物這兩者，并且成功地從非綴合肽中純化肽-PEG綴合物。表3:離子交換樹脂載體來源MonoSHR5/5強(qiáng)陽離子交換預(yù)載柱AmershamBiosciencesSE53纖維素，微粒強(qiáng)陽離子交換載體WhatmanSP瓊脂糖快速流動(dòng)強(qiáng)陽離子交換載體AmcrshamBiosciences實(shí)施例6:合成具有M酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(l國(guó)nal)VCQPLR(MeG)K(SEQIDNO:2)的肽單體的EPO-R激動(dòng)劑肽同型二聚體具有氨基絲列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQIDNO:2)的肽單體的EPO-R激動(dòng)劑肽同型二聚體如實(shí)施例1所述進(jìn)行合成，除了在步驟l中合成的肽單體為(AcG)GLYAC匪GPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQID:2)當(dāng)PEG通過氨基甲酸酯鍵連接至接頭時(shí)，這個(gè)使用SEQIDNO:2的合成的最終產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上可以示例如下^~NH2O當(dāng)PEG通過酰胺鍵連接至接頭時(shí)，這個(gè)使用SEQIDNO:2的合成的最終產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上可以示例如下這個(gè)實(shí)施例描述了多種用來評(píng)估本發(fā)明的EPO-R激動(dòng)劑肽的活性和效能的體外測(cè)試。這些測(cè)試的結(jié)果證明這項(xiàng)發(fā)明的新型肽結(jié)合EPO-R,并激活EPO-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，這些測(cè)試的結(jié)果顯示，新型肽組合物呈現(xiàn)比以前描述的EPO模擬肽令人吃驚的增加的EPO-R結(jié)合親和性和生物學(xué)活性。EPO-R激動(dòng)劑肽單體和二聚體根據(jù)實(shí)施例1或?qū)嵤├?中提供的方法制備。這些肽二聚體的效能用一系列體外活性測(cè)試進(jìn)行評(píng)估，其中包括報(bào)告測(cè)試(reporterassay)、增殖測(cè)試、竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)試和C/BFU-e測(cè)試。實(shí)施例7:體外活性測(cè)試下文進(jìn)一步詳細(xì)描述這四項(xiàng)測(cè)試。表2中概述了這些體外活性測(cè)試的結(jié)果。丄孩普^試這項(xiàng)測(cè)試以從鼠前B細(xì)胞系衍生的報(bào)告細(xì)胞Baf3/EpoR/GCSFRfos/lux作為基礎(chǔ)。這種報(bào)告細(xì)胞系表達(dá)包含人EPO受體的細(xì)胞外部分至人GCSF受體的細(xì)胞內(nèi)部分的嵌合受體。進(jìn)一步向這個(gè)細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染fos啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的荄光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體。通過加入紅細(xì)胞生成劑激活這種嵌合受體，進(jìn)而導(dǎo)致螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)，并因此在加入螢光素酶底物螢光素后產(chǎn)生光。因此，該類細(xì)胞中EPO-R的活化水平可以通過測(cè)定螢光素酶活性來定量。在補(bǔ)充了10%胎牛血清(FBS;Hyclone)、10%WEHI-3上清(WEHI國(guó)3細(xì)胞培養(yǎng)物的上清，ATCC#T1B-68)和青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)BaB/EpoR/GCSFRfos/lux細(xì)胞。測(cè)試前大約18小時(shí)，通過將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充了10%FBS和0.1%WEHI-3上清的DMEM/F12培養(yǎng)基中饑餓它們。在測(cè)試當(dāng)天，用補(bǔ)充了10。/。FBS(無WEHI-3上清)的DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，然后以1xio6個(gè)細(xì)胞/mL在存在已知濃度的測(cè)試肽或以EPO(R&DSystemsInc.，Minneapolis,MN)作為陽性對(duì)照的、補(bǔ)充了10"/oFBS(無WEHI-3上清)的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在這項(xiàng)測(cè)試中同時(shí)檢測(cè)連續(xù)稀釋的測(cè)試肽。將測(cè)試板在37。C、5%的C02大氣中孵育4小時(shí)，之后向每孔中加入螢光素(Steady-Glo;Promega,Madison，WI)。孵育5分鐘之后，在PackardTopcount光度計(jì)(PackardInstrumentCo.,DownersGrove,Ill.)上檢測(cè)光發(fā)射。將光計(jì)數(shù)相對(duì)測(cè)試肽濃度進(jìn)行作圖，并用GraphPad軟件進(jìn)行分析。將產(chǎn)生最大光發(fā)射一半的測(cè)試肽濃度記錄為EC50。Z教源試這項(xiàng)測(cè)試基于鼠前B細(xì)胞系Baf3，經(jīng)轉(zhuǎn)染表達(dá)人EPO-R。所得細(xì)胞系BaF3/Gal4/Elk/EPOR的增殖依賴于EPO-R的活化。細(xì)胞增殖的程度用MTT定量，其中MTT測(cè)試中的信號(hào)與活細(xì)胞的數(shù)量成比例。在旋轉(zhuǎn)燒瓶中將BaF3/Gal4/Elk/EPOR細(xì)月包培養(yǎng)在補(bǔ)充了10%FBS(Hyclone)和2%WEHI畫3上清(ATCC#TIB-68)的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)中。在旋轉(zhuǎn)燒瓶中將培養(yǎng)的細(xì)胞以1x106個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞密度在補(bǔ)充了10%FBS和0.1%WEHI-3上清的DMEM/F12培養(yǎng)基中饑餓過夜。然后將々幾餓的細(xì)胞用Dulbecco'sPBS(Gibco)洗滌兩次，并在補(bǔ)充了10%FBS(無WEHI-3上清)的DMEM/F12中懸浮成1xio6個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞密度。然后取50nL等份(~50，000個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞懸液在96孔測(cè)試板中一式三份放置。向96孔測(cè)試板中加入50jiL等份在補(bǔ)充了10%FBS(無WEHI-3上清I)的DMEM/F12培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋的受試EPO模擬肽、或50pLEPO(R&DSystemsInc.,Minneapolis,MN)或AranespTM(阿法達(dá)貝汀，Amgen商品化的ERO-R激動(dòng)劑)(最終孔體積為100jiL)。例如，可以測(cè)試12個(gè)不同稀釋度，其中測(cè)試肽(或?qū)φ誆PO肽)的終濃度在810pM至0.0045pM的范圍。然后將鋪板的細(xì)胞在37°C孵育48小時(shí)。接下來，向每個(gè)培養(yǎng)皿孔中加入10fiLMTT(RocheDiagnostics),然后孵育4小時(shí)。然后通過加入10。/。SDS+0.01NHC1終止反應(yīng)。然后將平板在37。C孵育過夜。然后通過分光光度法測(cè)定每孔在595nm波長(zhǎng)處的吸光度。將吸光度讀數(shù)對(duì)測(cè)試肽濃度繪圖，并用GraphPad軟件計(jì)算EC50。將導(dǎo)致最大吸光度一半的測(cè)試肽濃度記錄為EC50。3.好'/錄合順'用測(cè)試來進(jìn)行竟?fàn)幮越Y(jié)合計(jì)算，在其中所述測(cè)試中由于下列兩個(gè)珠子的接近作用而產(chǎn)生光信號(hào)具生物素化的EPO-R結(jié)合肽示蹤物的鏈親和素供體珠子和結(jié)合EPO-R的受體珠子。光通過非放射性能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生，其中第一個(gè)珠子在照射后釋放單線態(tài)氧，并且第二個(gè)珠子接觸釋放的單線態(tài)氧后發(fā)射光。這些珠子集合均有售(Packard)。珠子的接近通過EPO-R結(jié)合肽示蹤物結(jié)合EPO-R產(chǎn)生。與EPO-R結(jié)合肽示蹤物竟?fàn)幗Y(jié)合EPO-R的測(cè)試肽阻止這種結(jié)合，從而導(dǎo)致光發(fā)射下降。更加具體而言，所述方法如下向384孔板的孔中加入4nL連續(xù)稀釋的受試EPO-R激動(dòng)劑肽、或陽性或陰性對(duì)照。然后以2jiL/孔加入受體/珠子混合物。受體珠子混合物由15nL5mg/ml的鏈親和素供體珠子(Packard)、15jiL5mg/ml的單克隆抗體abl79(這種抗體識(shí)別包含在重組EPO-R中的人胎盤堿性磷酸酶蛋白的部分)、A蛋白包被的受體珠子(A蛋白將結(jié)合abl79抗體；Packard)、112.5jiL1:6.6稀釋的重組EPO-R(在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中以融合了包含abl79乾表位的人胎盤堿性磷酸酶蛋白的一部分的融合蛋白產(chǎn)生)和607.5jiLAlphaquest緩沖液(40mMHEPES，pH7.4;1mMMgCl2;0.1%BSA，0.05%吐溫20)組成。輕彈混合。以2fiL/孔加入生物素化的EPO-R結(jié)合肽示蹤物(30nM終濃度)。肽示蹤物為EPO-R結(jié)合肽(見表"報(bào)告EC50(pM)"),根據(jù)實(shí)施例1中所述方法用SEQIDNO:4制備。肽示蹤物生物素-gglyacIjhmgpitwvcIqpuigxk-nh2生物素-gglyachmgpitwvcqplrg/離心l分鐘混合。用PackardTopSeal密封平板，并用箔錫紙包裹。在室溫孵育過夜。18小時(shí)后用AlphaQuest讀數(shù)儀(Packard)讀取光發(fā)射值。將光發(fā)射對(duì)肽濃度作圖，并用GraphPad或Excel分析。將導(dǎo)致光發(fā)射相比無測(cè)試肽時(shí)觀察的光發(fā)射下降50%的測(cè)試肽濃度記錄為IC50。4wy試EPO-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激骨髓千細(xì)胞分化成為增殖的血紅細(xì)胞前體。這項(xiàng)測(cè)試檢測(cè)測(cè)試肽刺激來自原代人骨髓多能干細(xì)胞的血紅細(xì)胞前體增殖和分化的能力。為了這項(xiàng)測(cè)試，在補(bǔ)充了10%FBS(Hyclone)的IMDM培養(yǎng)基(Gibco)中連續(xù)稀釋測(cè)試肽。然后將這些連續(xù)稀釋液或陽性對(duì)照EPO肽加入到甲基纖維素中來產(chǎn)生1.5mL的終體積。然后徹底渦旋甲基纖維素和肽混合物。解凍等份(100,000個(gè)細(xì)胞/mL)的人骨髓衍生的CD34+細(xì)胞(Poietics/Cambrex)。在50mL試管中將解凍的細(xì)胞輕輕地加入到0.1mL1mg/ml的DNA酶(StemCells)中。接下來，向細(xì)胞輕輕加入40-50mLIMDM培養(yǎng)基前10mL培養(yǎng)基沿著50mL試管壁逐滴加入，然后將剩余體積的培養(yǎng)基沿著試管壁緩慢加入。然后將細(xì)胞以900轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，并通過輕輕吸取小心地移去培養(yǎng)基。將細(xì)胞重懸于1ml的IMDM培養(yǎng)基中，并在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器載玻片上計(jì)數(shù)每毫升的細(xì)胞密度(以10等份的細(xì)胞懸液置于載玻片上，并且細(xì)胞密度為平均計(jì)數(shù)xlO，000個(gè)細(xì)胞/ml)。然后將細(xì)胞在IMDM培養(yǎng)基中稀釋至15,000個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度。然后每1.5mL甲基纖維素和肽樣品中加入IOOnL稀釋的細(xì)胞(測(cè)試培養(yǎng)基中最終的細(xì)胞濃度為1000個(gè)細(xì)胞/mL),并渦旋混合物。使混合物中的氣泡消失，然后用鈍頭針吸取lmL。將0.25mL從每個(gè)樣品中吸取的混合物加入到24孔板(Falconbrand)4孔的每個(gè)孔中。在濕的培養(yǎng)箱中在37"C、5%C02下孵育鋪板的混合物14天。用相差顯微鏡(5x-l0x物鏡，最終放大倍數(shù)100x)計(jì)數(shù)存在的類紅細(xì)胞集落。將形成的集落數(shù)目相比EPO陽性對(duì)照觀察到的集落數(shù)目為最大值卯％的測(cè)試肽濃度記錄為EC卯[見表2:C/BFU-eEC90。表4:肽二聚體的體外活性測(cè)試<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>實(shí)施例8:體內(nèi)活性測(cè)試這個(gè)實(shí)施例描述了多種用來評(píng)估本發(fā)明的EPO-R激動(dòng)劑肽的活性和效能的體內(nèi)測(cè)試。EPO-R激動(dòng)劑肽單體和二聚體根據(jù)實(shí)施例1中提供的方法制備。這些肽單體和二聚體的體內(nèi)活性用一系列測(cè)試進(jìn)行評(píng)估，其中包括紅細(xì)胞增多的^f氐氧小鼠生物測(cè)試和網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)試。這兩個(gè)測(cè)試在下文進(jìn)一步做詳細(xì)描述。7.ir勿應(yīng)增,辨瓶真V、^^參^試在由Cotes和Bangham(1961),Nature191:1065-1067所述方法改進(jìn)的紅細(xì)胞增多的低氧小鼠生物測(cè)試中測(cè)定測(cè)試肽的體內(nèi)活性。這項(xiàng)測(cè)試檢測(cè)測(cè)試肽作為EPO模擬物發(fā)揮作用即激活EPO-R并誘導(dǎo)新的血紅細(xì)胞合成的能力。血紅細(xì)胞的合成基于摻入合成的血紅細(xì)胞血紅蛋白中的放射標(biāo)記的鐵來定量。將BDF1小鼠在周圍環(huán)境馴化7-10天。測(cè)定所有動(dòng)物的體重，并且不使用低體重動(dòng)物(<15g)。在低壓室中對(duì)小鼠進(jìn)行總共14天的連續(xù)條件循環(huán)。每24小時(shí)的循環(huán)由18小時(shí)0.40±0.02%的大氣壓和6小時(shí)的環(huán)境壓力組成。在條件循環(huán)之后，于給藥之前將小鼠再在環(huán)境壓力維持72小時(shí)。在PBS+0.1%BSA載體(PBS/BSA)中稀釋測(cè)試肽或重組人EPO標(biāo)準(zhǔn)品。先在二甲基亞砜(DMSO)中溶解肽單體母液。陰性對(duì)照組包括一組僅注射PBS/BSA的小鼠、以及一組注射l。/oDMSO的小鼠。每個(gè)劑量組包含10只小鼠。對(duì)小鼠皮下(頸背)注射0.5mL適當(dāng)樣品。注射樣品48小時(shí)之后，對(duì)小鼠腹膜內(nèi)注射0.2mlFe59(Dupont，NEN),達(dá)到大約0.75pCi/小鼠的劑量。在施用Fe"24小時(shí)之后測(cè)定小鼠體重，并在施用Fe5948小時(shí)之后處死小鼠。通過心臟穿刺收集每只動(dòng)物的血液，并測(cè)定血細(xì)胞比容(肝素用作抗凝血?jiǎng)?。用PackardY計(jì)數(shù)器分析每個(gè)血液樣品(0.2ml)的Fe"摻入。將非應(yīng)答小鼠(即那些放射摻入低于陰性對(duì)照組的小鼠)排除出適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)組。也排除血細(xì)胞比容值低于陰性對(duì)照組53%的小鼠。結(jié)果從每個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量10只動(dòng)物的集合中獲得。計(jì)算每組摻入血液樣品的平均放射量每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)。2.河織ir細(xì)應(yīng)謬y試對(duì)正常的BDF1小鼠連續(xù)三天施用(0.5mL,皮下注射)EPO對(duì)照或測(cè)試肽。第三天，還對(duì)小鼠施用(O.lmL,腹膜內(nèi)注射)鐵葡聚糖(100mg/ml)。第五天，用C02麻痹小鼠，并通過心臟穿刺取血。通過噻唑橙染色和流式細(xì)胞儀分析(網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)程序)測(cè)定每個(gè)血液樣品的網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(％)。手動(dòng)測(cè)定血細(xì)胞比容。用下列公式測(cè)定修正的網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)%網(wǎng)織紅細(xì)胞修正的=%網(wǎng)織紅細(xì)胞觀察的x(血細(xì)胞比容個(gè)體/血細(xì)胞比容標(biāo)準(zhǔn))對(duì)正常的CD1小鼠每周一次經(jīng)快速靜脈內(nèi)團(tuán)注施用EPO陽性對(duì)照、測(cè)試肽或載體，共四次。通過改變制劑中活性化合物的濃度來測(cè)試陽性對(duì)照和測(cè)試肽劑量的范圍，其中所述劑量以mg/kg表示。注射的體積為5ml/kg。載體對(duì)照組包含12只動(dòng)物，而剩余劑量組每組為8只小鼠。記錄每天的生存和每周的體重。對(duì)給藥的小鼠禁食，然后通過吸入異氟烷來麻醉，并在第l天(對(duì)栽體對(duì)照小鼠)、以及第15天和第29天(4只小鼠/組/天)通過心臟或腹部大動(dòng)脈穿刺收集定期的血液樣品。將血液轉(zhuǎn)移到Vacutainer⑧牌試管。優(yōu)選的抗凝血?jiǎng)橐叶匪囊宜?EDTA)。用本領(lǐng)域熟知的自動(dòng)化臨床分析器(例如Coulter，Inc.制造的儀器)檢測(cè)血紅細(xì)胞合成和生理性質(zhì)例如血細(xì)胞比容(Hct)、血紅蛋白(Hgb)和總紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)來評(píng)估血液樣品的終點(diǎn)。實(shí)施例9:合成具有^J^酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK(SEQIDNO:l)的肽單體的EPO-R激動(dòng)劑肽同型二聚體步凝7-合成農(nóng)卓謬；肽單體用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc化學(xué)法在ABI431A肽合成儀上用TG-RAM樹脂(0.18mmol/gRappPolymere,德國(guó))合成。為了合成具酰胺化的^J^末端的肽單體，用82.5。/。TFA、5%水、6.25%苯甲醚、6.25%乙二石危醇來從樹脂切割完全組裝的肽。將脫保護(hù)的產(chǎn)物從樹脂濾出，并用二乙醚沉淀。徹底干燥之后，產(chǎn)物通過C18反相高壓液相層析儀純化，使用了在0.1%三氟醋酸中的乙腈/水的梯度。肽的結(jié)構(gòu)通過電噴霧質(zhì)譜確認(rèn)。肽單體示例如下(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK-NH2(犯qjj)N0:",嚴(yán)2-合4'三甜教遂接關(guān)室溫下向在100mLDCM中的亞氨乙酸二乙酯(IO.Og，52.8mmol)和Boc-P-丙氨酸(10.0g，52.8mmol)的溶液中于10分鐘期間加入二異丙基碳二亞胺(8.0mL,51.1mmol)。在添加期間反應(yīng)混合物升溫10度，然后在20分鐘期間冷卻回室溫。攪拌反應(yīng)混合物過夜，并濾去沉淀的二異丙脲。減壓下移去溶劑來產(chǎn)生膠，并將殘余物溶解在乙酸乙酯中，并再次過濾移去額外沉淀的尿素。將有機(jī)相放入分液漏斗，洗滌(飽和的NaHC03,鹽水，0.5NHC1,鹽水)，干燥(MgS04),過濾，并減壓下濃縮來提供無色油狀的二酯產(chǎn)物。將二酯置于1:1的MeOH:THF(100mL)混合物中，并向其中加入水(25mL),然后加入NaOH(5g，125mmol)。pH測(cè)定為>10。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物2小時(shí)，然后用6NHC1酸化為pHl。用NaCl飽和K相，并用乙酸乙酯提取4次。對(duì)合并的有機(jī)相進(jìn)行洗滌(鹽水)、干燥(MgS04)、并減壓下濃縮來產(chǎn)生白色的半固體。將固體溶解在50mLDCM中，并向其中加入300mL己烷來產(chǎn)生白色漿狀物。減壓下移除溶劑來提供白色固體的二酸(14.7g,兩步產(chǎn)率91.5%)。向在20mLDMF中的二酸(1g，3.29mmol)溶液中加入N-羥基琥珀酰亞胺(770mg，6.69mmol)、二異丙基碳二亞胺(1.00mL，6.38mmol)和4-二甲基氨基處吱(3mg，0.02mmo1)。攪拌反應(yīng)混合物過夜，并減壓下移去溶劑。將殘余物置于乙酸乙酯中，并過濾移去沉淀的脲。將有機(jī)相》文入分液漏斗、洗滌(飽和的NaHC03，鹽水，0.5NHC1，鹽水)、干燥(MgS04)、過濾、并減壓下濃縮來提供白色固體的二-NHS酯產(chǎn)物(1.12g，產(chǎn)率68%)。NHBoc#嚴(yán)3-摔三#雜遂凝興偶聯(lián)至農(nóng)豐體為了偶聯(lián)至接頭，在無水DMF中混合2當(dāng)量的肽和1當(dāng)量的三功能性接頭來產(chǎn)生清澈溶液，2分鐘之后加入5當(dāng)量的DIEA。在環(huán)境溫度攪拌混合物14小時(shí)。減壓下移去溶劑，并將粗產(chǎn)物于DCM中的80%TFA中溶解30分鐘來移去Boc基團(tuán)，然后用C18反相HPLC進(jìn)行純化。二聚體的結(jié)構(gòu)用電噴霧質(zhì)鐠確認(rèn)。這個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)將接頭連接至每個(gè)單體的賴氨酸殘基e-氨基的氮原子。用SEQIDNO:1的偶聯(lián)顯示如下。(AcO)GLYACHMGPT(l-iinl)VCQPLRK-NH2VDMF，DIEA(AcG)GLYACHMGPlT(l-nal)VCQPLR-NH.(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR—HN'(AcG)GLYACHMGPIT(l-iial)VCQPUl畫NH'(AcG)GLYACHMGPIT(l-iial)VCQPLR—HN',凝4-合成逸舍兩個(gè)遽過務(wù)扇^迷接W游^尸五C^^尸五G部為、用過量的mPEG2-NPC處理Lysinol(可購(gòu)得)來獲得MPEG2-lysino1,然后與NPC反應(yīng)來形成mPEG2-lysinol-NPC。附尸五Gl2-丄"-層S這個(gè)產(chǎn)物可以從例j口NektarTherapeutics(490DiscoveryDrive,Huntsville，Alabama35806)的分子工程目錄(2003),貨號(hào)2Z3X0T01購(gòu)得。步驟5-農(nóng)二炎謬^尸五G必.'遞過扇差f凝凝鍵#尸￡*(7在無水DMF中以1:2的摩爾比混合肽二聚體和PEG種類(mPEG2-Lysinol-NPC)來提供清澈溶液。5分鐘后，向上述溶液中加入4當(dāng)量的DIEA。于環(huán)境溫度攪拌混合物14小時(shí)，然后用C18反相HPLC純化。PEG化肽的結(jié)構(gòu)通過MALDI質(zhì)譜確認(rèn)。也通過下文概述的陽離子交換層析對(duì)純化的肽進(jìn)行純化。下文用SEQIDNO:1顯示使用mPEG-Lysinol-NPC的PEG化。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage106</formula>遞迎凝麼鍵^/^G化在無水DMF中以1:2的摩爾比混合肽二聚體和PEG種類(來自ShearwaterCorp,USA的mPEG2-Lys-NHS)來提供清澈溶液。5分鐘后，向上述溶液中加入10當(dāng)量的DIEA。于環(huán)境溫度攪拌混合物2小時(shí)，然后用C18反相HPLC純化。PEG化肽的結(jié)構(gòu)通過MALDI質(zhì)譜確認(rèn)。也通過下文概述的陽離子交換層析對(duì)純化的肽進(jìn)行純化。下文用SEQIDNO:1顯示使用mPEG2-Lys-NHS的PEG化。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage107</formula>#凝6:-農(nóng)的庠子^換趁^:調(diào)查了幾種交換載體從未反應(yīng)的(或水解了的)PEG分離上述肽-PEG綴合物的能力、以及其保留起始的二聚體肽的能力。將離子交換樹脂(2-3g)加載入lcm柱，隨后轉(zhuǎn)變?yōu)殁c形式(向柱加載0,2NNaOH，直至洗出液pH為14，大約5個(gè)柱體積)，然后轉(zhuǎn)變?yōu)闅湫问?用0.1NHCl或0.1MHOAc洗脫，直至與洗出液匹配的裝載pH,大約5個(gè)柱體積)，隨后用25%ACN/水洗滌直至pH為6。將綴合前的肽或肽-PEG綴合物溶解在25%的ACN/水中(10mg/mL),并將pH用TFA調(diào)整為<3，然后加載至柱。在用2-3個(gè)柱體積的25%ACN/7JC洗滌并收集5mL級(jí)分之后，將肽用在25%ACN/7JC中的0.1MNH4OAc洗滌來從柱上釋放下來，再次收集5mL級(jí)分。通過HPLC分析來顯示哪些級(jí)分含有預(yù)期的肽。用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)的分析表明，當(dāng)肽保留在柱上、并用NBUOAc溶液洗脫(通常介于級(jí)分4和10之間)時(shí)，沒有觀察到非綴合的PEG污染。當(dāng)肽在最初的洗滌緩沖液(通常為最初的兩個(gè)級(jí)分)中洗脫時(shí)，沒有觀察到預(yù)期的PEG綴合物和過量的PEG的分離。下列柱成功地保留了肽和肽-PEG綴合物這兩者，并且成功地從非綴合肽中純化肽-PEG綴合物表5:離子交換樹脂<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>實(shí)施例10:合成具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPlT(l-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQIDNO:2)的肽單體的EPO-R激動(dòng)劑肽同型二聚體具有氨基餅列(AcG)GLYACHMGPIT(l國(guó)nal)VCQPLR(MeG)K(SEQIDNO:2)的肽單體的EPO-R激動(dòng)劑肽同型二聚體如實(shí)施例1所述進(jìn)行合成，除了步驟l中合成的肽單體為(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQIDNO:2)當(dāng)PEG通過氨基甲酸酯鍵連接至間隔物時(shí)，這個(gè)用SEQIDNO:2合成的最終產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上可以示例如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage109</formula>當(dāng)PEG通過酰胺鍵連接至間隔物時(shí)，這個(gè)用SEQIDNO:2合成的終產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上可以示例如下(<formula>formulaseeoriginaldocumentpage109</formula>實(shí)施例11:體外活性測(cè)試這個(gè)實(shí)施例描述了多種用來評(píng)估本發(fā)明的EPO-R激動(dòng)劑肽的活性和效能的體外測(cè)試。這些測(cè)試的結(jié)果證明這項(xiàng)發(fā)明的新型肽結(jié)合EPO-R，并激活EPO-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，這些測(cè)試的結(jié)果顯示，新型肽組合物呈現(xiàn)比以前描述的EPO模擬肽令人吃驚的增加的EPO-R結(jié)合親和性和生物學(xué)活性。EPO-R激動(dòng)劑的肽單體和二聚體根據(jù)實(shí)施例1或?qū)嵤├?中提供的方法制備。這些肽二聚體的效能用一系列體外活性測(cè)試進(jìn)行評(píng)估，其中包括報(bào)告測(cè)試(reporterassay)、增殖測(cè)試、竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)試和C/BFU-e測(cè)試。下文進(jìn)一步詳細(xì)描述這四項(xiàng)測(cè)試。表2中概述了這些體外活性測(cè)試的結(jié)果。/.孩普豸試這項(xiàng)測(cè)試以從小鼠前B細(xì)胞系衍生的報(bào)告細(xì)胞Baf3/EpoR/GCSFRfos/lux作為基礎(chǔ)。這種報(bào)告細(xì)胞系表達(dá)包含人EPO受體的細(xì)胞外部分至人GCSF受體的細(xì)胞內(nèi)部分的嵌合受體。進(jìn)一步向這個(gè)細(xì)胞系轉(zhuǎn)染fos啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的營(yíng)光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體。通過加入紅細(xì)胞生成劑激活這種嵌合受體，進(jìn)而導(dǎo)致螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)，并因此在加入營(yíng)光素酶底物螢光素后產(chǎn)生光。因此，在該類細(xì)胞中EPO-R的活化水平可以通過測(cè)定螢光素酶活性來定量。在補(bǔ)充了10%胎牛血清(FBS;Hyclone)、10%WEHI-3上清(WEHI曙3細(xì)胞培養(yǎng)物的上清，ATCC#TIB-68)和青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)BaB/EpoR/GCSFRfos/lux細(xì)胞。測(cè)試前大約18小時(shí)，通過將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充了.10%FBS和0.1%WEHI-3上清的DMEM/F12培養(yǎng)基中饑餓它們。在測(cè)試當(dāng)天，用補(bǔ)充了10%FBS(無WEHI-3上清)的DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，然后以1x1(^個(gè)細(xì)胞/mL在存在已知濃度的測(cè)試肽或以EPO(R&DSystemsInc.,Minneapolis,MN)作為陽性對(duì)照的、補(bǔ)充了10%FBS(無WEHI-S上清)的DMEM/Fi:2培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在這項(xiàng)測(cè)試中同時(shí)檢測(cè)連續(xù)稀釋的測(cè)試肽。將測(cè)試板在37°C、5%的C02大氣中孵育4小時(shí)，之后向每孔中加入螢光素(Steady-Glo;Promega，Madison，WI)。孵育5分鐘之后，在PackardTopcouiit光度計(jì)(PackardInstrumentCo.，DownersGrove，IU.)上檢測(cè)光發(fā)射。將光計(jì)數(shù)相對(duì)測(cè)試肽濃度作圖，并用GraphPad軟件進(jìn)行分析。將產(chǎn)生最大光發(fā)射值一半的測(cè)試肽濃度記錄為EC50。這項(xiàng)測(cè)試基于鼠前B細(xì)胞系Baf3,經(jīng)轉(zhuǎn)染表達(dá)人EPO-R。所得細(xì)胞系BaF3/Gal4/Elk/EPOR的增殖依賴于EPO-R的活化。細(xì)胞增殖的程度用MTT定量，其中MTT測(cè)試中的信號(hào)與活細(xì)胞的數(shù)量成比例。將BaF3/Gal4/Elk/EPOR細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)燒瓶中在補(bǔ)充了10%FBS(Hyclone)和2%WEHI畫3上清(ATCC#TIB-68)的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)。將培養(yǎng)的細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)燒瓶中以1x106個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞密度在補(bǔ)充了10%FBS和0.1%WEHI-3上清的DMEM/F12培養(yǎng)基中饑餓過夜。然后將饑餓的細(xì)胞用Dulbecco'sPBS(Gibco)洗滌兩次，并在補(bǔ)充了10%FBS(無WEHI-3上清)的DMEM/F12中懸浮成1x106個(gè)細(xì)胞/毫升的密度。然后取50nL等份(50，000個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞懸液在96孔測(cè)試板中一式三份放置。向96孔測(cè)試板中加入50jtL等份在補(bǔ)充了10%FBS(無WEHI-3上清I)的DMEM/F12培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋的受試EPO模擬肽、或50nLEPO(R&DSystemsInc"Minneapolis,MN)或AranespTM(阿法達(dá)貝汀，Amgen商品化的ERO-R激動(dòng)劑)(最終孔體積為100fiL)。例如，可以測(cè)試12個(gè)不同稀釋度，其中測(cè)試肽(或?qū)φ誆PO肽)的終濃度在810pM至0.0045pM的范圍。然后將鋪板的細(xì)胞在37。C孵育48小時(shí)。接下來，向每個(gè)培養(yǎng)皿孔中加入10fiLMTT(RocheDiagnostics),然后孵育4小時(shí)。然后通過加入10。/oSDS+0.01NHCl終止反應(yīng)。然后將平板在37"C孵育過夜。然后通過分光光度法測(cè)定每孔在595nm波長(zhǎng)處的吸光度。將吸光度讀數(shù)對(duì)測(cè)試肽濃度繪圖，并用GraphPad軟件計(jì)算EC50。將導(dǎo)致最大吸光度一半的測(cè)試肽濃度記錄為EC50。1;^爭(zhēng)遂潛會(huì)^試用測(cè)試來進(jìn)行竟?fàn)幮越Y(jié)合計(jì)算，在其中所述測(cè)試中由于下列兩個(gè)珠子的接近作用而產(chǎn)生光信號(hào)具生物素化的EPO-R結(jié)合肽示蹤物的鏈親和素供體珠子和結(jié)合EPO-R的受體珠子。光通過非放射性能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生，其中第一個(gè)珠子在照射后釋放單線態(tài)氧，并且第二個(gè)珠子接觸釋放的單線態(tài)氧后發(fā)射光。這些珠子集合均已商品化(Packard)。珠子的接近通過EPO-R結(jié)合肽示蹤物結(jié)合EPO-R產(chǎn)生。與EPO-R結(jié)合肽示蹤物竟?fàn)幗Y(jié)合EPO-R的測(cè)試肽阻止這種結(jié)合，從而導(dǎo)致光發(fā)射下降。更加具體而言，所述方法如下向384孔板的孔中加入4nL連續(xù)稀釋的受試EPO-R激動(dòng)劑肽、或陽性或陰性對(duì)照。然后以2jiL/孔加入受體/珠子混合物。受體珠子混合物由15jiL5mg/ml的鏈親和素供體珠子(Packard)、15fiL5mg/ml的單克隆抗體abl79(這種抗體識(shí)別包含在重組EPO-R中的人胎盤堿性磷酸酶蛋白的部分)、A蛋白包被的受體珠子(A蛋白將結(jié)合abl79抗體；Packard)、112.51:6.6稀釋的重組EPO-R(在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中以融合了包含abl79靶表位的人胎盤堿性磷酸酶蛋白的一部分的融合蛋白產(chǎn)生)和607.5jiLAlphaquest緩沖液(40mMHEPES，pH7.4;1mMMgCl2;0.1%BSA，0.05%吐溫20)組成。輕彈混合。以2pL/孔加入生物素化的EPO-R結(jié)合肽示蹤物(30nM終濃度)。肽示蹤物為EPO-R結(jié)合肽(見表"報(bào)告EC50(pM)")，根據(jù)實(shí)施例1中所述方法用SEQIDNO:4制備。肽示蹤物生物素-gglyachmgpitwv3qplrG\k-nh2生物素-gglyachmgpitwvcqplrg/離心1分鐘混合。用PackardTopSeal密封平板，并用箔錫紙包裹。在室溫孵育過夜。18小時(shí)后用AlphaQuest讀數(shù)儀(Packard)讀取光發(fā)射值。將光發(fā)射對(duì)肽濃度作圖，并用GraphPad或Excel分析。記錄為IC50。4.C/BFt7-e刺試EPO-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激骨髓干細(xì)胞分化成為增殖的血紅細(xì)胞前體。這項(xiàng)測(cè)試檢測(cè)測(cè)試肽刺激來自原代人骨髓多能干細(xì)胞的血紅細(xì)胞前體增殖和分化的能力。為了這項(xiàng)測(cè)試，將測(cè)試肽在補(bǔ)充了10。/。FBS(Hyclone)的IMDM培養(yǎng)基(Gibco)中進(jìn)行連續(xù)稀釋。然后將這些連續(xù)稀釋液或陽性對(duì)照EPO肽加入到甲基纖維素中來產(chǎn)生1.5mL的終體積。然后徹底渦旋甲基纖維素和肽混合物。解凍等份(100，000個(gè)細(xì)胞/mL)的人骨髓衍生的CD34+細(xì)胞(Poietics/Cambrex)。在50mL試管中將解凍的細(xì)胞輕輕地加入到0.1mL1mg/ml的DNA酶(StemCells)中。接下來，向細(xì)月包輕輕加入40-50mLIMDM培養(yǎng)基前10mL培養(yǎng)基沿著50mL試管壁逐滴加入，然后將剩余體積的培養(yǎng)基沿著試管壁緩慢加入。然后將細(xì)胞以卯0轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，并通過輕輕吸取小心地移去培養(yǎng)基。將細(xì)胞重懸于lml的IMDM培養(yǎng)基中，并在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器載玻片上計(jì)數(shù)每毫升的細(xì)胞密度(以10fiL等份的細(xì)胞懸液置于載玻片上，并且細(xì)胞密度為平均計(jì)數(shù)x10,000個(gè)細(xì)胞/ml)。然后將細(xì)胞在IMDM培養(yǎng)基中稀釋至15,000個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度。然后每1.5mL曱基纖維素和肽樣品中加入100nL稀釋的細(xì)胞(測(cè)試培養(yǎng)基中最終的細(xì)胞濃度為1000個(gè)細(xì)胞/mL)，并渦旋混合物。使混合物中的氣泡消失，然后用鈍頭針吸取lmL。將0.25mL從每個(gè)樣品中吸取的混合物加入到24孔板(Falconbrand)4孔的每個(gè)孔中。在濕的培養(yǎng)箱中在37°C、5%C02下孵育鋪板的混合物14天。用相差顯微鏡(5x-10x物鏡，最終放大倍數(shù)100x)計(jì)數(shù)存在的類紅細(xì)胞集落。將形成的集落數(shù)目相比EPO陽性對(duì)照觀察到的集落數(shù)目為最大值卯％的測(cè)試肽濃度記錄為EC90[見表2:C/BFU-eEOO]。<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>實(shí)施例12:體內(nèi)活性測(cè)試這個(gè)實(shí)施例描述了多種用來評(píng)估本發(fā)明的EPO-R激動(dòng)劑肽的活性和效能的體內(nèi)測(cè)試。EPO-R激動(dòng)劑肽的單體和二聚體根據(jù)實(shí)施例1中提供的方法制備。這些肽單體和二聚體的體內(nèi)活性用一系列測(cè)試進(jìn)行評(píng)估，其中包括紅細(xì)胞增多的低氧小鼠生物測(cè)試和網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)試。這兩個(gè)測(cè)試在下文進(jìn)一步做詳細(xì)描述。1.iz:翻應(yīng)增/W瓶歲V、處^:參^/試在由Cotes和Bangham(1961)，Nature191:1065-1067所述方法改進(jìn)的紅細(xì)胞增多的低氧小鼠生物測(cè)試中測(cè)定測(cè)試肽的體內(nèi)活性。這項(xiàng)測(cè)試檢測(cè)測(cè)試肽作為EPO模擬物發(fā)揮作用即激活EPO-R并誘導(dǎo)新的血紅細(xì)胞合成的能力。血紅細(xì)胞的合成基于摻入合成的血紅細(xì)胞血紅蛋白中的放射標(biāo)記的鐵來定量。將BDF1小鼠在周圍環(huán)境馴化7-10天。測(cè)定所有動(dòng)物的體重，并且不使用低體重動(dòng)物(<15g)。在低壓室中對(duì)小鼠進(jìn)行總共14天的連續(xù)條件循環(huán)。每24小時(shí)的循環(huán)由18小時(shí)0.40±0.02%的大氣壓和6小時(shí)的環(huán)境壓力組成。在條件循環(huán)之后，于給藥之前將小鼠再在環(huán)境壓力維持72小時(shí)。在PBS+0.1%BSA載體(PBS/BSA)中稀釋測(cè)試肽或重組人EPO標(biāo)準(zhǔn)品。先在二甲基亞砜(DMSO)中溶解肽單體母液。陰性對(duì)照組包括一組僅注射PBS/BSA的小鼠、以及一組注射l。/。DMSO的小鼠。每個(gè)劑量組包含10只小鼠。對(duì)小鼠皮下(頸背)注射0.5mL適當(dāng)樣品。注射樣品48小時(shí)之后，對(duì)小鼠MJ^內(nèi)注射0.2mlFe59(D叩ont，NEN)，達(dá)到大約0.75nCi/小鼠的劑量。在施用Fe"24小時(shí)之后測(cè)定小鼠體重，并在施用Fe"48小時(shí)之后處死小鼠。通過心臟穿刺收集每只動(dòng)物的血液，并測(cè)定血細(xì)胞比容(肝素用作抗凝血?jiǎng)?。用PackardY計(jì)數(shù)器分析每個(gè)血液樣品(0.2ml)的Fe"摻入。將非應(yīng)答小鼠(即那些放射摻入低于陰性對(duì)照組的小鼠)排除出適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)組。也排除血細(xì)胞比容值低于陰性對(duì)照組53%的小鼠。結(jié)果從每個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量10只動(dòng)物的集合中獲得。計(jì)算每組摻入血液樣品的平均放射量[每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)。2河織ir^^^承y試對(duì)正常的BDF1小鼠連續(xù)三天施用(0.5mL，皮下注射)EPO對(duì)照或測(cè)試肽。第三天，還對(duì)小鼠施用(0.1mL，腹膜內(nèi)注射)鐵葡聚糖(100mg/ml)。第五天，用C02麻痹小鼠，并通過心臟穿刺取血。通過瘞唑橙染色和流式細(xì)胞儀分析(網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)程序)測(cè)定每個(gè)血液樣品的網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(％)。手動(dòng)測(cè)定血細(xì)胞比容。用下列公式測(cè)定修正的網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)%網(wǎng)織紅細(xì)胞修正的=%網(wǎng)織紅細(xì)胞觀察的x(血細(xì)胞比容個(gè)體/血細(xì)胞比容標(biāo)準(zhǔn))對(duì)正常的CD1小鼠每周一次經(jīng)快速靜脈內(nèi)團(tuán)注施用EPO陽性對(duì)照、測(cè)試肽或載體，共四次。通過改變制劑中活性化合物的濃度來測(cè)試陽性對(duì)照和測(cè)試肽劑量的范圍，其中所述劑量以mg/kg表示。注射的體積為5ml/kg。載體對(duì)照組包含12只動(dòng)物，而剩余劑量組每組為8只小鼠。記錄每天的生存和每周的體重。對(duì)給藥的小鼠禁食，然后通過吸入異氟烷來麻醉，并在第l天(對(duì)載體對(duì)照小鼠)、以及笫15天和第29天(4只小鼠/組/天)通過心臟或腹部大動(dòng)脈穿刺收集定期的血液樣品。將血液轉(zhuǎn)移到Vacutainer⑧牌試管。優(yōu)選的抗凝血?jiǎng)橐叶匪囊宜?EDTA)。用本領(lǐng)域熟知的自動(dòng)化臨床分析器(例如Coulter,Inc.制造的儀器)檢測(cè)血紅細(xì)胞合成和生理性質(zhì)例如血細(xì)胞比容(Hct)、血紅蛋白(Hgb)和總紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)來評(píng)估血液樣品的終點(diǎn)。實(shí)施例13:動(dòng)物和人正常健康志愿者(NHV)血紅蛋白水平的增加丄，g迷基于非臨床和臨床數(shù)據(jù)，完全合成的EPO受體激動(dòng)劑肽I具有安全且有效地減輕EPO生產(chǎn)不足續(xù)發(fā)的貧血的潛能。預(yù)期肽I具有一些超過目前可用的EPO產(chǎn)品的潛在優(yōu)點(diǎn)，其中所述優(yōu)點(diǎn)包括延長(zhǎng)的半衰期和藥物動(dòng)力學(xué)活性，具有期望的每3-4周的劑量間隔，這可以解釋為改善的便利性和順應(yīng)性；降低的抗體介導(dǎo)的純紅細(xì)胞發(fā)育不全(PRCA)的可能性，這是因?yàn)闆]有與內(nèi)源EPO共有的共同氨基酸序列；治療患有PRCA的患者的潛能，其中所述的PRCA由針對(duì)商業(yè)可獲得的EPO的抗體與內(nèi)源EPO交叉反應(yīng)引起；以及增強(qiáng)的穩(wěn)定性，具有與蛋白質(zhì)療法相比室溫下延長(zhǎng)的貯存期限。因?yàn)殡腎的一級(jí)絲餅列與重組的人EPO(rHuEPO)不同，所以其誘導(dǎo)抗內(nèi)源EPO交叉反應(yīng)性免疫應(yīng)答的可能性較小。盡管非常罕見，但交叉反應(yīng)性免疫應(yīng)答可引起伴隨著重組人ESA和內(nèi)源EPO都喪失效能的嚴(yán)重負(fù)作用。此外，因?yàn)殡腎是合成的肽，所以其生產(chǎn)避免了重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品可能出現(xiàn)的宿主細(xì)胞物質(zhì)污染藥物的潛在風(fēng)險(xiǎn)。2.農(nóng)/^動(dòng)參*#秀參/七'謝動(dòng)力夢(mèng)在小鼠、大鼠(正常紅細(xì)胞的(normocythemic)和腎切除的)、狗、兔和猴中進(jìn)行單一或者重復(fù)的劑量給藥之后，觀察到肽I是有效的具有劑量依賴活性的紅細(xì)胞生成刺激劑。在大鼠和猴子中的藥理學(xué)研究表明，通過血紅蛋白水平測(cè)定的網(wǎng)織紅細(xì)胞(未成熟的RBC)和RBC的上升是劑量成比例的。在大鼠、狗和猴子中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究證明了肽I與當(dāng)前商品化的rHuEPO產(chǎn)品相比持久的血漿持續(xù)性。在大鼠中的消除半衰期(t^)范圍為21.5-30.7小時(shí)，在狗中為73.7小時(shí)。肽I的生物學(xué)分布主要為血漿級(jí)分。對(duì)5/6腎切除大鼠進(jìn)行9.87mg肽I/kg的靜脈內(nèi)施用之后，t1/2約為48小時(shí)，清除率低至0.763mL/小時(shí)/kg(與正常紅細(xì)胞的大鼠的1.44mL/小時(shí)/kg相比)，產(chǎn)生增加的AUC倍數(shù)1.8。2.農(nóng)/在乂尹^^參動(dòng)力夢(mèng)和^參Y七'謝動(dòng)力夢(mèng)2./.凝迷和才法肽I在一次1期研究中在20名NHV中進(jìn)行了測(cè)試。肽I這種第一次在人中的研究為隨才幾、雙盲、安慰劑對(duì)照、單劑量、IV、增加的劑量、安全性和耐受性的實(shí)驗(yàn)。研究的主要目的是評(píng)估肽I的安全性和藥物代謝動(dòng)力學(xué)，以及確定藥學(xué)有效劑量(PAD)。將7名雄性志愿者的組以5:2的比率安排來接受單劑量的肽I或安慰劑。以增加的劑量水平添加組，直至觀察到PAD，其中所述PAD通過血紅蛋白自基線值的增加來確定，并在另一志愿者的組中重復(fù)鑒定為PAD的劑量水平點(diǎn)。對(duì)登i6的4個(gè)組以肽I劑量分別為0.025、0.05、0.1mg/kg和0.1mg/kg(每組單一劑量)的連續(xù)方式開始研究。研究結(jié)果表明，在第3組接受0.1mg/kg肽I后網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白水平增加。在第4組中重復(fù)這一劑量來證實(shí)在第3組中觀察到的結(jié)果。如此地，研究結(jié)束。下文概述了非盲法的結(jié)果。"^參動(dòng)力#潛果顯示網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(絕對(duì)數(shù)和百分?jǐn)?shù))隨肽I劑量增加的劑量依賴性增加。在所有劑量組中網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)在給藥后大約7天達(dá)到最大值。比較最大網(wǎng)織紅細(xì)胞應(yīng)答和網(wǎng)織紅細(xì)胞對(duì)時(shí)間的曲線(AUC(M4天和AUC0.28天)，劑量組間顯示顯著差異(p<0.05)。在給藥后28天期間的血紅蛋白應(yīng)答和自基線的改變(均為平均數(shù)和最大值)表現(xiàn)出伴隨肽I劑量增加的劑量依賴性增加，而對(duì)照組在研究相關(guān)的血液繪圖之后沒有外源的紅細(xì)胞生成刺激的時(shí)間里表現(xiàn)為血紅蛋白輕微下降單因素方差分析(ANOVA),0.0001的p值。用使用混合模型的單因素協(xié)方差分析(ANCOVA)來比較所有四組中個(gè)體隨時(shí)間自基線的變化。這種分析的結(jié)果顯示所有四個(gè)劑量組間的顯著性劑量應(yīng)答(p-0.0001),其中0.025和0.1mg/kg組間差異顯著(p-0.0027),其中0.05和0.1mg/kg組間差異也顯著(p-0.0113)。肽I伴隨血紅蛋白增加至少1.0g/dL的PAD為0.1mg/kg。此外，在給藥后42天里監(jiān)測(cè)組3和組4(0.1mg/kg肽I或安慰劑)的受試者。在第42天，平均血紅蛋白水平在用0.1mg/kg肽I處理的受試者中恢復(fù)到基線，但在安慰劑的受試者中仍低于基線值。因此，在貫穿研究的第42天，施用0.1mg/kg肽I的受試者和施用安慰劑的受試者之間血紅蛋白自基線變化的差異>0.5g/dL。血清的EPO水平隨肽I劑量增加而瞬間下降。其它藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化(紅細(xì)胞數(shù)和血細(xì)胞比容增加、鐵蛋白和網(wǎng)織紅細(xì)胞血紅蛋白含量瞬間減少、可溶性運(yùn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)瞬間增加以及EPO瞬間減少)與刺激紅細(xì)力包生成一致。秀#/七'謝動(dòng)力辯果在5分鐘期間靜脈內(nèi)施用0.025、0.05和0.1mg/kg肽I后，藥物濃度一般在輸注起始后的5分鐘至1小時(shí)之間達(dá)到峰值。在0.025mg/kg劑量組中，肽I濃度在5-15分鐘之間達(dá)到峰值，而0.1mg/kg劑量的tmax接近l小時(shí)。達(dá)到Cn^后，血漿濃度下降，并且一般在0.025mg/kg劑量后高達(dá)96小時(shí)都可以進(jìn)行計(jì)量(>25ng/mL)，0.05mg/kg劑量高達(dá)5天，并且0.1mg/kg劑量高達(dá)7天。計(jì)算顯示，0.1mg/kg劑量的半衰期有小幅增加，在0.025mg/kg劑量后范圍為16.7-21.9小時(shí)(平均19.2小時(shí))，在0.05mg/kg劑量后為15.3-25.1小時(shí)(平均18.7小時(shí))，并且在0.1mg/kg劑量后為17.7-33.1小時(shí)(平均23.5小時(shí))。藥物的分布和消除表現(xiàn)為不遵循標(biāo)準(zhǔn)的一室或二室動(dòng)力學(xué)。僅在較低的藥物濃度觀察到第一級(jí)動(dòng)力學(xué)，這表明血漿濃度的代謝/消除過程的飽和度大于大約400ng/mL。分布體積顯示隨劑量幾乎沒有變化(0.025、0.05和0.1mg/kg劑量分別為平均2165、1903和2010mL)。血漿清除率顯示隨劑量的小的降低，0.025、0.05和0.1mg/kg劑量的幾何平均數(shù)分別為78.0、70.7和59.2mL/小時(shí)。劑量歸一化的C咖x和AUQ(o-無窮)數(shù)據(jù)的ANOVA表明，Cmax與劑量具有線性相關(guān)性。然而，AUC(。-無努)在最高劑量0.1mg/kg顯示非線性的證據(jù)，這可能與在更高劑量時(shí)觀察到的藥物清除率小幅下降有關(guān)。2乂安全絲果15名受試者(8人中4人服用安慰劑，并且20人中11人服用肽I)經(jīng)歷了總共28例不良事件(AE)(安慰劑組中6例，并且肽I組中22例)。對(duì)于服用肽I的受試者，頭痛(4/20，20.0%)和腹痛((2/20，10.0%)、惡心((2/20，10.0%)和鼻咽炎((2/20，10.0%)是較頻繁報(bào)告的事件。所有不良事件(AE)，除一例外，等級(jí)評(píng)定都為輕微(l級(jí))。認(rèn)為肽I受試者中(15/22)觀測(cè)到的大多數(shù)AE可能與研究藥物肽I無關(guān)。4組之間AE的頻率、嚴(yán)重性或模式都沒有差異。沒有嚴(yán)重不良事件(SAE)或由于AE而在研究中停藥；然而，一名給0.025mg/kg劑量肽I的受試者由于輕微藥物反應(yīng)而停止了研究藥物。這種反應(yīng)在輸注2分鐘后開始，其為胸部開始出現(xiàn)潮紅、并擴(kuò)張到面部、感覺發(fā)熱、不舒服以及咽喉刺痛。作為安全預(yù)防，這名受試者停止輸注。癥狀自發(fā)且迅速地消退。無需治療介入。生命體征上沒有變化。實(shí)驗(yàn)室參數(shù)正常，其中所述參數(shù)包括額外的免疫測(cè)試；因此，無法解釋這種特異性質(zhì)的反應(yīng)。許多藥物都觀察到類似(或更嚴(yán)重的)藥物反應(yīng)，包括其它ESA。此外，應(yīng)在靜脈內(nèi)施用肽I期間觀察患者。如果患者產(chǎn)生類似癥狀，那么停止注射。一名安慰劑受試者和一名肽I受試者分別伴隨藥物治療產(chǎn)生輕^L頭痛和輕微的腹部絞痛。生命體征、心電圖(ECG)或?qū)嶒?yàn)值在臨床上沒有顯著變化。在這次實(shí)驗(yàn)中沒有受試者產(chǎn)生對(duì)肽I的特異抗體。25總而言之，肽I在單次靜脈內(nèi)施用0.025、0.05或0.1mg/kg的劑量后表現(xiàn)出安全性和良好的耐受性，具有與安慰劑類似的安全鐠。藥物代謝動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明，0.1mg/kg劑量的半衰期范圍為大約15-33小時(shí)，平均23.5小時(shí)。所有劑量的中位數(shù)相當(dāng)，在輸注開始后15分鐘出現(xiàn)。C腿表現(xiàn)為與劑量具有線性關(guān)系；AUCV^)在0.1mg/kg劑量表現(xiàn)為非線性。僅在較低藥物濃度下觀察到一級(jí)動(dòng)力學(xué)，這表明血漿濃度的代謝/消除過程的飽和度〉400ng/mL。在評(píng)估的所有劑量肽I都顯示出對(duì)網(wǎng)織紅細(xì)胞的藥學(xué)活性；通常，應(yīng)答是劑量依賴性的，隨劑量增加應(yīng)答更明顯并且更長(zhǎng)。由于0.1mg/kg劑量組在10名肽I受試者中伴隨著血紅蛋白自基線的臨床和統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加，具有自基線的平均最大增加1.36±0.39g/dL，所以將其定義為NHV中的PAD。其它藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化(紅細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞比容增加、鐵蛋白和網(wǎng)織紅細(xì)胞血紅蛋白含量瞬間減少、可溶性運(yùn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)瞬間增加以及EPO瞬間減少)與刺激紅細(xì)胞生成一致。2005年6月4日在Stockholm舉辦的歐洲血液學(xué)協(xié)會(huì)第10次年度會(huì)120議(EuropeanHematologyAssociation10thAnnualCongress)上展示的展板和摘要#0470在此處以其整體引入作為參考。實(shí)施例14:透析前、透析以及腫瘤患者血紅蛋白水平的增加丄遽浙#,悉者在不進(jìn)行透析、并且先前未服用紅細(xì)胞生成刺激劑(ESA)治療的慢性腎病(CKD)患者中進(jìn)行肽I注射的單靜脈內(nèi)劑量的安全性、藥物動(dòng)力學(xué)以及藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究，其為隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照、依次劑量增加的研究。這項(xiàng)研究將評(píng)估單靜脈內(nèi)注射(IV)劑量水平的肽I在不進(jìn)行透析(透析前患者)的CDK患者中的安全語(safetyprofile)。這項(xiàng)研究也將評(píng)估單劑量的肽I與藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的劑量應(yīng)答關(guān)系，其中所述的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)包括血紅蛋白、網(wǎng)織紅細(xì)胞和鐵的存儲(chǔ)；評(píng)估在透析前患者中由靜脈內(nèi)施用單劑量水平的肽I的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜；確定在透析前患者中靜脈內(nèi)施用的藥學(xué)有效劑量(PAD)，例如使>70%的患者實(shí)現(xiàn)血紅蛋白自基線的增加^lg/dL的劑量。研究的終點(diǎn)包括不良事件(AE)、嚴(yán)重不良事件(SAES)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，其中包括Cmax、AUCo-tAUC。-無窮、t訓(xùn)、Vd和CL、藥理學(xué)參數(shù)，其中包括網(wǎng)織紅細(xì)胞、血紅蛋白、網(wǎng)織紅細(xì)胞的血紅蛋白含量以及鐵存儲(chǔ)的血清測(cè)定值(例如血清鐵蛋白、運(yùn)鐵蛋白飽和度和運(yùn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì))、自基線的平均血紅蛋白變化、自基線的最大血紅蛋白變化、實(shí)現(xiàn)血紅蛋白自基線增加》lg/dL的受治療患者的比率、以及血紅細(xì)胞輸注的頻率。選來進(jìn)行研究的患者為年齡在18-75歲、慢性腎病之后血紅蛋白>9g/dL并且Cllg/dL、以前未進(jìn)行ESA治療的透析前患者，登記滿足合格標(biāo)準(zhǔn)的患者。在9名患者的每組中，將患者隨機(jī)分配來接受單次劑量的肽I(11=7)或安慰劑(n=2)。為確保每組中有5名肽I處理患者至少22天的數(shù)據(jù)可用，將替換掉組中在22天前終止研究的第三名和隨后患者。將每名替代的患者指定為與退出的患者相同的處理組。不替換22天后自研究中止的患者。計(jì)劃連續(xù)登記多達(dá)6個(gè)劑量水平組(多達(dá)4個(gè)計(jì)劃的劑量水平和2個(gè)額外的較低的中間的、和/或重復(fù)[證實(shí)的劑量水平)，其中所述劑量水平由獨(dú)立安全監(jiān)督者(IndependentSafetyMonitor)、研究者(Investigator)和贊助商(Sponsor)確定。這次實(shí)驗(yàn)中最多登記54名可評(píng)估的患者。期望研究中的每名患者參與至少28天下述劑量處理。每名患者接受單次劑量的肽I或安慰劑。計(jì)劃的依次肽I劑量水-尿肽I劑量fmg/kg)0.050.10.20.3額外的證實(shí)性中間的或較低的劑量額外的證實(shí)性中間的或較低的劑量為:這是每組9名透析前患者高達(dá)G劑量組的隨^L、雙盲、安慰劑對(duì)照、依次劑量增加的研究。在每組中，監(jiān)測(cè)患者29天或者直至隨后發(fā)生的任何不良事件穩(wěn)定。監(jiān)測(cè)所有患者的血紅蛋白水平直到提高的水平恢復(fù)到基線水平的0.5g/dL內(nèi)?；€的血紅蛋白濃度定義為研究用藥前三個(gè)最近血紅蛋白值的平均值。在研究中，決定每組起始或結(jié)束的血紅蛋白變化需要用下一連續(xù)的血紅蛋白值來確定。如果患者的血紅蛋白水平達(dá)到14g/dL,若有臨床指示，那么應(yīng)對(duì)患者進(jìn)行靜脈切開放血。如果患者的血紅蛋白水平達(dá)到16g/dL(已確定)，那么應(yīng)對(duì)患者進(jìn)行靜脈切開放血。在對(duì)第一組給藥后，隨后加入的下一劑量水平的另一組將基于實(shí)驗(yàn)方案指示的劑量增加標(biāo)準(zhǔn)。下一劑量水平組的劑量增加基于實(shí)驗(yàn)方案指示的停止標(biāo)準(zhǔn)來中止。非盲法的獨(dú)立安全監(jiān)督者將在正進(jìn)行的基礎(chǔ)上參考非盲法的臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來確定何時(shí)滿足劑量增加或中止標(biāo)準(zhǔn)。研究者臨M員和贊助商臨床人員不知道個(gè)體患者的處理安排和患者鑒定的PK、血液學(xué)和鐵參數(shù)結(jié)果，其中所述結(jié)果包括血細(xì)胞比容、血紅蛋白、MCHC(平均細(xì)胞血紅蛋白濃度)、MCH(平均細(xì)胞血紅蛋白)，MCV(平均細(xì)胞體積)、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和網(wǎng)織紅細(xì)胞血紅蛋白含量、或鐵存儲(chǔ)結(jié)果，其中所述鐵存儲(chǔ)結(jié)果包括鐵蛋白、運(yùn)鐵蛋白飽和度和運(yùn)4失蛋白受體蛋白質(zhì)；但這些工作人員在研究過程中可以檢查這些參數(shù)經(jīng)鑒定的結(jié)果。這些工作人員不知道所鑒定的這些參數(shù)的結(jié)果的患者，這時(shí)因?yàn)槿绻b定了結(jié)果的患者，那么處理安排就可能不是盲法的。當(dāng)組中所有可評(píng)估患者(不少于7名)到達(dá)22天，如果未鑒定到安全性問題，并且組中沒有患者實(shí)現(xiàn)血紅蛋白》1.0g/dL的增加，或者所有接受肽I并實(shí)現(xiàn)血紅蛋白自基線增加>1.0g/dL的患者顯示在最小兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)期間的穩(wěn)定性(0.5g/dL血紅蛋白峰值之內(nèi))或可逆性(血紅蛋白峰值下降)，那么對(duì)下一組開始增加劑量是允許的。如果碰到下列條件中的任何一項(xiàng)，那么向當(dāng)前組中加入新患者以及增加至新劑量都將停止組中2名或多名患者出現(xiàn)3或4級(jí)肽I相關(guān)的不良事件；組中接受肽I的2名或多名接受肽I的患者在任意四周時(shí)間期間血紅蛋白增加》2.0g/dL(增加自基線水平開始)；或者組中接受肽I的2名或多名患者的血紅蛋白超過目標(biāo)范圍上限(>13g/dL)。如果未鑒定出安全問題，那么在組中所有評(píng)估患者(不少于7名)到達(dá)22天后開始額外的9名患者組來研究證實(shí)性(重復(fù))的較低或者中間劑期望透析前患者測(cè)定的PAD為0.025-0.2mg/kg、可能0.05-0.1mg/kg、可能0.067-0.075mg/kg。2邊浙悉者進(jìn)行在慢性血液透析患者中靜脈內(nèi)注射施用肽I來維持貧血治療的安全性、藥物動(dòng)力學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)的劑量探測(cè)研究，以便測(cè)定每月由靜脈內(nèi)施用肽I的劑量范圍，其中所述研究是公開標(biāo)記的、多中心的、連續(xù)的，并且其中所述每月劑量范圍使血紅蛋白值對(duì)紅細(xì)胞生成素a(Epoetinalfa)穩(wěn)定的血液透析患者的血紅蛋白維持在高于1.0g/dL或低于基線之內(nèi)。這項(xiàng)研究也評(píng)估在血液透析患者中經(jīng)靜脈施用高達(dá)3次劑量的肽I的安全鐠，評(píng)估在血液透析患者(研究患者亞組)中經(jīng)靜脈內(nèi)施用高達(dá)3次劑量的肽I的藥物代謝動(dòng)力學(xué)鐠。研究的終點(diǎn)包括血紅蛋白自基線的平均每周變化、經(jīng)過13周血紅蛋白在1.0g/dL以上或基線以下的患者的數(shù)量(％);經(jīng)過13周血紅蛋白維持在9.5-13.0g/dL內(nèi)的患者數(shù)量(％);研究期間未調(diào)整劑量的患者數(shù)量(%)和研究期間劑量增加或減少的患者數(shù)量(％)、血紅細(xì)胞輸注頻率；額外的藥學(xué)參數(shù)，其中包含網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(絕對(duì)值和AUC)、網(wǎng)織紅細(xì)胞血紅蛋白含量和鐵儲(chǔ)量的血清測(cè)定值(例如，血清鐵蛋白、運(yùn)鐵蛋白飽和度和可溶性運(yùn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì))；不良事件；嚴(yán)重不良事件；以及藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，其中包括Cmax、AUC(MAUCo.無窮、t1/2e、Vd、Vss和CL(研究患者亞組)。用藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物動(dòng)力學(xué)分析的結(jié)果測(cè)定初級(jí)轉(zhuǎn)換系數(shù)(preliminaryconversionfactor)，其基于每周的紅細(xì)胞生成素a(Epoetinalfa)劑量來最好地預(yù)測(cè)肽I的每月劑量。選來進(jìn)行研究的患者是年齡在18歲或以上、血紅蛋白用穩(wěn)定劑量的商品化紅細(xì)胞生成素ot維持穩(wěn)定的血液透析患者，登記滿足合格條件的患者。計(jì)劃在3-10個(gè)臨床中心登記每組15名患者的多達(dá)4個(gè)連續(xù)劑量水平的組。為確保接受三次肽I劑量的每組中最少有10名患者數(shù)據(jù)可用，將替換掉組中在接受笫三次劑量之前終止研究的第6名和隨后的患者，最多可替換掉四名患者。不替換接受三次劑量后中止研究的患者。最初計(jì)劃依次加入兩個(gè)劑量水平組。根據(jù)觀察得到的安全譜和藥理學(xué)反應(yīng)，可以加入多達(dá)2個(gè)額外的每組15名患者的組來研究較低的中間的、和/或者重復(fù)的(證實(shí)的)劑量水平、和/或施用頻率。這個(gè)實(shí)驗(yàn)中可登記最少30名并且最多60名可評(píng)估的患者。期望研究中的每名患者在4周篩選期之后參與大約15周。根據(jù)支持性數(shù)據(jù)的有效性，計(jì)劃對(duì)給藥持續(xù)時(shí)間進(jìn)行延長(zhǎng)另外12周的修改。肽I劑量每4周施用1次，共施用3次劑量，其在透析的最后15分鐘以快速的靜脈內(nèi)團(tuán)注30秒來施用。組中的每名患者接受公開標(biāo)記劑量的肽I，其中所述劑量起始于預(yù)先指定的紅細(xì)胞生成素OC至肽I的轉(zhuǎn)變水平。下一組基于先前組觀察到的劑量應(yīng)答關(guān)系而增加或向下降低劑量。計(jì)劃的肽I起始劑量水平轉(zhuǎn)換為組100U/kg/周紅細(xì)胞生成素oc至肽I劑量(mg/kg/Q4W)轉(zhuǎn)換系數(shù)起始組0.033增加組或降低組對(duì)于增加組，為0.041一0.050對(duì)于降低組，為0.017-0.025中間組或證實(shí)組待確定中間組或證實(shí)組待確定在個(gè)體患者中肽I的劑量可以進(jìn)行如下調(diào)整。以肽I研究藥物的第三劑量開始，如果證實(shí)患者的血紅蛋白自基線下降大于1.0g/dL、或者證實(shí)患者的血紅蛋白自基線下降》0.5g/dL而到達(dá)llg/dL以下的水平，那么劑量將增加25%。以研究藥物的第三劑量開始，如果證實(shí)患者的血紅蛋白自基線增加大于1.5g/dL、或者證實(shí)患者的血紅蛋白自基線增加>0.5g/dL而到達(dá)12g/dL以上的水平，那么劑量將下降25%。如果在研究期間的任何時(shí)間證實(shí)患者的血紅蛋白在任意2周期間增加(自基線增加)大于1.0g/dL，那么下一個(gè)劑量將減少25%。如果在研究期間的任何時(shí)間證實(shí)患者的血紅蛋白超過12.5g/dL,那么將延遲下一個(gè)劑量直至血紅蛋白降低到12.0g/dL，并且劑量將減少25%?；€的血紅蛋白濃度定義為在施用研究藥物之前3周的3個(gè)最近星期三所收集的透析前血紅蛋白值的平均值。研究期間，進(jìn)行個(gè)體劑量調(diào)整或組起始或中止標(biāo)準(zhǔn)判斷的血紅蛋白水平的變化需要用7天內(nèi)任意時(shí)間重復(fù)的血紅蛋白值來確認(rèn)。這是每組15名血液透析患者、2-4個(gè)處理組、公開標(biāo)記的相繼劑量揮:究實(shí)驗(yàn)。每名患者每四周1次地共接受3次劑量的靜脈內(nèi)注射的肽I劑量。在接受第一次劑量的肽I后，患者在整個(gè)研究期間至少每周觀察一次。研究期間，纟失的狀態(tài)才艮才居KidneyDiseaseOutcomesQualityInitiative(K/DOQI)的治療方針進(jìn)行維持。125在最后施用肽I之后，最少監(jiān)測(cè)患者42天，或者直到隨后出現(xiàn)的不良事件穩(wěn)定為止。停止處理后，監(jiān)測(cè)所有患者的血紅蛋白水平直至其恢復(fù)到目標(biāo)范圍。如果患者的血紅蛋白水平達(dá)到14g/dL(經(jīng)確認(rèn)的)，那么將根據(jù)研究者的判斷對(duì)患者進(jìn)行靜脈切開放血。如果患者的血紅蛋白水平達(dá)到16g/dL(經(jīng)確認(rèn)的)，那么將對(duì)患者進(jìn)行靜脈切開放血。靜脈切開放血的方法根據(jù)位置的標(biāo)準(zhǔn)臨床實(shí)踐(thesite'sstandardclinicalpractice)進(jìn)行。記錄靜脈切開放血的體積。進(jìn)行靜脈切開放血開的患者中止服用肽I，并將靜脈切開放血后的藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)將排除在分析之外。對(duì)第一組給藥后，隨后基于實(shí)驗(yàn)方案特定的劑量增加和降低標(biāo)準(zhǔn)來加入下一組。一旦確定了適當(dāng)?shù)膭┝克睫D(zhuǎn)換系數(shù)，那么將在證實(shí)性組中重復(fù)轉(zhuǎn)換系數(shù)劑量水平。獨(dú)立安全監(jiān)督者和贊助者將在正進(jìn)行的基礎(chǔ)上參考臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來確定何時(shí)滿足劑量增加、減少、額外的組或中止標(biāo)準(zhǔn)。第7周開始，檢查登記在組中的6名或多名患者的數(shù)據(jù)，如果獨(dú)立安全監(jiān)督者未鑒定出安全問題、并且組合的6名或多名患者確認(rèn)血紅蛋白在第7周或之后自基線下降超過1.0g/dL,那么可停止登記入當(dāng)前組，并且允許下一組增加劑量。第7周開始，檢查登記在組中的6名或多名患者的數(shù)據(jù)，如果獨(dú)立安全監(jiān)督者未鑒定出安全問題、并且組合的6名或多名患者確認(rèn)血紅蛋白在第7周或之后自基線增加超過1.0g/dL達(dá)到大于13.0g/dL的血紅蛋白值、或者確認(rèn)血紅蛋白在研究開始后的任意兩周期間增加超過1.0g/dL(自基線以上開始增加)，那么可停止登記入當(dāng)前組，并且允許下一組P爭(zhēng)低劑量。第7周開始，檢查登記在組中的IO名或更多患者的數(shù)據(jù)時(shí)，如果獨(dú)立安全監(jiān)督者未鑒定出安全問題，那么開始額外的組來研究較低或中間的(介于當(dāng)前和先前研究之間的)轉(zhuǎn)換系數(shù)、和/或施用頻率。最多加入兩個(gè)額外組。在檢查了登記在組中的IO名或更多患者的第7周數(shù)據(jù)后，如果獨(dú)立安全監(jiān)督者未鑒定出安全問題、并且不滿足劑量增加或劑量減少規(guī)則，那么可啟動(dòng)使用相同轉(zhuǎn)換系數(shù)的證實(shí)組來重復(fù)相同的轉(zhuǎn)換系數(shù)和/或施用頻率。如果滿足下述標(biāo)準(zhǔn)即組中3名患者出現(xiàn)肽I相關(guān)的3級(jí)或4級(jí)不良事件，那么當(dāng)前組停止加入新患者，并且停止增加至新劑量。預(yù)計(jì)對(duì)透析前患者測(cè)定的PAD為0.025-0.2mg/kg、可能0.05-0.1mg/kg、可能0.067-0.075mg/kg。進(jìn)行在患有化學(xué)療法誘導(dǎo)的貧血(CIA)的腫瘤患者中皮下施用肽I的安全性、藥物動(dòng)力學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)的公開標(biāo)記、多中心劑量增大的研究來測(cè)定伴隨著患有化學(xué)誘導(dǎo)的貧血的患者體內(nèi)的血紅蛋白應(yīng)答的每三周經(jīng)皮下(SC)注射施用的肽I劑量。其它目的包括評(píng)估在接受并發(fā)骨髓抑制化學(xué)治療的癌癥患者中每三周1次地皮下施用多達(dá)4次劑量肽I的安全譜；測(cè)定在患有CIA的患者中不同劑量水平肽I的Hgb自基線的變化；測(cè)定對(duì)肽I具有Hgb應(yīng)答(如終點(diǎn)的定義)的患者比例；測(cè)定將CIA患者的血紅蛋白增加并維持在11-13g/dL的目標(biāo)范圍的肽I皮下施用劑量；評(píng)估在CIA患者(研究患者亞組中)中皮下施用高達(dá)4劑量肽I的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜；以及探究活性劑量的肽I的劑量頻率和腸胃外鐵替換的效果。研究終點(diǎn)包括治療組中血紅蛋白增加大于2g/dL或者前28天未進(jìn)行RBC輸注、在4周、9周和12周時(shí)Hgb增加大于1g/dL達(dá)到至少12g/dL的患者比例；前28天未進(jìn)行RBC輸注、在4周、9周、12周時(shí)Hgb自基線增加>1g/dL的患者比例；在4周、9周、12周時(shí)Hgb在11-13g/dL目標(biāo)范圍內(nèi)的患者比例；第4周后Hgb值在ll-13g/dL目標(biāo)范圍內(nèi)的比例；血紅蛋白自基線的平均變化；血紅細(xì)胞輸注頻率；額外的藥學(xué)參數(shù)，其中包括網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(絕對(duì)值和AUC)、網(wǎng)織紅細(xì)胞的血紅蛋白含量、鐵存儲(chǔ)測(cè)定值的變化例如運(yùn)鐵蛋白飽和度和血清鐵蛋白；不良事件(AE);嚴(yán)重不良事件(SAE);以及研究患者一亞類藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，其中包括C則x、AUC0-t、AUCp、t1/2e(消除半衰期)、Vd(表觀分布體積)、Vss(穩(wěn)態(tài)體積)和CL(清除率)。選來進(jìn)行研究的患者為年齡在18-80歲、化學(xué)治療之后血紅蛋白>9g/dL并且<11g/dL、之前卯天內(nèi)未進(jìn)行ESA處理、并且滿足合格標(biāo)準(zhǔn)的患者，對(duì)其指定藥物監(jiān)測(cè)者(MM)認(rèn)可的起始劑量或隨后的相繼劑量的肽I。為確保每處理組有最少10名處理患者12周的數(shù)據(jù)可用，替換掉組中8周前中止研究的第6名和后續(xù)患者，最多進(jìn)行5次替換。每次替換的患者指定為與退出患者相同的處理組。隨后增加多達(dá)4組公開標(biāo)記處理、15名患者的組來研究較低的中間和/或重復(fù)的劑量水平、和/或施用肽I的頻率、和/或?qū)⑦\(yùn)鐵蛋白飽和水平維持在25-50%的腸胃外鐵替換。如果才笨究所有可能的劑量方案，那么這個(gè)實(shí)驗(yàn)中可以登記最少30名并且最多90名患者(不包括替換)。期望研究中的每名患者在多達(dá)4周的篩選期后參與多達(dá)12周。15名患者的后續(xù)組將接受增加劑量的肽I。公開標(biāo)記的劑量將通過每3周1次共4次劑量(研究第1、4、7、IO周)的SC注射來施用。一般而言，肽I將在化學(xué)治療周期的第一天施用。肽I的起始劑量和劑量頻率基于健康志愿者的1期數(shù)據(jù)，并且根據(jù)從對(duì)肽I和其它紅細(xì)胞生成刺激試劑(ESA)的紅細(xì)胞生成應(yīng)答的PK/PD數(shù)據(jù)建模的反應(yīng)來預(yù)測(cè)。每組中安排的肽I劑量水平和患者數(shù)量為<table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table>在最后一次注射后監(jiān)控患者28天或者直至不良事件穩(wěn)定或者最終出現(xiàn)的血紅蛋白值介于11-13g/dL之間。不允許增加劑量。第4周以后，如果需要RBC輸注來將Hgb維持在目標(biāo)范圍，那么患者將從藥物研究中移出，返回到標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理，并且另外監(jiān)控28天的安全性。如果在研究期間的任意時(shí)間，患者的血紅蛋白在任意2周期間內(nèi)增加H.0g/dL，那么將延遲下一劑量直至血紅蛋白穩(wěn)定(一周中的增加<0.5g/dL)，并且劑量將下降50%?；€血紅蛋白濃度定義為在施用研究藥物前周收集的最近2次每周血紅蛋白值(例如篩選和基線值)的平均數(shù)。研究期間，對(duì)于組起始或中止判斷標(biāo)準(zhǔn)的血紅蛋白水平變化需要通過7天內(nèi)下一個(gè)連續(xù)血紅蛋白值來確認(rèn)。這是每組15名CIA患者、高達(dá)6個(gè)處理組的^^開標(biāo)記、多中心的實(shí)驗(yàn)。在最初的處理組中，每3周1次共高達(dá)4次劑量地經(jīng)皮下施用公開標(biāo)記的肽I。在第一次劑量之后，整個(gè)研究期間至少每周觀察患者一次。在最后施用研究藥物之后，最少監(jiān)控患者28天，或者直到不良事件穩(wěn)定、或者最后出現(xiàn)的血紅蛋白值介于11-13g/dL之間。如果患者的血紅蛋白水平達(dá)到14g/dL(經(jīng)確認(rèn)的)，那么可對(duì)患者如臨床指示地進(jìn)行靜脈切開放血，并記錄靜脈切開放血的體積。進(jìn)行靜脈切開放血的患者中止服用研究藥物，并將靜脈切開放血后的藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)排除在分析之外。醫(yī)藥監(jiān)督者(MM)和贊助商將在正進(jìn)行的基礎(chǔ)上參考安全性和藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)來確定是否以及何時(shí)滿足中止標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)登記在組中的6名或更多患者完成了至少6周的監(jiān)控(即第二次劑量后至少3周)后，如果MM未鑒定出安全問題、并且在第4周后對(duì)6名或更多患者進(jìn)行了輸注或者確認(rèn)了第6周時(shí)的血紅蛋白增加小于lg/dL，那么可停止登記入當(dāng)前組并且允許下一組將劑量擴(kuò)大。在6名或更多患者登記在組中、并且完成了至少6周的監(jiān)控(第2次劑量后至少3周)后，如果出現(xiàn)至少3級(jí)或4級(jí)可能與肽I相關(guān)的AE、或者如果MM鑒定出任何對(duì)肽I特異的憂慮、或者總共6名或更多患者確認(rèn)了血紅蛋白水平>13.0g/dL(與輸注無關(guān))或者確認(rèn)血紅蛋白在任意兩周期間內(nèi)增加>1.0g/dL(與輸注無關(guān))，那么可停止登記入當(dāng)前組并且允許在下一組中將劑量降低至較低水平。如果MM和贊助商未鑒定出安全問題，那么可以起始多達(dá)兩個(gè)15名患者的、額外的、公開標(biāo)記的處理組來研究較低的中間(介于當(dāng)前和先前研究的劑量之間)或重復(fù)的劑量水平。此外，一旦測(cè)定了每三周施用的活性劑量，可以登記多達(dá)兩個(gè)額外的組來測(cè)定以不同頻率(例如，每4周施用的每3周劑量的4/3)的部分施用相同總劑量的相對(duì)效果。也可以在分開的組中探究腸胃外施用鐵來實(shí)現(xiàn)運(yùn)鐵蛋白25-50%飽和度的效果。預(yù)期對(duì)腫瘤患者測(cè)定的PAD為0.075-0.5mg/kg、可能0.2-0.4mg/kg、可能0.25mg/kg。本發(fā)明不限于本文描述的特定實(shí)施方案。事實(shí)上，除了本文描述的那些之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員從上述描述和附圖清楚本發(fā)明的多種修改。這些修改旨在落入所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。需要進(jìn)一步理解的是，所有值都是近似的，并且是提供來進(jìn)行描述的。在本發(fā)明的說明書中引用和討論了許多參考文獻(xiàn)，其中包括專利、專利申請(qǐng)和多種出版物。對(duì)這些參考文獻(xiàn)的引用和/或討論僅用來闡明本發(fā)明的描述，并且不是承認(rèn)任何此類參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的"現(xiàn)有技術(shù)"。說明書中引用和討論的所用參考文獻(xiàn)在此處都以其整體和如同每篇參考文獻(xiàn)單獨(dú)引入作為參考的相同程度引入作為參考。130權(quán)利要求1.治療患有以促紅細(xì)胞生成素缺乏或者低的或缺陷的血紅細(xì)胞群體為特征的疾病的患者的方法，其中所述方法包括向患者施用治療有效量的結(jié)合并激活促紅細(xì)胞生成素受體(EPO-R)的化合物，其中所述的治療有效量為每1千克患者體重0.025至0.5毫克化合物的劑量，其中所述的化合物包含(a)含有第一肽單體和第二肽單體的肽二聚體部分，其中所述的第一肽單體和第二肽單體包含氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR；(b)接頭部分，其共價(jià)結(jié)合所述肽單體；(c)聚乙二醇(PEG)部分，其包含線形無分支的具有10,000-60,000道爾頓分子量的PEG；以及(d)間隔物部分，其共價(jià)連接所述PEG部分至所述接頭部分，并且具有下式其中R4選自NH、NHCO、CO、COO和NHCOO。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述的^^酸序列額外地包含(MeG)、K或(MeG)K。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的氨基,列為(AcG)GLYACHMGPIT(l畫nal)VCQPLRK。4.權(quán)利要求2的方法，其中所述的M酸序列為(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)。5.權(quán)利要求2的方法，其中所述的氨基酸序列為(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)K。6.權(quán)利要求l的方法，其中所述的間隔物為亞氨基二乙酰接頭。7.權(quán)利要求l的方法，其中所述的間隔物為十原子PEG(2,2，-(乙二氧撐(雙乙胺)))。8.權(quán)利要求l的方法，其中所述的接頭為賴氨酸。9.權(quán)利要求l的方法，其中所述的PEG為10,000-60,000道爾頓。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述的PEG為20,000-40,000道爾頓。11.權(quán)利要求l的方法，其中所述的方法還包括可藥用載體。12.權(quán)利要求l的方法，其中所述的疾病為腎衰竭或透析。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述的治療有效量為每l千克患者體重0.025-0.2毫克化合物的劑量。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的劑量為每1千克患者體重0.05-0.1毫克化合物。15.權(quán)利要求l的方法，其中所述的疾病為伴隨惡性腫瘤的貧血。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述的治療有效量為每l千克患者體重0.075-0.5毫克化合物的劑量。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述的劑量為每1千克患者體重0.2-0.4毫克化合物。18.權(quán)利要求l的方法，其中每3-4周施用治療有效量一次。19.權(quán)利要求l、2、5、6、8-18中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的化合物為(AcG)GLYAC服GPrr(l-nal)VCQPLR(MeG一NH,(AcG)GLYAHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeGHiN'全文摘要本發(fā)明涉及為促紅細(xì)胞生成素受體(EPO-R)激動(dòng)劑的肽化合物。本發(fā)明也涉及使用此類肽化合物治療與血紅細(xì)胞生產(chǎn)不足或缺陷相關(guān)的疾病的治療方法。也提供了包含本發(fā)明的肽化合物的藥物組合物和劑量。文檔編號(hào)A61K38/00GK101553242SQ200680026991公開日2009年10月7日申請(qǐng)日期2006年6月5日優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日發(fā)明者A·迪列日,K·伍德伯恩,K·洛伊特,R·B·納索,R·斯特德申請(qǐng)人:阿費(fèi)麥克斯公司