專利名稱：前列腺干細(xì)胞標(biāo)志物的制作方法
前列腺干細(xì)胞標(biāo)志物本發(fā)明涉及干細(xì)胞的基因標(biāo)志物，典型的是前列腺干細(xì)胞，特別是癌干細(xì)胞，例如前列腺癌干細(xì)胞的標(biāo)志物；基于所述千細(xì)胞基因和 表達(dá)產(chǎn)物的治療劑和診斷分析；以及包括用以鑒別治療劑的篩選分析。背景有效治療癌癥面臨的難題是識(shí)別腫瘤中具有維持腫瘤生長能力的 細(xì)胞群體。證據(jù)表明肺瘤是無性系的，因此來源于單個(gè)細(xì)胞。然而， 很少有研究鑒別和定性了那些負(fù)責(zé)維持腫瘤細(xì)胞生長的細(xì)胞類型。已 尋找了某些這些所謂的"癌干細(xì)胞"。我們已鑒別了CD133,其由原始的造血干細(xì)胞表達(dá)，并作為前列 腺上皮細(xì)胞的進(jìn)一步的干細(xì)胞標(biāo)志物由發(fā)育中的上皮細(xì)胞表達(dá)。 CD133細(xì)胞限于"2)3，群(1型膠原的受體)，并位于基底層中，常常在 出芽區(qū)域或分支點(diǎn)的基底(附

圖1A)。 /CD133+細(xì)胞顯示出上皮干細(xì)胞的兩種重要特性它們具有在體外的高增殖潛能(附圖1B)，并 能在免疫抑制的雄性棵鼠中重組成前列腺樣的腺泡(附圖1C)。在我們共同待批準(zhǔn)的申請(qǐng)(WO 2005/089043)中，我們描述了前列 腺干細(xì)胞的分離，該干細(xì)胞已直接從一 系列患者樣本的淋巴結(jié)和前列述標(biāo)志物典型地表達(dá)為前列腺干細(xì)胞標(biāo)志物；人上皮細(xì)胞抗原(HEA)、 CD44、 "2/3,和CD133。在形態(tài)學(xué)上，細(xì)胞為成纖維樣(fibroblastoid) 細(xì)胞瘤(高水平表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)胞特有的波形蛋白)或上皮細(xì)胞，具有產(chǎn)生 與前列腺上皮細(xì)胞分化有關(guān)的祖細(xì)胞的能力。使用包被基質(zhì)膠 (Matrigel)的濾膜的侵入試驗(yàn)已確定這些細(xì)胞通過基質(zhì)膠的侵入能力 比PC3M(—種高轉(zhuǎn)移特性的PC3細(xì)胞亞系)大2-3倍。本發(fā)明的描述我們已進(jìn)行了CD133陽性前列腺干細(xì)胞的陣列分析，并比較了CD 133陽性干細(xì)胞和CD133陽性癌干細(xì)胞之間的基因表達(dá)。 生長因子/受體陣列分析已鑒別了一些基因，這些基因編碼生長因子/受體蛋白或 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中導(dǎo)致刺激細(xì)胞生長和/或細(xì)胞增殖的蛋白。稱為細(xì)胞因子的一組生長因子參與一些不同的細(xì)胞功能。這些包括，例如但不局 限于，免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、能量代謝的調(diào)節(jié)以及生長和發(fā)育的控制。細(xì) 胞因子通過靶細(xì)胞上細(xì)胞表面表達(dá)的受體介導(dǎo)其效應(yīng)。細(xì)胞因子受體 可分成三種單獨(dú)的亞群。1型(如生長激素(GH)家族)受體的特征為在其 胞外域的氨基末端部分中有四個(gè)保守的半胱氨酸殘基且在C-末端部 分中存在一個(gè)保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser基序。該重復(fù)的Cys基序也存在于2型(干擾素家族)和m型(腫瘤壞死因子家族)中。血管生成中涉及另一組生長因子。血管生成是新生血管從現(xiàn)有血 管床的發(fā)育，是一個(gè)復(fù)雜的多級(jí)過程，涉及細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解， 然后是內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、細(xì)胞分裂和分化以形成小管，最后形成新生 血管。血管生成參與諸如肺瘤細(xì)胞生長的病理狀態(tài)。參與血管生成的基因包括，例如但不局限于；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF、 VEGF B、 VEGFC、 VEGFD);轉(zhuǎn)化生長因子(TGFb);酸性和堿性成纖維細(xì)胞生 長因子(aFGF和bFGF);以及血小板衍生生長因子(PDGF)。生長因子等的許多受體通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)與膜結(jié)合。GPI-錨是對(duì)蛋白增加糖基磷脂酰肌醇的翻譯后修飾，使這些蛋白能錨定在 細(xì)胞膜的胞外側(cè)。通常地，具有GPI錨的細(xì)胞外蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu) 域或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。GPI錨蛋白出現(xiàn)于所有真核生物中，并形成各種不 同的蛋白，包括，例如，與膜結(jié)合的酶和粘附分子。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中涉及的基因經(jīng)常與位于細(xì)胞膜的受體有關(guān)，受體一旦 激活就會(huì)導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，該級(jí)聯(lián)引起轉(zhuǎn)錄激活和細(xì)胞增殖。例如， PTEN基因產(chǎn)物為一種多特異性的磷酸酶，除具有使如粘著斑激酶 (FAK)的一些蛋白靶標(biāo)去磷酸化的能力外，該酶還能通過將磷酸肌醇 (PI)(3，4,5) P3降解回到PI(4,5)P2從而拮抗磷酸肌醇脂質(zhì)激酶(以下為 PI3K)。磷酸肌醇已涉及到多種不同的細(xì)胞過程中，如空泡(vacuolar)蛋白分類、細(xì)胞骨架重構(gòu)和介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)通信事件，通過這些，生長因 子、激素和神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)細(xì)胞活性、增殖和分化發(fā)揮生理作用。相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)陣列分析已鑒別許多編碼蛋白的基因，這些蛋白為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是在多細(xì)胞生物體中包圍細(xì)胞的非活性物質(zhì)的 復(fù)雜混合物。脊推動(dòng)物中ECM包括蛋白質(zhì)和糖(以及骨中的礦物質(zhì)) 的混合物。蛋白質(zhì)成分包括蛋白和諸如膠原(膠原I-XII)的糖蛋白(通 過添加糖部分進(jìn)行修飾的蛋白)；基底膜中發(fā)現(xiàn)的層粘連蛋白，上皮細(xì) 胞與之結(jié)合的一種結(jié)構(gòu)；具有將細(xì)胞與ECM結(jié)合功能的纖連蛋白； 以及給皮膚提供柔韌性的彈性蛋白。也在ECM中發(fā)現(xiàn)蛋白聚糖，這 些糖蛋白包括比蛋白質(zhì)更多的糖。數(shù)種糖被加至蛋白聚糖，其中最多 的是乙酰葡萄糖胺。許多蛋白聚糖為硫酸鹽，例如硫酸軟骨素、硫酸 類肝素、硫酸角質(zhì)素和透明質(zhì)酸。大多數(shù)脊推動(dòng)物細(xì)胞若非與ECM相連則不能存活，不能錨定于 ECM ，經(jīng)常與癌中的細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)。細(xì)胞通過細(xì)胞表達(dá)的稱為整合 素(integrin)的錨定分子與ECM連接，整合素通過膠原、層粘連蛋白和 纖連蛋白與ECM結(jié)合。整合素是細(xì)胞膜蛋白，其通過從細(xì)胞表面突 出的胞外域與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。整合素胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞骨架的肌絲 接觸。在癌癥轉(zhuǎn)移中，原發(fā)性癌細(xì)胞具有能動(dòng)性并能轉(zhuǎn)移(移動(dòng))至其 它組織形成繼發(fā)性癌。最后導(dǎo)致患者死亡的就是繼發(fā)性癌。為了轉(zhuǎn)移， 癌細(xì)胞必須穿過組織的基底膜以便能到達(dá)將癌細(xì)胞運(yùn)送至全身的血液 和淋巴系統(tǒng)。肺瘤周圍ECM的降解主要通過腫瘤周圍的間質(zhì)細(xì)胞分 泌的金屬蛋白酶(MMP)催化。有越來越多的證據(jù)顯示癌細(xì)胞通過激素 的旁分泌刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生MMP。MMP是一類正在擴(kuò)大的蛋白酶，能分成3種類型。類型1包括 降解結(jié)締組織膠原的膠原酶，例如MMP-1、 MMP-8和MMP-13;類 型2包括降解基底膜膠原的明膠酶以及包括MMP-2和MMP-9;第 三種類型包括降解ECM蛋白聚糖、層粘連蛋白和纖連蛋白的間質(zhì)溶 解素并包括MMP-10和MMP-ll。 MMP的活性能纟皮促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子如IL-1和TNFa增強(qiáng)。轉(zhuǎn)錄因子/相關(guān)的轉(zhuǎn)錄陣列分析已鑒別許多編碼蛋白的基因，這些蛋白為轉(zhuǎn)錄因子蛋白 或與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的蛋白。轉(zhuǎn)錄因子是與DNA增強(qiáng)子或啟動(dòng)子元件結(jié)合的蛋白。這些因子 經(jīng)常靠近基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子抑制或促進(jìn)RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄 起始，以及保持活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的維持。轉(zhuǎn)錄因子包含兩個(gè)基本的 功能結(jié)構(gòu)域。反式激活域?yàn)榈鞍踪|(zhì)一個(gè)區(qū)域，其與轉(zhuǎn)錄裝置的其它部 分，例如RNA聚合酶或其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用；以及DNA結(jié)合域， 包括識(shí)別基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)特異堿基的氨基酸。在 一 些實(shí)例中增強(qiáng)子 元件可定位于距轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的一定距離處或甚至在內(nèi)含子中，Lewin B, 1994. Genes V, Oxford University Press, Oxford。通常，DNA結(jié)合域與 核苷酸序列或基序相互作用，核苷酸序列或基序?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合 的位置以增強(qiáng)或抑制轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子的 一個(gè)重要家族包括同源結(jié)構(gòu)域蛋白。該轉(zhuǎn)錄因子家族 具有由16個(gè)氨基酸組成以螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋構(gòu)象排列的所謂同源結(jié)構(gòu)域 區(qū)域的特征。 一些轉(zhuǎn)錄因子同時(shí)具有同源結(jié)構(gòu)域和第二 DNA結(jié)合區(qū) 域。在一些實(shí)例中，包括同源結(jié)構(gòu)域和第二 DNA結(jié)合區(qū)域的該區(qū)域 稱為POU結(jié)構(gòu)域。包含 一 個(gè)保守結(jié)合結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族的另 一 個(gè)實(shí)例為螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域。肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子MyoD包含此基序，同樣地，決 定黑腹果蠅(A me/am gaste。周圍神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞命運(yùn)的幾種黑腹果 蠅蛋白也包含此基序。相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族稱為堿性亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子家族或 bZip。 bZip蛋白為二聚體，其各個(gè)亞基在羧基末端包含堿性的DNA 結(jié)合域，該末端后緊接著包含數(shù)個(gè)亮氨酸殘基的螺旋。bZip家族成員 的實(shí)例為C/EBP、 Apl,以及酵母轉(zhuǎn)錄因子GCN4。一大類轉(zhuǎn)錄因子為核激素受體。已知甾類激素增加特定類型基因 的轉(zhuǎn)錄。 一旦激素進(jìn)入細(xì)胞，它就與其特異受體蛋白結(jié)合，將受體轉(zhuǎn)化為能進(jìn)入細(xì)胞核并與特定的DNA序列基序結(jié)合的構(gòu)象。該甾類激素受體家族包括蛋白質(zhì)，其識(shí)別雌激素、黃體酮、睪酮和腎上腺皮質(zhì)素以及如視黃酸、曱狀腺素和維生素D的非甾類脂質(zhì)。已知將DNA包裝為染色質(zhì)的方式能影響基因表達(dá)。有幾種水平 的DNA結(jié)構(gòu)包裝將雙鏈螺旋變成有絲分裂染色體，其后DNA變得比 其伸展長度短約50,000倍。雙鏈螺旋DNA纏繞在核小體的結(jié)構(gòu)單位 周圍，核小體包括一個(gè)由4種類型的組蛋白組成的八聚體核心H2A、 H2B、 H3,以及H4蛋白各兩個(gè)。大約166個(gè)堿基對(duì)通過DNA骨架 中的負(fù)電荷磷酸基團(tuán)與組蛋白蛋白中的正電荷氨基酸(如，賴氨酸和精 氨酸)之間的靜電力與核小體結(jié)合。核小體被組織成下一結(jié)構(gòu)水平的染色質(zhì)纖維，也稱為螺線管。染 色質(zhì)結(jié)構(gòu)不是靜態(tài)的，結(jié)構(gòu)上的這種規(guī)律性變化稱為"染色質(zhì)重構(gòu)"。 此過程已被定義為改變?nèi)旧|(zhì)區(qū)域的核酸酶敏感性的任何事件，且能 獨(dú)立地出現(xiàn)或與如轉(zhuǎn)錄的加工過程一致。核心組蛋白中進(jìn)化上保守的賴氨酸殘基的可逆乙?；谵D(zhuǎn)錄調(diào) 節(jié)、細(xì)胞周期進(jìn)程以及發(fā)育事件中起著關(guān)鍵作用。組蛋白乙?；姆€(wěn) 定狀態(tài)受多種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白脫乙酰化酶(HDAC) 的酶活性控制。組蛋白高乙?；c轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)，而組蛋白低乙酰化 與轉(zhuǎn)錄靜止(quiescence)有關(guān)，因此組蛋白脫乙?；缚烧J(rèn)為是酶的轉(zhuǎn) 錄阻遏物。通常，組蛋白脫乙?；覆恢苯油ㄟ^特異DNA-結(jié)合位點(diǎn)把基因 作為靶標(biāo)。而是，脫乙?；缸鳛榈鞍踪|(zhì)復(fù)合體的部分集合到靶定阻 遏的基因。作為該復(fù)合體部分的其它蛋白，稱為輔阻遏物，負(fù)責(zé)靶定 欲阻遏的基因。在人中，現(xiàn)已鑒別四種高同源性的I類HDAC酶 (HDAC1、HDAC2、HDAC3，和HDAC8)， HDAC1 ， HDAC2和HDAC3 廣泛地在許多不同細(xì)胞類型中表達(dá)(Yang et al， 1997 and 2002)。 HDAC 1 和HDAC2為酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子RPD3的人類直系同源基因 (orthologues)。預(yù)測(cè)的HDAC3氨基酸序列分析顯示了 428個(gè)氨基酸的 開放閱讀框，具有預(yù)測(cè)的49kDa分子量。DNA復(fù)制和修復(fù)陣列分析已鑒別許多編碼DNA復(fù)制或DNA修復(fù)中涉及的蛋白的 基因。DNA損傷可通過許多因素產(chǎn)生。例如，某些波長的輻射，(如 Y射線或X射線)，紫外線特別是被DNA強(qiáng)烈吸收的UV-C射線；呼 吸和其它代謝過程中產(chǎn)生的高活性氧自由基；以及環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的可人 造或自然存在的化學(xué)誘變劑。DNA可以不同方式損傷。例如，形成DNA的四種石威基可在不同 位置被共價(jià)修飾；氨基的脫氨作用是導(dǎo)致胞嘧啶突變?yōu)槟蜞奏さ耐ǔ?修飾。其它修飾包括錯(cuò)配，例如胸苷至尿嘧啶的轉(zhuǎn)換，DNA分子的磷 酸骨架中的單鏈斷裂以及可為鏈內(nèi)或鏈間的堿基之間的共價(jià)交聯(lián)。多 種化學(xué)治療藥物作為交聯(lián)劑用于癌癥的治療。已推導(dǎo)人類DNA的完整DNA序列的人類基因組計(jì)劃已鑒別出約 130個(gè)被認(rèn)為與DNA修復(fù)和復(fù)制有關(guān)的基因。損傷的或不適當(dāng)?shù)膲A 基摻入可通過幾種機(jī)制進(jìn)行校正。這些機(jī)制包括直接的化學(xué)逆轉(zhuǎn)或切 除修復(fù)。切除修復(fù)將損傷的堿基切除并以正確的堿基取代。有三種被 細(xì)胞用來》務(wù)復(fù)DNA損傷的切除修復(fù)機(jī)制。堿基切除修復(fù)包括通過DNA糖基化酶去除損傷的堿基；去除其 磷酸脫氧核糖以產(chǎn)生有缺口的DNA;通過DNA聚合酶p以正確的核 苷酸取代以及通過DNA連接酶將斷鏈連接。核苷酸切除修復(fù)涉及通 過一或多種蛋白質(zhì)因子識(shí)別錯(cuò)誤；通過稱為轉(zhuǎn)錄因子IIH的酶分開 DNA鏈以產(chǎn)生"泡"；在損傷區(qū)域的5'和3'側(cè)切斷；通過DNA聚 合酶s和cj進(jìn)行損傷區(qū)域的取代合成；以及通過DNA連接酶將斷鏈 連接。錯(cuò)配修復(fù)校正正常堿基中的錯(cuò)配。錯(cuò)配的校正利用參與堿基切除 修復(fù)中的酶和識(shí)別錯(cuò)配并通過MLH 1在錯(cuò)配周圍切斷的蛋白，例如由 MSH2編碼的蛋白，以及其它蛋白。這些基因任一種中的突變與結(jié)腸 癌的遺傳形式有關(guān)。錯(cuò)配的修復(fù)通過DNA聚合酶s和a完成。此外，DNA中單和雙鏈斷裂的修復(fù)還涉及許多蛋白。單鏈斷裂的 修復(fù)利用參與堿基切除修復(fù)的許多蛋白。雙鏈斷裂通過直接連接斷裂 的游離端或通過同源重組進(jìn)行修復(fù)。直接連接中的錯(cuò)誤與某些癌有關(guān)，例如Burkitt's淋巴瘤和B細(xì)胞白血病。BRCA-1和BRCA-2基因在同 源重組中的功能和這些基因中的突變與乳腺癌和卯巢癌有關(guān)。我們已進(jìn)行基因陣列分析以鑒別癌干細(xì)胞特有的基因，與來自正 ?；蛄夹愿杉?xì)胞群體的對(duì)照干細(xì)胞樣本相比，這些基因表現(xiàn)上調(diào)。我 們?cè)诖斯_這些基因及其在鑒別治療藥物中的用途，這些藥物用于治 療癌癥，特別是前列腺癌，并有助于開發(fā)診斷分析以;險(xiǎn)測(cè)肺瘤細(xì)胞生 長的早期發(fā)生。本公開涉及癌干細(xì)胞特異基因的鑒別。發(fā)明描述根據(jù)本發(fā)明的第 一方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)癌干細(xì)胞特異核酸分 子由癌干核酸分子編碼的多肽的活性的試劑，其中所述的癌細(xì)胞特異 核酸分子選自i) 如SEQ IDNO:l-452中所示的核酸序列組成的核酸分子；ii) 如表1中所示的具有Genbank登錄號(hào)的核酸序列組成的 核酸分子；iii) 在嚴(yán)緊雜交條件下與上述(i)或(ii)中的核酸分子雜交并編 碼多肽的核酸分子，其中所述多肽為千細(xì)胞所特異的，特征在于所迷試劑用作藥物。 當(dāng)兩個(gè)互補(bǔ)的核酸分子以一定數(shù)量的氫鍵互相結(jié)合時(shí)便發(fā)生核酸 分子的雜交。雜交的嚴(yán)緊性可根據(jù)核酸周圍的環(huán)境條件、雜交方法的 性質(zhì)和所用核酸分子的組成及長度發(fā)生變化。對(duì)于獲得具體嚴(yán)緊程度 所需的雜交條件的計(jì)算在Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(分子克隆實(shí)'驗(yàn)室手冊(cè))(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001); 以及Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2(生4匕與分子生 物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-核酸探針雜交第二章第一部分)(Elsevier, New York, 1993)中加以討論。Tm是所給50%的核酸分子鏈與其互補(bǔ)鏈雜交時(shí)的 溫度。下述是雜交條件的實(shí)例，不是對(duì)雜交條件的限制極高嚴(yán)緊度(允許具有至少90%同 一性的序列雜交)雜交 洗滌2次: 洗滌2次:5xSSC在65°C 16小時(shí)2xSSC在室溫(RT)每次15分鐘 0.5x SSC在65。C每次20分鐘高嚴(yán)緊度(允許具有至少80%同一性的序列雜交) 雜交5x-6xSSC在65°C-70。C 16-20小時(shí) 洗滌2次 2x SSC在RT每次5-20分鐘洗滌2次lx SSC在55。C-70。C每次30分鐘低嚴(yán)緊度(允許具有至少50%同 一性的序列雜交) 雜交6xSSC在RT至55°C 16-20小時(shí) 洗滌至少2次2x-3xSSC在RT至55°C每次20-30分鐘。 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑為拮抗劑?；蛘撸?述試劑為一種激動(dòng)劑。本發(fā)明的另 一方面提供了調(diào)節(jié)多肽活性的試劑，包括選自下述的 核酸分子編碼的氨基酸序列i) 如SEQ IDNO:l-452中所示的核酸分子；ii) 編碼變體多肽的核酸分子，其中所述變體多肽通過添加、 刪除或取代氨基酸序列中至少 一個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行修飾， 氨基酸序列由選自SEQ ID NO:l-452的核酸序列編碼，其 中所述多肽為干細(xì)胞所特異的；iii) 編碼一種多肽的核酸分子，該多肽由如表1中所示的具有 Genbank登錄號(hào)的氨基酸序列組成；特征為所述試劑用作藥物。變體多肽可通過以任何組合存在的一或多個(gè)取代、添加、刪除、 剪切而在氨基酸序列方面具有差異。優(yōu)選的變體是標(biāo)準(zhǔn)多肽通過保守 的氨基酸取代變化而來。這些取代是以另一個(gè)具有相似特征的氨基酸 取代一個(gè)所給的氨基酸。下述非限制性的氨基酸列表被認(rèn)為是保守的取代(相似的)a)丙氨酸、絲氨酸，和蘇氨酸；b)谷氨酸和天冬氨 酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺d)精氨酸和賴氨酸；e)異亮氨酸、亮 氨酸，蛋氨酸和纈氨酸，以及f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。此外，本發(fā)明以多肽序列為特征，其與本文公開的多肽序列，或 片斷及其功能相同的多肽具有至少75%的同 一性。在一個(gè)實(shí)施方案中， 多肽與本文描述的氨基酸序列具有至少85%同一性，更優(yōu)選至少90% 同一性，甚至更優(yōu)選至少95%同一性，仍然更優(yōu)選至少97%同一性， 以及最優(yōu)選至少99%同一性。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑為多肽。優(yōu)選的所述多肽 為抗體或抗體的活性結(jié)合部分。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體為單克隆抗體或其活性結(jié) 合部分。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體為通過重組方法產(chǎn)生的嵌 合抗體或人源化抗體，通過嚢括所述抗體的可變區(qū)與人抗體的不變或 恒定區(qū)的重組方法產(chǎn)生。嵌合抗體為重組抗體，其中所有小鼠或大鼠抗體的V-區(qū)都與人抗 體C-區(qū)組合。人源化抗體為融合鼠抗體V-區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)與來自人抗 體V-區(qū)的框架區(qū)的重組雜交抗體。該互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)是抗體重鏈 和輕鏈N末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)限制V-區(qū)大多數(shù)變化的區(qū)域。在抗體分子表面 這些區(qū)域形成環(huán)。這些環(huán)提供抗體與抗原的結(jié)合表面。來自非人動(dòng)物時(shí)，嵌合抗體和人源化抗體的抗原性減少，因?yàn)橹亟M雜交抗體內(nèi)的鼠 (即外源)抗體數(shù)量減少，而人抗體區(qū)域不會(huì)引起免疫反應(yīng)。這導(dǎo)致免 疫反應(yīng)更弱且抗體的清除率降低。顯然，這是在治療人疾病中使用治 療抗體時(shí)所希望的。將人源化抗體設(shè)計(jì)為具有更少的"外源，，抗體區(qū)域， 因此認(rèn)為其具有比嵌合抗體更少的致免疫性。在本發(fā)明的 一 個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑為 一 種抗體片斷。 免疫王求蛋白或抗體的各種片斷為本領(lǐng)域所公知，即，F(xiàn)ab、 Fab2、 F(ab')2、 Fv、 Fc、 Fd、 scFvs等。Fab片斷是由免疫球蛋白重鏈可變區(qū) 和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)共價(jià)配對(duì)的免疫活性部分構(gòu)成的多亞基蛋白，能特異地與抗原結(jié)合。Fab片斷通過蛋白水解裂解(例如，用木瓜 蛋白酶)完整的免疫球蛋白分子產(chǎn)生。Fab2片斷包括兩個(gè)連接的Fab片 斷。當(dāng)這兩個(gè)片斷通過免疫球蛋白鉸鏈區(qū)連接時(shí)，產(chǎn)生F(ab')2片斷。 Fv片斷是由免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)共價(jià)配 對(duì)的免疫活性部分構(gòu)成的多亞基蛋白，能特異地與抗原結(jié)合。片斷也 可以為僅包含一條輕鏈可變區(qū)的單鏈多肽，或其包含輕鏈可變區(qū)的三 個(gè)CDR且與重鏈可變區(qū)不連接的片斷，或者其包含重鏈可變區(qū)的三個(gè) CDR且與輕鏈部分不連接的片斷；以及從抗體片斷形成的多特異性抗 體，例如這已被描述于美國專利第6,248,516號(hào)。Fv片斷或單個(gè)區(qū)域 (結(jié)構(gòu)域)片斷通常通過在宿主細(xì)胞系中表達(dá)有關(guān)鑒定的區(qū)域產(chǎn)生。這 些及其它免疫球蛋白或抗體片斷在本發(fā)明范圍內(nèi)，并被描述于標(biāo)準(zhǔn)的 免疫學(xué)教科書中，如Paul, Fundamental Immunology(基礎(chǔ)免疫學(xué))或 Jane way et al. Immunobiology(免疫生物學(xué))(如上所引用的)。如今，分 子生物學(xué)使得這些片斷能夠直接合成(通過在細(xì)胞中表達(dá)或使用化學(xué) 方法)，及其組合物的合成。可產(chǎn)生單個(gè)的可變區(qū)，即所謂的單鏈抗體可變區(qū)片斷(scFv，s)。如 果存在特異性單克隆抗體的雜交瘤，技術(shù)人員可熟練地通過RT PCR 從所述雜交瘤中提取的mRNA分離scFv's的mRNA?；蛘撸衫檬?菌體展示篩選鑒別表達(dá)scFVs的克隆?；蛘咚銎瑪酁?結(jié)構(gòu)域抗體片 斷"。結(jié)構(gòu)域抗體是抗體的最小結(jié)合部分(大約13kDa)。此技術(shù)的實(shí)例 公開于US6,248,516、 US6，291,158、 US6,127，197及EP0368684中， 本文以參考的方式將其全體引入。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述抗體片斷為單鏈抗體可變區(qū)片斷。 抗體或免疫球蛋白的片斷也可具有雙特異性功能，與兩種不同抗 原的兩個(gè)不同抗原決定簇結(jié)合。優(yōu)選地，所述多肽的所述嵌合/人源單克隆抗體作為融合多肽在適 于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化原核或真核細(xì)胞的表達(dá)載體中產(chǎn)生。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體為調(diào)理素抗體。 吞噬作用由巨噬細(xì)胞和多形白細(xì)胞介導(dǎo)，涉及攝取和消化微生物、 損傷的或死亡的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、不溶顆粒和活化的凝固因子。調(diào)理素是促進(jìn)吞噬上述外源小體的試劑。因此調(diào)理素抗體是提供相同功能的抗體。調(diào)理素的實(shí)例是抗體的Fc部分或補(bǔ)體C3。優(yōu)選地，給所述抗體提供一種標(biāo)記物，包括常規(guī)標(biāo)記或標(biāo)簽，例 如放射性的和/或熒光的和/或抗原決定簇的標(biāo)記或標(biāo)簽。在本發(fā)明的可選的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體，或抗體片斷已與 治療劑聯(lián)合或交聯(lián)。優(yōu)選地，所述治療劑為化療劑。優(yōu)選地，所述試劑選自順鉑；卡鉑；環(huán)磷酰胺；苯丙氨酸氮芥 (melphalan);卡氮芥；曱氨蝶呤；5-氟尿嘧啶；阿糖胞苷；巰嘌呤； 柔紅霉素；多柔比星；表柔比星；長春堿；長春新堿；放線菌素D; 絲裂霉素C;紫杉醇；L-天冬酰胺酶；G-CSF;表鬼臼毒etoposide; 秋水仙》咸；甲石黃酸去4失胺(derferoxamine mesylate);以及喜樹堿。在本發(fā)明的可選的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑為一種核酸分子。 例如，反義核酸；適體(aptamer);或小的干涉RNA。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子為小的干涉RNA。特異地去除基因功能的技術(shù)是通過引入雙鏈RNA,也稱為小的 抑制或干涉RNA(siRNA)，至細(xì)胞中破壞與包含于siRNA分子中的序 列互補(bǔ)的mRNA。 siRNA分子包括RNA的兩條互補(bǔ)鏈(有義鏈和反義 鏈)，這兩條鏈互相退火形成雙鏈RNA分子。siRNA分子通常來自欲 去除基因的外顯子?，F(xiàn)在闡述RNA干涉的機(jī)制。許多生物體通過激活導(dǎo)致siRNA形 成的級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)雙鏈RNA的存在作出反應(yīng)。雙鏈RNA的存在激活包 括核糖核酸酶III的蛋白質(zhì)復(fù)合體，該酶將雙鏈RNA加工成更小的片 斷(siRNA，長度大約21-29個(gè)核普酸)，這些片斷成為核糖核蛋白復(fù)合 體的部分。siRNA指導(dǎo)核糖核酸酶復(fù)合體來裂解與siRNA反義鏈互補(bǔ) 的mRNA，從而破壞mRNA。本發(fā)明的另 一 方面提供了包括本發(fā)明試劑的藥物組合物。本發(fā)明的另一方面提供了組合物，包括選自以下的核酸分子 i)由如SEQ ID NO: 1 - 452中所示的核酸序列組成的核酸分 子；ii) 由如表1中所示的具有Genbank登錄號(hào)的核S復(fù)序列組成 的核酸分子；iii) 在嚴(yán)緊雜交條件下與上述(i)或(ii)中的核酸分子雜交并編 碼多肽的核酸分子，其中所述多肽為干細(xì)胞所特有。本發(fā)明的另一方面提供了包括多肽的組合物，該多肽包括選自以 下的氨基酸序列i) 包括如表1中所示的具有Genbank登錄號(hào)的氨基酸 序列的多肽，或變體多肽，其中所述變體通過添加、 刪除或取代如表1中所示具有Genbank登錄號(hào)的氨 基酸序列的至少一個(gè)氨基酸殘基被修飾；ii) 包括由核酸分子編碼的氨基酸序列的多肽，該核酸分 子包括如SEQ ID NO: 1-452中所示的核酸序列；iii) 包括由核酸分子編碼的氨基酸序列的多肽，該核酸分 子在嚴(yán)緊雜交條件下與上述(ii)中的核酸分子雜交并 編碼多肽，其中所述多肽為干細(xì)胞特異的，其中所述的組合物用作一種疫苗。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包括佐劑和/或載體。 佐劑為通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性增加對(duì)抗原的特異性免疫反應(yīng)的物 質(zhì)或方法。佐劑的實(shí)例包括，僅舉實(shí)例，弗氏佐劑、胞壁酰二肽，脂 質(zhì)體。載體為免疫原分子，當(dāng)其與第二分子結(jié)合時(shí)，增加后者的免疫 反應(yīng)。 一些抗原本質(zhì)上不是免疫原性的，然而當(dāng)與外源蛋白質(zhì)分子如 鑰孔嘁血藍(lán)(keyhole-limpet)蛋白或破傷風(fēng)類毒素聯(lián)合時(shí)可能產(chǎn)生抗體 反應(yīng)。這些抗原包含B細(xì)胞抗原決定簇，但不包含T細(xì)胞抗原決定簇。 這種偶聯(lián)物的蛋白質(zhì)部分("載體"蛋白)提供刺激輔助T細(xì)胞的T細(xì)胞 抗原決定簇，T細(xì)胞反過來刺激抗原特異性B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞并產(chǎn) 生抗抗原的抗體。輔助T細(xì)胞也能刺激其它免疫細(xì)胞，如細(xì)胞毒T細(xì)給藥時(shí)，將本發(fā)明治療組合物在藥物可接受的制劑中給藥。這些 制劑通?？砂伤幱脻舛鹊柠}、緩沖劑、防腐劑、合適的載體、增 強(qiáng)免疫的添加劑如佐劑和細(xì)胞因子以及任選的其它治療劑(例如，順鉑；卡鉑；環(huán)磷酰胺；苯丙氨酸氮芥；卡氮芥；曱氨蝶呤；5-氟尿嘧 啶；阿糖胞苷；巰。票呤；柔紅霉素；多柔比星；表柔比星；長春堿； 長春新堿；放線菌素D;絲裂霉素C;紫杉醇；L-天冬酰胺酶；G-CSF; 表鬼臼毒；秋水仙》威；甲石黃酸去鐵胺；以及喜樹石威?？蓪⒈景l(fā)明的治療劑通過任何常規(guī)途徑給藥，包括注射或經(jīng)過一 段時(shí)間的輸注。給藥可通過，例如，口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、 腔內(nèi)、皮下或透皮。當(dāng)使用抗體治療時(shí)，優(yōu)選的給藥途徑是使用肺的 氣霧劑。制備包含抗體的氣霧劑遞送體系的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所 熟知。通常，這些體系應(yīng)利用不會(huì)顯著影響抗體生物特性，如互補(bǔ)結(jié) 合能力的成分(例如，見Sciarra and Cutie,"氣霧劑"在Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition(雷明頓制藥學(xué)，第18版)，1990 ， pp 1694-1712中；以參考的方式將其引入)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地 確定產(chǎn)生抗體氣霧劑的各項(xiàng)參數(shù)和條件，不需做過多的試驗(yàn)。本發(fā)明的組合物以有效量使用。"有效量"是單 一 或與另外的劑量 的組合物產(chǎn)生期望反應(yīng)的量。在治療具體的疾病，如癌癥時(shí)，期望反 應(yīng)指抑制疾病的進(jìn)展。這可包括僅僅暫時(shí)減慢疾病的進(jìn)展，盡管更優(yōu) 選地，它包括永久地停止疾病的進(jìn)展。這可以常^見方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)或可 根據(jù)本文討論的本發(fā)明的診斷方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。當(dāng)然，這些量將依賴于治療的具體疾病、疾病的嚴(yán)重度、患者的 個(gè)體參數(shù)，包括年齡、身體健康狀況、身材和體重、治療的持續(xù)時(shí)間、 同時(shí)存在的其它治療的性質(zhì)(若存在)、具體的給藥途徑以及健康從業(yè) 者知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)內(nèi)的類似因素。這些因素為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知， 只需常規(guī)試驗(yàn)就能得出。根據(jù)可靠的醫(yī)學(xué)判斷，通常優(yōu)選使用單個(gè)成 分或其組合的最大劑量，即最高安全劑量。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員應(yīng)當(dāng)了解，患者可能因?yàn)獒t(yī)學(xué)原因、精神原因或事實(shí)上的任何其它 原因而堅(jiān)持使用 一個(gè)更低的劑量或可耐受劑量。前述方法中所用的藥物組合物優(yōu)選無菌且包含有效量的抗體或核 酸，以一個(gè)適于對(duì)患者給藥的重量或體積單位產(chǎn)生期望的反應(yīng)。例如， 反應(yīng)可通過，由報(bào)告體系測(cè)定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的增強(qiáng)或抑制，通過測(cè)定如基 因表達(dá)的下游的效應(yīng)，或通過測(cè)定組合物的生理效應(yīng)來確定。同樣地，反義/siRNA分子的效應(yīng)可輕易地通過測(cè)定加入了反義/siRNA組合物 的細(xì)胞中單個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行確定。其它測(cè)定為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員所知，并可用于測(cè)定反應(yīng)的水平。對(duì)個(gè)體的抗體或核酸給藥的劑量可根據(jù)不同的參數(shù)，特別是根據(jù) 所用的給藥方式和個(gè)體的情況進(jìn)行選擇。其它因素包括所需的治療時(shí) 間。當(dāng)個(gè)體對(duì)使用的起始劑量反應(yīng)不足時(shí)，可使用更高劑量(或通過不 同的更局部的遞送途徑產(chǎn)生有效的更高劑量)至個(gè)體可耐受的程度。通常，才艮據(jù)本領(lǐng)域中任何標(biāo)準(zhǔn)的方法，以1 ng至1 mg,優(yōu)選10 ng 至lOOpg的劑量來配制或施用抗體的劑量。當(dāng)使用核酸或其變體時(shí)， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法通常配制和給藥的劑量為lng至0.1mg。組合物的其 它給藥方法為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知，其中劑量、注射方案、注 射位置、給藥方式(例如，骨內(nèi))等等與前述不同。對(duì)非人哺乳動(dòng)物進(jìn) 行的組合物給藥，(如用于試驗(yàn)?zāi)康幕颢F醫(yī)治療目的)，在與上述基本 相同的條件下完成。此處所用的個(gè)體為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人，并且包括 非人的靈長類動(dòng)物、母牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒動(dòng)物。給藥時(shí)，本發(fā)明的藥物制劑以藥物可接受的量和藥物可接受的組 合物使用。術(shù)語"藥物可接受的"指無毒性材料，不干擾活性成分的生 物活性作用。這些制劑通?？砂}、緩沖劑、防腐劑、合適的載體， 以及任選其它治療劑。當(dāng)用于藥物時(shí)，鹽應(yīng)是藥物可接受的，但非藥 物可接受的鹽可方便地用于制備其藥物可接受的鹽，且不排除在本發(fā) 明范圍之外。這些藥理學(xué)上和制藥上可用的鹽包括，但不局限于，從 下述酸制備的那些鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、 乙酸、水楊酸、檸檬酸、曱酸、丙二酸、琥珀酸等等。并且，藥物可 接受的鹽可制備成堿金屬或堿土金屬鹽，如鈉、鉀或鈣鹽。如果需要，可將藥物組合物與一種可藥用載體組合。此處所用的 術(shù)語"可藥用載體"指一或多種適于對(duì)人給藥的合適的固體或液體充填 劑、稀釋劑或封裝物質(zhì)。術(shù)語"載體"指與活性成分組合以促進(jìn)使用的 天然或合成的有機(jī)或無機(jī)成分。藥物組合物的成分也能與本發(fā)明的分 子以及相互之間進(jìn)行混合，其混合的方式使得沒有顯著減弱所需藥效 的相互作用。藥物組合物可包含合適的緩沖劑，包括乙酸鹽；檸檬酸鹽；硼 酸鹽；和磷酸鹽。藥物組合物也可任選包含合適的防腐劑，如苯扎氯銨；氯丁醇； 對(duì)羥苯曱酸酯和硫柳汞。藥物組合物可方便地制成單位劑型，可通過藥學(xué)領(lǐng)域中熟知的任 何方法制備。所有方法包括將活性劑與構(gòu)成 一 或多種輔助劑的載體聯(lián) 合的步驟。通常，組合物通過均勻地直接將活性化合物與液體載體、 分開良好的固體載體或二者聯(lián)合，如果必需，然后將產(chǎn)物成形進(jìn)行制 備。適于口服給藥的組合物可以不同單位存在，如膠嚢、片劑、錠劑， 各包含預(yù)定量的活性化合物。其它組合物包括水懸液或非水懸液，如 糖漿、酏劑或乳劑。適于腸胃外給藥的組合物方便地包括抗體或核酸的無菌水或非水 制劑，優(yōu)選與受者血液等滲。該制劑可根據(jù)已知方法使用合適的分散 劑或濕潤劑及懸浮劑配制。無菌注射劑也可為無菌可注射溶液或混懸 液，使用無毒的可腸胃外使用的稀釋劑或溶劑，例如，1，3-丁二醇溶 液?？捎玫暮线m的載體和溶劑為水、林格氏液以及等滲氯化鈉溶液。 此外，將無菌的不揮發(fā)油常規(guī)地用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可使用 任何溫和的不揮發(fā)油，包括合成的單或二甘油酯。此外，如油酸的脂 肪酸可用于注射劑的制劑中。適于口腔、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)等給藥 的載體制劑可在Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明頓制藥學(xué))， Mack Publishing Co., Easton， PA中發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的另一方面提供了適于表達(dá)本發(fā)明人源化或嵌合抗體的載體。本發(fā)明的 一 方面提供細(xì)胞，已將其以編碼本發(fā)明人源化或嵌合抗 體的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。括 、 " 、 ；、, 、'、(i) 提供以載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，該載體包括編碼本發(fā)明人源化或嵌合抗體的核酸分子；(ii) 在有助于生產(chǎn)所述抗體的條件中生長所述細(xì)胞；(iii) 從所述細(xì)胞或其生長環(huán)境中純化所述抗體。本發(fā)明的另一方面提供產(chǎn)生上述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。 本發(fā)明的另 一 方面提供使用本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生本發(fā)明單克 隆抗體的方法。本發(fā)明的另一方面提供制備產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞 系的方法，包括步驟i) 以免疫原免疫具有免疫能力的哺乳動(dòng)物，該免疫原包括至少 一種具有如表1中Genbank登錄號(hào)所示的氨基酸序列的多肽， 或其片斷，或至少一種由如SEQ ID NO 1-452中所示的核酸分 子編碼的多肽；ii) 將受免疫的具有免疫能力的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì) 月包融合，形成雜交瘤細(xì)胞；iii) 篩選由步驟(ii)雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體與(i)的多肽的 結(jié)合活性；iv) 培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，以擴(kuò)增和/或分泌所述單克隆抗體；以及v) 從培養(yǎng)上清夜中回收單克隆抗體。優(yōu)選地，所述具有免疫能力的哺乳動(dòng)物為小鼠?；蛘撸鼍哂?免疫能力的哺乳動(dòng)物為大鼠。使用雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體為本領(lǐng)域所熟知。用于產(chǎn)生單克 隆抗體的方法/>開于Kohler and Milstein ， Nature(自然)256， 495-497(1975)以及Donillard and Hoffman ， "Basic Facts about Hybridomas " in Compendium of Immunology (《免疫學(xué)相克論》中的"關(guān) 于雜交瘤的基本知識(shí)")V.IIed. by Schwartz, 1981，將其引入以供參考。本發(fā)明的另 一方面提供確定個(gè)體癌癥的診斷分析，包括步驟 i)提供分離的細(xì)胞樣品；ii) 將(i)中樣品與結(jié)合劑接觸，該結(jié)合劑與如SEQ ID NO 1-452 中核酸序列所示的核酸分子結(jié)合；iii) 與正常的配對(duì)對(duì)照樣品比較，確定所述樣品中所述核酸分子 的表達(dá)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述結(jié)合劑為一種寡核苷酸引物。 優(yōu)選地，所述分析為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述結(jié)合劑為一種抗體，該抗 體與由如SEQ ID NO 1-452中所示的核酸分子編碼的多肽或多肽變體 特異性地結(jié)合，該多肽變體包括從參照氨基酸序列添加、刪除或取代 至少一個(gè)氨基酸殘基變化而來的氨基酸序列。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述癌癥為前列腺癌。本發(fā)明的另一方面提供試劑盒，其包括與如SEQIDNO 1-452中 核酸序列所示的核酸分子特異性反應(yīng)的結(jié)合劑，或與多肽特異性反應(yīng) 的試劑，該多肽包括由包括如SEQ ID NO 1 -452中所示的核酸序列的 核酸分子編碼的氨基酸序列。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一 步包括與所述核酸 分子或所述多肽特異性反應(yīng)的寡核苷酸或抗體。優(yōu)選地，所述試劑盒包括熱穩(wěn)定的DNA聚合酶和指導(dǎo)核酸擴(kuò)增 所需的組分。優(yōu)選地，所述試劑盒包括指導(dǎo)所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一 套說明書和對(duì)照核酸。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒包括一種與多肽 特異性反應(yīng)的抗體，該多肽包括由如SEQIDNO 1-452中所示的核酸 序列編碼的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述試劑盒包括開展免疫測(cè)定所需的組分，包括，例如， 與第 一抗體特異性反應(yīng)的第二抗體，該第 一抗體特異性結(jié)合所述多肽， 以及檢測(cè)所述第二抗體與所述第一抗體結(jié)合所需的酶試劑。本發(fā)明的另 一 方面提供篩選調(diào)節(jié)多肽活性的試劑的方法，該多肽 由選自以下的核酸分子編碼a) 包括如SEQ ID NO 1-452中所示的核酸序列的核酸分子；b) 由如表1中Genbank登錄號(hào)所示的核酸序列構(gòu)成的核酸分子；c)在嚴(yán)緊雜交條件下與上述(i)或(ii)中的核酸分子雜交并編碼 多肽的核酸分子，其中所述多肽為干細(xì)胞特異的；i) 形成制劑，其包括多肽，或其序列變體，以及至少一種被測(cè) 試試劑；ii) 根據(jù)所述多肽的活性確定所述試劑的活性。 在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述試劑為一種拮抗劑。在本發(fā)明另一優(yōu)選方法中，所述試劑為激動(dòng)劑。用本發(fā)明篩選方法鑒別的試劑包括，抗體、siRNA、適體、小的 有機(jī)分子(例如肽、環(huán)肽)、此處公開的多肽的顯性陰性變體。如上所述，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供來自此處公開的多 肽的"顯性陰性"多肽。顯性陰性多肽是蛋白質(zhì)的非活性變體，從與細(xì) 胞機(jī)器相互作用中取代活性蛋白，或與活性蛋白竟?fàn)?，從而減少活性性陰性受體能夠減少該配體表達(dá)的生物效應(yīng)。同樣地，通常與耙蛋白 相互作用但不磷酸化靶蛋白的無催化活性的顯性陰性激酶可降低靶蛋 白響應(yīng)細(xì)胞信號(hào)引起的磷酸化。類似地，與另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子或基因控 制區(qū)域內(nèi)的啟動(dòng)子位點(diǎn)結(jié)合但不增加基因轉(zhuǎn)錄的顯性陰性轉(zhuǎn)錄因子可 通過占據(jù)啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)而不增加轉(zhuǎn)錄，從而減少正常轉(zhuǎn)錄因子的作 用。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，對(duì)肽試劑氨基酸序列的修飾可 增強(qiáng)該肽與其靶序列的結(jié)合性和/或穩(wěn)定性。此外，肽的修飾也可增加 肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性，從而減少抑制此處公開的多肽活性所必需的肽的 有效量。這將有利地減少在體內(nèi)可能產(chǎn)生的不良副作用。修飾包括， 例如但不局限于，乙?；王０坊；蛘呋騼?yōu)選地，所述修飾包括在 生產(chǎn)重組或合成形式的肽中使用修飾的氨基酸。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯 而易見的是，修飾的氨基酸包括，例如，4-羥脯氨酸、5-羥基賴氨酸、 N6-乙酰基賴氨酸、N6-曱基賴氨酸、N6，N6-二甲基賴氨酸、N6,N6,N6-三甲基賴氨酸、環(huán)己基丙氨酸、D-氨基酸、鳥氨酸。其它修飾包括具 有Q、 C3或C4烴基R基團(tuán)的氨基酸，該基團(tuán)任選被l、 2或3個(gè)選自鹵素(如F、 Br、 1)、羥基或C,-C4烷氧基的取代基取代。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù) 人員也顯而易見的是，保留p53結(jié)合活性的肽可通過環(huán)化修飾。環(huán)化 為本領(lǐng)域所知，(見Scott et al Chem Biol(化學(xué)生物學(xué))(2001)， 8: 801-815;Gellerman et al J. Peptide Res(肽研究雜志)(2001)， 57: 277-291; Dutta et al J. Peptide Res(肽研究雜志)(2000)， 8: 398-412; Ngoka and Gross J Amer Soc Mass Spec(美國質(zhì)譜會(huì)志)(1999), 10: 360-363。本發(fā)明的另 一方面提供治療個(gè)體癌癥的方法，其包括給予有效量 的本發(fā)明試劑。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述對(duì)象為人。 在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述癌癥為前列腺癌。 本發(fā)明的另一方面提供了使動(dòng)物免疫抵抗癌性疾病狀態(tài)的方法， 其包括給予有效量的核酸或由選自本發(fā)明的核酸分子編碼的多肽。 在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述動(dòng)物為人。 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述癌癥為前列腺癌。 此處所用的術(shù)語"癌癥"指具有自主生長能力的細(xì)胞，即，具有迅 速增殖細(xì)胞生長特征的不正常狀態(tài)或情況。該術(shù)語包括所有類型的癌 性生長或致癌過程，轉(zhuǎn)移的組織或惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或器官，與 組織病理學(xué)類型或侵襲階段無關(guān)。術(shù)語"癌癥"包括各種器官系統(tǒng)的惡 性腫瘤，如那些影響例如肺、乳腺、甲狀腺、淋巴、胃腸和生殖泌尿 道的惡性腫瘤，以及腺癌，其包括惡性腫瘤，如大多數(shù)結(jié)腸癌、腎細(xì) 胞癌、前列腺癌和/或睪丸腫瘤、肺的非小細(xì)胞癌、小腸癌和食道癌。 術(shù)語"癌瘤"是本領(lǐng)域所^H人的，指上皮或內(nèi)分泌組織的惡性腫瘤，包 括呼吸系統(tǒng)癌、胃腸系統(tǒng)癌、生殖泌尿系統(tǒng)癌、睪丸癌、乳腺癌、前 列腺癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌和黑素瘤。代表性的癌瘤包括那些從宮頸、肺、 前列腺、乳腺、頭和頸、結(jié)腸和卵巢組織形成的癌。術(shù)語"癌瘤"還包 括癌肉瘤，例如，包括由癌和肉瘤組織組成的惡性胂瘤。"腺癌"指來 自腺組織的癌或其中肺瘤細(xì)胞形成可辨別的腺結(jié)構(gòu)。術(shù)語"肉瘤"是本 領(lǐng)域公認(rèn)的，指間充質(zhì)細(xì)胞衍生的惡性腫瘤。在本說明書和權(quán)利要求中，單詞"包括(comprise)"和"包含(contain)"以及該單詞的變化，例如"comprising"和"comprise",指"包 括但不局限于"，不排除其它的部分、添加劑、組分、整體或步驟。在本說明書和權(quán)利要求中，單數(shù)包括復(fù)數(shù)意義，除非文中另有要 求。特別是，使用不定冠詞時(shí)，應(yīng)將說明預(yù)期理解為復(fù)數(shù)和單數(shù)，除 非文中另有要求。將與本發(fā)明的具體方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├嚓P(guān)的所述特征、整 體、特性、化合物、化學(xué)部分或基團(tuán)理解為適用于此處所述的任何其 它方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├鞘遣贿m合的?，F(xiàn)僅通過舉例并參照下述附圖、材料及方法來描述本發(fā)明的實(shí)施方案；圖1: CD 133作為前列腺上皮細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物的驗(yàn)證1A:以 核染料DAPI(藍(lán)色)和與PE(紅色)直接偶聯(lián)的抗CD133標(biāo)記的前列 腺腺泡的石蠟切片。IB:具有(X2(3,/CD133+表型的基底細(xì)胞具有高于 a2(3 。w/CD133-的集落形成效率(CFE)。 CFE以形成的集落數(shù)/選擇的細(xì) 胞數(shù)xl00。/。進(jìn)行計(jì)算。將CFE表示為與對(duì)照CFE的比值。結(jié)果顯示 為四個(gè)試—驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤。1C.通過移植口2口^ /CD133+ 基底細(xì) 胞形成的前列腺腺泡的異種移植物，以(A)蘇木精和伊紅，(B) 3鄰E12， (C)抗K18， (D)抗PAP和(E)抗雄激素受體染色。橫棒為 40,;圖2:前列腺淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶(LNMP)的腫瘤"千"細(xì)胞的鑒定。2A. 基于(X2P,hi/CD133+選擇的腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)分化。2B.將LNMP的侵 襲分析活性與PC3M和永生化的前列腺上皮細(xì)胞系PNTla相比4吏；圖3a表示來自a2 hi /CD133+纟田胞(PE434細(xì)胞；Gleason 9)的 NFkB表達(dá)；附圖3b表示NFkB和CD133+表達(dá)的FACS點(diǎn)圖；84% 的細(xì)胞為NFkB單陽性以及0.21。/。為NFkB和CD133陽性。表1概述前列腺干細(xì)胞和前列腺癌干細(xì)胞的陣列分析。基因/核酸 禾口氨基酉吏序歹'j以可在http: 〃www.ncbi.nkn.nih.gov登錄的Genbank登 錄號(hào)標(biāo)示?；蛞惨酝ㄓ妹麡?biāo)示。將以供參考的方式將各登錄的內(nèi)容 引入，包括個(gè)體基因的氨基酸序列。材料和方法分離的腫瘤干細(xì)胞的基因型使用與散發(fā)的前列腺癌有關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)志物(8p 10q 16p),我們能 夠確定，與同 一 患者的血淋巴細(xì)胞DNA相比，分離的 HEAVCDA^/a^hi /CD133+細(xì)胞是否顯示出前列腺肺瘤丟失了雜合 模式特征。在培養(yǎng)物的微量試樣上以3MM紙和熒光標(biāo)記的PCR引物 (Macintosh etal.， 1998)完成分析。這將使我們能區(qū)分正常細(xì)胞和癌細(xì) 胞，并確定干細(xì)胞是否的確是轉(zhuǎn)化事件的靶標(biāo)。假定的癌干細(xì)胞的增殖、分化和惡化潛能分離不同的腫瘤細(xì)胞群體，在體外和體內(nèi)確定其增殖、分化和惡 性的潛能。將下述群體HEA+/CD44X管腔細(xì)胞(luminal cell))、 HEAVCD44+(基底細(xì)胞)、HEA+/CD44+/a2p! '。w/CD 133-(傳輸細(xì)胞(transit cell))、HEAVCD44Va2(3ihi/CD133+(干細(xì)胞)分離并與未分類的腫瘤群體 進(jìn)行比較。集落形成效率(CFE):不依賴于貼壁和依賴于貼壁的生長。不同的癌細(xì)胞群體(如上述)的轉(zhuǎn)化潛能(不依賴于貼壁)通過其在 軟瓊脂中形成集落的能力進(jìn)行測(cè)定。在21天后使用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)個(gè) 體集落。比較CFE和集落大小。在重建的基底膜基質(zhì)凝膠中的形態(tài)發(fā)生我們已確定腫瘤千細(xì)胞及其始祖在重建的基底膜(如基質(zhì)膠 (Matrigel))中經(jīng)歷腺形態(tài)發(fā)生的潛能。我們已證明，當(dāng)存在雄激素的情 況下，在具有間質(zhì)的以膠原為基礎(chǔ)的基質(zhì)(如基質(zhì)膠)中生長時(shí)，正常 基底細(xì)胞能經(jīng)歷腺形態(tài)發(fā)生。產(chǎn)生構(gòu)造和表型類似于體內(nèi)腺泡的球狀 體，且常有分支的泡和管(Langetal., 2001)。相反，癌細(xì)胞常形成紡 錘狀細(xì)胞的大聚集物，無明顯的結(jié)構(gòu)。盡管如此，這些結(jié)構(gòu)常包含顯 示某種分化程度的細(xì)胞，類似最初的腫瘤。侵入試驗(yàn)將這些干細(xì)胞遷移穿過基質(zhì)膠的能力通過改良的博伊登室(Boyden-chamber)方法(Albini et al., 1987)進(jìn)行測(cè)定。使用定時(shí)的共聚 焦顯微鏡和以EGFP標(biāo)記的細(xì)胞評(píng)價(jià)遷移速率。我們已產(chǎn)生表達(dá)低水 平EGFP的前列腺上皮細(xì)胞。將基于產(chǎn)生的pLNCX-EGFP(2)的重組逆 轉(zhuǎn)錄病毒用于感染細(xì)胞群體，將抗G418的集落用于運(yùn)動(dòng)力試驗(yàn)中。 將低水平的GFP表達(dá)用于實(shí)時(shí)跟蹤侵入和運(yùn)動(dòng)力。體內(nèi)腫瘤形成腫瘤干細(xì)胞必須具有界定正常干細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)移植后它們必 須增殖、分化和自我更新。為確定不同肺瘤表型在體內(nèi)克隆的能力， 將干細(xì)胞、傳輸細(xì)胞、基底細(xì)胞、管腔細(xì)胞和未分類細(xì)胞的移植物置 入6至8周齡免疫抑制的雄性小鼠前列腺中。在移植時(shí)將小鼠以皮下 植入緩釋睪酮球劑進(jìn)行激素治療。來自成功植入且開始腫瘤增殖的各 群體的細(xì)胞數(shù)通過改變植入的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測(cè)定。不同群體的自我更新 能力通過連續(xù)植入第二受者進(jìn)行測(cè)定。陣列樣品和數(shù)據(jù)處理 總RNA的提取 a7hi/CD133+細(xì)胞使用QIAgen RNeasy微柱從高達(dá)1 x 104個(gè)選擇細(xì)胞提取總RNA。 將細(xì)胞在100^1 RLT緩沖液+ 1 % |3-巰基乙醇中溶解，采用"從動(dòng)物細(xì) 胞分離總RNA"的操作方法(RNeasy_Micro0403.pdf, 39-44,以供參考 方式將其引入)。Q^'。w細(xì)胞使用QIAgen RNeasy小柱從1 x 105至1 x 106個(gè)選擇細(xì)胞提取總 RNA。將細(xì)胞在350|ilRLT緩沖液+1。/。p-巰基乙醇中溶解，釆用"從 動(dòng)物細(xì)胞分離總RNA"的操作方法(RNeasy—Mini0601.pdf, 31-35,以 供參考方式將其引入)。以分光光度計(jì)在260nm測(cè)定RNA產(chǎn)率，使用Agilent 2100生物 分析儀以毛細(xì)管電泳;險(xiǎn)查RNA完整性。制備片斷化的標(biāo)記的cRNA將總RNA擴(kuò)增，使用兩輪的cDNA合成、IVT(體外轉(zhuǎn)錄)以及采 用Affymetrix小^見才莫標(biāo)記方法vll(smallv2—technote.pdf,以供參考方 式將其引入)標(biāo)記生物素，該方法有以下^f奮改1. 每個(gè)樣品使用10-50ng總RNA(步驟1)。2. 將兩個(gè)第二鏈cDNA合成反應(yīng)中的T4DNA聚合酶步驟省略 (步驟2&7)。3. 在第二個(gè)循環(huán)，用于cRNA擴(kuò)增和標(biāo)記的IVT(步驟9)使用 Affymetrix GeneChip IVT標(biāo)記試劑盒代替ENZO BioArray High Yield RNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒，此階^殳采用Affymetrix真核生物if又樣和陣列 處理標(biāo)準(zhǔn)方法(expression—s2—manual—0604.pdf， section 2.1.34- 2.1.35 ， 以供參考方式將其引入)。第 一和第二個(gè)循環(huán)的cRNA產(chǎn)物的質(zhì)量和cRNA片斷使用Agilent 2100生物反應(yīng)儀以毛細(xì)管電泳檢查。陣列雜交在Affymetrix HG-U133plus2基因芯片上將標(biāo)記的片斷化的 cRNA(15昭)與寡核苷酸探針雜交。關(guān)于雜交、洗滌、染色和掃描， 采用 Affymetrix 真核生物耳又樣和陣列處理標(biāo)準(zhǔn)方法 (expression—s2—manual_0604.pdf， section 2.2.3-2.3.17，以供參考方式將 其引入)。1. 4吏用Affymetrix Hybridization Oven 640進(jìn)4亍雜交。2. 使用Affymetrix Fluidics Station 450采用EukGE-WS2v5方法 進(jìn)行洗滌和染色。3. 4吏用Affymetrix Gene Scanner 3000進(jìn)4亍P車歹寸掃4笛。數(shù)據(jù)處理使用Affymetrix GCOS軟件處理掃描的基因芯片圖像來取得各探 針的強(qiáng)度值和信號(hào)(存在、不存在或少量邊緣值)。使用MAS5算法取 得探針強(qiáng)度。使用Agilent GeneSpring GX軟件進(jìn)行不同樣品數(shù)據(jù)集之間的比 較。使用三個(gè)步驟(以所給順序連續(xù)應(yīng)用)，首先標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行比較的數(shù) 據(jù)集1. 轉(zhuǎn)化值O.Ol至0.01。2. 標(biāo)準(zhǔn)化各芯片至該芯片測(cè)定結(jié)果的50%。3. 標(biāo)準(zhǔn)化各探針至該探針測(cè)定結(jié)果的中位值。為了分析數(shù)據(jù)，使用下述參數(shù)1. 將所有來自前列腺癌樣本的細(xì)胞歸類為惡性，所有來自BPH 樣本的細(xì)胞歸類為良性("腫瘤類型"參數(shù))。2. 將所有高整合素a^和CD133表達(dá)的選擇細(xì)胞歸類為干細(xì)胞， 所有低整合素a2p,表達(dá)的選擇細(xì)胞歸類為定型基底細(xì)胞("細(xì)胞類型" 參數(shù))。3. 對(duì)數(shù)據(jù)的進(jìn)一步解釋可以綜合上述參數(shù)，取得以下條件惡性 干細(xì)胞、惡性定型基底細(xì)胞、良性干細(xì)胞和良性定型基底細(xì)胞。使用三種選擇(以所給順序連續(xù)應(yīng)用)去除低質(zhì)量的和無信息的數(shù)據(jù)1. 去除所有樣品中標(biāo)記為"無"的探針。2. 去除至少在四種條件中的三種條件下標(biāo)準(zhǔn)差參數(shù)級(jí)〉1的探針。3. 去除在所有四種條件下標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)值低于2倍總變化的探針。
權(quán)利要求
1.調(diào)節(jié)癌干細(xì)胞特異核酸分子活性的試劑，或由癌干核酸分子編碼的多肽，其中所述的癌細(xì)胞特異核酸分子選自i)SEQ ID NO1-452中所示的核酸序列構(gòu)成的核酸分子；ii)在嚴(yán)緊雜交條件下與上述(i)中的核酸分子雜交并編碼一種多肽的核酸分子，其中所述多肽為干細(xì)胞所特有，用作藥物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其中所述試劑為拮抗劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其中所述試劑為激動(dòng)劑。
4. 調(diào)節(jié)多肽活性的試劑，該多肽包括選自下述核酸分子編碼的氨 基酸序列i) SEQ ID NO: 1-452中所示的核酸分子編碼的氨基酸序列；ii) 編碼變體多肽的核酸分子編碼的多肽，其中所述變體多肽通過 添加、刪除或取代氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行修飾，該氨 基酸序列由選自SEQIDNO:l-452的核酸序列編碼，其中所述多肽為 干細(xì)胞所特有，特征為所述試劑用作藥物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑，其中所述試劑為多肽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑，其中所述多肽為抗體或抗體的活 性結(jié)合部分。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑，其中所述抗體為單克隆抗體或其 活性結(jié)合部分。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的試劑，其中所述抗體為嵌合抗體或 人源化抗體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的試劑，其中所述試劑為抗體 片斷。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑，其中所述片斷選自Fab、 Fab2、 F(ab')2、 Fv、 Fc、 Fd或scFvs。
11. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的試劑，其中所述抗體片斷為單鏈抗體 可變區(qū)片斷。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的試劑，其中所述抗體為兩種不 同抗原的雙特異性結(jié)合的兩種不同抗原決定簇。
13. 根據(jù)權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)所述的試劑，其中所述抗體為調(diào) 理素抗體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求6-13中任一項(xiàng)所述的試劑，其中所述抗體具有 標(biāo)志物或一示簽。
15. 根據(jù)權(quán)利要求6-14中任一項(xiàng)所述的試劑，其中所述抗體或抗 體片斷與治療劑連接或交聯(lián)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑，其中所述治療劑為化療劑。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的試劑，其中所述試劑選自順鉑； 卡鉑；環(huán)磷酰胺；苯丙氨酸氮芥；卡氮芥；甲氨蝶呤；5-氟尿嘧啶； 阿糖胞苷；巰。票呤；柔紅霉素；多柔比星；表柔比星；長春堿；長春 新堿；放線菌素D;絲裂霉素C;紫杉醇；L-天冬酰胺酶；G-CSF; 表鬼臼毒；秋水仙堿；曱磺酸去鐵胺；和喜樹堿。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的試劑，其中所述試劑為核 酸分子。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑，其中所述核酸分子選自反義 核酸，適體或小的干涉RNA。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑，其中所述核酸分子為小的干涉 RNA。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑，其中所述小的千涉RNA長度 為21-29個(gè)核苷酸。
22. 藥物組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1-21中任何一項(xiàng)所述的試劑。
23. 組合物，包括選自以下的核酸分子i) 由SEQ ID NO: 1-452中所示的核酸序列組成的核酸分子；ii) 在嚴(yán)緊雜交條件下與上述(i)中的核酸分子雜交并編碼多肽的核 酸分子，其中所述多肽為干細(xì)胞所特有，用作疫苗。
24. 包含多肽的組合物，該多肽包括由SEQ ID NO 1-452中所示 的核酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列，或變體多肽，其中所述變 體多肽通過添加、刪除或取代氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行 修飾，該氨基酸序列由選自SEQIDNO:l-452的核酸序列編碼，用作疫苗。
25. 根據(jù)權(quán)利要求23或24的組合物，其中所述組合物包括佐劑 和/或載體。
26. 載體，其適于表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求8-14中任一項(xiàng)的人源化或嵌 合抗體或抗體片斷。轉(zhuǎn)染。 ' -， ；"、， 一
27.
28. 產(chǎn)生本發(fā)明人源化或嵌合抗體的方法，包括i) 提供一種以載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，該載體包括編碼根據(jù)權(quán)利 要求8-14中任何一項(xiàng)的人源化或嵌合抗體或抗體片斷的核酸分子；ii) 在有助于生產(chǎn)所述抗體的條件中生長所述細(xì)胞；iii) 從所述細(xì)胞，或其生長環(huán)境純化所述抗體或片斷。
29. 產(chǎn)生權(quán)利要求7的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
30. 產(chǎn)生權(quán)利要求7的單克隆抗體的方法，包括使用權(quán)利要求29 的雜交瘤細(xì)胞系。
31. 制備產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的方法，包括步驟i) 以免疫源免疫具有免疫能力的哺乳動(dòng)物，該免疫源包括至少 一種由如SEQ ID NO 1-452中所示的核酸分子編碼的多肽， 或其片斷；ii) 將受免疫的具有免疫能力的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤 細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞；iii) 篩選由步驟(ii)雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體與(i)的多肽的 結(jié)合活性；iv) 培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，以增加和/或分泌所述單克隆抗體；以及v) 從培養(yǎng)上清夜中回收單克隆抗體。
32.確定個(gè)體中癌癥的診斷分析，包括步驟 i)提供分離的細(xì)胞樣品；ii) 將(i)中樣品與結(jié)合劑接觸，該結(jié)合劑與SEQIDNO 1-452中 核酸序列所示的核酸分子、或在嚴(yán)緊雜交條件下與所述的核 酸分子雜交的核酸分子并編碼變體多肽的核酸分子結(jié)合；iii) 與正常的配對(duì)對(duì)照樣品比較，確定所述樣品中所述核酸分子 的表達(dá)。
33. 根據(jù)權(quán)利要求的32所述的分析，其中所述結(jié)合劑為寡核苦酸 引物。
34. 根據(jù)權(quán)利要求的33所述的分析，其中所述的分析為聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
35. 根據(jù)權(quán)利要求的32所述的分析，其中所述結(jié)合劑為抗體，該 抗體與由SEQIDNO 1-452中所示的核酸分子編碼的多肽，或多肽變 體特異性地結(jié)合，多肽變體包括從參照氨基酸序列添加、刪除或取代 至少一個(gè)氨基酸殘基變化而來的氨基酸序列。
36. 根據(jù)權(quán)利要求的35所述的分析，其中所述的癌癥為前列腺癌。
37. 試劑盒，其包括與SEQ ID NO 1-452中核酸序列所示的核酸 分子特異性反應(yīng)的結(jié)合劑，或與多肽特異性反應(yīng)的試劑，該多肽包括 由包括SEQ ID NO 1-452中所示的核酸序列的核酸分子編碼的氨基酸 序列。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的試劑盒，其中所述試劑盒進(jìn)一步包括 與所述核酸分子或所述多肽特異性反應(yīng)的寡核苷酸或抗體。
39. 根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括 熱穩(wěn)定的DNA聚合酶和指導(dǎo)核酸擴(kuò)增所需的組分。
40. 根據(jù)權(quán)利要求37-39中任何一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述試 劑盒包括指導(dǎo)所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的 一 套說明書和對(duì)照核酸。
41. 根據(jù)權(quán)利要求37-40中任何一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述試 劑盒包括與多肽特異性反應(yīng)的抗體。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括開展免 疫分析所需的組分，包括，例如，與第一抗體特異性反應(yīng)的第二抗體， 該第一抗體特異性結(jié)合所述多肽，以及檢測(cè)所述第二抗體與所述第一 抗體結(jié)合所需的酶試劑。
43. 篩選調(diào)節(jié)多肽活性的試劑的方法，該多肽由選自以下的核酸 分子編碼a) 由SEQIDNO 1-452中所示的核酸序列組成的核酸分子；b) 在嚴(yán)緊雜交條件下與上述(i)中的核酸分子雜交并編碼多肽的 核酸分子，其中所述多肽為千細(xì)胞特有；i) 形成制劑，其包括多肽或其序列變體，以及至少一種待測(cè)試試劑；ii) 根據(jù)所述多肽的活性確定所述試劑的活性。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述試劑為拮抗劑。
45. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述試劑為激動(dòng)劑。
46. 治療個(gè)體癌癥的方法，其包括給予有效量的權(quán)利要求1-21中 任何一項(xiàng)的試劑。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述個(gè)體為人。
48. 根據(jù)權(quán)利要求46或47所述的方法，其中所述癌癥為前列腺癌。
49. 使動(dòng)物免疫抵抗癌性疾病的方法，其包括給予有效量的核酸 或由選自以下的核酸分子編碼的多肽i)由SEQ ID NO 1 -452中所示的核酸序列組成的核酸分子；核酸分子，其中所述多肽為干細(xì)胞特有。
50. 根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述動(dòng)物為人。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述癌癥為前列腺癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了干細(xì)胞的基因標(biāo)志物，典型的是前列腺干細(xì)胞，特別是癌干細(xì)胞，例如前列腺癌干細(xì)胞的標(biāo)志物；基于所述干細(xì)胞基因的治療劑和診斷分析；以及包括用以鑒別治療劑的篩選分析。
文檔編號(hào)A61K39/00GK101253274SQ200680027529
公開日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2006年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月26日
發(fā)明者安妮·柯林斯, 斯蒂文·布賴斯, 諾曼·梅特蘭 申請(qǐng)人:波休爾醫(yī)療有限公司