專利名稱：：增強(qiáng)治療劑黏膜遞送的緊密連接調(diào)控肽成分的制作方法增強(qiáng)治療劑的黏膜遞送的緊密連接調(diào)控肽成分發(fā)明背景在任何疾病或病況的治療中基本的關(guān)心是保證將治療劑藥物安全并且有效地遞送到受試者。治療劑遞送的常規(guī)途徑包括靜脈內(nèi)注射和口服施用。然而，這些遞送方法有缺點(diǎn)，并且因此需要備選的遞送系統(tǒng)。通過(guò)注射施用藥物的一個(gè)主要缺點(diǎn)是通常需要由培訓(xùn)過(guò)的人員來(lái)施用藥物。另外，當(dāng)通過(guò)注射施用藥物時(shí)，培訓(xùn)過(guò)的人員處在危險(xiǎn)中。對(duì)于自我-施用的藥物，許多患者勉強(qiáng)或不能在正規(guī)基礎(chǔ)上給他們自己注射。注射還與增加的感染危險(xiǎn)有關(guān)。藥物注射的其它缺點(diǎn)包括個(gè)體之間遞送結(jié)果的可變性，以及藥物作用的不可預(yù)知的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。盡管具有這些缺點(diǎn)，對(duì)于許多重要的治療化合物，注射仍為唯一經(jīng)過(guò)核準(zhǔn)的遞送方式。這些包括常規(guī)藥物，以及快速發(fā)展的肽和蛋白生物治療劑列表。這些化合物通過(guò)備選施用途徑例如口服、鼻和其它黏膜途徑的遞送是理想的，但是可能提供更低的生物利用度。對(duì)于大分子種類，例如，肽和蛋白治療化合物，備選施用途徑可能受到易失活性和經(jīng)過(guò)黏膜屏障的低吸收的限制。由于肝的第一遍代謝(hepaticfirst-passmetabolism)和/或在胃腸道中的降解，一些治療劑的口服施用在作用中表現(xiàn)出非常低的生物利用度和極大的時(shí)間延遲。治療化合物的黏膜施用與注射和其它施用方式相比提供某些優(yōu)點(diǎn)，例如，關(guān)于遞送的便利性和速度，以及減少或消除順應(yīng)性問(wèn)題和副作用。然而，生物活性藥劑的黏膜遞送受到黏膜屏障作用和其它因素的限制。上皮細(xì)胞組成黏膜屏障，并且提供外部環(huán)境與黏膜和黏膜下組織以及細(xì)胞外區(qū)室之間的重要界面。黏膜上皮細(xì)胞的一種最重要的功能是確定并且調(diào)節(jié)黏膜滲透性。在這種情形中，上皮細(xì)胞在不同生理區(qū)室之間產(chǎn)生選擇性滲透屏障。選擇滲透性是分子通過(guò)細(xì)胞質(zhì)的調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)(跨細(xì)胞途徑)和細(xì)胞間空間的調(diào)節(jié)的滲透性(旁細(xì)胞途徑(paracellularpathway))的結(jié)果。己知上皮細(xì)胞之間的細(xì)胞間連接參與上皮細(xì)胞屏障作用的維持和調(diào)控，以及細(xì)胞-細(xì)胞黏附。上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接(TJ)對(duì)于調(diào)控旁細(xì)胞途徑的滲透性的細(xì)胞-細(xì)胞連接特別重要，并且還將細(xì)胞表面分成頂部和基底外側(cè)區(qū)室。緊密連接在上皮細(xì)胞之間形成連續(xù)的周圍細(xì)胞間接觸，并且產(chǎn)生水、溶質(zhì)和免疫細(xì)胞的旁細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)控屏障。通過(guò)限制頂部和基底外側(cè)膜結(jié)構(gòu)域之間的膜脂質(zhì)交換，它們還提供構(gòu)成細(xì)胞極性的第二種類型的屏障。認(rèn)為緊密連接直接參與上皮細(xì)胞的屏障和防御功能，分別通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞間密封以生成針對(duì)溶質(zhì)通過(guò)旁細(xì)胞途徑擴(kuò)散的一級(jí)屏障，和通過(guò)作用為頂部和基底外側(cè)質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域之間的邊界以產(chǎn)生并且維持細(xì)胞極性而參與。緊密連接還參與白細(xì)胞到達(dá)炎性位點(diǎn)的移動(dòng)。應(yīng)答化學(xué)引誘劑，白細(xì)胞通過(guò)穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞而從血液移動(dòng)，并且在黏膜感染的情形中，穿過(guò)發(fā)炎的上皮細(xì)胞。移動(dòng)主要沿著旁細(xì)胞途徑發(fā)生，并且似乎通過(guò)以高度協(xié)調(diào)和可逆的方式開放和關(guān)閉緊密連接而調(diào)控。已經(jīng)鑒定許多蛋白與TJs有關(guān)，包括內(nèi)部和外部質(zhì)膜蛋白。目前對(duì)這些蛋白的復(fù)合體結(jié)構(gòu)和相互作用功能的理解還是有限的。在與上皮細(xì)胞連接相關(guān)的許多蛋白中，已經(jīng)鑒定了一些種類的跨上皮膜蛋白，其可能在上皮細(xì)胞連接的生理調(diào)控中起作用。這些包括許多"連接黏附分子"(JAMs)和叫作閉合蛋白、密蛋白和連蛋白的其它TJ-相關(guān)的分子。JAMs、閉合蛋白、和密蛋白延伸到旁細(xì)胞空間，并且特別預(yù)測(cè)這些蛋白是形成相鄰上皮細(xì)胞之間的上皮屏障和通過(guò)上皮細(xì)胞層的通道的候選物。在一種模型中，提議閉合蛋白、密蛋白和JAM作為嗜同性結(jié)合配偶體相互作用，以在上皮細(xì)胞之間產(chǎn)生水、溶質(zhì)和免疫細(xì)胞的旁細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)控的屏障。在藥物遞送的情形中，藥物不受遞送-增強(qiáng)劑的幫助而透過(guò)黏膜表面的上皮細(xì)胞層的能力似乎與許多因素有關(guān)，包括分子大小、脂溶性、和離子化。通常，低于約300-1,000道爾頓的小分子經(jīng)常能夠透過(guò)黏膜屏障，然而，隨著分子大小增加，滲透性快速減小。由于這些原因，黏膜藥物施用典型地比注射施用需要更大量的藥物。其它治療化合物，包括大分子藥物，通常很難通過(guò)黏膜遞送。除了低的內(nèi)在滲透性之外，大的大分子藥物通常經(jīng)受有限的擴(kuò)散，以及內(nèi)腔和細(xì)胞酶促降解和在黏膜位點(diǎn)的快速清除。因此，為了以治療有效量遞送這些更大的分子，需要細(xì)胞透性增強(qiáng)劑來(lái)幫助它們穿過(guò)這些黏膜表面，并且進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)，在那里它們可以迅速地在目標(biāo)組織上作用。黏膜組織為大分子的自由擴(kuò)散提供基本的屏障，而在黏膜分泌物中存在的酶促活性可以嚴(yán)重地限制治療劑，特別是肽和蛋白的生物利用度。在某些黏膜位點(diǎn)，諸如鼻黏膜，由于快速的粘液纖毛清除，遞送的蛋白和其它大分子種類的典型的停留時(shí)間有限，例如，約15-30分鐘或更少。在本領(lǐng)域內(nèi)對(duì)藥物制劑和施用治療化合物的方法存在長(zhǎng)久的和尚未滿足的需求，其中所述治療化合物提供增強(qiáng)的黏膜遞送，包括被靶向的組織和生理區(qū)室如在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。更具體地，在本領(lǐng)域中，對(duì)于黏膜遞送用于在哺乳動(dòng)物受試者中治療疾病和其它不利病況的治療化合物的安全和可靠的方法與組合物存在需求。對(duì)于通過(guò)一種或多種黏膜途徑提供治療量的大分子藥物的有效遞送的方法和組合物存在相關(guān)的需求，所述方法和組合物作用快速，易于實(shí)施，并且具有有限的不利副作用如黏膜刺激或組織損傷。在本領(lǐng)域中，還對(duì)于增強(qiáng)克服黏膜上皮細(xì)胞屏障機(jī)制的生物治療化合物的黏膜遞送的方法和組合物存在需求。在此之前，黏膜上皮細(xì)胞的選擇滲透性被描述為治療性大分子，包括生物活性肽和蛋白的黏膜遞送的主要障礙。因此，在本領(lǐng)域中，對(duì)于促進(jìn)生物治療化合物黏膜遞送的新方法和工具存在尚未滿足的需求。特別地，在本領(lǐng)域中，對(duì)促進(jìn)此前證明很難通過(guò)黏膜屏障遞送的生物治療化合物的黏膜遞送的新方法和制劑存在需求。附圖簡(jiǎn)述圖1圖示PN159對(duì)PTHw4滲透的影響，其使用具有其它增強(qiáng)劑(Me-(3-CD，DDPC,EDTA)的PN159。圖2圖示PN159對(duì)PTHt.34滲透的影響，其使用無(wú)其它增強(qiáng)劑的PN159。實(shí)施例B:體內(nèi)毒性將化合物在吐溫/水的混合物中配制，通過(guò)靜脈內(nèi)(i.v.)途徑給藥(以每周一次的頻率給藥超過(guò)3周，注射的體積為每棵鼠0.2ml，化合物的劑量逐漸增加6.25、12.5、25和50mg/kg)于體重約為20g的棵鼠(bab/c，由IffaCredo提供)。最大耐受量(MTD)為既不引起死亡也不使得體重減少超過(guò)20%的最大劑量。例如，實(shí)施例2化合物的MTD為5mg/kg(靜脈內(nèi)給藥3周，每周一次)，或者，采用HCT116對(duì)其進(jìn)行的體內(nèi)活性研究表明，該化合物較其"非-酯化"的相近結(jié)構(gòu)同系物(制備2化合物)毒性低2倍。實(shí)施例C:藥用組合物制備1000片片劑，每一片含有10mg活性成分實(shí)施例2化合物...........................................................................................10g羥丙基纖維素...............................................................................................2g小麥淀粉.......................................................................................................10g乳糖.............................................................................................................謂g硬脂酸鎂......................................................................................................3g滑石粉...........................................................................................................3g。試者中可逆地增強(qiáng)生物活性劑的黏膜上皮轉(zhuǎn)運(yùn)。優(yōu)選地，緊密連接調(diào)控成分包含由2-500個(gè)氨基酸殘基、或2-100個(gè)氨基酸殘基、或2-50個(gè)氨基酸殘基組成的肽或蛋白部分。緊密連接調(diào)控肽或蛋白可以是單體或寡聚體，例如，二聚體。緊密連接調(diào)控肽可以通過(guò)與適當(dāng)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的技術(shù)一致的重組或化學(xué)合成方式生產(chǎn)。先前已經(jīng)描述過(guò)能夠調(diào)控上皮細(xì)胞緊密連接功能的肽(Johnson,P.H.和S.C.Quay,五義/^W.0//".i>Mg_De//v.(關(guān)于藥物遞送的專家觀點(diǎn))2:281-98,2000)。特別地，表明一種新穎的緊密連接調(diào)控(TJM)肽，PN159，減少穿過(guò)組織屏障的跨上皮電阻(TER)，并且增加具有低細(xì)胞毒性和細(xì)胞生存能力高保持性的3,000DaMW葡聚糖的旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述TJMP選自由下列各項(xiàng)組成的組NH2-KLALKLALKALKAALKLA-酰胺NH2-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-酰胺NH2-LLETLLKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHRR-酰胺NH2-AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQ-酰胺NH2-RKKRRQRRRPPQCAAVALLPAVLLALLAP-酰胺NH2-RQIKIWFQNRRMKWKK-酰胺NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺NH2-KLWSAWPSLWSSLWKP-酰胺NH2畫RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG隱酰胺馬來(lái)酰亞胺-GLGSLLKKAGKKLKQPKSKRKV-酰胺NH2-KETWWETWWTEWSQPGRKKRRQRRRRPPQ-酰胺。在本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述TJMP選自由下列各項(xiàng)組成的組CNGRCGGKKKLKLLLKLLLRKLRKRLLRLRKLRKRLLRo在一個(gè)方面中，本發(fā)明描述適于跨黏膜遞送的治療性小分子、肽和蛋白的制劑，其中通過(guò)緊密連接調(diào)控肽的存在而促進(jìn)跨黏膜遞送，其中所述肽與水溶性聚合物綴合。優(yōu)選地，所述水溶性聚合物是選自由下列各項(xiàng)組成的組的聚環(huán)氧垸a-取代的聚環(huán)氧垸衍生物，烷基-封端的聚環(huán)氧乙烷，雙-聚環(huán)氧乙烷，聚(原酸酯)如聚(乳-共-乙交酯)及其衍生物，聚乙二醇(PEG)均聚物及其衍生物，聚丙二醇均聚物及其衍生物，聚(環(huán)氧烷)的共聚物，以及聚(環(huán)氧烷)的嵌段共聚物或其活化的衍生物。優(yōu)選地，所述聚環(huán)氧垸具有約200到約50,000的分子量。更優(yōu)選地，所述聚環(huán)氧烷具有約200到約20,000的分子量。特別優(yōu)選的聚環(huán)氧烷是聚乙二醇和聚環(huán)氧乙烷。TJMP可以與多于一條的水溶性鏈綴合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚(環(huán)氧烷)鏈?zhǔn)蔷垡叶?PEG)鏈，其可以具有約0.2和約200千道爾頓(kDa)的分子大小。水溶性聚合物可以通過(guò)間隔臂與緊密連接調(diào)控肽綴合。這種連接可以是可逆的。所述水溶性聚合物可以是線性的或可以是有支鏈的。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽與單一聚(環(huán)氧烷)鏈共價(jià)連接。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，聚(環(huán)氧垸)具有低于2.00或低于1.20的多分散性值(Mw/Mn)。所述聚(環(huán)氧烷)鏈可以是有支鏈的或沒(méi)有支鏈的。與水溶性聚合物諸如聚(乙二醇)(PEG)及PEG的衍生物綴合已經(jīng)用作提高蛋白特別是注射劑型的半衰期的策略(Caliceti,P.和F.M.Veronese,A/v.Z>wg￡>e//v.Zev.6^級(jí)藥激遞送祭述J55:1261-77,2003)。用聚合物如PEG修飾肽和蛋白的其它潛在的益處包括化學(xué)(Diwan,M.和T.G.Park,/"f./P/zar附.0^,藥學(xué)染,志>>252:111-22,2003)和生化穩(wěn)定性(Na,D.H.,等,乂Sc/.f秀學(xué)裨學(xué)染志J妙256-61，2004)以及免疫原性的減少(Yang，Z.，等，Ca"cerOi"i^^究J":6673-78，2004)。綴合到蛋白上的PEG應(yīng)用的最常見(jiàn)實(shí)例是在所述PEG鏈具有足夠長(zhǎng)的分子量以賦予上述作用的情形中。特別地，已經(jīng)描述需要至少20kDaMW的PEG。例如，Holtsberg等(Holtsberg，F(xiàn).W.，等，JCoWra/ie/.G^釋染孟J肌259-71,2002)表明，對(duì)于與PEG綴合的蛋白精氨酸脫亞氨酶(deiminase)，當(dāng)PEG為20kDa或更大時(shí)，在小鼠中靜脈內(nèi)施用時(shí)制劑的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥效特性增加。當(dāng)PEGMW低于20kDa時(shí)，幾乎沒(méi)有效果。在另一個(gè)實(shí)例中，在大鼠中，對(duì)肽鮭魚降鈣素的單-PEG化導(dǎo)致提高的鼻內(nèi)生物利用度，所述提高與PEG分子量(MW)成反比(Lee,K.C.，等，Cfl/"/7!w"e/"/.6^^0"眾資織^73:545-9，2003，禾CIShin，B.S.，等，C7zew.P/wr附.5w〃.f7bAyo)f眾學(xué)^7^"學(xué)公告(T東^""52:957-60,2004)，其通過(guò)引用完全結(jié)合于此。一些優(yōu)選的聚(環(huán)氧烷)選擇由下列各項(xiàng)組成的組OC-取代的聚(環(huán)氧烷)衍生物，聚(乙二醇)(PEG)均聚物及其衍生物，聚(丙二醇)(PPG)均聚物及其衍生物，聚(環(huán)氧乙烷)(PEO)聚合物及其衍生物，雙-聚(環(huán)氧乙烷)及其衍生物，聚(環(huán)氧烷)的共聚物，和聚(環(huán)氧垸)的嵌段共聚物，聚(丙交酯-共-乙交酯)及其衍生物，或它們的活化衍生物。所述水溶性聚合物可以具有約200到約40000Da，優(yōu)選地約200到約20000Da，或約200到10000Da，或約200到5000Da的分子量。通常，緊密連接調(diào)控肽和PEG或其它水溶性聚合物之間的綴合物可以抵抗生理作用，包括蛋白質(zhì)水解、酶作用或水解。備選地，所述綴合物可以通過(guò)生物降解作用，例如前體-藥物途徑而裂解。優(yōu)選地，所述分子與單一聚(環(huán)氧烷)鏈共價(jià)連接，所述聚(環(huán)氧垸)鏈可以無(wú)支鏈或有支鏈。綴合的方法通常是普通技術(shù)人員所知的，例如，美國(guó)專利號(hào)5,595,732;美國(guó)專利號(hào)5,766,897;美國(guó)專利號(hào)5,985,265;美國(guó)專利號(hào)6,528,485;美國(guó)專利號(hào)6,586,398;美國(guó)專利號(hào)6,869,932;和美國(guó)專利號(hào)6,706,289。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，TJMP減小穿過(guò)黏膜組織屏障的電阻。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，電阻的減少為應(yīng)用滲透增強(qiáng)劑前的電阻的至少80%。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，TJMP增加分子穿過(guò)黏膜組織屏障的滲透性，優(yōu)選地至少兩倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述增加的滲透性是旁細(xì)胞的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所增加的滲透性由緊密連接的修飾而導(dǎo)致。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，所增加的滲透性是跨細(xì)胞的，或者是跨細(xì)胞和旁細(xì)胞的結(jié)合。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，黏膜組織層包括上皮細(xì)胞層。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞選自由氣管細(xì)胞，支氣管細(xì)胞，肺泡細(xì)胞，鼻細(xì)胞，肺細(xì)胞,胃腸細(xì)胞，表皮細(xì)胞或口腔細(xì)胞組成的組，優(yōu)選鼻細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，活性試劑是肽或蛋白。所述肽或蛋白可以具有2-1000個(gè)氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽或蛋白包括2-50個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽或蛋白是環(huán)形的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽或蛋白通過(guò)物理或化學(xué)鍵合形成二聚體或更高級(jí)的寡聚體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽或蛋白選自由GLP-l,PYY3.36,PTHw4和胰高血糖素樣肽的抑制劑-4組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物活性劑是蛋白，優(yōu)選地選自由j3-干擾素、a-干擾素、胰島素、促紅細(xì)胞生成素、G-CSF、和GM-CSF、生長(zhǎng)激素、以及它們的任一種的類似物組成的組。本發(fā)明的滲透性肽包括PN529，其包含序列WEAALAEALAEALAEHLASQPKSKRKV(SEQIDNO57)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是將分子施用給動(dòng)物的方法，其包括制備任何上述制劑，并且使得所述制劑與所述動(dòng)物的黏膜表面接觸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述黏膜表面是鼻內(nèi)的。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含任一種上述制劑的劑型，其中所述劑型是液體，優(yōu)選的是小滴形式。備選地，所述劑型還可以是固體，在施用之前在液體中重構(gòu)，作為散劑施用，或者以膠囊、片劑或凝膠形式。本發(fā)明的另一個(gè)方面是在哺乳動(dòng)物受試者中可逆地增強(qiáng)生物試劑的黏膜上皮轉(zhuǎn)運(yùn)的分子，其具有緊密連接調(diào)控成分肽(TJMP)，TJMP類似物，TJMP或TJMP類似物的綴合物，或其復(fù)合物。本發(fā)明的滲透性肽包括PN159，其具有序列NH2-KLALKLALKALKAALKLA-酰胺。本發(fā)明中包含的是本文公開的PN159的類似物，這些類似物的組合，和PN159的任何衍生物，變體，片段，模擬體或融合分子。所述滲透性試劑可逆增加黏膜上皮旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，其典型地通過(guò)在受試者中黏膜上皮表面調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)和/或生理性而增加。這一作用典型地包括通過(guò)滲透性試劑而抑制相鄰上皮細(xì)胞的上皮膜黏附蛋白之間的同型或異型結(jié)合。用于這種同型或異型結(jié)合阻滯的靶點(diǎn)蛋白可以選自各種相關(guān)的連接黏附分子(JAMs)、閉合蛋白或密蛋白。上皮細(xì)胞生物學(xué)己經(jīng)克隆編碼鼠連接黏附分子-l(JAM-l)的cDNA，并且其對(duì)應(yīng)一種預(yù)測(cè)的I型跨膜蛋白(包含單一跨膜結(jié)構(gòu)域)，具有約32-kD的分子量(Williams,等，Mo/ec"/ar/mw""o/ogyf分^^度學(xué)J36:1175-1188，1999;Gupta，等，/t/BM5h/e(7L^M5主命"0:51-56,2000;Ozaki,等，J/wmw"o/.f免i^學(xué)染,若JM3:553-557，1999;Martin-Padura,等，JCW/,Ao/.f潘應(yīng)生激學(xué)染UW2:117-127,1998)。所述分子的細(xì)胞外片段包含兩個(gè)Ig-樣結(jié)構(gòu)域，其被描述為氨基端"VH-型"和羧基端"C2-型"羧基端p-夾心折疊(Bazzoni等，M/crac&cw/加'o"f錄凝萃J&143-152,2001)。鼠JAM-1還包含兩個(gè)用于N-糖基化的位點(diǎn)，和一個(gè)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。JAM-1蛋白是免疫球蛋白(Ig)超家族的一員，并且位于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接處。超級(jí)結(jié)構(gòu)研究表明JAM-1被限制在包含閉合蛋白和密蛋白的原纖維(fibrils)的膜區(qū)域。另一個(gè)JAM家族成員，叫作"血管內(nèi)皮細(xì)胞連接-相關(guān)分子"(VE-JAM)，包含兩個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，和一個(gè)相對(duì)短的細(xì)胞質(zhì)尾部。VE-JAM主要位于內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)邊界(Palmeri，等，所o/.f主激眾學(xué)雜,^^275:19139-19145,2000)。VE-JAM由小靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá)，并且還由其它血管的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。另一個(gè)報(bào)道的JAM家族成員，JMA-3，具有預(yù)測(cè)的氨基酸序列，其分別與JAM-2和JAM-1表現(xiàn)出36%和32%的相同性。JAM-3表現(xiàn)出廣泛的組織表達(dá)性，在腎、腦和胎盤中有明顯更高的水平。在細(xì)胞水平上，JAM-3轉(zhuǎn)錄物在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。己經(jīng)報(bào)道JAM-3和JAM-2為結(jié)合配偶體。特別地，報(bào)道JAM-3胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合JAM2-Fc。JAM-3蛋白在激活之后在外周血淋巴細(xì)胞上上調(diào)。(PiaArrate，等，B/o/.C&m.f主激化學(xué)染力，:45826-45832,2001)。另一種提議的參與上皮細(xì)胞緊密連接調(diào)控的跨膜黏附蛋白是閉合蛋白。閉合蛋白是一種約65-kD的II型跨膜蛋白，其由4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、2個(gè)胞外環(huán)和一個(gè)大的C-端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成(Furuse,等，/Ce//.5z'o/.(^應(yīng)主欽學(xué)染U725:1777-1788(1993);Furuse,等，《/CW/.說(shuō)o/.f激應(yīng)f激學(xué)雜U727:1617-1626，1994)。當(dāng)通過(guò)免疫-冷凍斷裂電鏡(immuno-freezefractureelectronmicroscopy)觀察時(shí)，閉合蛋白直接集中在緊密連接原纖維內(nèi)(Fujimoto,J.CW/(細(xì)胞科學(xué)雜志)108:3443-3449,1995)。另外兩種緊密連接整合膜蛋白，崈蛋白-l和密蛋白-2，通過(guò)從雞肝直接生化分級(jí)分離富連接的膜而鑒定(Fiiruse，等，J！Ce//.所o/.C欲虜主激學(xué)染U/W:1539-1550,1998)。發(fā)現(xiàn)密蛋白-1和密蛋白-2與閉合蛋白共同純化，作為十二垸基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上的一條大約22-kD的寬凝膠條帶。從小鼠cDNA文庫(kù)克隆的兩個(gè)非常相關(guān)的蛋白的推定的序列預(yù).測(cè)有4個(gè)跨膜螺旋，2個(gè)短的細(xì)胞外環(huán)，和短的細(xì)胞質(zhì)N-和C-端。盡管與閉合蛋白拓?fù)湎嗨?，它們不享有序列同源性。后?lái)，已經(jīng)克隆了6個(gè)其它密蛋白基因產(chǎn)物(密蛋白-3到密蛋白-8)，并且表明位于緊密連接原纖維內(nèi)，如通過(guò)免疫金冷凍斷裂標(biāo)記所確定的那樣(Morita,等,Prac.WW/.^c^/.t/Wf夷房辟學(xué)綜學(xué)叛J敗511-516，1999)。假定在不存在閉合蛋白時(shí)保持屏障，那么密蛋白-1到密蛋白-8被視為細(xì)胞外空間的主要密封-形成元件的候選物。位于上皮細(xì)胞連接處的其它細(xì)胞質(zhì)蛋白包括連蛋白、偶對(duì)蛋白(symplekin)、帶蛋白、和7H6。連蛋白報(bào)道為與閉合蛋白的細(xì)胞質(zhì)尾部結(jié)合的細(xì)胞質(zhì)蛋白。代表這一蛋白家族的是"ZO-l，ZO-2，和ZO-3"。推定連蛋白是亞洲霍亂弧菌(ra^oc/zo/erae)來(lái)源的緊密連接毒素(ZOT)的人蛋白類似物。連蛋白可能在發(fā)育、生理和病理學(xué)過(guò)程一一包括組織形態(tài)發(fā)生，流體、大分子和白細(xì)胞在腸腔和間質(zhì)之間的運(yùn)動(dòng)，和炎性/自體免疫紊亂過(guò)程中的緊密連接調(diào)控中起作用(參見(jiàn)，例如，Wang,等，/Ce//.C智^^辨學(xué)J^"J)7":4435-40，2000;Fasano,等，￡a"cef^^/7/"刀J355:1518-9,2000;Fasano，X朋.7V.K^cadSc/.，f紐藥辨學(xué)綜牟T^975:214-222，2000)。在腹腔疾病的急性階段，連蛋白表達(dá)在腸組織中增加，所述腹腔疾病是緊密連接打開并且滲透性增加的一種臨床病況。在體外非人靈長(zhǎng)類腸上皮細(xì)胞中，連蛋白誘導(dǎo)緊密連接解體，和隨后的腸滲透性增加。在活性亞洲霍亂弧菌(Kc/w/wm)ZOT片段和人連蛋白中的氨基酸比較鑒定了在這兩種蛋白N端區(qū)域內(nèi)的推定的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。ZOT生物活性結(jié)構(gòu)域增加腸滲透性，這通過(guò)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞受體相互作用，隨后激活胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致胞內(nèi)緊密連接解體而進(jìn)行。所述ZOT生物活性結(jié)構(gòu)域向所述蛋白的羧基端定位，并且與由亞洲霍亂弧菌產(chǎn)生的預(yù)測(cè)的裂解產(chǎn)物一致。這一結(jié)構(gòu)域與連蛋白，ZOT哺乳動(dòng)物類似物，共享有推定的受體-結(jié)合基序。在ZOT活性片段和連蛋白之間的氨基酸比較，與基因定點(diǎn)誘變實(shí)驗(yàn)結(jié)合，表明對(duì)著加工的ZOT的氨基端和連蛋白的氨基端的八肽受體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。(DiPierro,等，/Ao/.ff激眾學(xué)染,吝J276:19160-19165，2001)。報(bào)道Z0-1結(jié)合肌動(dòng)蛋白、AF-6、ZO-相關(guān)激酶(ZAK)、胞襯蛋白，和a-聯(lián)蛋白。用于本發(fā)明的滲透性肽包括天然的或合成的、治療或預(yù)防活性的肽(包括兩個(gè)或多個(gè)共價(jià)連接的氨基酸)、蛋白、肽或蛋白片段、肽或蛋白類似物、肽或蛋白模擬物、以及活性肽或蛋白的化學(xué)修飾衍生物或鹽。因此，當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"滲透性肽"通常意欲包括所有這些活性種類，即，肽和蛋白、肽和蛋白片段、肽和蛋白類似物、肽和蛋白模擬物、以及活性肽或蛋白的化學(xué)修飾衍生物和鹽。通常，滲透性肽或蛋白是易于通過(guò)部分取代、添加或刪除天然存在的或天然的(例如，野生型、天然存在的突變體、或等位基因變體)肽或蛋白序列內(nèi)的氨基酸而獲得的突變蛋白。另外，包括天然肽或蛋白的生物活性片段。所述突變的衍生物和片段基本上保持天然肽或蛋白的需要的生物活性。在具有碳水化合物鏈的肽或蛋白的情形中，通過(guò)在這些碳水化合物種類中的改變而標(biāo)記的生物活性變體也包括在本發(fā)明內(nèi)。用于本發(fā)明的方法和組合物的滲透性肽、蛋白、類似物和模擬物通常配制在藥物組合物中，所述藥物組合物包含黏膜遞送-增強(qiáng)或滲透有效量的滲透性肽、蛋白、類似物或模擬物，其通過(guò)在哺乳動(dòng)物受試者中調(diào)控上皮細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)和/或生理學(xué)而可逆地增強(qiáng)黏膜上皮旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。生物活性劑本發(fā)明的方法和組合物針對(duì)增加廣譜生物活性劑的黏膜如鼻內(nèi)遞送，以在哺乳動(dòng)物受試者中獲得治療、預(yù)防或其它理想的生理結(jié)果。當(dāng)用于本申請(qǐng)時(shí)，術(shù)語(yǔ)"生物活性劑"包括當(dāng)按照本文的方法和組合物黏膜施用給哺乳動(dòng)物受試者時(shí)產(chǎn)生生理反應(yīng)的任何物質(zhì)。在這種情形中，有用的生物活性劑包括在臨床醫(yī)學(xué)的所有主要領(lǐng)域應(yīng)用的治療或預(yù)防試劑，以及營(yíng)養(yǎng)物、輔因子、酶(內(nèi)源的或外源的)、抗氧化劑等等。因此，所述生物活性劑可以是水溶性的或水不溶性的，并且可以包括更高分子量的蛋白、肽、碳水化合物、糖蛋白、脂質(zhì)和/或糖脂、核苷、多核苷酸和其它活性劑。在本發(fā)明的方法和組合物中有用的藥劑包括含有廣譜化合物的藥物和大分子治療或預(yù)防劑，其包括小分子藥物，肽，蛋白和疫苗試劑。用于本發(fā)明的代表性藥劑是生物活性的，用于治療或預(yù)防受試者中選擇的疾病或病況。在這種情形中，生物活性可以確定為關(guān)于生理參數(shù)、標(biāo)記或與受試者疾病或病況相關(guān)的臨床癥狀的任何顯著的(即，可檢測(cè)的，令人滿意地顯著)作用，其通過(guò)適當(dāng)?shù)捏w外或體內(nèi)檢測(cè)系統(tǒng)包括實(shí)際患者、細(xì)胞培養(yǎng)、樣品檢測(cè)或可接受的動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)估。本發(fā)明的方法和組合物為治療哺乳動(dòng)物受試者中的疾病和其它病況提供出乎意料的益處，例如，所述益處通過(guò)提供治療和預(yù)防化合物黏膜遞送的提高的速率、持續(xù)時(shí)間、保真性或控制而調(diào)控，以到達(dá)受試者中選擇的生理區(qū)室(例如，進(jìn)入或穿過(guò)鼻黏膜，進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，或者到達(dá)受試者內(nèi)任何選擇的靶點(diǎn)器官、組織、流體或細(xì)胞或細(xì)胞外區(qū)室)。在各種代表性實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可以結(jié)合選自下列各項(xiàng)的一種或多種生物活性劑阿片樣物質(zhì)(opiods)或阿片樣物質(zhì)拮抗劑，諸如嗎啡，氫嗎啡酮，羥嗎啡酮，洛伐啡諾(lovorphanol)，左洛啡烷，可待因，納美芬，烯丙嗎啡,納洛酮(nalozone),納曲酮，丁丙諾啡，布托啡諾，和納布啡(nalbufine);皮質(zhì)酮，諸如可的松，氫化可的松，氟氫可的松，潑尼松，潑尼松龍,甲潑尼龍，曲安西龍，地塞米松(dexamethoasone),倍他米松(betamethoasone),巾白拉米松(paramethosone)，禾口氟輕松；其它抗炎藥，諸如秋水仙堿，布洛芬，吲哚美辛，和吡羅昔康；抗病毒劑諸如阿昔洛韋，利巴韋林(ribavarin),三氟胸苷(trifluorothyridine),Am-A(阿糖呋喃糖腺嘌呤)，?；B苷，去甲脫氧鳥嘌呤核苷(nordeoxyguanosine),疊氮胸苷，二脫氧腺苷，和二脫氧胞苷；抗雄激素藥如螺內(nèi)酯；雄激素，如睪酮；雌激素，如雌二醇；黃體酮；肌肉松弛劑，如罌粟堿；血管舒張藥，如硝酸甘油，血管活性腸肽和降鈣素相關(guān)的基因肽；抗組胺劑，如賽庚啶；具有組胺受體位點(diǎn)阻滯活性的試劑，如多塞平，丙米嗪，和西咪替丁;止咳藥，如右美沙芬；精神安定藥如氯氮平片劑；抗心律失常藥；抗癲癇藥；酶，諸如過(guò)氧化物歧化酶和神經(jīng)腦啡肽酶(neuroenkephalinase);抗真菌劑，諸如兩性霉素B，灰黃霉素，咪康唑，酮康唑，噻康唑，伊曲康唑，和氟康唑；抗細(xì)菌劑，諸如青霉素，頭孢菌素，四環(huán)素，氨基糖苷，紅霉素(erythromicin),慶大霉素，多粘菌素B;抗癌劑，諸如5-氟尿嘧啶，博來(lái)霉素，甲氨喋呤，和羥基脲，二脫氧肌苷，氟尿苷，6-巰基嘌呤，多柔比星，柔紅霉素，伊達(dá)比星(I-darubicin),泰素和紫杉醇；抗氧化劑，諸如維生素E,類視色素，類胡蘿卜素，輔酶Q,金屬鰲合劑，和植酸；抗心律失常藥，諸如奎尼??；和抗高血壓藥如哌唑嗪，維拉帕米，硝苯地平，和地爾硫萆；鎮(zhèn)痛藥如對(duì)乙酰氨基酚和阿司匹林；單克隆和多克隆抗體，包括人源化抗體及抗體片段；反義寡核苷酸；和RNA,DNA和包含編碼治療肽和蛋白的基因的病毒載體。除了這些代表性的活性劑種類和類別，本發(fā)明的方法和組合物包括上文或本文其它地方所述或本領(lǐng)域另外所知的任何生理活性劑，以及任何多種活性劑的組合，其在本發(fā)明的方法和組合物中單獨(dú)或組合有效用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物受試者中所選的疾病或病況(參見(jiàn)，戶/7;wWam'Z)eW/^/e^wcef度^^Jr參考J,由利通工業(yè)有限公司(LittonIndustries,Inc)的分公司醫(yī)學(xué)經(jīng)濟(jì)學(xué)公司(MedicalEconomicsCompany)出版)。不管所用的化合物的種類，用于本發(fā)明的生物活性劑應(yīng)該以充分的量存在于本發(fā)明的組合物和方法中，所述量足以為受試者提供需要的生理作用，而沒(méi)有顯著的、不可接受的毒性或其它不利的副作用。熟練的技術(shù)人員應(yīng)該容易確定所有生物活性劑的適當(dāng)?shù)膭┝克剑鵁o(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)。由于本發(fā)明的方法和組合物提供提高的生物活性劑的遞送，所以可以成功地應(yīng)用顯著低于常規(guī)劑量水平的劑量水平。一般地，所述活性物質(zhì)將以總鼻內(nèi)制劑的約0.01重量％到約50重量％、通常約0.1重量％—約20重量％、并且一般約1.0重量％—5重量％或10重量％的量存在于組合物中，這取決于所用的具體的物質(zhì)。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)生物活性"肽"和"蛋白"包括各種大小的多肽，并且不將本發(fā)明限于任何具體大小的氨基酸聚合物。本發(fā)明包括從小至長(zhǎng)度為幾個(gè)氨基酸的肽，到任何大小的蛋白，以及肽一肽、蛋白一蛋白融合體和蛋白一肽融合體，只要所述蛋白或肽在激發(fā)特別的生理、免疫、治療或預(yù)防性作用或反應(yīng)的情形中是有生物活性的。本發(fā)明提供用于提高生物活性肽和蛋白的黏膜遞送的新穎的制劑和協(xié)同的施用方法。用于本發(fā)明的治療肽和蛋白的代表性實(shí)例包括，但不限于組織血纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF),成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-酸性或堿性)，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-a或(3),血管活性腸肽，腫瘤壞死因子(TNF),下丘腦釋放因子，促乳素，促甲狀腺激素(TSH),促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH),甲狀旁腺激素(PTH)，促卵泡激素(FSF),促性腺激素釋放激素(LHRH),內(nèi)啡肽，胰高血糖素，降鈣素，催產(chǎn)素，卡貝縮宮素，aldoetecone,腦啡肽(enkaphalins)，somatostin,生長(zhǎng)激素，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，促性腺激素，雌激素，孕酮，睪酮，a-促黑激素，非天然存在的阿片樣物質(zhì)，利多卡因，酮洛芬，舒芬太尼，特布他林，氟哌利多，東莨菪堿，戈那瑞林，環(huán)吡酮，丁螺環(huán)酮,降鈣素，色甘酸二鈉或咪達(dá)唑侖，環(huán)孢素，賴諾普利，卡托普利，地拉普利，西咪替丁，雷尼替丁，法莫替丁，過(guò)氧化物歧化酶，天冬酰胺酶，精氨酸酶，精氨酸脫氨酶，腺苷脫氨酶核糖核酸酶，胰蛋白酶，化學(xué)胰蛋白酶(chemotrypsin)，和木瓜蛋白酶。其它有用的肽的實(shí)例包括，但不限于，鈴蟾肽,P物質(zhì)，血管升壓素，a-球蛋白，運(yùn)鐵蛋白，凝血因子I，(3-脂蛋白，(3-球蛋白，凝血因子II，血漿銅藍(lán)蛋白，(X2-糖蛋白，OC2-球蛋白，胎球蛋白，OCr脂蛋白，Od-球蛋白，白蛋白，前白蛋白，以及其他生物活性蛋白和重組蛋白產(chǎn)物。在本發(fā)明更詳細(xì)的方面中，提供用于提高特別的、生物活性肽或蛋白治療劑的黏膜遞送的方法和組合物，以治療現(xiàn)存的疾病或病況(即，消除、或者減少其發(fā)生或癥狀的嚴(yán)重性)，或者在鑒定為處于所述疾病或病況的危險(xiǎn)中的受試者中預(yù)防疾病或病況的發(fā)作。用于本發(fā)明這些方面的生物活性肽和蛋白包括，但不限于，造血藥；抗感染藥；抗癡呆藥(antidememia);抗病毒劑；抗腫瘤藥；退熱藥；鎮(zhèn)痛藥；消炎藥；抗?jié)兯?；抗過(guò)敏劑；抗抑郁藥；治療精神病的藥；強(qiáng)心劑；抗心律失常藥；血管舒張劑；抗高血壓藥如降血壓藥利尿劑；抗糖尿病藥；抗凝血?jiǎng)?；降膽固醇藥；用于骨質(zhì)疏松癥的治療劑；激素；抗生素；疫苗；等。用于本發(fā)明這些方面的生物活性肽和蛋白包括，但不限于，細(xì)胞因子；肽激素；生長(zhǎng)因子；作用在心血管系統(tǒng)上的因子；細(xì)胞黏附因子；作用在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)上的因子；作用在體液電解質(zhì)和血液有機(jī)物質(zhì)上的因子；作用在骨和骨骼生長(zhǎng)或生理上的因子；作用在胃腸系統(tǒng)上的因子；作用在腎和泌尿器官上的因子；作用在結(jié)締組織和皮膚上的因子；作用在感覺(jué)器官上的因子；作用在免疫系統(tǒng)上的因子；作用在呼吸系統(tǒng)上的因子;作用在生殖器官上的因子；和各種酶類。例如，可以在本發(fā)明的方法和組合物內(nèi)施用的激素包括雄激素、雌激素、前列腺素、生長(zhǎng)激素、促性腺激素、白介素、類固醇和細(xì)胞因子?？梢栽诒景l(fā)明的方法和組合物內(nèi)施用的疫苗包括細(xì)菌和病毒疫苗，諸如用于肝炎、流感、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、結(jié)核病、金絲雀痘(canarypox)、水痘(chickenpox)、麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、肺炎、和人類免疫缺陷性病毒(fflV)的疫苗?？梢栽诒景l(fā)明的方法和組合物內(nèi)施用的細(xì)菌類毒素包括白喉、破傷風(fēng)、作i單胞菌(pseudonomas)禾卩結(jié)核分枝桿菌(mycobactriumtuberculosis)。用于本發(fā)明的特別的心血管或溶血栓試劑的實(shí)例包括水蛭素(hirugen),hirulos禾卩蛭素(hirudine)。用本發(fā)明有效施用的抗體試劑包括單克隆抗體、多克隆抗體、人源化抗體、抗體片段、融合體和多聚體、以及免疫球蛋白。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"保守氨基酸取代"是指具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的普通互換性。例如，通?？苫Q的具有脂族側(cè)鏈的氨基酸組為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂族—羥基側(cè)鏈的氨基酸組為絲氨酸和蘇氨酸；具有含有酰胺的側(cè)鏈的氨基酸組為天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族側(cè)鏈的氨基酸組為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸組為賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和具有含有硫的側(cè)鏈的氨基酸組為半胱氨酸和甲硫氨酸。保守取代的實(shí)例包括非極性(疏水性)殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸彼此之間的取代。同樣地，本發(fā)明考慮極性(親水性)殘基的取代，諸如精氨酸和賴氨酸之間的取代，谷氨酰胺和天冬酰胺之間的取代，以及蘇氨酸和絲氨酸之間的取代。另外，還考慮堿性殘基如賴氨酸、精氨酸或組氨酸彼此之間的取代或者酸性殘基如天冬氨酸或谷氨酸彼此之間的取代。代表性的保守氨基酸取代組為纈氨酸一亮氨酸一異亮氨酸，苯丙氨酸一酪氨酸，賴氨酸一精氨酸，丙氨酸一纈氨酸，和天冬酰胺一谷氨酰胺。術(shù)語(yǔ)生物活性肽或蛋白類似物還包括天然肽或蛋白的修飾的形式，包括20種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如，D—氨基酸)，或非天然的氨基酸，如cx,a-雙取代的氨基酸、N—垸基氨基酸、乳酸。這些和其它非常規(guī)氨基酸還可以取代或插入到本發(fā)明所用的天然肽和蛋白內(nèi)。非常規(guī)氨基酸的實(shí)例包括4-羥基脯氨酸,Y-羧基谷氨酸,e-N,N,N-三甲基賴氨酸,s-N-乙?；嚢彼幔琌-磷酸絲氨酸，N-乙酰基絲氨酸，N-甲酰甲硫氨酸，3-甲基組氨酸,5-羥基賴氨酸,co-N-甲基精氨酸，以及其它的類似氨基酸和亞氨基酸(例如，4-羥基脯氨酸)。另外，生物活性肽或蛋白類似物包括碳水化合物、脂質(zhì)和/或蛋白質(zhì)性部分的單一或多取代、刪除和/或加入，所述碳水化合物、脂質(zhì)和/或蛋白質(zhì)性部分作為所述肽或蛋白的結(jié)構(gòu)成分天然存在或人工存在，或者與所述肽或蛋白結(jié)合或另外締合。在一個(gè)方面中，通過(guò)用其它側(cè)鏈取代20種遺傳編碼的氨基酸(或D氨基酸)的一個(gè)或多個(gè)天然存在的側(cè)鏈而修飾用于本發(fā)明的肽(包括多肽)，例如，用諸如烷基、低級(jí)垸基、環(huán)4-,5-,6-,至7-元垸基、酰胺、酰胺低級(jí)烷基、酰胺二(低級(jí)垸基)、低級(jí)烷氧基、羥基、羧基及其低級(jí)酯衍生物、和具有4-,5-,6-,到7-元雜環(huán)的基團(tuán)，以產(chǎn)生肽模擬物。例如，可以制備脯氨酸類似物，其中脯氨酸殘基的環(huán)大小從5元到4、6或7元變化。環(huán)基可以是飽和的或不飽和的，并且如果是不飽和的，可以是芳香基或非芳香基的。雜環(huán)基可以包含一個(gè)或多個(gè)氮、氧、和/或硫雜原子。這樣的基團(tuán)的實(shí)例包括呋咱基(fiirazanyl)，呋喃基，咪唑烷基，咪唑基，咪唑啉基，異噻唑基，異噁唑基，嗎啉基(例如，嗎啉代)，噁唑基，哌嗪基(例如，l-哌嗪基)，哌啶基(例如，l-哌啶基，哌啶子基)，吡喃基，吡嗪基，吡唑烷基，吡唑啉基，吡唑基，噠嗪基吡啶基，嘧啶基吡咯烷基(例如,l-吡咯烷基)，吡咯啉基，吡咯基，噻二唑基(thiadiazolyl),噻唑基，噻吩基，硫代嗎啉基(例如，硫代嗎啉代)，和三唑基。這些雜環(huán)基可以被取代或未被取代。在基團(tuán)被取代的情形中，取代基可以是烷基、烷氧基、鹵素、氧、或者取代或未取代的苯基。肽和蛋白，以及肽和蛋白類似物和模擬物還可以與許多非蛋白聚合物如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯(polyoxyalkenes)中的一種或多種共價(jià)結(jié)合，結(jié)合以在美國(guó)專利號(hào)4,640,835;美國(guó)專利號(hào)4,496,689;美國(guó)專利號(hào)4,301,144;美國(guó)專利號(hào)4,670,417;美國(guó)專利號(hào)4,791,192;或美國(guó)專利號(hào)4,179,337中提出的方式進(jìn)行。本發(fā)明內(nèi)的其它肽和蛋白類似物和模擬物包括糖基化變體，和與其它化學(xué)部分的共價(jià)或聚集綴合物。共價(jià)衍生物可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法將官能度與位于氨基酸側(cè)鏈中或位于N—或C一端的基團(tuán)連接而制備。這些衍生物可以包括，但不限于，羧基端或含有羧基側(cè)鏈的殘基的脂族酯或酰胺，含有羥基的殘基的O-?；苌铮桶被税被峄蚝邪被臍埢缳嚢彼峄蚓彼岬腘-?；苌铩ｕ；x自包括C3—C18正常烷基的烷基一部分的組，由此形成烷?；减；N類。還可以應(yīng)用與載體蛋白例如免疫原性部分的共價(jià)附著。除了這些修飾之外，可以進(jìn)行生物活性肽和蛋白的糖基化改變，例如，通過(guò)在其合成和加工過(guò)程中或在其它加工步驟中修飾肽的糖基化模式而進(jìn)行。完成這一修飾的特別優(yōu)選的方式為，通過(guò)將所述肽暴露于來(lái)源于正常提供這樣的加工的細(xì)胞的糖基化酶，例如，哺乳動(dòng)物糖基化酶而進(jìn)行。還成功地應(yīng)用去糖基化酶，以產(chǎn)生本發(fā)明內(nèi)有用的修飾的肽和蛋白。還包括天然一級(jí)氨基酸序列的形式，其具有其它較小修飾，包括磷酸化的氨基酸殘基，例如，磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸，或其它部分，包括核糖基或交聯(lián)試劑。肽模擬物還可以具有已經(jīng)通過(guò)磷酸化、磺化、生物素?；蛘呒尤牖蛞瞥渌糠帧⑻貏e是具有與磷酸脂(或鹽)基相似的分子形狀的那些部分而化學(xué)修飾的氨基酸殘基?？梢原h(huán)化用于本發(fā)明的活性肽，或者在所述肽的末端結(jié)合脫氨基或脫羧基殘基，以致不存在末端氨基或羧基，以減少對(duì)蛋白酶的敏感性，或者以限制所述肽的構(gòu)象。在本發(fā)明的肽類似物和模擬物中的C端官能團(tuán)包括酰胺、酰胺低級(jí)烷基、酰胺二(低級(jí)烷基)、低等垸氧基、羥基、和羧基、和其低級(jí)酯衍生物、以及其藥用鹽。本發(fā)明提供各種添加劑、稀釋劑、基質(zhì)(base)和遞送賦形劑，其有效控制水含量以提高蛋白穩(wěn)定性。在這種意義上有效作為抗一聚集劑的這些試劑和載體物質(zhì)包括，例如，各種官能度的聚合物，諸如聚乙二醇、葡聚糖、二乙基氨基乙基葡聚糖、和羧甲基纖維素，其顯著地增加與其混合或者與其連接的肽和蛋白的穩(wěn)定性并且減少固相聚集。在一些實(shí)例中，蛋白的活性或物理穩(wěn)定性還可以通過(guò)針對(duì)肽或蛋白藥物的水溶液的各種添加劑而增強(qiáng)。例如，可以使用添加劑，諸如多元醇(包括糖)、氨基酸，蛋白，諸如膠原蛋白和明膠，以及各種鹽。某些添加劑，特別是糖和其它多元醇，還給干燥的如凍干的蛋白賦予顯著的物理穩(wěn)定性。這些添加劑還可以用于本發(fā)明以便不但在凍干過(guò)程中，還在以干燥狀態(tài)存儲(chǔ)的過(guò)程中，防止蛋白聚集。例如，在各種條件下的固相溫育過(guò)程中，蔗糖和菲可70(具有蔗糖單位的聚合物)表現(xiàn)出顯著的抗肽或蛋白聚集的保護(hù)作用。這些添加劑還可以提高包埋在聚合物基質(zhì)中的固體蛋白的穩(wěn)定性。然而其它添加劑，例如蔗糖，在升高的溫度在潮濕氛圍中穩(wěn)定蛋白抗固體一狀態(tài)聚集，如可以在本發(fā)明的某些緩慢恒定釋放的制劑中發(fā)生的。蛋白如明膠和膠原蛋白還作用為穩(wěn)定劑或填充劑以減少在這種情形中不穩(wěn)定的蛋白的變性和聚集。這些添加劑可以結(jié)合到聚合物熔化加工過(guò)程中和本發(fā)明的組合物中。例如，可以通過(guò)將含有上述各種穩(wěn)定的添加劑的溶液簡(jiǎn)單凍干或者噴霧干燥而制備多肽微粒。由此可以獲得未聚集的肽和蛋白在延長(zhǎng)的時(shí)間階段的緩慢恒定釋放。本發(fā)明提供各種其它制備成分和方法，以及特異性的配制添加劑，其產(chǎn)生用于黏膜遞送易于聚集的肽和蛋白的制劑，其中所述肽或蛋白穩(wěn)定為基本上純的、未聚集的形式?？紤]將一定范圍的成分和添加劑用于這些方法和制劑。這些抗聚集試劑的實(shí)例是連接的環(huán)糊精(CDS)二聚體，其選擇性地結(jié)合多肽的疏水側(cè)鏈。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些CD二聚體以顯著抑制聚集的方式結(jié)合蛋白的疏水片段。關(guān)于涉及的所述CD二聚體和蛋白二者，這種抑制是選擇性的。所述蛋白聚集的選擇性抑制在本發(fā)明的鼻內(nèi)遞送方法和組合物中提供額外的益處。用于這種情形的其它試劑包括具有受到特異性地阻斷肽和蛋白的聚集的接頭控制的可變的幾何學(xué)的CD三聚體和四聚體(Breslow等，7:爿w.CT^w.f夷，眾學(xué)鈔會(huì)^^志刀7S:11678-11681，1996;Breslow等，層S園f夷房嵐家棄學(xué)綜學(xué)叛;"何:11156-11158,1997)。電荷修飾和pH值控制劑和方法為了改善用于提高穿過(guò)疏水黏膜屏障遞送的生物活性劑(例如，大分子藥物、肽或蛋白)的轉(zhuǎn)運(yùn)特性，本發(fā)明還提供用于所選的生物活性劑或本文所述的遞送一增強(qiáng)劑的電荷修飾的技術(shù)和試劑。在這一點(diǎn)上，大分子的相關(guān)的滲透性通常與它們的分配系數(shù)相關(guān)。分子的離子化程度，其取決于所述分子的pKa和在黏膜表面上的pH值，還影響所述分子的滲透性。用于黏膜遞送的生物活性劑和滲透劑的滲透和分配可以由所述活性劑或滲透劑的電荷改變或電荷分布而促進(jìn)，例如，所述電荷改變或電荷分布通過(guò)改變帶電官能團(tuán)，通過(guò)修飾遞送活性劑的遞送賦形劑或溶液的pH值，或者通過(guò)協(xié)調(diào)電荷一或pH值一改變劑與所述活性劑的施用而實(shí)現(xiàn)。防腐劑防腐劑如氯丁醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉(0.5%)、苯酚、甲酚、對(duì)-氯-間-甲酚、苯乙醇、苯甲醇、醋酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯滎、硫柳滎、山梨酸、氯化芐乙銨或benzylkoniumchloride,可以加入到本發(fā)明的制劑中，以抑制微生物生長(zhǎng)。PH和緩沖系統(tǒng)pH值通常使用緩沖液如包含檸檬酸和檸檬酸鹽如檸檬酸鈉的系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。其它適當(dāng)?shù)木彌_系統(tǒng)包括醋酸與醋酸鹽系統(tǒng)、琥珀酸與琥珀酸鹽系統(tǒng)、蘋果酸與蘋果酸鹽系統(tǒng)、和葡糖酸與葡糖酸鹽系統(tǒng)。備選地，可以使用包含混合酸/鹽系統(tǒng)的緩沖系統(tǒng)，諸如醋酸和檸檬酸鈉系統(tǒng)，檸檬酸、醋酸鈉系統(tǒng)，和檸檬酸、檸檬酸鈉、苯甲酸鈉系統(tǒng)。對(duì)于任何緩沖系統(tǒng)，可以加入其它的酸如鹽酸，以及其它的堿如氫氧化鈉，用于最終pH值調(diào)節(jié)。用于調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)和/或生理的其它試劑上皮細(xì)胞緊密連接通常不能透過(guò)具有約15埃的半徑的分子，除非用如本發(fā)明所提供的刺激基本連接開放的連接生理學(xué)控制劑處理。在本發(fā)明的方法和組合物中作用為二級(jí)生理學(xué)調(diào)控的有用目標(biāo)的"二級(jí)"緊密連接調(diào)控成分中，Z01-Z02雜二聚體復(fù)合物本身表現(xiàn)出易于受到可以容易地并且有效地改變黏膜上皮細(xì)胞的旁細(xì)胞滲透性的外源試劑的生理學(xué)調(diào)控。一種已被充分研究的這樣的試劑為來(lái)自亞洲霍亂弧菌的細(xì)菌毒素，叫作"緊密連接毒素"(ZOT)。還參見(jiàn)，WO96/37196;美國(guó)專利號(hào)5，945，510;5,948,629;5,912,323;5,864,014;5,827,534;5,665,389;禾B5,908,825。因此，ZOT及其它調(diào)控Z01-Z02復(fù)合物的試劑可以與一種或多種生物活性劑組合配制或者協(xié)調(diào)施用。配制和施用本發(fā)明的黏膜遞送制劑包含典型地與一種或多種藥用載體以及任選地其它治療成分組合在一起待施用的生物活性劑。在與所述制劑的其它成分相容并且在受試者中不激發(fā)不可接受的有害作用的意義上，所述載體必須是"藥用的"。所述載體為本文在上文中所述的，或者另外為藥學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的。理想地，所述制劑不應(yīng)該包含已知所述生物活性劑與之一起施用不相容的物質(zhì)如酶或氧化劑。所述制劑可以通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域公知的任何方法進(jìn)行制備。本發(fā)明的組合物和方法可以通過(guò)許多黏膜施用方式施用給受試者，包通過(guò)口腔、直腸、陰道、鼻內(nèi)、肺內(nèi)、或透皮遞送，或者通過(guò)局部遞送至眼、耳、皮膚或其它黏膜表面。按照本發(fā)明的組合物通常以作為鼻或肺部噴霧劑的水溶液進(jìn)行施用，并且可以通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的各種方法以噴霧形式分散。用于分散作為鼻噴霧劑的液體的優(yōu)選系統(tǒng)在美國(guó)專利號(hào)4,511,069中公開。這樣的制劑可以便利地通過(guò)將按照本發(fā)明的組合物溶解在水中以產(chǎn)生水溶液，并且使得所述溶液無(wú)菌而制備。所述制劑可以存在于多劑量容器中，例如，存在于在美國(guó)專利號(hào)4,511,069中公開的密封分配系統(tǒng)中。其它適當(dāng)?shù)谋菄婌F劑遞送系統(tǒng)已在7>ww^rma/^Wem/cMe&ca"o"6^^系統(tǒng)^"激治#>>,Y.W.Chien編，Elsevier出版社，紐約,1985;和在美國(guó)專利號(hào)4，778，810中得到描述。其它的氣溶膠遞送形式可以包括，例如，壓縮空氣-、噴氣式-、超聲-和壓電式噴霧器，其遞送溶解或懸浮在藥物溶劑如水、乙醇或它們的混合物中的生物活性劑。本發(fā)明的鼻和肺部噴霧溶液典型地包含藥物或待遞送的藥物，任選地用表面活性劑如非離子表面活性劑(例如，聚山梨酯-SO)和一種或多種緩沖劑、穩(wěn)定劑或張力劑(tonidfiers)配制。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述鼻噴霧溶液還包含推進(jìn)劑。所述鼻噴霧溶液的pH值任選地在約pH3.0和7.2之間，但是當(dāng)需要時(shí)，調(diào)整pH值使得帶電荷的大分子種類(例如，治療蛋白或肽)以基本上未離子化的狀態(tài)遞送最優(yōu)化。所應(yīng)用的藥學(xué)溶劑還可以是弱酸性的水性緩沖液(pH值3-6)。用于這些組合物的適當(dāng)?shù)木彌_劑如上文所述或者如本領(lǐng)域另外所知?？梢蕴砑悠渌煞?，以提高或保持化學(xué)穩(wěn)定性，所述其它成分包括防腐劑、表面活性劑、分散劑、或氣體。適當(dāng)?shù)姆栏瘎┌?，但不限于，苯酚、?duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸酯、間-甲酚、硫柳汞、苯扎氯銨(benzylalkonimumchloride)等。適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┌?，但不限于，油酸、失水山梨糖醇三油酸酯、聚山梨酯、磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿(phosphotidylcholines)、和各種長(zhǎng)鏈甘油二酯和磷脂。適當(dāng)?shù)姆稚┌ǎ幌抻?，乙二胺四乙酸等。適當(dāng)?shù)臍怏w包括，但不限于，氮?dú)?、氦氣、含氯氟烴(CFCs)、氫氟烴(HFCs)、二氧化碳、空氣等。適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑和張力劑(tonidfyingagent)包括糖和其它多元醇、氨基酸、和有機(jī)與無(wú)機(jī)鹽。液體透皮制劑可以作為滴劑例如裝置(installation)或作為小滴(噴霧)進(jìn)行施用。噴霧可以通過(guò)泵、噴霧器或者通過(guò)本領(lǐng)域所述的其它方法而產(chǎn)生。對(duì)于肺部遞送，用于深入肺部沉積的液體小滴表現(xiàn)出適于在肺部通道中沉積的最小的顆粒大小，通常約小于10nm質(zhì)量中值當(dāng)量空氣動(dòng)力學(xué)直徑(massmedianequivalentaerodynamicdiameter,MMEAD)，通常約小于5lumMMEAD，通常約小于約2MMEAD。對(duì)于鼻遞送，所述液體小滴顆粒大小通常約小于1000iimMMEAD,通常小于100pmMMEAD。在備選實(shí)施方案中，黏膜制劑作為干粉制劑施用，其包含以適當(dāng)顆粒大小或者在適宜的顆粒大小范圍之內(nèi)的干燥的通常是凍干形式的生物活性劑，用于鼻內(nèi)遞送。對(duì)于肺部遞送，用于深入肺部沉積的粉末顆粒表現(xiàn)出適于在肺部通道中沉積的最小顆粒大小，通常約小于10pm質(zhì)量中值當(dāng)量空氣動(dòng)力學(xué)直徑(MMEAD),通常約小于5pmMMEAD,通常約小于約2!imMMEAD。對(duì)于鼻遞送，所述粉末顆粒大小通常約小于1000pmMMEAD,通常小于100)amMMEAD。在這些大小范圍內(nèi)的鼻內(nèi)可吸入粉末可以通過(guò)各種常規(guī)技術(shù)諸如噴射研磨、噴霧干燥、溶劑沉淀、超臨界流體冷凝等生產(chǎn)。這些適當(dāng)MMEAD的干粉可以通過(guò)常規(guī)干粉吸入器(DPI)施用給患者，所述常規(guī)干粉吸入器依賴患者的呼吸，當(dāng)肺或鼻吸入時(shí)，以將所述散劑分散成氣溶膠化的量。備選地，所述干粉可以通過(guò)空氣輔助裝置進(jìn)行施用，所述空氣輔助裝置使用外部能源，以將所述散劑分散成氣溶膠化的量，例如使用活塞泵進(jìn)行。藥物粉末顆?？梢栽诟稍餇顟B(tài)配制成聚集成大顆粒(>100umMMEAD)的顆粒，其包含適當(dāng)?shù)妮d體，諸如乳糖，其中當(dāng)分配所述散劑時(shí)，藥物顆粒和載體顆粒的聚集體被破壞。干粉裝置典型地需要約1mg-20mg范圍的粉末質(zhì)量，以產(chǎn)生單一的氣溶膠化劑量("噴煙")。如果生物活性劑的需要的或理想的劑量低于這一量，那么粉狀的活性劑將典型地與藥物干燥填充(bulking)粉末組合，以提供需要的總散劑質(zhì)量。優(yōu)選的干燥填充粉末包括蔗糖、乳糖、右旋糖、甘露醇、甘氨酸、海藻糖、人血清白蛋白(HSA)、和淀粉。其它適當(dāng)?shù)母商畛浞勰┌ɡw維二糖、葡聚糖、麥芽三糖、果膠、檸檬酸鈉、抗壞血酸鈉、等等。為了配制用于本發(fā)明中黏膜遞送的組合物，所述生物活性劑可以與各種藥用添加劑、以及用于分散所述活性劑的基質(zhì)或載體組合。理想的添加劑包括，但不限于，pH值控制劑，諸如精氨酸、氫氧化鈉、甘氨酸、鹽酸、檸檬酸等。另外，可以包含局部麻醉劑(例如，苯甲醇)、等滲劑(例如，氯化鈉、甘露醇、山梨糖醇)、吸附抑制劑(例如，吐溫80)、溶解性增強(qiáng)劑(例如，環(huán)糊精及其衍生物)、穩(wěn)定劑(例如，血清白蛋白)、和還原劑(例如，谷胱甘肽)。當(dāng)用于黏膜遞送的組合物是液體時(shí)，如參照視為統(tǒng)一的0.9%(W/V)生理鹽水溶液的張力進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，制劑的張力典型地被調(diào)整到這樣的值，即，在所述張力值，在施用位點(diǎn)的鼻黏膜中將不會(huì)誘導(dǎo)基本的、不可逆的組織損傷。通常，將溶液的張力調(diào)整到約1/3到3，或l/2到2，或3/4到1.7的值。所述生物活性劑可以分散在基質(zhì)或賦形劑中，其可以包含具有分散所述活性劑的能力的親水性化合物和任何需要的添加劑。所述基質(zhì)可以選自寬范圍的適當(dāng)?shù)妮d體，包括但不限于，聚羧酸的共聚物或其鹽，羧酸酐(例如，順式丁烯二酸酐)，與其它單體(例如，甲基(甲)丙烯酸酯、丙烯酸等)的共聚物，親水性乙烯基聚合物如聚乙烯乙酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮，纖維素衍生物如羥甲基纖維素、羥丙基纖維素等，和天然聚合物如脫乙酰殼多糖、膠原蛋白、藻酸鈉、明膠、透明質(zhì)酸及它們的非毒性金屬鹽。通常，選擇可生物降解的聚合物作為基質(zhì)或載體，例如，聚乳酸，聚(乳酸-乙醇酸)共聚物，多羥基丁酸，聚(羥基丁酸-乙醇酸)共聚物及它們的混合物。備選地或另外地，合成的脂肪酸酯如聚甘油脂肪酸酯、脂肪酸糖酯等可以用作載體。親水性聚合物和其它載體可以單獨(dú)使用或者組合使用，并且可以通過(guò)部分結(jié)晶化、離子鍵合、交聯(lián)等賦予所述載體提高的結(jié)構(gòu)完整性。載體可以以各種形式提供，包括，流體或黏性溶液、凝膠、糊劑、散劑、微球體和薄膜，它們直接用于鼻黏膜。在這種情形中，使用選擇的載體可以導(dǎo)致促進(jìn)生物活性劑的吸收。所述生物活性劑可以與基質(zhì)或載體按照各種方法組合，并且所述活性劑的釋放可以通過(guò)擴(kuò)散、載體的崩解、或者水道的締合制劑而進(jìn)行。在一些情形中，所述活性劑分散在由適當(dāng)?shù)木酆衔锢?-氰基丙烯酸異丁酯制成的微膠囊(微球體)或納米膠囊(納米球體)中(參見(jiàn)，例如，Michad，等，《/尸/w/7wa^尸/^rw"co/.("秀學(xué)秀潘學(xué)染^;>W:l-5，1991)，并且分散在用于鼻黏膜的生物相容性分散介質(zhì)中，其產(chǎn)生隨著延長(zhǎng)的時(shí)間緩慢恒定的遞送和生物活性。為了進(jìn)一步增強(qiáng)本發(fā)明的藥劑的黏膜遞送，包含所述活性劑的制劑還可以含有親水性低分子量化合物作為基質(zhì)或賦形劑。所述親水性低分子量化合物提供通道介質(zhì)，通過(guò)其水溶性活性劑如生理活性肽或蛋白可以通過(guò)所述基質(zhì)擴(kuò)散到吸收所述活性劑的機(jī)體表面。所述親水性低分子量化合物任選地吸收來(lái)自黏膜、或施用氛圍的濕氣，并且溶解水溶性活性肽。所述親水性低分子量化合物的分子量通常不超過(guò)10000，并且優(yōu)選不超過(guò)3000。代表性的親水性低分子量化合物包括多元醇化合物，諸如寡-、二-和單糖如蔗糖、甘露醇、乳糖、L-阿拉伯糖、D-赤蘚糖,D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、乳酮糖、纖維二糖、龍膽二糖(gentibiose)、甘油和聚乙二醇。在本發(fā)明內(nèi)用作載體的其它親水性低分子量化合物的實(shí)例包括N-甲基吡咯烷酮和醇(例如，寡乙烯醇、乙醇、乙二醇、丙二醇等)。這些親水性低分子量化合物可以單獨(dú)使用或者彼此組合或者與所述鼻內(nèi)制劑的其它活性或無(wú)活性成分組合使用。本發(fā)明的組合物可以備選地包含適當(dāng)?shù)纳項(xiàng)l件需要的藥用載體物質(zhì)，諸如pH值調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、濕潤(rùn)劑等，例如，乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、失水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。關(guān)于固體組合物，可以使用常規(guī)無(wú)毒性藥用載體，例如，其包括藥學(xué)級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述生物活性劑在定時(shí)釋放制劑中施用，例如，在包含緩慢釋放聚合物的組合物中施用。所述活性劑可以用防止快速釋放的載體制備，例如，控制釋放的賦形劑，如聚合物、微封裝的遞送系統(tǒng)或生物黏合凝膠。所述生物活性劑在本發(fā)明的各種組合物中的延長(zhǎng)的遞送可以通過(guò)在所述組合物中包含延緩吸收的試劑例如一硬脂酸鋁水凝膠和明膠而導(dǎo)致。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"受試者"意指可以施用本發(fā)明的組合物的任何哺乳動(dòng)物患者。試劑盒本發(fā)明還包括含有上述藥物組合物、活性成分的試劑盒、包裝和多容器單元(linit)，和/或用于施用其的方式，這些試劑盒、包裝和多容器單元和/或施用方式用于在哺乳動(dòng)物受試者中預(yù)防和治療疾病和其它病況。簡(jiǎn)言之，這些試劑盒包括含有配制在用于黏膜遞送的藥物制劑中的一種或多種生物活性劑的容器或制劑。所述生物活性劑任選地包含在填充分配容器(bulkdispensingcontainer)或單元或多單元?jiǎng)┬椭?。例如，肺部或鼻?nèi)噴霧涂藥器可以提供任選的分配方式。包裝材料任選地包括指示其中包裝的藥劑可以黏膜應(yīng)用，例如，鼻內(nèi)應(yīng)用以治療或預(yù)防具體的疾病或病況的標(biāo)記或說(shuō)明。提高多核苷酸遞送的多肽在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，選擇或者合理設(shè)計(jì)提高多核苷酸遞送的多肽以包含兩親性氨基酸序列。例如，可以選擇有用的增強(qiáng)多核苷酸遞送的多肽，其包含形成疏水序列結(jié)構(gòu)域或基序的多個(gè)非極性或疏水性氨基酸殘基，與形成帶電荷序列結(jié)構(gòu)域或基序的多個(gè)帶電荷的氨基酸殘基連接，產(chǎn)生兩親性肽。在其它實(shí)施方案中，選擇包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或基序和融合肽結(jié)構(gòu)域或基序的提高多核苷酸遞送的多肽。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是能夠插入并且優(yōu)選地通過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的肽序列。融合肽是能夠使得脂質(zhì)膜例如質(zhì)膜或圍繞內(nèi)體的膜不穩(wěn)定的肽，其可以在低pH值被增強(qiáng)。代表性的融合結(jié)構(gòu)域或基序在廣泛多樣性的病毒融合蛋白和其它蛋白例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(FGF4)中找到。為了合理設(shè)計(jì)本發(fā)明的提高多核苷酸遞送的多肽，將蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域用作促進(jìn)核酸通過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞的基序。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)運(yùn)的核酸將被封裝在內(nèi)體中。內(nèi)體的內(nèi)部具有低的pH值，導(dǎo)致融合肽基序使得內(nèi)體的膜不穩(wěn)定。內(nèi)體膜的不穩(wěn)定和破壞允許siNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中，在這里siNA可以與RISC復(fù)合物締合并且可以導(dǎo)向其靶點(diǎn)mRNA。用于任選地結(jié)合到本發(fā)明的提高多核苷酸遞送的多肽中的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括1.TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)(SEQIDNO:l)KRRQRRR;2.PenetratinPTD(SEQIDNO:2)RQIKI曹QNRRMKWKK;3.W22PTD(SEQIDNO:3)DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD;4.卡波西(Kaposi)FGF信號(hào)序列(SEQIDNO:4)AAVALLPAVLLALLAP,禾口SEQIDNO:5)AAVLLPVLLPVLLAAP;5.人卩3整聯(lián)蛋白信號(hào)序列(SEQIDNO:6)VTVLALGALAGVGVG;6.gp41融合序列(SEQIDNO:7)GALFLGWLGAAGSTMGA;7.凱門鍔(On'ma"craco辦/w)Ig(v)輕鏈(SEQIDNO:8)MGLGLHLLVLAAALQGA;8.hCT-來(lái)源的肽(SEQIDNO:9)LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP;9.T薦portan(SEQIDNO:10)GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL;10.Loligomer(SEQIDNO:11)TPPKKKRKVEDPKKKK;11.精氨酸肽(SEQIDNO:12)RRRRRRR;禾口12.兩親性模式肽(SEQIDNO:13)KLALKLALKALKAALKLA。用于任選地結(jié)合到本發(fā)明的提高多核苷酸遞送的多肽中的病毒融合肽融合結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括1.流感HA2(SEQIDNO:14)GLFGAIAGFIENGWEG;2.仙臺(tái)病毒(Sendai)Fl(SEQIDNO:15)FFGAVIGTIALGVATA;3.呼吸道合胞病毒Fl(SEQIDNO:16)FLGFLLGVGSAIASGV;4.HIVgp41(SEQIDNO:17)GVFVLGFLGFLATAGS;和5.依波拉病毒(Ebola)GP2(SEQIDNO:18)GAAIGLA曹YFGPAA。然而在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，提供提高多核苷酸遞送的多肽，其結(jié)合促進(jìn)本發(fā)明的方法和組合物內(nèi)的多肽一siNA復(fù)合物形成和/或增強(qiáng)siNAs的遞送的DNA—結(jié)合結(jié)構(gòu)域或基序。在這種情形中代表性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括許多"鋅指"結(jié)構(gòu)域，如關(guān)于DNA—結(jié)合調(diào)控蛋白和下文鑒定的其它蛋白所述(參見(jiàn)，例如，Simpson,等,說(shuō)o/.C&肌f生激眾學(xué)泰志)27&28011-28018,2003)。表l:不同DNA—結(jié)合蛋白的代表性鋅指基序C2H2鋅指基序<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>*本表顯示雙鏈DNA結(jié)合的保守鋅指基序，其特征在于C-x(2,仆C-x(12)-H-x(3)-H基序模式，其本身可以用來(lái)選擇并且設(shè)計(jì)按照本發(fā)明的提高多核苷酸遞送的多肽。**表1中關(guān)于Spl，Sp2，Sp3，Sp4，DrosBtd,DrosSp,CeT22C8.5和Y4pBlA.4所示的序列在本文分別編號(hào)為SEQIDNOs19，20，21，22，23，24，25，和26。用于構(gòu)建本發(fā)明提高多核苷酸遞送的多肽的備選DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括，例如，HIVTat蛋白序列的部分(參見(jiàn)，實(shí)施例，如下)。在本文下述的本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，通過(guò)將任何前述結(jié)構(gòu)元件、結(jié)構(gòu)域或基序組合到單一多肽中，可以合理地設(shè)計(jì)并且構(gòu)建提高多核苷酸遞送的多肽，以有效地調(diào)控siNAs到靶點(diǎn)細(xì)胞的增強(qiáng)的遞送。例如，將TAT多肽的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域融合到叫作HA2的流感病毒血凝素蛋白的N—端20個(gè)氨基酸中，以產(chǎn)生一種代表性的本發(fā)明的提高多核苷酸遞送的多肽。在本發(fā)明公開內(nèi)容中提供各種其它的提高多核苷酸遞送的多肽構(gòu)建體，這表明本發(fā)明的概念廣泛地適用于產(chǎn)生并且應(yīng)用用于提高siNA遞送的有效的提高多核苷酸遞送的多肽的各種集合。本發(fā)明內(nèi)其它代表性的提高多核苷酸遞送的多肽可以選自下述肽WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR(SEQIDNO:27);GKINLKALAALAKKIL(SEQIDNO:28)，RVIRVWFQNKRCKDKK(SEQ(SEQIDNO:30)，GEQIAQUAGYIDIILKKKKSK(SEQIDNO:31)，聚Lys匿Trp,4:1，MW20,000-50,000;和聚Orn-Trp，4:1,MW20,000-50,000。其它用于本發(fā)明的組合物和方法的提高多核苷酸遞送的多肽包含所提及的(mellitin)蛋白序列的全部或部分。實(shí)施例本發(fā)明通過(guò)下述實(shí)施例進(jìn)行舉例說(shuō)明，所述實(shí)施例不限制在權(quán)利要求中描述的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1黏膜遞送-滲透動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞毒性器官型模型下述方法通常用于評(píng)估關(guān)于生物活性治療劑和提高黏膜遞送的有效量的滲透性肽的黏膜遞送參量、動(dòng)力學(xué)和副作用，所述提高黏膜遞送的有效量的滲透性肽通過(guò)調(diào)控哺乳動(dòng)物受試者中上皮細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)和/或生理而可逆地提高黏膜上皮旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。EpiAirwayTM系統(tǒng)由馬特泰克(MatTek)公司(阿什蘭，MA)開發(fā)，作為內(nèi)襯于呼吸道的假?gòu)?fù)層上皮的模型。上皮細(xì)胞生長(zhǎng)在氣液界面處的以多孔膜為底部的細(xì)胞培養(yǎng)插入物上，這導(dǎo)致細(xì)胞分化成高度極化的形態(tài)。頂面有纖毛，具有微絨毛超結(jié)構(gòu)，并且上皮產(chǎn)生粘液(通過(guò)免疫印跡已經(jīng)證實(shí)了粘蛋白的存在)。插入物的直徑為0.875cm,提供0.6cm2的表面積。在運(yùn)輸前約3周在工廠將細(xì)胞鋪在插入物上。一個(gè)"試劑盒"由24個(gè)單元組成。A.當(dāng)?shù)竭_(dá)時(shí)，將所述單元放置在6孔微量培養(yǎng)板中的無(wú)菌支持物上。每個(gè)孔接受5mL專有的(proprietary)培養(yǎng)基。這種基于DMEM的培養(yǎng)基不含血清，但是補(bǔ)充了表皮生長(zhǎng)因子和其它因子。一直檢測(cè)所述培養(yǎng)基中認(rèn)為用于鼻內(nèi)遞送的任何細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子的內(nèi)源水平，但是除胰島素外不含所有細(xì)胞因子和迄今為止已研究的因子。5mL的體積恰好足以提供與單元自身底部的接觸，但是允許上皮的頂面保持與空氣直接接觸。在這一步驟及在包括將單元轉(zhuǎn)移到含有液體的孔中的所有后續(xù)步驟中都使用無(wú)菌鑷子，以確保在所述單元的底部和培養(yǎng)基之間沒(méi)有截留空氣。B.將在它們的平板中的單元在培養(yǎng)箱中在空氣中含有5%C02的氛圍中在37'C保持24小時(shí)。在這一時(shí)間末，用新鮮培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基，并且將所述單元放回培養(yǎng)箱繼續(xù)保持24小時(shí)。實(shí)驗(yàn)方案一一滲透動(dòng)力學(xué)A.24EpiAirwayTM單元的"試劑盒"可常規(guī)用于評(píng)估5種不同的制劑，每種制劑都應(yīng)用在一式四份的孔中。每個(gè)孔用來(lái)確定滲透動(dòng)力學(xué)(4個(gè)時(shí)間點(diǎn))、跨上皮電阻(TER)。另一組孔用作對(duì)照，它們?cè)诖_定滲透動(dòng)力學(xué)過(guò)程中進(jìn)行假處理，但是其他的與用于確定跨上皮細(xì)胞阻抗和存活能力的含有測(cè)試樣品的單元同樣處理。B.在所有實(shí)驗(yàn)中，將待研究的黏膜遞送制劑以100的體積應(yīng)用到每個(gè)單元的頂面，所述體積足以覆蓋整個(gè)頂面。留出適當(dāng)體積的應(yīng)用到頂面的濃度的測(cè)試制劑(通常所需要的不超過(guò)100ioL)，以隨后通過(guò)ELISA或其它指定的檢測(cè)而確定活性物質(zhì)的濃度。C.將所述單元放置在無(wú)架臺(tái)的6孔平板中用于本實(shí)驗(yàn)每孔含有0.9mL培養(yǎng)基，其足以與所述單元的多孔膜底部接觸，但是對(duì)所述單元不產(chǎn)生任何顯著的向上的流體靜力學(xué)壓力。D.為了將誤差的潛在來(lái)源最小化并且避免任何濃度梯度的形成，在研究中的每一時(shí)間點(diǎn)，將所述單元從一個(gè)含有0.9mL的孔轉(zhuǎn)移到另一個(gè)孔?；趯?00iaL體積的測(cè)試物質(zhì)應(yīng)用到頂面的零時(shí)刻，這些轉(zhuǎn)移在下列時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行15分鐘，30分鐘，60分鐘，和120分鐘。E.在時(shí)間點(diǎn)之間，將在它們的平板中的單元保持在37'C培養(yǎng)箱中。還將每孔含有0.9mL培養(yǎng)基的平板保持在培養(yǎng)箱中，以致在當(dāng)將平板移出并且用無(wú)菌鑷子將單元從一個(gè)孔轉(zhuǎn)移到另一個(gè)孔的短時(shí)間內(nèi)發(fā)生溫度的最小變化。F.每個(gè)時(shí)間點(diǎn)完成時(shí)，將培養(yǎng)基從轉(zhuǎn)移每個(gè)單元的孔移出，并且整分到兩個(gè)管中(一個(gè)管接收700)iL，和另一個(gè)管接收200pL)，以用于確定滲透的測(cè)試物質(zhì)的濃度，并且在所述測(cè)試物質(zhì)是細(xì)胞毒性的情形中，以用于從上皮細(xì)胞釋放細(xì)胞質(zhì)酶，乳酸脫氫酶。如果檢測(cè)將在24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，那么將這些樣品存放在冰箱中，或者將所述樣品亞整分，并且在-8(TC冷凍保存，直到解凍一次進(jìn)行檢測(cè)。避免重復(fù)的冷凍-解凍循環(huán)。G.為了將誤差最小化，在開始實(shí)驗(yàn)之前將所有的管、平板和孔都預(yù)先標(biāo)記oH.在120分鐘時(shí)間點(diǎn)結(jié)束時(shí)，將單元從最后含有0.9mL的孔轉(zhuǎn)移到每孔含有0.3mL培養(yǎng)基的24孔微量培養(yǎng)板中。這一體積也足以接觸單元底部，但是不會(huì)對(duì)所述單元施加向上的流體靜力學(xué)壓力。在檢測(cè)跨上皮細(xì)胞阻抗之前將所述單元放回培養(yǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)方案_一跨上皮電阻A.呼吸道上皮細(xì)胞在體內(nèi)和體外形成緊密連接，并且由此限制溶質(zhì)穿過(guò)組織的流動(dòng)。這些連接在切除的呼吸道組織中賦予幾百歐姆Xcm2的跨上皮電阻。在馬特泰克(MatTek)EpiAirwayTM單元中，生產(chǎn)商聲稱跨上皮電阻(TER)通常在約1000歐姆Xcm2。本文確定的數(shù)據(jù)表明，在滲透研究中的步驟順序中假暴露的對(duì)照EpiAirwayTM單元的TER稍低(700-800歐姆Xcm2)，但是，由于小分子的滲透與TER的倒數(shù)成比例，所以這一值仍然足夠高，足以為滲透提供基本的屏障。相反，不含細(xì)胞的以多孔膜為底的單元只提供最小的跨膜電阻(約5-20歐姆Xcm2)。B.TER的準(zhǔn)確測(cè)定需要將歐姆計(jì)的電極置于膜上和膜下的顯著的表面積上，并且從所述膜到電極的距離應(yīng)該可被再現(xiàn)地控制。由MatTek推薦并且本發(fā)明的所有實(shí)驗(yàn)都應(yīng)用的TER確定方法使用來(lái)自WorldPrecisionInstruments,Inc.(世界精密儀器公司)，薩拉索塔，F(xiàn)L的"EVOM"tm上皮細(xì)胞伏特歐姆計(jì)和"ENDOHM"組織電阻測(cè)量室("ENDOHM"tmtissueresistancemeasurementchamber)。C.在測(cè)定TER之前，將所述室開始充滿杜爾貝科(Dulbecco，s)磷酸緩沖鹽水(PBS)至少20分鐘，以平衡電極。D.用所述室中的1.5mLPBS和被測(cè)量的以膜為底的單元中的350nLPBS測(cè)定TER。將頂部電極調(diào)整到正好在不含細(xì)胞(但是含有350pLPBS)的一個(gè)單元的膜上部的位置，然后固定，以保證可再現(xiàn)地放置。不含細(xì)胞的單元的電阻典型地為5-20歐姆Xcm""背景電阻")。E.—旦所述室準(zhǔn)備好并且記錄了背景電阻，那么將剛才用于滲透測(cè)定的24孔平板從培養(yǎng)箱中移出，并且單獨(dú)放置在所述室中進(jìn)行TER測(cè)定。F.首先將每個(gè)單元轉(zhuǎn)移到含有PBS的培養(yǎng)皿中，以確保膜底部濕潤(rùn)。將350PBS的等分試樣添加到所述單元中，然后小心地吸入標(biāo)記的管中以潤(rùn)洗頂面。然后對(duì)所述單元應(yīng)用350iiLPBS再次洗滌，并且將PBS吸入到同一收集管中。G.在置于所述室(含有新鮮的1.5mLPBS等分試樣)之前，將所述單元外表面輕輕印跡除去過(guò)多的PBS。在將頂部電極放置于所述室上之前將350PBS等分試樣添加到所述單元中，并且在EVOM計(jì)上讀取TER。H.在ENDOHM室中讀取所述單元的TER之后，移出所述單元，吸出PBS并且保存，并且將所述單元放回到每孔含有0.3mL培養(yǎng)基的24孔平板，在所述單元的頂面具有空氣界面。I.所述單元以下述順序讀取所有假處理的對(duì)照，然后是所有制劑-處理的樣品，接著是每個(gè)假處理的對(duì)照的第二次TER讀數(shù)。所有的TER值報(bào)告為組織表面積的函數(shù)。TER計(jì)算為TER=(R廣Rb)xA其中R是具有膜的插入物的電阻，Rb是空白插入物的電阻，并且A是膜的面積(0.6cm2)。包含增強(qiáng)鼻內(nèi)遞送增強(qiáng)試劑例如滲透性肽的藥物制劑的作用通過(guò)穿過(guò)EpiAirwayTM細(xì)胞膜(黏膜上皮細(xì)胞層)的TER檢測(cè)。滲透性肽以1.0mM的濃度應(yīng)用到EpiAirwayTM細(xì)胞膜。TER值相對(duì)于對(duì)照值(對(duì)照-約1000歐姆-cm2;標(biāo)準(zhǔn)化到100)的減小表明細(xì)胞膜電阻的減小和黏膜上皮細(xì)胞滲透性的增加。實(shí)驗(yàn)方案一一LDH檢測(cè)通過(guò)使用CytoTox96細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(普洛麥格(Promega)公司,麥迪遜，威斯康星州)檢測(cè)來(lái)自細(xì)胞的乳酸脫氫酶(LDH)的損失而測(cè)定細(xì)胞死亡量。將50微升樣品上樣到96孔檢測(cè)平板上。新鮮的不含細(xì)胞的培養(yǎng)基用作空白。向每個(gè)孔中加入50pl底物溶液，并且將平板在黑暗中在室溫溫育30分鐘。溫育后，向每個(gè)孔中加入50pl終止溶液，并且將所述平板在光學(xué)密度平板讀數(shù)儀上在490nm讀數(shù)。實(shí)驗(yàn)方案一一EIA方法EIA試劑盒(p/nS-1178(EIAH6101)購(gòu)自半島實(shí)驗(yàn)室公司(PeninsulaLaboratoriesInc.，BACHEM分部，圣卡洛斯，加利福尼亞，800-922-1516)。17x120mm聚丙烯圓錐管(p/n352097，法歐肯(Falcon),富蘭克林湖(FranklinLakes)，新澤西)用于所有樣品制備。8種標(biāo)準(zhǔn)物用于PTH定量。其余的檢測(cè)步驟與試劑盒插入物相同。實(shí)施例2通過(guò)PN159增強(qiáng)上皮滲透作用本發(fā)明下述實(shí)施例表明，本發(fā)明的滲透作用增強(qiáng)肽，以PN159為例，增強(qiáng)肽治療藥物包括PTH和肽YY的黏膜滲透。由PN159表明的本發(fā)明的肽的這種滲透增強(qiáng)活性，可能等價(jià)于，或者大于通過(guò)使用一種或多種小分子滲透增強(qiáng)劑而獲得的上皮滲透增強(qiáng)。肽YY3.36(PYY3.36)是一種己經(jīng)成為許多臨床試驗(yàn)的主題的34個(gè)氨基酸的肽。這種生物活性肽的黏膜遞送可以在包含小分子滲透增強(qiáng)劑的制劑中得到增強(qiáng)。因此，本研究評(píng)估以PN159為例的本發(fā)明的滲透增強(qiáng)肽是否可以代替小分子滲透增強(qiáng)劑促進(jìn)肽YY的黏膜遞送的作用。這些研究包括體外評(píng)估PN159減小跨上皮電阻(TEER)和增加標(biāo)記物質(zhì)的滲透的作用，以及證明與所述體外結(jié)果一致的相關(guān)的體內(nèi)研究。在本實(shí)施例中，描述PN159與PTH的組合。PTH可以是全長(zhǎng)肽(1-84)、或片段如(1-34)。所述制劑還可以是PTH、滲透性肽、和一種或多種其它滲透增強(qiáng)劑的組合。所述制劑還可以包含緩沖劑、張力劑、pH值調(diào)節(jié)劑、和肽/蛋白穩(wěn)定劑如氨基酸、糖或多元醇、聚合物、和鹽。自身或與其它滲透增強(qiáng)劑組合對(duì)PTH滲透的作用。評(píng)估的PN159濃度為25，50,和100^M。其它滲透增強(qiáng)劑為45mg/mlM-(3-CD，1mg/mlDDPC,和1mg/mlEDTA。山梨醇用作張力劑(146-190mM)以將制劑的摩爾滲透壓濃度(osmolarity)調(diào)節(jié)至(」220mOsm/kg。將制劑pH值固定在4.5。在本實(shí)施例中選擇PTH作為模型肽。2mg/mlPTH與PN159與或不與其它滲透增強(qiáng)劑組合。使用體外上皮組織模型檢測(cè)所述組合，以通過(guò)LDH檢測(cè)而監(jiān)測(cè)PTH滲透、跨上皮電阻(TER)，和所述制劑的細(xì)胞毒性?？缟掀る娮鑱?lái)自本研究的TER檢測(cè)的結(jié)果表明大于80%的TER減少由PN159引起。用增加的PN159濃度觀察到更高的TER減少。應(yīng)用到頂面的培養(yǎng)基沒(méi)有減小TER，而tritonX處理的組如預(yù)計(jì)那樣表現(xiàn)出顯著的TER減少。細(xì)胞毒性本研究關(guān)于LDH的數(shù)據(jù)表明，當(dāng)用25-100pMPN159處理細(xì)胞時(shí)，沒(méi)有觀察到顯著的細(xì)胞毒性。應(yīng)用到頂面的培養(yǎng)基沒(méi)有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，而TritonX處理的組如預(yù)計(jì)那樣表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性。滲透關(guān)于有和無(wú)其它增強(qiáng)劑的PN159的PTHw4滲透數(shù)據(jù)分別在圖1和2中顯示。在存在PN159時(shí)觀察到PTH滲透的顯著增加。在25，50，和100jiMPN159之間沒(méi)有觀察到％滲透的顯著的不同。PN159對(duì)PTH滲透的作用與45/1/1mg/mlM-卩-CD/DDPC/EDTA的作用相當(dāng)。使用45/1/1mg/mlM-b-CD/DDPC/EDTA和PN159組合觀察到PTH滲透的額外的增加。實(shí)施例3PN159對(duì)肽激素治療劑的體內(nèi)滲透增強(qiáng)作用等于或超過(guò)小分子滲透增強(qiáng)劑的增強(qiáng)作用將20只3—6月齡并且重2.1—3.0kg的雄性新西蘭白兔隨機(jī)分成5個(gè)處理組，每組4只動(dòng)物。將測(cè)試動(dòng)物以15nl/kg并且通過(guò)吸管鼻內(nèi)給藥。下表5表示5種不同的給藥組的組合物。對(duì)于給藥組l(見(jiàn)表2),使用包含小分子滲透增強(qiáng)劑的PYY臨床制劑。在這些研究中的小分子增強(qiáng)劑包括甲基-P環(huán)糊精、二癸酰基磷脂酰膽堿(DDPC)、禾口/或EDTA。給藥組2接受溶解在磷酸緩沖的鹽水(PBS)中的PYY。對(duì)于給藥組3-5，將不同濃度的PN159加到給藥組2中，以致給藥組3-5中的每一組由PYY,PN159和PBS組成。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>通過(guò)直接在耳緣靜脈進(jìn)行直接靜脈穿刺而收集連續(xù)的血液樣品(每份約2ml)，收集到含有EDTA作為抗凝血?jiǎng)┑难菏占苤小Ｔ诮o藥后0，2.5，5,10,15,30,45,60,和120分鐘收集血液樣品。收集血液之后，管子輕輕搖動(dòng)幾次，以抗凝血，然后加入50iil牛胰蛋白酶抑制劑溶液。在大約4°C以約1,600xg離心血液15分鐘，并且血漿樣品分配到一式兩份等分試樣中，并且在大約-7(TC冷凍保存。平均在一個(gè)處理組中的所有4只動(dòng)物，檢測(cè)下述PYY的血漿濃度(表3):表3<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>與組2(無(wú)增強(qiáng)劑)制劑比較，確定下述相對(duì)增強(qiáng)比例(表5):表5<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>前述數(shù)據(jù)圖表顯示在圖3中，并且表明，與小分子滲透增強(qiáng)劑比較，以PN159為例的本發(fā)明的滲透性肽能夠在體內(nèi)將人激素肽治療劑的鼻內(nèi)滲透增強(qiáng)到相等的或更大的程度。在50mM濃度觀察到所述肽的最大作用。100MM濃度導(dǎo)致稍低的滲透，盡管二者都導(dǎo)致比小分子滲透增強(qiáng)劑更高的滲透性。實(shí)施例4PN159對(duì)寡肽治療劑的滲透增強(qiáng)作用本實(shí)施例表明本發(fā)明的一種代表性肽，PN159增強(qiáng)一種環(huán)五肽，黑皮質(zhì)素4受體激動(dòng)劑(MC-4RA)，一種用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞受體的模式寡肽激動(dòng)劑的上皮滲透的功效。在這一實(shí)施例中，描述一種或多種滲透性肽與MC-4RA的組合。在這種情形中有用的制劑可以包括寡肽治療劑、滲透性肽和一種或多種其它滲透增強(qiáng)劑的組合。所述制劑還可以含有緩沖劑、張力劑、pH值調(diào)節(jié)劑、和肽/蛋白穩(wěn)定劑如氨基酸、糖或多元醇、聚合物、和鹽。在本研究中評(píng)估PN159對(duì)MC-4RA滲透的作用。MC-4RA是一種具有約1,100Da分子量的甲烷磺酸鹽，其調(diào)控MC-4受體的活性。評(píng)估的PN159濃度為5,25,50，和100pM。45mg/mlM-[3-CD用作所有制劑的穩(wěn)定劑，以獲得10mg/ml的肽濃度。評(píng)估PN159自身或與EDTA(l，2.5,5,或10mg/ml)組合的作用。制劑的pH值固定在4，并且摩爾滲透壓濃度為220mOsm/kg。HPLC方法通過(guò)RP-HPLC分析MC-4RA在基底外側(cè)部培養(yǎng)基中的濃度，所述RP-HPLC使用C18RP層析，流速lmL/分鐘，和柱溫25。C。溶劑A:在水中0.1%的TFA;溶劑B:在ACN中0.1%的TFA注射體積50pL檢領(lǐng)lj:220nm運(yùn)行時(shí)間15分鐘MC-4RA與5，25,50,禾B100)iMPN159組合，并且在pH值4和摩爾滲透壓濃度220mOsm/kg。使用體外上皮組織模型檢測(cè)所述組合，以通過(guò)MTT和LDH檢測(cè)而監(jiān)測(cè)PTH滲透、跨上皮電阻(TER)、和所述制劑的細(xì)胞毒性。MC-4RA滲透的研究結(jié)果顯示在圖4中。這些研究表明，除了增強(qiáng)肽激素治療劑的黏膜滲透之外，PN159還顯著增強(qiáng)寡肽治療劑的上皮滲透。實(shí)施例5PN159對(duì)小分子藥物的滲透增強(qiáng)作用本實(shí)施例表明本發(fā)明的一種代表性肽，PN159增強(qiáng)以乙酰膽堿酯酶(ACE)抑制劑加蘭他敏為例的小分子藥物的上皮滲透的功效。在本實(shí)施例中，描述一種或多種滲透性肽與小分子藥物的組合。在這種情形中有用的制劑可以包括小分子藥物、滲透性肽、和一種或多種其他滲透增強(qiáng)劑的組合。所述制劑還可以包含緩沖劑、張力劑、pH值調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑和/或防腐劑。本發(fā)明將加蘭他敏與PN159組合，以增強(qiáng)加蘭他敏穿過(guò)鼻黏膜的滲透。由于加蘭他敏是一種可以獨(dú)立地透過(guò)鼻上皮膜的小分子，所以這種藥物滲透的增加是出乎意料的。因此，通過(guò)加入增強(qiáng)肽滲透的賦形劑而介導(dǎo)的加蘭他敏通過(guò)上皮滲透的顯著增強(qiáng)作用是令人驚訝的，這是基于通常沒(méi)有預(yù)計(jì)到所述賦形劑顯著增加加蘭他敏穿過(guò)上皮組織層的滲透。因此，本發(fā)明將通過(guò)增加它們的生物利用度而促進(jìn)加蘭他敏及其它小分子藥物的鼻遞送。在本研究中，40mg/ml乳酸鹽形式的加蘭他敏與25，50，和100PN159在溶液中、pH5.0和摩爾滲透壓濃度270mOsm組合。使用體外上皮組織模型檢測(cè)所述組合，以通過(guò)上文所述的LDH和MTT檢測(cè)而監(jiān)測(cè)加蘭他敏滲透、跨上皮電阻(TER)、和所述制劑的細(xì)胞毒性。加蘭他敏的滲透檢測(cè)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)HPLC分析進(jìn)行，如下。HPLC分析應(yīng)用無(wú)梯度LC(WatersAlliance(沃特斯聯(lián)合))方法和UV檢測(cè)，確定制劑中和在基底外側(cè)培養(yǎng)基(滲透樣品)中的加蘭他敏濃度。柱沃特斯對(duì)稱柱(WatersSymmetryShield)，C18,5pm，25x0.46cm流動(dòng)相在50mM甲酸銨中的5%ACN，pH3.0流速1ml/分鐘柱溫30°C校準(zhǔn)曲線0-400ng/ml溴化加蘭他敏檢測(cè)在285nm的紫外線(UV)基于前述研究，PN159提高小分子的跨黏膜遞送。加蘭他敏被選作模型低分子量藥物，并且認(rèn)為這一分子的結(jié)果是用于其它小分子藥物的滲透性肽活性的預(yù)期。為了評(píng)估這種情形中的滲透性活性，將40mg/ml乳酸鹽形式的加蘭他敏與25,50，和100(iMPN159在溶液中、pH5.0和摩爾滲透壓濃度270mOsm組合。使用體外上皮組織模型檢測(cè)所述組合，以通過(guò)LDH和MTT檢測(cè)而監(jiān)測(cè)加蘭他敏滲透、跨上皮電阻(TER)、和所述制劑的細(xì)胞毒性。在所述體外組織模型中，加入PN159導(dǎo)致藥物穿過(guò)細(xì)胞屏障的滲透的顯著增加。具體地，在40mg/ml加蘭他敏的Papp中存在2.5—3.5倍的增加。(圖5)在加蘭他敏存在下，PN159減少TER，正如實(shí)施例II中所述。在所有檢測(cè)濃度的乳酸加蘭他敏和PN159存在下，細(xì)胞存活能力保持高(>80%)。相反，如通過(guò)LDH檢測(cè)的，在存在PN159和乳酸加蘭他敏時(shí)，細(xì)胞毒性低。這些檢測(cè)都表明PN159對(duì)上皮膜沒(méi)有毒性?？偨Y(jié)上述結(jié)果，本文己經(jīng)表明PN159令人驚訝地增加作為模型低分子量藥物的加蘭他敏的上皮滲透。將PN159加入到加蘭他敏溶液中顯著增強(qiáng)加蘭他敏穿過(guò)上皮細(xì)胞單層的滲透。證據(jù)表明PN159暫時(shí)減少穿過(guò)上皮膜的TER，而沒(méi)有損壞膜中的細(xì)胞，如通過(guò)高細(xì)胞存活能力和低細(xì)胞毒性所測(cè)定那樣。因此，PN159是一種在體內(nèi)增強(qiáng)加蘭他敏及其它小分子藥物的生物利用度的代表性肽，其通過(guò)在本文中使用體外模型證明的相同的機(jī)制而增強(qiáng)。迸一步預(yù)測(cè)到PN159還在更高的濃度增強(qiáng)加蘭他敏的滲透?；瘜W(xué)穩(wěn)定性在治療相關(guān)的儲(chǔ)存條件下確定PN159的化學(xué)穩(wěn)定性。應(yīng)用表示穩(wěn)定性的HPLC方法。溶液(50mM)保存在不同的pH值(4.0,7.3,和9.0)和溫度(5。C，25。C,35°C,40°C,和50。C)條件下。在pH值4的樣品含有10mM檸檬酸緩沖液。在pH值7.3和9.0的樣品含有10mM磷酸緩沖液。典型的儲(chǔ)存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)(包括阿倫尼烏斯作圖法(Arrheniusplot))顯示在圖6中?？梢钥闯觯诘蜏囟群蚿H值PN159在化學(xué)上是最穩(wěn)定的。例如，在5"C和pH4.0或pH7.3，對(duì)于6個(gè)月的儲(chǔ)存，存在基本上100%的PN159恢復(fù)。當(dāng)保存溫度升高到25'C時(shí)，6個(gè)月后，對(duì)于在pH4或pH7的樣品分別存在7%和26%的天然PN159損失。在pH9和/或升高的溫度，例如，40-50°C，跟著發(fā)生PN159的快速消耗。4.0-7.3的pH值范圍和冷凍到環(huán)境溫度的溫度范圍對(duì)于鼻內(nèi)制劑是最相關(guān)的。因此，這些數(shù)據(jù)支持PN159可以在與IN制劑相關(guān)的儲(chǔ)存條件下保持化學(xué)完整性。在藥物相對(duì)時(shí)間滲透的速率中存在顯著的增加。這些數(shù)據(jù)用來(lái)計(jì)算滲透性常數(shù)(P，)，顯示在表6中。表6使用體外組織模型檢測(cè)的P;<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>pH為5.0。在不存在PN159時(shí)，加蘭他敏的Papp為約2.1xlO"cm/s。當(dāng)存在25,50禾口100mMPN159時(shí)，P叩p分別為5.1x1(T6,6.2xl(T6，和7,2x10-6cm/s。因此，在這種模式低分子量藥物的P，中，PN159提供2.4-到3.4-倍的增加。己經(jīng)確定PN159用于低分子量化合物跨黏膜制劑的用途，重要地是辨別這些觀察是否能夠外推到更大的分子，例如治療性肽和蛋白。為了這一目的，在不存在和存在25，50,和100mMPN159時(shí)，對(duì)作為模式治療肽的鮭魚降鈣素進(jìn)行體外組織研究。當(dāng)不存在PN159時(shí)，對(duì)于降鈣素的Papp為約Ixl0'7cm/S，低于加蘭他敏的P叩p約一個(gè)數(shù)量級(jí)，推測(cè)這是由于分子量的不同導(dǎo)致的。當(dāng)存在PN159時(shí)，數(shù)據(jù)表明降鈣素滲透的顯著增加，與只有降鈣素的情形相比，在Papp中達(dá)到23-到47-倍增加(表6)。為了研究這些發(fā)現(xiàn)的普遍性，在不存在和存在PN159時(shí)，在所述體外模型中檢驗(yàn)兩種其它的肽，即人甲狀旁腺激素l-34(PTHw4)和人肽YY3-36(PYY3_36)(Papp數(shù)據(jù)顯示在表6中)。當(dāng)不存在PN"9時(shí)，這兩種肽的Papp與降鈣素的Papp—致。在PTHw4的情形中，PN159的存在在Papp中提供約3-5倍的增加。當(dāng)在PN159存在下配制PYY3.36時(shí)，Papp增加約12-到17-倍。這些數(shù)據(jù)證實(shí)我們的發(fā)現(xiàn)一一PN159具有增強(qiáng)跨黏膜藥物遞送的用途一一的普遍性。實(shí)施例6PN159的D-氨基酸形式合成并且純化在表7中列出的D-氨基酸取代的PN159肽，并且使用在上述實(shí)施例中所述的方法檢測(cè)它們?cè)鰪?qiáng)TER和滲透性的能力。表7D-氨基酸取代<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>PN407表現(xiàn)出較小但是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的滲透性提高。所有的D和反逆反(retroinverso)形式的PN159都表現(xiàn)出減小的TER恢復(fù)，這表明可以用于體內(nèi)遞送的更長(zhǎng)的TER減小作用。隨機(jī)D取代(PN434)可以在TER減小和滲透性增強(qiáng)二者上引起無(wú)效活性。實(shí)施例7PN159長(zhǎng)度變化合成并且純化在表8中列出的具有長(zhǎng)度變化的PN159肽，并且使用在上述實(shí)施例中所述的方法檢測(cè)它們?cè)鰪?qiáng)TER和滲透性的能力。表8不同大小<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>*來(lái)自多次重復(fù)的平均值結(jié)果表明，PN159的長(zhǎng)度對(duì)于其TER減少和增強(qiáng)的滲透性活性很重要。將PN159延長(zhǎng)到20個(gè)氨基酸增加TER減少作用但是減小滲透性作用。TER恢復(fù)更緩慢。將PN159縮短到16個(gè)氨基酸對(duì)TER減少?zèng)]有作用，但是減小滲透性作用。將PN159縮短到14個(gè)氨基酸顯著減小滲透性，這表明PN159的長(zhǎng)度對(duì)滲透性非常重要。與滲透性作用相反，PN159長(zhǎng)度對(duì)TER減少的作用更緩和。實(shí)施例8PN159中的色氨酸和精氨酸取代合成并且純化在表9中列出的具有氨基酸取代的PN159肽，并且使用在上述實(shí)施例中所述的方法檢測(cè)它們?cè)鰪?qiáng)TER和滲透性的能力。表9氨基酸取代<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>結(jié)果表明，精氨酸胍頭部基團(tuán)(headgrcmp)比賴氨酸和組氨酸更有效。色氨酸是水-膜界面上的優(yōu)選氨基酸。PN407對(duì)滲透性表現(xiàn)出較小但是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的提高。精氨酸取代賴氨酸顯著減小滲透性，但是對(duì)TER減少有很少影響，這表明賴氨酸的重要性是滲透性。在氨基酸10用天冬酰胺單一取代丙氨酸消除了滲透性，這表明a螺旋對(duì)PN159活性的重要性。實(shí)施例9PN159中的疏水性變化合成并且純化在表10中列出的具有氨基酸取代的PN159肽，并且使用在上述實(shí)施例中所述的方法檢測(cè)它們?cè)鰪?qiáng)TER和滲透性的能力。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>*來(lái)自多次重復(fù)的平均值PN159具有280。的疏水面。結(jié)果表明，疏水面的減小可以引起PN159活性的減小。PN159的兩親性對(duì)于它的活性也是重要的。體外方法和方案測(cè)定每一TJMP的跨上皮電阻(TER)、TER恢復(fù)、細(xì)胞毒性(LDH)和樣品滲透(EIA)。用于每種檢測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)條件和方案在下文中詳細(xì)闡釋。實(shí)施例10體外方法和方案緊密連接調(diào)控肽或TJMPs是這樣的肽，S卩，所述肽能夠以在上皮細(xì)胞之間產(chǎn)生開孔的作用損害(compromising)緊密連接的完整性并且因此減少上皮的屏障功能?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)樣品透過(guò)人鼻上皮組織模型系統(tǒng)的電阻和程度水平，而體外檢測(cè)緊密連接完整性的狀態(tài)。電阻的減少和增強(qiáng)的滲透表明，緊密連接已被損害，并且已在上皮細(xì)胞之間產(chǎn)生開孔。有效地，將誘導(dǎo)可檢測(cè)的叫作(TER)減少的穿過(guò)組織膜電阻的減少，并且促進(jìn)小分子通過(guò)組織膜的增強(qiáng)的滲透的肽分類為TJMPs。另外，還評(píng)估關(guān)于TJMPs的細(xì)胞毒性水平，以確定這些肽是否能夠在藥物穿過(guò)黏膜表面的遞送例如鼻內(nèi)(IN)藥物遞送中作用為緊密連接調(diào)控肽。在本實(shí)施例中描述用于篩選本發(fā)明代表性的肽(參考實(shí)施例25的表23)的檢測(cè)。這些檢測(cè)包括跨上皮電阻(TER)、細(xì)胞毒性(LDH)、和樣品滲透。本實(shí)施例還描述所用的試劑和細(xì)胞培養(yǎng)條件。表11舉例說(shuō)明用于后續(xù)實(shí)施例中的樣品試劑。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>細(xì)胞培EpiAirway頂系統(tǒng)由馬特泰克(MatTek)公司(阿什蘭，MA)開發(fā)，作為內(nèi)襯于呼吸道的假?gòu)?fù)層上皮的模型。上皮細(xì)胞生長(zhǎng)在氣液界面處的以多孔膜為底的細(xì)胞培養(yǎng)插入物上，這導(dǎo)致細(xì)胞分化成高度極化的形態(tài)。頂面有纖毛，具有微絨毛超結(jié)構(gòu)，上皮產(chǎn)生粘液(通過(guò)免疫印跡已經(jīng)證實(shí)了粘蛋白的存在)。在運(yùn)輸前約3周在工廠將細(xì)胞鋪在插入物上。在實(shí)驗(yàn)開始前那天收到EpiAirwayTM培養(yǎng)膜。它們?cè)诓缓蛹t和不含氫化可的松的杜爾貝科(DuIbecco's)改良的Eage培養(yǎng)基(DMEM)中運(yùn)輸。細(xì)胞有纖毛并且是假?gòu)?fù)層的，在包括聚碳酸酯過(guò)濾系統(tǒng)的密斯博(Millipore)多篩(Multiscreen)Caco-296-孔檢測(cè)系統(tǒng)上生長(zhǎng)至匯合。當(dāng)收到時(shí)，插入物系統(tǒng)未開封在4"C保存，和/或在使用前在每孔250nl基本培養(yǎng)基(不含酚紅和不含氫化可的松的杜爾貝科改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM))中在37°C/5%C02培養(yǎng)24小時(shí)。這種模型系統(tǒng)用來(lái)評(píng)估TJMPs調(diào)控TEER、影響細(xì)胞毒性和提高上皮細(xì)胞單層的滲透的功效。馬特泰克(MatTek)公司(阿什蘭,MA)的細(xì)胞系是正常的、來(lái)源于人的氣管/支氣管上皮細(xì)胞(EpiAirwayTM組織模型)的來(lái)源。提供細(xì)胞為插入物，其在包括透明的親水性特氟隆(PTFE)的密斯博(Millipore)小室(Milicdl)-CM濾器上生長(zhǎng)至匯合。當(dāng)收到時(shí)，在使用之前將所述膜在lml基本培養(yǎng)基(不含酚紅和不含氫化可的松的杜爾貝科改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM))中在37。C/5n/。C02培養(yǎng)24-48小時(shí)。給插入物在恢復(fù)的每一天提供營(yíng)養(yǎng)。將Madin-Darbey犬腎細(xì)胞(MDCK)、人腸上皮細(xì)胞(Caco-2)和人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE14o-)的細(xì)胞接種在來(lái)自密斯博的多篩(Multi-Screen)Caco-296-孔插入物上。這些細(xì)胞作為單層并且在與EpiAirway上皮細(xì)胞相似的條件下生長(zhǎng)。肽合成使用諾瓦生物化學(xué)(NovaBiochem)TGR樹脂以50微摩爾的規(guī)模在RaininSymphony合成儀上進(jìn)行肽合成。通過(guò)用20%的在DMF中的哌啶處理兩次，IO分鐘而進(jìn)行去保護(hù)作用。去保護(hù)后，將樹脂用10mL含有5%HOBt的DMF洗滌一次(30s)，并且用10mLDMF洗滌4次(30s)。通過(guò)將5倍過(guò)量的在DMF中的Fmoc氨基酸遞送到反應(yīng)容器中然后遞送等體積的激活劑溶液，所述激活劑溶液含有6.25倍過(guò)量的N-甲基嗎啉和5倍過(guò)量的HCTU，而進(jìn)行偶聯(lián)。在合成過(guò)程中應(yīng)用40分鐘的偶聯(lián)時(shí)間。在第一次偶聯(lián)反應(yīng)后，在開始第二次偶聯(lián)步驟之前，將樹脂用10mLDMF洗滌兩次(30s)。對(duì)于PEG化的肽，當(dāng)完成肽合成時(shí)，去除N端Fmoc基團(tuán)，并且人工向反應(yīng)容器中加入2當(dāng)量的在DMF中的0-(N-Fmoc-2-氨基乙基)-0'-(2-羧基乙基)-十一亞乙基二醇。盡管以人工方式，但是將2當(dāng)量的激活劑溶液遞送到反應(yīng)容器中，并且允許偶聯(lián)過(guò)夜進(jìn)行。通常，獲得大于97%的偶聯(lián)效率，并且任何未反應(yīng)的肽通過(guò)乙酸酐封端。通過(guò)遞送10mL含有2.5%TIS、2.5%水的TFA然后輕輕氮攪動(dòng)3小時(shí)，在單個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行裂解。將裂解溶液自動(dòng)收集到圓錐管中，合并在一起，并且通過(guò)在減壓下蒸發(fā)而減小體積。將得到的溶液用過(guò)量的冰冷的醚研磨，過(guò)濾并且用冰冷的醚徹底洗滌。干燥后，粗肽吸收在密斯博(Millipore)水中，并且凍干到干燥。FITC(熒光素-5-異硫氰酸酯)-葡聚糖滲透檢測(cè)使用分子量3000的FITC標(biāo)記的葡聚糖(FD3)來(lái)評(píng)估個(gè)體TJMP對(duì)上皮細(xì)胞單層滲透的作用。將組織插入物平板轉(zhuǎn)移到含有200m1DPBS+十作為基本培養(yǎng)基的96-孔接收平板上。每個(gè)組織培養(yǎng)插入物的頂面用20^1單一檢測(cè)制劑樣品(關(guān)于檢測(cè)制劑的詳情參考實(shí)施例25的表24)在37t:在黑暗中在振蕩器(100rpm)上溫育1個(gè)小時(shí)。在1個(gè)小時(shí)的溫育時(shí)間后，從每個(gè)組織培養(yǎng)插入物采集在下面的基本培養(yǎng)基樣品，并且暫時(shí)在室溫下保存在暗處，直到通過(guò)熒光光譜學(xué)量化FD3水平。關(guān)于FD3測(cè)量，將150pl基本培養(yǎng)基樣品轉(zhuǎn)移到黑的、清楚的底部的96-孔平板中。使用來(lái)自博奧泰克儀器(BiotekInstrument)的FLx800熒光平板讀數(shù)儀測(cè)量在485/20激發(fā)后在528/20的熒光發(fā)射。滲透計(jì)算為%滲透=i^i^x腦表觀滲透性(Papp),cm/sec=定義的關(guān)于滲透的式術(shù)語(yǔ)-Cb:基底外側(cè)部濃度Ca:頂部濃度Vb:基底外側(cè)部體積Va:頂部體積SA:濾器表面積dt:實(shí)耗時(shí)間每個(gè)組織插入物置于含有1m馬特泰克(MatTek)基本培養(yǎng)基的單個(gè)孔中。在插入物的頂面，按照研究設(shè)計(jì)將應(yīng)用25ial檢測(cè)制劑，并且將樣品放置在振蕩器(100rpm)上在37°C1.5小時(shí)。將FITC-標(biāo)記的葡聚糖溶液頂部加入到插入物中，并且在溫育時(shí)間后從基底外側(cè)培養(yǎng)基進(jìn)行熒光測(cè)量。FITC-葡聚糖的濃度表示為應(yīng)用到細(xì)胞上的起始物質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。具有分子量4000(MW4000)的FITC標(biāo)記的葡聚糖用來(lái)評(píng)估關(guān)于個(gè)體TJMP滲透的負(fù)荷(cargo)大小限制。注意，可以獲得各種大小的FITC標(biāo)記的葡聚糖，以進(jìn)行大小限制性研究?？缟掀る娮?TER)和TER恢復(fù)使用與具有電極導(dǎo)線的EVOM上皮細(xì)胞伏特歐姆表(世界精密儀器(WorldPrecisionInstruments),薩拉索塔，F(xiàn)L)連接的Endohm-12組織電阻測(cè)量室，完成TER檢測(cè)。在檢驗(yàn)校準(zhǔn)前，關(guān)閉電源，將電極和組織培養(yǎng)空白插入物在馬特泰克(MatTek)培養(yǎng)基中平衡至少20分鐘。用Endohm組織室中的1.5ml培養(yǎng)基和空白插入物中的300pi培養(yǎng)基測(cè)量背景電阻。這樣調(diào)整頂部電極，以致其正好接近，但不接觸插入物膜頂面?？瞻撞迦胛锏谋尘半娮钁?yīng)該為約5-20歐姆。對(duì)于每次TER測(cè)定，將300pl馬特泰克(MatTek)培養(yǎng)基加入到插入物中，然后置于在Endohm室中。所有的TER值報(bào)道為組織表面積的函數(shù)。TER計(jì)算為TER=(R廣Rb)xA其中&是具有膜的插入物的電阻，Rb是空白插入物的電阻，并且A是膜的面積(0.6cm2)。TER值相對(duì)于對(duì)照值(對(duì)照=約1000歐姆-cm2;標(biāo)準(zhǔn)化到100)的減小表明細(xì)胞膜電阻的減小和黏膜上皮細(xì)胞滲透性的增加。對(duì)于TER恢復(fù)，在處理后第1,3，5,和21小時(shí)測(cè)量TER，s。TER百分?jǐn)?shù)計(jì)算為%TER=(TERT處理后/TERT0)/(TERT處理后/TERT0對(duì)于對(duì)照培養(yǎng)基)。在一些實(shí)施方案中，使用具有電極導(dǎo)線的REMS自動(dòng)取樣器(世界精密儀器(WorldPrecisionInstruments),薩拉索塔，F(xiàn)L)進(jìn)行TER測(cè)量。在檢驗(yàn)校準(zhǔn)前，關(guān)閉電源，將電極和組織培養(yǎng)空白插入物在馬特泰克(MatTek)Air-100TM培養(yǎng)基中平衡至少20分鐘。通過(guò)多次測(cè)量空白插入物平板，已經(jīng)確定插入物系統(tǒng)的背景電阻，并且將同一值用于在該平臺(tái)上的每次檢測(cè)。在將插入物與檢測(cè)制劑溫育前測(cè)量零時(shí)刻TER(TERO)。這樣調(diào)整頂部電極，以致其正好接近，但不接觸插入物膜的頂面?？瞻撞迦胛锏谋尘半娮钁?yīng)該為約5-20歐姆。對(duì)于每次TER測(cè)定，將100^馬特泰克(MatTek)Air-100TM培養(yǎng)基加入到插入物中，并且將250pi加入到基底孔中，然后置于Endohm室中。所有的TER值報(bào)道為組織表面積的函數(shù)。電阻表示為歐姆、m2和初始TER值的百分?jǐn)?shù)。TER值計(jì)算為標(biāo)準(zhǔn)電阻，Ohm*cm2=(7^;^一空^)*o.l2相對(duì)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage57</formula>定義的關(guān)于TER計(jì)算的式術(shù)語(yǔ)TERO:在零時(shí)刻的TER測(cè)量TERt:在檢測(cè)制劑溫育后在時(shí)刻t進(jìn)行的TER測(cè)量空白背景電阻測(cè)量TER值相對(duì)于對(duì)照值的減小表明細(xì)胞膜電阻的減小和黏膜上皮細(xì)胞滲透性的增加。細(xì)胞毒性(LDH測(cè)定)通過(guò)使用CytoTox96細(xì)胞毒性測(cè)定試劑盒(普洛麥格(Promega)公司,麥迪遜，威斯康星州)測(cè)量來(lái)自細(xì)胞的乳酸脫氫酶(LDH)的損失而測(cè)定細(xì)胞死亡量。將50微升樣品上樣到96孔測(cè)定平板上。新鮮的不含細(xì)胞的培養(yǎng)基用作空白。向每個(gè)孔中加入50pl底物溶液，并且將平板在黑暗中在室溫溫育30分鐘。溫育后，向每個(gè)孔中加入50nl終止溶液，并且將所述平板在光學(xué)密度平板讀數(shù)儀上在490nm讀數(shù)。釋放到基底外側(cè)培養(yǎng)基中的LDH測(cè)量表示樣品的相對(duì)細(xì)胞毒性。將具有0.3%辛基酚聚(乙二醇醚)x(TritonX-100)對(duì)照插入物作為100%裂解，允許LDH值表示為總裂解的百分?jǐn)?shù)。備選地，可以使用WST-1測(cè)定測(cè)量細(xì)胞毒性。WST-1測(cè)定基于線粒體代謝活性測(cè)量細(xì)胞存活能力。在肽處理、洗滌和在處理后IO分鐘TER測(cè)量后，將細(xì)胞單層的頂面用WST-1試劑(羅氏(Roche))在37'C溫育4個(gè)小時(shí)。使用微量平板讀數(shù)儀在OD450nm測(cè)量頂部細(xì)胞上清液。％值=樣品OD45(Z培養(yǎng)基對(duì)照OD450,o在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使用CytoTox96細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(普洛麥格(Promega)公司，麥迪遜，威斯康星州)檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)從細(xì)胞向頂部培養(yǎng)基中的釋放而測(cè)定細(xì)胞死亡量。稀釋在磷酸緩沖的鹽水(PBS)中的l。/。辛基酚聚(乙二醇醚)x(TritonX-100m)在培養(yǎng)的細(xì)胞中引起100%的裂解，并且在本文作為L(zhǎng)DH檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照。在用檢測(cè)制劑(關(guān)于檢測(cè)制劑的詳情參考實(shí)施例25的表24)溫育1個(gè)小時(shí)的時(shí)間后，用培養(yǎng)基將每個(gè)插入物的總液體體積達(dá)到200^的終體積。然后，通過(guò)用設(shè)定為100pl體積的多通道移液管吹吸4次，而將頂部培養(yǎng)基混合?；旌虾?，將來(lái)自每個(gè)插入物頂面的i00pl樣品轉(zhuǎn)移到新的96-孔平板中。將頂部培養(yǎng)基樣品用平板密封物密封，并且保存在室溫用于在同一天進(jìn)行分析，或者在4t:保存過(guò)夜用于第二天分析。為了檢測(cè)LDH水平，將100pl頂部培養(yǎng)基樣品中的5^在新的96-孔平板中稀釋在45nlDPBS中。將新鮮的不含細(xì)胞的培養(yǎng)基用作空白。向每個(gè)孔中加入50pl底物溶液，并且將其在室溫遠(yuǎn)離直接的光線溫育30分鐘。30分鐘溫育后，向每個(gè)孔中加入50^終止溶液。使用來(lái)自博奧泰克儀器(BiotekInstruments)的uQuant吸收平板讀數(shù)儀檢測(cè)在490nm的光密度(OD)。釋放到頂部培養(yǎng)基中的LDH檢測(cè)表示樣品的相對(duì)細(xì)胞毒性。通過(guò)從測(cè)定的個(gè)體檢測(cè)制劑的吸光度減去測(cè)定的PBS對(duì)照的吸光度(LDH釋放的基底水平)，然后將所述值除以對(duì)于1%TritonX-10()TM陽(yáng)性對(duì)照所測(cè)量的吸光度，乘以IOO，而計(jì)算每種檢測(cè)制劑的細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)。用于計(jì)算細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)的式如下相對(duì)細(xì)胞毒性,％=隱—，、100摩爾滲透壓濃度通過(guò)來(lái)自高級(jí)儀器公司(AdvancedInstrumentsInc.)(諾伍德，馬薩諸塞州)的模型20200檢測(cè)樣品。實(shí)施例11在體外調(diào)控上皮緊密連接并且增強(qiáng)上皮細(xì)胞層滲透的肽表12顯示在體外調(diào)控緊密連接蛋白并且增強(qiáng)上皮細(xì)胞層滲透的11種肽的氨基酸序列，其通過(guò)TER檢測(cè)和滲透動(dòng)力學(xué)而測(cè)定。為了這些實(shí)施例的目的，由于它們相似的活性，所以選擇PN27代表PN27和PN28。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>PN159，PN202,PN27,和PN283減少TER超過(guò)90°/。，而PN161,PN250,PN228,PN73,和PN58減少TER達(dá)到82%-88%。PN28未顯示，但是它功能與Pn27相等。最后PN183具有55n/。的TER減少。這些數(shù)據(jù)表明所有檢測(cè)的TJMPs能夠在體外損害上皮細(xì)胞緊密連接。另夕卜，進(jìn)行TER恢復(fù)分析以確定用TJMPs處理后EpitAirway上皮細(xì)胞層恢復(fù)的速率。令人吃驚地，結(jié)果表明，在所有檢測(cè)的TJMPs中，PN250，PN202,和PN161具有最快的恢復(fù)時(shí)間。這些數(shù)據(jù)表明TJMPs對(duì)上皮細(xì)胞層的作用本質(zhì)上是短暫的。實(shí)施例13緊密連接調(diào)控肽的體外滲透動(dòng)力學(xué)在本實(shí)施例中，檢測(cè)TJMPs調(diào)控EpiAirway上皮細(xì)胞滲透的作用。下表14顯示以滲透百分?jǐn)?shù)表示的每種TJMP的滲透動(dòng)力學(xué)總結(jié)。在所述表中突出的方格代表對(duì)于該TJMP在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)觀察到的最大程度的滲透。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>這些數(shù)據(jù)表明，所有檢測(cè)的TJMPS能夠在體外增強(qiáng)上皮細(xì)胞單層的滲透。通常，滲透性程度與肽減少TER的能力相關(guān)。實(shí)施例14緊密連接調(diào)控肽不會(huì)引起顯著的細(xì)胞毒性本實(shí)施例評(píng)估在暴露于TJMPs之后對(duì)上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。在用每種肽處理15分鐘和60分鐘之后進(jìn)行LDH撿測(cè)。在所有的情形中，在15分鐘處理后幾乎沒(méi)有觀察到LDH釋放。在60分鐘處理后，在所檢測(cè)的肽中細(xì)胞毒性水平不同，但是在可接受的水平之內(nèi)，這表明所有檢測(cè)的肽都不會(huì)引起顯著的細(xì)胞損傷。實(shí)施例15在所有檢測(cè)的上皮細(xì)胞類型中，緊密連接調(diào)控肽減少TER是一致的為了確定在EpitAirway上皮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中觀察到的TER結(jié)果是否代表其他上皮細(xì)胞類型，將MDCK,Caco-2，和16HBE14o-細(xì)胞用TJMps處理，并且檢測(cè)TER。在所有情形中，使用這些細(xì)胞類型觀察到的TER結(jié)果與使用EpiAirway上皮細(xì)胞觀察到的TER結(jié)果一致，這表明這些TJMPs具有減少所有上皮細(xì)胞類型中的TER的能力。實(shí)施例16基于表現(xiàn)排列緊密連接調(diào)控肽排列9種TJMPs，并且按照在表15中顯示的它們的滲透性水平、TER值、TER恢復(fù)速率和細(xì)胞毒性，而將其分成4種不同的表現(xiàn)等級(jí)。表15中不包括PN183和PN28。下表總結(jié)在用所述肽處理EpiAirway上皮細(xì)胞15分鐘后和用所述肽處理EpitAirway上皮細(xì)胞60分鐘后，每種TJMPs的最佳濃度(即，與最高滲透性水平相關(guān)的最大程度的TER減少并且不表現(xiàn)出顯著細(xì)胞毒性)和相對(duì)應(yīng)的滲透百分?jǐn)?shù)。另外，對(duì)每種肽顯示關(guān)于15分鐘和60分鐘處理的LDH值(細(xì)胞毒性)。還顯示TER恢復(fù)。TER恢復(fù)速率與斜率值直接相關(guān)(即，更大的斜率值與更快的TER恢復(fù)相關(guān))。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>實(shí)施例17緊密連接調(diào)控肽增強(qiáng)FITC-葡聚糖MW4000穿過(guò)上皮細(xì)胞單層的滲透在本實(shí)施例中，進(jìn)行研究以確定存在每種TJMP時(shí)FITC-葡聚糖MW4000的滲透動(dòng)力學(xué)。這一實(shí)驗(yàn)評(píng)估滲透是否取決于肽與上皮細(xì)胞單層一起溫育的時(shí)間，以及滲透是否是負(fù)荷大小依賴性的。在用TJMP和FITC-葡聚糖MW4000處理細(xì)胞15分鐘后以及處理細(xì)胞60分鐘后檢測(cè)細(xì)胞滲透(圖7)。PYY制劑用作陽(yáng)性對(duì)照，并且磷酸緩沖鹽水(PBS)用作陰性對(duì)照。在表現(xiàn)出與最高滲透性水平相關(guān)的最大TER減少程度并且不表現(xiàn)顯著的細(xì)胞毒性的濃度檢測(cè)所述肽。對(duì)于同一種TJMP，60分鐘的處理表現(xiàn)出比15分鐘的處理顯著更高的滲透程度。令人吃驚地，PN161，PN127，和PN228表現(xiàn)出與PN159相等的滲透水平(大約7.5。/。)。在與細(xì)胞溫育60分鐘后，TJMPsPN250,PN283:PN202,PN58獲得大約5%的滲透，所述滲透恰好沒(méi)有達(dá)到通過(guò)PN161,PN127，PN228和PN159獲得的滲透。這些數(shù)據(jù)表明，所有檢測(cè)的TJMPs都能夠增強(qiáng)FITC-葡聚糖MW4000的滲透，并且這種增強(qiáng)作用取決于肽與上皮細(xì)胞層接觸時(shí)間的長(zhǎng)短。上述實(shí)驗(yàn)證明，所檢測(cè)的TJMPs能夠在體外增強(qiáng)上皮細(xì)胞單層的滲透。實(shí)施例18緊密連接調(diào)控肽在體外增強(qiáng)滲透性與在體內(nèi)觀察到的增強(qiáng)的滲透翕度相關(guān)進(jìn)行線性回歸分析，以確定在體外EpiAirway上皮細(xì)胞模型系統(tǒng)中觀察到的TJMP滲透動(dòng)力學(xué)是否與對(duì)于同一種TJMP觀察到的體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)相關(guān)。為了確定體外滲透數(shù)據(jù)是否作為體內(nèi)效果的良好的指示，將從使用PYY和TJMPs進(jìn)行的體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究獲得的曲線下面積-最終(last)值(AUC-last)針對(duì)使用PYY和TJMPs進(jìn)行的體外上皮細(xì)胞單層滲透研究繪圖。體外滲透表示為百分?jǐn)?shù)，而AUC-last(AUC-最終)表示為分鐘*§/1111。關(guān)于10種不同的TJMPs的體外和體內(nèi)研究進(jìn)行繪圖，并且進(jìn)行線性回歸。得到0.82的R^直(82%相關(guān)性)，這表明對(duì)于來(lái)源于體內(nèi)的AUC值和體外觀察的滲透性百分?jǐn)?shù)存在高度的相關(guān)性。令人驚訝地，當(dāng)排除檢測(cè)間(inter-assay)可變性時(shí)，得到0.996的R"直(基本上100%)，這表明在體外滲透性和體內(nèi)效果之間存在直接的相關(guān)性。因此，體外滲透可以用來(lái)預(yù)測(cè)體內(nèi)效果。實(shí)施例19TJMP對(duì)肽激素治療劑的體內(nèi)滲透增強(qiáng)作用等于或者超過(guò)小分子滲透增強(qiáng)劑的增強(qiáng)作用將20只3—6月齡并且重2.1—3.0kg的雄性新西蘭白兔隨機(jī)分成5個(gè)處理組，每組4只動(dòng)物。將測(cè)試動(dòng)物以15pl/kg并且通過(guò)吸管鼻內(nèi)給藥。下表19表示5種不同的給藥組的組成。對(duì)于給藥組1(見(jiàn)表16)，使用包含小分子滲透增強(qiáng)劑的PYY臨床制劑。在這些研究中的小分子增強(qiáng)劑包括甲基-p-環(huán)糊精、二癸酰基磷脂酰膽堿(DDPC)、禾卩/或EDTA。給藥組2接受溶解在磷酸緩沖鹽水(PBS)中的PYY。對(duì)于給藥組3-5，將不同濃度的PN159加到給藥組2中，以致給藥組3-5中的每一組由PYY,PN159和PBS組成<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>通過(guò)直接在耳緣靜脈進(jìn)行直接靜脈穿刺而收集連續(xù)的血液樣品(每份約2ml)，收集到含有EDTA作為抗凝血?jiǎng)┑难菏占苤?。在給藥后0，2.55,10,15,30，45，60，和120分鐘收集血液樣品。收集血液之后，管子輕輕搖動(dòng)幾次，以抗凝血，然后加入50^牛胰蛋白酶抑制劑溶液。在大約4°C以約1，600xg離心血液15分鐘，并且將血漿樣品分配到一式兩份等分試樣中，并且在大約-7(TC冷凍保存。平均在一個(gè)處理組中的所有4只動(dòng)物，檢測(cè)下述PYY的血漿濃度(表17):表17<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>從上述數(shù)據(jù)計(jì)算的藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)顯示在下表18中:表18<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>與組2(無(wú)增強(qiáng)劑)制劑比較，確定下述相對(duì)增強(qiáng)比例(表19):表19<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>前述數(shù)據(jù)表明，與小分子滲透增強(qiáng)劑比較，TJMP在體內(nèi)將人激素肽治療劑的鼻內(nèi)滲透增強(qiáng)到相等的或更大的程度。在50^M濃度觀察到所述肽的最大作用。100pM濃度導(dǎo)致稍低的滲透，盡管二者都導(dǎo)致比小分子滲透增強(qiáng)劑更高的滲透性。實(shí)施例20TJMP對(duì)寡肽治療劑的滲透增強(qiáng)作用本實(shí)施例表明本發(fā)明的一種代表性肽，PN159增強(qiáng)一種環(huán)五肽，黑皮質(zhì)素-4受體激動(dòng)劑(MC-4RA)，一種用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞受體的模式寡肽激動(dòng)劑，的上皮細(xì)胞滲透的功效。在這一實(shí)施例中，描述一種或多種滲透性肽與MC-4RA的組合。在這種情形中有用的制劑包括寡肽治療劑、滲透性肽和一種或多種其它滲透增強(qiáng)劑的組合。所述制劑還可以含有緩沖劑、張力劑、pH值調(diào)節(jié)劑、和肽/蛋白穩(wěn)定劑如氨基酸、糖或多元醇、聚合物、和鹽。在本研究中評(píng)估PN159對(duì)MC-4RA滲透的作用。MC-4RA是一種具有約1,100Da分子量的甲烷磺酸鹽，其調(diào)控MC-4受體的活性。評(píng)估的PN159濃度為5,25,50,和100pM。45mg/mlM-P-CD用作所有制劑的增溶齊U，以獲得10mg/ml的肽濃度。評(píng)估PN159自身或與EDTA(l，2.5，5,或10mg/ml)組合的作用。制劑的pH值固定在4，并且摩爾滲透壓濃度為220mOsm/kg。HPLC方法通過(guò)RP-HPLC分析MC-4RA在基底外側(cè)部培養(yǎng)基中的濃度，所述RP-HPLC使用C18RP層析，流速lmL/分鐘，和柱溫25'C。溶劑A:在水中0.1%的TFA;溶劑B:在ACN中0.1%的TFA注射體積50juL檢測(cè)220nm運(yùn)行時(shí)間15分鐘MC-4RA與5，25,50,禾n100pMPN159組合，并且在pH值4和摩爾滲透壓濃度220mOsm/kg。使用體外上皮組織模型檢測(cè)所述組合，以通過(guò)MTT和LDH檢測(cè)而監(jiān)測(cè)PTH滲透、跨上皮電阻(TER)、和所述制劑的細(xì)胞毒性。MC-4RA滲透的研究結(jié)果表明，該TJMP，除了增強(qiáng)肽激素治療劑的黏膜滲透之外，還顯著增強(qiáng)寡肽治療劑的上皮滲透。實(shí)施例21TJMP對(duì)小分子藥物的滲透增強(qiáng)作用本實(shí)施例表明本發(fā)明的一種代表性肽，PN159增強(qiáng)以乙酰膽堿酯酶(ACE)抑制劑加蘭他敏為例的小分子藥物的上皮滲透的功效。在本實(shí)施例中，描述一種或多種滲透性肽與小分子藥物的組合。在這種情形中有用的制劑可以包括小分子藥物、滲透性肽、和一種或多種其它滲透增強(qiáng)劑的組合。所述制劑還可以包含緩沖劑、張力劑、pH值調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑和/或防腐劑。本發(fā)明將加蘭他敏與PN159組合，以增強(qiáng)加蘭他敏穿過(guò)鼻黏膜的滲透。由于加蘭他敏是一種可以獨(dú)立地透過(guò)鼻上皮膜的小分子，所以這種藥物滲透的增加是出乎意料的。因此，通過(guò)加入增強(qiáng)肽滲透性的賦形劑而介導(dǎo)的加蘭他敏通過(guò)上皮滲透的顯著增強(qiáng)作用是令人驚訝的，這是基于通常沒(méi)有預(yù)計(jì)到所述賦形劑顯著增加加蘭他敏穿過(guò)上皮組織層的滲透。因此，本發(fā)明將通過(guò)增加它們的生物利用度而促進(jìn)加蘭他敏及其它小分子藥物的鼻遞送。在本研究中，40mg/ml乳酸鹽形式的加蘭他敏與25,50，和100PN159在溶液，pH5.0和摩爾滲透壓濃度270mOsm中組合。使用體外上皮組織模型檢測(cè)所述組合，以通過(guò)上文所述的LDH和MTT檢測(cè)而監(jiān)測(cè)加蘭他敏滲透、跨上皮電阻(TER)、和所述制劑的細(xì)胞毒性。加蘭他敏的滲透檢測(cè)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)HPLC分析進(jìn)行，如下。HPLC分析應(yīng)用無(wú)梯度LC(WatersAlliance(沃特斯聯(lián)合))方法和UV檢測(cè)，確定制劑中和在基底外側(cè)培養(yǎng)基(滲透樣品)中的加蘭他敏濃度。柱沃特斯對(duì)稱柱(WatersSymmetryShield)，C18，5um,25x0.46cm流動(dòng)相在50mM甲酸銨中的5%ACN,pH3.0流速1ml/分鐘柱溫30°C校準(zhǔn)曲線0-400ng/ml溴化加蘭他敏檢測(cè)在285nm的紫外線(UV)基于前述研究，PN159提高小分子的跨黏膜遞送。選擇加蘭他敏作為模型低分子量藥物，并且認(rèn)為這一分子的結(jié)果是用于其它小分子藥物的滲透性肽活性的預(yù)測(cè)。為了評(píng)估這種情形中的滲透性活性，將40mg/ml乳酸鹽形式的加蘭他敏與25，50，和100pMPN159在溶液，pH5.0和摩爾滲透壓濃度270mOsm中組合。使用體外上皮組織模型檢測(cè)所述組合，以通過(guò)LDH和MTT檢測(cè)而監(jiān)測(cè)加蘭他敏滲透、跨上皮電阻(TER)、和所述制劑的細(xì)胞毒性。在所述體外組織模型中，加入PN159導(dǎo)致藥物穿過(guò)細(xì)胞屏障的滲透的顯著增加。具體地，在40mg/ml加蘭他敏的Papp中存在2.5—3.5倍的增加。在加蘭他敏存在下，PN159減少TER，正如前述實(shí)施例中所述。在所有檢測(cè)濃度的乳酸加蘭他敏和PN159存在下，細(xì)胞存活能力保持較高(>80%)。相反，如通過(guò)LDH所檢測(cè)，在存在PN159和乳酸加蘭他敏時(shí)，細(xì)胞毒性較低。這些檢測(cè)都表明PN159對(duì)上皮膜沒(méi)有毒性。在不存在PN159時(shí)，加蘭他敏的Papp為約2.1xlO"cm/s。當(dāng)存在25，50和100mMPN159時(shí)，P卿分別為5.1x10_6,6.2x10_6,和7.2xl(T6cm/s。因此，在這種模型低分子量藥物的Papp中，PN159提供2.4-至3.4-倍的增加。TJMP令人驚訝地增加作為模型低分子量藥物的加蘭他敏的上皮滲透。將PN159加入到加蘭他敏溶液中顯著增強(qiáng)加蘭他敏穿過(guò)上皮細(xì)胞單層的滲透。證據(jù)表明PN159暫時(shí)減少穿過(guò)上皮膜的TER，而沒(méi)有損壞膜中的細(xì)胞，如通過(guò)高細(xì)胞存活能力和低細(xì)胞毒性所測(cè)定那樣。TJMP在體內(nèi)增強(qiáng)加蘭他敏及其它小分子藥物的生物利用度，其通過(guò)在本文中使用體外模型證明的相同的機(jī)制而增強(qiáng)。進(jìn)一步預(yù)測(cè)到TJMP還在更高的濃度增強(qiáng)加蘭他敏的滲透。實(shí)施例22TJMP對(duì)蛋白的滲透增強(qiáng)作用已經(jīng)確定PN159用于低分子量化合物的跨黏膜制劑的用途，重要地是辨別這些觀察是否能夠外推到更大的分子，例如治療性肽和蛋白。為了這一目的，在不存在和存在25,50,和100mMPN159時(shí)，對(duì)作為模式治療肽的鮭魚降鈣素進(jìn)行體外組織研究。當(dāng)不存在PN159時(shí)，對(duì)于降鈣素的Papp為約1Xl(T7Cm/S，低于加蘭他敏的Papp約一個(gè)數(shù)量級(jí)，推測(cè)這是由于分子量的不同。當(dāng)存在PN159時(shí)，數(shù)據(jù)表明降鈣素滲透的顯著增加，與只有降鈣素的情形相比，在P叩p中達(dá)到23-到47-倍增加(表20)。表20使用體外組織模型檢測(cè)的P;<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>為了研究這些發(fā)現(xiàn)的普遍性，在不存在和存在PN159時(shí)，在所述體外模型中檢驗(yàn)兩種其它的肽，即人甲狀旁腺激素l-34(PTH,.34)和人肽YY3-36(PYY3_36)(Papp數(shù)據(jù)顯示在表20中)。當(dāng)不存在PN159時(shí)，這兩種肽的P柳與降鈣素的P鄰p—致。在PTHw4的情形中，PN159的存在在Papp中提供約3-5倍的增加。當(dāng)在PN159存在下配制PYY3—36時(shí)，Papp增加約12-到17-倍。這些數(shù)據(jù)證實(shí)我們的發(fā)現(xiàn)，即TJMP增強(qiáng)小分子和蛋白的跨黏膜藥物遞送的普遍性。實(shí)施例23TJMP的化學(xué)穩(wěn)定性在治療相關(guān)的儲(chǔ)存條件下確定PN159的化學(xué)穩(wěn)定性。應(yīng)用表示穩(wěn)定性的HPLC方法。溶液(50mM)保存在不同的pH值(4.0，7.3,和9.0)和溫度(5。C,25°C，35°C,40°C，和5(TC)條件下。在pH值4的樣品含有10mM擰檬酸鹽緩沖液。在pH值7.3和9.0的樣品含有10mM磷酸鹽緩沖液。儲(chǔ)存穩(wěn)定性結(jié)果(包括阿倫尼烏斯作圖法(Arrheniusplot))表明，在低溫度和pH值PN159在化學(xué)上是最穩(wěn)定的。例如，在5°C和pH4.0或pH7.3，對(duì)于6個(gè)月的儲(chǔ)存，存在基本上100X的PN159恢復(fù)。當(dāng)保存溫度升高到25"C時(shí)，6個(gè)月后，對(duì)于在pH4或pH7的樣品分別存在7X和26X的天然PN159損失。在pH9和/或升高的溫度，例如，40-50°C，跟著發(fā)生PN159的快速消耗。4.0-7.3的pH值范圍和冷凍到環(huán)境溫度的溫度范圍對(duì)于鼻內(nèi)制劑是最相關(guān)的。因此，這些數(shù)據(jù)支持TJMP可以在與IN制劑相關(guān)的儲(chǔ)存條件下保持化學(xué)完整性。實(shí)施例24在兔中通過(guò)鼻內(nèi)施用在體內(nèi)評(píng)估緊密連接調(diào)控肽在兔中進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)(PK)研究，以評(píng)估通過(guò)鼻內(nèi)(IN)遞送施用的肽YY(PYY)與各種緊密連接調(diào)控肽(TJMPs)的血漿藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征。動(dòng)物模型在本研究中，新西蘭白兔(Hra:(NZW)SPF)用作測(cè)試受試者，以通過(guò)鼻內(nèi)施用和靜脈內(nèi)輸注而評(píng)估MC-4RA的血漿藥物代謝動(dòng)力學(xué)。動(dòng)物的處理按照在USDA動(dòng)物福利法(USDAAnimalWelfareAct)中列出的規(guī)章(9CFR第1、2和3部分)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南(GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals,(ILAR出版，1996,國(guó)家科學(xué)院印刷))中指定的條件進(jìn)行。由于從施用給兔的藥物獲得的藥物代謝動(dòng)力學(xué)曲線非常近似于相同的藥物在人中的PK曲線，所以選擇兔作為本研究的動(dòng)物受試者。給藥施用關(guān)于9種檢測(cè)的TJMPs的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和給藥方案總結(jié)在表21中。所有的實(shí)驗(yàn)組都通過(guò)鼻內(nèi)(IN)施用給予同單個(gè)TJMP或磷酸緩沖鹽水(PBS:陰性對(duì)照)組合的205(ig/kgPYY(3-36)。使用自動(dòng)移液器和一次性塑料吸頭，將每種制劑一次施用到左鼻孔中。將動(dòng)物頭部向后翹起，并且在動(dòng)物吸入時(shí)施用所述劑量，以便允許毛細(xì)管作用將溶液吸入鼻孔。在IN施用后，控制動(dòng)物頭部在向后翹起的位置約15秒，以防止施用的劑量的任何損失。在這一步驟過(guò)程中，采取極度的小心，以避免由與鼻內(nèi)黏膜接觸導(dǎo)致的任何潛在的組織損傷。表21<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>PN556具有與PN283相同的一級(jí)序列，但是在肽的N端沒(méi)有馬來(lái)酰亞胺修飾。血液和血漿樣品收集通過(guò)IN給藥施用后，通過(guò)直接在耳緣靜脈進(jìn)行靜脈穿刺而從每只動(dòng)物收集連續(xù)的血液樣品。在給藥前，給藥后5，10，15，20，30，45，60,90，120和180分鐘收集血液樣品。樣品收集到含有EDTA二鉀作為抗凝血?jiǎng)┑墓苤?。管子在離心之前冷卻。所有的樣品在收集l小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行離心。收集血漿，并且轉(zhuǎn)移到預(yù)先標(biāo)記的塑料小瓶中，在干冰/丙酮浴中冷凍，然后在進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析之前保存在大約-7(TC。在每次血液采樣時(shí)刻進(jìn)行臨床觀察，并且恰好在5分鐘之前和鼻內(nèi)給藥后1小時(shí)對(duì)在IN施用檢測(cè)組中的所有動(dòng)物的兩個(gè)鼻孔進(jìn)行檢査。分析方法通過(guò)應(yīng)用ELISA，分析來(lái)自所有研究組中每只動(dòng)物的樣品的PYY(3-36)水平。將給藥之前和給藥后的檢測(cè)樣品在HPLC上運(yùn)行進(jìn)行質(zhì)量控制。血漿等分試樣(O.lmL)是在加入生物分析內(nèi)標(biāo)后用乙腈沉淀的蛋白。將上清液用氮?dú)飧稍?，在HPLC緩沖液中重構(gòu)，并且然后注射到HPLC系統(tǒng)中。通過(guò)陽(yáng)離子電噴霧離子化串聯(lián)三極四極質(zhì)譜儀(positiveiondectrosprayionizationtandemtriplequadrupolemassspectrometer)檢湖!)流出物。PK數(shù)據(jù)通過(guò)WinNonlin(法薩特公司(PharsightCorp.)，芒廷維尤(MountainView))進(jìn)行分析。結(jié)果關(guān)于每個(gè)檢測(cè)組的平均血漿PK參數(shù)總結(jié)在表22中。在施用任何制劑后，沒(méi)有觀察到不利的臨床跡象。通過(guò)IN施用制劑的動(dòng)物的兩個(gè)鼻孔的鼻內(nèi)檢查后顯示沒(méi)有任何發(fā)紅，沒(méi)有腫脹。PK研究評(píng)估Cmax(最大觀察濃度)，Tmax(最大濃度的時(shí)刻)和AUC(曲線下面積)末端和無(wú)窮大極限(inf)。按照它們的體內(nèi)滲透性水平排列8種TJMPs，并且分成4種不同的表現(xiàn)等級(jí)，等級(jí)I包含具有最大體內(nèi)滲透性水平的TJMPs，并且每個(gè)后續(xù)等級(jí)包含具有逐漸減小的體內(nèi)滲透性水平的TJMPs。表22<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>這些數(shù)據(jù)表明對(duì)于PN161和PN27二者觀察到的體內(nèi)滲透性與PN159相當(dāng)；并且其余的TJMPs，在所檢測(cè)的濃度，獲得低于PN159的體內(nèi)滲透性水平。實(shí)施例25在體外增強(qiáng)上皮細(xì)胞層滲透的緊密連接調(diào)控肽本實(shí)施例描述篩選本發(fā)明的代表性肽PN679和PN745(表23所示)以及每種肽的檢測(cè)制劑(表24所示)，以確定每種肽關(guān)于上皮細(xì)胞單層滲透增強(qiáng)作用的有效濃度范圍。表23緊密連接調(diào)控肽<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>下表24描述含有本發(fā)明的代表性肽(表24中的"活性劑"欄)的個(gè)別檢測(cè)制劑，和作為陽(yáng)性和陰性檢測(cè)制劑對(duì)照的檢測(cè)制劑，它們通過(guò)TER、LDH(細(xì)胞毒性)和樣品滲透增強(qiáng)作用檢測(cè)而進(jìn)行檢驗(yàn)。每種肽在25^M,100j^M，250|iM，500^VI和1000pM濃度迸行檢測(cè)。此處的PN159(檢測(cè)制劑#11)作為TJMP陽(yáng)性對(duì)照，并且先前已經(jīng)表現(xiàn)出在25pM有效減小TER和增強(qiáng)樣品滲透的能力。1%的TritonX-100(檢測(cè)制劑#14)作為細(xì)胞毒性(LDH)檢測(cè)和TER減小檢測(cè)二者的陽(yáng)性對(duì)照。"特別的加料(specialsauce)"(SS)在此處作為小分子滲透增強(qiáng)劑。088++作為陰性對(duì)照。除了具有pH5的目的pH值的檢測(cè)制劑#12夕卜，每種檢測(cè)制劑具有300nl的終體積，和pH7的目的pH值。1%的TritonX-100(檢測(cè)制劑#14)作為細(xì)胞毒性(LDH)檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照。在300^總體積的每種檢測(cè)制劑中，只將20^樣品應(yīng)用到來(lái)源于人的氣管/支氣管上皮細(xì)胞(EpiAirwayTM組織模型系統(tǒng))，以評(píng)估每種檢測(cè)制劑對(duì)TER、LDH和樣品滲透的作用。表24檢測(cè)制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>實(shí)施例26PN679和PN745在體外調(diào)控緊密連接蛋白本實(shí)施例表明，代表性肽PN679和PN745以劑量依賴型方式有效減小TER并且顯著增強(qiáng)樣品的滲透，而沒(méi)有引起顯著的細(xì)胞毒性，這表明這些肽是有效的TJMPs。表25總結(jié)了關(guān)于在實(shí)施例25的表24中描述的檢測(cè)制劑的TER、LDH和樣品滲透(FD3)數(shù)據(jù)。關(guān)于PN679的檢測(cè)制劑#1和關(guān)于PN745的檢測(cè)制劑#6檢測(cè)兩次。關(guān)于TER、LDH和樣品滲透的其它撿測(cè)結(jié)果顯示在括號(hào)中。表25<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>ss-"特別的加料包含100^M,250|iM,500和1000nM本發(fā)明的代表性肽PN679(檢測(cè)制劑#1,#2,#3和#4)或PN745(檢測(cè)制劑#6,#7,#8和#9)的任一種的檢測(cè)制劑將TER減小到與"特別的加料"相等的程度，并且顯著低于確定的TJMP對(duì)照物PN159的程度。如預(yù)計(jì)那樣，083++陰性對(duì)照沒(méi)有顯著地減小TER。這兩種肽減小TER的能力與它們?cè)鰪?qiáng)FD3分子的滲透的能力高度相關(guān)。100)iM劑量的PN679(檢測(cè)制劑#4)和PN745(檢測(cè)制劑弁9)都表現(xiàn)出與PN159TJMP相似的滲透百分?jǐn)?shù)，但是具有較低的細(xì)胞毒性(較低的^LDH釋放)。更高濃度的任一種肽導(dǎo)致增加的FD3滲透水平，所述水平超過(guò)PN159的水平，但是也增加LDH的釋放水平，這表明增加的細(xì)胞毒性。如預(yù)計(jì)那樣，088++對(duì)照沒(méi)有誘導(dǎo)可檢測(cè)到的1^釋放。基于所觀察到的TER減少、樣品滲透和細(xì)胞毒性(LDH釋放)，100pM劑量的任一種代表性肽PN679和PN745似乎用于進(jìn)一步分析這兩種TJMPs最理想。前述數(shù)據(jù)表明出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即，代表性的肽PN679和PN745在體外減小人上皮細(xì)胞單層的TER，并且增強(qiáng)小分子滲透，而沒(méi)有顯著的毒性。這些數(shù)據(jù)表明，這些緊密連接調(diào)控肽(TMJP)是用于穿過(guò)黏膜表面的藥物遞送例如鼻內(nèi)(IN)藥物遞送的極好的候選物。實(shí)施例27緊密連接調(diào)控肽在體外增強(qiáng)滲透與在體內(nèi)觀察到的增強(qiáng)的滲透高度相關(guān)進(jìn)行線性回歸分析，以確定在體外EpitAirway上皮細(xì)胞模型系統(tǒng)中觀察到的TJMP滲透動(dòng)力學(xué)是否與對(duì)于同一種TJMP觀察到的體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)相關(guān)。為了確定體外滲透數(shù)據(jù)是否作為體內(nèi)效果的良好的指示，將從使用PYY和TJMPs進(jìn)行的體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究獲得的曲線下面積-最終(last)值(AUC-last)針對(duì)使用PYY和TJMPs進(jìn)行的體外上皮細(xì)胞單層滲透研究繪圖。體外滲透表示為百分?jǐn)?shù)，而AUC-last(AUC-最終)表示為分鐘fpg/ml。關(guān)于10種不同的TJMPs的體外和體內(nèi)研究進(jìn)行繪圖，并且進(jìn)行線性回歸。得到0.82的R"直(82%相關(guān)性)，這表明對(duì)于來(lái)源于體內(nèi)的AUC值和體外觀察的滲透性百分?jǐn)?shù)存在高度的相關(guān)性。令人驚訝地，當(dāng)排除檢測(cè)間(inter-assay)可變性時(shí)，得到0.996的W值(基本上100。％)，這表明在體外滲透性和體內(nèi)效果之間存在直接的相關(guān)性。因此，體外滲透可以用來(lái)預(yù)測(cè)體內(nèi)效果。實(shí)施例28TJMP對(duì)肽激素治療劑的體內(nèi)滲透增強(qiáng)作用等于或者超過(guò)小分子滲透增強(qiáng)劑的增強(qiáng)作用將20只3—6月齡并且重2.1—3.0kg的雄性新西蘭白兔隨機(jī)分成5個(gè)處理組，每組4只動(dòng)物。將測(cè)試動(dòng)物以15pl/kg并且通過(guò)吸管鼻內(nèi)給藥。下表26表示5種不同的給藥組的組成。對(duì)于給藥組1(見(jiàn)表26)，使用包含小分子滲透增強(qiáng)劑的PYY臨床制劑。在這些研究中的小分子增強(qiáng)劑包括甲基-P-環(huán)糊精、二癸?；字Ｄ憠A(DDPC)、禾n/或EDTA。給藥組2接受溶解在磷酸緩沖鹽水(PBS)中的PYY。對(duì)于給藥組3-5，將不同濃度的PN159加到給藥組2中，以致給藥組3-5中的每一組由PYY,PN159和PBS組成。表26<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>通過(guò)直接在耳緣靜脈進(jìn)行靜脈穿刺而收集連續(xù)的血液樣品(每份約2ml),收集到含有EDTA作為抗凝血?jiǎng)┑难菏占苤?。在給藥后0，2.5，5，10，15，30,45,60，和120分鐘收集血液樣品。收集血液之后，管子輕輕搖動(dòng)幾次，以抗凝血，然后加入50^牛胰蛋白酶抑制劑溶液。在大約4'C以約1,600xg離心血液15分鐘，并且將血漿樣品分配到一式兩份等分試樣中，并且在大約-7(TC冷凍保存。平均在一個(gè)處理組中的所有4只動(dòng)物，檢測(cè)下述PYY的血漿濃度(表27):表27檢測(cè)組PYY血漿濃度的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>1513731.2398.22512563.07534455.320882.7253019537.55476.47515222.635294.37525470.4754513036.075340.79081.12521582.22516499.55607080.875283.8254843.159461.92510676,6251201671.9192.5751224.22337.7751891.275從上述數(shù)據(jù)計(jì)算的藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)顯示在下表28中:表28藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)總結(jié)變量組平均值SDSECmax(pg/mL)19832.1817737.218868.605Tmax(分鐘)132.520.615510.3078AUClast(分鐘*經(jīng)/1111^)1991732.1930296.3465148.1AUCINF(分鐘g/mL)11357132928368.5535993.8t1/2(分鐘)123.691.7130.989Cmax(pg/mL)2516.725196.49298.246Tmax(分鐘)226.2514.36147.1807AUClast(分鐘+pg/mL)236475.729926.1044963.052AUCINF(分鐘、g/mL)260847.4117688.318844.156t1/2(分鐘)284.591926.885913.4429Cmax(pg/mL)315533.9513225.886612.941Tmax(分鐘)322.58.66034.3301AUClast(分鐘g/mL)3748104.1661213.8330606.9AUCINF(分鐘g/mL)3796354.7721017.8360508.9t1/2(分鐘)324.84674.31082.1554Cmax(pg/mL)440995.5332112.7116056.35Tmax(分鐘)426.257.53.75AUClast(分鐘+pg/mL)4169249913398%669947.8AUCINF(分鐘承pg/mL)417873481395185697592.4<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>前述數(shù)據(jù)表明，與小分子滲透增強(qiáng)劑比較，TJMP在體內(nèi)將人激素肽治療劑的鼻內(nèi)滲透增強(qiáng)到相等的或更大的程度。在50^M濃度觀察到所述肽的最大作用。100pM濃度導(dǎo)致稍低的滲透，盡管二者都導(dǎo)致比小分子滲透增強(qiáng)劑更高的滲透。實(shí)施例29TJMP對(duì)寡肽治療劑的滲透增強(qiáng)作用本實(shí)施例表明本發(fā)明的一種代表性肽，PN159增強(qiáng)一種環(huán)五肽，黑皮質(zhì)素-4受體激動(dòng)劑(MC-4RA)，一種用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞受體的模式寡肽激動(dòng)劑的上皮滲透的功效。在這一實(shí)施例中，描述一種或多種滲透性肽與MC-4RA的組合。在這種情形中有用的制劑可以包括寡肽治療劑、滲透性肽和一種或多種其它滲透增強(qiáng)劑的組合。所述制劑還可以含有緩沖劑、張力劑、pH值調(diào)節(jié)劑、和肽/蛋白穩(wěn)定劑如氨基酸、糖或多元醇、聚合物、和鹽。在本研究中評(píng)估PN159對(duì)MC-4RA滲透的作用。MC-4RA是一種具有約1,100Da分子量的甲垸磺酸鹽，其調(diào)控MC-4受體的活性。評(píng)估的PN159濃度為5，25,50,和100pM。45mg/mlM-(3-CD用作所有制劑的增溶齊lJ，以獲得10mg/mi的肽濃度。評(píng)估PN159自身或與EDTA(l,2.5,5,或10mg/ml)組合的作用。制劑的pH值固定在4，并且摩爾滲透壓濃度為220mOsm/kg。HPLC方法通過(guò)RP-HPLC分析MC-4RA在基底外側(cè)部培養(yǎng)基中的濃度，所述RP-HPLC使用C18RP層析，流速lmL/分鐘，和柱溫25'C。溶劑A:在水中0.1%的TFA;溶劑B:在ACN中0.1%的TFA注射體積50檢測(cè)220nm運(yùn)行時(shí)間15分鐘MC-4RA與5，25,50，和100PN159組合，并且在pH值4和摩爾滲透壓濃度220mOsm/kg。使用體外上皮組織模型檢測(cè)所述組合，以通過(guò)MTT和LDH檢測(cè)而監(jiān)測(cè)PTH滲透、跨上皮電阻(TER)、和所述制劑的細(xì)胞毒性。MC-4RA滲透的研究結(jié)果表明，除了增強(qiáng)肽激素治療劑的黏膜滲透之外，TJMP還顯著增強(qiáng)寡肽治療劑的上皮滲透。實(shí)施例30TJMP對(duì)小分子藥物的滲透增強(qiáng)作用本實(shí)施例表明本發(fā)明的一種代表性肽，PN159增強(qiáng)以乙酰膽堿酯酶(ACE)抑制劑加蘭他敏為例的小分子藥物的上皮滲透的功效。在本實(shí)施例中，描述一種或多種滲透性肽與小分子藥物的組合。在這種情形中有用的制劑可以包括小分子藥物、滲透性肽、和一種或多種其它滲透增強(qiáng)劑的組合。所述制劑還可以包含緩沖劑、張力劑、pH值調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑和/或防腐劑。本發(fā)明將加蘭他敏與PN159組合，以增強(qiáng)加蘭他敏穿過(guò)鼻黏膜的滲透。由于加蘭他敏是一種可以獨(dú)立地透過(guò)鼻上皮膜的小分子，所以這種藥物滲透的增加是出乎意料的。因此，通過(guò)加入增強(qiáng)肽滲透的賦形劑而介導(dǎo)的加蘭他敏通過(guò)上皮滲透的顯著增強(qiáng)作用是令人驚訝的，這是基于通常沒(méi)有預(yù)計(jì)到所述賦形劑顯著增加加蘭他敏穿過(guò)上皮組織層的滲透。因此，本發(fā)明將通過(guò)增加它們的生物利用度而促進(jìn)加蘭他敏及其它小分子藥物的鼻遞送。在本研究中，40mg/ml乳酸鹽形式的加蘭他敏與25，50，和100jliMPN159在溶液，pH5.0和摩爾滲透壓濃度-270mOsm中組合。使用體外上皮組織模型檢測(cè)所述組合，以通過(guò)上文所述的LDH和MTT檢測(cè)而監(jiān)測(cè)加蘭他敏滲透、跨上皮電阻(TER)、和所述制劑的細(xì)胞毒性。加蘭他敏的滲透檢測(cè)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)HPLC分析進(jìn)行，如下。HPLC分析應(yīng)用無(wú)梯度LC(WatersAlliance(沃特斯聯(lián)合))方法和UV檢測(cè)，確定制劑中和在基底外側(cè)培養(yǎng)基(滲透樣品)中的加蘭他敏濃度。柱沃特斯對(duì)稱柱(WatersSymmetryShield),C18，5um,25x0.46cm流動(dòng)相在50mM甲酸銨中的5%ACN，pH3.0流速1ml/分鐘柱溫30°C校準(zhǔn)曲線0-400pg/ml溴化加蘭他敏檢測(cè)在285nm的紫外線(UV)基于前述研究，PN159提高小分子的跨黏膜遞送。選擇加蘭他敏作為模型低分子量藥物，并且認(rèn)為這一分子的結(jié)果是用于其它小分子藥物的滲透性肽活性的預(yù)測(cè)。為了評(píng)估這種情形中的滲透性活性，將40mg/ml乳酸鹽形式的加蘭他敏與25,50，和100pMPN159在溶液中、pH5.0和摩爾滲透壓濃度-270mOsm組合。使用體外上皮組織模型檢測(cè)所述組合，以通過(guò)LDH和MTT檢測(cè)而監(jiān)測(cè)加蘭他敏滲透、跨上皮電阻(TER)、和所述制劑的細(xì)胞毒性。在所述體外組織模型中，加入PN159導(dǎo)致藥物穿過(guò)細(xì)胞屏障的滲透的顯著增加。具體地，在40mg/ml加蘭他敏的Papp中存在2.5—3.5倍的增加。在加蘭他敏存在下，PN159減少TER，正如前述實(shí)施例中所述。在所有檢測(cè)濃度的乳酸加蘭他敏和PN159存在下，細(xì)胞存活能力保持較高(>80%)。相反，當(dāng)通過(guò)LDH檢測(cè)時(shí)，在存在PN159和乳酸加蘭他敏時(shí)，細(xì)胞毒性低。這些檢測(cè)都表明PN159對(duì)上皮膜沒(méi)有毒性。在不存在PN159時(shí)，加蘭他敏的P卿為約2.1xlO《cm/s。當(dāng)存在25，50和100mMPN159時(shí)，P卿分別為5.1x10-6，6.2x10_6,和7.2xl(T6cm/s。因此，在這種模型低分子量藥物的Papp中，PN159提供2.4-至3.4-倍的增加。TJMP令人驚訝地增加作為模型低分子量藥物的加蘭他敏的上皮滲透。將PN159加入到加蘭他敏溶液中顯著增強(qiáng)加蘭他敏穿過(guò)上皮細(xì)胞單層的滲透。證據(jù)表明PN159暫時(shí)減少穿過(guò)上皮膜的TER，而沒(méi)有損壞膜中的細(xì)胞，如通過(guò)高細(xì)胞存活能力和低細(xì)胞毒性所測(cè)定那樣。TJMP在體內(nèi)增強(qiáng)加蘭他敏及其它小分子藥物的生物利用度，其通過(guò)在本文中使用體外模型證明的相同的機(jī)制而增強(qiáng)。進(jìn)一步預(yù)測(cè)到TJMP還在更高的濃度增強(qiáng)加蘭他敏的滲透。實(shí)施例31TJMP對(duì)蛋白的滲透增強(qiáng)作用已經(jīng)確定PN159用于低分子量化合物的跨黏膜制劑的用途，重要地是辨別這些觀察是否能夠外推到更大的分子，例如治療性肽和蛋白。為了這一目的，在不存在和存在25,50，禾n100mMPN159時(shí)，對(duì)作為模式治療肽的鮭魚降鈣素進(jìn)行體外組織研究。當(dāng)不存在PN159時(shí)，對(duì)于降鈣素的Papp為約1x10-7cm/s，低于加蘭他敏的Papp約一個(gè)數(shù)量級(jí)，推測(cè)這是由于分子量的不同所導(dǎo)致的。當(dāng)存在PN159時(shí)，數(shù)據(jù)表明降鈣素滲透的顯著增加，與只有降鈣素的情形相比，在Papp中達(dá)到23-到47-倍增加(表30)。表30使用體外組織模型檢測(cè)的Papp<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>pH值為5.0為了研究這些發(fā)現(xiàn)的普遍性，在不存在和存在PN159時(shí)，在所述體外模型中檢驗(yàn)兩種其它的肽，即人甲狀旁腺激素l-34(PTHw4)和人肽YY3-36(PYY3.36)(Papp數(shù)據(jù)顯示在表30中)。當(dāng)不存在PN159時(shí)，這兩種肽的Papp與降鈣素的P卿一致。在PTHw4的情形中，PN"9的存在在Papp中提供約3-5倍的增加。當(dāng)在PN159存在下配制PYY^時(shí)，Papp增加約12-到17-倍。這些數(shù)據(jù)證實(shí)我們的發(fā)現(xiàn)，即TJMP增強(qiáng)小分子和蛋白的跨黏膜藥物遞送的普遍性。實(shí)施例32TJMP的化學(xué)穩(wěn)定性在治療相關(guān)的儲(chǔ)存條件下確定PN159的化學(xué)穩(wěn)定性。應(yīng)用表示穩(wěn)定性的HPLC方法。溶液(50mM)保存在不同的pH值(4.0，7.3，和9.0)和溫度(5'C，25。C,35。C,4(rC，和50。C)條件下。在pH值4的樣品含有10mM檸檬酸鹽緩沖液。在pH值7.3和9.0的樣品含有10mM磷酸緩沖液。儲(chǔ)存穩(wěn)定性結(jié)果(包括阿倫尼烏斯作圖法(Arrheniusplot))表明，在低溫度和pH值PN159在化學(xué)上是最穩(wěn)定的。例如，在5。C和pH4.0或pH7.3,對(duì)于6個(gè)月的儲(chǔ)存，存在基本上100X的PN159恢復(fù)。當(dāng)保存溫度升高到25'C時(shí)，6個(gè)月后，對(duì)于在pH4或pH7的樣品分別存在7X和26X的天然PN159損失。在pH9和/或升高的溫度，例如，40-50°C，跟著發(fā)生PN159的快速消耗。4.0-7.3的pH值范圍和冷凍到環(huán)境溫度的溫度范圍對(duì)于鼻內(nèi)制劑是最相關(guān)的。因此，這些數(shù)據(jù)支持TJMP可以在與IN制劑相關(guān)的儲(chǔ)存條件下保持化學(xué)完整性。實(shí)施例33在兔中通過(guò)鼻內(nèi)施用在體內(nèi)評(píng)估緊密連接調(diào)控肽在兔中進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)(PK)研究，以評(píng)估通過(guò)鼻內(nèi)(IN)遞送施用的肽YY(PYY)與各種緊密連接調(diào)控肽(TJMPs)的血漿藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征。動(dòng)物模型在本研究中，新西蘭白兔(Hm:(NZW)SPF)用作測(cè)試受試者，以通過(guò)鼻內(nèi)施用和靜脈內(nèi)輸注而評(píng)估MC-4RA的血槳藥物代謝動(dòng)力學(xué)。動(dòng)物的處理按照在USDA動(dòng)物福利法(USDAAnimalWelfareAct)中列出的規(guī)章(9CFR第1、2和3部分)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物詞養(yǎng)管理和使用指南(ILAR出版，1996，國(guó)家科學(xué)院印刷)中指定的條件進(jìn)行。由于從施用給兔的藥物獲得的代謝動(dòng)力學(xué)曲線非常近似于相同的藥物在人中的PK曲線，所以選擇兔作為本研究的動(dòng)物受試者。給藥施用關(guān)于9種檢測(cè)的TJMPs的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和給藥方案總結(jié)在表31中。所有的實(shí)驗(yàn)組都通過(guò)鼻內(nèi)(IN)施用給予同單個(gè)TJMP或磷酸緩沖鹽水(PBS:陰性對(duì)照)組合的205)Lig/kgPYY(3-36)。使用自動(dòng)移液器和一次性塑料吸頭，將每種制劑一次施用到左鼻孔中。將動(dòng)物頭部向后翹起，并且在動(dòng)物吸入時(shí)施用所述劑量，以便允許毛細(xì)管作用將溶液吸入鼻孔。在IN施用后，控制動(dòng)物頭部在向后翹起的位置約15秒，以防止施用的劑量的任何損失。在這一步驟過(guò)程中，采取極度的小心，以避免由與鼻內(nèi)黏膜接觸導(dǎo)致的任何潛在的組織損傷。表31<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>PN556具有與PN283相同的一級(jí)序列，但是在肽的N端沒(méi)有馬來(lái)酰亞胺修飾。血液和血漿樣品收集通過(guò)IN給藥施用后，通過(guò)直接在耳緣靜脈進(jìn)行靜脈穿刺而從每只動(dòng)物收集連續(xù)的血液樣品。在給藥前，給藥后5，10,15,20,30,45,60,90，120和180分鐘收集血液樣品。樣品收集到含有EDTA二鉀作為抗凝血?jiǎng)┑墓苤小９茏釉陔x心之前冷卻。所有的樣品在收集l小時(shí)之內(nèi)迸行離心。收集血漿，并且轉(zhuǎn)移到預(yù)先標(biāo)記的塑料小瓶中，在干冰/丙酮浴中冷凍，然后在進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析之前保存在大約-70。C。在每次血液采樣時(shí)刻進(jìn)行臨床觀察，并且恰好在5分鐘之前和鼻內(nèi)給藥后1小時(shí)對(duì)在IN施用檢測(cè)組中的所有動(dòng)物的兩個(gè)鼻孔迸行檢査。分析方法通過(guò)應(yīng)用ELISA，分析來(lái)自所有研究組中每只動(dòng)物的樣品的PYY(3-36)水平。將給藥之前和給藥后的檢測(cè)樣品在HPLC上運(yùn)行進(jìn)行質(zhì)量控制。血漿等分試樣(O.lmL)是在加入生物分析內(nèi)標(biāo)后用乙腈沉淀的蛋白。將上清液用氮?dú)飧稍?，在HPLC緩沖液中重構(gòu)，并且然后注射到HPLC系統(tǒng)中。通過(guò)陽(yáng)離子電噴霧離子化串聯(lián)三極四極質(zhì)譜儀檢測(cè)流出物。PK數(shù)據(jù)通過(guò)WinNonlin(法薩特公司(PharsightCorp.)，芒廷維尤(MountainView))進(jìn)行分析。結(jié)果將關(guān)于每個(gè)檢測(cè)組的平均血漿PK參數(shù)總結(jié)在表32中。在施用任何制劑后，沒(méi)有觀察到不利的臨床跡象。通過(guò)IN施用制劑的動(dòng)物的兩個(gè)鼻孔的鼻內(nèi)檢査后顯示沒(méi)有任何發(fā)紅，也沒(méi)有腫脹。PK研究評(píng)估Cmax(最大觀察濃度),Tmax(最大濃度的時(shí)刻)和AUC(曲線下面積)末端和無(wú)窮大極限(inf)。按照它們的體內(nèi)滲透性水平排列8種TJMPs，并且分成4種不同的表現(xiàn)等級(jí)，等級(jí)I包含具有最大體內(nèi)滲透性水平的TJMPs，并且每個(gè)后續(xù)等級(jí)包含具有逐漸減小的體內(nèi)滲透性水平的TJMPs。表32藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>實(shí)施例34純化已經(jīng)合成下述PEG化的PN159肽(表33):表33合成的PEG化的PN0159肽列表<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>將150mg量的粗肽吸收在15mL含有0.1。/。TFA和3mL乙酸的水中。在攪拌和超聲處理后，將混合物轉(zhuǎn)移到1.5mLEppendorf管中，并且在13000rpm離心。收集上清液，并且通過(guò)MillexGV0.22um注射濾器過(guò)濾。將這種溶液通過(guò)5mL注射環(huán)以5mL/分鐘的流速上樣到Zorbax300SBCI8柱(21.2mmIDx250mm，7um顆粒大小)上。通過(guò)運(yùn)行0.2%B/分鐘的線性AB梯度完成純化，其中溶劑A是在水中的0.in/。TFA，和溶劑B是在乙腈中的0.1。/。TFA。在這些條件下，肽在15-17%B的范圍洗脫下來(lái)。實(shí)施例35細(xì)胞EpiAirwayTM細(xì)胞(以96孔形式(Air-196-HTS)或單獨(dú)的24孔插入物(Air-100))，一種人氣管/支氣管組織模型，購(gòu)自馬特泰克(MatTek)公司(阿什蘭，MA)，以篩選緊密連接調(diào)控肽(TJMPs)，篩選基于它們對(duì)跨上皮電阻(TER)和滲透性的作用而進(jìn)行。培養(yǎng)組織來(lái)源于單一供體，并且對(duì)于HIV、乙型肝炎、丙型肝炎、支原體、細(xì)菌、酵母菌和真菌篩選是為陰性。EpiAirway組織在補(bǔ)充瓊脂糖凝膠的培養(yǎng)基上冷凍運(yùn)輸。EpiAirway組織用生產(chǎn)商提供的培養(yǎng)基在37r復(fù)蘇24小時(shí)。用于EpiAirway模型的完全培養(yǎng)基(Epi-CM)含有DMEM、EFG和其它因子、慶大霉素(5pg/ml)、兩性霉素B(0.25pg/ml)以及作為pH指示劑的酚紅。實(shí)施例36確定TER使用自動(dòng)化的組織電阻系統(tǒng)(REMS)(世界精密儀器(WorldPrecessionInstrument)(WPI)有限公司，(薩拉索塔，佛羅里達(dá)州)對(duì)Air-196-HTS進(jìn)行TER檢測(cè)。為了監(jiān)測(cè)在96孔HTS形式中的TER，在組織培養(yǎng)箱(hood)中使用Endhom-Multi(STX)，以防止污染。當(dāng)過(guò)夜復(fù)蘇插入物時(shí)，將100|_d培養(yǎng)基用于頂面，250pl培養(yǎng)基用于基底室。背景TER用空白插入物(密斯博(Millipore))檢測(cè)，并且從組織插入物中減去。通過(guò)將所述插入物倒轉(zhuǎn)在紙巾上而將培養(yǎng)基傾出。然后，將插入物在紙巾上輕輕敲打，以確保最大限度去除頂部培養(yǎng)基。對(duì)于其它的TER檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，在處理后立即將插入物用150|alEpi-CM輕輕潤(rùn)洗三次，并且在TER檢測(cè)之前完全排盡。結(jié)果(圖8)表明，在單層上皮細(xì)胞上檢測(cè)的本發(fā)明的緊密連接調(diào)控肽PN159和PN159的PEG化形式都具有強(qiáng)的、可逆的增強(qiáng)上皮滲透性的作用。使用二者觀察到的作用以可預(yù)測(cè)的方式發(fā)生。此外，結(jié)果表明，PEG-159比單獨(dú)的PN159顯著地增強(qiáng)離子滲透性(減小TER)。PEG-PN159和159之間在TER中的最大差別在50|LiMPEG-PN159。實(shí)施例37滲透性檢測(cè)將熒光素異硫氰酸酯(FITC)標(biāo)記的糊精(MW3，000)以0.1-1mg/ml添加到處理混合物中。將處理混合物加到頂壁的側(cè)面，并且將平板在軌道振蕩器(新布倫斯維克科學(xué)，埃迪遜，新澤西州(NewBrunswickScientific,Edison，NJ))中以100rpm在37。C溫育指定的時(shí)間。在溫育末，將一式三份200pi的基底培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到黑壁熒光讀取平板上。通過(guò)微量培養(yǎng)板熒光讀取儀FLx800(博奧泰克(BIO-TEK)儀器有限公司，Winooski，VT)檢測(cè)在470nm波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度。標(biāo)準(zhǔn)物的連續(xù)稀釋用來(lái)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算濃度。滲透性以兩種方式檢測(cè)，作為供體質(zhì)量(頂部室)的比例或者作為受體質(zhì)量(基底室)的比例，以百分?jǐn)?shù)表示。在存在本發(fā)明的PN159和PEG-PN159時(shí)，觀察到PTH滲透的顯著增加(圖9)。使用二者觀察到的作用在10pM和100^M之間有些濃度依賴性。此外，結(jié)果表明PEG-PN159比PN159顯著增強(qiáng)分子滲透性。當(dāng)PEG-PN159的滲透性增加與PN159比較時(shí)(在圖10中作為兩個(gè)值之間的比例繪圖)，滲透增加的最大差別是在50濃度。實(shí)施例38細(xì)胞毒性檢測(cè)LDH檢測(cè)用來(lái)評(píng)估所述處理的細(xì)胞毒性。LDH水平通過(guò)CytoTox96無(wú)放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)(普洛麥格(Pmmega),麥迪遜，威斯康星州)按照生產(chǎn)商的方法確定。對(duì)于基底側(cè)LDH水平，將一式三份50pl的基底培養(yǎng)基用來(lái)確定LDH水平。對(duì)于頂部LDH水平，通過(guò)向頂室中加入150lilEpi-CM，而去除150^的稀釋的頂部樣品，將培養(yǎng)基通過(guò)上下吹吸而混合，并且去除150^培養(yǎng)基并稀釋2倍(最終8倍稀釋)，用于以50pl的一式三份檢測(cè)?？侺DH水平通過(guò)在終濃度0.9%的Triton-X100中裂解細(xì)胞而確定。每種樣品中的LDH表示為Triton-XlOO細(xì)胞裂解的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果(圖ll)表明，PEG-PN159具有比PN159更低的細(xì)胞毒性。實(shí)施例39兔中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)將25只雄性新西蘭白兔，大約3月齡，用于本研究。兔接受單一的鼻內(nèi)施用，一個(gè)鼻孔一劑量的緊密連接(TJ)肽和PYY3-36組，這使用自動(dòng)移液器和一次性塑料吸頭進(jìn)行。兔按照在表34中顯示的TH肽和對(duì)照組給藥。TJ肽(PN407,PN408,PN526(PEG-PN159),和PN159)都在具有鈣和鎂的0.75xDPBS中。陰性對(duì)照是只含有鈣和鎂的0.75xDPBS(PBS)。不含在檸檬酸鹽緩沖液中包含TJ肽的DDPC、EDTA和MbCD的陽(yáng)性PYY3-36對(duì)照制劑用于比較(PDF)。當(dāng)遞送所述劑量時(shí)，將動(dòng)物的頭部稍微向后翹起。給藥后，控制動(dòng)物頭部在向后翹起的位置約15秒。通過(guò)直接在耳緣靜脈進(jìn)行靜脈穿刺而收集連續(xù)的血液樣品(每份約1.5mL)，收集到含有EDTA作為抗凝血?jiǎng)┑难菏占苤?。在鼻?nèi)組給藥后O(給藥前)，5,10,15，30,45，60,120和240分鐘收集血液樣品。收集之后，管子輕輕倒轉(zhuǎn)幾次，以抗凝血，然后向收集管中加入50jal牛胰蛋白酶抑制劑，并且輕輕但是徹底混合。在大約4。C以約1,600xg離心15分鐘之前，將混合的樣品放置在冷凍包裝上。將血衆(zhòng)樣品分成一式兩份等分試樣(每份約0.35mL)，并且然后保存在大約-7(TC。表34<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>使用商購(gòu)ELISA試劑盒("活性總肽YY(PYY)ELISA",目錄號(hào).DSL-10-33600,診斷系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)有限公司(DiagnosticSystemsLaboratories,Inc.)，韋伯斯特(Webster)，德克薩斯州)進(jìn)行在兔血漿中的PYY3-36生物分析檢測(cè)。所述檢測(cè)是一種酶促擴(kuò)增的"一步"夾心型免疫檢測(cè)。在所述檢測(cè)中，將校正物、對(duì)照和未知樣品在已經(jīng)用另一種抗-PYY抗體包被的微量滴定孔中用抗-PYY抗體溫育。溫育和洗滌后，孔用發(fā)光底物，四甲基聯(lián)苯胺溫育。然后加入酸性終止溶液，并且通過(guò)在450和620nm的雙波長(zhǎng)吸光度檢測(cè)而確定底物的酶促轉(zhuǎn)換程度。測(cè)定的吸光度與存在的PYY的濃度成比例。5參數(shù)的邏輯數(shù)據(jù)簡(jiǎn)化方法(five-parameterlogisticdatareductionmethod)用于校正結(jié)果，以產(chǎn)生關(guān)于每種檢測(cè)的校正曲線。校正曲線用于根據(jù)它們的吸光度結(jié)果而內(nèi)插入未知樣品的PYY濃度值。試劑盒成分用于所有的檢測(cè)步驟，除了下述例外以外PYY3.36參照物質(zhì)用于產(chǎn)生校正物和對(duì)照；校正物和對(duì)照用洗脫(strip)(C18固相萃取柱)合并的兔血漿作為稀釋劑而制備；并且如果需要，將未知樣品稀釋在洗脫合并的兔血漿中。將在這一試劑盒中的抗體組合優(yōu)化，以檢測(cè)完整的人PYYw6，并且與小鼠PYYw6和人PYY3_36充分交叉反應(yīng)。關(guān)于對(duì)照(PBS和PDF)和TJ肽(PN159，PN407,PN408,和PN526)制劑的平均藥物代謝動(dòng)力學(xué)(PK)數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)顯示在表35中。關(guān)于每種緊密連接調(diào)控劑和對(duì)照的相對(duì)生物利用度(。/。BA)顯示在表36中。關(guān)于藥物代謝動(dòng)力學(xué)變量的變化系數(shù)百分?jǐn)?shù)顯示在表37中。表35關(guān)于在兔中的PYY3.36的平均PK參數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>表36緊密連接調(diào)控劑的％生物利用度<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>表37關(guān)于藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化％系數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>量化的下限(LLOQ)認(rèn)為是15.8pg/mL。將任何〈NUMBER的原始數(shù)據(jù)值設(shè)為7.9pg/mL用來(lái)分析。鼻施用后平均PYY3.36血漿濃度在圖12中以線性圖顯示，在圖13中以對(duì)數(shù)-線性圖顯示。施用鼻劑量的動(dòng)物的平均PYY3^血清濃度表示所有組在給藥后15-34分鐘之間的峰值濃度(丁^)。對(duì)于以205pg/kg的劑量水平的鼻PBS;PDF;PN159;PN407;PN408和PN526的平均Cmax分別為2,646.25;19,004.40;18,346.60;13,980.20;15,420.00和36,066.20pg/mL。對(duì)于鼻PBS;PDF;PN159;PN407;PN408和PN526的平均AUdast分別為118,438.13;1,289,219.50;973,038.80;725,950.50;721,601.50禾Q1,786,973.50分鐘承pg/mL。對(duì)于鼻PBS;PDF;PN159;PN407;PN408和PN526的平均AUCjnf分別為147,625.18;1'319，034.73;985,572.89;753,080.86;758,951.24和1，819，888.30分鐘*pg/mL。對(duì)于所有鼻制劑tl/2為約35-48分鐘；然而，PBS為83分鐘。參見(jiàn)表35關(guān)于包括標(biāo)準(zhǔn)偏差的所有藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的完整列表。對(duì)于PN159,PN407,PN408和PN526，基于關(guān)于緊密連接調(diào)控劑相對(duì)PDF制劑的AUCto的。/。BA分別為75,56，56和139%。與PDF相比，PBS的%生物利用度只為9%。還比較了變異系數(shù)(表37)。當(dāng)在制劑之間比較藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Cmax，PAUC時(shí)，所有的緊密連接調(diào)控劑具有相似的變異。使用一種方式方差分析模型分析所有5種制劑組之間的藥物代謝動(dòng)力學(xué)變化，并且發(fā)現(xiàn)關(guān)于Cmax,AUCto和AUCinfPBS制劑顯著低于PN526。(T醒:p=0.27;C,:p=0.009;AUClast:p=0.008;AUCinf:p=0.0097)。比較Cn^，PEG化的緊密連接調(diào)控劑PN526高于PDF1.9倍，并且分別高于PBS、PN407和PN40813.6、2.6和2.3倍。比較AUClast，PEG化的緊密連接調(diào)控劑PN526高于PDF1.4倍，并且分別高于PBS、PN407禾口PN40815.1、2.5和2.5倍。除了PBS在80分鐘以外，對(duì)于所有組tl/2約40分鐘。當(dāng)比較藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，C謹(jǐn)禾PAUC時(shí)，在PN526和PBS制劑之間存在顯著的差異；然而，在緊密連接調(diào)控劑之間不存在顯著性。與所有其它緊密連接調(diào)控劑相比，使用PN526生物利用度增加，并且與PBS對(duì)照制劑相比，藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的。這些數(shù)據(jù)表明，PEG化的肽制劑，PN526，具有增加的。/。BA，其高于沒(méi)有PEG化的肽的制劑，PN159,PN407,PN408,禾QPBS。此外，PN526的。/。BA也高于沒(méi)有PEG化的肽的陽(yáng)性對(duì)照PDF。本文給出的實(shí)施例只是用于舉例說(shuō)明的目的，并且不意欲限制本發(fā)明如權(quán)利要求所述的范圍。盡管在本文中應(yīng)用具體的術(shù)語(yǔ)和值，但是所述術(shù)語(yǔ)和值應(yīng)該理解為是代表性的，并且不限制本發(fā)明的范圍。出于所有目的，在本公開內(nèi)容中引用的所有出版物和參考文獻(xiàn)通過(guò)弓I用完全結(jié)合于此。權(quán)利要求1.一種含有肽的化合物，其具有在哺乳動(dòng)物黏膜中通過(guò)調(diào)控黏膜的滲透性而增強(qiáng)活性劑的黏膜上皮轉(zhuǎn)運(yùn)的活性，或其藥用鹽。2.權(quán)利要求1的化合物，其中所述肽具有小于IO千道爾頓的分子量。3.權(quán)利要求l的化合物，其中所述肽是緊密連接調(diào)控肽。4.權(quán)利要求l的化合物，其中所述化合物含有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或融合結(jié)構(gòu)域。5.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物含有鋅指結(jié)構(gòu)域。6.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物含有至少60%的賴氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸殘基。7.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物形成a-螺旋。8.權(quán)利要求l的化合物，其中所述滲透性是體外或體內(nèi)的。9.權(quán)利要求1的化合物，其中所述滲透性可逆增強(qiáng)。10.權(quán)利要求1的化合物，其中所述滲透性是基本上小于約90分鐘的時(shí)間周期。11.權(quán)利要求1的化合物，其中所述滲透性基本上在少于約60分鐘的時(shí)間周期內(nèi)被增強(qiáng)。12.權(quán)利要求1的化合物，其中在所述黏膜中所述滲透性被增強(qiáng)，而沒(méi)有誘導(dǎo)基本的細(xì)胞溶解。13.權(quán)利要求1的化合物，其中在所述黏膜中所述滲透性被增強(qiáng)，而保持細(xì)胞存活能力。14.權(quán)利要求1的化合物，其中所述滲透性通過(guò)增加黏膜脂質(zhì)流動(dòng)性而增強(qiáng)。15.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物是肽PN159。16.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物是PN159的類似物、綴合物、衍生物、變體、片段、模擬物、融合分子或復(fù)合物。17.權(quán)利要求1的化合物，其中所述肽選自由SEQ.IDNOs1-72組成的組。18.權(quán)利要求1的化合物，其中所述肽選自由SEQ.IDNOs32-35,38，46-49,53，和55組成的組。19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的化合物，其中所述化合物與水溶性鏈共價(jià)連接。20.權(quán)利要求19的化合物，其中所述化合物具有小于約300千道爾頓的分子量。21.權(quán)利要求19的化合物，其中所述化合物具有小于約200千道爾頓的分子量。22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的化合物，其中所述化合物與聚(環(huán)氧烷)鏈共價(jià)連接。23.權(quán)利要求22的化合物，其中所述聚(環(huán)氧烷)鏈?zhǔn)怯兄ф湹幕驘o(wú)支鏈的。24.權(quán)利要求22的化合物，其中所述聚(環(huán)氧烷)鏈?zhǔn)蔷垡叶?PEG)鏈。25.權(quán)利要求24的化合物，其中所述PEG具有約0.2和約200千道爾頓(kDa)之間的分子大小。26.權(quán)利要求24的化合物，其中所述PEG具有低于40kDa的大小。27.權(quán)利要求24的化合物，其中所述PEG具有低于20kDa的大小。28.權(quán)利要求24的化合物，其中所述PEG具有低于10kDa的大小。29.權(quán)利要求24的化合物，其中所述PEG具有低于5kDa的大小。30.權(quán)利要求24的化合物，其中所述PEG具有低于2kDa的大小。31.權(quán)利要求22的化合物，其中所述聚(環(huán)氧垸)具有小于2.00的多分散性值(Mw/Mn)。32.權(quán)利要求22的化合物，其中所述聚(環(huán)氧垸)具有小于1.20的多分散性值(Mw/Mn)。33.權(quán)利要求22的化合物，其中所述化合物和聚(環(huán)氧垸)通過(guò)間隔部分綴合。34.—種藥物制劑，其包含增強(qiáng)黏膜上皮轉(zhuǎn)運(yùn)有效量的權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)的化合物和治療有效量的活性劑。35.權(quán)利要求34的制劑，其中所述制劑減小穿過(guò)黏膜組織屏障的電阻。36.權(quán)利要求35的制劑，其中所述電阻的減少為至少80%。37.權(quán)利要求34的制劑，其中所述制劑相對(duì)于不包含權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)的化合物的類似的制劑增加所述活性劑穿過(guò)黏膜組織屏障的滲透性。38.權(quán)利要求37的制劑，其中滲透性的增加為至少兩倍。39.權(quán)利要求37的制劑，其中所述滲透性是旁細(xì)胞的。40.權(quán)利要求37的制劑，其中所述增加的滲透性由調(diào)控緊密連接導(dǎo)致。41.權(quán)利要求37的制劑，其中所述滲透性是跨細(xì)胞的或者是跨細(xì)胞和旁細(xì)胞的混合。42.權(quán)利要求37的制劑，其中所述黏膜組織屏障是上皮細(xì)胞層。43.權(quán)利要求42的制劑，其中所述上皮細(xì)胞選自由氣管細(xì)胞，支氣管細(xì)胞，肺泡細(xì)胞，鼻細(xì)胞，肺細(xì)胞,胃腸細(xì)胞，表皮細(xì)胞和口腔細(xì)胞組成的組。44.權(quán)利要求42的制劑，其中所述上皮細(xì)胞是鼻細(xì)胞。45.權(quán)利要求34的制劑，其中所述活性劑是肽、蛋白或核酸。46.權(quán)利要求45的制劑，其中所述肽或蛋白包括2-1000個(gè)氨基酸。47.權(quán)利要求45的制劑，其中所述肽或蛋包括2-50個(gè)氨基酸。48.權(quán)利要求45的制劑，其中所述肽或蛋白是環(huán)形的。49.權(quán)利要求45的制劑，其中所述肽或蛋白是二聚體或寡聚體。50.權(quán)利要求45的制劑，其中所述肽或蛋白選自由GLP-1、PYY3-36、PTH1-34和胰高血糖素樣肽的抑制劑-4組成的組。51.權(quán)利要求45的制劑，其中所述蛋白選自由P-干擾素、a-干擾素、胰島素、促紅細(xì)胞生成素、G-CSF、GM-CSF、生長(zhǎng)激素、以及它們的類似物組成的組。52.包含權(quán)利要求34-51中任一項(xiàng)的制劑的劑型，其中所述劑型是液體。53.權(quán)利要求52的劑型，其中所述液體是小滴形式。54.權(quán)利要求52的劑型，其中所述液體是氣溶膠形式。55.包含權(quán)利要求34-51中任一項(xiàng)的制劑的劑型，其中所述劑型是固體。56.權(quán)利要求55的劑型，其中所述固體在施用之前在液體中重構(gòu)。57.權(quán)利要求55的劑型，其中所述固體作為散劑施用。58.權(quán)利要求55的劑型，其中所述固體是膠囊、片劑或凝膠形式。59.—種給動(dòng)物施用分子的方法，其包括提供如權(quán)利要求34-58中任一項(xiàng)的制劑，并且將所述制劑與所述動(dòng)物的黏膜表面接觸。60.權(quán)利要求59的方法，其中所述黏膜表面是鼻內(nèi)。61.—種在哺乳動(dòng)物中增加鼻內(nèi)施用的活性劑的生物利用度的方法，其包括提供如權(quán)利要求34-58中任一項(xiàng)的制劑，并且將所述制劑施用給所述哺乳動(dòng)物。62.權(quán)利要求l的化合物，其中所述活性劑是siRNA。63.權(quán)利要求1的化合物，其中所述活性劑是dsDNA。64.權(quán)利要求1的化合物，其中所述活性劑是造血藥；抗感染藥；抗癡呆藥；抗病毒劑，抗腫瘤藥，退熱藥，鎮(zhèn)痛藥，消炎藥，抗?jié)兯帲惯^(guò)敏劑，抗抑郁藥，治療精神病的藥，強(qiáng)心劑，抗心律失常藥，血管舒張劑，抗高血壓藥，降血壓藥利尿劑，抗糖尿病藥，抗凝血?jiǎng)的懝檀妓?，用于骨質(zhì)疏松癥的治療劑，激素，抗生素，或疫苗。65.權(quán)利要求l的化合物，其中所述活性劑是細(xì)胞因子，肽激素，生長(zhǎng)因子，心血管因子，細(xì)胞粘附因子，中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)因子，體液電解質(zhì)因子，血液有機(jī)物質(zhì)，骨生長(zhǎng)因子，胃腸系統(tǒng)因子，腎因子，結(jié)締組織因子，感覺(jué)器官因子，免疫系統(tǒng)因子，呼吸系統(tǒng)因子，或生殖器官因子。66.權(quán)利要求1的化合物，其中所述活性劑是雄激素、雌激素、前列腺素、生長(zhǎng)激素、促性腺激素、白介素、類固醇或細(xì)胞因子。67.權(quán)利要求1的化合物，其中所述活性劑是用于肝炎、流感、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、結(jié)核病、金絲雀痘、水痘、麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、肺炎、或人類免疫缺陷性病毒(HIV)的疫苗。68.權(quán)利要求1的化合物，其中所述活性劑是白喉、破傷風(fēng)、假單胞菌(pseudomonas)或結(jié)核分枝桿菌(mycobactriumtuberculosis)的細(xì)菌類毒素。69.權(quán)利要求l的化合物，其中所述活性劑是水蛭素,hirulos或蛭素。70.權(quán)利要求1的化合物，其中所述活性劑是單克隆抗體、多克隆抗體、人源化抗體、抗體片段、或免疫球蛋白。71.權(quán)利要求1的化合物，其中所述活性劑是嗎啡，氫嗎啡酮，羥嗎啡酮，洛伐啡諾(lovorphanol)，左洛啡烷，可待因，納美芬，烯丙嗎啡，納洛酮，納曲酮，丁丙諾啡，布托啡諾，或納布啡。72.權(quán)利要求l的化合物，其中所述活性劑是可的松，氫化可的松，氟氫可的松，潑尼松，潑尼松龍，甲潑尼龍，曲安西龍，地塞米松，倍他米松，帕拉米松，或氟輕松。73.權(quán)利要求1的化合物，其中所述活性劑是秋水仙堿，對(duì)乙酰氨基酚，阿司匹林，布洛芬，酮洛芬，吲哚美辛，萘普生，美洛昔康，或吡羅昔康。74.權(quán)利要求l的化合物，其中所述活性劑是阿昔洛韋，利巴韋林，三氟胸苷，Ara-A(阿糖呋喃糖腺嘌呤)，?；B苷，去甲脫氧鳥嘌呤核苷，疊氮胸苷，二脫氧腺苷，或二脫氧胞苷。75.權(quán)利要求l的化合物，其中所述活性劑是螺內(nèi)酯，睪酮，雌二醇，黃體酮，促性腺激素，雌激素或孕酮。76.權(quán)利要求1的化合物，其中所述活性劑是罌粟堿，硝酸甘油，血管活性腸肽，降鈣素相關(guān)的基因肽，賽庚啶，多塞平，丙米嗪，西咪替丁，右美沙芬，氯氮平片劑，過(guò)氧化物歧化酶，神經(jīng)腦啡肽酶，兩性霉素B,灰黃霉素，咪康唑，酮康唑，噻康唑，伊曲康唑，氟康唑，頭孢菌素，四環(huán)素，氨基糖苷，紅霉素，慶大霉素，多粘菌素B，5-氟尿嘧啶，博來(lái)霉素，甲氨喋呤，和羥基脲，二脫氧肌苷，氟尿苷，6-巰基嘌呤，多柔比星，柔紅霉素,伊達(dá)比星，泰素，紫杉醇，維生素E,奎尼丁，哌唑嗪，維拉帕米，硝苯地平，或地爾硫萆。77.權(quán)利要求1的化合物，其中所述活性劑是組織血纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF),成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-酸性或堿性)，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-a或P)，血管活性腸肽，腫瘤壞死因子(TNF),下丘腦釋放因子，促乳素，促甲狀腺激素(TSH),促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH),甲狀旁腺激素(PTH)，促卵泡激素(FSF)，促性腺激素釋放激素(LHRH)，內(nèi)啡肽，胰高血糖素，降鈣氣催產(chǎn)素，卡貝縮宮素，aldoetecone，腦啡肽，somatostin，生長(zhǎng)激素，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素,a-促黑激素，利多卡因，舒芬太尼，特布他林，氟哌利多，東莨菪堿，戈那瑞林，環(huán)吡酮，丁螺環(huán)酮，降鈣素，色甘酸二鈉或咪達(dá)唑侖，環(huán)孢素，賴諾普利，卡托普利，地拉普利，雷尼替丁，法莫替丁，過(guò)氧化物歧化酶，天冬酰胺酶，精氨酸酶，精氨酸脫氨酶，腺苷脫氨酶核糖核酸酶，胰蛋白酶，化學(xué)胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，鈴蟾肽,P物質(zhì)，血管升壓素，a-球蛋白，運(yùn)鐵蛋白，凝血因子I,P-脂蛋白，(3-球蛋白，凝血因子II,血漿銅藍(lán)蛋白，oc2-糖蛋白，a2-球蛋白，胎球蛋白，al-脂蛋白，al-球蛋白，白蛋白，或前白蛋白。78.—種藥物產(chǎn)品，其包括含有權(quán)利要求1的化合物的溶液，和用于黏膜、鼻內(nèi)、或肺部噴霧的調(diào)節(jié)器。全文摘要本發(fā)明提供包含用于黏膜上皮轉(zhuǎn)運(yùn)活性劑的序列的化合物和成分。描述緊密連接調(diào)控肽成分用于轉(zhuǎn)運(yùn)和遞送。滲透性可以可逆地增強(qiáng)。用于增強(qiáng)遞送的化合物和成分可以是肽或蛋白變體、綴合物、或其它類似物類型和結(jié)構(gòu)。文檔編號(hào)A61K38/00GK101233151SQ200680027586公開日2008年7月30日申請(qǐng)日期2006年7月27日優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日發(fā)明者書-千·陳·夸伊,亨利·R·科斯坦蒂諾,保羅·?？瓶恕ぜs翰遜,史蒂文·C·夸伊,奧尼·P·西萊諾,崔坤元,納吉·拉莫哈瑞,邁克爾·E·休斯敦,邁克爾·V·坦普林申請(qǐng)人:納斯泰克制藥公司