專(zhuān)利名稱(chēng)：Src激酶抑制劑對(duì)溶骨性病變的抑制的制作方法
SRC激酶抑制劑對(duì)溶骨性病變的抑制本申請(qǐng)要求2005年6月17日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào) 60/691, 933的優(yōu)先權(quán)，通過(guò)參考將其以整體引入本文。 發(fā)明背景I. 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總地涉及細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞生理學(xué)、醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域。 更特別地，它涉及在有此需要的患者中調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞發(fā)生，特別是與 癌癥誘導(dǎo)的骨組織破壞有關(guān)的破骨細(xì)胞發(fā)生的方法。II. 相關(guān)技術(shù)的描述乳腺癌是美國(guó)最常見(jiàn)的女性惡性肺瘤，是導(dǎo)致婦女癌癥死亡的第 二大原因?；既橄侔┑膵D女有骨轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)。5到10%的乳腺癌患者在 初期即存在向骨轉(zhuǎn)移的疾病。患由轉(zhuǎn)移性乳腺癌導(dǎo)致的溶骨性骨病的 患者發(fā)生病理性骨折、骨痛、脊髓壓迫和高鈣血癥的危險(xiǎn)增加。當(dāng)前 治療骨轉(zhuǎn)移的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)是二碳磷酸鹽治療，它延遲了骨骼事件，但不 能完全阻止它們。此外，不是所有的患者都會(huì)對(duì)該治療有應(yīng)答。在需 要更有效的治療的同時(shí)，也需要對(duì)該疾病進(jìn)行進(jìn)一步的生物學(xué)和分子 水平的剖析。NF-kB的受體激活劑(RANK)及NF-kB配體的受體激活 劑(RANKL,也稱(chēng)作TRANCE/ODF/OPGL)是破骨細(xì)胞發(fā)生的重要介質(zhì)，與 多種疾病有關(guān)，包括類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、骨巨細(xì)胞瘤、佩 吉特病、轉(zhuǎn)移性乳腺和前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤和家族性膨脹性骨質(zhì) 溶解(familial expansile osteolysis)。護(hù)骨蛋白(OPG,也稱(chēng)作 0CIF/TR1)是一種可溶的、誘殺型受體，可以抑制RANKL結(jié)合到它的細(xì) 胞表面受體RANK上。RANKL、 RANK和0PG的敲除型小鼠模型表明了這些分子在破骨細(xì) 胞發(fā)生(即，骨再建)中具有重要作用。這些分子的生物學(xué)重要性通過(guò) 耙向破壞0PG誘導(dǎo)嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松癥，通過(guò)耙向破壞RANKL或OPG的過(guò)度表達(dá)誘導(dǎo)骨硬化癥得以理解。因此，破骨細(xì)胞的形成可以歸于骨髓微環(huán)境中RANKL和OPG的相對(duì)比例，該平衡的改變可能是很多代謝 性骨疾病中骨丟失的主要原因。與RANKL-/-小鼠類(lèi)似，RANK的乾向破 壞也導(dǎo)致了骨硬化癥表型。RANK-V-和1^胍1-/-小鼠都顯示了缺乏破 骨細(xì)胞，表明這些分子是破骨細(xì)胞發(fā)生的必要條件。此外，RANK和 RANKL是淋巴結(jié)器官發(fā)生及早期B和T細(xì)胞發(fā)育所需要的。此外，缺 乏TRAF6、 c-Src、 c-Fos或NF-k B亞基P50/p52的小鼠也顯示了骨硬 化癥表型；盡管這些突變小鼠具有破骨細(xì)胞，但這些細(xì)胞顯然在骨再 吸收中有缺陷。因此，RANKL和RANK以及它們的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳遞分子 是調(diào)節(jié)正常的骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)的統(tǒng)治性因子。RANK/RANKL/OPG在骨再建中的重要性和大多數(shù)癌誘導(dǎo)的骨組織 破壞是由于破骨活性增強(qiáng)之間的關(guān)系，提示RANK/RANKL/OPG在骨疾病 和癌癥中具有重要作用。除了 RANK/RANKL/OPG與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)外， 近來(lái)的報(bào)道提示這些分子在其它疾病包括類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨巨細(xì)胞 瘤、佩吉特病和家族性膨脹性骨質(zhì)溶解(由于RANK的外顯子1中的突 變)中的潛在作用。轉(zhuǎn)移性乳腺和前列腺癌具有作為骨中的轉(zhuǎn)移灶侵入 和生長(zhǎng)的能力，導(dǎo)致了溶骨性病變。在其中腫瘤導(dǎo)致增加的破骨細(xì)胞 發(fā)生和骨組織破壞的轉(zhuǎn)移性腫瘤小鼠^^莫型中，全身施用OPG減輕了腫 瘤介導(dǎo)的骨組織破壞和與骨癌有關(guān)的疼痛。因此，靶向于MM信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)機(jī)制可能可以用作 一種治療策略來(lái)抑制不希望的與癌癥和代謝性骨 疾病有關(guān)的骨組織破壞。需要另外的策略來(lái)防止與轉(zhuǎn)移性癌癥有關(guān)的 不希望的骨組織破壞或者伴隨骨丟失或與骨丟失有關(guān)的病癥。發(fā)明筒述根據(jù)本發(fā)明，提供結(jié)構(gòu)式I， II, III，或IV的化合物式I<formula>formula see original document page 9</formula>其中n是l-3的整數(shù)；X是N, CH，條件是當(dāng)X是N時(shí)，n是2或 3; R是l到3個(gè)碳原子的烷基；R (1)是2， 4-二 Cl ， 5-0Me; 2，4-二C1; 3，4，5-三-OMe; 2-C1, 5-0Me; 2-Me, 5-0Me; 2，4-二-Me; 2， 4-二 Me-5-0Me， 2，4-二Cl， 5-0Et; R (2)是1到2個(gè)碳原子的烷基，和其 藥學(xué)可接受的鹽。式II<formula>formula see original document page 9</formula>其中n是2或3; R是l到3個(gè)碳原子的烷基；R(2)是l到2個(gè)碳 原子的烷基，和其藥學(xué)可接受的鹽。式III,一(,n其中n是2或3; R(1)是2，4-二C1， 5-0Me; 2，4-二C1; 3， 4， 5-三-OMe; 2-C1， 5-0Me; 2-Me, 5-0Me; 2， 4-二-Me; 2， 4-二 Me-5-0Me， 2，4-二Cl， 5-OEt; R (2)是1到2個(gè)碳原子的烷基，和其藥學(xué)可接受 的鹽。式IV其中n是2或3; R是l到3個(gè)碳原子的烷基；R (1)是2， 4-二 Cl ， 5-0Me; 2，4-二C1; 3， 4， 5-三-0Me; 2-C1， 5-0Me; 2-Me， 5-0Me; 2,4-二-Me; 2， 4-二Me-5-0Me， 2，4-二C1， 5-0Et。本發(fā)明的化合物可以用于治療、預(yù)防或抑制骨再吸收、病理性骨 再吸收、破骨細(xì)胞活性、破骨細(xì)胞發(fā)生、溶骨性病變或者其他伴隨著 骨丟失或破壞的病理性情況。在一些方案中，所述化合物作為藥物組 合物的一部分使用。本發(fā)明的具體化合物包括化合物l一4-((2，4-二氯-5-曱氧基苯基)氨基)-6-曱氧基-7-(3-(4-甲基-1-哌嗪基)丙氧基)-3-喹啉腈；化 合物2 — 4- ((2， 4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基)-7- (3- (4-乙基-l-哌溱 基)丙氧基)-6-甲氧基-3-喹啉腈；化合物3—4-[(2，4-二氯-5-甲氧基 苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[2-(4-甲基-l-哌嗪基)乙氧基]-3-喹啉腈； 化合物4 — 4- [ (2， 4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-7- [2- (4-乙基-l-哌 嗪基)乙氧基]-6-甲氧基-3-喹啉腈；化合物5 — 4-[(2，4-二氯-5-曱氧 基苯基)氨基]-6-甲氧基-7- [ (l-甲基哌啶-4-基)甲氧基]-3-喹啉腈； 化合物6 — 4- [ (2， 4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]+甲氧基-7- [2- (1-甲基哌啶-4-基)乙氧基]-3-喹啉腈；化合物7—4-[(2，4-二氯-5-甲氧 基苯基)氨基]-6-甲氧基-7- [3- (1-甲基哌啶-4-基)丙氧基]會(huì)啉-3-腈；化合物8 — 4-[(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-7-[(l-乙基哌啶 -4-基)甲氧基]-6-甲氧基喹啉-3-腈；化合物9一4-[(2，4-二氯-5-曱 氧基苯基)氨基]-6-乙氧基-7- [3- (4-甲基哌溱-l-基)丙氧基]會(huì)啉-3-腈；化合物10 — 4-[(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧基 -7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹啉-3-腈；化合物11一4-[(2，4-二 氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧基-7-[3-(4-乙基哌嚷-l-基)丙氧基] 喹啉-3-腈；化合物12 — 4-[(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧 基-7-[3-(l-甲基哌啶-4-基)丙氧基]喹啉-3-腈；化合物13 — 4- [ (2， 4-二氯-5-曱氧基苯基)氨基]+乙氧基-7- [2- (4-甲基-l-哌 嗪基)乙氧基]喹啉-3-腈；化合物14一4-[(2，4-二氯-5-曱氧基苯基) 氨基]-6-乙氧基-7- [2- (1-甲基哌啶-4-基)乙氧基]會(huì)啉-3-腈；化合物 15 — 4-[(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-曱氧基-7-[3-(4-丙基 -l-哌嗪基)丙氧基]-3-喹啉腈；化合物16 —4-[(2，4-二氯苯基)氨 基]-6-曱氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)曱氧基]-3-喹啉腈；化合物17 一6-甲氧基-7- [ (1-甲基哌啶-4-基)曱氧基]-4- [ (3， 4， 5-三甲氧基苯 基)氨基]喹啉-3-腈；化合物18 — 4-[(2-氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[(l-甲基哌啶-4-基)曱氧基]喹啉-3-腈；化合物19一6-曱 氧基-4- [ (5-甲氧基-2-甲基苯基)氨基]-7- [ (1-甲基哌啶-4-基)甲氧 基]喹啉-3-腈；化合物20 — 4-[(2，4-二曱基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹啉-3-腈；化合物21 — 6-甲氧基 -4- [ (5-甲氧基-2， 4-二曱基苯基)氨基]-7- [ (1-甲基哌啶-4-基)甲氧 基]全啉-3-腈；化合物22 —4-[(2，4-二氯-5-乙氧基苯基)氨基]-6-甲 氧基-7-[(l-曱基哌啶-4-基)甲氧基]喹啉-3-腈；和其藥學(xué)可接受的 鹽。在一些實(shí)施方案中， 一種優(yōu)選的化合物是化合物1 —4-((2，4-二 氯-5-甲氧基苯基)氨基)-6-曱氧基-7- (3- (4-甲基-1-哌嗪基)丙氧 基)-3-喹啉腈?？紤]到，本文所述的任何方法或組合物可以相對(duì)于本文所述的任 何其他方法或組合物使用。當(dāng)在權(quán)利要求和/或說(shuō)明書(shū)中與術(shù)語(yǔ)"包含"一起使用時(shí)，詞語(yǔ)"一" 可以意指"一"，但它也具有"一種或多種"，"至少一種"和"一 種或一種以上"的含義。除非另有明確說(shuō)明是指僅有的供選方案或供選方案是互相排斥 的，在權(quán)利要求中使用術(shù)語(yǔ)"或，，是指"和/或"，盡管本公開(kāi)內(nèi)容支 持意指僅有的供選方案和"和/或"的定義。根據(jù)下文的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯 而易見(jiàn)。但是，應(yīng)當(dāng)理解的是，詳細(xì)的描述和具體的實(shí)施例盡管指出 了本發(fā)明具體的實(shí)施方案，但它們都是以解釋說(shuō)明的方式給出的，因 為根據(jù)該詳細(xì)描述，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種改變和變化對(duì)于 本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見(jiàn)。附圖簡(jiǎn)述下面的附圖形成了本說(shuō)明書(shū)的一部分，將其包括在內(nèi)以進(jìn)一步地 說(shuō)明本發(fā)明的一些方面。通過(guò)參考這些附圖中的一或多幅并結(jié)合下文 具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述，可以更好地理解本發(fā)明。附

圖1A-1C. SKI606是破骨細(xì)胞發(fā)生的有效抑制劑。(附圖U)4-苯基氨基-3-喹啉腈SKI606的結(jié)構(gòu)。(附圖1B)將B醒細(xì)胞接種入48 孔板中(2 x 104個(gè)細(xì)胞/孔)，并用M-CSF (10ng/ml)或M-CSF和RANKL (100 ng/ml)刺激， 一式四份使用所示濃度的SKI606。在第3天補(bǔ)充 M-CSF。在第5天固定細(xì)胞并用來(lái)自Sigraa-Aldrich (St. Louis， M0)的TRAP染色試劑盒進(jìn)行TRAP染色。(附圖1C)顯示的是三個(gè)試驗(yàn)的代 表性數(shù)據(jù)。顯示的是用10x物鏡來(lái)自不同處理的代表性視野的照片。附圖2A-2B. B醒細(xì)胞以時(shí)間依賴(lài)性的方式應(yīng)答SKI606。(附圖 2A)將BMM細(xì)胞接種入48孔板中(2 x 104個(gè)細(xì)胞/孔)，并用M-CSF (10 ng/ml)或M-CSF和RANKL (300 ng/ml)—式四份預(yù)處理指定時(shí)間，然 后用300 nM SKI606處理。在第3天補(bǔ)充M-CSF。在第5天固定細(xì)胞 并用來(lái)自Sigma-Aldrich (St. Louis， MO)的TRAP染色試劑盒進(jìn)行 TRAP染色。(附圖2B)顯示的是三個(gè)試驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。照片是用10x物鏡來(lái)自不同處理的代表性視野。附圖3A-3B. MDA-MB-435細(xì)胞在RAW264. 7細(xì)胞中刺激破骨細(xì)胞 發(fā)生。(附圖3A)。將RAW264. 7細(xì)胞(500細(xì)胞/孔；每種處理8個(gè)孔) 接種入含指定密度MDA-MD-435細(xì)胞的96孔板中，并培養(yǎng)5天。(附圖 3B)如上所述制備條件培養(yǎng)基。RAW264. 7細(xì)胞(750個(gè)細(xì)胞/孔；每種 處理8個(gè)孔)與指定濃度的來(lái)自MDA-MB-435的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)5天。 在第5天固定培養(yǎng)物并用來(lái)自Sigma-Aldrich (St. Louis， M0)的TRAP 染色試劑盒進(jìn)行TRAP染色。顯示的是五個(gè)試驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。照片是 用10x物鏡來(lái)自不同處理的代表性視野。附圖4A-4B. SKI606抑制RAW264. 7中MDA-MB-435刺激的破骨 細(xì)胞發(fā)生。(附圖4A)將RAW264. 7細(xì)胞(500細(xì)胞/孔；每種處理8個(gè) 孔)接種入含指定密度MDA-MD-435 (800細(xì)胞/孔)細(xì)胞的96孔板中，并 在增加劑量的SKI606存在下培養(yǎng)5天。(附圖4B)將RAW264. 7細(xì)胞 (750細(xì)胞/孔；每種處理8個(gè)孔)接種入96孔板中10%來(lái)自MDA-MB-435 的條件培養(yǎng)基中5天。在第5天固定培養(yǎng)物并用來(lái)自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)的TRAP染色試劑盒進(jìn)行TRAP染色。顯示的是五個(gè)試 驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。附圖5A-5C. SKI606顯著地減輕了肺瘤生長(zhǎng)和溶骨性病變。將 小鼠分成3個(gè)治療組。在脛骨注射5 x 105 MDA-MB-435細(xì)胞后3天開(kāi) 始每周5天口飼栽體(在PBS中的0. 5%Methocel/0. 4%吐溫)、在載體 中的150 mg/kg SKI606,或S. C.注射在0.1 ml PBS中的10 mg/kgZomeda (zolendronic acid)治療，共9周。(附圖5A)如下確定肺瘤 的重量注射腿的重量-相同動(dòng)物未注射后腿的重量。(附圖5B)由數(shù) 字X-射線(xiàn)圖像估計(jì)溶骨面積；將NIH Scion程序用于測(cè)量脛骨的面積 和溶骨面積，以計(jì)算溶骨區(qū)中的像素/脛骨面積中的像素的比例(附圖 5C)。固定注射了腫瘤的脛骨，并在EDTA中脫鉀，用來(lái)自Sigma-Aldrich (St. Louis， M0)的TRAP染色試劑盒將切片染色觀察多核破骨細(xì)胞03 個(gè)核)的存在。附圖6A-6C. SKI606顯著地減輕了腫瘤生長(zhǎng)和溶骨性病變。在 注射后35天攝取X-射線(xiàn)圖像，并以14天的間隔攝像。在9周后，對(duì) 用口飼載體(在PBS中的0.5% Methoce1/0. 4%吐溫)治療的對(duì)照組(附 圖6A)、用150 mg/kg (附圖6B)或Zomeda (附圖6C)治療的小鼠攝 取最終X-射線(xiàn)圖像。說(shuō)明性實(shí)施方案的描述活的骨組織通過(guò)釣礦物質(zhì)的再吸收和沉積過(guò)程連續(xù)地獲得補(bǔ)充。 該過(guò)程稱(chēng)作吸收-再吸收循環(huán)，通過(guò)兩種細(xì)胞類(lèi)型-成骨細(xì)胞和破骨細(xì) 胞來(lái)促進(jìn)。破骨細(xì)胞是一種多核細(xì)胞，并且是體內(nèi)已知具有降解(或再 吸收)骨的能力的唯——種細(xì)胞。在某些病理情況中，吸收-再吸收循 環(huán)是有缺陷的，導(dǎo)致骨降解。骨的降解典型地導(dǎo)致病理性骨折、骨痛、 脊髓壓迫和高鈣血癥的危險(xiǎn)增加。本發(fā)明的實(shí)施方案包括治療溶骨性病變、骨再吸收疾病或與病理 情況有關(guān)的骨再吸收的方法和組合物， 一般包括但不限于，骨質(zhì)疏松 癥、關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌向骨的轉(zhuǎn)移、骨癌、高鈣血癥、具 有矯形外科植入物的溶骨性病變、佩吉特病、和與曱狀旁腺功能亢進(jìn) 有關(guān)的骨丟失。代表性的癌癥包括但不限于，乳腺癌、前列腺癌、結(jié) 腸癌、子宮內(nèi)膜癌、多發(fā)性骨髓瘤、腎細(xì)胞癌、頭和頸癌及宮頸癌。 關(guān)節(jié)炎性病癥包括但不限于，佐劑-、膠原-、細(xì)菌-和抗原-誘發(fā)的關(guān) 節(jié)炎，特別是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。溶骨性病變包括但不限于釉質(zhì)細(xì)胞瘤、 動(dòng)脈瘤性骨嚢腫(損傷)、血管肉瘤-高分級(jí)、血管肉瘤-低分級(jí)、高歇病的骨損傷、甲狀旁腺功能亢進(jìn)的棕色瘤、成軟骨細(xì)胞瘤、軟骨粘液 樣纖維瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、透明細(xì)胞軟骨肉瘤、常規(guī)的髓內(nèi)骨肉 瘤、退行性關(guān)節(jié)病、成纖維細(xì)胞性纖維瘤、具有惡性纖維組織細(xì)胞瘤 的骨干骨髓狹窄、內(nèi)生軟骨瘤、嗜酸細(xì)胞肉芽腫、上皮樣血管內(nèi)皮瘤、 骨的尤因肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉瘤、纖維性結(jié)構(gòu)不良、紅色反應(yīng)性骨膜炎、巨細(xì)胞瘤、血管球瘤、骨中的綠色肉瘤、hardcastle"綜 合征、血管瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、高分級(jí)表面骨肉瘤、骨的霍杰金淋 巴瘤、皮質(zhì)內(nèi)骨肉瘤、骨內(nèi)分化良好的骨肉瘤、近皮質(zhì)軟骨瘤、白血 病、惡性纖維性組織細(xì)胞瘤、肢骨紋狀肥大、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性 腎癌、轉(zhuǎn)移性肺癌、轉(zhuǎn)移性前列腺癌、多病灶性骨肉瘤、多發(fā)性骨髄 瘤、骨化性肌炎、骨的神經(jīng)纖維瘤、非霍杰金淋巴瘤、非骨化性纖維 瘤(纖維性骨皮質(zhì)缺損)、nora， s損害、成骨細(xì)胞瘤、骨軟骨瘤、骨 軟骨瘤病(hmoce)、骨纖維結(jié)構(gòu)不良、骨樣骨瘤、骨瘤、骨髓炎、條紋 狀骨病、全身脆弱性骨硬化、骨肉瘤、佩吉特病、骨膜外骨肉瘤、骨 膜軟骨瘤、骨膜骨肉瘤、色素絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎、佩吉特病后肉瘤 (post-paget，s sarcoma)、骨的神經(jīng)鞘瘤、小細(xì)胞骨肉瘤、單一性 骨嚢腫、單生性纖維瘤、孤立性骨髓瘤(漿細(xì)胞瘤)、軟骨下囊腫、滑 膜性軟骨瘤病、毛細(xì)血管擴(kuò)張性骨肉瘤、"Tug"損害-骨千骺端纖維 缺損，或單房性骨嚢腫。i. SRC-相關(guān)的激酶抑制劑根據(jù)本發(fā)明，提供結(jié)構(gòu)式I的化合物其中n是l-3的整數(shù)；X是N、 CH，條件是當(dāng)X是N時(shí)，n是2或 3; R是l到3個(gè)碳原子的烷基；R(1)是2， 4-二 Cl， 5-0Me; 2，4-二Cl; 3,4，5-三-0Me; 2-C1 ， 5-0Me; 2-Me， 5-0Me; 2，4-二-Me; 2,4-二 Me-5-0Me， 2，4-二Cl， 5-0Et; R (2)是1到2個(gè)碳原子的烷基，和/或 其藥學(xué)可接受的鹽。本發(fā)明的具體化合物包括化合物1一4-((2，4-二氯-5-甲氧基苯 基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(4-甲基-l-哌溱基)丙氧基)-3-喹啉腈；化 合物2 — 4- ((2， 4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基)-7- (3- (4-乙基-l-哌嗪 基)丙氧基)-6-甲氧基-3-喹啉腈；化合物3 — 4-[(2，4-二氯-5-甲氧基 苯基)氨基]-6-甲氧基-7- [2- (4-甲基-1 -哌溱基)乙氧基]-3-喹啉腈； 化合物4一4- [ (2， 4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-7- [2- (4-乙基-l-哌 嗪基)乙氧基]-6-甲氧基-3-喹啉腈；化合物5 — 4-[(2，4-二氯-5-甲氧 基苯基)氨基]-6-甲氧基-7- [ (l-甲基哌啶-4-基)甲氧基]-3-喹啉腈； 化合物6 — 4-[ (2， 4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[2- (l-甲基哌啶-4-基)乙氧基]-3-喹啉腈；化合物7 — 4-[(2，4-二氯-5-甲氧 基苯基)氨基]-6-甲氧基-7- [3- (1-甲基哌啶-4-基)丙氧基]喹啉-3-腈；化合物8 — 4-[(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-7-[(l-乙基哌啶 -4-基)甲氧基]-6-甲氧基喹啉-3-腈；化合物9一4-[(2，4-二氯-5-甲 氧基苯基)氨基]-6-乙氧基-7- [3- (4-甲基哌溱-1 -基)丙氧基]喹啉-3-腈；化合物10-4-[(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧基 -7-[(l-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹啉-3-腈；化合物11一4-[(2，4-二 氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧基-7- [3- (4-乙基哌溱-l-基)丙氧基〗 喹啉-3-腈；化合物12 — 4-[(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧 基-7-[3-(1-甲基哌啶-4-基)丙氧基]喹啉-3-腈；化合物13 — 4- [ (2， 4-二氯-5-曱氧基苯基)氨基]-6-乙氧基-7- [2- (4-甲基-l-哌 嗪基)乙氧基]喹啉-3-腈；化合物14一4-[(2，4-二氯-5-曱氧基苯基) 氨基]-6-乙氧基-7- [2- (l-甲基哌啶-4-基)乙氧基]喹啉-3-腈；化合物 15 — 4- [ (2， 4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-曱氧基-7- [3- (4-丙基-l-哌嗪基)丙氧基]-3-喹啉腈；化合物16 — 4-[(2，4-二氯苯基)氨 基]-6-甲氧基-7-[(l-甲基哌啶-4-基)甲氧基]-3-喹啉腈；化合物17 一 6-曱氧基-7- [ (l-甲基哌啶-4-基)甲氧基]-4- [ (3， 4， 5-三甲氧基苯 基)氨基]喹啉-3-腈；化合物18 — 4-[(2-氯-5-曱氧基苯基)氨基]-6-曱氧基-7-[(1-曱基哌啶-4-基)甲氧基]喹啉-3-腈；化合物19一6-甲 氧基-4- [ (5-甲氧基-2-甲基苯基)氨基]-7- [ (1-甲基哌啶-4-基)甲氧 基]喹啉一3一腈；化合物20 — 4-[(2，4-二曱基苯基)氨基]-6-甲氧基 -7-[(l-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹啉-3-腈；化合物21 — 6-甲氧基 -4- [ (5-甲氧基-2， 4-二甲基苯基)氨基]-7- [ (1-甲基哌啶-4-基)曱氧 基]喹啉-3-腈；化合物22 — 4-[(2，4-二氯-5-乙氧基苯基)氨基]-6-曱 氧基-7-[(l-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹啉-3-腈；和其藥學(xué)可接受的 鹽。本發(fā)明的化合物可以用于治療、緩解、預(yù)防或抑制破骨細(xì)胞發(fā)生 或骨丟失。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述化合物用作藥物組合物的 一部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物1 —4-((2，4-二氯-5-甲氧 基苯基)氨基)-6-曱氧基-7- (3- (4-甲基-l-哌溱基)丙氧基)-3-喹啉腈 用于抑制破骨細(xì)胞發(fā)生或骨丟失。藥學(xué)可接受的鹽是由有機(jī)和無(wú)機(jī)酸例如醋酸、乳酸、羧酸、檸檬 酸、肉桂酸、酒石酸、琥珀酸、延胡索酸、馬來(lái)酸、丙二酸、扁桃酸、 蘋(píng)果酸、草酸、丙酸、鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、羥乙酸、 丙酮酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、水楊酸、苯甲酸和類(lèi)似已知的 可接受的酸產(chǎn)生的那些鹽。術(shù)語(yǔ)"烷基"是指飽和脂族基團(tuán)，包括直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán) 烷基(脂環(huán)族)、烷基取代的環(huán)烷基和環(huán)烷基取代的烷基。在一個(gè)優(yōu)選 的實(shí)施方案中，直鏈或支鏈烷基在它的主鏈中具有3個(gè)或更少個(gè)碳原 子。所述化合物可以通過(guò)口服；病損內(nèi)；腹膜內(nèi)；肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射； 輸注；脂質(zhì)體介導(dǎo)的遞送；局部；鼻；肛門(mén)；陰道；舌下；尿道；經(jīng) 皮；鞘內(nèi)；眼部或耳部遞送來(lái)提供。為了得到提供本發(fā)明的化合物的一致性，優(yōu)選本發(fā)明的化合物是單位劑量的形式。適當(dāng)?shù)膯挝粍┬桶ㄆ瑒⒛z嚢和在嚢或小瓶中的粉末。這樣的單位劑型可以包含O. 1， 0.5， 1， 10， 100， 200到300 ng或mg的本發(fā)明的化合物，包括其間 的所有值和范圍，在某些方面是2到100 ng或mg。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，單位劑型包含50到150 mg的本發(fā)明的化合物。本發(fā)明的化合 物可以口月良或以其他^>知的施用途徑施用。該化合物可以每日施用1， 2， 3， 4， 5到6次，更通常是每天、周或月1, 2， 3到4次，持續(xù)數(shù) 周、月或年。有效量是本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定的；它也取決于該化合 物的形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)地進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性的活性試驗(yàn)，以確 定該化合物在生物測(cè)定中的生物活性，由此確定需要施用多大劑量， 以及外推和分析臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)。本發(fā)明的化合物可以與常規(guī)的賦形劑 一起配制，其中賦形劑是例 如填充劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、調(diào)味劑、色素添加劑或載體。 載體可以是例如稀釋劑、氣霧劑、局部用載體、水性溶液、非水性溶 液或固體載體。載體可以是聚合物。本發(fā)明的栽體包括任何標(biāo)準(zhǔn)的藥 學(xué)可接受的栽體，例如磷酸鹽緩沖鹽溶液、醋酸鹽緩沖鹽溶液、水、 乳劑例如油/水乳劑或甘油三酯乳劑、各種類(lèi)型的潤(rùn)濕劑、片劑、包衣 片和/或膠嚢。當(dāng)口服或局部提供時(shí)，這些化合物可以通過(guò)在不同載體中遞送來(lái) 提供給患者。典型地，這些載體包含賦形劑例如淀粉、乳、糖、某些 類(lèi)型的粘土、明膠、硬脂酸、滑石、植物脂肪或油、樹(shù)膠或二醇。具 體的栽體需要根據(jù)所需的遞送方法來(lái)選擇，例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) 可以用于靜脈內(nèi)或全身遞送，植物脂肪、乳青、藥青、軟青或凝膠可 以用于局部遞送。本發(fā)明的化合物可以與適當(dāng)?shù)南♂寗?、防腐劑、增溶劑、乳化劑?輔劑和/或載體一起遞送，用于治療或預(yù)防溶骨性病變和/或骨丟失。 這些組合物是液體或凍干或其它千燥制劑，包括各種緩沖內(nèi)容物(例 如，Tris-HC1、醋酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強(qiáng)度的稀釋劑、防止表 面吸收的添加劑例如白蛋白或明膠、洗滌劑(例如，吐溫20、吐溫80、PLUR0NICF68、膽汁酸鹽)、增溶劑(例如，甘油、聚乙二醇)、抗氧化 劑(例如，抗壞血酸、偏亞硫酸氬鈉)、防腐劑(例如，疏柳汞、苯甲醇、 尼泊金類(lèi))、填充物質(zhì)或張力調(diào)節(jié)劑(例如，乳糖、甘露醇)、聚合物例 如聚乙二醇的共價(jià)結(jié)合、與金屬離子的絡(luò)合，或者將該化合物摻入到 水凝膠或脂質(zhì)體的顆粒制劑、微乳、膠束、單層或多層囊泡、血影或 球芽中或上。這些組成將影響該化合物或組合物的物理狀態(tài)、溶解性、 穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除率。組成的選擇取決于能治療、緩 解或預(yù)防特定病癥或疾病狀態(tài)的化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明的化合物可以通過(guò)膠囊局部遞送，該膠囊允許在一段時(shí)間 內(nèi)持續(xù)釋放該化合物。控制或持續(xù)釋放組合物包括在親脂貯庫(kù)(例如， 脂肪酸、蠟、油)中的制劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供本發(fā)明的化合物作為活性治療物質(zhì)用于治療、 調(diào)節(jié)、緩解、預(yù)防或抑制破骨細(xì)胞發(fā)生或骨丟失。本發(fā)明進(jìn)一步提供治療人骨丟失的方法，包括給診斷出溶骨性病 變或處于發(fā)生溶骨性病變的危險(xiǎn)的個(gè)體施用有效量的本發(fā)明的化合物 或藥物組合物。提供給患者的劑量將是不同的，取決于施用的是什么， 施用的目的，施用的方式等等。"治療有效量"是足以治愈、減輕或 緩解骨丟失的癥狀的量。本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)遞送或者與用于治療任何相關(guān)的疾病狀 態(tài)或病理情況的其他化合物組合遞送?？梢杂上铝形镔|(zhì)制備本發(fā)明的化合物(a)商業(yè)可購(gòu)的原料(b)可 以如文獻(xiàn)所述制備的已知原料或(c)本文參考的方案和試驗(yàn)方法中描 述的新中間體。本發(fā)明包括的化合物可以根據(jù)在U. S.專(zhuān)利6， 002， 008 和6， 780， 996;和U. S.專(zhuān)利申請(qǐng)20050101780A1中乂>開(kāi)的合成途徑來(lái) 制備，將每篇都以整體通過(guò)參考引入本文。反應(yīng)。有機(jī)合成領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在分子上存在的各種官能 團(tuán)必須與所計(jì)劃的化學(xué)轉(zhuǎn)化相符。當(dāng)沒(méi)有指定時(shí)，合成步驟的順序、 保護(hù)基的選擇和脫保護(hù)的條件對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。此夕卜，在一些情況中，原料上的取代基可能與某些反應(yīng)條件是不相容的。 與給定取代基有關(guān)的限制是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。適當(dāng)時(shí)在惰 性氣氛中進(jìn)行反應(yīng)。在文獻(xiàn)(Boschelli,等人，2001a; Boschelli等人，2001b; Boschelli等人，2003; Boschelli等人,2004和Ye等人，2001,將 每一篇都通過(guò)參考引入本文)中已經(jīng)報(bào)道了式I化合物的制備。n. 骨吸收-再吸收循環(huán)活的骨組織通過(guò)鉀礦物質(zhì)的再吸收和沉積過(guò)程連續(xù)地獲得補(bǔ)充。 該過(guò)程稱(chēng)作吸收-再吸收循環(huán)，通過(guò)兩種細(xì)胞類(lèi)型-成骨細(xì)胞和破骨細(xì) 胞來(lái)促進(jìn)。破骨細(xì)胞是一種多核細(xì)胞，并且是體內(nèi)已知具有降解(或再 吸收)骨的能力的唯一一種細(xì)胞。該再吸收活性是通過(guò)骨組織中的破骨 細(xì)胞形成凹(再吸收腔隙)完成的。事實(shí)上，細(xì)胞培養(yǎng)物中的破骨細(xì)胞 活性是通過(guò)它們?cè)诘V化組織例如骨或抹香鯨牙質(zhì)的切片上形成這些凹 的能力來(lái)測(cè)量的。破骨細(xì)胞來(lái)源于與血液的有形成分共有的造血前體 (Takahashi等人，1987)。破骨細(xì)胞的前體是單核的細(xì)胞(具有單個(gè)核 的細(xì)胞)，其見(jiàn)于骨髓中，在通過(guò)細(xì)胞融合方式經(jīng)歷復(fù)制和分化后形成 成熟和獨(dú)特的多核石皮骨細(xì)胞。成熟的^f皮骨細(xì)胞與其他多核細(xì)胞的區(qū)別 在于酶-耐酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的存在，該酶通常用作破骨細(xì)胞的 細(xì)胞標(biāo)志物。在與異常的破骨細(xì)胞發(fā)育或功能有關(guān)的病理情況中有這樣的情 況，其中骨再吸收增加導(dǎo)致發(fā)生骨結(jié)構(gòu)脆弱和/或易碎，例如骨質(zhì)疏松 癥，或骨吸收增加導(dǎo)致發(fā)生骨量過(guò)量，例如骨硬化癥。據(jù)信，破骨細(xì) 胞或成骨細(xì)胞群體過(guò)量或不足的發(fā)生是由于特定細(xì)胞因子相應(yīng)缺少或 過(guò)量所致。很多已知的細(xì)胞因子刺激或抑制血細(xì)胞數(shù)種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子 例如M-CSF,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子a (TGF-ct)，白細(xì)胞介素-1 (IL-1)和肺瘤 壞死因子(TNF)顯示出可以刺激骨髓單核細(xì)胞的增殖。盡管細(xì)胞因子例 如白細(xì)胞介素-l、腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素-6 (IL-6)可影響破骨細(xì) 胞生成和分化(Mundy， 1990)，這些因子不是特異性的破骨細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。RANKL、 RANK和護(hù)骨蛋白誘殺型受體(OPG)的敲除型小鼠模型表明 了這些分子在破骨細(xì)胞發(fā)生(即，骨再建)中具有重要作用。這些分子 的生物學(xué)重要性通過(guò)靶向破壞OPG誘導(dǎo)嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松癥，通過(guò)靶向 破壞RANKL或OPG的過(guò)度表達(dá)誘導(dǎo)骨硬化癥得以理解(Bucay等人， 1998; Kong等人，1999; Mizuno等人，1998)。因此，破骨細(xì)胞的形 成可歸于骨髓微環(huán)境中RAML和OPG的相對(duì)比例，該平衡的改變可能 是很多代謝性骨疾病中骨丟失的主要原因。與1^鳳卜/-小鼠類(lèi)似， RANK的粑向破壞也導(dǎo)致了骨硬化癥表型(Dougall等人，1999; Li等 人，2000)。 1^服-/-和RANKL-Z-小鼠都顯示出缺乏破骨細(xì)胞，表明這 些分子是破骨細(xì)胞發(fā)生的必要條件。此外，RANK和RANKL是淋巴結(jié)器 官發(fā)生及早期B和T細(xì)胞發(fā)育所需要的(Dougall等人，1999; Kong 等人，1999)。此外，缺乏TRAF6 (Lomaga等人，1999)、 c-Src (Soriano 等人，1991)、 c-Fos (Johnson等人，1992)或NF- k B亞基 p50/p52(Franzoso等人，1997; Iotsova等人，1997)的小鼠也顯示 出骨硬化癥表型；盡管這些突變小鼠具有破骨細(xì)胞，但這些細(xì)胞顯然 在骨再吸收中有缺陷。維持骨完整性需要骨形成和骨再吸收之間保持動(dòng)態(tài)平衡。通過(guò)破 骨細(xì)胞前體的分化和融合的凈效應(yīng)和通過(guò)活性破骨細(xì)胞凋亡的活性和 速率可以確定活性破骨細(xì)胞的凈庫(kù)大小。盡管成骨細(xì)胞系細(xì)胞表達(dá)的各種細(xì)胞因子(TNF、 IL-1、 IL-6、 IL-ll、 TGF)和分子(lla， 25-二羥 基維生素D3和糖皮質(zhì)激素)已經(jīng)在破骨細(xì)胞分化中顯示出具有一定的 作用，但似乎重要的因子是RANKL (由成骨細(xì)胞產(chǎn)生)和RANK (在破骨 細(xì)胞和破骨細(xì)胞祖細(xì)胞上表達(dá))，以及所產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和 途徑。也需要M-CSF，但它的功能仍然難以確定，但是可能僅僅是早 期破骨細(xì)胞祖細(xì)胞分化起始和存活所需要。人的骨骼是不斷重塑的，通常約2年周轉(zhuǎn)一次，允許在鈣平衡中 使用骨礦物質(zhì)。骨骼的強(qiáng)度和形狀通過(guò)節(jié)段置換得以維持由單核細(xì) 胞-巨噬細(xì)胞前體形成的破骨細(xì)胞降解一個(gè)骨部分(Scheven等人，1986;和Fujikawa等人，1996)，而同時(shí)，來(lái)源于間質(zhì)細(xì)胞的成骨細(xì) 胞合成新骨(Rickard，等人，1996)。這些不相關(guān)的細(xì)胞以成對(duì)的方式 分化，在幾周時(shí)間里產(chǎn)生新的骨部分。破骨細(xì)胞是多核巨細(xì)胞，來(lái)源于造血干細(xì)胞，是負(fù)責(zé)生理性和病 理性骨再吸收的主要細(xì)胞。破骨細(xì)胞專(zhuān)門(mén)用于除去骨的無(wú)機(jī)和有機(jī)相 (Blair等人，1986)。骨微環(huán)境中細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的水平的改變 導(dǎo)致破骨細(xì)胞的異常骨再吸收(其綜述參見(jiàn)Mundy等人，1997)。因此， 在小鼠中IL-4 (Lewis,等人,1993)和G-CSF (Takahashi，等人，1996) 的強(qiáng)制表達(dá)誘發(fā)了骨量減少，而過(guò)度表達(dá)可溶性TNF-a受體(Ammann， 等人，1997)或排除IL-6基因(Poli，等人，1994)的小鼠則免于雌激素 缺乏而導(dǎo)致的骨丟失。羥磷灰石礦物相的溶出依賴(lài)于通過(guò)碳酸酐酶II和質(zhì)子泵的作用 破骨細(xì)胞下再吸收腔隙的酸化(Vaes， 1968; Baron等人，1985; Blair 等人，1992)。破骨細(xì)胞的過(guò)度骨再吸收促成了許多人疾病的病理學(xué)，這些疾病 包括關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、牙周炎和惡性腫瘤性高釣血癥。在再吸收 過(guò)程中，破骨細(xì)胞除去了骨的礦物質(zhì)和有機(jī)成分(Blair等人，1986)。 當(dāng)前公眾關(guān)注的主要骨疾病是骨質(zhì)疏松癥、惡性腫瘤性高釣血癥、由 于骨轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致的骨量減少、牙周病、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、類(lèi)風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)周?chē)治g、佩吉特病、制動(dòng)誘發(fā)的骨量減少和糖皮質(zhì) 激素治療。所有這些病癥的特征在于由骨再吸收(分解)和骨形成之間 失去平衡而導(dǎo)致的骨丟失，其以平均每年約14%的速率持續(xù)一生。但 是，骨周轉(zhuǎn)的速率在各個(gè)部位是不同的，例如在推骨的骨小梁和頜骨 的牙槽骨中就高于長(zhǎng)骨的皮質(zhì)。骨丟失的可能性與周轉(zhuǎn)直接相關(guān)，在 絕經(jīng)后立即在稚骨中可總計(jì)超過(guò)每年5%，這種情況導(dǎo)致骨折的危險(xiǎn)增 加。周轉(zhuǎn)可以受到成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)或減弱或破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)或減 弱的影響。用于調(diào)節(jié)患者破骨細(xì)胞和/或成骨細(xì)胞的組合物和方法可以 用于治療伴隨骨丟失的多種疾病或病癥。吸收的試劑進(jìn)行治療中受益。抑制骨再吸收的 一種機(jī)制是抑制破骨細(xì) 胞前體細(xì)胞融合。III.治療溶骨性病癥的方法本發(fā)明涉及對(duì)病理性骨再吸收疾病或病癥患者的治療。術(shù)語(yǔ)"治 療益處，，是指在他/她的病癥的醫(yī)學(xué)治療方面任何促進(jìn)或增強(qiáng)患者健康 的作用，包括治療溶骨性病癥和/或調(diào)節(jié)骨再吸收、破骨細(xì)胞活性、和 /或破骨細(xì)胞發(fā)生。A.藥物制劑和遞送在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，關(guān)注的是涉及遞送本發(fā)明的一種或 多種化合物的方法。可以用本發(fā)明的一種或多種化合物預(yù)防、緩解或 治療的疾病和病癥的例子包括與癌向骨轉(zhuǎn)移有關(guān)的骨丟失，包括但不 限于肺、頭和頸、乳腺、胰、前列腺、腎、骨、睪丸、宮頸、胃腸、 結(jié)腸、膀胱和其他癌癥轉(zhuǎn)移，以及與溶骨性病變有關(guān)或伴隨溶骨性病 變的其他疾病或病癥。藥物組合物的"有效量" 一般定義為足以可檢測(cè)和可重復(fù)地達(dá)到 規(guī)定的目標(biāo)結(jié)果的量，例如緩解、減輕、最小化或限制溶骨性疾病或 病癥的程度或其癥狀。在一些方面，可以使用更嚴(yán)格的定義，包括預(yù) 防、消除、根除或治愈疾病。在一些特定的實(shí)施方案中，需要用本發(fā)明的方法和組合物抑制破 骨細(xì)胞發(fā)生或以其它方式逆轉(zhuǎn)、阻止或減少骨的再吸收。自然，施用 途徑將隨著損害的位置和性質(zhì)而不同，可以包括例如，真皮內(nèi)、皮下、 局部、胃腸外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、全身和經(jīng)口施用和制劑。如果適合，可以使用連續(xù)施用?？紤]經(jīng)注射器或?qū)Ч苓f送。這種 連續(xù)輸注可以在開(kāi)始治療后持續(xù)一段時(shí)間，從約1-2小時(shí)，到約2-6 小時(shí)，到約6-12小時(shí)，到約12-24小時(shí)，到約1-2天，到約1-2周或 更長(zhǎng)。 一般地，經(jīng)連續(xù)輸注的治療組合物的劑量等于通過(guò)單次或多次 注射給予的劑量，可以在輸注期間調(diào)整劑量。該治療可以包括多種"單位劑量"。單位劑量定義為包舍預(yù)定量 的治療組合物。所施用的量和具體途徑和制劑在臨床領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。單位劑量無(wú)需作為單次注射施用，而是可以包含在設(shè)定時(shí)間段里連續(xù)輸注。本發(fā)明的單位劑量可以方便地以mg/體積的制劑 或治療組合物的重量(例如，毫克或mg)描述。在一些實(shí)施方案中，遞送包括一種或多種本發(fā)明組合物的組合物 的方法包括經(jīng)全身施用。但是，可替代地，本文公開(kāi)的藥物組合物可 以胃腸外、皮下、氣管內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)或甚至腹膜內(nèi)施用。 可以通過(guò)注射器或用于注射溶液的任何其他方法進(jìn)行注射。作為游離堿或藥學(xué)可接受的鹽的活性化合物的溶液可以在水中適 當(dāng)?shù)嘏c表面活性劑例如羥丙基纖維素混合來(lái)制備。也可以在甘油、液 體聚乙二醇及其混合物中和在油中制備分散體。在貯存和使用的一般 條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物生長(zhǎng)。適合注射用途的藥 劑形式包括無(wú)菌水性溶液或分散液和臨時(shí)制備無(wú)菌注射溶液或分散液 的無(wú)菌粉末(U. S.專(zhuān)利5, 466， 468，特別地以整體通過(guò)參考引入本文)。 在所有情況中，該形式必須是無(wú)菌的，流動(dòng)性必須達(dá)到易于注射的程 度。它在制造和貯存條件下必須是穩(wěn)定的，且必須防止微生物例如細(xì) 菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包含例如水、乙醇、多元醇(例如， 甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等等)，其適當(dāng)?shù)幕旌衔锖?或植物油。可以通過(guò)使用包衣例如卵磷脂，通過(guò)維持所需的粒度(在分散體的情 況中)和通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性?？梢酝ㄟ^(guò)各種抗 菌劑和抗真菌劑例如尼泊金類(lèi)、三氯叔丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等等來(lái)防止微生物的作用。在很多情況中，優(yōu)選包括等滲劑例如糖或氯化鈉。可以通過(guò)在組合物中使用延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來(lái)實(shí)現(xiàn)可注射組合物的延長(zhǎng)吸收。對(duì)于水性溶液的胃腸外施用，例如，如果必要該溶液應(yīng)當(dāng)是適當(dāng)緩沖的，液體稀釋劑首先以足夠的鹽水或葡萄糖來(lái)使其等滲。這些特 定的水性溶液特別適合靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)和腹膜內(nèi)施用。在 該方面，可以使用的無(wú)菌水性介質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文公開(kāi)內(nèi) 容已知的。例如，l個(gè)劑量可以溶解于l ml的等滲NaCl溶液中，并加入到1000 ml的皮下輸液中，或在計(jì)劃的輸注位點(diǎn)注射(參見(jiàn)例如， "Remington's Pharmaceutical Sciences"， 第15版，第1035-1038 和1570-1580頁(yè))。根據(jù)所治療的患者的情況必然會(huì)對(duì)劑量進(jìn)行一些改 變。在任意情況中負(fù)責(zé)施用的人員將會(huì)確定個(gè)體患者的適當(dāng)劑量。此 外，對(duì)于人的施用，制劑應(yīng)當(dāng)滿(mǎn)足FDA Office of Biologies標(biāo)準(zhǔn)要 求的無(wú)菌、致熱原性、 一般安全性和純度的標(biāo)準(zhǔn)。制備無(wú)菌注射溶液，包括將需要量的活性化合物摻入到按需具有 上述列舉的各種其他成分的適當(dāng)溶劑中，然后過(guò)濾滅菌。 一般地，制 備分散液，包括將各種經(jīng)滅菌的活性成分摻入到無(wú)菌載體中，其中無(wú) 菌栽體包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和上述列舉的所需的其他成分。在用于制備 無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌粉末的情況中， 一些制備方法是真空干燥和凍千 技術(shù)，這些技術(shù)從先前無(wú)菌過(guò)濾的溶液中生產(chǎn)出活性成分加上任何其 他所需成分的粉末。本文公開(kāi)的組合物可以配制成中性或鹽的形式。藥學(xué)可接受的鹽 包括酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成)，和與無(wú)機(jī)酸例如鹽酸或磷 酸或這些有機(jī)酸例如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等形成的鹽。與 游離羧基形成的鹽也可以來(lái)自無(wú)機(jī)堿例如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵， 和有機(jī)堿例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等等。經(jīng)配制，溶 液可以以與劑量制劑相容的方式和治療有效量施用。這些制劑可以以 多種劑型例如注射溶液、藥物釋放膠嚢等等來(lái)容易地施用。本文使用的"載體"包括任意和所有溶劑、分散介質(zhì)、媒介、包 衣、稀釋劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑、緩沖劑、載 體溶液、混懸液、膠體等等。使用這些用于藥物活性物質(zhì)的介質(zhì)和試 劑是本領(lǐng)域公知的。除了與活性成分不相容的任意常規(guī)介質(zhì)或試劑， 關(guān)注它在治療組合物中的應(yīng)用。補(bǔ)充性活性成分也可以摻入到該組合 物中。短語(yǔ)"藥學(xué)可接受"是指當(dāng)施用于人時(shí)不會(huì)產(chǎn)生過(guò)敏性或類(lèi)似的 不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。包含蛋白質(zhì)作為活性成分的水性組合 物的制備是本領(lǐng)域公知的。典型地，這些組合物可以制成注射劑，為液體溶液或混懸液；也可以制備適合在注射前溶解或混懸在液體中的 固體形式。B.聯(lián)合治療在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法涉及抑制或調(diào)節(jié)骨再 吸收、破骨細(xì)胞活性和/或破骨細(xì)胞發(fā)生的化合物，其又可與其他試劑 或組合物聯(lián)合使用以增強(qiáng)其他治療例如抗腫瘤治療的效果，以改善治 療患者的生活質(zhì)量。這些組合物可以以組合量提供，有效地實(shí)現(xiàn)所需 的效果，例如殺滅癌細(xì)胞或抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，和抑制破骨細(xì)胞形成、 破骨細(xì)胞的活性或骨的再吸收。這些過(guò)程可涉及將細(xì)胞與本發(fā)明的組 合物和第二治療劑或多種因子同時(shí)接觸。這可以通過(guò)將細(xì)胞與包括兩種或多種試劑的單一組合物或藥理學(xué)制劑接觸，或?qū)⒓?xì)胞與兩種或多 種不同的組合物或制劑接觸，其中至少 一種組合物包括本發(fā)明的組合 物， 一種或多種其他組合物包括至少第二治療劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，關(guān)注的是除了促細(xì)胞凋亡、抗血管 形成、抗癌或細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑外，抗破骨細(xì)胞治療與免疫治療干預(yù)聯(lián) 合使用?？商娲?，該治療可以是在其他試劑治療前或后，間隔幾分 鐘到幾周。在其中分別將一種或多種第二治療劑和抗破骨細(xì)胞治療應(yīng) 用于細(xì)胞、組織、器官或患者的實(shí)施方案中，通常確保每次遞送的時(shí) 間之間不經(jīng)過(guò)顯著的時(shí)間段，以使得第二試劑和本發(fā)明的組合物仍然 能夠?qū)颊甙l(fā)揮有利的聯(lián)合效果。在這些情況中，關(guān)注的是，可以在 彼此間隔約12-24小時(shí)之內(nèi)，更優(yōu)選在彼此間隔約6-12小時(shí)之內(nèi)，使 細(xì)胞與兩種治療形式接觸。但在一些情況中可能需要顯著地延長(zhǎng)治療 的時(shí)間間期，在各次施用之間經(jīng)過(guò)數(shù)天(2, 3， 4， 5, 6或7)到數(shù)周(1， 2， 3, 4， 5, 6, 7或8)?？梢允褂酶鞣N組合，例如本發(fā)明的組合物是"A"和第二療法例如 化學(xué)療法是"B":A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A遵循施用這些組合物的 一般方案將本發(fā)明的抗破骨細(xì)胞組合物施 用于患者，考慮其毒性(如果有的話(huà))。預(yù)期如果必要該治療循環(huán)可 以重復(fù)。同時(shí)關(guān)注的是，各種標(biāo)準(zhǔn)療法及外科手術(shù)干預(yù)可以與所述的 療法聯(lián)合應(yīng)用。在特定的實(shí)施方案中，關(guān)注的是抗癌療法例如化學(xué)療法、放射療 法或免疫療法與本文所述的抗破骨細(xì)胞療法聯(lián)合使用。1. 化學(xué)療法癌癥療法也包括各種基于化學(xué)和放射治療的聯(lián)合療法。聯(lián)合化療包括例如順鉑(CDDP)、卡鉑、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹(shù)堿、 異磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、亞硝脲、更生霉素、柔紅 霉素、多柔比星、博來(lái)霉素、plicomycin、絲裂霉素、依托泊苷(VP16)、 他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受體結(jié)合劑、紫杉酚、吉西他濱、諾維 本、法尼基-蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移酶抑制劑、反鉑、5-氟尿嘧啶、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng) 春堿和曱氨蝶呤，或上述物質(zhì)任意的類(lèi)似物或衍生物變體。2. 放射療法導(dǎo)致DNA損害并已經(jīng)被廣泛使用的其他因素包括通常所知的Y-射線(xiàn)、X-射線(xiàn)和/或定向遞送放射性同位素給腫瘤細(xì)胞。DM損害因子 的其他形式也是我們關(guān)注的，例如微波、質(zhì)子束輻射(U.S.專(zhuān)利 5， 760， 395和U. S.專(zhuān)利4, 870， 287)和UV-輻射。非?？赡艿氖牵?有這些因子實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA、對(duì)DNA的前體、對(duì)DNA的復(fù)制和修復(fù)、和對(duì) 染色體的裝配和維持的寬范圍的損害。X-射線(xiàn)的劑量范圍是在較長(zhǎng)時(shí) 間里(3到4周)每日劑量為50到200倫琴，到單劑量為2000到6000 倫琴。放射性同位素的劑量范圍變化較大，取決于同位素的半衰期、 所發(fā)出的輻射的強(qiáng)度和類(lèi)型以及腫瘤細(xì)胞的攝取。當(dāng)用于細(xì)胞時(shí)，術(shù)語(yǔ)"接觸"和"暴露"在本文中是用于描述一 個(gè)過(guò)程，治療組合物和化學(xué)治療或放射治療劑通過(guò)該過(guò)程遞送到乾細(xì) 胞、組織或患者，或置于其鄰近。3. 免疫療法在癌癥治療中，免疫療法一般依賴(lài)于使用免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子(例如，單克隆抗體)來(lái)靶向和破壞癌細(xì)胞。曲妥單抗(HerceptinTM)就是這 樣的一個(gè)例子。免疫效應(yīng)物可以是，例如對(duì)腫瘤細(xì)胞表面上的一些標(biāo) 記物具有特異性的抗體?？贵w單獨(dú)可以用作治療的效應(yīng)物，或者它可 募集其他細(xì)胞來(lái)實(shí)際上實(shí)現(xiàn)細(xì)胞殺滅?？贵w也可以與藥物或毒素(化學(xué) 治療劑、放射性核素、蓖麻毒素A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等等) 綴合，僅僅用作靶向劑?？商娲?，效應(yīng)物可以是載有表面分子的淋 巴細(xì)胞，所述表面分子直接或間接地與腫瘤細(xì)胞耙相互作用。各種效 應(yīng)細(xì)胞包括細(xì)胞毒T細(xì)胞和NK細(xì)胞。治療方式的組合，即，直接的細(xì) 胞毒性和抑制或減少ErbB2將會(huì)為治療ErbB2過(guò)度表達(dá)的癌癥提供治 療益處。存在多種不同的癌癥被動(dòng)免疫療法的途徑。它們可以大致分為下 列種類(lèi)只注射抗體；注射與毒素或化學(xué)治療劑偶聯(lián)的抗體；注射與 放射性同位素偶聯(lián)的抗體；注射抗獨(dú)特型抗體；及最后，清除骨髓中 的肺瘤細(xì)胞。在主動(dòng)免疫療法中，施用抗原性肽、多肽或蛋白質(zhì)，或自體或同 種異體腫瘤細(xì)胞組合物或"疫苗"， 一般連同特殊的細(xì)菌佐劑 (Ravindranath和Morton, 1991; Morton等人，1992; Mitchell等 人，1990; Mitchell等人，1993)。在黑素瘤免疫療法中，引發(fā)高IgM得更好(Morton等人，1992)。 IgM抗體通常是過(guò)渡抗體，該規(guī)則的例 外似乎是抗-神經(jīng)節(jié)苷脂或抗碳水化合物抗體。在過(guò)繼免疫治療中，在體外分離患者的循環(huán)淋巴細(xì)胞或肺瘤浸潤(rùn) 的淋巴細(xì)胞，通過(guò)淋巴因子例如IL-2活化或用肺瘤壞死的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)， 并重新再施用(Rosenberg等人，1988; 1989)。為了完成這一點(diǎn)，可 以給動(dòng)物或人類(lèi)患者施用免疫有效量的活化淋巴細(xì)胞聯(lián)合本文描述的 摻入佐劑的抗原性肽組合物。活化的淋巴細(xì)胞最優(yōu)選是患者自己的細(xì) 胞，該細(xì)胞是早先從血或腫瘤樣品中分離并體外活化(或"擴(kuò)充")的。 該形式的免疫療法產(chǎn)生了幾例黑素瘤和腎癌的消退，但與無(wú)應(yīng)答者相 比，應(yīng)答者的百分比很小。4.手術(shù)約60%的癌癥患者會(huì)經(jīng)歷某種類(lèi)型的手術(shù)，包括預(yù)防性、診斷性 或分期性、治療性和姑息性手術(shù)。治療性手術(shù)包括下列的切除術(shù)，其 中物理性地除去、切除和/或破壞所有或部分的癌組織。肺瘤切除術(shù)是 指物理性地除去腫瘤的至少一部分。除了腫瘤切除術(shù)，通過(guò)手術(shù)治療 包括激光手術(shù)、冷凍手術(shù)、電外科和顯微鏡控制的手術(shù)(Mohs，手術(shù))。 進(jìn)一步關(guān)注的是，本發(fā)明可以與除去淺表癌、初期癌或附帶量的正常 組織聯(lián)合使用。實(shí)施例包括下列實(shí)施例用于展示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域的技術(shù) 人員應(yīng)當(dāng)理解，下列實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明 的實(shí)施中運(yùn)行良好的技術(shù)，由此可以認(rèn)為其構(gòu)成了優(yōu)選實(shí)施方式。但 是，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在所公開(kāi)的具 體實(shí)施方案中做出很多改變，而仍得到類(lèi)似或相似的結(jié)果，不脫離本 發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例1方法動(dòng)物和細(xì)胞系.雄性無(wú)胸腺的NCr棵鼠^f尋自Animal Production Area of the National Cancer Institute, Frederick Cancer Research Facility (Frederick, MD)。 Black 6小鼠(C57BL/6J)得自 Charles Rivers (Wilmington, MA)。將小鼠保持在無(wú)特異病原體條 件下的層流箱中，并在8周大時(shí)使用。所有的設(shè)備都根據(jù)United States Department of Agriculture, the Department of Health and Human Services,和NIH的當(dāng)前規(guī)程和標(biāo)準(zhǔn)得至寸了 the American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) 的認(rèn)可。用Purina嚙鼠動(dòng)物食物喂食小鼠，隨意獲取自來(lái)水。將乳腺 癌細(xì)胞系MDA-MB-435細(xì)胞保持在補(bǔ)充有10% FBS和1 mM丙酮酸鈉 (Invitrogen， Carlsbad, CA)的D-MEM (Invitrogen， Carlsbad, CA) 中。將小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264. 7保持在補(bǔ)充有10% FBS (Invitrogen，Carlsbad, CA)的DMEM/F12 (Invitrogen， Carlsbad, CA)中。所有培 養(yǎng)基包含l: 100稀釋的Fungizone (最終濃度青霉素G，鏈霉素100 單位/ml和兩性霉素B 250ng/ml)。初級(jí)骨髓細(xì)胞培養(yǎng).從8-12周大的Black 6小鼠(C57BU6 J)中無(wú) 菌解剖脛骨和股骨的初級(jí)骨髄細(xì)胞(B醒)。用不完全D-MEM沖洗出骨 髓，并以1200 rpm離心3分鐘，并重懸在5 ml不完全D-MEM中。在 室溫下將B畫(huà)細(xì)胞在20 ml紅細(xì)胞裂解緩沖液(8. 3 g/1 NHX1， 1 g/1 碳酸氫鈉，0.4 g/1 EDTA)中溫育1-2分鐘。加入補(bǔ)充有10% FBS和 100單位/ml青霉素的25 ml D-MEM(完全D-MEM)，將BMM細(xì)胞以UOO rpm離心3分鐘。然后將BMM細(xì)胞以1. 5-2 x 107細(xì)胞/10 cm皿與10 ml 的完全D-MEM進(jìn)行平板接種，并培養(yǎng)24小時(shí)。收集非貼壁細(xì)胞，以 1200 rpm離心5分鐘，并以2. 5 x 104細(xì)胞/孔的濃度接種到96孔皿 中用于細(xì)胞毒性分析，以2 x 104細(xì)胞/孔的濃度接種到48孔板中或 以5 x 103細(xì)胞/孔的濃度接種到96孔板中用于破骨細(xì)胞分化分析。 在10 ng/ml M-CSF存在下將細(xì)胞培養(yǎng)3天，然后洗滌并用于進(jìn)一步的 研究。為了分化成破骨細(xì)胞，加入30-100 ng/ml RANKL。在2天后給 培養(yǎng)基補(bǔ)充新鮮M-CSF和RANKL。細(xì)胞毒性分析.在96-孔平底組織培養(yǎng)皿中進(jìn)行SKI606對(duì)BMM細(xì) 胞的細(xì)胞毒性(分析)。接種BMM細(xì)胞(2. 5 x l(T)并如上所述處理。 將SKI606在培養(yǎng)基中稀釋?zhuān)⒁?倍系列稀釋加入到孔中。將細(xì)胞培 養(yǎng)72小時(shí)，并用結(jié)晶紫(O. 5%,在20。/。曱醇中)將剩余的貼壁細(xì)胞染色， 并用Sorenson， s緩沖液(O. 1 M檸檬酸鈉，pH 4.2，在50%乙醇中) 溶解。用Bio-Tek Instruments Inc (Wi廳ski， VT)的EL800通用微量板讀板器在630 nm處測(cè)量吸光度。體外破骨細(xì)胞分化.如上所述，將BMM細(xì)胞(2 x 1(T)在48-孔 板中培養(yǎng)，然后用100 ng/ml RANKL和10 ng/ml M-CSF處理。將細(xì) 胞培養(yǎng)物在第3天進(jìn)行培養(yǎng)基更換。在第5天，固定細(xì)胞，并通過(guò)使 用Sigma-Aldrich (St. Louis， MO)的白細(xì)胞酸性磷酸酶試劑盒計(jì)數(shù) 處理后96小時(shí)每個(gè)孔中的TRAP-陽(yáng)性、多核(〉3個(gè)核)細(xì)胞的總數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)破骨細(xì)胞分化。骨再吸收分析.如上所述，將B畫(huà)細(xì)胞(5 x 103)在96孔板中培 養(yǎng)。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞接種到Cambrex (Rockland, ME)的OsteoAssay 板上，開(kāi)始時(shí)用100 ng/ml RANKL和10 ng/ml M-CSF(含或不含300 nM SKI606)處理。在第3天用新鮮10 ng/ml M-CSF補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)物。在 第5天，將20 ju 1等分的上清液用于評(píng)價(jià)從0steoAssayTM板的骨再吸 收。通過(guò)使用 Nordic Bioscience Diagnostics (Portsmouth, VA) 的CrossLaps for Culture ELISA試劑盒測(cè)量從OsteoAssay 板釋放 的膠原I來(lái)評(píng)價(jià)骨再吸收。用Bio-Tek Instruments Inc (Winooski, VT)的EL800通用孩i量板讀板器在450 nm處測(cè)量吸光度，在650 nm 處的讀數(shù)作為參考。時(shí)間-依賴(lài)性.如上所述將BMM細(xì)胞(2 xl(n在48-孔板中培養(yǎng)， 并在沒(méi)有或存在300 nM SKI606下用RANKL (100 ng/ml)處理，其中 所述SKI606與RANKL刺激一同加入并在處理后96小時(shí)進(jìn)行TRAP染色， 或者在RANKL刺激后12， 24或48小時(shí)加入并在96小時(shí)進(jìn)4亍TRAP染 色。然后如上所述固定細(xì)胞，進(jìn)行TRAP染色，計(jì)數(shù)每種情況中的破骨 細(xì)胞數(shù)。RAW 264.7與MDA MB435細(xì)胞和條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)。為進(jìn)行共培 養(yǎng)分析，將RAW264. 7 (500細(xì)胞/孔)接種在96孔板中，然后使其貼壁 12小時(shí)。然后將MDA-MB-435以增加密度引入到RAW264. 7培養(yǎng)物中， 并培養(yǎng)12小時(shí)。然后在有或無(wú)指定濃度的SKI606的條件下培養(yǎng)共培 養(yǎng)物5天。然后如上所述固定細(xì)胞，進(jìn)行TRAP染色，計(jì)數(shù)每種情況中 的破骨細(xì)胞數(shù)。對(duì)于條件培養(yǎng)基，將MDA-MB-435細(xì)胞接種在10 cm板(l x 106 細(xì)胞/板)中并培養(yǎng)36小時(shí)。然后取出培養(yǎng)基，以2500 rpm離心5分 鐘，分離上清液并放置在4匸下直至使用。將RAW264. 7細(xì)胞(750細(xì) 胞/孔)接種在96孔板中，并使其貼壁12小時(shí)。加入來(lái)自MDA-MB-435 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，并在有或沒(méi)有指定濃度的SKI606的條件下培養(yǎng)5 天。然后如上所述固定細(xì)胞，進(jìn)行TRAP染色，計(jì)數(shù)每種情況中的破骨骨內(nèi)注射和骨組織樣品的處理.用0. 025%胰蛋白酶-0. 01% EDTA 溶液收獲MDA-MB-435細(xì)胞，在PBS中洗滌該細(xì)胞，并重懸于PBS中以 準(zhǔn)備植入小鼠中。肌內(nèi)注射氯胺酮(100 mg/kg)和乙酰丙喚(2. 5 mg/kg) 麻醉動(dòng)物。用28-規(guī)格的Ha邁ilton針頭將在0. 01 mlPBS中的5 x 105 MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞注射到雌性無(wú)胸腺NCr棵鼠中，注射到每只小 鼠的脛骨近端。注射后3天，將小鼠分為3組，開(kāi)始治療每日口飼 載體(O. 5% Methocel/0. 4%吐溫，在PBS中)，在栽體中的150 mg/kg SKI606或S. C.注射在0. 1 ml PBS中的10 g/kg Zomeda (zolendronic acid)。每日給予治療，每周5天共9周。在注射后35天攝取X-射線(xiàn) 圖像，并以14天的間隔攝像。在9周后，攝取最后的X-射線(xiàn)圖像， 由相同動(dòng)物荷有腫瘤和不荷有腫瘤的腿的重量差異計(jì)算腫瘤重量。固 定注射腫瘤的脛骨，并在EDTA中脫鈣，并用Sigma-Aldrich (St.胞(〉3個(gè)核)的存在。通過(guò)檢查組織學(xué)切片確定脛骨中腫瘤的發(fā)生率。 如下確定腫瘤的重量注射腿的重量-相同動(dòng)物的未注射的后腿的重 量。由數(shù)字X-射線(xiàn)圖像估計(jì)溶骨面積；將NIH Scion程序用于測(cè)量脛 骨的面積和溶骨面積，以計(jì)算溶骨區(qū)中的像素/脛骨面積中的像素的比例。結(jié)果為了鑒定可能的激酶抑制劑，測(cè)試化合物1， 2， 3, 4和5抑制 RANKL-誘導(dǎo)的RAW264. 7細(xì)胞的石皮骨細(xì)胞分化的能力。選擇SKI606， 因?yàn)橄嚓P(guān)的化合物已經(jīng)顯示是Src和Abl激酶的雙重抑制劑 (Boschelli等人，2001b)。鑒定并表征SKI606。發(fā)現(xiàn)該化合物在酶分 析中抑制Src， ICs。為1.2 nM，并以相當(dāng)?shù)臐舛纫种芐rc-依賴(lài)性蛋白 質(zhì)酪氨酸磷酸化。該化合物對(duì)于BMM細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性，600 nM SKI606條件下小 于10°/。的細(xì)胞死亡，表明對(duì)破骨細(xì)胞發(fā)生的抑制效果不是由于SKI606 對(duì)前體細(xì)胞的細(xì)胞毒性。該4-苯基氨基-3-喹啉腈的結(jié)構(gòu)是已知的(附圖1A)，并以劑量依賴(lài)性方式對(duì)B匪中RANKL-介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化具 有抑制效果(附圖1B)。如果在破骨細(xì)胞發(fā)生開(kāi)始后加入，BMM細(xì)胞表 現(xiàn)出對(duì)于SKI606的敏感性較低(附圖2A和2B)。此外，研究SKI606 抑制骨再吸收的能力，通過(guò)在有或無(wú)SKI606情況下在來(lái)自Cambrex (Rockland, ME)的OsteoAssayTM板上用RANKL刺激B固細(xì)胞。與M-CSF 和RANKL處理相比，在300 nM SKI606存在下用M-CSF和RANKL處理 的B固培養(yǎng)物顯示出膠原I釋放降低了 3. 7倍，而膠原I釋放是骨再 吸收的指示。檢查乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435在RAW264. 7細(xì)胞中誘導(dǎo)破骨細(xì)胞 發(fā)生的能力。發(fā)現(xiàn)這是密度依賴(lài)性的，800 MDA-MB-435細(xì)胞/孔是最 佳數(shù)目(附圖3A)。確定RAW264. 7細(xì)胞的最佳數(shù)目，對(duì)于該研究是500 個(gè)細(xì)胞/孔用于與MDA-MB-435細(xì)胞共培養(yǎng)(數(shù)據(jù)未顯示)。來(lái)自 MDA-MB-435細(xì)胞的條件培養(yǎng)基也能在RAW264. 7細(xì)胞培養(yǎng)物中支持破 骨細(xì)胞發(fā)生，在DMEM/F12中10%來(lái)自MDA-MB-435細(xì)胞的條件培養(yǎng)基 是最佳混合物(附圖3B)。這表明，MDA-MB-435細(xì)胞誘導(dǎo)RAW264. 7細(xì) 胞中破骨細(xì)胞發(fā)生的能力是由于釋放的因子而非細(xì)胞與細(xì)胞的接觸。 MDA-MB-435也可釋放出抑制因子例如0PG,所形成的破骨細(xì)胞的數(shù)目 隨著條件培養(yǎng)基的濃度升高而減少。其他研究包括研究SKI606抑制乳腺癌-誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成的能 力。在400 nM SKI606的濃度下，SKI606顯著地抑制了 RAW264. 7細(xì) 胞中MDA-MB-435-誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞發(fā)生(附圖4A) 。 SKI606還能以劑量 依賴(lài)性方式抑制來(lái)自MDA-MB-435細(xì)胞的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞 發(fā)生(附圖4B)。在體內(nèi)模型中評(píng)價(jià)SKI606，使用雌性無(wú)胸腺的NCr棵鼠(8周大)， 用28-規(guī)格的Hamilton針頭將在0. 01 ml PBS中的5 x 105 MDA-MB-435 細(xì)胞注射到每只小鼠的脛骨近端。將小鼠分成3個(gè)治療組，通過(guò)檢查 組織學(xué)切片和腫瘤重量來(lái)確定脛骨中胂瘤的發(fā)生率。用SKI606或 Zomeda治療的小鼠中脛骨腫瘤的重量顯著小于對(duì)照組的肺瘤(附圖5A 和表l)。用SKI606或Zomeda治療的小鼠中溶骨面積顯著較小(附圖5B和表1)。此外，在SKI606-治療的小鼠的腫瘤切片中TRAP-陽(yáng)性細(xì) 胞的數(shù)目顯著較少(附圖5C)。數(shù)字圖像的合成如附圖6A-6C所示。表1. SKI606對(duì)于MDA-MB-435骨腫瘤小鼠模型的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)組脛骨中腫瘤的發(fā)生率肺瘤的重量溶骨區(qū)的估計(jì)對(duì)照(栽體)12/12 (100%)0. 242 +/-0, 070. 294 +/-0. 06SKI6069/12 (75%)0. 088 +/-0. 020. 164 +/-0. 09Zomeda11/12 (92%)0. 073 +/-0. 020. 099 +/-0. 05參考文獻(xiàn)度，將下列文獻(xiàn)通過(guò)參考特別引入本文。U. S.專(zhuān)利4， 870， 287 U. S.專(zhuān)利5， 466， 468 U. S.專(zhuān)利5， 760， 395 U. S.專(zhuān)利6， 780, 996 U. S.專(zhuān)利6， 002， 008 U. S，專(zhuān)利申請(qǐng)20050101780A1Ammann等人，/. C/i". //2re〃. ， 99 (7): 1699-1703, 1997. Baron等人，/. Ce/"/o厶，101 (6): 2210-2222， 1985. Blair等人，/Ce7/"/o/.， 102 (4): 1164-1172， 1986. Blair等人，/. Ce〃腸c力e邁.，48 (4): 401-410， 1992. Blair等人，/. Ce77， 102 (4): 1164-1172， 1986. Boschelli等人，脅org.歸.C力e邁.Ze". ， 13: 3797， 2003. Boschelli等人，/ C力e瓜，44: 822， 2001b.Boschelli等人，/. #eA C力e瓜，47: 1599， 2004. Bucay等人，， 12 (9): 1260-1268， 1998. 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權(quán)利要求
1.一種抑制骨再吸收的方法，包括提供治療有效量的下式的化合物式I其中n是1-3的整數(shù)；X是N，CH，條件是當(dāng)X是N時(shí)，n是2或3；R是1到3個(gè)碳原子的烷基；R(1)是2，4-二Cl，5-OMe；2，4-二Cl；3，4，5-三-OMe；2-Cl，5-OMe；2-Me，5-OMe；2，4-二Me；2，4-二Me-5-OMe，2，4-二Cl，5-OEt；R(2)是1到2個(gè)碳原子的烷基，或其藥學(xué)可接受的鹽。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中該化合物具有下式: 式I其中n是2-3的整數(shù)；X是N、 CH，條件是當(dāng)X是N時(shí)，n是2或3; R是l到3個(gè)碳原子的烷基；R(l)是2，4-二 Cl， 5-0Me; 2， 4-二 Cl; 3， 4， 5-三-OMe; 2-Cl， i-OMe; 2-Me， 5-0Me; 2， 4-二 Me; 2， 4-二 Me-5-0Me， 2， 4-二 Cl， ;-0EtjR(2)是l到2個(gè)碳原子的烷基， 或是其藥學(xué)可接受的鹽。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中該化合物具有下式: 式IX是N， CH n是3;R(2)和R是甲基;或是其藥學(xué)可接受的鹽。
4. 權(quán)利要求l的方法，其中R(2)是甲基。
5. 權(quán)利要求l的方法，其中X是N。
6. 權(quán)利要求l的方法，其中X是CH。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中該化合物是4-[(2，4-二氯-5-甲氧 基苯基)氨基]-6-甲氧基-7- [3- (4-甲基-1-哌嗪基)丙氧基]-3-喹啉腈 或其藥學(xué)可接受的鹽。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中該化合物是4-[(2，4-二氯-5-甲氧 基苯基)氨基]-7- [3- (4-乙基-l-哌嗪基)丙氧基]-6-甲氧基-3-喹啉 腈；4- [ (2， 4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7- [2- (4-甲基-l-哌溱基)乙氧基]-3-喹啉腈；4-[(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)氨 基]-7-[2-(4-乙基-l-哌溱基)乙氧基]-6-甲氧基-3-喹啉腈； 4- [ (2， 4-二氯-5-曱氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7- [ (1-甲基哌啶-4-基) 曱氧基]-3-喹啉腈；4- [ (2， 4-二氯-5-曱氧基苯基)氨基]-6-甲氧基 -7-[2-(l-甲基噥啶-4-基)乙氧基]-3-喹啉腈；4-[(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7- [3- (1-甲基哌啶-4-基)丙氧基]喹啉-3-腈；4- [ (2, 4-二氯-5-曱氧基苯基)氨基]-7- [ (1-乙基哌啶-4-基)甲氧 基]-6-甲氧基喹啉-3-腈；4- [ (2， 4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧 基-7- [3- (4-甲基哌溱-l-基)丙氧基]喹啉-3-腈；4- [ (2， 4-二氯-5-曱 氧基苯基)氨基]-6-乙氧基-7- [ (1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹啉-3-腈；4- [ (2， 4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧基-7- [3- (4-乙基哌嗪 -l-基)丙氧基]喹啉-3-腈；4- [ (2， 4-二氯-5-曱氧基苯基)氨基]-6-乙 氧基-7- [3- (l-甲基哌啶-4-基)丙氧基]喹啉-3-腈；4- [ (2， 4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧基-7- [2- (4-曱基-l-哌溱基)乙氧基]喹啉 -3-腈；4- [ (2， 4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧基-7- [2- (1-甲基 哌啶-4-基)乙氧基]喹啉-3-腈；4-[(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)氨 基]-6-曱氧基-7-[3-(4-丙基-l-哌喚基)丙氧基]-3-喹啉腈； 4- [ (2， 4-二氯苯基)氨基]-6-曱氧基-7- [ (1-甲基哌啶-4-基)甲氧 基]-3-喹啉腈；6-曱氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧 基]-4- [ (3， 4， 5-三甲氧基苯基)氨基]喹啉-3-腈；4- [ (2-氯-5-甲氧基 苯基)氨基]-6-曱氧基-7-[(l-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹啉-3-腈；6-曱氧基-4- [ (5-甲氧基-2-曱基苯基)氨基]-7- [ (1-甲基哌啶-4-基)曱 氧基]喹啉-3-腈；4- [ (2， 4-二甲基苯基)氨基]-6-曱氧基-7- [ (l-曱基 哌啶-4-基)甲氧基]喹啉-3-腈；6-曱氧基-4-[(5-甲氧基-2，4-二甲基 苯基)氨基]_7- [ (1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹啉-3-腈；4- [ (2， 4-二氯 -5-乙氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7- [ (l-曱基哌啶-4-基)曱氧基]喹啉 -3-腈；或其藥學(xué)可接受的鹽。
9. 權(quán)利要求1的方法，其中該化合物是Src激酶抑制劑。
10. 權(quán)利要求l的方法，其中所述骨丟失與骨質(zhì)疏松癥；骨巨細(xì) 胞瘤；多發(fā)性骨髓瘤；家族性膨脹性骨質(zhì)溶解；骨量減少；牙周?。?甲狀旁腺功能亢進(jìn)；類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)周?chē)治g；佩吉特病； 制動(dòng)誘導(dǎo)的骨量減少；惡性腫瘤性高鈣血癥；骨轉(zhuǎn)移；釉質(zhì)細(xì)胞瘤； 動(dòng)脈瘤性骨嚢腫(損傷)；血管肉瘤(高分級(jí))；血管肉瘤(低分級(jí))；高 歇病的骨損傷；甲狀旁腺功能亢進(jìn)的棕色瘤；成軟骨細(xì)胞瘤；軟骨粘液樣纖維瘤；軟骨肉瘤；脊索瘤；透明細(xì)胞軟骨肉瘤；常規(guī)的髓內(nèi)骨 肉瘤；退行性關(guān)節(jié)??；成纖維細(xì)胞性纖維瘤；具有惡性纖維組織細(xì)胞 瘤的骨干骨髓狹窄；內(nèi)生軟骨瘤；嗜酸細(xì)胞肉芽腫；上皮樣血管內(nèi)皮 瘤；骨的尤因肉瘤；骨外骨肉瘤；纖維肉瘤；纖維性結(jié)構(gòu)不良；紅色 反應(yīng)性骨膜炎；血管球瘤；骨中的綠色肉瘤；Hardcastle's綜合征； 血管瘤；血管外皮細(xì)胞瘤；高分級(jí)表面骨肉瘤；骨的霍杰金淋巴瘤； 皮質(zhì)內(nèi)骨肉瘤；骨內(nèi)分化良好的骨肉瘤；近皮質(zhì)軟骨瘤；白血病；惡 性纖維性組織細(xì)胞瘤；肢骨紋狀肥大；轉(zhuǎn)移性乳腺癌；轉(zhuǎn)移性腎癌； 轉(zhuǎn)移性肺癌；轉(zhuǎn)移性前列腺癌；多病灶性骨肉瘤；骨化性肌炎；骨的 神經(jīng)纖維瘤；非霍杰金淋巴瘤；非骨化性纖維瘤(纖維性骨皮質(zhì)缺損)； Nora， s損害；成骨細(xì)胞瘤；骨軟骨瘤；骨軟骨瘤??；骨纖維性結(jié)構(gòu) 不良；骨樣骨瘤；骨瘤；骨髓炎；條紋狀骨??；全身脆弱性骨硬化； 骨膜外骨肉瘤；骨膜軟骨瘤；骨膜骨肉瘤；色素絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎； 佩吉特病后肉瘤；骨的神經(jīng)鞘瘤；小細(xì)胞骨肉瘤；單一性骨嚢腫；單 生性纖維瘤；孤立性骨髓瘤(漿細(xì)胞瘤)；軟骨下嚢腫；滑膜性軟骨瘤 病；毛細(xì)血管擴(kuò)張性骨肉瘤；"Tug"損害-骨干骺端纖維缺損；或單 房性骨嚢腫有關(guān)。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述骨轉(zhuǎn)移是肺、頭和頸、乳腺、 胰腺、前列腺、腎、骨、睪丸、宮頸、胃腸、結(jié)腸、膀胱癌轉(zhuǎn)移。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述骨轉(zhuǎn)移是乳腺或前列腺癌轉(zhuǎn)移。
13. 權(quán)利要求ll的方法，進(jìn)一步包括提供抗腫瘤治療。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述抗腫瘤治療是化學(xué)療法、放射 療法、免疫療法或手術(shù)。
15. 權(quán)利要求l的方法，其中該化合物是口服的。
全文摘要
本發(fā)明總地包括治療骨再吸收疾病或與病理情況有關(guān)的骨再吸收的方法和組合物，其中所述疾病或情況包括但不限于，骨質(zhì)疏松癥、關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌向骨的轉(zhuǎn)移、骨癌、高鈣血癥、具有矯形外科植入物的溶骨性病變、佩吉特病、和與甲狀旁腺功能亢進(jìn)有關(guān)的骨丟失。代表性的癌癥包括但不限于，乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、多發(fā)性骨髓瘤、腎細(xì)胞癌、頭和頸癌及宮頸癌。關(guān)節(jié)炎性病癥包括但不限于，佐劑-、膠原-、細(xì)菌-和抗原-誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎，特別是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
文檔編號(hào)A61K31/44GK101242835SQ200680029746
公開(kāi)日2008年8月13日 申請(qǐng)日期2006年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月17日
發(fā)明者A·波伯蘭茲, B·G·達(dá)爾納伊, J·E·普利斯, M·塔爾帕茲 申請(qǐng)人:得克薩斯大學(xué)體系董事會(huì)