專利名稱：促進上皮再生的制作方法
促進上皮再生本發(fā)明涉及制備促進上皮再生的藥物。本發(fā)明還涉及在需要這種 促進的個體中促進上皮再生的方法。人體包括很多不同類型的上皮，其結(jié)構(gòu)和復(fù)雜性根據(jù)它們的位置、 作用和功能而不同。上皮的最基本形式為單層上皮，由一層上皮細胞組成。單層上皮 形式的實例為單層扁平上皮，由一層扁平鱗狀細胞組成。身體中單層扁平上皮的實例包括間皮、內(nèi)皮和肺泡的襯層(lining)。上皮的另一種常見形式為復(fù)層上皮。它由多層組成，不同層細胞 的大小、形狀和功能不同。復(fù)層上皮還可以根據(jù)它們表面上的細胞類 型被進一步表征。例如，復(fù)層扁平上皮在其表面具有鱗狀(扁平)細胞。構(gòu)成復(fù)層扁 平上皮的細胞的形狀因在上皮中位置的不同而不同。位于上皮上表面 的細胞通常具有扁平鱗片狀結(jié)構(gòu)，而靠近上皮基底的細胞可能趨向于 具有多面體形狀。角蛋白的存在結(jié)構(gòu)上加強了上皮細胞，角蛋白分子 存在的量傾向于隨著在上皮內(nèi)高度的增加而增加。復(fù)層扁平上皮通常 包含多層含有角蛋白的細胞。存在的角蛋白分子的類型可以根據(jù)細胞 層和身體部位而不同。最顯著的身體上皮是表皮，即覆蓋皮膚的復(fù)層扁平上皮層。由于 表皮的位置，它是與外界環(huán)境接觸最頻繁的組織，因此是最常暴露于 環(huán)境損傷和其他損傷的組織。復(fù)層上皮的其它實例包括復(fù)層柱狀上皮和復(fù)層纖毛柱狀上皮，其 中細胞的最上層是柱狀的，并具有游動纖毛。遍布身體的上皮受到多種不同形式的損傷。這種損傷可損害或完 全破壞受傷上皮的功能，這種損傷的結(jié)果取決于受損上皮的種類和作 用。因此，促進上皮再生在多種不同情況下是有利的。然而，即使有 促進上皮再生的愿望，亟需更多且更為有效的藥物和方法，通過它們促進上皮再生可以實現(xiàn)。當前用于促進上皮再生的一系列療法之間有顯著不同。例如，中厚皮片提供區(qū)的處理(綜述在Rakel " W. 1998中)可能僅涉及使移植物 提供區(qū)暴露和不做治療，或作為選擇可采用如下療法例如應(yīng)用敷料 劑(通常為油紗敷料劑，它可單獨使用或注入多種抗感染劑、藻酸鹽、 水膠體、合成復(fù)合膜、透明膜或蜂蜜)、應(yīng)用人工皮膚(可從個體自身 的表皮產(chǎn)生)、應(yīng)用同種異體移植物(通常為牛或豬同種異體移植物)或 應(yīng)用軟膏劑(通常為含有銀基化合物作為抗感染劑的軟膏劑)。這種缺乏單一普遍接受的療法表明需要可以促進上皮再生的新方 法。而且，已深刻認識到當前療法存在很多缺點和不足。當前療法的副作用包括移植物提供區(qū)和/或接收區(qū)的拖延的愈合 時間、替代上皮的發(fā)育可能比原先存在的較粗糙和/或較薄、增加的感 染比率、浮腫和紅斑、治療區(qū)周圍增生性結(jié)疤、來自同種異體移植材 料的朊或病毒感染的風險、進行治療所花費的長時間(從患者自身細胞 產(chǎn)生人工皮膚的情況下)以及提供區(qū)和接收區(qū)的疼痛。本發(fā)明目的在于提供用于促進上皮再生的新藥物，它至少克服現(xiàn) 有技術(shù)的一些不足。本發(fā)明第一方面提供具有TGF-&活性的試劑在制備用于促進上 皮再生的藥物中的用途。優(yōu)選地，具有TGF-/33活性的試劑可以選自TGF-i33, TGF-]83的 生物活性片段、變體及衍生物，以及能夠促進和/或模擬TGF-/33生物 活性的物質(zhì)。療的上皮中產(chǎn)生的再生相比較，上皮再生速度的任何增加。采用本領(lǐng)域已知的任何適合的上皮再生模型可容易地將本發(fā)明方 法得到的上皮再生速度與對照治療或未治療的上皮中產(chǎn)生的再生速度 相比較。例如，采用小鼠、大鼠、兔或豬中的公知體內(nèi)模型可比較已 知區(qū)域的實-瞼性上皮損傷部位的再生速度，如Tomlinson and Ferguson (2003)、 Davidson d a/. (1991)和Paddock " a/. (2003)中所描述的。 本發(fā)明第二方面提供促進上皮再生的方法，該方法包括對需要這種促進的個體給予治療有效量的具有TGF-/33活性的試劑。本發(fā)明這方面所提及的"具有TGF-ft活性的試劑的治療有效量" 是足以在被給藥個體中促進上皮再生的具有TGF-/33活性的試劑的量。如上所述，上皮尤其是表皮比身體任何其他組織經(jīng)受更直接、頻 繁和損傷性的外界環(huán)境遭遇。因此非常需要修復(fù)和更新上皮組織如表 皮以確保它們的最大功能性效力。實際上，盡管本發(fā)明方法和藥物適 合用于在所有類型上皮中促進上皮再生，并且在所有試驗的上皮中均 是有效的，但本發(fā)明的應(yīng)用尤其優(yōu)選促進表皮再生。本發(fā)明的其他優(yōu) 選實施方案包括促進扁平上皮再生，和/或促進角質(zhì)化的上皮再生。應(yīng) 了解本發(fā)明的方法和藥物對覆蓋頭皮的表皮可以是有益的。本發(fā)明的促進上皮再生能夠使得在先前受損區(qū)或棵露區(qū)形成功能 性上皮屏障。形成的上皮屏障能阻止諸如細菌、真菌和病毒的病原體 進入到下層組織或建群。因此，在期望防止或減少已破損上皮層部位 感染的情況下，促進上皮再生可以是有益的。完整上皮層的存在也起到作為體液流動屏障的作用，因此能防止 下層組織脫水。因此，促進上皮再生能夠防止或減少由體液經(jīng)損傷或 其他破損上皮層流失所引起的組織脫水。本發(fā)明基于非常驚奇的發(fā)現(xiàn)通過提供細胞因子TGF-ft或具有 特征生物活性的試劑可刺激上皮再生。先前人們^人為 TGF-Z3s(存在三種哺乳動物亞型TGF-^、 TGF-j82和TGF-]83)抑制上皮 再生?；隗w外和體內(nèi)測定均已報道了 TGF-Z3對上皮再生的抑制作用。 對TGF-(3亞型對培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞(皮膚上皮細胞)作用的研究表 明，盡管TGF-/3治療增加了角質(zhì)形成細胞表達與遷移有關(guān)的整合蛋白， 但表皮再生所必需的角質(zhì)形成細胞增殖的速度減小4艮多。采用體內(nèi)研 究也報道了對上皮再生所必需的上皮細胞增殖的TGF-Z3-介導(dǎo)的抑制 作用。盡管所有亞型都顯示了所報道的TGF-Z3抑制作用，但不同亞型的 相對效力存在差異。研究已表明在抑制人角質(zhì)形成細胞原代培養(yǎng)物中 DNA合成和增殖的能力上，TGF-j83是最有效的亞型，它比TGF-^或TGF-j32具有更強的抑制作用。除了采用培養(yǎng)細胞研究之外，最近進行了很多體內(nèi)研究，它們采 用特定的化合物或遺傳技術(shù)干擾TGF-z3信號通路。這些研究進一步表 明了 TGF-j3s尤其是TGF-j83抑制上皮再生。與先前出版的報道相比，本申請的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在上皮組織損傷前 或損傷后對該組織應(yīng)用具有TGF-/33活性的試劑能夠促進上皮層再生， 而不是抑制這種再生。不希望被束縛于任何假設(shè)，發(fā)明者認為通過 TGF-A介導(dǎo)的促進上皮細胞遷移實現(xiàn)促進上皮再生。由此，與具有 活性的試劑不存在時相比，上皮細胞(其遷移已被促進)能夠更 快地重建群和再生損傷上皮。應(yīng)了解當本發(fā)明在例如上皮再形成反應(yīng)被減弱、抑制、延遲或存 在缺陷時可以是有益的情況下，本發(fā)明的促進上皮再生可用于誘導(dǎo)有 效的上皮再形成。然而，特別優(yōu)選地，用于促進上皮再生的本發(fā)明方 法和藥物也可在經(jīng)受上皮損傷的患者中實現(xiàn)以加快正常上皮再生反應(yīng) 的速度。身體上皮再形成反應(yīng)可能存在缺陷的情況有很多。例如，有缺陷 的皮膚上皮再形成與如下狀況有關(guān)例如天皰瘡、Hailey-Hailey病(家 族性良性天皰瘡)、中毒性表皮壞死松解癥(TEN)/Lye11綜合癥、大皰性 表皮松解癥、皮膚利什曼病和光化性角化病。有缺陷的肺上皮再形成 可能與特發(fā)性肺纖維化(IPF)或間質(zhì)性肺病有關(guān)。有缺陷的眼上皮再形 成可能與如下狀況有關(guān)例如角膜緣干細胞部分缺失或角膜糜爛。有 缺陷的胃腸道或結(jié)腸上皮再形成可能與如下狀況有關(guān)例如慢性肛裂 (肛門裂)、潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病(Crohn's disease)以及其他炎性腸 病。響應(yīng)皮膚損傷的上皮再形成過程在很多個體中也可能受到干擾。 例如，已經(jīng)知道與年輕個體中的相比老年的人皮膚損傷表現(xiàn)出較少活 力的上皮再生。還存在很多其他狀況或病癥與延遲的或減弱的響應(yīng)損 傷的上皮再生有關(guān)。例如，糖尿病患者、使用多味藥的患者(例如由于 老年)、更年期婦女、易受壓力性損傷的患者(例如截癱患者)、靜脈疾 病患者、臨床上肥胖的患者、接受化療的患者、接受放療的患者、接受類固醇治療的患者或免疫受損的患者都可能經(jīng)受減弱的上皮再生。 很多這樣的情形中缺乏適當?shù)纳掀ぴ偕磻?yīng)使得創(chuàng)傷區(qū)形成感染，并 延遲正常創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，它可能導(dǎo)致形成諸如潰瘍的慢性創(chuàng)傷。因此， 應(yīng)了解通過本發(fā)明方法或藥物的上皮促進作用對這些患者是有益的。不偏離上文所述，可能通常優(yōu)選可以通過實現(xiàn)本發(fā)明的上皮再生 促進作用使得進行中的上皮再形成反應(yīng)得到增強(即，相較于沒有促進 作用正常得到的上皮再生反應(yīng)，產(chǎn)生更大的最大上皮再生反應(yīng))。應(yīng)了 解以這種方式可誘導(dǎo)其他健康個體中存在的上皮損傷部位更快速再 生。很多實驗和研究工作已擴展到鑒定和開發(fā)可用于促進上皮再形成 反應(yīng)受損患者的上皮再生的治療劑和技術(shù)。然而，未經(jīng)受減弱的上皮 再形成的患者群構(gòu)成了享有醫(yī)療保健服務(wù)總?cè)丝谥械脑S多和工作人口 的較大部分。由此，技術(shù)人員會立即認識到社會會從開發(fā)適合這些健 康患者需要的治療劑和技術(shù)中獲得很大益處。因此，促進健康患者的 上皮再生是本發(fā)明所有方面的優(yōu)選實施方案。促進急性創(chuàng)傷(與慢性創(chuàng) 傷相對)的上皮再形成也是本發(fā)明所有方面的優(yōu)選實施方案。為了本發(fā)明目的，慢性創(chuàng)傷可定義為當經(jīng)受適當(常規(guī))治療性處 理時在形成的八周內(nèi)不顯示任何愈合趨勢的任何創(chuàng)傷。急性創(chuàng)傷可以 為除慢性創(chuàng)傷之外的任何創(chuàng)傷。優(yōu)選的急性創(chuàng)傷可以為切口創(chuàng)傷，其 中特別優(yōu)選手術(shù)切口創(chuàng)傷。上皮如表皮或角膜上皮可能經(jīng)受由很多不同類型創(chuàng)傷引起的損 傷。上皮，例如可由于物理創(chuàng)傷或損傷被損傷，它包括擦傷、磨損、 創(chuàng)傷(穿透傷和非穿透傷)、手術(shù)切口和其他手術(shù)操作(尤其是組織如皮 膚的部分厚移植物)、"燒傷"(除非上下文另外需要，燒傷可以被認為 包括由暴露于高溫或低溫、化學試劑或輻射而引起的組織損傷)和其他 形式的創(chuàng)傷。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的藥物和方法促進響應(yīng)損傷的上皮再生特別有 效。作為示例，對表皮受損的皮膚損傷尤其有益。然而，應(yīng)了解本發(fā) 明方法也可以用于其他類型的損傷和創(chuàng)傷，包括諸如呼吸上皮或環(huán)繞 內(nèi)部組織或器官的上皮的損傷、損害或創(chuàng)傷。被促進的上皮再生可以是除了消化上皮的上皮。例如除了腸上皮或胃腸道上皮的上皮。磨個體的大面積。結(jié)果，燒傷損傷特別易感于并發(fā)癥，如由于缺乏功 能性上皮層引起的感染和脫水。因此，促進響應(yīng)燒傷損傷的上皮再生 為本發(fā)明的優(yōu)選應(yīng)用。促進上皮再生，例如在皮膚損傷區(qū)，使得損傷區(qū)外觀迅速改善。 美容在很多臨床環(huán)境中是重要的，尤其當上皮損傷發(fā)生在諸如臉、脖 子和手的身體顯著部位。因此，在期望改進損傷區(qū)外觀的部位促進上 皮再生為本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。病原體(如細菌、真菌或病毒)的作用、化學損傷(如由腐蝕性試劑 或諸如化療所釆用的細胞毒藥物的作用所引起的化學灼傷)、或例如曰曬中發(fā)生的輻射損傷(通過微粒輻射或通過電磁輻射，如Y輻射、紫外 輻射等)也可引起上皮損傷。采用本發(fā)明的方法和藥物促進上皮再生可 有效地用于所有上述情形。應(yīng)了解引起人類上皮損傷的很多相同因素也可能是其他動物尤其 是獸醫(yī)動物或家畜(例如馬、牛、狗、貓等)中的問題。因此本發(fā)明方 法也可用于非人類動物。應(yīng)用具有TGF-/33活性的試劑促進響應(yīng)上皮移植操作相關(guān)損傷的 上皮再生為本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。因皮膚移植產(chǎn)生的上皮損傷除了 美容因素之外可能是臨床上成問題的。上皮再生既有益于上皮移植物提供區(qū)，其中再生有助于重建功能 性上皮層，又有益于接受區(qū)，其中再生可改善和加速整合被移植的組 織。在采用皮膚、人工皮膚或皮膚替代品的移植物的情況下，移植物 接受區(qū)的上皮再生也是有益的。在上皮移植物提供區(qū)促進上皮再生減少了恢復(fù)功能性上皮層所用 的時間，因而減少了提供區(qū)感染的可能性。促進上皮再生還減少了可 能在提供區(qū)發(fā)生的起皰和組織破壞的發(fā)生。優(yōu)選地，上皮移植物為表皮(皮膚)移植物。本發(fā)明的方法和藥物 可用于促進全厚皮片和部分厚皮片情況下的上皮再生。這樣的皮膚移 植物(即全厚皮片或部分厚皮片)可以是網(wǎng)狀的或非網(wǎng)狀的。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)有或沒有完整上皮層也是決定例如供皮區(qū)的損傷或被 移除的上皮區(qū)部位的疼痛程度的因素。因此，通過在這樣的部位促進 上皮再生有可能減少例如與獲得皮膚移植物有關(guān)的疼痛。在上皮供區(qū)促進上皮再生的其他優(yōu)點為這減少了能夠從提供區(qū)再 獲取組織所需要的時間。再獲取指隨后從先前用過的提供區(qū)移除更多 上皮組織。這在可供獲取的上皮有限和/或需要獲取的皮膚面積大的情 形下尤其具有優(yōu)勢。這種情形的實例包括需要從兒童和/或經(jīng)受大部分 體表燒傷的患者中獲取移植物的場合。因此，本發(fā)明第三方面提供準備上皮移植物提供區(qū)用于再獲取的 方法，該方法包括給予需要這種準備的上皮供區(qū)治療有效量的具有TGF-j33活性的試劑。本發(fā)明這方面的上下文中"治療有效量"指足以 促進上皮再生使得可從供皮區(qū)獲取更多上皮移植物的具有TGF-/33活 性的試劑的量。應(yīng)了解通常由主管醫(yī)師決定供皮區(qū)的再生是否已足夠 以允許再獲取，而且這樣的人在沒獲益于本發(fā)明準備的情況下通過相 關(guān)書籍和他們自己的經(jīng)驗得到很多指導(dǎo)，這些指導(dǎo)表明通常多久可以 進4亍這種再獲取。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)采用TGF-/33自身，TGF-A的生物活性片段、變體和 衍生物，以及能促進和模擬TGF-/33生物活性的物質(zhì)可實現(xiàn)由具有 TGF-i83活性的試劑引起的促進上皮再生。通過它們在體內(nèi)或體外復(fù)制 TGF-i33作用的能力可容易地鑒定出適合的TGF-&生物活性片段、變 體和衍生物。采用適合的動物模型可體內(nèi)獲得TGF-j83活性，其中可比對照區(qū)中發(fā)生的上皮再生速率。適合的動物模型可以包括含上皮層(如 皮膚的表皮)組織的部分厚創(chuàng)傷或全厚創(chuàng)傷。技術(shù)人員應(yīng)了解當評估上皮再生的速度時(例如，為了鑒定再生是 否已被促進)應(yīng)考慮的相關(guān)參數(shù)為所獲得的上皮覆蓋范圍。應(yīng)注意從其 他因素中區(qū)分出這種上皮覆蓋度，如創(chuàng)傷中存在的肉芽組織的量(或諸 如血塊形成相關(guān)基質(zhì)的其他物質(zhì))。這類肉芽組織通過充填創(chuàng)傷空隙或 創(chuàng)傷基層有助于創(chuàng)傷閉合，但由于其基本上由非上皮細胞類型組成， 所以并不促成上皮再生。在分析創(chuàng)傷(如皮膚創(chuàng)傷)的情況下，通常上皮細胞可以由于其扁平的形態(tài)(與"紡錘"形狀的成纖維細胞或炎癥性 反應(yīng)的圓形細胞相對)被鑒定出來。Sequence ID No. 1為天然的人TGF-/53的氨基酸序列，如下MIHWCF腦 LEENCCVRPL Y腳RQDLG, KWVHE鵬W, ANFCSQPCPY IMADTTHST 糊LYKT證 EASA勤CVP Q亂iPLT露'(S辨鵬nce扱lfiU) ?，F(xiàn)有技術(shù)包括適合用于本發(fā)明方法和藥物的很多TGF-j33變體形 式。例如，EP-A-0 684 260描述了包括具有本發(fā)明適用的生物活性的 的經(jīng)#~飾形式的多肽和編碼該多肽的核酸。EP-A-0 684 260的 公開內(nèi)容代表了用于本發(fā)明的優(yōu)選多肽和核酸?？捎糜诒景l(fā)明的TGF-j83變體包括含有保守氨基酸替代的蛋白，它 保留了 TGF-Z 3的生物活性，通過其促進上皮再生的能力被表征。優(yōu)選 地，保守的替代為設(shè)計除去蛋白酶切割位點或涉及降解或清除 的其他肽結(jié)構(gòu)的替代。下文提供了可用于本發(fā)明藥物和方法的TGF-& 的變體和書t生物的更多細節(jié)。適合的TGF-/33變體形式可以為其中某些天然氨基酸被具有與被 替代氨基酸有相同生物物理特性的側(cè)鏈的氨基酸所替代，以產(chǎn)生保守 變化。例如，小的非極性疏水氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和蛋氨酸。大的非極性疏水氨基酸包括苯 丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、半 胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電(堿性)氨基酸包括賴氨酸、精 氨酸和組氨酸。帶負電(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。諸如翻譯中或翻譯后發(fā)生的蛋白序列的其他修飾，如乙?；Ⅴ?胺化、羧化、磷酸化、蛋白水解切割或連接到配體，可提供更多的適 合用于本發(fā)明藥物和方法的TGF-Z 3變體形式。適合用于本發(fā)明方法和藥物的TGF-&衍生物包括增加或降低 TGF-A體內(nèi)半衰期的衍生物。能夠增加TGF-仏半衰期的衍生物的實 例包括的類肽衍生物、TGF-/ 3的D-氨基酸衍生物和肽-類肽雜 合物。應(yīng)了解，因為TGF-Z53及其片段(以及很多其可能的變體和衍生物) 是蛋白或可能包含肽基組分，所以它們可能經(jīng)受很多方式(如生物系統(tǒng) 中的蛋白酶活性)的降解作用。這種降解作用可能限制多肽的生物利用 度，由此限制多肽實現(xiàn)其生物學功能的能力。已有很多成熟技術(shù)，通 過它們可設(shè)計和生產(chǎn)在生物背景中具有增強穩(wěn)定性的肽衍生物。這些 肽衍生物由于對蛋白酶介導(dǎo)的降解作用具有增強的抗性而可能具有提 高的生物利用度。優(yōu)選地，適合用于本發(fā)明的肽衍生物或類似物比衍 生其的肽具有更強的蛋白酶抗性。優(yōu)選地，通過保護N末端和/或C末端可以使得TGF-/33、其變體 或片段更加抗蛋白酶。例如，N末端可被乙酰基保護。C末端可被酰 胺基保護。通過現(xiàn)有技術(shù)描述的公知的蛋白降解測定可以將TGF-/33衍生物的蛋白酶抗性與TGF-/33自身的蛋白酶抗性相比較。了解TGF-j33結(jié)構(gòu)可容易地設(shè)計TGF-jS3類肽衍生物。可以采用可購得的軟件依據(jù)成熟的實驗設(shè)計開發(fā)類肽衍生物。逆類肽(其中所有氨基酸反方向被類肽殘基替代)也能夠模擬的上皮再生促進特性。與包含一個類肽殘基的肽或類肽-肽雜合 物相比，預(yù)料逆類肽以反向結(jié)合在配體-結(jié)合槽中。結(jié)果，類肽殘基的 側(cè)鏈能夠與原始肽的側(cè)鏈指向相同。TGF-/33的D-氨基酸形式包含在適合用于本發(fā)明方法和藥物的 TGF-i83衍生物的其它實施方案中。這種情況下，組成衍生物的氨基酸 殘基的順序與原始TGF-Z33相比是反向的。采用D-氨基酸而不是L-氨 基酸制備衍生物大大減少這類試劑通過正常代謝過程的任何不期望的 降解，減少需要給予的試劑量以及給藥頻率。應(yīng)了解，為了成為適合用于本發(fā)明方法和藥物的TGF-仏生物活性 片段、變體或衍生物，該片段、變體或衍生物必須保留TGF-ft的上 皮再生促進活性?？梢蕴峁┗钚曰蚍腔钚孕问降腡GF-/33 (或其生物活性片段、變體 或衍生物)用于本發(fā)明的方法或藥物。通過很多機制，例如包嚢，可使 TGF-/33失活。可通過外界刺激降解膠嚢使得在需要時釋放活性試劑。適合該方法的外界刺激包括紫外光、超聲、體內(nèi)酶或熱。TGF-Z53還可以非活性前體提供，它在與含有將該前體轉(zhuǎn)化為其活 性形式所必需的天然裂解酶的組織接觸后被激活。Sequence ID No. 2 提供了天然存在的人TGF-&前體的氨基酸序列，如下MKMHLCpALV VLAIJLMFATV' SLSUTCTnLGT^BNTBSBY AVCf腿TB:K, FE權(quán)曹微SADDTNYCF雄WGit寵，Q.AL測TTR1LL Y細D9KEDM V1EFNVSS聰,靈CPCHKG，NEDDHGMMff臓LDN'IQGLAE廳Lcsp夠ae鵬彥亂2》或者，通過結(jié)合分子的分子添加(molecularaddition)實現(xiàn)失活。在 需要時可通過諸如紫外光、超聲、體內(nèi)酶或熱的外界刺激將結(jié)合分子 分離。用于生成無活性TGF-&的適合的肽在本領(lǐng)域是公知的，因為 TGF-|3s常^v細胞中以稱為潛活TGF-j3的無活性形式分泌出來。潛活 TGF-jS由N末端潛活相關(guān)肽(Latency Associated Peptide) (LAP)和 TGF-j3組成，它也^皮稱為小潛活復(fù)合物(Small Latent Complex)。另外， 小潛活復(fù)合物可與另 一稱為潛活TGF-|8結(jié)合蛋白(Latent TGF-/3 Binding Protein)(LTBP)的大小可不同的肽(來自不同基因)結(jié)合，這種情 況下，整個復(fù)合物稱為大潛活TGF-j8復(fù)合物(Large Latent TGF-jS Complex)。當使得TGF-iS從LAP上離解時，潛活TGF-j3被活化。這種離解 可以與甘露糖-6-磷酸/胰島素樣生長因子II受體(M6P-R)協(xié)調(diào)，且涉及蛋白酶，例如纖維蛋白溶酶，通過組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶連接在細胞表面的底物。自由基和活性氧通過引起從LAP的離解也能夠活化TGF-/3。本發(fā)明還包括能夠促進或模擬TGF-/33生物活性的物質(zhì)在制備用 于促進上皮再生的藥物中的用途。能促進或模擬TGF-/33生物活性的物質(zhì)可通過很多方式實現(xiàn)它們 的作用。例如，這些物質(zhì)可增加TGF-j83的表達，或者可增加TGF-/33 的半衰期，例如通過減少TGF-Z 3的代謝。能促進或模擬TGF-仏生物 活性的物質(zhì)的實例包括蛋白物質(zhì)和非蛋白物質(zhì)。例如，能促進或模擬 TGF-/33生物活性的物質(zhì)包括調(diào)節(jié)TGF-i33活性的轉(zhuǎn)錄因子、能夠模擬 TGF-i83生物活性的激活抗體、復(fù)制TGF-j83的受體-結(jié)合效應(yīng)的無機小 分子、以及能誘導(dǎo)保留了在的受體結(jié)合中產(chǎn)生的特征的細胞內(nèi) 信號級聯(lián)放大的物質(zhì)。優(yōu)選地，促進上皮再生可以使得上皮再生速度比對照治療或未治 療上皮中發(fā)生的再生高至少5%、 10%、 20%或30%。更優(yōu)選地，促進 的上皮再生可以使得上皮再生速度比對照治療或未治療上皮中發(fā)生的 再生高至少40%、 50%或60%。還更優(yōu)選地，促進的上皮再生可以使 得上皮再生速度比對照治療或未治療上皮中發(fā)生的再生高至少70%、 80%或90%,且最優(yōu)選地，促進的上皮再生可以-使得上皮再生的速度 比對照治療或未治療上皮中發(fā)生的再生高至少100%。優(yōu)選地，促進上皮再生可以使得上皮再形成時間比發(fā)生在對照治 療或未治療上皮中的快1天、2天或3天。更優(yōu)選地，促進的上皮再 生可以使得上皮再形成的時間比發(fā)生在對照治療或未治療上皮中的快 至少4天、5天或6天。還更優(yōu)選地，促進的上皮再生可以使得上皮 再形成時間比發(fā)生在對照治療或未治療上皮中的快至少7天、8天或9 天，且最優(yōu)選地，促進的上皮再生可以使得上皮再形成時間比發(fā)生在 對照治療或未治療上皮中的快至少10天。對于再獲取上皮的時間，例如從中厚皮片提供區(qū)，優(yōu)選地，促進 上皮再生可以使得再獲取時間比發(fā)生在對照治療或未治療上皮中的快 l天、2天或3天。更優(yōu)選地，促進的上皮再生可以使得再獲取時間比 發(fā)生在對照治療或未治療上皮中的快至少4天、5天或6天。還更優(yōu)選地，促進的上皮再生可以使得再獲取時間比發(fā)生在對照治療或未治療上皮中的快至少7天、8天或9天，且最優(yōu)選地，促進的上皮再生 可以使得再獲取時間比發(fā)生在對照治療或未治療上皮中的快至少10 天。本發(fā)明藥物可以提供治療有效量的適于促進上皮再生的本發(fā)明試 劑。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)當在上皮損傷前或者一旦這些損傷已發(fā)生時給予這些 藥物能促進上皮再生。預(yù)防性使用本發(fā)明試劑以促進上皮再生為本發(fā)明的優(yōu)選使用方 式。應(yīng)了解這種應(yīng)用最適合于已經(jīng)知道預(yù)期上皮損傷的時間和位置的 情況，例如，由非急需施行的操作產(chǎn)生的損傷，但是在上皮損傷可能 發(fā)生的情形下也可用本發(fā)明的試劑預(yù)處理。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在上皮即將損 傷前給予本發(fā)明試劑(即，損傷發(fā)生前一小時或優(yōu)選半小時內(nèi))是非常 效的，盡管在較早時間給藥(例如直到上皮損傷前24小時或48小時) 也是有效的。預(yù)防性應(yīng)用本發(fā)明的用途、方法和藥物為本發(fā)明的優(yōu)選 實施方案，且在皮膚移植物提供區(qū)和/或接受區(qū)的準備中是特別優(yōu)選 的。當在上皮損傷已經(jīng)發(fā)生后給藥時，本發(fā)明試劑也有效地促進上皮 再生。優(yōu)選地，損傷開始后應(yīng)盡可能早地進行這種給藥，但是直到損 傷上皮完全恢復(fù)的任何時間本發(fā)明試劑都能夠促進上皮再生。應(yīng)了解， 可有效給予本發(fā)明試劑使得它們能促進上皮再生的"窗口"取決于很 多因素，包括所討論上皮的性質(zhì)(包括上皮的天然修復(fù)速率)、已發(fā)生 損傷的程度和損傷面的大小。因此，在大面積上皮損傷的情況下，或 在損傷了天然再生慢的上皮的情況下，還可在再生反應(yīng)的相對晚期有 效給予本發(fā)明試劑。例如，優(yōu)選地，可在上皮損傷發(fā)生后第1小時到 24小時內(nèi)給予本發(fā)明試劑，但如果在直至損傷開始后第十天或更長時 間給藥時，本發(fā)明試劑仍可達到對上皮再生的有益促進。通過在上皮損傷部位反復(fù)給予本發(fā)明試劑可促進上皮再生。例如， 可根據(jù)需要對損傷上皮給予治療有效量的本發(fā)明試劑直到上皮完全再 生。例如，可在損傷發(fā)生后的至少最初三天內(nèi)對上皮損傷部位每天一 次或每天兩次給予本發(fā)明試劑。最優(yōu)選地，上皮損傷發(fā)生前和發(fā)生后都給予本發(fā)明試劑。發(fā)明者 發(fā)現(xiàn)在上皮即將損傷前給予本發(fā)明試劑，接著在上皮損傷后三天內(nèi)每 天給予這種試劑，對促進上皮再生尤其有效。應(yīng)了解，用于上皮損傷部位的本發(fā)明試劑的量取決于很多因素， 如該試劑的生物活性和生物利用度，而它們又取決于給藥模式和試劑的理化性質(zhì)。其他因素可以包括A) 治療對象中該試劑的半衰期。B) 被治療的具體狀態(tài)。C) 對象的年齡。給藥頻率也受到上述因素的影響，尤其是治療對象中所選擇的本 發(fā)明試劑的半衰期。通常，當采用本發(fā)明試劑治療已有的上皮損傷部位時，上皮損傷 一發(fā)生或一被診斷就應(yīng)給予該試劑。使用本發(fā)明試劑的治療應(yīng)持續(xù)到 損傷上皮再生到臨床醫(yī)生滿意為止。給藥頻率取決于所采用的本發(fā)明試劑的生物半衰期。通常，應(yīng)當 對靶組織給予含有本發(fā)明試劑的霜劑或軟膏劑使得該試劑在上皮損傷 部位的濃度維持在適合具有療效的水平。這可能需要每天一次給藥或 甚至每天幾次給藥?？赏ㄟ^能實現(xiàn)所期望的促進上皮再生作用的任何適當途徑給予治 療有效量的本發(fā)明試劑，例如以本發(fā)明藥物的形式，但可以優(yōu)選地在 上皮損傷部位進行局部給藥。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)以注射形式在上皮損傷部位給予本發(fā)明試劑(尤其是 TGF-iS3)可有效促進上皮再生。例如，在表皮損傷的情況下，可通過皮 內(nèi)注射方式給予本發(fā)明試劑。因此，本發(fā)明優(yōu)選的組合物包括本發(fā)明 試劑的注射用溶液(例如，用于在上皮損傷部位或?qū)⒁獡p傷部位的邊緣 周圍注射)。用于本發(fā)明該實施方案的適合制劑見下文中的附錄。或者，或另外地，也可以局部形式給予本發(fā)明試劑來促進上皮再 生?？勺鳛閾p傷區(qū)域的初始和/或隨后治療的一部分進行這種給藥。下 文詳細列出了適合局部給藥的制劑?？赏ㄟ^注射到創(chuàng)傷表面、通過氣 霧劑噴霧以及還可通過在封閉或半封閉敷料如Opsite、 Bioclusive、Tegaderm等下應(yīng)用到創(chuàng)傷表面來應(yīng)用外用制劑。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)對損傷上皮(或者，在預(yù)防性應(yīng)用情況下，對將會被損 傷的上皮)局部應(yīng)用本發(fā)明試劑尤其提高本發(fā)明的上皮再生促進作用。優(yōu)選地，配制含有本發(fā)明試劑的組合物使得它們另外包含糖。糖 可優(yōu)選地選自麥芽糖、甘露糖、蔗糖和葡萄糖。尤其優(yōu)選地，糖是麥 芽糖。糖，例如麥芽糖，可以以足夠的量存在使得該組合物對于被給 予該組合物的部位基本上是等張的。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在制劑中采用諸如麥芽糖的糖類顯著地和驚人地提高 了能夠從含有TGF-j83的容器中(例如載藥注射器)回收的活性物質(zhì)的量 和TGF-]83分子的固有生物活性。關(guān)于TGF-j33物質(zhì)的回收，相較于基 于甘露醇的制劑，麥芽糖制劑使得回收物質(zhì)增加了 4倍(通過ELISA 測定)。關(guān)于TGF-j33的固有生物活性，相較于甘露醇制劑(Mink肺上皮 細胞測定中ICso為30.104 [± 7.093] pg/mL),麥芽糖制劑(Mink肺上皮 細胞測定中ICso為7.309 [± 1.044] pg/mL)使得活性增加了 4倍。在將要通過注射方式給予組合物的情況下，尤其優(yōu)選采用在諸如 麥芽糖的糖類存在下配制的本發(fā)明試劑的組合物。發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)， 相較于采用其他張力緩沖劑(如甘露醇)的制劑，在這些制劑中采用諸 如麥芽糖的糖類在降低接受注射組合物的患者所經(jīng)受的疼痛水平方面 具有顯著的優(yōu)勢。實際上，包含本發(fā)明活性試劑和諸如麥芽糖的糖類的組合物如此 有益以至于它們構(gòu)成了本發(fā)明的單獨方面。因此，本發(fā)明第四方面提 供包含存在糖的情況下配制的具有TGF-Z33活性的試劑的組合物，所述 糖選自麥芽糖、甘露糖、蔗糖和葡萄糖。優(yōu)選地，所述糖包含麥芽糖。用于本發(fā)明任何前述方面的適合組合物可以包含存在糖的情況下 配制的活性試劑，所述糖例如濃度為0.1 M至0.4 M糖的麥芽糖。更 優(yōu)選地，適合的制劑可以包含存在0.25M糖的情況下配制的活性試劑。包含本發(fā)明活性試劑的組合物可采取很多不同形式，這具體取決 于使用它們的方式。因此，例如，它們可以是液體、軟膏劑、霜劑、 凝膠劑、水凝膠、散劑或氣霧劑的形式。所有這些組合物均適合局部 應(yīng)用于損傷上皮，這是對需要治療的個體(人或動物)給予本發(fā)明試劑的優(yōu)選方式。在優(yōu)選的實施方案中，可以通過將試劑(具有期望的純度)與任選 的生理上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合來制備適于局部腸胃外 給藥(如皮內(nèi)和皮下)的本發(fā)明試劑的治療制劑，所述載體、賦形劑或 穩(wěn)定劑為用于重組的凍干和非凍干粉末制劑、非水溶液和水溶液、包 括乳劑和半固態(tài)制劑的非水分散體/懸浮液和水分散體/懸浮液?？山邮?的載體，包括賦形劑，在所采用的劑量和濃度下對受者是無毒的，且包括但不限于緩沖液，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑， 包括抗壞血酸和曱硫氨酸；張力調(diào)節(jié)劑，如氯化鈉、葡萄糖、甘油等； 防腐劑，如氯化十八烷基二曱基苯基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨； 卡索氯銨；苯酚、丁醇或卡醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯曱 酸甲酯和/或?qū)αu基苯甲酸丙酯和/或?qū)αu基苯曱酸丁酯；鄰苯二酚；間 苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇和間曱酚)；低分子量(少于約IO個殘基)多肽； 蛋白，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡 咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰氨、組氨酸、精氨酸 或賴氨酸；單糖、二糖和包括葡萄糖、甘露糖或糊精的其他碳水化合 物；螯合劑，如EDTA;其他糖，如蔗糖、甘露醇、麥芽糖、海藻糖 或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，如鈉；金屬配合物(例如Zn-蛋白配合物)； 陰離子表面活性劑，如脂肪酸肥皂、?；蛩猁}或?；腔《猁}； 陽離子表面活性劑，如烷基伯胺、烷基仲胺、烷基^k胺、或烷基季胺； 非離子表面活性劑，例如?；崦撍嚼嫣谴减ヮ惢蝓；峋垡已趸?酯類、聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚物。除了活性試劑之外，用于本發(fā)明局部腸胃外給藥的藥物制劑的實 例任選地或另外地包括以下0.01M至0.1 M磷酸鹽緩沖液，和高至0.9% w/v的氯化鈉(以達到與血液等張，290-300 mOsm/L) 1-10 w/v %麥芽糖(盡管作為選擇可采用另 一適合的糖)，和 0.1 mg/ml聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酉旨(TweenTM80)。 技術(shù)人員容易了解可基于上述溶液制備凍干(冷凍干燥的)粉塊。 本發(fā)明的優(yōu)選實施方案可以下列形式呈現(xiàn)小瓶裝、安瓿裝或載藥注射器裝的無菌溶液、適合重組的無菌凍干(冷凍干燥的)粉末、無 菌混懸劑或適合局部腸胃外給藥的任何其他藥物可接受形式。在本發(fā)明的其他優(yōu)選實施方案中，可通過將具有期望純度的物質(zhì) 與任選的生理上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合來制備適于局部 給藥的本發(fā)明試劑的治療制劑，所述載體、賦形劑或穩(wěn)定劑的形式為 凍干或非凍干的粉末制劑、非水溶液或水溶液、非水分散體/懸浮液或 水分散體/懸浮液，包括乳劑和半固態(tài)制劑?？山邮艿妮d體，包括賦形 劑，在所使用的劑量和濃度下對受者是無毒的，它包括但不限于經(jīng)純化的水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、林格溶液、林格乳酸鹽溶液、 葡萄糖溶液、葡萄糖/鹽水溶液、水-醇溶液、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖、 甘露糖、甘露醇、麥芽糖、山梨糖醇、聚乙二醇(PEG)、丙二醇(PG)、 磷酸鹽、醋酸鹽、明膠、膠原、Carbopol 934 (BF Goodrich Corp.)、 植物油和合成油、植物蠟和合成蠟、陰離子表面活性劑例如脂肪酸肥 皁、?；蛩猁}、或?；腔《猁}；陽離子表面活性劑，如烷基 伯胺、烷基仲胺、烷基叔胺或烷基季胺；非離子表面活性劑，例如酰 基酸脫水山梨糖醇酯類或酰基酸聚乙氧基酯類、聚氧乙烯和聚氧丙烯 的共聚物等。還可以另外地包括適合的防腐劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、 抗微生物劑和緩沖劑，例如對鞋基苯曱酸曱酯和/或?qū)αu基苯曱酸丙酯 和/或?qū)αu基苯曱酸丁酯；丁基化羥基苯曱醚(BHA)、 丁化羥基甲苯 (BHT)、杵檬酸、抗壞血酸等?？捎糜谥苿┲械娜閯?、霜劑或軟膏劑 基質(zhì)包括水基霜劑和乳劑(水包油型)、油基霜劑和乳劑(油包水型)、軟 膏劑(乳化的和非乳化的烴)、凝膠、水凝膠等。用于局部給藥的其他 制劑包括氣霧劑、繃帶和其他創(chuàng)傷敷料?；蛘?，可在適合的聚合物基 質(zhì)或膜中并入或包嚢本發(fā)明的治療化合物，由此提供適合放置在治療 部位或植入治療部位附近的緩釋給藥裝置。除活性成分外，用于本發(fā)明局部給藥的半固態(tài)水凝膠制劑的藥物 制劑的實例包括以下0.1% w/v至2.0% w/v的羥基纖維素，和0.1% w/v至1.0% w/v的Carbopol 934 (BF Goodrich Corp.),和 10-20。/。w/v的丙二醇，和0.005% w/v至0.020% w/v的對羥基苯曱酸甲酯，和 0.005% w/v至0.020% w/v的對羥基苯甲酸丙酯，和 氫氧化鈉或鹽酸適量加至pH 4-10 經(jīng)純化的水，適量加至100% w/v。用于本發(fā)明局部應(yīng)用的適合組合物(包括在存在麥芽糖情況下配 制的本發(fā)明活性試劑的組合物)可以下列形式呈現(xiàn)瓶裝、罐裝、管裝、 噴霧器裝的無菌溶液、用于重建的無菌凍干(冷凍干燥的)或非凍干粉 末、無菌分散體/懸浮液、無菌半固體或適于局部給藥的任何其他藥物 可接受形式?？稍跓o菌敷料或貼片上提供本發(fā)明的試劑，其可用于覆蓋待治療 的上皮損傷部位。應(yīng)了解包含本發(fā)明試劑的組合物的載體應(yīng)該是患者良好耐受的， 并使得藥物在上皮損傷部位釋放。這樣的載體優(yōu)選是生物相容的、可 生物降解的、可生物再吸收的、可生物分解的和/或非炎性的。包含本發(fā)明試劑的組合物可用在許多方法中。因此，例如，組合物可用在上皮損傷部位中和/或其周圍以調(diào)節(jié)上皮再生。如果組合物被 用于"現(xiàn)有的"上皮損傷部位，那么藥物可接受的載體應(yīng)該是相對"溫 和的"，即生物相容的、可生物降解的、可生物分解的和/或非炎性的 載體。本發(fā)明試劑或編碼該試劑的核苷酸可被并入到緩慢或延遲釋放裝 置中。這種裝置例如可以;改置在皮膚上或嵌入皮膚內(nèi)，且試劑或核酸 在幾天、幾周或甚至幾個月中被釋放。這種裝置可特別用于需要長期 促進上皮再生的患者。當用于給予通常需要頻繁給藥的試劑或核酸時 (例如通過其他途徑至少每天給藥)，該裝置可以特別有優(yōu)勢。本發(fā)明試劑的日劑量可單次給藥(例如，每天應(yīng)用局部制劑或每天 注射)。或者，本發(fā)明試劑可能需要一天內(nèi)給藥兩次或更多次。作為其 它選擇，對不需要重復(fù)給藥的患者，可采用緩釋裝置提供最佳劑量的 本發(fā)明試劑。在一個實施方案中，用于給予本發(fā)明試劑的藥物載體可以是液體， 且適合的藥物組合物會是溶液形式。在另一個實施方案中，藥物可接受的載體是固體，且適合的組合物是散劑或片劑形式。在其它實施方 案中，本發(fā)明試劑可被組方為藥物可接受透皮貼片的 一部分。固體載體可包括一種或多種物質(zhì)，其也可以充當矯味劑、潤滑劑、增溶劑、助懸劑、填充劑、助流劑、壓制助劑、粘合劑或藥片崩解劑， 其也可以是包嚢物質(zhì)。散劑中，載體是微細的固體，它與本發(fā)明的微 細的試劑混合。片劑中，本發(fā)明試劑以適當比例與具有必要壓制特性 的栽體混合，并被壓緊成為所期望的形狀和大小。散劑和片劑優(yōu)選包含高至99%的本發(fā)明試劑。適合的固體載體例如包括磷酸鈣、硬脂酸 鎂、滑石、糖類、乳糖、糊精、淀粉、明膠、纖維素、聚乙烯吡咯烷 酮、低熔點蠟和離子交換樹脂。液體載體可用在制備溶液、混懸液、乳劑、糖漿劑、酏劑和加壓組合物中。本發(fā)明試劑可溶解或懸浮在藥物可接受的液體載體中，例 如水、有機溶劑、兩者的混合物或藥物可接受的油或脂。液體載體可 包含其他適合的藥物添加劑，如增溶劑、乳化劑、緩沖液、防腐劑、 增甜劑、矯味劑、助懸劑、增稠劑、色素、粘度調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑或滲 透調(diào)節(jié)劑。用于口服和腸胃外給藥的液體載體的適合實例包括水(部分 地包含上述添加劑，例如纖維素衍生物，優(yōu)選羧曱基纖維素鈉溶液)、 醇類(包括 一 元醇和多元醇，例如二元醇類)和它們的書f生物以及油(例 如分餾的椰子油和花生油)。對腸胃外給藥，載體也可以是油狀酯，如 油酸乙酯、十四烷酸異丙酯。無菌液體載體可用于腸胃外給藥的無菌 液體形式組合物。用于加壓組合物的液體載體可以是卣化烴或其他藥 物可接受的拋射劑。為無菌溶液或混懸液的液體藥物組合物可用于例如肌內(nèi)注射、鞘 內(nèi)注射、硬膜外注射、腹膜內(nèi)注射、皮內(nèi)注射或皮下注射。無菌溶液 也可靜脈內(nèi)給藥、通過氣霧劑噴霧或在封閉或半封閉敷料下敷用而局 部給藥。本發(fā)明試劑可制備為無菌固體組合物，例如通過冷凍干燥或 凍干，在給藥時可使用無菌水、鹽水或其他適合的無菌注射介質(zhì)將它 們?nèi)芙饣驊腋?。載體旨在包括必需的和惰性的粘合劑、助懸劑、潤滑 劑、食用香料、增甜劑、防腐劑、染料和包衣。在期望通過口服方式給予本發(fā)明試劑的情況下，應(yīng)了解所選擇的試劑優(yōu)選是對降解有增強抗性的試劑。例如，本發(fā)明試劑可以優(yōu)選地 不是肽或可以不含有肽組分。本發(fā)明試劑的組合物適合用于減輕或控制角膜上皮(角膜基質(zhì)細 胞上面的細胞)損傷。這種損傷可由意外受傷(如上所述)或手術(shù)操作(例 如對角膜的激光手術(shù))對眼睛的創(chuàng)傷所引起。這種情況下本發(fā)明的組合 物或藥物可以是滴眼劑的形式。盡管該組合物可用于角膜中，但發(fā)明 者認為本發(fā)明方法可優(yōu)選地用于無基質(zhì)細胞的組織中，如皮膚或頭皮。本發(fā)明試劑可用于多種"體內(nèi)"部位的上皮損傷(即，發(fā)生在體內(nèi) 而不是外表面的上皮損傷)。因此，例如，包括本發(fā)明試劑的藥物可配已知的方法，如制藥工業(yè)常規(guī)釆用的那些(例如體內(nèi)實驗、臨床實 驗等)，可用來確立包括本發(fā)明試劑的組合物的具體配方和給予這些組 合物的精確治療方案(如活性試劑的日劑量和給藥頻率)。通常，包括本發(fā)明試劑的組合物應(yīng)當被配制為使得當對上皮損傷部位給藥時在該部位獲得0.01 nM-10 mM/cm2或0.01 nM-10 mM/cm的 試劑濃度。優(yōu)選地，包括本發(fā)明試劑的組合物應(yīng)當被配制為使得當對 上皮損傷部位給藥時在該部位可獲得0.1 nM-l mM/cm2或0.1 nM-l mM/cm的試劑濃度。更優(yōu)選地，包括本發(fā)明試劑的組合物應(yīng)當被配制 為使得當對上皮損傷部位給藥時在該部位可獲得0.1 nM-400 ]LiM/cm2 或0.1 nM-400 /iM/cm的試劑濃度。僅作為例子，含有50 ng/100 /d-500 ng/100 pi本發(fā)明試劑(如TGF -/33)的注射溶液適合用于部分厚表皮損傷部位。能促進上皮再生的本發(fā)明試劑的適合日劑量取決于上述因素和待 治療的上皮損傷部位的大小。通常，治療上皮損傷部位所需的本發(fā)明 試劑的量為0.01 nM-10 mM該試劑/cm2/24 h或0.01 nM-10 mM該試劑 /cm/24 h,取決于上皮損傷部位的面積以及其他若干因素。本發(fā)明試劑可作為單一療法(即單獨使用試劑)促進上皮再生?；?者，本發(fā)明的用途、方法或藥物可與其他能促進上皮再生的化合物或 治療進行組合。例如，本發(fā)明的用途、方法或藥物可與敷料(其可以包 括紗布、合成復(fù)合膜和/或透明膜，其中任何一種均可任選地用抗感染劑、藻酸鹽、水膠體或蜂蜜浸漬)、人工皮膚(如由個體自身表皮產(chǎn)生 的人工皮膚，或可購得的等同物)或軟膏劑(如包含銀基抗感染化合物 的軟膏劑)組合。適合與本發(fā)明方法、用途或藥物組合的可購得的人工皮膚的兩個實例是Apligraf (Graftskin)和Dermagraft。本發(fā)明的用途、方法或藥物也適合用于與其他常規(guī)或發(fā)展中的療 法進行組合。以下段落關(guān)注這種療法的實例，并提到了適應(yīng)癥，其中 采用聯(lián)合療法是優(yōu)選的。當在創(chuàng)傷愈合(以及特別是燒傷愈合和皮膚潰瘍愈合)的情況下促 進上皮再生時，將本發(fā)明的用途、方法或藥物與清創(chuàng)劑組合可能是優(yōu) 選的。這種試劑的適合的實例可以包括諸如膠原酶(Smith & Nephew) 的酶制劑、化學制劑、外科/機械制劑或生物制劑如蛆蟲療法?；蛘呋蛄硗獾?，當在創(chuàng)傷愈合中促進上皮再生時，可能優(yōu)選組合 本發(fā)明的用途、方法或藥物與諸如cytoporins的溶解性肽。這些肽可 摻入到生物細胞膜中由此引起細胞溶解。用于聯(lián)合療法的適合 cytoporins的實例是HB-107 (由Helix BioMedix, Inc.生產(chǎn))。通過采用胸腺素/3-4與本發(fā)明的用途、方法和藥物組合可促進創(chuàng) 傷愈合(尤其是糖尿病)、大皰性表皮松解癥和眼疾病(包括角膜創(chuàng)傷愈 合)中的上皮再生。適合這種應(yīng)用的胸腺素/3-4的重組形式由RegeneRx Biopharmaceuticals Inc.生產(chǎn)。適合與本發(fā)明用途、方法或藥物一起用于促進與創(chuàng)傷愈合和諸如潰瘍的皮膚疾病相關(guān)的上皮再生的聯(lián)合療法中的另一試劑是匹米前列 素(Pimilprost)。該化合物是前列腺素II的穩(wěn)定類似物，具有血小板凝 集抑制劑和血管舒張劑的生物活性?？蓙V人Sumitomo Pharmaceuticals Co. Ltd.獲得適合與要求保護的用途、方法和藥物聯(lián)合使用的匹米前列素 (Pimilprost)?？梢酝ㄟ^將本發(fā)明的用途、方法和藥物與諸如氨來p占諾(可從 Access Pharmaceuticals Inc.購得)的肥大細胞脫顆粒抑制劑組合來促進 口腔中的上皮再生，例如在創(chuàng)傷或口腔潰瘍的治療中。還可通過將本發(fā)明的用途、方法和藥物與熱激蛋白70 (HSP-70) 或熱激蛋白誘導(dǎo)物氯吡哌醇(Bimoclomal)組合來促進創(chuàng)傷愈合中的或糖尿病合并癥引起的上皮損傷的再生，氯吡派醇由Biorex Research and Development Co.生產(chǎn)，是適合用于這些聯(lián)合療法的HSP誘導(dǎo)物的優(yōu)選 實例。為了促進諸如胃內(nèi)層(例如上皮再形成促進胃潰瘍愈合的情況 下)、表皮和角膜上皮的組織中的上皮再生，組合本發(fā)明的用途、方法 和藥物與能夠加速組織再生的促黑素抑制素類似物可能是優(yōu)選的。這 種類型的適合類似物的實例是Alaptid,可從VUFB購得?？捎欣赜糜谂c本發(fā)明的用途、方法和藥物組合的另 一 試劑是肝 素酶III。優(yōu)選地，這種組合可用于促進與創(chuàng)傷愈合和外部潰瘍治療(尤 其是糖尿病性潰瘍)有關(guān)的上皮再生。用于該組合的肝素酶III的適合 形式由IBEX Technologies, Inc.生產(chǎn)，命名為IBT-9302。另外地或作為選擇，本發(fā)明的用途、方法和藥物可與Chrysalis Biotechnology, Inc.生產(chǎn)的合成凝血酶擬肽Chrysalin聯(lián)合使用。這種 聯(lián)合對于促進與創(chuàng)傷愈合和糖尿病性潰瘍尤其是糖尿病性足部潰瘍有 關(guān)的上皮再生可能是優(yōu)選的?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的用途、方法或藥物與GroPepLtd.生產(chǎn)的PV-707 的組合來實現(xiàn)促進燒傷損傷部位的上皮再生，PV-707是肽生長因子激 動劑?？梢酝ㄟ^聯(lián)合使用合成硫酸脫氫表雄酮(DHEAS)與本發(fā)明的用 途、方法和藥物來促進創(chuàng)傷尤其是燒傷中的上皮再生。適合這種應(yīng)用 的一種合成DHEAS由Pharmadigmlnc.生產(chǎn)，名稱為PB-005?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的用途、方法或藥物與重組乳鐵蛋白的組合來促 進皮膚病和創(chuàng)傷愈合治療中的上皮再生。重組人乳鐵蛋白的一種適合 開j式由Agennix Inc.生產(chǎn)。適合促進與創(chuàng)傷愈合響應(yīng)有關(guān)的上皮再生的另 一聯(lián)合療法在于將 本發(fā)明的用途、方法或藥物與游離脫氧核糖核苷酸組合。PN-105提供 了這種脫氧核糖核苷酸的適合來源，它包括凝膠基質(zhì)的這些分子的等 重混合物，由Wellstat Therapeutics Corp.生產(chǎn)。已有 一 系列設(shè)計用來增進或增加上皮再生的方法和組合物采用除 TGF-j83之外的生長因子。應(yīng)了解，本發(fā)明的用途、方法或藥物也可以與這些現(xiàn)有療法聯(lián)合使用。下文就如何將本發(fā)明與其他基于生長因子 的療法聯(lián)合使用提供進一步的指導(dǎo)。本發(fā)明的用途、方法和藥物可與成纖維細胞生長因子(FGF)家族的 成員聯(lián)合使用。例如，本發(fā)明可以與堿性FGF (FGF-2)聯(lián)合使用。本 發(fā)明用途、方法或藥物與FGF-2的這種組合在促進創(chuàng)傷損傷后的上皮 再生中可以是尤其優(yōu)選的?？梢缘靡嬗谶@種組合的創(chuàng)傷部位的實例包 括燒傷、移植物提供區(qū)和諸如潰瘍(包括不愈合潰瘍，如糖尿病性潰瘍 和褥齊)的慢性創(chuàng)傷。FGF-2可以優(yōu)選重組FGF-2(rFGF-2)，且更優(yōu)選 重組人FGF-2 (rhFGF-2)。適合用于本發(fā)明這個實施方案中的rFGF-2 的適合實例是由Scios Inc.或Chiron生產(chǎn)的?？梢耘c本發(fā)明的用途、方法和藥物聯(lián)合使用以促進上皮再生的成 纖維細胞生長因子家族的另一成員是FGF-IO (也稱為角質(zhì)形成細胞生 長因子-2或KGF-2)，以促進由下列引起的上皮損傷的再生創(chuàng)傷、皮 膚愈合過程中的合并癥(如皮膚潰瘍)、諸如口腔粘膜炎或潰瘍性結(jié)腸 炎的疾病或諸如在克羅恩病中發(fā)生的胃腸上皮損傷。適合與本發(fā)明的 用途、方法或藥物聯(lián)合使用的 一種FGF-10適合形式由Human Genome Sciences, Inc.生產(chǎn)，名稱為Repifermin。本發(fā)明的用途、方法和藥物也可以與血小板衍生的生長因子 (PDGF)家族中的成員聯(lián)合使用。例如，本發(fā)明的用途、方法或藥物與 PDGF-B的組合可用于促進創(chuàng)傷愈合尤其是燒傷創(chuàng)傷愈合或糖尿病性 足部潰瘍愈合中的上皮再生。在這種組合的一個優(yōu)選實施方案中，可 以優(yōu)選地通過腺病毒載體的方法遞送所使用的PDGF-B。 Selective Genetics, Inc.生產(chǎn)這種&i病毒載體的適合實例，名稱為 AdPDGF-B/GAM。另一適合的組合將本發(fā)明的用途、方法或藥物與PDGF-BB聯(lián)合 4吏用?？梢栽谶@種組合中采用的PDGF-BB的實例可購得，名稱為還可使用本發(fā)明用途、方法或藥物與細胞因子抑制劑的組合來促 進上皮再生。這種組合例如可用于促進響應(yīng)損傷的上皮再生，或治療 在腸易激病(IBD)或克羅恩病中發(fā)生的上皮損傷。這種抑制劑的適合實例為Semapimod (CNI-1493),它是合成脒基腙MAPK抑制劑，由 Picower Institute for Medical Research生產(chǎn)?；蛘呋蛄硗獾?，可聯(lián)合提供本發(fā)明的試劑與能夠抑制蛋白酶活性 的化合物?？筛鶕?jù)廣謙抑制活性或選擇性抑制上皮損傷部位存在的蛋 白酶(或蛋白酶家族)的能力來選擇蛋白酶抑制劑。被抑制的蛋白酶可 以包括中性白細胞彈性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、纖維蛋白溶酶原激 活劑(例如尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑或組織纖維蛋白溶酶原激活 劑)、纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶、furin和諸如ADAM或ADAM-TS 的"解聚素(disintegrin)和金屬蛋白酶"家族的成員。適合的蛋白酶抑 制劑可以包括肽、蛋白或小分子抑制劑。應(yīng)了解，TGF-|S3，其片段、書f生物和變體，、以及能增加 生物活性的試劑可代表待給予的優(yōu)選試劑，所述給予通過涉及細胞表 達編碼這些分子的核酸序列的技術(shù)。這些細胞表達方法特別適于在其 中長時間需要多肽、衍生物和類似物的療效的醫(yī)學應(yīng)用，例如，期望 在一段時間內(nèi)增加有缺陷上皮再生響應(yīng)的情況。對相關(guān)損傷上皮組織給予本發(fā)明試劑的很多公知方法具有不足之 處，在于可能難以在甚至幾天的過程中在上皮損傷部位保持試劑的水 平，因為很多適合的試劑在體內(nèi)可能具有短的半衰期。試劑半衰期短 可能有很多原因，包括(i) 蛋白酶等的降解。(ii) 被結(jié)合蛋白清除。(iii) 諸如decorin和纖連蛋白的胞外基質(zhì)分子的結(jié)合和對試劑活 性的抑制。此外，用于上皮損傷愈合部位治療的試劑需要以適合的載體給藥， 且通常以包含活性試劑和載體的組合物提供。如下文進一步所速，這 些載體優(yōu)選非炎性的、生物相容的、可生物分解的，并且必須不能降 解該試劑或使該試劑失活(在貯存或應(yīng)用中)。然而，可能經(jīng)常難以提 供用于向待治療組織給藥的滿意載體。能夠避免或減輕這些問題的便利方法是通過基因治療方法在上皮 損傷部位提供治療有效量的本發(fā)明試劑。本發(fā)明第五方面提供用于基因治療技術(shù)的遞送體系，所述遞送體系包含編碼本發(fā)明試劑的DNA分子，所述DNA分子能夠被轉(zhuǎn)錄并使 得所選擇的試劑表達。本發(fā)明第六方面提供上文所定義的遞送體系在制備用于促進上皮 再生的藥物中的用途。本發(fā)明第七方面提供促進上皮再生的方法，該方法包括給予需要 治療的患者治療有效量的本發(fā)明第五方面所定義的遞送體系。由于遺傳密碼的簡并性，很明顯，編碼適合用于本發(fā)明的試劑的 核酸序列可以不同或改變而基本上不影響其編碼的產(chǎn)物的序列，以提 供其功能性變體。如上所述，適合用于本發(fā)明的試劑必須保留TGF-/33 的上皮再生促進活性。編碼TGF-j33變體的適合核芬酸包括通過序列內(nèi)編碼相同氨基酸 的不同密碼子的替代而改變序列的核苷酸，因此產(chǎn)生沉默變化。其他體通過編碼具有與被替代氨基酸具有相似生物物理特性的側(cè)鏈的氨 基酸的不同密碼子替代而被改變的序列，以產(chǎn)生保守變化。例如，小 的非極性疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈 氨酸、脯氨酸和曱硫氨酸。大的非極性疏水性氨基酸包括苯丙氨酸、 色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、 天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電的(堿性)氨基酸包括賴氨酸、精氨酸和 組氨酸。帶負電的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。相比最常規(guī)遞送體系可能達到的，本發(fā)明的遞送體系非常適合在 更長時間中在上皮損傷部位維持本發(fā)明試劑的水平。位于上皮損傷部 位的、經(jīng)本發(fā)明第五方面公開的DNA分子轉(zhuǎn)化的細胞可持續(xù)表達適 合促進上皮再生的本發(fā)明試劑。因此，即使本發(fā)明試劑的體內(nèi)半衰期 很短，治療有效量的試劑也可從治療組織持續(xù)表達。而且，可以采用本發(fā)明遞送體系提供DNA分子(由此提供本發(fā)明 試劑)而不需要使用例如與上皮損傷部位接觸的軟膏劑或霜劑所必需 的常規(guī)藥物載體。本發(fā)明遞送體系使得DNA分子能被表達(當對患者給予遞送體系時)以產(chǎn)生直接或間接地具有促進上皮再生活性的本發(fā)明試劑。"直接" 指基因表達產(chǎn)物本身具有促進上皮再生的必需活性。"間接"指基因表 達產(chǎn)物經(jīng)過或介導(dǎo)(例如作為酶)至少另 一 步反應(yīng)以提供有效促進上皮 再生的活性試劑。DNA分子可包含在適合的載體中以形成重組載體。載體例如可以 是質(zhì)粒、粘?；蚴删w。在用于使用DNA分子轉(zhuǎn)化細胞的本發(fā)明遞 送體系中這些重組載體非常有用。重組載體還可以包括其他功能元件。例如，重組載體可^^皮設(shè)計為 使得載體在細胞核中自主復(fù)制。這種情況下，誘導(dǎo)DNA復(fù)制的元件 對重組載體是必需的?；蛘?，重組載體可被設(shè)計為使得載體和重組 DNA分子整合到細胞基因組中。這種情況下，偏好定向整合的DNA 序列(例如同源重組)是所期望的。重組載體還可以具有編碼克隆過程 中可以用作選擇標記的基因的DNA。重組載體還可包括啟動子或調(diào)節(jié)基因以根據(jù)需要控制基因表達。DNA分子可以(但不是必需)被整合到治療對象細胞的DNA中。 可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)化未分化細胞導(dǎo)致產(chǎn)生遺傳上修飾的子細胞。這種情況下， 可能需要在對象中調(diào)控表達，例如用特定的轉(zhuǎn)錄因子、基因活化物或 更優(yōu)選地使用誘導(dǎo)型啟動子，其響應(yīng)在上皮損傷部位特異存在的信號 轉(zhuǎn)錄基因?；蛘?，遞送體系可被設(shè)計為偏愛不穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)化治療對 象中的已分化細胞。這種情況下，調(diào)控表達不那么重要，因為當轉(zhuǎn)化 的細胞死亡或停止表達蛋白時(理想地，當上皮損傷部位有效再生時)， DNA分子的表達會停止。遞送體系可以對個體提供DNA分子而不用將其整合到載體中。 例如，DNA分子可以被并入脂質(zhì)體或病毒顆粒中?；蛘?，可通過適合 的方法例如直接胞吞攝取將"棵露的"DNA分子插入到對象細胞中。可通過轉(zhuǎn)染、感染、顯微注射、細胞融合、原生質(zhì)體融合或微彈 轟擊將DNA分子轉(zhuǎn)移到對象細胞中。例如，轉(zhuǎn)移可以通過采用包被 金顆粒的微彈轟擊、含有DNA分子的脂質(zhì)體、病毒載體(例如腺病毒)、 以及通過局部應(yīng)用或通過注射將質(zhì)粒DNA直接應(yīng)用于上皮損傷部位 而提供直接DNA攝取(例如胞吞)的方式。DNA分子表達的本發(fā)明試劑可直接或間接地上調(diào)TGF-^表達和/ 或活性，由此促進上皮再生。通過誘導(dǎo)本發(fā)明試劑的增加的細胞表達，其然后可以促進上皮再生，可以實踐本發(fā)明方法?？梢酝ㄟ^增加試劑的天然表達(例如天然表 達諸如TGF-/33的天然存在試劑)、或通過誘導(dǎo)試劑的非天然表達(例如 通過不天然表達TGF-/53的細胞誘導(dǎo)TGF-/53的表達)或通過誘導(dǎo)試劑的 過表達來實現(xiàn)本發(fā)明試劑的這種治療性表達。本發(fā)明試劑的細胞表達，天然的或是非天然的表達，可通過上皮 細胞，其可以是損傷區(qū)邊緣現(xiàn)有的上皮細胞，或者該表達可以通過治 療性引入損傷區(qū)的上皮細胞(例如培養(yǎng)的內(nèi)源或外源上皮細胞)?；蛘?， 可以通過與待促進的上皮再生鄰近或接觸的細胞表達所述試劑來實現(xiàn) 本發(fā)明試劑的細胞表達。例如，在期望促進上皮再生的情況下，可通 過位于損傷上皮之下或周圍的皮膚中的細胞來表達本發(fā)明試劑。應(yīng)了解，可離體操作待治療性引入以促進上皮再生的細胞使得它 們以提高的水平表達本發(fā)明試劑，隨后將該細胞引入損傷區(qū)。如上所 述，這些細胞本身可以是上皮細胞，或者可以是位置上足夠接近損傷 上皮的細胞，以至于該細胞表達的試劑能促進期望的上皮再生。該細 胞可優(yōu)選為用于制備或制造人工皮膚或皮膚替代物的離體培養(yǎng)的細 胞。該細胞可更優(yōu)選為自體細胞，盡管應(yīng)了解可以采用任何適合的細 胞。因此本發(fā)明第八方面提供藥物，其包括被誘導(dǎo)表達本發(fā)明試劑的 任何相關(guān)細胞類型(例如上皮細胞、巨噬細胞、單核細胞、成纖維細胞、 內(nèi)皮細月包或干細月包)?？赏ㄟ^用外部信號影響細胞的方法，或通過將核酸包括到細胞中 引起本發(fā)明第四至第六方面的試劑表達的方法誘導(dǎo)本發(fā)明試劑的細胞 表達。下文非限定性實施例1和2進一步描述了本發(fā)明。實施例1說明 了人全厚皮膚創(chuàng)傷中TGF-A促進上皮再生，實施例2說明了 TGF-& 能夠在人部分厚皮膚創(chuàng)傷中促進上皮再生。實施例涉及附圖，其中

圖1，說明i) 創(chuàng)傷后第3天和第7天拍的照片，顯示了上皮再生過程中人 全厚皮膚創(chuàng)傷的宏觀表觀。ii) 相同時間點的顯微照片，顯示了上皮再生過程中損傷部位的 組織結(jié)構(gòu)。圖1顯示了用50 ng/100 mL TGF/33、安慰劑或標準療法治療的創(chuàng) 傷的宏觀和組織學圖像的實例。顯示創(chuàng)傷后3天和7天的結(jié)果。具體地，圖A和B分別顯示創(chuàng)傷后第3天TGF-i83治療創(chuàng)傷的宏 觀和微觀表觀。組織學圖像分析顯示了 54%的上皮再形成。圖C和D分別顯示創(chuàng)傷后第3天安慰劑治療創(chuàng)傷的宏觀和微觀表 觀。組織學圖像分析顯示了 20%的上皮再形成。圖E和F分別顯示創(chuàng)傷后第3天用標準療法治療創(chuàng)傷的宏觀和微 觀表觀。組織學圖像分析顯示了 19%的上皮再形成。圖G和H分別顯示創(chuàng)傷后第7天TGF-j83治療創(chuàng)傷的宏觀和微觀 表觀。組織學圖像分析顯示了 100%的上皮再形成。圖I和J分別顯示創(chuàng)傷后第7天安慰劑治療創(chuàng)傷的宏觀和微觀表 觀。組織學圖像分析顯示了 100%的上皮再形成。圖K和L分別顯示創(chuàng)傷后第7天標準療法治療創(chuàng)傷的宏觀和微觀 表觀。組織學圖像分析顯示了 100%的上皮再形成。圖2顯示了創(chuàng)傷后第3天和第7天TGF-Z53治療和未治療/安慰劑 治療的創(chuàng)傷中獲得的上皮再形成平均百分比的比較。顯示的結(jié)果為用 50 ng/100 jiiLTGF/33、安慰劑或標準療法治療創(chuàng)傷的創(chuàng)傷后第3天和第 7天時的上皮再形成。通過組織學切片的圖像分析得出結(jié)果。*表示用 不配對t檢驗評價的顯著結(jié)果(p-0.05)。圖3顯示了說明創(chuàng)傷后21天內(nèi)部分厚皮膚創(chuàng)傷的宏觀表觀的照 片，并且由此顯示上皮再生進展。圖A-I分別顯示了第O、 1、 2、 3、 4、 7、 8、 15和21天時安慰劑 治療的創(chuàng)傷。相反，圖J-R分別顯示了第0、 1、 2、 3、 4、 7、 8、 15 和21天時TGF-/53治療的創(chuàng)傷。實施例1TGF-i33對人全厚皮膚創(chuàng)傷上皮再形成的作用進行了經(jīng)當?shù)貍惱砦瘑T會批準的I期試驗，包括上皮損傷情況下 劑量增加的首次人體(FIM)試驗以確定皮內(nèi)注射給予TGF-&的最大耐 受劑量(MTD)。用雙盲法、對照的安慰劑(載體)和標準療法、隨機化、 平行組研究在18-45歲健康男性白種人志愿受試者中研究反復(fù)的、增 加濃度的皮內(nèi)TGF-^的臨床安全性、耐受性、全身藥代動力學和局部 藥效學(研究和實驗方案參考號RN1001-319-1001-001)。研究設(shè)計了共72個受試者，TGF-/33 (和完全匹配安慰劑)的設(shè)計劑 量為50ng/100pL、 100ng/100 juL、 500 ng/100 jiiL、 1000 ng/100/aL、 10 jiig/100 ]LiL和100 /xg/100 /xL。研究數(shù)據(jù)被錄入于2003年12月8日鎖定的數(shù)據(jù)庫(Regulatory compliant database),并且于2003年12月19日公開研究(即發(fā)布隨機 編碼)。研究中所有受試者的每個手臂都接受各兩處全厚皮膚3 mm鉆取 活組織檢查和對他們所有創(chuàng)傷的標準治療。標準治療提供了所有情況 下濕創(chuàng)傷愈合的最佳療法。對每個受試者臂上的創(chuàng)傷對除進行如此處 理之外，創(chuàng)傷接受TGF-jS3對TGF-iS3安慰劑、TGF-/33對空白(標示為標 準療法)或TGF-i33安慰劑對空白(標準療法)。此項研究的設(shè)計使得創(chuàng)傷 治療效果既可在受試者內(nèi)又可在受試者間進行比較，即個體作為他們 自己的對照。研究中使用的TGF-]83原料藥根據(jù)GMP生產(chǎn)，包含酸和醇作為賦 形劑。連續(xù)稀釋這種物質(zhì)以提供用于研究中皮內(nèi)注射的載藥無菌注射 器(也根據(jù)GMP生產(chǎn))。酸和醇賦形劑的濃度根據(jù)從原料藥連續(xù)稀釋到 所需TGF-Z33注射劑量的過程而不同。由于不同濃度的這些賦形劑對安 全性/耐受性和對人體中愈合作用的影響是未知的，也以相同方式根據(jù) GMP制備完全匹配的安慰劑(即，安慰劑包含同等濃度的賦形劑，但 不含TGF-^蛋白)。這也使得能夠比較完全匹配的安慰劑和單獨的標 準療法，以證明賦形劑本身對愈合是否有任何副作用。研究設(shè)計使得每個劑量組中的9名受試者在每個臂上具有兩處如上所述已用TGF-iS3、安慰劑或標準療法治療的鉆取活組織4企查。對于 每名受試者的手臂，兩處活組織檢查部位在內(nèi)面做了標記，并在局部 麻醉下將TGF-j83、安慰劑或空白(標準療法)皮內(nèi)注射到該部位。然后 /人每個標記部位取下3 mm全厚皮膚鉆取活組織4企查。創(chuàng)傷后的第1 天再次如上用相同處理治療該部位，即在局部麻醉下用TGF-/33、安慰 劑或空白(標準療法)。隨后在創(chuàng)傷后第3天或第7天取下創(chuàng)傷用于組 織學檢查，以分析在起始鉆取活組織檢查后第3天和第7天時的創(chuàng)傷 愈合的治療效果。隨訪受試者。在整個研究期間收集安全性和耐受性 數(shù)據(jù)。取下創(chuàng)傷，組織學加工置于石蠟塊中，進行組織切片然后采用圖 像分析法分析上皮再形成。以這種方式每劑量組產(chǎn)生共36處創(chuàng)傷，其 中16處創(chuàng)傷用TGF-Z 3治療、IO處創(chuàng)傷用安慰劑治療、IO處創(chuàng)傷用標 準療法治療。這產(chǎn)生了如下的在創(chuàng)傷后兩個不同時間點的每種治療的 創(chuàng)傷數(shù)用于組織學分析在創(chuàng)傷后第3天取下8處TGF-/33治療的創(chuàng)傷、5處安慰劑治療的 創(chuàng)傷和5處標準療法治療的創(chuàng)傷。在創(chuàng)傷后第7天取下8處TGF-j83治療的創(chuàng)傷、5處安慰劑治療的 創(chuàng)傷和5處標準療法治療的創(chuàng)傷。上皮損傷部位上皮再形成的百分比根據(jù)如下公式計算上皮再形成％ =(全部創(chuàng)傷直徑-非上皮形成的創(chuàng)傷直徑)x100/全部創(chuàng)傷直徑 結(jié)果加速人全厚皮膚創(chuàng)傷的上皮再形成。圖1顯示了人全厚皮膚創(chuàng)傷的表皮再生進程，其包括iii) 創(chuàng)傷后第3天和第7天拍的照片，顯示了上皮再生過程中全 厚皮膚創(chuàng)傷的宏觀表觀；和iv) 相同時間點的顯微照片，顯示了上皮再生過程中損傷部位的 組織學。組織學切片分析表明在創(chuàng)傷后兩個時間點在安慰劑和標準療法對照治療的創(chuàng)傷中均產(chǎn)生同等的上皮再形成，且因此將這些組組合與TGF-ft治療的創(chuàng)傷進行比較。從圖l可看出TGF-Z 3治療全厚皮膚創(chuàng)傷能促進上皮再生，使得表 皮重建早于未治療的或安慰劑治療的創(chuàng)傷。圖2顯示了實施例1的結(jié)果，其比較了在創(chuàng)傷后第3天和第7天 時TGF-&治療的和未治療/安慰劑治療的創(chuàng)傷中上皮再形成的平均百 分比。圖2清楚地說明了與對照創(chuàng)傷中產(chǎn)生的上皮再形成相比，濃度為 50ng/100^L的TGF-)83的治療顯著加速了創(chuàng)傷上皮再形成。在接受高 達(500 ng/100 /aL) 的個體中也觀察到了相對對照創(chuàng)傷，藥物治療創(chuàng)傷中上皮再生的促進。實施例2對人部分厚皮膚創(chuàng)傷/皮膚移植物提供區(qū)上皮再形成的作用經(jīng)當?shù)貍惱砦瘑T會批準進行了初步試驗(非盲法)，以在兩名18-45 歲的健康男性白種人志愿受試者中研究向中厚皮片提供區(qū)皮內(nèi)和局部 應(yīng)用TGF-iS3的作用。采用的TGF-i83濃度為50 ng/100 /iL，并將獲得 的上皮再生速度與同等濃度的完全匹配的安慰劑相比較。 和安慰劑都如上所述根據(jù)GMP制備。首先在下背中線的每一邊確定和標記出提供區(qū)，每處為1.5x2 cm， 然后用含有1/200,000腎上腺素的局部麻醉劑浸潤。隨后每邊接受皮內(nèi) 注射^f吏得一邊接受劑量為50 ng/cm、々TGF-/53，另一邊接受完全匹配 的安慰劑。隨后受試者俯臥休息30分鐘，然后從每邊標記部位收集約 0.55 mm厚的中厚皮片，輕微按壓進行止血。收集移植物后立即對創(chuàng) 傷局部使用TGF-仏或者安慰劑，然后包扎創(chuàng)傷后受試者離開。第二天 受試者返回再一次局部使用TGF-^或安慰劑，使得在所有階段每處創(chuàng) 傷都接受相同的治療，即三次施用TGF-Z 3或三次施用安慰劑。隨后在 兩周內(nèi)每天觀察受試者，然后在第21天觀察受試者，之后隨訪。結(jié)果加速人部分厚皮膚創(chuàng)傷/皮膚移植物提供區(qū)的上皮再形成。使用損傷部位照片評估的宏觀分析表明TGF-iS3顯著加快了上皮 再生的促進作用，與安慰劑治療對照中的速度相比，提高了部分厚皮 片提供區(qū)上皮再形成的速度，直到創(chuàng)傷后第8天。圖3顯示了說明宏觀表觀的照片，由此顯示了創(chuàng)傷開始后21天內(nèi) 部分厚皮膚創(chuàng)傷中上皮再生的進展。圖3中用星號(*)標記了顯示上皮 再生促進作用的照片?？捎^察到創(chuàng)傷后第15天和第21天TGF-j33治療的和未治療/安慰 劑治療的創(chuàng)傷之間的差異在宏觀上變小。該作用被以下事實解釋 TGF-j33治療部位在第8天或之前已是上皮再形成完全的，而安慰劑治 療部位僅在第15天左右達到同等程度的上皮再形成。結(jié)論(實施例1和2)上述結(jié)果令人驚訝地證實了 TGF-/3家族的特定成員TGF-j83能促 進上皮再生。該發(fā)現(xiàn)與技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)所預(yù)期的直接相反，因 為以前的報道暗示了 TGF-]3家族成員抑制皮膚創(chuàng)傷中的表皮再生，且 TGF-&亞型是該過程的最有效的抑制劑。在全厚皮膚創(chuàng)傷和部分厚皮 膚創(chuàng)傷中(其例如可用作皮膚移植物提供區(qū))均實現(xiàn)了由TGF-Z33治療引 起的上皮再生促進作用。在使用劑量直到50 ng/100 juL活性試劑的 TGF-j83治療中都觀察到了在人中的療效。附錄 制劑在下述標題下詳細提供了臨床試驗中為確定具有TGF-/33活性的 試劑促進上皮再生的能力所采用的制劑。研究中使用的藥品以濃度為9.1 mg/mL的20 mM醋酸和 20%異丙醇溶液提供。連續(xù)稀釋該物質(zhì)以生產(chǎn)含有典型數(shù)據(jù)中所述濃 度的TGF-ft的注射器。技術(shù)人員應(yīng)了解，不考慮用于生成最終溶液的 其他稀釋劑，連續(xù)稀釋會保持痕量的醋酸和異丙醇。爿厶必承話逸織^^查卩全岸發(fā)炎^/務(wù)J^理摩采^的斜浙對于鉆取活組織檢查/全厚皮膚創(chuàng)傷研究，將藥品稀釋在含有5% w/v甘露醇的PBS中，并用醋酸調(diào)節(jié)到pH 3.8。發(fā)現(xiàn)該制劑有效促進 上皮再生。作為對上述基于甘露醇的制劑的其它選擇，還制備了基于麥芽糖 的制劑(下文更全面地描述)。驚奇地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明試劑與麥芽糖組合的 這種制劑顯著減少與注射組合物有關(guān)的疼痛。發(fā)明者進行的研究臨床 上證實了存在糖的情況下尤其是存在等張濃度麥芽糖的情況下配制的 本發(fā)明試劑減輕了鉆取活組織檢查研究中與注射基于甘露醇的制劑有 關(guān)的疼痛?；邴溠刻堑闹苿┖突诟事洞嫉闹苿┑男ЯΦ捏w外分析顯示了 含有與麥芽糖組合的本發(fā)明試劑的組合物的其它驚人優(yōu)勢。采用 ELISA測定法和Mink肺上皮細胞測定法對PBS/甘露醇制劑和0.25 M 麥芽糖制劑進行比較的研究表明麥芽糖制劑使得TGF-]33活性增加了 約4倍。爿2. ^岸乂^炎供且治^摩《^的浙浙對于此項研究，TGF-Z33被配制在0.25 M麥芽糖中(即，每升用于 注射的水中含有90g麥芽糖；相當于9。/。(w/v)麥芽糖注射水溶液)。 皮內(nèi)和局部應(yīng)用該制劑以促進上皮再生。參考文獻Tomlinson A, Ferguson MW. Wound healing: a model of dermal wound repair (創(chuàng)傷愈合皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的模型).Methods Mol Biol 2003; 225: 249-260.Davidson JM， Nanney LB， Broadley KN， Whitsett JS, Aquino AM, Beccaro M, Rastrelli A. Hyaluronate derivatives and their application to wound healing: preliminary observations (透明質(zhì)酸鹽書亍生物及其在創(chuàng) 傷愈合中的應(yīng)用初步觀察).Clin Mater. 1991; 8(l-2):171-7.Paddock BDST, Schultz GS, Mast BA. Methods in reepithelialization. A porcine model of partial-thickness wounds (上皮再形成方法。部分厚 皮膚創(chuàng)傷的豬模型).Methods Mol Med. 2003; 78:17-36.Rakel BA, Bermel MA， Abbott LI， Baumler SK， Burger MR, Dawson CJ， Heinle JA， Ocheltree IM. Split-thickness skin graft donor site care: a quantitative synthesis of the research (中厚皮片提供區(qū)治療研究的定量 合成).Appl Nurs Res. 1998 Nov; 11 (4); 174-82.
權(quán)利要求
1.具有TGF-β3活性的試劑在制備用于促進上皮再生的藥物中的用途。
2. 如權(quán)利要求l所述的用途，其中所述試劑為TGF-i83。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述試劑為TGF-(83的片段、 書亍生物或變體。
4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述試劑為能夠促進和/或 模擬TGF-j33生物活性的物質(zhì)。
5. 如權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述上皮 再生位于急性創(chuàng)傷部位。
6. 如權(quán)利要求1至5中任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述上皮 再生發(fā)生在年輕和/或健康患者中。
7. 如權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的用途，其中待促進所 述上皮再生的上皮為復(fù)層扁平上皮。
8. 如權(quán)利要求7所述的用途，其中所述上皮為表皮。
9. 如權(quán)利要求7所述的用途，其中所述上皮為角膜上皮。
10. 如權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述上 皮為呼吸上皮。
11. 如權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述上皮為腹部、胸部或骨盆腔的襯層上皮。
12. 如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述藥物 用于在損傷后促進上皮再生。
13. 如權(quán)利要求10所述的用途，其中所述藥物用于在手術(shù)后促 進上皮再生。
14. 如權(quán)利要求12所述的用途，其中所述手術(shù)包括上皮移植術(shù)。
15. 如權(quán)利要求14所述的用途，其中所述手術(shù)包括i) 上皮移植物摘除術(shù)；ii) 任選地，上皮移植物的成網(wǎng)；和iii) 將所述移植物用于接受區(qū)。
16. 如權(quán)利要求14所述的用途，其中所述藥物用于對所述移植 物提供區(qū)給藥。
17. 如權(quán)利要求14所述的用途，其中所述藥物用于對所述移植 物接受區(qū)給藥。
18. 如權(quán)利要求14所述的用途，其中所述藥物用于對移植物給藥。
19. 如權(quán)利要求12至18中任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述 手術(shù)包括皮膚移植。
20. 如權(quán)利要求19所述的用途，其中所述皮膚移植物為全厚皮片。
21. 如權(quán)利要求19所述的用途，其中所述皮膚移植物為部分厚 皮片。
22. 如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述藥物 用于在燒傷損傷后促進上皮再生。
23. 如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述藥物 用于局部應(yīng)用。
24. 如權(quán)利要求1至23中任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述 藥物用于局部注射。
25. 如權(quán)利要求1至232中任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述 藥物為霜劑或軟膏劑。
26. 如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述促進 上皮再生為預(yù)防性促進。
27. 如權(quán)利要求1至5或7至26中任一權(quán)利要求所述的用途， 用于制備促進減弱的、抑制的、延遲的或有缺陷的上皮再生的藥物。
28. 如權(quán)利要求1至26中任一權(quán)利要求所述的用途，用于制備 力o速正常上皮再生的藥物。
29. 如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的用途，用于制備促進 老年人上皮再生的藥物。
30. 如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的用途，其中在存在麥 芽糖的情況下配制所述試劑。
31. 如權(quán)利要求30所述的用途，其中所述麥芽糖的濃度為0.1M 至0.4M麥芽糖。
32. 如權(quán)利要求30所述的用途，其中所述麥芽糖的濃度為0.25 M 麥芽糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及TGF-β₃或具有TGF-β₃活性的試劑促進上皮再生的用途。提供制備藥物的方法和促進上皮再生的方法。具體地，本發(fā)明的藥物和治療方法適用于在健康患者中和/或急性創(chuàng)傷中促進上皮再生。
文檔編號A61L27/54GK101252949SQ200680031912
公開日2008年8月27日 申請日期2006年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月12日
發(fā)明者修·萊弗蒂, 尼克·奧克萊斯頓, 沙倫·奧凱恩, 馬克·弗格森 申請人:瑞諾弗有限責任公司