專利名稱：：用于流感診斷和治療的方法和組合物的制作方法用于流感診斷和治療的方法和組合物相關(guān)申請本申請要求美國臨時申請60/696，221(2005年7月1日提交)、美國臨時申請60/726,377(2005年10月13日提交)、60/765,292(2006年2月2日提交)和60/792,274(2006年4月14日提交)的優(yōu)先權(quán)，上述各申請均在此完整引入作為參考。
背景技術(shù)：
：流行性病毒感染造成世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的喪失生命并引起人類疾病，范圍從普通感冒到危及生命的流感、西尼羅河病毒(WestNile)和HIV感染。及時的檢測、診斷和治療是在流行性、廣泛流行性和動物流行性背景中限制疾病傳播的關(guān)鍵?？焖俸Y查和診斷方法對減少患者患病和群體風(fēng)險是特別有用。同樣地，快速抑制病毒組裝和增殖的治療劑特別適用于治療方案。最近，流感A已經(jīng)顯示成為對人群潛在的嚴(yán)重風(fēng)險。禽類株已經(jīng)交叉到人類，越來越多的證據(jù)表明人和人之間的傳播很快就可能發(fā)生、禽流感株對人群影響的實例是最近出現(xiàn)的超強毒禽流感株H5N1(鳥流感)，其中大約50%的感染個體(42人)死亡，在中國、印度尼西亞和越南由于屠宰上百萬家禽導(dǎo)致食物短缺。跟蹤流行的可能性，世界衛(wèi)生組織在2005年7月考慮將全球威脅水平提高到4或者5(共6個級別)。一位輿論領(lǐng)袖(叩inionleader)最近在媒體上表示，對禽流感的"檢測、監(jiān)督、預(yù)防和治療"...(是)..."與時間的競賽"1。因為很少從人類分離出禽類株，并且人類中的死亡率很高，看來在全世界人群中實際上不存在免疫力。因此，存在世界范圍大流行的可能。對比來說，在1918年全球流感流行造成大約2-4千萬人死亡。今天隨著人口密度的增加，可能會有更高的死亡率。在病毒安全參考實驗室中，例如滿足防護級別4(ContainmentGroup4)病原體的要求，用于流感A感染的檢測和確認(rèn)的病毒學(xué)試驗方法是耗時耗力并且高風(fēng)險的，目卩，包括在含胚雞蛋中的病毒分離4-7天；從死亡或者瀕死胚胎中收集尿囊液；在紅細胞凝集和紅細胞凝集抑制試驗、免疫擴散試驗中檢測上述液體；禾P，利用專fl制備的單一特異性抗血清，在過夜免疫擴散分析中通過紅細胞凝集,和神經(jīng)氨酸苷酶，對液體中的病毒進行最終分型?，F(xiàn)有的分型包括鑒定16個不同的可能的病毒紅細胞凝集素蛋白的每一種與9個不同的可能的病毒神經(jīng)氨酸苷酶蛋白的組合。令人遺憾的是，因為只有很少的流感A致病株在當(dāng)時危及經(jīng)濟和健康，這種耗時的工作很多可能是不需要的和浪費的?，F(xiàn)有的流感抗原的快速免疫診斷檢測，像"BinaxNOWFIuAandFluBTM"(Binax,Inc.,Porltand，ME)，"DirectigenFluA+BTM"(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)，"FluOIATM"(BiostarInc.,Boulder,CO)，"QuickVueTM"(Quidel,SandDiego,CA)，"InfluABQuick"(DenkaSiekenCo.，Ltd.,Japan)禾口"XpectFluA&B"(RemelInc.,Le證a,KS)，據(jù)報道能夠檢測流感A或者區(qū)別流感A和B，但重要地是，不能區(qū)別不同的流感A亞型或者流感A的致病和非致病株。該檢測形式的復(fù)雜性可能要求專業(yè)訓(xùn)練。此外，通常需要大量的病毒顆粒以獲得陽性試驗結(jié)果，這限制了它們在病毒排放水平最高時的短暫窗口期的使用。分析敏感度也是可變的，在某些分析中產(chǎn)生高達20%假陰性試驗結(jié)果，成為當(dāng)前的重要關(guān)注36(例如，參見"WHOrecommendationsontheuseofrapidtestingforinfluenzadiagnosis(WHO推薦使用流感診斷的快速檢測)"，2005年7月)。最近引入基于逆轉(zhuǎn)錄PCR的診斷(RT-PCR)用于確認(rèn)流感A病毒，使檢測能力產(chǎn)生重要進步36，但是費力，且需要高度受訓(xùn)的人員，使得當(dāng)場(on-site)和野外檢測(field-testing)困難。因為反轉(zhuǎn)錄酶的相對低效，有效檢測病毒RNA可能需要大量病毒(例如，104病毒顆粒)和多至20個引物。盡管存在這些顯著的障礙，但在美國、加拿大和香港的12個不同的參與檢測實驗室之間，最近記載了參考實驗室中高水平熟練的RT-PCR流感A檢測36。利用RT-PCR和HA引物，Lee等人"描述了H5和H7亞型病毒間的定量鑒別。Munch等人"報告了利用NP引物，在RT-PCR中，相似的可能差異特異性。令人遺憾的是，RT-PCR不易于適合流行背景中對象的高通量篩査，或者在農(nóng)業(yè)或者醫(yī)護點(point-of-care)背景中的現(xiàn)場使用。此外，新流感株的復(fù)雜性、多樣性和快速出現(xiàn)使高風(fēng)險株的診斷困難，因此快速反應(yīng)在現(xiàn)在幾乎是不可能的。對流行病學(xué)家來說，高突變率和基因重配造成的多樣性，使得難以預(yù)期新品系在何處出現(xiàn)和及時做出反應(yīng)引入新的PCR診斷引物。因而，(目前)流感的多樣性表明了多重PCR方法的必要性。禽流感病毒(H5N1)被認(rèn)為是通過水生野禽中流感病毒的突變和部分重配進化的2'3。"患病"鳥類中的高致病性疾病可以不同，從疾病的明顯病征很少的突然死亡到伴有呼吸癥狀、過度流淚、竇炎、頭部水腫、無羽表皮的發(fā)紺和腹瀉的更具特征的疾病，即，OIE在其健康指導(dǎo)中采用的"患病"的診斷病征(ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals(陸生動物診斷分析和疫苗手冊)，第五版，2004，WorldOrganizationforAnimalHealth(世界動物衛(wèi)生組織〉)。在被感染的鳥類中，流感A病毒僅在2-3天內(nèi)就排放4，5?？紤]到人類中的高死亡率，快速檢測對隔離感染的禽類和人類對象和保護人群是必要的。在本領(lǐng)域，禽流感(birdflu)的人類病例歷史上發(fā)生于東南亞地區(qū)，那里缺乏復(fù)雜的診斷分析設(shè)備、病毒安全參考BL4實驗室和方法的順暢通路。因此，在個體患者水平評估群體風(fēng)險現(xiàn)在是非常成問題的。在其他目標(biāo)中，本發(fā)明提供這些問題的解決方案。支持農(nóng)業(yè)和公眾健康所需的快速診斷分析，被證明是挑戰(zhàn)性的一即，對于抗病毒宿主應(yīng)答(抗體)的血清學(xué)檢測或者樣本中病毒蛋白(抗原)的鑒定。流感A亞型的檢測也是復(fù)雜的，因為(i)流行病學(xué)的范圍和公眾健康的需要，即，對于環(huán)境樣本中和感染家畜，(例如豬流感)，家禽(例如禽流感(avianflu))和人類(例如禽流感(birdflu))中病毒檢測的潛在需要；和，(ii)可能檢驗的樣品范圍廣，可能包括血清，鼻咽、咽喉含漱、鼻或者喉部的樣本(人類)；和，泄殖腔、糞便和氣管的樣本(鳥類)。因為高危病毒傾向于快速傳播，速度極為重要。高親合力的特異性結(jié)合試劑無疑是關(guān)鍵和必需的。在其他目標(biāo)中，本發(fā)明解決這些關(guān)鍵需求。通過紅細胞凝集-抑制(HI)的經(jīng)典流感血清試驗(用于抗體)相對簡單，但在農(nóng)業(yè)實踐中這些試驗對于免疫或者自然感染后檢測禽抗體是相對不敏感的，因為血清抗體在感染后傾向于快速下降。在最優(yōu)條件下，例如Xu等人"最近描述了一種膠乳凝集試驗，g卩，利用完全熱滅活的疫苗病毒和來自免疫鳥類的血清。據(jù)報道后一HI-試驗具有88%的靈敏度(12%假陰性)和98%的特異性，在這種情況下，對這種危險病毒病原體的農(nóng)業(yè)或者公共衛(wèi)生檢測來說假陰性率太高。同樣地，利用中國禽類場所的樣品，最近Jin等人4描述了重組流感NP抗原在ELISA分析中的可能應(yīng)用。這些研究者注意到病毒排放從第2天開始，但抗病毒抗體的滴度在2周時最高。遺憾的是，在檢測被感染的動物之前后者的"滯后"在當(dāng)前世界范圍的危機中是無法接受的。展示進一步可能的復(fù)雜因素，后者研究中的數(shù)據(jù)顯示低劑量的病毒只產(chǎn)生非常低滴度的抗體，即，說明隱性感染可能檢測不到。流感即流感B常規(guī)診斷方法中的現(xiàn)有局限性在Steininger等人41發(fā)表的數(shù)據(jù)中有記錄。在后來的研究中，使用不同的試驗方法檢測標(biāo)準(zhǔn)A型流感儲存病毒制品；和，有下列發(fā)現(xiàn)即，基于酶的快速分析比常規(guī)病毒分離法檢測的靈敏度低大約1000倍；而常規(guī)病毒分離法又比RT-PCR的靈敏度低大約1000倍。盡管后者有靈敏度的總量限制，但ELISA仍然正確鑒別出62%的陽性樣本和88%取自小于5歲的流感B患者的樣本。作為差樣本對分析性能影響的實例，對商業(yè)可用的流感試驗分析其在檢測實驗性感染的志愿者的鼻咽樣本中病毒抗原的靈敏度。報道的結(jié)果表明，分析靈敏度對于Directigen流感分析43(BectonDickinson)來說大約是60%;禾卩，對流感光學(xué)免疫測定(FLUOIA;ThermoBioStar/Biota)44來說在48-100°/。范圍內(nèi)。重要的是，(不管后來的分析的明顯局限性)，Sharaia等人"報道了A型流感病毒感染的快速確認(rèn)(i)減少不相關(guān)的實驗室試驗，例如尿分析和白細胞檢驗，以及，(ii)抗生素在發(fā)燒嬰兒和幼兒中的不恰當(dāng)使用。因此，在臨床實踐中靈敏度相對較差的篩查分析仍然是有用的，因為該分析正確鑒別出那些需要額外隨診的患者。顯而易見，為了非參考實,室的使用，需要對用戶友善性、速度、分辨性和絕對定量靈敏度進行改進，艮P，即使用于常規(guī)流感檢測。同樣地，常規(guī)流感檢測對于提示如何獲得所需分析性能的方法沒有特別的幫助，所述檢測性能是檢測患者樣本中高危流感A株所需要的。H5N1和H7禽流感A病毒呈現(xiàn)的毒力因子和H9N2流感病毒動物流行病的傳播和它們與哺乳動物宿主因子的相互作用已經(jīng)被綜述5。在流感惡性禽類株編碼的蛋白中，NS1(非結(jié)構(gòu)蛋白-l)早期在感染細胞中表達，但與HA和NA不同，它與病毒粒子無關(guān)，只表達為胞內(nèi)蛋白。NS1由基因組片段8編碼，是增強病毒mRNA翻譯的病毒調(diào)節(jié)因子；干擾宿主細胞mRNA的成熟和轉(zhuǎn)運6;結(jié)合宿主mRNA的poly(A)尾；改變宿主細胞基因表達的內(nèi)在小干擾RNA(siRNA)控制7;預(yù)防抗病毒蛋白激酶R的ds-RNA誘導(dǎo)；抑制干擾素o//3(IFN-/]8)的抗病毒作用的誘導(dǎo)s和拮抗其抗病毒作用9'1Q;和，通過巨噬細胞"和樹突狀細胞12刺激促炎性細胞因子的產(chǎn)生。INF-o://3在先天性和獲得性免疫應(yīng)答以及發(fā)病機理中的作用已經(jīng)被綜述13。感染細胞中NS1蛋白的分布表明優(yōu)選核定位，即，在細胞質(zhì)、核糖體和多聚核糖體部分22-24的量較少。高毒力禽H5N1株的NS1蛋白在體外顯著抑制人細胞的干擾素應(yīng)答25。一些機理研究表明，NS1中羧基末端缺失可能減弱野生型A/Swine/Texas/4199-2/98(TX/98)病毒26以及馬流感病毒27的體內(nèi)毒力。有趣地是，缺失NS1基因的流感A似乎在干擾素-缺陷型細胞系中復(fù)制得最好28，向作者提示INF-a//3的NS1抑制可能是高效病毒增殖必需的。此外，據(jù)報道高毒力H5N1-NS1基因重重配到毒力較低的H1N1-A株中降低了雜交病毒的肺清除率，并還引起炎性細胞因子的水平升高29。Tumpey等人4()報道了檢測抗NS1抗體可能可用于區(qū)別已接種的和已感染的家禽，即，因為NS1只在感染細胞中表達，而不在滅活的梯度純化疫苗病毒中表達。令人遺憾的是，后來基于抗體的血清試驗方法遇到上面和HI試驗相同的普遍問題即，低靈敏度和不能在病毒排放和感染潛在傳播前檢測到病毒。利用H7N3株，Cattoli等人42報告評估了對來自實驗和自然感染火雞的氣管樣本中病毒檢測的計時、特異性和敏感性，即，抗原-捕獲ELISA，RT-PCR和實時RT-PCR，(即，后兩個試驗針對M基因)。在后來相對受控的實驗室條件下，早在感染后3-5天就可以特異性和高靈敏度良好地檢測病毒。他們總結(jié)出只要有足夠的檢測靈敏度，理論上應(yīng)該可能在感染第3-5天檢測到至少這種特定的禽類病毒和或許其他更高毒力的禽類株。因此，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域仍然明顯需要能夠檢測具體致病病毒株的改進的、廉價的、快速的、精確的和有鑒別力的方法，所述致病病毒最經(jīng)常涉及引起醫(yī)學(xué)上重大的疾病。還特別需要簡單的分析方法，其能夠在不發(fā)達國家、市場、診所、醫(yī)生和獸醫(yī)辦公室、學(xué)校和食品加工廠由相對未受過訓(xùn)練的人員常規(guī)使用?？紤]到新流感A變異體的傳播在世界范圍內(nèi)造成的威脅，臨床領(lǐng)域需要新的和改進的抗病毒藥劑。本發(fā)明滿足了這些需求。發(fā)明簡述在一方面，本發(fā)明通過檢測患者樣本中是否存在A型流感病毒的NS1蛋白，存在表明患者感染了A型流感病毒，從而提供鑒定患者是否感染A型流感病毒的方法。檢測步驟能包括將患者樣本與特異結(jié)合A型流感病毒蛋白NS1的試劑接觸；并檢測該試劑和NS1蛋白的特異結(jié)合，特異結(jié)合表明A型流感病毒的存在。備選或者此外，該檢測可以包括檢測編碼NS1蛋白的PDZ配體模體(PL)的mRNA的存在，并由mRNA的存在推斷出NSl蛋白的存在。優(yōu)選的PL具有以下模體S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸和X是任意氨基酸。優(yōu)選，該試劑是至少一種PDZ多肽?；蛘?，該試劑可以是至少一種抗體。對于泛-特異(pan-specific)性抗體，抗體可以是對NS1蛋白的保守區(qū)域特異。優(yōu)選，接觸步驟包括將患者樣本與特異結(jié)合A型流感病毒蛋白NS1不同表位的第一和第二試劑接觸，第一試劑固定在支持物上，檢測步驟檢測其中第一和第二試劑與NS1蛋白特異結(jié)合的夾心，表明病毒的存在。第一和第二試劑可以是第一和第二抗體，但優(yōu)選第一試劑是一種或者多種PDZ多肽，第二試劑是一種或者多種抗體。第一試劑可以是一種或者多種PDZ多肽和一種或者多種抗體的混合物?？贵w可以是對A型流感病毒NS1的全部亞型特異的抗體。一種或者多種PDZ多肽可以是下列的一種或者多種外膜，PSD95(PDZ#2)，PSD95(PDZ#1,2,3),DLG1(PDZ#1),DLG1(PDZ#1,2),DLG1(PDZ#2),DLG2(PDZ#1),DLG2(PDZ#2)，Magi3(PDZ#1)，PTN3(PDZ#1),MAST2(PDZ弁l)，NeDLG(PDZ#1，2)，Shankldl，Shank2dl,Shank3dl,Syntrophinla，Syntrophinyl,Magil(PDZ#1),Magil(PDZ#4)，Tipl;PTPL1(PDZ#1),Mint3(PDZ#1)，LymMystique(PDZ弁l),DLG2(PDZ#3),MUPPl(PDZ#8)，NeDLG(PDZ#1)，DLG5(PDZ#1)，PSD95(PDZ#1),NumBP(PDZ#3),LIMK1(PDZ#1)，KIAA0313,DLGl(PDZ#2)，Syntenin(PDZ#2)，Pickl,MAST2，PTN3(PDZ#1),NOSl(PDZ#1,2，3)，MINT1(PDZ#2)，ZO-1(PDZ#2)，NSP和RIM212?；颊邩颖究梢允窍铝械娜我庖环N血液，組織，鼻分泌物，肺滲出液，泄殖腔樣本，糞便樣本，喉拭子和唾液。優(yōu)選，患者是人，鳥類，豬，馬，或者哺乳動物。PDZ多肽優(yōu)選包括PL結(jié)合區(qū)(80-100氨基酸區(qū))，例如PSD95d2的PL結(jié)合區(qū)于SEQIDNO:l提供。為了進行亞型特異測定，PDZ多肽優(yōu)選的是PSD95dl,PSD95d2,PSD95d3,INADL8dl，Magildl,DLGld2，DLGld3，NeDLGldl,或者NeDLGld2。在另一方面，本發(fā)明提供了通過鑒定亞型特異性流感A型病毒蛋白NS1PDZ配體模體(PL)區(qū)的存在，對A型流感感染進行診斷和分型的方法。優(yōu)選PL具有以下模體S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸和X是任意氨基酸。在一方面，本發(fā)明提供檢測待測樣本中包含PL區(qū)的A型流感病毒蛋白的存在和量的方法，該方法通過在適于結(jié)合的條件下，將等份的待測樣本與至少一種PDZ肽和至少一種PDZ配體(PU檢測試劑混合；和測定PDZ肽和PL檢測試劑之間的結(jié)合，結(jié)合的降低表明待測樣本中A型流感病毒蛋白的存在。優(yōu)選，A型流感病毒蛋白是NP，HA，M1或者NS1。優(yōu)選，PL檢測試劑包括來自A型流感病毒蛋白C末端的PL模體，所述蛋白選自NP,HA,M1和NS1。優(yōu)選PL模體是S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸和X是任意氨基酸。在另一方面，本發(fā)明提供鑒定患者是否感染A型流感病毒的方法，該方法通過檢測患者的鼻分泌物、痰樣本或者喉拭子中是否存在A型流感病毒的NS1蛋白，存在表明患者感染A型流感病毒。在一方面，本發(fā)明提供在待測樣本中檢測包含PL區(qū)的A型流感病毒蛋白的存在和量的方法，該方法通過混合等份的待測樣本和至少一種PDZ肽；和檢測PDZ肽和PLA型流感病毒蛋白之間的結(jié)合，結(jié)合表明待測樣本中A型流感病毒蛋白的存在。在另一方面，本發(fā)明通過檢測患者是否感染流感A，提供檢測患者是否感染流感A致病株的方法，如果患者被感染，檢測患者樣本中具有PL模體的非結(jié)構(gòu)蛋白的存在，存在表明患者感染了A型流感病毒的致病株。在一方面，本發(fā)明提供鑒定患者樣本中A型流感病毒特異性亞型存在的方法，該方法通過將患者樣本與至少一種PDZ多肽或者至少一種捕獲抗體接觸，所述PDZ多肽或捕獲抗體與對流感病毒A亞型特異的NS1蛋白的PL模體特異結(jié)合；并檢測PDZ多肽或者捕獲抗體是否與樣本中的PL模體特異結(jié)合，特異結(jié)合表明該亞型的存在。優(yōu)選，該接觸步驟包括將患者樣本與大量PDZ多肽接觸，所述PDZ多肽特異結(jié)合多個NS1蛋白中的多個PL模體，所述NS1蛋白對流感病毒A的多個亞型特異；并且檢測包括確定哪種PDZ多肽特異結(jié)合其PL模體，與一種或者多種PDZ多肽的結(jié)合從而表明亞型的存在。優(yōu)選，捕獲抗體識別NS1的羧基末端。優(yōu)選，捕獲抗體或者PDZ多肽識別一種或者多種PDZ配體模體(PLs):ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4),TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10),NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQIDNO:13),DMAL(SEQIDNO:14)，DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18)，SEV,SEI,SKV,和SKI。優(yōu)選，PDZ多肽至少是下列的一種外膜，PSD95(PDZ#2),PSD95(PDZ#1,2,3),DLGl(PDZ#1),DLGl(PDZ#1,2)，DLGl(PDZ#2),DLG2(PDZ#1),DLG2(PDZ#2)，Magi3(PDZ#1)，PTN3(PDZ#1),MAST2(PDZ#1),NeDLG(PDZ#1，2)，Shankldl，Shank2dl,Shank3dl，Syn加phinla,Syntrophinyl,Magil(PDZ#1),Magil(PDZ#4),Tipl;PTPLl(PDZ#1)，Mint3(PDZ#1)，LymMystique(PDZ弁l)，DLG2(PDZ#3)，MUPP1(PDZ弁8)，NeDLG(PDZ弁l)，DLG5(PDZ#1),PSD95(PDZ#1),NumBP(PDZ#3),LIMK1(PDZ#1),KIAA0313,DLGl(PDZ#2)，Syntenin(PDZ#2),Pickl,MAST2,PTN3(PDZ#1),NOS1(PDZ#1,2,3),MINT1(PDZ#2),ZO-1(PDZ#2),NSP和RIM2。患者樣本可以是鼻分泌物，痰樣本，喉拭子，泄殖腔樣本，糞便樣本，肺滲出液，或者唾液。如果該方法用于鑒定亞型，則該亞型優(yōu)選禽流感A并且PL是PL模體ESEV/I/A(SEQIDN0:19)?；蛘?，亞型是H3N2和PL是PL模體RSKV(SEQIDNO:8)?；蛘?，PL是PL模體ESKV(SEQIDNO:4)?；蛘?，亞型是H1N1和PL是PL模體RSEV(SEQIDNO:7)。該方法還能夠包括將樣本與檢測抗體接觸。優(yōu)選，檢測抗體包括信號發(fā)生化合物，并且不抑制PL與PDZ的結(jié)合或者捕獲抗體與NS1的結(jié)合。PDZ多肽或者抗體可以固定在固相支持物上。如果固相支持物是毛細管流動分析裝置，接觸步驟包括將小棒浸在患者樣本中。優(yōu)選，毛細管流動測定是免疫測定法。優(yōu)選，固相支持物是側(cè)向流測定。在一方面，本發(fā)明提供用于患者樣本中流感A病毒的鑒定和分亞型的試劑盒，所述試劑盒包括與固定在固相支持物上的流感A病毒NS1特異結(jié)合的試劑。優(yōu)選，該試劑是抗體，PDZ多肽，寡核苷酸適配體，或者混合物。在另一方面，本發(fā)明提供用于患者樣本中流感A病毒鑒定和/或分亞型的試劑盒，包括與流感A病毒編碼蛋白特異結(jié)合的試劑；和與NS1蛋白特異結(jié)合的試劑。優(yōu)選，特異結(jié)合NS1蛋白的試劑與蛋白上的PL區(qū)結(jié)合。優(yōu)選，該試劑是抗體，PDZ多肽，寡聚核苷酸適配體，或者混合物。優(yōu)選，流感A病毒編碼蛋白是NS1。在一方面，本發(fā)明提供用于患者樣本中流感A病毒鑒定和/或分亞型的試劑盒，包括與NS1在非PL模體處特異結(jié)合的試劑和與NS1在PL模體處特異結(jié)合的試劑。在一方面，本發(fā)明提供具有大量PDZ多肽的試劑盒，所述PDZ多肽對多個流感A病毒的多個NS1蛋白的多個PL模體特異。在一方面，本發(fā)明提供鑒定能夠特異結(jié)合流感病毒PDZ配體(PL)的PDZ多肽的方法，通過將流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白PL與具有PDZ結(jié)構(gòu)域的候選多肽在適于結(jié)合的條件下接觸；檢測PL與候選多肽的特異結(jié)合；并確認(rèn)PL結(jié)合到PDZ結(jié)合位點。在一方面，本發(fā)明提供分離的抗體，該抗體與A型流感病毒NS1蛋白中的羧基末端模體特異結(jié)合。優(yōu)選，具有PL模體的羧基末端模體是ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9),GSKV(SEQIDNO:10),NICI(SEQIDNO:ll)，TICI(SEQIDNO:12)'RICI(SEQIDNO:13)，DMAL(SEQIDNO:14)，DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16)，DLDY(SEQIDNO:17)，SICL(SEQIDNO:18)，SEV,SEI，SKV，或者SKI。優(yōu)選，抗體是單克隆抗體或者抗體片段。優(yōu)選；PL模體是ESEV/I/A(SEQIDNO:19)。'在一方面，本發(fā)明提供對感染A型流感病毒或者具有感染風(fēng)險的患者進行治療或者預(yù)防的方法，該方法通過對患者使用有效方案的藥劑來實現(xiàn)，所述藥劑抑制病毒的NSl蛋白與細胞的PDZ蛋白的相互作用，從而作用于感染的治療或者預(yù)防。優(yōu)選，該藥劑是與A型流感病毒NS1蛋白的PL模體特異結(jié)合的抗體。優(yōu)選，藥劑是反義寡核苷酸，小分子，siRNA或者鋅指蛋白，并且該藥劑抑制流感ANSl蛋白或者PDZ蛋白的表達。優(yōu)選，NSl的PL模體是ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3)，ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9),GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO.ll)，TICI(SEQIDNO:12),RICI(SEQIDNO:13)，DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15),DIAL(SEQIDNO:16)，DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18),SEV,SEI，SKV,或者SKI。優(yōu)選，藥劑是PDZ多肽并且它包括至少與PLSEQIDNO:1相互作用的結(jié)合區(qū)。優(yōu)選，PDZ多肽下面的至少一種外膜，PSD95(PDZ#2),PSD95(PDZ#1,2,3)，DLGl(PDZ#1)，DLGl(PDZ#1，2)，DLGl(PDZ#2)，DLG2(PDZ#1)，DLG2(PDZ#2),Magi3(PDZ#1)，PTN3(PDZ#1)，MAST2(PDZ#1),NeDLG(PDZ#1,2),Shankldl,Shank2dl,Shank3dl,Syntrophinla,Syntrophiny1,Magil(PDZ#1)，Magil(PDZ#4)，Tipl;PTPLl(PDZ#1)，Mint3(PDZ#1),LymMystique(PDZ#1)，DLG2(PDZ#3)，MUPPl(PDZ#8),NeDLG(PDZ#1),DLG5(PDZ#1)，PSD95(PDZ#1),NumBP(PDZ#3),LIMK1(PDZ#1),KIAA0313,DLGl(PDZ#2)，Syntenin(PDZ#2),Pickl，MAST2,PTN3(PDZ#1),NOSl(PDZ#1,2，3)，MINT1(PDZ#2)，ZO-1(PDZ#2)，NSP和RIM2。在另一方面，本發(fā)明提供篩選抗病毒劑的方法，該方法通過在待測化合物存在或者缺失的條件下，將PDZ多肽和流感病毒PDZ配體(PL)接觸；和將待測化合物存在條件下較之缺失條件下的PDZ/PL結(jié)合量作比較，優(yōu)選抗病毒劑減少PDZ/PL結(jié)合，并還可能包括在體內(nèi)或者胞內(nèi)檢測試劑以鑒定其是否干擾干擾素的產(chǎn)生。在一方面，本發(fā)明提供非天然的PDZ配體(PL)肽診斷試劑，其具有選自流感A蛋白C端氨基酸序列內(nèi)的氨基酸線性陣列，因此PL能夠結(jié)合哺乳動物PDZ多肽。優(yōu)選，PL具有以下模體S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸和X是任意氨基酸。優(yōu)選，流感ANSI蛋白陣列包括以下至少一種ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4),TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6)，RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9),GSKV(SEQIDNO:10),NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12),RICI(SEQIDNO:13),DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15),DIAL(SEQIDNO:16)，DLDY(SEQIDNO:17)，SICL(SEQIDNO:18),SEV',SEI,SKV或者SKI。還能包括診斷試劑，例如陽性對照，陰性對照"分析標(biāo)準(zhǔn)品，分析校準(zhǔn)品(calibrator)，競爭性分析配體，標(biāo)記的肽檢測劑或者固相捕獲劑。還能包括合成肽，重組多肽，基本上純化的天然PL多肽，基本上純化的天然PL多肽的片段，模擬PL的肽，寡核苷寧適配體PL或者多肽適配體PL。優(yōu)選，PL肽來自流感ANSI蛋白。在一方面，本發(fā)明提供一種非天然的PDZ多肽診斷試劑，用于檢測生物樣本中的流感APL，所述生物樣本包含能夠結(jié)合流感ANSI蛋白的非天然PDZ多肽，優(yōu)選的PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白診斷試劑選自陽性對照、陰性對照、分析標(biāo)準(zhǔn)品、分析校準(zhǔn)品、競爭性配體、標(biāo)記的蛋白檢測結(jié)合伴侶和捕獲劑的診斷試劑，優(yōu)選外膜，PSD95(PDZ#2)，PSD95(PDZ#1,2,3),DLG1(PDZ#1)，DLG1(PDZ#1,2),DLG1(PDZ#2),DLG2(PDZ#1)，DLG2(PDZ#2)，Magi3(PDZ#1),PTN3(PDZ#1)，MAST2(PDZ#1),NeDLG(PDZ#1，2),Shankldl,Shank2dl,Shank3dl,Syntrophinla,Syntrophiny1,Magil(PDZ弁l)，Magil(PDZ#4),Tipl;PTPL1(PDZ#1)，Mint3(PDZ#1),LymMystique(PDZ#1)，DLG2(PDZ#3),MUPPl(PDZ#8),NeDLG(PDZ#1),DLG5(PDZ#1)，PSD95(PDZ#1)，NumBP(PDZ#3),LIMK1(PDZ弁l),KIAA0313,DLGl(PDZ#2),Syntenin(PDZ#2)，Pickl,MAST2，PTN3(PDZ#1)，NOS1(PDZ#1,2,3),MINT1(PDZ#2),ZO-1(PDZ#2)，NSP或者RIM2。在另一方面，本發(fā)明提供用于檢測待測樣本中流感A蛋白的信號發(fā)生結(jié)合劑，所述待測樣本包含非天然PL或者非天然PDZ，其中PL或者PDZ均是與信號發(fā)生化合物共價連接的肽或者多肽。在一方面，本發(fā)明提供鑒定患者是否感染致病流感A的方法，該方法通過檢測患者樣本中是否存在A型流感病毒的NS2蛋白，該蛋白在70位具有絲氨酸，其存在表明患者感染流感A的致病株。優(yōu)選的檢測步驟是將患者樣本與特異結(jié)合具有絲氨酸70的序列的試劑接觸。優(yōu)選試劑是抗體或者核酸。在一方面，提供鑒定患者是否感染致病A型禽流感病毒的方法，該方法包括，將患者樣本與PSD-95PDZ蛋白接觸；和檢測PSD-95PDZ蛋白與樣本之間的特異結(jié)合，特異結(jié)合表明A型流感病毒的存在，該存在表明患者感染致病A型禽流感病毒。優(yōu)選，致病A型流感病毒是H5N1。優(yōu)選，PSD-95PDZ蛋白是PSD-95的結(jié)構(gòu)域2。優(yōu)選，流感NS1蛋白PL具有以下模體ESKV，ESEI(SEQIDNO:3)，或者ESEV(SEQIDNO:2)。在一方面，接觸步驟包括將患者樣本與PSD-95PDZ蛋白和抗體接觸，所述抗體與A型流感病毒蛋白NS1的不同抗原表位而不是PSD-95PDZ蛋白特異結(jié)合，PSD-95固定在支持物上，檢測步驟檢測NS1蛋白與抗體的特異結(jié)合。在另一方面，該方法包括將患者樣本與第二PDZ蛋白接觸的另外步驟，INADLd8作為對照并檢測特異結(jié)合，第一PDZ-95蛋白相對于第二PDZ蛋白特異結(jié)合更高表明患者感染了致病A型禽流感病毒。附圖簡述圖1是顯示禽類、人類和其他哺乳動物中NS1PL序列ESEV(SEQIDNO:2)出現(xiàn)的時程圖。，圖2是顯示禽類、人類和其他哺乳動物中NS1PL序列EPEV(SEQIDNO:27)出現(xiàn)的時程圖。圖3是顯示禽類、人類和其他哺乳動物中NS1PL序列RSKV(SEQIDNO:8)出現(xiàn)的時程圖。圖4顯示對檢驗6個人流感A陽性樣本的鼻分泌物的結(jié)果。圖5顯示感染A/PR/8/34的MDCK細胞中的NSl表達。圖6顯示細胞中PDZ與NS1的相互作用。圖7顯示細胞中INADLd8與H3N2NS1的相互作用。圖8顯示利用PDZ捕獲劑和單克隆抗體檢測劑AU-4B2，用于NS1診斷的側(cè)向流形式。圖9顯示利用單克隆抗體捕獲劑和單克隆抗體檢測劑AU-4B2的側(cè)向流形式。圖10a-k是11個示范性側(cè)向流流感檢測形式。定義除非另外定義，所有此處使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解含義相同的。下列文獻給技術(shù)人員提供了本發(fā)明使用的許多術(shù)語的一般定義Singleton等人，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY(微生物和分子生物)(第二版，1994);THECAMBRIDGEDICTIONARYOFSCIENCEANDTECHNOLOGY(劍橋科技詞典)(Walker編著，1988);和Hale&Marham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY(HARPERCOLLINS生物詞典)(1991)。盡管與此處描述的方法相似或者等同的任何方法和材料都可用于本發(fā)明的實踐或者檢測，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。按照邏輯(而不是字母)順序提供定義以幫助讀者實現(xiàn)本發(fā)明，即，如下也就是，"試劑"包括任何物質(zhì)，分子，元素，化合物，實體，或者其組合，包括但不限于，例如，蛋白，多肽，小的有機分子，多糖-肽嵌合分子，核苷酸-肽嵌合分子等。試劑的典型實例包括非天然狀態(tài)的天然產(chǎn)物，合成肽化合物，化合物，以及兩種或更多種天然或者非天然化合物。除非另作說明，術(shù)語"試劑"，"物質(zhì)"，和"化合物"可以互換使用。"禽流感A"是指A亞型流感，其感染禽類對象并在禽類對象之間傳染。禽流感血凝素(hemmagglutinin)亞型的典型實例包括H5,H6，H7,H9和H10，典型菌株包括H5N1，H6N2,H7N3，H7N7,H9N2，H10N4和H畫5。"禽類對象"是指適合進行檢測或者治療的對象，包括所有種類的鳥類，包括野生鳥類(例如野禽)和家養(yǎng)種類(例如家禽)。優(yōu)選，要檢測或者治療的禽類對象選自雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴕鳥、鴯鹋和外來鳥類例如鸚鵡、美冠鸚鵡和雞尾鸚鵡。更優(yōu)選，要檢測的禽類對象是雞，火雞，鵝或者鵪鶉。"非天然"用來指在自然界不存在的組合物。非天然組合物的典型實例包括基本上純化的組合物，以及，那些包含著在自然界的相同化學(xué)形式中不會出現(xiàn)的化合物的組合物，例如，化學(xué)和基因修飾蛋白、核酸等。此處使用的"調(diào)節(jié)"是指例如通過激動結(jié)合活性的上調(diào)(即，活化或者剌激)，和例如通過拮抗結(jié)合活性的下調(diào)(即抑制鳴者遏制)二者。此處使用的術(shù)語"PDZ配體結(jié)合調(diào)節(jié)劑"是指能夠改變包含PDZ結(jié)構(gòu)域的多肽與PDZ配體(即，"PL")結(jié)合的試劑。調(diào)節(jié)劑包括，但不限于，活化劑例如激動劑和抑制劑例如拮抗劑二者。抑制劑可能引起部分或者完全的結(jié)合抑制。當(dāng)用于區(qū)別不同的流感病毒株情況下，"流感A的致病株"是指根據(jù)OIE世界動物衛(wèi)生組織、世界衛(wèi)生組織或者它們指定的代表提出的指南的"須通報禽流感"(NAI)病毒，例如，在OIE"ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals,5thedition,(陸生動物診斷分析和疫苗手冊，第五版)2004(www.oie.inf)中提出的指南。此外，該致病株在毒力或者H5或者H7病毒的典型試驗中具有"高致病性"，所述H5或者H7病毒具有流感A血凝素(HA)前體蛋白HAO切割位點的氨基酸序列，所述氨基酸序列與在毒性病毒中觀察到的任何HAO切割位點氨基酸序列相似，SP，如OIE或者代表性的相似國家或者國際組織或者行業(yè)協(xié)會所規(guī)定。流感A毒性H5和H7株中HAO切割位點氨基酸序列的典型實例包括病毒前體血凝素蛋白切割位點處的多個堿性氨基酸(精氨酸或者賴氨酸)，例如，其中H7病毒的低毒株具有-PEIPKGR*GLF-(SEQIDNO:20)或者-PENPKGR*GLF-(SEQIDNO:21)，高致病株具有-PEIPKKKKR*GLF-(SEQIDNO:22)，-PETPKRKRKR*GLSF-(SEQIDNO:23),-PEIPKICREKR*GLF-(SEQID1^0:24)或者孑￡?。?amp;101101*007-(SEQIDNO:25)?，F(xiàn)在典型的毒力試驗包括用感染性病毒接種4-8周齡雞，其中如果病毒株在10天內(nèi)造成大于75%的死亡率，則該病毒株被認(rèn)為是髙致病性的；和/或，靜脈內(nèi)致病性指數(shù)(IVPI)大于1.2的任意病毒，其中靜脈內(nèi)接種的鳥類在10天期間每24小時檢査；正常，記分為"O";患病為"l";嚴(yán)重患病為"2";死亡為"3";禾口，計算平均分作為IVPI。后來的高致病性病毒株被OIE稱為"高致病性NAI病毒"(HPNIA)?，F(xiàn)有的NAI典型實例包括流感A的H5和H7株?，F(xiàn)在HPNIA的典型實例包括H5N1。"流感A的低致病株"表示須通報的禽流感A，g卩，NAI分離物(上文)，但其對雞不具有致病性并且不具有HAO切割位點氨基酸序列，所述序列與在毒性病毒中觀察到的任何HAO切割位點氨基酸序列相似，即，該病毒株被OIE稱為"低致病性禽流感(LPAI)"。"PDZ結(jié)構(gòu)域"是指與腦突觸蛋白￡SD-S>5、果蠅(Qrosophila)分隔連接蛋白Discs-Large(SLG)和/或上皮細胞緊密連接蛋白^01(^01)具有大約90個連續(xù)氨基酸同源的氨基酸序列；優(yōu)選大約80-90個；更優(yōu)選，大約70-80個，更優(yōu)選大約50-70個氨基酸。PDZ結(jié)構(gòu)域的典型實例在本領(lǐng)域還已知有Discs-Large同源性重復(fù)("DHRs")和"GLGF"重復(fù)(SEQIDNO:26)。在各種膜相關(guān)蛋白中發(fā)現(xiàn)了PDZ結(jié)構(gòu)域的實例，包括鳥苷酸化激酶同系物的MAGUK家族的成員，幾種蛋白磷酸酯酶和激酶，神經(jīng)元一氧化氮合成酶(neuronalnitricoxidesynthase)，月中瘤抑制蛋白，和幾種抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白，總稱為sy;rophins。該PDZ結(jié)構(gòu)域包括天然和非天然的氨基酸序列。PDZ結(jié)構(gòu)域的典型實例包括PDZ蛋白的多態(tài)變異體，以及，包含兩個不同PDZ蛋白等部分的嵌合PDZ結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選，該PDZ結(jié)構(gòu)域包含與下列公開的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列美國專利申請?zhí)?0/485,788(2004年2月3日提交)，國際專利申請PCT/US03/285/28508(2003年9月9日提交),國際專利申請PCT/USOl/44138(2001年11月9日提交)，在此完整引入作為參考。典型的非天然PDZ結(jié)構(gòu)域包括那些氨基酸序列的對應(yīng)遺傳密碼已經(jīng)突變的PDZ結(jié)構(gòu)域，例如，用于產(chǎn)生改變(增強或者減弱)與PL結(jié)合或者與PL結(jié)合特異性的氨基酸改變。任選PDZ結(jié)構(gòu)域或者其變異體與來自腦突觸蛋白PSD-95、果蠅分隔連接蛋白Discs-Large(DLG)和/或上皮細胞緊密連接蛋白ZOl(ZOl)和動物同系物中至少一種的PDZ結(jié)構(gòu)域具有至少50、60、70、80或者90%的序列一致性。任選天然PDZ結(jié)構(gòu)域的變異體與天然PDZ結(jié)構(gòu)域具有至少90%的序列一致性。PDZ結(jié)構(gòu)域的序列一致性由PDZ結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少70個氨基酸確定，優(yōu)選80個氨基酸，和更優(yōu)選80-90或者80-100個氨基酸。當(dāng)類似物和人序列進行最大限度比對時，類似物的氨基酸指定為天然人序列中相應(yīng)氨基酸的相同編號。類似物通常與天然存在的肽在一個、兩個或者幾個位置存在不同，經(jīng)常借助于保守置換。術(shù)語"等位基因變異體"用于指相同種類中不同個體基因之間的變異和該基因編碼的蛋白中相應(yīng)的變異。PSD-95d2的示范性PDZ結(jié)構(gòu)域如SEQIDNO:l所示。"PDZ蛋白"，與"包含PDZ結(jié)構(gòu)域的多肽"和"PDZ多肽"可以互換使用，是指具有PDZ結(jié)構(gòu)域(上文)的天然存在或者非天然存在的蛋白。以前(上文)已經(jīng)公開了PDZ蛋白的典型實例，包括CASK,MPPl,DLG1，DLG2，PSD95,NeDLG，TIP-33，TIP-43,LDP,LIM,LIMK1,LIMK2，MPP2,AF6,G0RASP1，INADL,KIAA0316，KIAA1284，MAGIl，MAST2,MINT1，NSP,N0S1，PAR3，PAR3L,PAR6/3,PICK1,Shank1,Shank2,Shank3,SITAC-18,TIP1,和Z0-1。用于篩查分析的該非天然PDZ結(jié)構(gòu)域多肽可以包含例如比天然PDZ結(jié)構(gòu)域小的PDZ結(jié)構(gòu)域。例如非天然PDZ結(jié)構(gòu)域可任選包含"GLGF"模體，即，具有GLGF氨基酸序列(SEQIDNO:26)的模體，其通常位于PDZ結(jié)構(gòu)域附近，例如通常在N端大約10-20個氨基酸內(nèi)。PDZ結(jié)合活性通常需要GLGF模體(SEQIDNO:26)和緊挨著GLGF模體(SEQIDNO:26)N端的3個氨基酸。同樣地，非天然PDZ結(jié)構(gòu)域可以構(gòu)建為PDZ結(jié)構(gòu)域C-末端缺失/3-折疊，即，通?？梢詮奶烊籔DZ結(jié)構(gòu)域刪除這一區(qū)域而不影響PL的結(jié)合。提供了一些示范性的PDZ蛋白，括號內(nèi)是GI或者檢索號(accessionnumbers):PSMD9(9184389)，af6(430993)，AIPC(12751451),ALP(2773059)，APXL-1(13651263)，MAGI2(2947231)，CARDI1(1282772),CARDI4(13129123)，CASK(3087815),CNK1(3930780),CBP(3192908)，Densin180(16755892),DLG1(475816),DLG2(12736552),DLG5(3650451),DLG6剪接變異體(splicevar)1(14647140),DLG6剪接變異體2(AB053303),DVLI(2291005)，DVL2(2291007),DVL3(6806886)，ELFIN1(2957144)，ENIGMA(561636),ERBIN(8923908),EZRIN結(jié)合蛋白50(3220018),FLJOOOll(10440342),FU11215(11436365),FLJ12428(BC012040),FLJ12615(10434209),FLJ20075Semcap2(7019938),FLJ21687(10437836),FLJ31349(AK055911),FLJ32798(AK057360),GoRASPl(NM031899),GoRASP2(13994253),GRIP1(4539083),GTP酶活化酶(2389008)，鳥嘌呤交換因子(6650765),HEMBA1000505(10436367),HEMBA1003117(7022001),HSPC227(7106843)，HTRA3(八Y0楊94),HTRA4(AL576444),INADL(2370148)，KIAA0147Vartul(1469875)，KIAA0303MAST4(2224546)，KIAA0313(7657260),KIAA0316(6683123)，KIAA0340(2224620),KIAA0380(2224700),KIAA0382(7662087),KIAA0440(2662160),KIAA0545(14762850)，KIAA0559(3043641),KIAA0561MAST3(3043645),KIAA0613(3327039),KIAA0751RIM2(12734165),KIAA0807MAST2(3882334)，KIAA0858(4240204),KIAA0902(4240292),KIAA0967(4589577)，KIAA0973SEMCAP3(5889526),KIAA1202(6330421),KIAA1222(6330610)，KIAA1284(6331369)，KIAA1389(7243158),KIAA1415(7243210)，KIAA1526(5817166)，KIAA1620(10047316),KIAA1634MAGI3(10047344)，KIAA1719(1267982),LIMMystique(12734250)，LIM(3108092)，LIMK1(4587498),LIMK2(1805593)，LIM-RIL(1085021)，LU層1(U52111)，MAGI1(3370997),MGC5395(BC012477)，MINT1(2625024),MINT3(3169808)，MPP1(189785),MPP2(939884),MPP3(1022812)，MUPP1(2104784),NeDLG(10853920)，NeurabinII(AJ401189)，N0S1(642525)，新PDZ基因(7228177)，新絲氨酸蛋白酶(1621243)，Numb結(jié)合蛋白(AK056823):外膜蛋白(7023825),p55T(12733367),PAR3(8037914),PAR3-樣(AF428250),PAR6(2613011)，PAR6p(13537116),PAR6y(13537118)，PDZ-73(5031978)，PDZK1(2944188),PICK1(4678411)，PIST(98394330),prlL16(1478492),PSAP(6409315)，PSD95(3318652)，PTN-3(179912),PTN-4(190747),PTPL1(515030)，RGS12(3290015),RGS3(18644735)，Rho-GAPIO(NM020824),Rhophilin-樣(14279408),絲氨酸蛋白酶(2738914),Shank2(6049185),Shank3(AC000036),Sliroom(18652858),與GRASP65相似(14286261)，與Numbpx2的配體相似(BC036755),與PIT同系物相似(21595065)，SIP1(2047327),SITAC-18(8886071)，SNPCIIA(20809633),Shank1(7025450)，Syntenin(2795862),Syntrophin1a(1145727),Syntrophinj82(476700),Syntrophiny1(9507162)，Syntrophiny2(9507164)，TAX2-樣蛋白(3253116)，TIAM1(4507500),TIAM2(6912703)，TIP1(2613001),TIP2(2613003),TIP33(2613007),TIP43(2613011)，X-ll/3(3005559),ZO-1(292937),ZO-2(12734763),ZO-3(10092690)。"PDZ配體"，縮寫為"PL"，表示一種天然存在的蛋白，該蛋白具有與PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合并與其形成分子間相互作用復(fù)合物的氨基酸序列。之前在現(xiàn)有的美國和國際專利申請(上文)中已經(jīng)披露了PL的典型實例。流感APL的其他實例在下面實施例部分中提供。"PDZ試劑"用來指一種化合物，其與那些不包括PDZ試劑的對照相比，在檢測分析中干擾至少20%的PDZ配體多肽和包含PDZ結(jié)構(gòu)域多肽之間發(fā)生的結(jié)合相互作用，例如，至少30%，至少40%。，至少50%，至少60%，至少70%,至少80%，至少卯％，至少95%，享到大約99%或者100%。盡管不希望受限于任何具體的作用機理，但該PDZ劑可能起干擾作用，例如通過結(jié)合到否則將與流感NS1配體結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域；或者，它可以直接結(jié)合NS1配體以阻止其結(jié)合PDZ蛋白。通常，后來的PDZ試劑是那些在特定分析中表現(xiàn)出IC50在大約lmM或者更低范圍內(nèi)的PDZ試劑。顯示更低IC50的化合物，例如，通常其IC50為大約100jmM，10/iM，1/iM，100nM，10nM,lnM甚或更低。后來的PDZ試劑可用于治療和預(yù)防藥物組合物，給藥以減輕、治療或者預(yù)防由流感A病毒感染引起的一種或者多種疾病的癥狀。"PL調(diào)節(jié)劑"在用于PDZ試劑(上文)背景時，是指結(jié)合流感ANSI蛋白并調(diào)節(jié)其與PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合的化合物。"PDZ調(diào)節(jié)劑"在用于PDZ試劑(上文)背景時，是指結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域并調(diào)節(jié)流感NS1蛋白在對象PDZ結(jié)構(gòu)域位點結(jié)合的化合物。該PDZ調(diào)節(jié)劑和PL調(diào)節(jié)劑可以分別是設(shè)計成結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域或者PL的肽、模擬肽或者小分子模擬物。下面的實施例部分非常詳細地描述了檢測PDZ調(diào)節(jié)劑是否結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域的分析法。同樣地，還闡明了用于檢測PL調(diào)節(jié)劑是否結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域的分析法，例如，重組PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白與重組NS1融合蛋白結(jié)合。"PDZ介導(dǎo)的病癥"是指流感A感染對象中的一種或者多種癥狀，由流感A病毒蛋白PL在宿主細胞PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)合引起。后來的癥狀起因于病毒感染，包括，但不限于發(fā)燒，咳嗽，喉嚨痛，肌肉疼痛，結(jié)膜炎，呼吸問題，氣道中過度粘液產(chǎn)生，對繼發(fā)性細菌感染的易感性增加，肺炎，神經(jīng)感染等。"患病"用在此處是指禽類對象時，包括的體征和癥狀可以從幾乎沒有明顯病征的猝死到具有呼吸征象、過度流淚、竇炎、頭部水腫、無羽表皮發(fā)紺和腹瀉的更具特征的疾病。OIE在它們的衛(wèi)生指南"ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals,第五版，世界動物衛(wèi)生組織"中披露了"患病"的典型診斷體征、樣本和檢驗。此處使用的"類似物"是指結(jié)構(gòu)上類似感興趣的天然PDZ或者PL分子的分子，但其已經(jīng)被修飾，例如，通過取代或者化學(xué)修飾一種或者多種所選的氨基酸取代基。與起始分子比較，類似物可能顯示相同、相似或者改進的功用。合成和篩選類似物以鑒定具有改進特征的已知化合物的變異體在醫(yī)藥領(lǐng)域是公知的，例如，增強結(jié)合親合力，改變與目標(biāo)結(jié)合的選擇性，減少與非目標(biāo)分子的結(jié)合，改進體外和體內(nèi)穩(wěn)定性，和改進藥理學(xué)性質(zhì)。"接觸"具有其正常含義，是指結(jié)合兩種或更多種試劑從而使成分合并，例如，待測樣本中的PL與PDZ合并。接觸可以在體外發(fā)生，例如，PDZ蛋白與細胞裂解產(chǎn)物在試管或者其他容器中合并，或者，原位，例如，借助于細胞的天然生物合成活性，天然宿主細胞PDZ蛋白和天然病毒PL在流感感染的細胞中合并?；蛘撸ㄟ^例如將PDZ結(jié)構(gòu)域編碼序列轉(zhuǎn)染到流感A感染細胞中，而合并重組PDZ與病毒PL。"多聚體"用于指一種或者多種類型重復(fù)單元的連續(xù)陣列，而不管來源。多聚體可以在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，特別包括多肽和多核苷酸，以及，包含氨基酸、核苷酸或者其類似物的化合物。術(shù)語"多核苷酸"是指任意長度核苷酸或者其類似物的多聚體，包括長度范圍從10-100個核苷酸的寡核苷酸和長度大于100個核苷酸的多核苷酸。術(shù)語"多肽"是指具有任意長度的氨基酸連續(xù)排列的多聚體，優(yōu)選連續(xù)排列中從大約12個到大約50個氨基酸范圍；和，最優(yōu)選的大于大約50個氨基酸。"多肽"和"蛋白"互換使用，包括氨基酸(其中天然肽鍵骨架被替換為非天然合成骨架)和多肽(其中一種或者多種天然氨基酸被替換為一種或者多種非天然存在或者合成的模擬氨基酸)的聚合連續(xù)陣列。"融合蛋白"是指由來源于兩種或更多種天然蛋白的氨基酸序列組成的多肽，其表達為單個重組蛋白，即，在其天然狀態(tài)不連接的兩種或更多種氨基酸序列在重組蛋白中連接在一起，例如利用它們各自的氨基和羧基末端通過肽鍵，從而形成單一連續(xù)的氨基酸序列。融合蛋白可以是兩個、三個或者甚至四個或者更多個不同的天然或者非天然蛋白的組合。典型融合蛋白包括那些具有兩個或者更多個異源的，艮口，無關(guān)的，氨基酸序列；那些兼具異源和同源的，即，相關(guān)的，序列。融合蛋白還由下列氨基酸序列組成有或者沒有N端甲硫氨酸殘基的氨基酸序列，那些標(biāo)簽用于抗原的抗原表位鑒定的氨基酸序列，以及，那些具有信號發(fā)生化合物作為融合伴侶的氨基酸序列，例如，具有熒光伴侶的融合蛋白；酶伴侶例如/3-半乳糖苷酶；化學(xué)發(fā)光伴侶例如熒光素酶；等。"捕獲試劑"，當(dāng)用于診斷分析試劑或者方法的背景時，是指在結(jié)合相互作用和適用于診斷分析形式的時間段內(nèi)，能夠結(jié)合流感病毒分析物的試劑，所述相互作用具有足夠的強度(例如測定為結(jié)合親合力)和特異性，該特異性允許從不同病毒分析物的混合物中濃縮病毒分析物；所述適用于診斷分析形式的時間段，即，通常大約5分鐘到大約90分鐘；優(yōu)選大約5分鐘到大約60分鐘；和，最優(yōu)選的大約5分鐘到大約30分鐘。根據(jù)本發(fā)明的可選實施方式，該捕獲試劑包含PDZ結(jié)構(gòu)域或者PL。典型的捕獲試劑在下面實施例部分說明。捕獲試劑通常"特異結(jié)合"一種或者多種病毒分析物，例如，包含PL的蛋白，而排斥其他分析物，例如，不包含PL的蛋白。優(yōu)選，該捕獲試劑結(jié)合該病毒分析物的解離常數(shù)(KD)小于大約1(T6M，優(yōu)選，小于大約10'7M;和，最優(yōu)選的，小于大約10—8M。"特異結(jié)合"，當(dāng)用于該天然和非天然PDZ結(jié)構(gòu)域與PL試劑之間的結(jié)合相互作用時，用于指捕獲或者檢測試劑優(yōu)先結(jié)合特定病毒分析物的能力，所述特定病毒分析物存在于不同病毒分析物的混合物中。在某些實施方式中，該特異結(jié)合相互作用能夠辯別具有或者缺失PL的蛋白，即，在一些實施方式中鑒別能力大于大約IO到約IOO倍；和，優(yōu)選大于約1000到約10,000倍。術(shù)語"基本上一致"是指當(dāng)最優(yōu)比對時，例如利用缺省缺口權(quán)重(defaultgapweight)通過程序GAP或者BESTFIT，兩個肽序列共有至少65%的序列一致性，優(yōu)選至少80%或者90%的序列一致性，更優(yōu)選至少95%的序列一致性或者更高(例如，99%的序列一致性或者更高)。優(yōu)選，不同的殘基位置區(qū)別在于保守氨基酸取代。"結(jié)合干擾"用于涉及PDZ結(jié)構(gòu)域與PL的第一結(jié)合相互作用，從而在診斷分析形式中形成復(fù)合物；其中，隨后在必要的^二結(jié)合相互作用中檢測該復(fù)合物，即，當(dāng)?shù)谝唤Y(jié)合相互作用抑制第二結(jié)合相互作用導(dǎo)致信號發(fā)生化合物產(chǎn)生的信號強度減弱時，產(chǎn)生干擾。本發(fā)明方法中該組合物發(fā)生的信號受到的結(jié)合干擾小于15%;優(yōu)選，小于10%;和，最優(yōu)選小于大約5%。"捕獲劑/分析物復(fù)合物"是由捕獲試劑，例如PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白，和分析物，例如含有PL的流感病毒蛋白，特異結(jié)合產(chǎn)生的復(fù)合物。在"適于特異結(jié)合的條件下"，捕獲試劑和分析物特異結(jié)合，S卩，一個與另一個，其中這種物理化學(xué)條件可以便利地根據(jù)例如鹽濃度、pH、去污劑濃度、蛋白濃度、溫度和時間表示。該條件適合于例如在溶液中使得結(jié)合發(fā)生；或者可選地，結(jié)合成員中的一種被固定到固相上。這種合適的典型條件在診斷領(lǐng)域是公知的，例如參見，Harlow和Lane,"Antibodies:ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)。合適的條件優(yōu)選導(dǎo)致結(jié)合相互作用的解離常數(shù)(KD)小于大約1(^M;優(yōu)選，小于大約1(^M;禾卩，最優(yōu)選小于大約10—8M。"表面結(jié)合捕獲試劑"與"固相捕獲試劑"互換使用，用來指固定在固體基質(zhì)表面的PDZ結(jié)構(gòu)域或者PL捕獲劑，所述固體基質(zhì)例如，片層，珠子，或者其他結(jié)構(gòu)，例如在下面更詳細說明的帶孔板等。在某些實施方式中，此處使用的捕獲劑的集合存在于相同支持物的表面上，例如，以其中表面上的特定位置對應(yīng)于存在的特定表面結(jié)合捕獲劑的陣列形式。"分離的"或者"純化的"通常指物質(zhì)(化合物，多核苷酸，蛋白，多肽，多肽組合物)的分離，使得該物質(zhì)在其存在的樣本中占有顯著的百分比(例如，大于2%，大于5%，大于10%，大于20%,大于50%，或者更高，通常直到大約90%-100%)。在某些實施方式中，基本上純化的成份包括樣本的至少50%,80%-85%，或者90-95%。用于純化感興趣的多核苷酸和多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的，包括，例如，離子交換層析，親合層析和密度沉降。通常，當(dāng)相對于樣本的其他成份，一種物質(zhì)在該樣本中存在的量是在自然界未發(fā)現(xiàn)的，則該物質(zhì)被純化。"評價"，當(dāng)用于該試驗的背景時，是指評估試驗結(jié)果和/或進行試驗測定，以確定流感A病毒分析物是否存在于待測樣本中。典型的評估包括"確定(determining)"，"測定(rneasuring)"，"評估(evaluating)"和"分析(assaying)"，它們可以互換使用，包括定量和/或定性測定。評價可以是相對的或者絕對的。"評價結(jié)合"包括檢測結(jié)合相互作用的量或者程度，以及，檢測是否發(fā)生特定結(jié)合相互作用，S卩，結(jié)合是否存在。"治療"，是指將本發(fā)明的化合物對需要其的對象給藥，目的是達到所需的藥理和/或生理作用，例如，預(yù)防或者減輕一種或者多種疾病的癥狀(上文)。該治療可以采用預(yù)防方式給藥，S卩，預(yù)防一種或者多種疾病癥狀的發(fā)展；和/或，治療以緩解或者消除疾病的癥狀。需要其治療的對象包括人類和家養(yǎng)動物。此處使用的"受試者"，是指人類和家養(yǎng)動物，例如哺乳動物，魚，鳥，爬行動物，兩棲動物等等。."信號發(fā)生化合物"，縮寫為"SGC"，是指可以連接到PL或者PDZ的分子(例如利用下面披露的化學(xué)連接方法)，并且能夠在本公開的分析法中反應(yīng)形成可檢測的化學(xué)或者物理實體(即，反應(yīng)產(chǎn)物)。反應(yīng)產(chǎn)物的典型實例包括沉淀物、熒光信號、具有顏色的化合物，等等。典型SGC包括例如，生物發(fā)光化合物(例如，熒光素酶)，熒光團(例如，如下文)，生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光化合物，放射性同位素(例如，1311，125I，14C，3H，35S，32P，等等)，酶(例如，如下文)，結(jié)合蛋白(例如，生物素，抗生物素蛋白，鏈霉親和素等等)，磁性顆粒，化學(xué)反應(yīng)性化合物(例如，著色染劑)，標(biāo)記的寡核苷酸；分子探針(例如，CY3，ResearchOrganics,Inc.),等等。典型的熒光團包括異硫氰酸熒光素，琥珀酰熒光素，若丹明B，麗絲胺(lissamine)，9，10-二苯基蒽，二萘嵌苯，紅熒烯，芘和其熒光衍生物例如異氰酸酯，異硫氰酸酯，酰氯或者磺酰氯，傘形酮，鑭系元素例如銪(Eu)的稀土螯合物，等等?？捎糜谛盘柊l(fā)生結(jié)合物的典型SGC包括下列中的酶1類IUB，尤其是i丄i和1.6(例如，乙醇脫氫酶，甘油脫氫酶，乳酸脫氫酶，蘋果酸脫氫酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，甘油醛-3-磷酸膠氫酶等等)；1.11.1類IUB(例如，過氧化氫酶，過氧化物酶，氨基酸氧化酶，半乳糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，抗壞血酸氧化酶，心肌黃酶，尿素酶等等)；2類IUB，尤其是2.7和2.7.1(例如，己糖激酶等等)；3類IUB，尤其是3.2.1和3丄3(例如，a淀粉酶，纖維素酶，^-半乳糖透明質(zhì)酸酶(galacturonidase),淀粉葡萄糖苷酶，/3-葡糖醛酸酶，堿性磷酸酶，酸性磷酸酶等等)；4類IUB(例如，裂解酶)；5類IUB，尤其是5.3和5.4(例如，磷酸葡糖異構(gòu)酶，磷酸丙糖酶異構(gòu)酶(triosphosphataseisomerase)，磷酸葡糖變位酶等等)。信號發(fā)生化合物還包括其產(chǎn)物可以通過熒光和化學(xué)發(fā)光波長檢測的SGC，例如，熒光素酶，熒光發(fā)射金屬例如l52Eu，或者鑭系的其他；化合物例如魯米諾，異魯米諾，吖啶鑰鹽，等等；生物發(fā)光化合物例如熒光素；熒光蛋白；等等。熒光蛋白包括，但不限于下列即，(i)綠色熒光蛋白(GFP),即，包括但不限于，GFP的"人源化"形式，其中天然存在的核苷酸序列的密碼子被改變成更密切匹配人密碼子偏差；(ii)源于維多利亞多管水母(A叫uoriavictoria)的GFP和其衍生物，例如，"人源化"衍生物例如增強的GFP，它是商品化提供的，例如，來自Clontech，Inc.;(iii)來自其他種類例如海腎(Renillareniformis),Renillamulleri,或者Ptilosarcusguernyi的GFP，如WO99/49019和Peelle等人(2001)J.ProteinChem.20:507-519所描述；(iv)"人源化"重組GFP(hrGFP)(Stratagene);和，(v)來自珊瑚蟲(Anthozoan)種類的其他熒光和有色蛋白，例如Matz等人(1999)NatureBiotechnol17:969-973所描述那些；等等。該信號發(fā)生化合物可以偶聯(lián)到PL或者PDZ結(jié)構(gòu)域多肽?？梢酝ㄟ^金屬螯合基團例如EDTA實現(xiàn)某些SGC與蛋白的連接。該SGC都具有允許檢測和/或定量待測樣本中流感PL分析物的共同特性。利用目視法可以檢測該SGC;優(yōu)選，適于自動化的方法例如分光光度法，熒光法，化學(xué)發(fā)光法，電納米方法(electricalnanometricmethod)包括例如，電導(dǎo)、阻抗、電阻等等的變化和磁場方法。此處使用的"固相"是指可以靜電、疏水或者共價連接一種或者多種反應(yīng)物的表面。典型的固相包括例如尼龍6;尼龍66;聚苯乙烯；膠乳珠；磁性珠；玻璃珠；聚乙烯；聚丙烯；聚丁烯；丁二烯-苯乙烯共聚物；硅橡膠；聚酯；聚酰胺；纖維素和衍生物；丙,酸酯；甲基丙烯酸酯；聚乙烯；氯乙烯；聚氯乙烯；聚氟乙烯；聚苯乙烯共聚物；硅凝膠；硅片玻璃；瓊脂糖；右旋糖苷；脂質(zhì)體；不溶蛋白金屬；和，硝化纖維素。典型的固相包括形成為珠子、管、條帶、圓盤、濾紙、板等等的那些。濾器可用于捕獲分析物例如作為濾液，或者通過截留起作用，或者通過將PL或者PDZ共價結(jié)合到濾器上起作用(例如，參見下面的實施例部分)。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方式，配給用戶的固相捕獲試劑可以由包被"捕獲試劑"(下文)的固相(上文)組成，并進行包裝(例如，在氮氣氣氛下)以保存和/或最大化捕獲試劑與生物樣本中流感PL分析物的結(jié)合。"捕獲試劑"是指能夠結(jié)合流感PL的固定PDZ多肽(或者肽)。該捕獲試劑可以由PDZ溶液；或者修飾以促進其與固相結(jié)合的PDZ;或者已經(jīng)固定在固相表面上的PDZ組成，所述固定在固相表面上的PDZ例如，通過靜電力、范德華力、疏水力、共價化學(xué)鍵等等(如下面進一步披露)將PDZ連接到固相(上文)來固定。PDZ捕獲試劑的典型實例在下面的實施例部分公開，包括活動的固相PDZ捕獲試劑，例如固定在活動的膠乳珠上的PDZ，例如在膠乳珠浸染棒(dipstick)分析中。"檢測試劑"是指一種結(jié)合物，包含連接到PL或者PDZ多肽或者肽的SGC;或者，連接到能夠特異結(jié)合PL或者PDZ的抗體的SGC。該檢測試劑的典型實例包括一種或者多種PL或者PDZ與一種或者多種SGC化合物的復(fù)合物，即，高分子復(fù)合物。有關(guān)檢測試劑包括活動的固相檢測試劑，例如膠乳珠浸染棒分析中活動的膠乳珠。"生物樣本"是指從活的(或者死的)生物體，例如，哺乳動物、魚、鳥、爬行動物、有袋類動物等等獲得的樣本。生物樣本包括組織液，組織切片，空氣或者水中帶有的生物材料，并例如通過過濾、離心等等從中收集，例如，用于評價生物恐怖威脅等等。備選的生物樣本可以取自胎兒或者卵，卵黃和羊水。典型生物液體包括，例如尿液，血液，血漿，血清，腦脊液，精液，肺灌洗液，糞便，痰，粘液，含水生物材料等等?；蛘?，生物樣本包括鼻咽或者口咽拭子，鼻灌洗液，來自氣管、肺、肺泡、腸、脾、腎、大腦、肝和心臟的組織，痰，粘液，含水生物材料，泄殖腔拭子，痰，鼻和口腔粘液，等等。典型的生物樣本還包括食品，例如，肉、加工食品、家禽、豬等等的樣本。生物樣本還包括污染的溶液(例如，食品加工溶液等等)，來自門診場所、醫(yī)院、診所、食品加工場所(例如，飯店，屠宰場，冷藏庫，超級市場包裝等等)的拭樣。生物樣本還可以包括原位組織和體液(即，不是收集用于檢驗的樣本)，例如，該方法可用于檢測眼睛中病毒感染的存在或者嚴(yán)重性，例如，利用滴眼劑，將測試條(teststrips)直接用于結(jié)膜；或者，通過例如將指示劑膠囊置于檢驗對象的口或者鼻咽，檢測肺感染的存在或者程度?；蛘?，拭子或者測試條可以置于口中。生物樣本可以來源于對象的任意組織，器官或者細胞群。在一些實施方式中，從對象獲得刮片、活組織切片或者灌洗液。生物樣本可以包括體液例如血液，尿液，痰液，和口腔液體；和樣本例如鼻洗滌液、拭子或者抽吸物，氣管抽吸物，下疳拭子，和大便樣本。適于目標(biāo)個體病原體檢測的生物樣本的收集方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如鼻咽樣本例如鼻拭子、洗滌液或者抽吸物，或者，在涉及呼吸系統(tǒng)疾病的高危流感A病毒情況下的氣管抽吸物，口腔拭子等等。因此，本發(fā)明的實施方式提供可用于檢測各種不同類型的生物樣本中流感A污染或者感染的存在或者量的方法。任選，生物樣本可以懸浮在包含抗生素例如青霉素、鏈霉素、慶大霉素和制霉菌素的等滲溶液中。此處使用的"配體"是指能夠結(jié)合PDZ結(jié)合位點的PL化合物。配體的典型實例包括包含PL的復(fù)合病毒顆粒(上文)，該顆粒發(fā)現(xiàn)于各種不同的流感A株中。該配體能夠填滿PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點處的三維空間，使得靜電斥力被最小化，靜電引力被最大化，疏水性和氫鍵鍵合力被最大化。配體以特異和可飽和的方式結(jié)合PDZ多肽，并且結(jié)合親合力可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的配體結(jié)合檢測法測定，例如下面所公開的。"特異性"，當(dāng)用于本發(fā)明實施方式的分析背景時，是指根據(jù)本發(fā)明步驟進行的該分析，能夠從一組生物樣本(例如，100個樣本的組)中正確鑒定出樣本的"指示"百分比。該樣本組全部包含一種或者多種胞壁質(zhì)分析物(例如，細菌或者真菌污染的陽性對照樣本)。優(yōu)選該"指示"特異性大于85%，(例如，分析法能夠指示100個樣本中大于85個包含一種或者多種胞壁質(zhì)分析物)，并最優(yōu)選，該分析法的指示特異性大于90%。任選，該分析法能夠鑒別"真正的非流感A病例"，艮P，從生物樣本組(例如，100個樣本的組)中檢測出陰性樣本的"指示"百分比。優(yōu)選，本發(fā)明的該步驟能夠正確鑒定出"真正的非禽流感A病例"；和最優(yōu)選，本發(fā)明的該步驟能夠正確鑒定出"真正的低致病性禽流感A病例"。在不同的實施方式中，樣本的陰性對照組或者不包含流感APL分析物；或者，包含非禽流感APL分析物；或者，包含非致病的流感PL。優(yōu)選該特異性大于85%，(例如，分析法能夠指出100個樣本中超過85個)，和最優(yōu)選，該檢測法的特異性大于90%。"特異性"，當(dāng)用于本發(fā)明實施方式的背景時，是指根據(jù)本發(fā)明步驟進行的該分析法能夠從一組包含陽性對照(上文)和陰性對照(即，缺失PL分析物)的樣本組中鑒定出"指示"百分比的包含流感PL分析物的那些樣本。優(yōu)選該"指示"的靈敏度大于85%和最優(yōu)選大于90%。任選，該分析法能夠從一組樣本中以包含流感PL分析物的那些樣本的"指示"百分比鑒定出"真正的流感A病例"。優(yōu)選，本發(fā)明的該步驟能夠正確的鑒定出"真正的禽流感A病例"；禾Q，最優(yōu)選，本發(fā)明的該步驟能夠正確的鑒定出"真正的致病性禽流感A病例"。在不同的實施方式中，樣本的陽性對照組包含流感APL分析物；或者，包含禽流感APL分析物；或者，包含高致病性的流感APL。優(yōu)選該"指示"靈敏度大于大約70%和更優(yōu)選大于大約80%。甚至更優(yōu)選，靈敏度大于大約85%和最優(yōu)選大于對照靈敏度的大約90%?；蛘?，該靈敏度可以參照鑒定相同蛋白的PCR反應(yīng)的靈敏度測定。就特異性和靈敏度而言，任選可以運用下列定義"陽性預(yù)測值"，縮寫為PPV，是指在本方法中檢測為陽性并且是真正禽流感A病例的樣本的百分比。優(yōu)選，本方法的PPV大于約65%，和最優(yōu)選的大于約80%。."陰性預(yù)測值"，縮寫為NPV，是指檢測為陰性并且是真正陰性流感A病例的樣本的百分比。優(yōu)選，本方法的NPV大于約85y。，和最優(yōu)選大于約90%。當(dāng)涉及生物樣本時，"真正陽性流感A"是指兩個或者更多個獨立試驗確認(rèn)的包含流感A病毒顆粒的樣本，所述試驗例如，在含胚雞卵中分離和培養(yǎng)，在商業(yè)化免疫測定法、免疫擴散、紅細胞凝集和/或紅細胞凝集抑制試驗中鑒定病毒抗原來鑒別HA和/或NA亞型，在呼吸器官標(biāo)本的細胞中病毒RNA的RT-PCR檢測或者流感A抗原的免疫熒光檢測。當(dāng)涉及生物樣本時，"真正陽性禽流感A"是指兩個或者更多個獨立試驗確認(rèn)的包含禽流感A病毒顆粒的樣本，所述試驗例如，在含胚雞卵中分離和培養(yǎng)，在商業(yè)化免疫分析試驗、免疫擴散、紅細胞凝集禾口/或紅細胞凝集抑制試驗中鑒定病毒抗原來鑒別HA和/或NA亞型，在呼吸器官標(biāo)本的細胞中病毒RNA的RT-PCR檢測或者禽流感A抗原的免疫熒光檢測。當(dāng)涉及生物樣本時，"真正陽性高致病性禽流感A"是指如上文定義并由兩個或者更多個獨立試驗確認(rèn)的包含高致病性禽流感A病毒顆粒的樣本，所述試驗例如，在含胚雞卵中分離和培養(yǎng)，在商業(yè)化免疫分析試驗、免疫擴散、紅細胞凝集和/或紅細胞凝集抑制試驗中鑒定病毒抗原來鑒別HA和/或NA亞型，在呼吸器官標(biāo)本的細胞中病毒RNA的RT-PCR檢測或者禽流感A抗原的免疫熒光檢測。當(dāng)涉及生物樣本時，"陰性禽流感A，，是指兩個或者更多個獨立試驗確認(rèn)的不包含禽流感A病毒顆粒的樣本，所述試驗例如，在含胚雞卵中分離和培養(yǎng)，在商業(yè)化免疫分析試驗、免疫擴散、紅細胞凝集和/或紅細胞凝集抑制試驗中鑒定病毒抗原來鑒別HA禾n/或NA亞型，呼吸器官標(biāo)本的細胞中病毒RNA的RT-PCR檢測或者流感A抗原的免疫熒光檢測。當(dāng)涉及生物樣本時，"真正陰性禽禽流感A"是指兩個或者更多個獨立試驗確認(rèn)的不包含禽流感A病毒顆粒的樣本，所述試驗例如，在含胚小雞卵中分離和培養(yǎng)，在商業(yè)化免疫分析試驗、免疫擴散、紅細胞凝集和/或紅細胞凝集抑制試驗中鑒定病毒抗原鑒別HA和/或NA亞型，呼吸器官標(biāo)本的細胞中病毒RNA的RT-PCR檢測或者流感A抗原的免疫熒光檢測。在這種情況下，生物樣本可能包含除了禽流感A病毒顆粒以外的流感A病毒顆粒，即，如上文定義。當(dāng)涉及生物樣本時，"真正陰性高致病性禽流感A"是指如上定義并且由兩個或者更多個獨立試驗確認(rèn)的不包含高致病性禽流感A病毒顆粒的樣本，所述試驗例如，在含胚小雞卵中分離和培養(yǎng)，在商業(yè)化免疫分析試驗、免疫擴散、紅細胞凝集和/或紅細胞凝集抑制試驗中鑒定病毒抗原來鑒別HA和/或NA亞型，呼吸器官標(biāo)本的細胞中病毒RNA的RT-PCR檢測或者流感A抗原的免疫熒光檢測。但是該樣本可能包含上文定義的流感A病毒顆?；蛘咻^低致病性的禽流感A病毒顆粒。當(dāng)用于本發(fā)明實施方式的試驗法情況下時，"背景"是指試驗結(jié)果中的不確定性，(有時表示為假陽性或者假陰性結(jié)果的百分比或者通過測定試驗結(jié)果的置信度)，是由試驗中存在可能干擾分析的正確運行的物質(zhì)時產(chǎn)生的。可能起干擾作用的物質(zhì)，即，干擾物質(zhì)、混淆(confounding)物質(zhì)等的典型實例包括內(nèi)源性PDZ結(jié)合多肽，信號發(fā)生化合物的抑制劑或者底物，例如，酶抑制劑，自由基反應(yīng)性化合物，內(nèi)源性過氧化物等等。此處使用的"基本上純化的"是指包含非天然狀態(tài)的天然PDZ或者PL多肽或者肽的制劑，例如其純度高于自然界中的水平。典型的比天然樣本中記載的更高水平的純度包括PDZ和PL多肽和其片段，相對于存在于天然來源材料中的水平，它們被富集大于約10倍到約25倍，優(yōu)選的大于約26倍到約50倍，和最優(yōu)選大于約100倍。該制劑還優(yōu)選包含小于約10%的雜質(zhì)，和最優(yōu)選小于約5%的可檢測雜質(zhì)，例如通過SDS-PAGE或者反相HPLC。先前已經(jīng)確定并在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中電子儲存的核酸和蛋白序列在此通過Genbank檢索號(GI)引入作為參考。在那些Genbank項目中披露的序列集合為了一切目的在此完整引入作為參考。申請人明確保留以后修改說明書以具體列舉一種或者多種這些序列、或者其任意標(biāo)明部分的權(quán)利。此處涉及的各種生化和分子生物學(xué)方法都是本領(lǐng)域公知的，并且描述于，例如，Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.第二(1989)和第三(2000)版，禾卩CurrentProtocolsinMolecularBiology,(A醫(yī)bel,F.M.等人編著)JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork(1987-1999)。核酸可以是DNA或者RNA，和單鏈或者雙鏈。寡核苷酸可以是天然存在或者合成的，但通常通過合成方法制備。優(yōu)選的本發(fā)明的核酸包括DNA片段，或者它們的互補序列(complement)，包括如表12所示的包含Ser70的NS2序列中的任意一個。該片段通常在5和100個連續(xù)堿基之間，并且范圍經(jīng)常在5，10，12，15，20，或者25個核苷酸到10，15，30，25，20，50或者100個核苷酸之間。5-10,5-20，10-20,12-30,15-30，10-50,20-50或者20-100個堿基之間的核酸是常見的。多態(tài)性位點可以存在于片段內(nèi)的任意位置。該片段可以來自于表12所示的NS2的任意等位基因形式。為了在表中簡便起見，符號T用于代表DNA中的胸腺嘧啶和RNA中的尿嘧啶。因此，在RNA寡核苷酸中，符號T應(yīng)解釋為表示尿嘧啶殘基。雜交探針能夠以堿基特異方式結(jié)合核酸的互補鏈。這種探針包括核酸，月太核酸，如Nielsen等人于Science254，1497-1500(1991)的描述。'術(shù)語引物是指一種單鏈寡核苷酸，它能夠在合適條件(即，存在4種不同的核苷三磷酸和聚合劑，例如，DNA或者RNA聚合酶或者逆轉(zhuǎn)錄酶)、合適緩沖液和合適溫度下，作為模板指導(dǎo)的DNA合成起始點。引物的適合長度取決于引物的打算用途，但范圍通常在15到40個核苷酸之間。短的引物分子通常需要較冷的溫度以便與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。引物無須反映模板的精確序列，但必須足夠互補以便與模板雜交。術(shù)語引物位點是指與引物雜交的靶DNA區(qū)域。術(shù)語引物對是指包括5'上游引物和3'下游引物的引物組，5'上游引物與待擴增的DNA序列的5'端雜交，3'下游引物與待擴增的序列的3'端互補序列雜交。多態(tài)性是指病毒種群中兩種或更多遺傳確定的可變序列或者等位基因的存在。第一個鑒定的等位基因形式被隨意命名為參照形式，而其他等位基因形式被命名為可變或者變體等位基因。在這種情況下，多態(tài)性包括70位，其中甘氨酸被替換為絲氨酸。單核苷酸多態(tài)性發(fā)生在被單核苷酸占據(jù)的多態(tài)性位點，這是等位基因序列之間的變異位點。該位點通常在等位基因高度保守序列(例如，種群成員中變化小于1/100或者1/1000的序列)的前后。單核苷酸多態(tài)性通常由于多態(tài)性位點處一個核苷酸取代另一個而產(chǎn)生。轉(zhuǎn)換(transition)是一種嘌呤被另一種嘌呤或者一種嘧啶被另一種嘧啶替換。顛換(transversion)是一種嘌呤被一種嘧啶替換，或者反之亦然。單核苷酸多態(tài)性還可以源于相對于參照等位基因的核苷酸的缺失或者核苷酸的插入。一組多態(tài)性是指至少2個，和有時5個，或者更多的如表12或者13禾口/或表3a-e所示的多態(tài)性。雜交通常在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進行，該條件允許寡核苷酸和靶DNA之間的特異結(jié)合，靶DNA包含如表12或者13和/或表3a-e所示的多態(tài)性位點中的一種。嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為任意合適的緩沖液濃度和溫度以及任意去除寡核苷酸非特異性結(jié)合的洗滌條件，所述緩沖液濃度和溫度允許寡核苷酸能夠與高度同源的序列特異雜交，該序列跨越至少一個如表12或者13所示的多態(tài)性位點。例如，5xSSPE(750mMNaCl，50mM磷酸鈉，5mMEDTA,pH7.4)和溫度25-3(TC的條件適于等位基因特異探針的雜交。通常洗滌條件的范圍從室溫到60°C。術(shù)語引物是指一種單鏈寡核苷酸，它能夠在合適條件(即，存在4種不同的核苷三磷酸和聚合試劑，例如，DNA或者RNA聚合酶或者逆轉(zhuǎn)錄酶)、合適緩沖液和合適溫度下，作為模板指導(dǎo)的.DNA合成起始點。引物的適合長度取決于引物的打算用途，但范圍通常在15到30個核苷酸之間，盡管也可以使用更短或者更長的引物。短的引物分子通常需要較冷的溫度以便與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。引物無須反映模板的精確序列，但必須足夠互補以便與模板雜交。術(shù)語"引物位點"是指與引物雜交的靶DNA區(qū)域。術(shù)語"引物對"是指包括5'上游引物和3'下游引物的引物組，5'上游引物與待擴增的DNA^列的5'端雜交，3'下游引物與待擴增DNA序列的3'端互補序列雜交。為將氨基酸取代分類為保守或者非保守，氨基酸分組如下組I(疏水性側(cè)鏈)正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸；組II(中性親水性側(cè)鏈)半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸；組III(酸性側(cè)鏈)天冬氨酸，谷氨酸；組IV(堿性側(cè)鏈)天門冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸；組V(影響鏈取向的殘基)甘氨酸，脯氨酸；和組VI(芳香族側(cè)鏈)色氨酸，酪氨酸，苯丙氮酸。保守取代包括同類氨基酸之間的取代。非保守取代是由這些類型中一種的成員交換另一成員構(gòu)成。此處敘述的方法可以按照所敘述事件的任意次序進行，即，達到這樣的順序邏輯上可行的程度。此外，當(dāng)提供范圍數(shù)值時，應(yīng)當(dāng)清楚，在所述范圍上下限之間的每個居間值，以及落在該范圍內(nèi)的任意其他提及的或者居間的值都包括在本發(fā)明內(nèi)。同時，預(yù)期所述的本發(fā)明改變的任何任選特征可以闡明并獨立提出權(quán)利要求，或者與此處描述的任意一個或者多個特征結(jié)合。指示單個物品包括存在有多個相同物品的可能性。更具體地，如此處和所屬權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式"一個"、"所述(said)"和"該(the)"包括復(fù)數(shù)指示，除非上下文明顯另有規(guī)定。還應(yīng)注意，可以起草權(quán)利要求以排除任何任選元素。因而，對于權(quán)利要求元素的敘述相關(guān)的排它術(shù)語如"唯一""只有"等的使用，或者"負性"限制的使用，本聲明意在作為前提基礎(chǔ)。發(fā)明詳述本發(fā)明的前提部分基于注意到流感NS1蛋白具有PL區(qū)，該PL區(qū)與哺乳動物PDZ蛋白相互作用，并且不同的PL模體與不同的PDZ蛋白特異性相互作用。本發(fā)明的前提還部分地基于以下結(jié)果在身體分泌物例如鼻分泌物中能夠發(fā)現(xiàn)可檢測水平的NS1PL蛋白。流感A奪取正常宿主細胞的功能，并引起導(dǎo)致致病性的變化。已發(fā)現(xiàn)某些致病性流感株具有非結(jié)構(gòu)NS1蛋白，該蛋白含有結(jié)合哺乳動物PDZ蛋白的配體模體。作為急性毒力因子，NS1蛋白可能干擾或者轉(zhuǎn)變宿主細胞高分子蛋白復(fù)合物的PDZ蛋白組裝。因為PDZ蛋白還通常參與分子伴侶、內(nèi)吞和分泌過程，此處公開的證據(jù)有力支持以下觀點毒性流感株破壞基于細胞PDZ的調(diào)節(jié)機制。本發(fā)明提供新的診斷組合物和方法，以及，治療性抗病毒耙位和候選化合物。本結(jié)果顯示特異PDZ蛋白與流感NS1的結(jié)合具有高親合力和特異性。PDZ蛋白與毒性而不是非毒性流感A株中的C端三-和四-肽NS1模體結(jié)合。為了說明該方法，利用重組PDZ蛋白和交叉反應(yīng)的抗NS1單克隆抗體，構(gòu)建嵌合分析以區(qū)別致病性和非致病性流感A株(又稱為毒性的和非毒性的)。該分析方法包括將對象的待測樣本與包含PDZ結(jié)構(gòu)域的多肽接觸，并檢測樣本中的致病性流感ANSIPJ)Z配體是否結(jié)合PDZ配體多肽。包含PDZ的多肽和病毒PDZ配體乏間的結(jié)合表明NS1來自于流感A的毒性株。當(dāng)對患者樣本進行試驗時，該結(jié)果表明對象感染了流感A病毒的致病株。該分析特別適合于鑒定H5和/或H7致病株。更優(yōu)選該分析鑒定至少一種致病株，包括H5N1、H7N2、H7N7、H10N7，并最優(yōu)選該分析鑒定H5N1株。更優(yōu)選，該分析鑒定禽類株的致病株，例如當(dāng)前造成禽流感的H5N1，其具有NS1PL模體ESEV(SEQIDN0:2)。不同的流感A株編碼具有不同PDZ配體(PL)的蛋白。因此不同的流感A株可以根據(jù)它們的PL進行區(qū)分。因此，本發(fā)明還提供通過與特異NS1PL類型的關(guān)系，確定流感病毒亞型的方法。還提供檢測人類對象是否感染禽流感病毒H5N1株的方法。還提供鑒定抗病毒劑的分析法。因為該方法檢測只在感染細胞內(nèi)部產(chǎn)生的病毒NS1抗原，所以該方法可用于篩查，以檢測當(dāng)前被感染的對象。該方法是特別有利的，因為與其他方法不同，它可以區(qū)別已免疫和被感染的對象。被感染的對象具有病毒NS1抗原，而已免疫的則沒有。最優(yōu)選，該方法能夠區(qū)別禽流感A病毒的不同亞型，以鑒定(即，具有陽性分析結(jié)果)一種或者多種高致病性禽流感A株，如果它們存在于生物樣本中。優(yōu)選，該分析方法包括例如，在商業(yè)化屠宰場、農(nóng)場或者養(yǎng)殖場監(jiān)控禽類對象感染高致病性禽流感A株例如H5N1或者H7的步驟，。在其他實施方式中，本發(fā)明通過鑒定被感染的動物并除去和/或銷毀和/或治療它們以預(yù)防傳染其他對象，而提供預(yù)防在大量對象中流行的流感A病毒傳播的方法。優(yōu)選，該方法包括區(qū)分感染了高致病性流感A株，例如禽類亞型如H5N1，與那些感染了較低致病性株的禽類和人類對象。此外本發(fā)明提供檢測對象是否感染流感病毒；和/或，受試者是否感染高危流感A病毒的禽類株的方法。該方法包括將來自對象的待測樣本與特異識別NS1PL的PDZ結(jié)構(gòu)域多肽、抗體和/或適配體和/或其他試劑接觸，并檢測待測樣本中的分析物與PDZ結(jié)構(gòu)域多肽、抗體和/或適配體之間是否發(fā)生結(jié)合相互作用。評價和檢測該結(jié)合相互作用可用于確定待測樣本包含流感病毒PL;從而確認(rèn)受試者被感染。該方法還可以在流感A病毒株之間進行區(qū)分，例如評價對象是否感染高危禽流感病毒株(致病性)例如H5N1，或者，感染較低危的H1N1株(無致病性)。還提供在鑒定藥物抗病毒化合物，例如藥物開發(fā)中有用的篩選分析法。因此，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了在各種診斷和治療應(yīng)用中的用途。I.流感病毒流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，并基于它們核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(Ml)的抗原差異分為A、B和C組。進一步分型到株通?；趯Υ嬖谟趦蓚€毒粒糖蛋白中的抗原類型，即，紅細胞凝集素(HA;H)和神經(jīng)氨酸苷酶(NA;N)進行評價。HA和NP是毒性因子，介導(dǎo)病毒粒子與宿主細胞表面的連接。Ml蛋白被認(rèn)為在病毒組裝和出芽中起作用，而NP在RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起作用。除這些毒粒蛋白之外，兩個其他非結(jié)構(gòu)(即非毒粒)蛋白在病毒感染細胞中表達，它們被稱為非結(jié)構(gòu)蛋白l和2(NS1;NS2)。非結(jié)構(gòu)病毒蛋白NS1具有多重功能，包括調(diào)節(jié)剪接和核輸出細胞mRNAs和刺激翻譯，以及抵抗宿主干擾素能力。在流感病毒中已經(jīng)鑒定和測序了NS1蛋白，該序列可以在NCBI數(shù)據(jù)庫中查到。其他流感病毒中的NS1蛋白，是指與在已知流感亞型中鑒定為NS1的蛋白之一具有最大序列相似性的蛋白，使用的序列例如，genbank檢索號，CY003340，CY003324，DQ266101，等等。全部禽流感病毒分類為A型。已經(jīng)從人，豬，馬和海洋哺乳動物以及家養(yǎng)和野生鳥類中分離出A型病毒。禽流感病毒是發(fā)生人流感大流行的關(guān)鍵因素，因為1957年的亞洲流行性感冒和1968年的香港流感都是由據(jù)認(rèn)為是禽類來源的病毒引起。近年來，H5N1和H7N7亞型的純種禽流感病毒已經(jīng)在香港和荷蘭直接造成致命的人類疾病(Horimoto，T.和Kawaoka,Y.(2001)Clin.Microbiol.Rev.14:129-149;Guan，Y.等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:8156-8161)。II.PL區(qū)下面的實施例顯示，流感病毒病原體包含具有PDZ配體的模體的病毒蛋白，所述PDZ配體結(jié)合PDZ蛋白。具有PL模體的病毒蛋白，包括紅細胞凝集素(HA),核蛋白(NP)，基質(zhì)l(Ml)和非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)蛋白。但是，II型PL模體(全部，單除了NS1蛋白)顯示與PDZ蛋白較弱的結(jié)合。通常在蛋白最后3或者4個C末端氨基酸處發(fā)現(xiàn)PL模體。在大多數(shù)流感NS1蛋白中發(fā)現(xiàn)的可鑒別模體是S/T-X-V/I/L,其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸，X是任意氨基酸。.各特異性模體的頻率在實施例l和表3a-e中顯示。盡管EPEV(SEQIDNO:27)禾QKMAD(SEQIDNO:28)不對應(yīng)于典型的PL模體，但它們在一定程度上結(jié)合PDZ，并且也能用于鑒定。表3a-e和圖1-3的結(jié)果顯示了通過H和N抗原鑒別的亞型和相應(yīng)NS1PL模體之間的非隨機關(guān)系。特異NS1PL模體此處被稱為NS1PL類。III.PDZ蛋白最近已經(jīng)顯示PDZ結(jié)構(gòu)域是細胞質(zhì)膜蛋白復(fù)合物的主要組織者。最初鑒定PDZ結(jié)構(gòu)域為突觸后密度蛋白PSD95/SAP90、果蠅腫瘤抑制物dig-A和緊密連接蛋白ZO-1內(nèi)的保守序列元件。盡管最初被稱為GLGF(SEQIDNO:26)或者DHR模體，但現(xiàn)在它們己知為代表前3個包含PDZ的蛋白(PDZ:PSD95/DLG/ZO-l)的縮寫。現(xiàn)在這些80-90個氨基酸的序列己在超過75種蛋白中得到了很好的鑒定，并在單個蛋白內(nèi)特征性地多拷貝表達。PDZ結(jié)構(gòu)域被國家生物技術(shù)信息中心(theNationalCenterforBiotechnologyInformation)(www.ncbi.gov)i只另U為家族，例如在Pfam中。還發(fā)現(xiàn)它們存在于不同生物體的整個系統(tǒng)發(fā)育中，如多細胞動物、植物和細菌。這種廣泛的物種分布好象是只有這種結(jié)構(gòu)域特有的，但或許PDZ結(jié)構(gòu)域最區(qū)別性特征在于觀察到絕大多數(shù)包含它們的蛋白與胞質(zhì)膜相關(guān)。盡管在許多不同結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了PDZ結(jié)構(gòu)域，但各PDZ蛋白通常局限于特定的亞細胞結(jié)構(gòu)域，例如突觸；細胞-細胞接觸；或者頂端、底部或者側(cè)部的細胞表面。這引出一種推測，即PDZ結(jié)構(gòu)域進化早，在組織胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域中發(fā)揮主要作用。PDZ結(jié)構(gòu)域最普遍的功能可能是將它們的配體定位到合適的胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域。在極化上皮細胞中，PDZ蛋白清楚地定位在不同的頂端、底部-側(cè)部和結(jié)合的膜結(jié)構(gòu)域，并且在大部分情況下，與它們的跨膜和細胞溶質(zhì)結(jié)合伴侶共定位。顯然PDZ蛋白還具有一個基本作用，在特定亞細胞結(jié)構(gòu)域內(nèi)空間簇聚集和錨定跨膜蛋白。PDZ結(jié)構(gòu)域包含約80-90個殘基，它們折疊成具有5-6個鏈和兩個a螺旋的|3-夾心結(jié)構(gòu)。肽配體結(jié)合在由/3鏈(bB)、a螺旋和結(jié)合肽的羰基的環(huán)組成的疏水性裂縫(cleft)中。肽以反平行模式與bB鏈結(jié)合，C末端殘基占據(jù)疏水性袋。PDZ雜二聚體形成線性的頭尾(head-to-tail)排列，參與伴侶蛋白之一上內(nèi)部構(gòu)件(internal)的識別。PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白在本領(lǐng)域是已知的，通過蛋白測序和鑒定PDZ結(jié)構(gòu)域的存在，新的蛋白能夠被鑒定為具有PDZ結(jié)構(gòu)域。2004年8月2日提交的美國專利申請10/485,788詳細解釋了PDZ蛋白，并給出了大量實例?；蛘?，懷疑是PDZ蛋白的蛋白可以檢測與各種PL蛋白或者NS1PL類的結(jié)合。IV.PDZ/PL相互作用來自流感的包含PL模體的NS1蛋白與實施例中所示的PDZ蛋白結(jié)合。實施例2顯示了用于鑒定結(jié)合的方法。2004年8月2日提交的美國專利申請10/485,788和2003年11月14日提交的10/714,537詳細描述了檢測PDZ結(jié)構(gòu)域多肽和候選PDZ配體多肽之間結(jié)合的兩個互補分析(A和G分析)。在兩個不同分析的每一種中，檢測具有對應(yīng)于預(yù)期結(jié)合一種或者多種PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白的C末端的序列的肽(即候選PL肽)，和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽(通常是包含PDZ結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)之間的結(jié)合。A.檢測PDZ結(jié)構(gòu)域多肽和NMDA受體PL蛋白之間相互作用的分析建立了兩個稱為"A"和"G"的互補分析來檢測PDZ結(jié)構(gòu)域多肽和候選PDZ配體之間的結(jié)合。在兩個不同分析的每一種中，檢測具有對應(yīng)于預(yù)期結(jié)合一種或者多種PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白C末端的序列的肽(即候選PL肽)和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽(通常是包含PDZ結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)之間的結(jié)合。在"A"分析中，固定候選PL肽并檢測可溶PDZ結(jié)構(gòu)域多肽與固定肽的結(jié)合("A"分析的命名是因以下事實在一個實施方式中用抗生物素蛋白表面(旦vidin)固定肽)。在"G"分析中，固定PDZ結(jié)構(gòu)域多肽，并檢測可溶PL肽的結(jié)合("G"分析的命名是因為用QST-結(jié)合表面固定PDZ結(jié)構(gòu)域多肽)。下面描述示范性的分析。I."A分析"利用固定PL肽檢測PDZ配體結(jié)合。分析包括下列步驟(1)將生物素化的候選PL肽固定在抗生物素蛋白包被的表面上。然后測定PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白與該表面的結(jié)合。(2)抗生物素蛋白與表面，例如蛋白結(jié)合表面結(jié)合。任選，通過每孔添加100ML溶于不含鈣和鎂的磷酸鹽緩沖鹽水pH7.4("PBS"，GibcoBRL)的20/xg/mL的抗生物素蛋白(Pierce)，在4°C12小時，將抗生物素蛋白結(jié)合到聚苯乙烯96孔板(例如，NuncPolysorb(cat#—475094))。然后通過每孔添加200/aLPBS，在4°C2小時，對板進行處理以阻斷非特異性的相互作用，所述PBS每100mL含有2g無蛋白酶牛血清白蛋白("PBS/BSA")。然后對板的每孔重復(fù)添加每孔200/xLPBS，用PBS洗板3次，然后將板的內(nèi)含物倒入廢液器中，在干燥表面上輕叩板。(3)通過每孔添加50jtiL溶于PBS/BSA的0.4/iM肽，在4'C30分鐘，將生物素化的PL肽(或者候選PL肽)固定在板的孔表面上。通常，各個不同的肽添加到至少8個不同的孔，因此能夠做出多重測量(例如，雙份重復(fù)，并且還利用不同的GST/PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白和單獨的GST陰性對照)，并且還準(zhǔn)備其他的陰性對照孔，其中沒有肽被固定。在PL肽固定到表面上后，用PBS洗板3次。(4)通過每孔添加50/iL包含溶于PBS/BSA的5/ig/mLGST/PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白的溶液，在4。C2小時，使得GST/PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白與表面反應(yīng)。作為陰性對照，添加單獨的GST(即不是融合蛋白)到指定孔，通常每個固定肽至少2個孔(即雙份重復(fù)測量)。反應(yīng)2小時后，用PBS洗板3次以去除未結(jié)合的融合蛋白。(5)可以利用本領(lǐng)域已知的各種方法和檢測器檢測GST/PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白與抗生物素蛋白-生物素化肽表面的結(jié)合。在一個實施方式中，板中每孔添加50/xL溶于PBS/BSA的抗GST抗體(例如2.5/ig/mL多克隆山羊抗GST抗體，Pierce)，使其在4。C反應(yīng)20分鐘。用PBS洗板3次，添加第二種可檢測的標(biāo)記抗體。在一個實施方式中，板中每孔添加50piL2.5/ig/mL辣根過氧化酶(HRP)偶聯(lián)的多克隆兔抗山羊免疫球蛋白抗體，使其在4'C反應(yīng)20分鐘。用包含0.2%Tween20的50mMTrispH8.0洗板5次，通過每孔添加100/iLHRP底物溶液(TMB，Dako)，在室溫(RT)20分鐘顯色。通過每孔添加100jaL1M硫酸終止HRP和其底物的反應(yīng)，在450nm讀出板上各孔的光密度(O.D.)。(6)通過對來自PL肽和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽組合的孔中信號與背景信號進行比較，檢測PL肽和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽的特異結(jié)合。背景信號是陰性對照中發(fā)現(xiàn)的信號。典型的特異或者選擇性反應(yīng)至少兩倍于背景信號，更典型的超過5倍于背景信號，和最典型的是IO倍于或者更多倍于背景信號。此外，統(tǒng)計上有顯著意義的反應(yīng)包括多次測量的信號和背景相差至少兩個標(biāo)準(zhǔn)誤差的反應(yīng)，更典型的是4個標(biāo)準(zhǔn)誤差，和最典型的是6個或者更多個標(biāo)準(zhǔn)誤差。相應(yīng)地，比較信號的重復(fù)測定與背景的重復(fù)測定的統(tǒng)計檢驗(例如T-檢驗)將得出p值0.05，更典型的是p值〈0.01，和最典型的是p值O.OOl或者更低。如所述，在"A"分析的實施方式中，來自GST/PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白與未接觸(即未被覆蓋)PL肽的抗生物素蛋白表面相結(jié)合的信號是一個合適的陰性對照(有時稱為"B")。來自單獨GST多肽(即不是融合蛋白)與已經(jīng)接觸(即被覆蓋)PL肽的包被抗生物素蛋白的表面相結(jié)合的信號是第二種合適的陰性對照(有時稱為"B2")。因為所有的檢測都進行多次(即至少兩次)，用幾次檢測的算術(shù)平均值(或者，相當(dāng)于，'平均)確定結(jié)合，用平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差確定結(jié)合檢測中的概率誤差。'N次檢測的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差等于下列的平方根各檢測值和平均值之間差值的平方和，除以(N)和(N-l)的乘積。因此，在一個實施方式中，通過將特定PL-PDZ組合的平均信號("平均S")和信號的標(biāo)準(zhǔn)誤差("SE")與平均值B1和/或平均值B2進行比較，確定PDZ蛋白與板結(jié)合PL肽的特異結(jié)合。II."G分析"一利用固定PDZ結(jié)構(gòu)域融合多肽的PDZ配體結(jié)合檢在一方面，本發(fā)明提供一種檢測法，其中GST/PDZ融合蛋白被固定在表面上("G"分析)。然后測量標(biāo)記PL肽(例如圖3a-e中所列那些中的一種)與該表面的結(jié)合。在一個優(yōu)選的實施方式中，該分析法按下列步驟進行(1)將PDZ結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)合到表面，例如蛋白結(jié)合表面。在一個優(yōu)選的實施方式中，包含一個或多個PDZ結(jié)構(gòu)域的GST/PDZ融合蛋白與聚苯乙烯96孔板結(jié)合。能夠通過任意不同的標(biāo)準(zhǔn)方法將GST/PDZ融合蛋白結(jié)合到板上，盡管需要小心操作使融合蛋白結(jié)合到板的步驟不改變PDZ結(jié)構(gòu)域的配體結(jié)合性質(zhì)。在一個實施方式中，GST/PDZ融合蛋白通過包被在96孔板上的抗GST抗體來結(jié)合。當(dāng)按下列操作時可以實現(xiàn)與板的充分結(jié)合a.聚苯乙烯96孔板(例如，NuncPolysorb)中每孔添加100/iL溶于PBS的5/xg/mL山羊抗GST多克隆抗體(Pierce)，在4°C12小時。b.每孔添加200jliLPBS/BSA，在4'C2小時，對板進行封閉。c.用PBS洗板3次。d.板上每孔添加50pL溶于PBS/BSA的5/xg/mLGST/PDZ融合蛋白或者作為陰性對照的單獨GST多肽(即不是融合蛋白)，在4'C2小時。e.再用PBS洗板3次。(2)通過每孔添加50/iL溶于PBS/BSA的20/iM生物素化的肽溶液，使生物素化的PL肽與表面在4'C反應(yīng)IO分鐘，然后再在25'C孵育20分鐘。用冰冷的PBS洗板3次。(3)可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法和檢測器檢測生物素化的肽與GST/PDZ融合蛋白表面的結(jié)合。在一個示范性步驟中，每孔添加100/xL溶于BSA/PBS的0.5/xg/mL鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合物，在4。C反應(yīng)20分鐘。然后用包含0.2%Tween20的50mMTrispH8.0洗板5次，通過每孔添加100jtiLHRP底物溶液(TMB，Dako)在室溫(RT)20分鐘顯色。通過每孔添加100/iL1M硫酸終止HRP和其底物的反應(yīng)，在450nm處讀出板上各孔的光密度(O.D.)。(4)通過對來自PL肽和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽組合的孔中的信號與背景信號進行比較，確定PL肽和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽的特異結(jié)合。背景信號是陰性對照中發(fā)現(xiàn)的信號。典型的特異性或者選擇性反應(yīng)至少兩倍于背景信號，更典型的超過5倍于背景信號，和最典型的是10倍于或者更多倍于背景信號。此外，統(tǒng)計上有顯著意義的反應(yīng)包括多次測量得到信號和背景相差至少兩個標(biāo)準(zhǔn)誤差的反應(yīng)，更典型的是4個標(biāo)準(zhǔn)誤差，和最典型的是6個或者更多個標(biāo)準(zhǔn)誤差。相應(yīng)地，'比較信號的重復(fù)測定與背景的重復(fù)測定的統(tǒng)計檢驗(例如T-檢驗)將得出p值<0.05，更典型的是p值O.Ol，和最典型的是p值O.OOl或者更低。如所述，在"G"分析的實施方式中，來自給定PL肽與固定的(表面結(jié)合的)單獨GST多肽結(jié)合的信號是合適的陰性對照(有時稱為"B1")。因為所有的測定都進行多次(即至少兩次)，用幾次檢測的算術(shù)平均值(或者，相當(dāng)于，平均)確定結(jié)合，并用平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差確定結(jié)合測定中的概率誤差。N次檢測平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差等于下列的平方根各檢測值和平均值之間差值的平方和，除以(N)和(N-l)的乘積。因此，在一個實施方式中，通過將特定PL-PDZ組合的平均信號("平均S")和信號的標(biāo)準(zhǔn)誤差("SE")與平均值B1進行比較，確定PDZ蛋白與板結(jié)合肽的特異結(jié)合。i)"G'分析"和"G"分析"上文描述的"G分析"特定條件的兩種特定改變尤其有用。改變的分析法使用更少量的標(biāo)記PL肽，并且相對上文描述的特定分析條件，對PDZ配體結(jié)合的檢測的生化要求略有不同。為了方便起見，本章節(jié)描述的分析條件稱為"G'分析"和"G"分析",而在前面章節(jié)中描述的G分析特定條件稱為"&分析"。"G'分析"與"Ge分析"相同，除了步驟(2)中肽濃度是10mM而不是20]hM。這導(dǎo)致檢測親合力較低和/或離解速率較快的相互作用時靈敏度略低。相應(yīng)地，它稍微增加了以下情況的確定性，即被檢測的相互作用具有足夠的親合力和半衰期，從而具有生物學(xué)重要性并且是有用的治療目標(biāo)。"G"分析"與"GG分析"相同，除了步驟(2)中肽濃度是l/xM而不是20/xM，并且在25"C孵育60分鐘(而不是，例如，4°C10分鐘然后是25'C20分鐘)。這導(dǎo)致對親合力低、離解速率快、和/或親合力在25'C比在4'C更低的相互作用的靈敏度較低。如果(我們發(fā)現(xiàn)通常對PDZ配體結(jié)合來說是成立的)反應(yīng)熵是負的(即產(chǎn)物的熵小于反應(yīng)物的熵)，則相互作用在25'C的親合力比在4r時低。相反，在"G"分析"和"GG分析"中，對結(jié)合和離解速率慢的相互作用，PDZ-PL結(jié)合信號可能是相似的，因為PDZ-PL復(fù)合物將在"G"分析"的較長孵育期間積聚。因此"G"分析"和"GG分析"結(jié)果的比較可用于估算不同PDZ-PL相互作用的相對熵、焓和動力學(xué)。(熵和焓通過等式AG-RTln(Kd)=AH-TAS與結(jié)合親合力建立聯(lián)系，其中AG、H和S分別是反應(yīng)自由能、焓和熵，T是凱氏度數(shù)的溫度，R是氣體常數(shù)，Kd是平衡解離常數(shù))。特別是，只能在"G11分析"中檢測到或者在"GQ分析"中檢測更強的相互作用通常在25'C具有快速的離解速率(tl/2"0分鐘)和負反應(yīng)熵，而在"G"分析"中檢測的同樣強的相互作用通常在25'C具有較慢的離解速率(0/2>10分鐘)。PDZ-PL相互作用的熱力學(xué)和動力學(xué)的大致估算(可通過上文概述的"G。分析"相對"G"分析"結(jié)果的比較實現(xiàn))可用于設(shè)計相互作用的有效抑制劑。例如，基于從給定PDZ結(jié)構(gòu)域緩慢解離(通過與"GG分析"相似的"G"分析"中的結(jié)合證明)的PL化學(xué)結(jié)構(gòu)的小分子抑制劑可能自身解離緩慢，因此具有高親合力。'采用這樣的方式，"G分析"步驟(2)溫度和持續(xù)時間的改變可用于了解PDZ配體結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)和熱力學(xué)，并了解該反應(yīng)抑制劑的設(shè)計。本發(fā)明的可檢測標(biāo)記物可以是任意可檢測的化合物或者組合物，它們可以直接或者間接與分子結(jié)合(例如上面描述)。該標(biāo)記物能夠是本身可檢測(例如，放射性同位素標(biāo)記或者熒光標(biāo)記)或者，對酶標(biāo)記物來說，可以催化底物化合物或者組合物可檢測的的化學(xué)變化。優(yōu)選的標(biāo)記物是酶標(biāo)記物，它催化非放射性顯色試劑的變色。有時，標(biāo)記物間接與抗體結(jié)合。技術(shù)人員知道用于間接結(jié)合的不同技術(shù)。例如，抗體可以與生物素結(jié)合，上述任意類型的標(biāo)記物可以與抗生物素蛋白結(jié)合，或者反之亦然(同樣參見上面的"A"和"G"分析)。生物素選擇性結(jié)合到抗生物素蛋白，因此，標(biāo)記物可以用這種間接方式與抗體結(jié)合。參見，Ausubd，上文，對涉及生物素-抗生物素蛋白結(jié)合和相似分析的技術(shù)的綜述。或者，為實現(xiàn)標(biāo)記物與抗體的間接結(jié)合，抗體與小半抗原(例如地高辛)結(jié)合，上述不同類型標(biāo)記物中的一種與抗-半抗原抗體(例如抗-地高辛抗體)結(jié)合。因此，可以實現(xiàn)標(biāo)記物與抗體的間接結(jié)合。分析變化可以包括不同的洗滌步驟。"洗滌"表示將固相暴露于水溶液(通常是緩沖液或者細胞培養(yǎng)基)，以這種方法使未結(jié)合的材料(例如，未粘附細胞，未粘附捕獲劑，未結(jié)合配體，受體，受體構(gòu)建物，細胞裂解產(chǎn)物或者HRP抗體)從中去除。為減少背景噪聲，方便的是在洗滌液中包括去污劑(例如，TritonX)。通常，洗滌后從分析板的孔中倒出水性洗滌液。利用自動化洗滌設(shè)備可以方便地實現(xiàn)洗滌。有時，可能需要幾個洗滌步驟(例如，在大約1到IO個洗滌步驟之間)。PDZ-PL檢測分析中還可以使用不同的緩沖液。例如，不同的阻斷緩沖液可用于降低分析背景。術(shù)語"阻斷緩沖液"是指包含至少一種阻斷化合物的水性pH緩沖溶液，其能夠結(jié)合沒有被包含PL或者PDZ的蛋白包被的基質(zhì)的暴露表面。阻斷化合物通常是蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)，明膠，酪蛋白或者奶粉，并且不與分析中的任何試劑交叉反應(yīng)。阻斷緩沖液的pH通常在大約7到7.5之間，合適的緩沖劑包括磷酸鹽和TRIS。在檢測PDZ-PL相互作用中，可以使用不同的酶-底物組合。酶-底物組合的實例包括，例如(i)辣根過氧化物酶(HRPO)與過氧化氫酶作為底物，其中過氧化氫酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺[OPD]或者3,3',5，5'-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽[TMB])(如上所述)。(ii)堿性磷酸酶(AP)與對-硝基苯磷酸作為生色底物。(^)/3-0-半乳糖苷酶(/30-0^)與生色底物(例如對-硝基苯-/3-0-半乳糖苷酶)或者熒光底物4-甲基傘型酮-P-D-半乳糖苷酶。己有大量的其他酶-底物組合。對于這些組合的總體概述，可參見美國專利4，275,149和4,318,980，這兩篇均在此引入作為參考。下頁的表1和2，列出包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白("PQZ蛋白")和PDZ配體("PL")，此處已經(jīng)鑒定出它們彼此結(jié)合。每個,PL蛋白具有結(jié)合至少一種PDZ蛋白的親合力。表1的第2欄列出PL蛋白來源的流感A蛋白(例如，紅細胞凝集素(HA)，核蛋白(NP)，基質(zhì)(Ml)和非結(jié)構(gòu)蛋白l(NS1));第3欄列出PL模體氨基酸序列；第4欄提供與PL結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白的GenBank識別號(GI號)(該數(shù)據(jù)庫項目在此引入作為參考，包括其中描述的任意注釋)。表1—PDZ-PL的相互作用*<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>PDZ蛋白可以產(chǎn)生為融合蛋白，只要它們包含活性PDZ結(jié)構(gòu)域。例如，已經(jīng)產(chǎn)生了PDZ結(jié)構(gòu)域克隆入載體(PGEX-3X載體)用于產(chǎn)生GST-PDZ融合蛋白(Pharmacia)，并在現(xiàn)有的美國和國際專利申請中有教導(dǎo)，例如，美國專利申請10/485,788(2004年2月3日提交)，國際專利申請PCT/US03/285/28508(2003年9月9日提交)，國際專利申請PCT/USOl/44138(2001年11月9日提交)，在此夷整引入作為參考。V.篩選PDZ蛋白篩選方法可以包括利用已知的用于序列分析和/或結(jié)構(gòu)域分析的任意計算機程序，使用序列分析鑒定PDZ結(jié)構(gòu)域。一旦鑒定出PDZ蛋白，可以篩選其與流感PL蛋白相互作用的能力。PDZ蛋白或者PDZ結(jié)構(gòu)域多肽是包含PDZ結(jié)構(gòu)域的任何蛋白。任意包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白，無論是天然、重組、嵌合或者片段，都可篩選其結(jié)合流感PL結(jié)構(gòu)域的能力。美國專利申請10/485,788(2004年2月3日提交)，國際專利申請PCT/US03/285/28508(2003年9月9日提交)，國際專利申請PCT/US01/44138(2001年11月9日提交)給出了PDZ結(jié)構(gòu)域的鑒定方法，在此完整引入作為參考。VI.篩選其他PL結(jié)合劑適于在診斷分析中使用的PL結(jié)合劑包括特異結(jié)合一種或者多種PL模體的任意試劑。利用在篩選抗病毒劑方法中公開的相同方法能夠鑒定這樣的試劑。例如，利用包含PL模體的蛋白能夠鑒定該試劑。利用任意類型的文庫，例如包括表達文庫和小分子文庫，能夠鑒定待測化合物。用于篩選治療劑或者治療先導(dǎo)物的待測化合物的優(yōu)選來源是噬菌體展示文庫。參見，例如，Devlin,W091/18980;Key,B.K.，等人編著,PhageDisplayofPeptidesandProteins,ALaboratoryManual,AcademicPress,SanDiego,CA，1996。噬菌體展示是一種強大的技術(shù)，使人能夠從包含108-109個不同序列的文庫中，使用噬菌體遺傳學(xué)選擇和擴增具有所需特征的肽或者蛋白?？梢詫⑽膸煸O(shè)計為氨基酸序列在所需位置的選擇性上色(variegation)，使得文庫對所需特征偏好。設(shè)計文庫使肽表達為與噬菌體表面呈現(xiàn)的蛋白融合。挑選具有所需特征的噬菌體展示肽，能夠再生長進行擴增。因為肽是通過噬菌體的增殖擴增的，可以方便地測序所選噬菌體的DNA，從而促進所選肽的快速分析。通過篩選特異結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白和/或NS1PL的噬菌體，能夠挑選出編碼肽抑制劑的噬菌體。產(chǎn)生與蛋白融合的文庫，例如表達在噬菌體表面的基因II。文庫可以由不同長度的、線性的或者通過包含兩個Cys氨基酸進行限制的肽組成，與噬菌體蛋白融合或者還可以融合到其他作為支架的蛋白。還可以設(shè)計文庫偏好此處公開的PL區(qū)或者偏好從初始文庫篩選的結(jié)合噬菌體得到的肽序列，所述初始文庫提供其他的分析抑制劑化合物。VII.用于診斷和治療用途的抗體本發(fā)明的NSl,NSlPL,PDZ和PDZPL結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽可用于產(chǎn)生在診斷和治療中使用的抗體。抗體可以是多克隆抗體、不同的單克隆抗體或者具有不同表位特異性的集合單克隆抗體。采用依據(jù)抗體類型的標(biāo)準(zhǔn)方法，單克隆抗體由包含抗原的蛋白片段制備(參見，例如，Kohler，等人，Nature,256:495，(1975);和Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratoryManual(C.S.H.P.,NY，1988)Queen等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA86:10029-10033(1989)和WO卯/07861;Dower等人，WO91/17271和McCafferty等人，WO92/01047(每項在此引入作為參考用于所有的目的)。噬菌體展示技術(shù)還可以用于誘變抗體的'CDR區(qū)，所述抗體先前顯示具有與本發(fā)明肽的親合力。一些抗體與存在于NS1或者PDZ蛋白的一種形式而不是其他形式中的抗原表位結(jié)合。例如，一些抗體與NSlC端PL位點內(nèi)的抗原表位結(jié)合。那些結(jié)合特異性NSlPL模體的抗體可被分為NS1PL類-特異抗體。此外，一些抗體與PDZ蛋白的PDZ結(jié)構(gòu)域內(nèi)的抗原表位結(jié)合。一些抗體與例如表1中所示的PDZ多肽特異結(jié)合，而不與其他結(jié)合?？梢约兓贵w，例如，通過與支持物結(jié)合和從其洗脫，所述支持物上結(jié)合有激發(fā)抗體的多肽或者肽。術(shù)語"抗體"或者"免疫球蛋白"用于包括完整的抗體和其結(jié)合片段。通常，片段與作為片段來源的完整抗體競爭與抗原片段的特異結(jié)合，所述抗原片段包括分開的重鏈，輕鏈Fab，F(xiàn)ab'F(ab')2，F(xiàn)abc和Fv。通過重組DNA技術(shù)或者通過酶或者化學(xué)分離完整的免疫球蛋白來產(chǎn)生片段。術(shù)語"抗體"還包括一種或者多種免疫球蛋白鏈，該免疫球蛋白鏈與其他蛋白化學(xué)結(jié)合，或者與其他蛋白表達為融合蛋白。術(shù)語"抗體"還包括雙特異性(bispecific)抗體。雙特異性或者雙功能抗體是一種人工雜交抗體，具有兩個不同的重/輕鏈對和兩個不同的結(jié)合位點?？梢酝ㄟ^各種方法包括雜交瘤融合或者Fab'片段連接產(chǎn)生雙特異性抗體。參見，例如，Songsivilai&Lachmann，Clin.Exp.Immunol,79:315-321(1990);Kostelny等人，J.Immunol.148，1547-1553(1992)?？贵w可以用作流感A感染和其亞型，尤其是禽流感A感染的預(yù)測和診斷的試劑(例如，在預(yù)包裝的試劑盒中)?？梢杂酶鞣N方法預(yù)測和診斷流感A感染。A.泛反應(yīng)性(Pan-reactive)抗體泛皿性或者泛特異性(pan-specific)抗體是單克隆或者多克隆抗體，它們與任意和所有的流感A病毒NS1蛋白結(jié)合，或者，與超過3種流感NS1蛋白結(jié)合，或者更優(yōu)選的超過5種。優(yōu)選，泛反應(yīng)性或者泛特異性抗體識別至少下列3種流感A株H5N1，H3N2和H1N1。泛反應(yīng)性抗體可用于鑒定流感A病毒的存在但不能鑒定它是何種亞型。因此，泛皿性單克隆抗體可以特異識別NS1蛋白的保守區(qū)，或者可以識別兩種或更多種NS1蛋白或者特異NS1PL類的PL區(qū)。優(yōu)選的NS1蛋白的保守區(qū)例如可以在RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)，在國家生物技術(shù)信息中心(theNationalCenterforBiotechnologyInformation)的網(wǎng)址上顯示為NCBIIVNS1ABP。然而，已經(jīng)顯示的PL區(qū)在病毒亞型之間是不同的，有可能鑒定出結(jié)合NS1區(qū)超過一種PL的單克隆抗體。但是，泛反應(yīng)性抗體的其他實施方式包括多克隆抗體和/或單克隆抗體的混合物，其作為一個整體來看能夠鑒定全部或者很多流感A病毒。這些抗體能夠識別NS1蛋白的保守或者非保守區(qū)。如果抗體識別NS1PL區(qū)，抗體混合物優(yōu)選識別還包含PL區(qū)的NS1:ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3)，ESKV(SEQIDNO:4),TSEV(SEQIDNO:5),GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:IO),NICI(SEQIDNO:ll),TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQIDNO:13),DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18)，SEV，SEI,SKV和SKI。如果使用超過一種抗體和/或PDZ蛋白，PDZ蛋白優(yōu)選是至少一種選自表1或者2的蛋白，并且抗體優(yōu)選模擬至少一種PDZ蛋白。。B.PDZ蛋白的單克隆抗體替代品(surrogates)如上面和實施例中所示，存在多種識別并結(jié)合NS1蛋白上PL模體的PDZ蛋白。識別相同模體的抗體也可以用作這些PDZ蛋白的替代品。優(yōu)選，PDZ蛋白是下列的一種外膜蛋白，PSD95(PDZ#2);PSD95(PDZ#1,2,3);DLGl(PDZ#1);DLGl(PDZ#1,2);DLGl(PDZ#2);DLG2(PDZ#1);DLG2(PDZ#2);Magi3(PDZ#1);PTN3(PDZ#1);MAST2(PDZ#1);NeDLG(PDZ#1，2);Shankldl;Shank2dl;Shank3dl;Syntrophinla;Syntrophin化Magil(PDZ#1);Magil(PDZ#4);Tipl;PTPLl(PDZ#1);Mint3(PDZ#1);LymMystique(PDZ#1);DLG2(PDZ#3);MUPPl(PDZ#8);NeDLG(PDZ#1);DLG5(PDZ#1);PSD95(PDZ#1);NumBP(PDZ#3);LIMK1(PDZ#1);KIAA0313;DLGl(PDZ#2);Syntenin(PDZ弁2);Pickl或者類似物或者片段。更優(yōu)選，抗體模擬特異識別PLESEV(SEQIDNO:2)的任意PDZ蛋白。識別特異NS1PL模體的抗體替代品可命名為NS1PL類別-特異的。C.抗體和其他結(jié)合劑的混合物抗體和PDZ蛋白(和/或適配體)的混合物可用于任何分析。PDZ蛋白和抗體可以用于NS1不同亞型的鑒定，流感A病毒的鑒定，鑒別出與較低致病形式比較的致病形式。在一些分析中，混合抗體和PDZ蛋白，共同施用于一個樣本。在其他分析中，抗體和PDZ蛋白是分離的，以便結(jié)合不同的樣本以鑒定兩個不同的亞型或者對亞型的鑒定進行確認(rèn)。VIII.適配體適藍體是在體外從大量隨機序列種群選擇的RNA或者DNA分子，通過形成結(jié)合袋(bindingpockets)識別特異的配體。變構(gòu)核糖酶是RNA酶，其活性通過效應(yīng)子分子與適顯體結(jié)構(gòu)域的結(jié)合而調(diào)節(jié)，所述適愿體結(jié)構(gòu)域位于活性位點外。這些RNA作為精確的分子開關(guān)，受特異效應(yīng)子存在或者缺失的控制。適藍體能夠結(jié)合核酸，蛋白，甚至完整的生物體。適藍體不同于抗體，然而它們模擬抗體在各種診斷形式中的性質(zhì)。因此，適M體可以用于替代抗體和/或PDZ蛋白，或者與抗體和/或PDZ蛋白聯(lián)用，鑒定一般和特異NS1PL區(qū)的存在。IX.NS2序列和致病性的相關(guān)性流感A的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2都是由相同基因利用不同的剪接產(chǎn)生的。發(fā)生的剪接類型導(dǎo)致NS1和NS2蛋白羧基末端的差異。就NS1來說，這導(dǎo)致羧基末端特殊的PL，而NS2在C端沒有PL。因為NS1中PL區(qū)的特異序列能與致病性有關(guān)，對NS2蛋白的變化分析任意類型的相關(guān)性。分析致病株中由剪接產(chǎn)生的NS2序列，與那些不具有致病性比較進行分析。表12和13在蛋白水平和核苷酸水平對序列進行了分析。這些表顯示70位的甘氨酸到絲氨酸的取代與病毒的致病性和/或毒性高度相關(guān)，特別是關(guān)于1918年大流行的H1N1株。利用H5N1株描述了示范性的NS2序列，如國家生物技術(shù)信息中心(wWw.ncbi.gov)所述，例如AF144307，并且當(dāng)序列最大限度地比對時，并且對相應(yīng)的其他NS2蛋白進行氨基酸和編碼氨基酸密碼子的編號。因為這種相關(guān)性，鑒定出一種方法，該方法利用NS2在Ser70處的多態(tài)性作為單獨的試驗來分析一種給定的流感八株是否是致病性的。該方法還可用于鑒定特異流感株?；蛘撸琋S2多態(tài)性可以和此處公開的NS1試驗聯(lián)用，鑒定致病性或者確認(rèn)以不同方法鑒定的致病性。篩選NS2蛋白中Ser70序列變化的方法包括鑒定蛋白水平或者核苷酸水平變化的方法。1.基于蛋白的診斷試驗本發(fā)明提供基于蛋白的診斷試驗，以鑒定包括Ser70的NS2蛋白的存在，用于鑒定流感A病毒、流感A病毒株和致病性的流感A病毒株。利用NS2中Ser70多態(tài)性序列的診斷試驗可以使用與NS1分析中相同的形式(參見章節(jié)vni和其他相關(guān)的章節(jié))。該試驗鑒定位置70處絲氨酸的存在，如果絲氨酸存在，鑒定流感株為致病性的。如果絲氨酸不存在，則鑒定流感株為非致病性的。識別NS2蛋白中絲氨酸70變化的單克隆或者多克隆抗體可用于鑒定一種流感株為流感A，能夠鑒定特異流感A株，并且能夠鑒定一種病毒是否是致病性的。可以產(chǎn)生NS2抗體以識別絲氨酸70的存在，并可用于鑒定致病性的株。例如，能夠利用表12或者13中提供的肽產(chǎn)生抗體，所述抗體針對70位具有絲氨酸的NS2區(qū)。然后篩選絲氨酸70抗體以確定它們是否與70位具有甘氨酸或者其他氨基酸的肽發(fā)生交叉反應(yīng)?；蛘?，可以產(chǎn)生針對各病毒株識別包括絲氨酸70的特異序列的抗體，產(chǎn)生株-特異抗體(還可參見為NS1抗體提供的章節(jié)VIII)。在一些試驗中，抗體用于鑒定一種病毒株為致病性的。在一些試驗中，NS2抗體可代替NS1抗體。在一些試驗中，NS2抗體與NS1抗體在任何使用NS1蛋白的試驗中聯(lián)用。NS2抗體可用于鑒定特異性流感A病毒，鑒定一種病毒為流感A病毒，或者鑒定一種病毒是致病性的?；蛘?，其他結(jié)合劑可用于替代抗體，例如通過噬菌體展示文庫技術(shù)選擇的肽。2.核酸診斷試驗本發(fā)明還提供基于核酸的診斷試驗，以鑒定編碼包括Ser70的蛋白的NS2核酸的存在。這些試驗可以用于鑒定流感A病毒，流感A病毒株，和致病性的流感A病毒株。該診斷試驗使用一種序列，該序列包括在各種形式的NS2中編碼Ser70的密碼子。例如，該診斷試驗可以使用與編碼Ser70序列互補的探針或者引物。優(yōu)選，使用編碼表12中鑒定的肽的序列。如果絲氨酸70被鑒定為存在，則鑒定流感病毒為致病性的。檢測NS2中多態(tài)性的方法。能夠通過幾種方法確定樣本中堿基的同一性，所述堿基占據(jù)NS2核酸的包括表12所示Ser-70的序列，所述方法依次進行描述。A.單堿基延伸方法例如，US5,846,710，US6,004,744,US5，888，819和US5,856,092描述了單堿基延伸方法。簡單來說，該方法通過與靶序列S補的引物雜交起作用，使得引物的3'端立即緊鄰但不跨越靶序列的潛在變異位點。也就是說，該引物包括耙多核苷酸互補序列的子序列，所述子序列終止在緊鄰多態(tài)性位點5'端的堿基。雜交在一種或者多種標(biāo)記核苷酸存在的條件下進行，所述標(biāo)記核苷酸與可能占據(jù)潛在變異位點的堿基互補。例如，對于編碼NS2Ser70多態(tài)性的序列，可以使用一種或者多種標(biāo)記的核苷酸引物。針對各多態(tài)性的引物能夠包括不同的標(biāo)記以區(qū)分多態(tài)性。優(yōu)選，引物重疊或者部分編碼剪接位點。這表示剪接位點或者多態(tài)性區(qū)域的一些部分包含在引物中，優(yōu)選Ser70位點。在一些方法中，尤其是使用多重差異標(biāo)記的核苷酸的方法中，核苷酸是雙脫氧核苷酸。如果存在與占據(jù)靶序列中變異位點的堿基互補的核苷酸，則在允許引物延伸的條件下進行雜交。延伸合并標(biāo)記的核苷酸，從而產(chǎn)生標(biāo)記的延伸引物。如果使用多重差異標(biāo)記的核苷酸并且目標(biāo)是雜合體，則可以獲得多重差異標(biāo)記的延伸引物。檢測延伸的引物，提供指示哪些堿基占據(jù)目標(biāo)多核苷酸中的變異位點。B.等位基因-特異性探針例如Saiki等人(Nature324,163-166(1986);Dattagupta，EP235,726，Saiki,WO89/11548描述了用于分析多態(tài)性的Mit的設(shè)計和使用。利用該公開的內(nèi)容，可以將探針設(shè)計為識別包括Ser70多態(tài)性的特定序列，所述特定序列與一種類型病毒或者病毒株的靶DNA片段雜交，而不與其他類型病毒或者病毒株的相應(yīng)片段雜交，這是由于兩種病毒中各自片段中存在的不同多態(tài)性形式造成的。雜交條件應(yīng)該足夠嚴(yán)謹(jǐn)，使Ser70區(qū)的等位基因之間的雜交強度存在顯著差異，優(yōu)選基本二元的反應(yīng)(binaryresponse)，其中探針只與一種等位基因雜交。一些探針設(shè)計為與靶DNA的片段雜交，使得Ser70的多態(tài)性位點對準(zhǔn)探針的中心位置(例如，15mer中的第7位；16mer中的第8或者9位)。這種探針設(shè)計實現(xiàn)了來自不同病毒和/或株的編碼NS2蛋白的不同核酸之間雜交的良好區(qū)分。這些探針經(jīng)常成對使用，對子中的一個成員表現(xiàn)出與耙序列的一種參照形式完全匹配，而另一成員表現(xiàn)出與變異體形式或者不同的參照形式完全匹配。然后可以將幾對探針固定在相同的支持物上，用于相同靶序列內(nèi)多重多態(tài)性的同時分析。還可以通過與核酸陣列雜交鑒別多態(tài)性，W095/11995描述了其中的一些實例(在此完整引入作為參考用于所有目的)。C.等位基因特異的擴增方法等位基因-特異性引物與靶DNA中重疊多態(tài)性的位點雜交，并且引物只擴增與引物表現(xiàn)出完全互補的等位基因形成。參見Gibbs，NucleicAcidRes.17,2427-2448(1989)。這種引物與在遠端位點雜交的第二引物聯(lián)用。擴增起始于兩個引物，產(chǎn)生可檢測的產(chǎn)物，提示存在特異的等位基因形式。通常用第二對引物作為對照，其中一個在多態(tài)性位點顯示單個堿基錯配，另一個顯示與遠端位點的完全互補。單堿基錯配阻止擴增，沒有形成可檢測的產(chǎn)物。在一些方法寧，錯配包括在與多態(tài)性相關(guān)的寡核苷酸的3'-端位置，因為這個位置對于從引物延長是最不穩(wěn)定的。參見，例如，WO93/22456。在這種情況下，可以將等位基因特異引物設(shè)計為與NS2的剪接位點重疊，包括Ser70位置。D.直接測序本發(fā)明NS2多態(tài)性序列的直接分析可以利用雙脫氧鏈終止法或者Maxam-Gilbert方法實現(xiàn)(參見Sambrook等人，MolecularCloning,ALaboratoryManual(第二版，CSHP,NewYork1989);Zyskind等人，RecombinantDNALaboratoryManual,(Acad.Press,1988))。)E.變性梯度凝膠電泳利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物可以利用變性梯度凝膠電泳進行分析。根據(jù)DNA在溶液中序列依賴性的不同熔解性質(zhì)和電泳遷移，可以鑒定NS2Ser70多態(tài)性的不同等位基因。Erlich編著，PCRTechnology,PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification,(W.H.FreemanandCo,NewYork,1992),Chapter7。F.單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析耙序列的等位基因可以利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析進行區(qū)分，所述單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析通過單鏈PCR產(chǎn)物電泳遷移的變化鑒定堿基差異，如Orita等人描述，Pro"Nat.Acad.Sci.86，2766-2770(1989)。如上所述能夠產(chǎn)生擴增的PCR產(chǎn)物，加熱或者變性，形成單鏈擴增產(chǎn)物。單鏈核酸可以重新折疊或形成部分取決于堿基序列的二級結(jié)構(gòu)。單鏈擴增產(chǎn)物不同的電泳遷移率可能與靶序列等位基因之間的堿基序列差異相關(guān)。3.NS2治療劑一此處公開的篩針對NSl和PDZ蛋白的抗病毒治療劑和篩選抗病毒治療劑的方法同樣可以用于鑒定NS2的結(jié)合伴侶，鑒定阻斷NS2和結(jié)合伴侶之間相互作用的治療劑，和治療毒性流感A感染的患者。(參見章節(jié)XI藥物組合物)。鑒定針對NS2的治療劑的靶標(biāo)包括，在包含Ser70的重疊區(qū)阻斷結(jié)合伴侶和NS2相互作用的試劑，阻斷NS2PL(內(nèi)部位點)和PDZ結(jié)合伴侶之間相互作用的試劑，和磷酸化Ser70的絲氨酸激酶，導(dǎo)致抑制相互作用。X.診斷試驗本發(fā)明的實施方式提供診斷捕獲劑和檢測劑，它們可用于在各種不同類型的生物樣本中鑒定流感A病毒和其產(chǎn)物的檢測法。可用于檢測流感病毒的代表性試驗形式包括酶聯(lián)固相吸附試驗，放射性標(biāo)記結(jié)合試驗，PDZ-和PL-結(jié)合試驗，時間分辨PDZ和PL熒光試驗，以及，夾心和酶-級聯(lián)試驗形式。示例性的方法，可以從免疫測定領(lǐng)域用于該試驗的方法修改，包括均相和多相試驗形式；競爭性和非競爭性試驗形式；酶連接固相試驗形式，熒光試驗形式，時間分辨熒光試驗形式，生物發(fā)光試驗形式，級聯(lián)酶試驗等等。在本發(fā)明的某些實施方式中，一種或者多種PDZ蛋白被用作捕獲劑從生物樣本分離一種或者多種PL分析物。在其它可選的實施方式中，一種或者多種PDZ蛋白與一種或者多種信號發(fā)生化合物結(jié)合，用作鑒定生物樣本中一種或者多種PL分析物的存在或者量的檢測劑。在其他實施方式中，PL蛋白和PL肽與信號發(fā)生化合物(PL-SGC)結(jié)合，用于競爭性配體抑制試驗，即，其中病毒PL的存在與一種或者多種PL-SGC競爭與PDZ的結(jié)合。優(yōu)選，PDZ蛋白是下列至少一種外膜蛋白，PSD95(PDZ#2);PSD95(PDZ#1,2,3);DLG1(PDZ#1);DLG1(PDZ#1,2);DLG1(PDZ#2);DLG2(PDZ#1);DLG2(PDZ#2);Magi3(PDZ#1);PTN3(PDZ#1);MAST2(PDZ#1);NeDLG(PDZ#1,2);Shankldl;Shank2dl;Shank3dl;Syntrophinla;Syntrophin化Magil(PDZ#1);Magil(PDZ#4);Tipl;PTPL1(PDZ#1);Mint3(PDZ#1);LymMystique(PDZ#1);DLG2(PDZ#3);MUPPl(PDZ#8);NeDLG(PDZ#1);DLG5(PDZ#1);PSD95(PDZ#1);NumBP(PDZ#3);LIMK1(PDZ弁l);KIAA0313;DLGl(PDZ#2);Syntenin(PDZ#2);Pickl或者類似物或者片段。對那些常規(guī)鑒定流感A的試驗，可以使用PDZ蛋白和抗體的混合物。對于這些試驗，PDZ蛋白可能包括將上述一種蛋白與識別其他病原體特異的或者流感A特異的PL模體的其他蛋白混合。本發(fā)明提供檢測樣本中病原體PL蛋白的方法，并發(fā)現(xiàn)其在診斷對象病毒感染中的用途。在許多實施方式中，從受試者處獲得生物樣本,檢測樣本中病原體PL蛋白的存在。樣本中可檢測量的病原體PL蛋白的存在表明個體感染了特定病毒。在其他實施方式中，檢測生物樣本中病原體PL蛋白的水平，與樣本中的對照量進行比較。樣本中病原體PL蛋白的相對量指示病原體感染的嚴(yán)重性。該方法通常包括對流感APL蛋白特異的兩種結(jié)合伴侶，其中一個是如上所述的PDZ結(jié)構(gòu)域多肽。通常，該方法包括a)利用結(jié)合伴侶之一從樣本分離病原體PL，和b)用另一種結(jié)合伴侶檢測病原體PL蛋白。對亞型特異性試驗或者NS1PL類別特異性試驗，待鑒定的PL優(yōu)選是下面一種ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4),TSEV(SEQIDNO:5),GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10),NICI(SEQIDNO:ll),TICI(SEQIDNO:12)'RICI(SEQIDNO:13),DMAL(SEQIDNO:14)，DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17)，SICL(SEQIDNO:18),SEV，SEI，SKV和SKI。對亞型特異性試驗，使用的PDZ蛋白優(yōu)選是下面的至少—種PSD95(PDZ#2);PSD95(PDZ#1,2,3);DLG1(PDZ#1);DLG1(PDZ弁1,2);DLG1(PDZ弁2);DLG2(PDZ弁l);DLG2(PDZ#2);Magi3(PDZ#1);PTN3(PDZ#1);MAST2(PDZ#1);NeDLG(PDZ#1，2);Shankldl;Shank2dl;Shank3dl—;Syntrophinla;Syntrophinyl;Magil(PDZ#1);Magil(PDZ糾)；Tipl;PTPLl(PDZ#1);Mint3(PDZ#1);LymMystique(PDZ#1);DLG2(PDZ#3);MUPPl(PDZ#8);NeDLG(PDZ#1);DLG5(PDZ#1);PSD95(PDZ#1);NumBP(PDZ#3);LIMK1(PDZ#1);KIAA0313;DLG1(PDZ#2);Syntenin(PDZ#2);Pickl或者類似物或者片段。NSIPL可以高度預(yù)測病毒的H和A抗原和亞型。對病原體特異性試驗，待鑒定的NS1PL優(yōu)選是下面的至少一種ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3)，ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6)，RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8)，GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11)，TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQNO:13),DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15),DI^JL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17)，SICL(SEQIDNO:18),SEV，SEI,SKV和SKI。對病原體特異性試驗，使用的PDZ蛋白優(yōu)選是選自表l或者2中的至少一種或者類似物或者片段。對流感A特異性試驗，待鑒定的NS1PL優(yōu)選是下面的至少一種ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3)，ESKV(SEQIDNO:4),TSEV(SEQIDNO:5),GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8)，GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQIDNO:13)，DMAL(SEQIDNO:14)，畫TL(SEQIDNO:15),DIAL(SEQIDNO:16)，DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18)，SEV，SEI,SKV和SKI。對病原體特異性試驗，使用的PDZ蛋白優(yōu)選是選自表1或者2中的至少一種或者類似物或者片段。A.ELISA夾心多相分析形式如下面實施例部分所述，利用該PDZ捕獲和單克隆抗NS1，構(gòu)建檢測生物樣本中高危流感A株的夾心分析形式。當(dāng)前皿的靈敏度范圍在l-l，000ng/ml之間即，對商業(yè)用于檢測生物樣本中流感A病毒類型或者量具有足夠的靈敏度，注意下列告誡艮口，a)免疫測定法能夠區(qū)別流感AH5N1，H1N1和H3N2株的NS1蛋白；b)不同分析形式的交叉反應(yīng)模式不同，并還取決于待檢測的特定流感A株，以及，包含細胞裂解產(chǎn)物的生物樣本中的絕對靈敏度；和，c)在診斷設(shè)備領(lǐng)域中確定不同分析形式的檢測限現(xiàn)在是相對常規(guī)的。盡管可以確定可能用于本方法的各種競爭性和非競爭性分析形式，但現(xiàn)在優(yōu)選是夾心分析形式，因為已經(jīng)證明這些分析具有性能特征和各種良好建立的(wellestablished)信號放大策略。在當(dāng)前優(yōu)選的夾心免疫測定實施方式中，使用特異的高親合力非天然PDZ蛋白捕獲生物樣本中的天然病毒NS1抗原；用抗NS1小鼠單克隆抗體檢測結(jié)合的NS1抗原；和，利用信號發(fā)生化合物檢測結(jié)合的抗NS1抗體的存在，例如用偶聯(lián)酶的第二抗體(例如，偶聯(lián)辣根過氧化物酶的抗體；HRP)或者生物素化的第二抗體和鏈霉親和素-酶偶聯(lián)物(例如，HRP)。通常，本發(fā)明的方法包括以下步驟(i)利用第一結(jié)合劑即捕獲劑，從復(fù)雜生物樣本中分離(separating)(即，分離(isolating))天然病毒PL蛋白分析物；和，(ii)利用第二結(jié)合劑即檢測劑，檢測分離的PL分析物。分離和檢測步驟可以利用結(jié)合伴侶實現(xiàn)，所述結(jié)合伴侶對PL分析物具有不同水平的特異性，例如，如果捕獲劑是高特異性的，則可以要求檢測劑是較低特異性的，反之亦然。在某些實施方式中，捕獲劑優(yōu)選是PDZ結(jié)構(gòu)域多肽。更優(yōu)選，捕獲劑是表l和/或表2所列的一種。在其他實施方式中，第一結(jié)合伴侶是抗病原體PI^蛋白抗體或者抗體的混合物，條件是在這些實施方式中檢測劑的至^一種組分是PDZ多肽，例如，與捕獲/分離的PL分析物結(jié)合并且然后利用偶聯(lián)信號發(fā)生化合物的抗PDZ抗體檢測復(fù)合物中PL分析物的存在的PDZ蛋白檢測劑。在某些當(dāng)前優(yōu)選的實施方式中，直接的或者通過連接子，將PDZ捕獲劑結(jié)合在固相上。例如，在一個非限制性實施例中，PDZ結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)合磁珠。在后面的實施例中，當(dāng)接觸生物樣本時，固定在磁珠上的PDZ捕獲劑能夠與樣本中的流感病毒PL蛋白有效形成PDZ-PL相互作用復(fù)合物。然后，施加磁場，從樣本分離包含結(jié)合的流感病毒PL的相互作用復(fù)合物。在另一個非限制性實施例中，將PDZ結(jié)構(gòu)域多肽捕獲劑固定在微量滴定板的表面上；將包含流感PL的生物樣本與固定的捕獲劑接觸，導(dǎo)致PL與板表面的結(jié)合；用緩沖液洗板，從板上去除非PL病毒分析物；和，因此，固定的PL分析物從生物樣本分離。各種分離(separation)/分離(isolation)方法都是已知的，例如，利用磁場、洗滌等等。采用的特定方法取決于特定的分析形式。例如，可以通過許多不同的方法進行分離，包括但不限于洗滌；磁性方法；離心；過濾；層析法，包括分子篩、離子交換和親合層析；在電場中分離；毛細管作用例如在側(cè)向流測試條中；免測沉淀法；和，下面公開的類似方法。在某些實施方式中，通過將等份的生物樣本接觸測試條的一端，然后讓蛋白在測試條上遷移，例如通過毛細管作用例如側(cè)向流，從生物樣本中的其他病毒和細胞蛋白分離流感PL蛋白。該方法不同于先前的免疫測定法，因為在存在一種或者多種PDZ多肽試劑，抗體，和/或適配體的測定法中，例如，作為捕獲和/或檢測劑，這給予該測定法特異鑒定高危流感A病毒株的存在或者量的能力。該方法不同于先前的免疫測定法，在于以下事實它們鑒定存在于患者樣本中的病毒蛋白，而不是抗體。用于側(cè)向流分離、檢測和定量的方法和裝置是本領(lǐng)域已知的，例如，美國專利號6,942,981，5,569,608;6,297,020;和6,403,383，在此完整引入作為參考。在一個非限制性實施例中，測試條包括用于上樣的近端區(qū)域(上樣區(qū))和包含PDZ多肽捕獲劑和緩沖試劑和添加劑的遠端試驗區(qū)，所述緩沖試劑和添加劑適于遷移生物樣本中PDZ多肽和任意流感PL蛋白之間的結(jié)合相互作用。在其他實施方式中，測試條包括兩個試驗區(qū)域，該區(qū)域包含不同的PDZ結(jié)構(gòu)域多肽，即，每個能夠特異地與不同的流感PL蛋白分析物相互作用。根據(jù)上面公開的方法，從生物樣本中的其他蛋白分離流感PL蛋白分析物，即，采用這種方法使樣本中的分析物適合于檢測和/或定量。，利用PDZ多肽、偶聯(lián)信號發(fā)生化合物的PDZ多肽、抗體、適配體等等，本發(fā)明的實施方式提供檢測分離的流感PL蛋白的新方法。根據(jù)其他實施方式，利用對病原體PL蛋白特異的抗體，例如偶聯(lián)信號發(fā)生化合物的抗體，檢測與PDZ捕獲劑、抗體和/或適配體結(jié)合的流感PL分析物。當(dāng)然，各種檢測方法是診斷領(lǐng)域己知的，并且本(非限制性)公開的目的不是為了闡明所有可選的公知方法。而是，本公開是為了滿足闡明實施本發(fā)明最佳方式的要求，并作為可選方法的綜合參考指導(dǎo)。在某些實施方式中，在均相分析形式中，即，無需分離步驟，用偶聯(lián)了SGC(信號發(fā)生化合物)的PDZ結(jié)構(gòu)域檢測樣本中病原體PL蛋白分析物的存在。在該分析中，PL與PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)合誘導(dǎo)SGC產(chǎn)生信號的變化，例如，熒光各向異性的變化。-在其他實施方式中，多相固相檢測模型(上文公開)可用于檢測生物樣本中的流感PL分析物。如上文背景部分所述，PDZ蛋白與包含PL的細胞蛋白結(jié)合。同樣地，在感染細胞中，包含PL的流感病毒蛋白與宿主細胞的PDZ蛋白結(jié)合。盡管通常預(yù)期這些相互作用將在診斷分析形式中競爭結(jié)合，但在此還提供以下指導(dǎo)，即出乎意料地，這些后來天然相互作用的親合力和質(zhì)量平衡是非常弱的，或者在去污劑提取的細胞裂解產(chǎn)物中是被充分破壞的，或在該診斷分析形式中流感PL分析物是可檢測的。因此，在存在的去污劑例如Tween-20或者TritonX100小于約0.5%的條件下；優(yōu)選，小于約0.2%;和，最優(yōu)選，于大約0.1%的條件下，可以制備和測定裂解產(chǎn)物。在某些實施方式中，樣本中病毒PL蛋白的水平可以被定量和/或與對照進行比較。合適的陰性對照樣本例如從已知是健康的個體獲得，例如，已知沒有流感病毒感染的個體。特異性對照可以從已知患有流感B感染的個體，或者感染較低毒性流感株，例如，H1N1、H3N2等等的個體收集。對照樣品可以來自與待測對象有遺傳關(guān)系的個體，但還可以來自遺傳無關(guān)的個體。合適的陰性對照樣本還可能是來自個體在感染早期的收集的樣本，即，時間點比取得待測樣本的時間點早。本發(fā)明的實施方式還包括非感染性陽性對照，即，具有高危流感A病毒PL的氨基酸序列的重組蛋白。.初始Western印跡，(參見下面的實施例部分)，顯示生物樣本中NS1水平足以允許在各種不同的可行免疫分析形式中檢測這些抗原。但是，應(yīng)證明特定生物樣本中的NS1水平對于在特定免疫分析形式中檢測是有限的，然后，作為另一種選擇性的實施方式，通過體外感染細胞來擴增生物樣本中的活病毒，即，病毒擴增樣本中的NS1蛋白應(yīng)該在大約6小時到大約12小時內(nèi)可以檢測到。在其它的選擇性實施方式中，用于提高生物樣本和病毒擴增樣本中NS1抗原收率的方法包括利用蛋白酶抑制劑和蛋白酶體抑制劑，例如MG132。B.試劑的制備PL肽，PDZ結(jié)構(gòu)域多肽，和適配體可以通過本領(lǐng)域己知的合成(即，利用設(shè)備)或者利用重組方法制備。例如，用于重組蛋白表達的方法和條件是本領(lǐng)域公知的，例如，參見Sambrook，上文，和Ausubel，上文。Wi畫cker"FromGenestoClones,VCHPublishers,N.Y.，N.Y.,1987";和Ausubel,上文，綜合討論了利用哺乳動物組織細胞培養(yǎng)表達多肽的用途。2003年7月29日提交的美國專利申請序列號10/630,590和公布為US20040018487和美國專利序列號6,942,981中也公開了結(jié)合分析的細節(jié)?；诩毎姆治鐾ǔ０ɡ弥亟M表達系統(tǒng)，共同產(chǎn)生(即，在相同細胞內(nèi)產(chǎn)生，不管它們產(chǎn)生的時間)該PDZ結(jié)構(gòu)域多肽和流感PL。用于在真核細胞中產(chǎn)生該多肽的合適細胞公開在下面的實施例部分。有可能適于表達該PDZ結(jié)構(gòu)域多肽和流感PL的細胞類型包括下列例如，猴腎細胞(COS細胞),SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVI細胞(COS-7，ATCCCRL1651);人胚腎細胞(HEK-293,Graham等人，J.GenVirol.36:59(1977));HEK-293T細胞；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細胞(CHO，Urlaub禾HChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77:4216，(1980);小鼠塞爾托利細胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴腎細胞(CVIATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA,ATCCCCL2);犬腎細胞(MDCK，ATCCCCL34);布法羅大鼠肝細胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺細胞(W138，ATCCCCL75);人肝細胞(hepG2，HB8065);小鼠乳腺瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI細胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci383:44-68(1982》;NIH/3T3細胞(ATCCCRL-1658);和小鼠L細胞(ATCCCCL-I)。其他的細胞系將是顯而易見的。各種各樣的細胞可得自美國典型微生物菌種保藏中心(mericanTypeCultureCollection)，10801UniversityBoulevard,Manassas,Va.20110-2209。C.樣本制備可以使用包含可檢測濃度的流感蛋白并優(yōu)選NS1的任意樣本?？墒褂脴颖镜膶嵗?，例如，肺滲出液，細胞提取物(呼吸器官，鼻內(nèi)上皮層)，血液，粘液，和鼻拭子。此處顯示，在豬和人的鼻拭子中能夠發(fā)現(xiàn)非常高濃度的NS1。這是令人驚奇的，因為NSl被認(rèn)為是一種胞內(nèi)蛋白。因此，優(yōu)選的用于NS1鑒定的樣本是鼻分泌物。實施例中顯示了PL蛋白與PDZ蛋白和域抗體的結(jié)合，該結(jié)合在高達0.05。/。SDS的存在下發(fā)生，包括0.03%和0.01%。因此，當(dāng)鼻或者其他身體分泌物不可能容易地用于側(cè)向流形式時，它可以用SDS處理。優(yōu)選，添加的SDS的量直到最終濃度為0.01%，更優(yōu)選為0.03%,甚至更優(yōu)選為0.05%?？梢允褂闷渌桓蓴_PDZ蛋白、抗體或者適體或者其他試劑與PL蛋白結(jié)合的去污劑和類似物?？梢允褂貌桓蓴_蛋白/蛋白相互作用的其他樣品處理方法，包括用緩沖液或者水稀釋。D.單獨或者聯(lián)用常規(guī)流感A試驗,該試驗鑒定樣本中流感A的存在。因此，該試驗可以使用利用抗體或者適配體等鑒定NS1保守區(qū)域存在的方法。優(yōu)選，單一單克隆抗體或者單一適配體鑒定全部NS1的變異體。當(dāng)利用識別NS1蛋白保守區(qū)域的抗體時，這是非?？赡艿摹；蛘撸梢允褂贸^一種抗體和/或適配體和/或PDZ蛋白或者其他結(jié)合劑來鑒定全部流感A亞型。該方法還可以根據(jù)NS1蛋白的存在，使用抗體和PDZ蛋白的混合物來鑒定全部流感A。常規(guī)流感A試驗可以與更特異的試驗聯(lián)用來分型病毒，這些試驗可以順序或者同時進行。如果在該試驗中使用，還可以參見上面用于優(yōu)選的PL區(qū)和PDZ蛋白的泛特異抗體的說明。E.致病性流感A試驗該試驗鑒定具有NS1蛋白PL模體的全部形式的病毒。此處確定了流感A的非致病株具有缺失禽類PL模體的NS1蛋白。因此，特異性鑒定致病性流感A病毒存在的方法可以鑒定包含禽類PL區(qū)的NSl的存在。一種或者多種PDZ蛋白和/或抗體可用于鑒定所有的各種PL區(qū)。例如，如果只使用PDZ蛋白，至少需要兩種PDZ蛋白來鑒定所有的NS1PL蛋白?；蛘撸褂媚軌蜃R別包含PL區(qū)的NS1蛋白的單個抗體。優(yōu)選，待鑒定的NSl的PL區(qū)是下列至少一種ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3)，ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6)，RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8)，GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11)，TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQIDNO:13)，DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17)，SICL(SEQIDNO:18),SEV，SEI，SKV和SKI。優(yōu)選，待鑒定的PL區(qū)是包含禽類PL區(qū)的。優(yōu)選，一種或者多種PDZ蛋白選自表l或者2中的至少一種或者類似物或者活性片段。F.致病性A型禽流感病毒試驗H5N1禽流感的NS1蛋白具有結(jié)合多樣化PDZ結(jié)構(gòu)域的C端序列，所述PDZ結(jié)構(gòu)域不能結(jié)合典型人流感例如H3N2的NS1。77%的禽流感H5N1分離物的NSl蛋白末端是ESEV(SEQIDNO:2)，此夕卜，ESEV(SEQIDNO:2)、ESKV(SEQIDNO:4)和ESEI(SEQIDNO:3)后兩個最常見的C端NS1序列，占禽流感分離物的另外17%,也與PSD-95以高親合力結(jié)合(即分別為45nM和200nM)。H3N2NSl的末端是RSKV(SEQIDNO:8)，該序列與PSD-95結(jié)合的親合力即使有的話也非常低。因此PSD-95可以用作禽流感的檢測劑，并從其他株例如H3N2區(qū)別禽流感。盡管可以使用PSD-95的任意部分，只要其具有PDZ結(jié)構(gòu)域，但PSD-95結(jié)構(gòu)域-l、-2和-3具有不同的結(jié)合特異性和親合力。作為鑒定的一部分，其中PDZ蛋白與禽流感H5N1PLs的親合力最高(參見實施例2和表4a-e)，發(fā)現(xiàn)PSD-95結(jié)構(gòu)域2PDZ結(jié)合的親合力最高。因此，分析中使用的PSD-95PDZ蛋白只需要包括蛋白的一種PDZ結(jié)構(gòu)域，和優(yōu)選包括至少來自結(jié)構(gòu)域2的PDZ或者足以進行特異結(jié)合的其片段。PSD-95PDZ蛋白與樣本接觸。如果該樣本包含致病性流感病毒A，PSD-95PDZ與致病性流感病毒NS1蛋白的PL特異結(jié)合?？梢允褂美鐖D8和11和實施例6所敘述的側(cè)向流形式，利用PDZ捕獲然后是單克隆抗體檢測，檢測禽類NS1PL蛋白。.或者，側(cè)向流形式可以使用單克隆抗體捕獲和PDZ檢測。利用一種寧者多種重組PDZ蛋白作為捕獲劑，沿著膜在特定位置沉積在膜上，可以產(chǎn)生側(cè)向流(參見實施例6)。側(cè)向流結(jié)果的分析可以定性或者定量的。優(yōu)選，使用來自鼻分泌物的患者樣本?？梢灶A(yù)先處理樣本，使其更容易在側(cè)向流形式使用的膜上流動。患者樣本最初可以與偶聯(lián)信號分子的泛反應(yīng)性抗NS1單克隆抗體接觸。用于檢測的單克隆抗體優(yōu)選不與所使用PDZ蛋白相同的抗原表位結(jié)合，而是，代之以結(jié)合全部NS1蛋白共有的分離抗原表位。如果樣本中的NS1蛋白結(jié)合捕獲劑(沉積在膜上的PDZ蛋白)，PDZ蛋白在膜上沉積的位點出現(xiàn)條帶。利用這種側(cè)向流形式可以檢測對禽流感株特異的C端NS1模體。這些包括ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3)禾卩ESKV(SEQIDNO:4)。在一些情況下，可以使用EPEV(SEQIDNO:27)?；蛘呖梢允褂闷渌东@劑，包括只與NS1蛋白的一種PL模體特異結(jié)合的抗體。為了定性或者定量分析和為了質(zhì)量控制，可以包括下列對照的任意一種或者全部。對照帶由山羊抗小鼠抗體(GAM)組成。鑒通過將結(jié)合全部形式NS1蛋白的抗體沉積在膜上，來定是否存在任何流感A的泳道?？砂幮詫φ?，其包括具有除了PDZ結(jié)構(gòu)域以外全部結(jié)構(gòu)域的PSD-95蛋白。其他對照可以包括用于定量信號的對照，例如已知與膜上捕獲劑結(jié)合較弱、中等、較強或者根本不結(jié)合的純化形式的PL蛋白，優(yōu)選的捕獲劑是PDZ蛋白或者對一種或者多種PL特異的抗體。可以包括用于定量信號的對照，以便分析結(jié)合強度來區(qū)別與PSD-95結(jié)合較弱或者中等的PL。例如，實施例6指出利用下列符號定量結(jié)合強度(-)是指沒有結(jié)合，(+)是指較弱的結(jié)合，(++)是指中等的結(jié)合和(+++)是指較強的結(jié)合。與特定PDZ蛋白結(jié)合的強度可用于區(qū)別具有NS1的H1N1，所述NS1末端是與PSD-95以中等親合力結(jié)合的RSEV。用于強結(jié)合的陽性對照可以是來自H5N1的純化NS1，用于較弱結(jié)合的對照可以是來自H3N2的純化NS1，用于中等結(jié)合的對照可以是來自H1N1的純化NS1?；蛘?，可以使用其他PDZ蛋白進一步區(qū)分結(jié)合PSD-95的株。例如，如實施例6所示，H5N1和H1N1都結(jié)合PSD-95。所以，使用INADLD8鑒定病毒株是否是H1N1或者H5N1，因為只有H1N1結(jié)合。與INADLD8的結(jié)合可以使得不容置疑地鑒定PL作為H5N1與PSD-95結(jié)合。在表4a-e和實施例2中可以發(fā)現(xiàn)結(jié)合H1N1但不結(jié)合H5N1的其他PDZ蛋白。G.特定NS1PL試驗該試驗通過特定NS1PL鑒定NS1PL類的特定類型。它還可以通過特定NS1PL類來鑒定亞型。雖然通常HA和NP抗原的類型與NS1PL區(qū)相關(guān)，但情況不總是這樣。有可能，例如，由于重配或者病毒能經(jīng)受的其他遺傳過程，來自例如H1N1病毒的NS1PL區(qū)可能轉(zhuǎn)移到H2N1病毒中。但是，不受特定理論限制，NS1PL區(qū)的存在可能對患者樣本中病毒的致病性更具有提示作用。這可能是因為NS1在i染中所起的生物學(xué)作用。優(yōu)選的試驗鑒定人的PLESEV(SEQIDNO:2)。優(yōu)選的試驗鑒定禽流感ANS1PL，該PLs具有模體ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3),禾BESKV(SEQIDNO:4)。這鑒定病毒的高致病性株，并可以釆取合適測定來治療和隔離疾病。其他優(yōu)選的試驗包括，例如，能夠使人特異鑒定NSlPL亞型的陣列。這類陣列還可以包括流感A的常規(guī)試驗。這類試驗還可以包括確定HA和NP蛋白類型的試驗。優(yōu)選，待鑒定的PL是下列的一種ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5),GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8)，GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10),NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12),RICI(SEQIDNG:13),DMAL(SEQIDNG:14),DvlTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16)，DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18)，SEV，SEI,SKV和SKI.更優(yōu)選，待鑒定的NSlPL是ESEV(SEQIDNO:2)。優(yōu)選，所使用的至少一種PDZ蛋白選自表1或者2中的至少一種、片段或者類似物。更優(yōu)選，至少一種PDZ蛋白是下列的至少一種外膜蛋白，PSD95(PDZ#2);PSD95(PDZ#1,2,3);DLG1(PDZ#1);DLG1(PDZ#1,2);DLG1(PDZ#2);DLG2(PDZ#1);DLG2(PDZ#2);Magi3(PDZ#1);PTN3(PDZ#1);MAST2(PDZ#1);NeDLG(PDZ#1，2);Shank1dl;Shank2dl;Shank3dl;Syntrophinla;Syntrophin丫l;Magil(PDZ#1);Magil(PDZ#4);Tipl;PTPLl(PDZ#1);Mint3(PDZ#1);LymMystique(PDZ#1);DLG2(PDZ#3);MUPPl(PDZ#8);NeDLG(PDZ#1);DLG5(PDZ#1);PSD95(PDZ#1);NumBP(PDZ#3);LIMK1(PDZ#1);KIAA0313;DLG1(PDZ#2);Syntenin(PDZ#2);Pickl或者類似物或者片段和/或模擬任何PDZ蛋白的抗體(或者適配體)。H.血清抗體的試驗可以在任何形式的診斷方法中使用鑒定血清抗體存在的試驗，所述抗體結(jié)合特定的NSlPL模體和/或在70位具有絲氨酸的NS2蛋白。可以在側(cè)向流或者其他形式中使用特定的包括重疊區(qū)的NS1PL肽作為捕獲劑，所述重疊區(qū)包含Ser70。I.流行環(huán)境中分析的用途分析靈敏度和特異性可以該變，以實現(xiàn)生物樣本中流感ANSI檢測的不同絕對水平，例如，通過在競爭性分析形式中降低競爭性配體的水平，改變夾心分析中捕獲和檢測劑的量等等。因此，本試驗方法包括各種具有不同性能屬性的皿，以滿足不同用途中的不同要求，如下面實施例部分所述。例如，在禽類流行環(huán)境中，通常記錄到最高的PPV和陽性試驗結(jié)果更可能是真實的，g卩，最低的NPV和假陰性結(jié)果傾向于更可能。此外在監(jiān)控禽類對象中流感A的流行性時，將全部樣本提供給參考實驗室用于檢驗是目前的慣例。通過在本篩選分析中鑒定真正陽性的樣本，例如，在野外或者護理點，本試驗分析發(fā)現(xiàn)了減少最終必須提交給參考實驗室用于檢驗的樣本數(shù)目的用途，即，在流行期間當(dāng)試驗負擔(dān)高時具有特別的價值。因為目前都是實行宰殺所有動物，而不管它們是否被感染，相對高的假陽性率是可以接受的，但是它還必須還具有相對低的假陰性率。在某些實施方式中，本發(fā)明提供具有不同特異性、靈敏度、PPV和NPV的試驗試劑盒，在流行期間使用，此處稱為"流行性試驗方法"。優(yōu)選適合當(dāng)前需要，本流行性試驗方法具有以下皿性能即，特異性大于約65%;靈敏度大于約90%;PPV大于約85。/。；NPV大于約65n/。；假陽性值小于大約25%和假陰性率小于約5%。.相反，在禽類對象流感A發(fā)病率低的時候，通常記錄到最低的PPV，假陽性試驗結(jié)果更有可能，和最高的NPV，陰性試驗結(jié)果傾向于更有可能和真實。在這些低發(fā)病率的時候，篩查目標(biāo)可以是快速鑒定可能被感染的動物并隔離它們，直到例如在參考實驗室中完成驗證試驗。因此，在某些實施方式中，本發(fā)明提供具有增強的靈敏度和NPV的試驗方法，在低流感A發(fā)病率的時候使用，這時監(jiān)控是根本的，艮P，此處稱為"監(jiān)控試驗方法"。優(yōu)選，該監(jiān)控試驗方法具有以下分析性能-即，特異性大于約65%;靈敏度大于約90%;PPV大于約85。/o;NPV大于約65%;假陽性率小于約20%和假陰性率小于約5%。當(dāng)該監(jiān)控試驗方法用于篩查超過100個成員的禽群時，作為一個整體的禽群的PPV顯著高于任何特定分析中得到的預(yù)測值。因此，當(dāng)在監(jiān)控試驗方法中得到陽性試驗結(jié)果時，利用上文的流行性試驗分析法重復(fù)檢測禽群成員可能證明是有益的。在人類而不是禽類中，試驗?zāi)康漠?dāng)然是不同的。流感A感染的及時證據(jù)可能具有重要的病例管理意義，例如，盡早提示在兒童或者老年對象中施用抗病毒劑。通常對人的診斷產(chǎn)物要求高度的特異性和靈敏度，例如，大于90%的特異性和，和大于90。/。PPV的靈敏度。但是，在所定義的流行環(huán)境中，例如，游船感染，那里PPV高；假陽性的可能性低，假陰性的可能性高；和，當(dāng)提交樣本進行驗證試驗時，可能需要較低的特異性例如65%，以便進一步降低假陰性試驗結(jié)果的數(shù)目例如該值小于大約5%。J.診斷和治療試劑盒提供實施本方法的試劑盒。該試劑盒不同于免疫分析試劑盒，至少存在下列一種或者多種成分(i)PDZ結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)打印的說明書，用于指導(dǎo)利用PDZ結(jié)構(gòu)域多肽來鑒定生物樣本中高危流感A禽類病毒株的分析。該試劑盒允許鑒定患者樣本中的病毒蛋白而不是抗體，使其對被感染的個體更特異。該試劑盒任選包含一種或者多種試劑、緩沖液或者添加劑組合物或者上文公開的試劑；和，在某些實施方式中，該試劑盒還可以包含對流感A病毒PL，優(yōu)選NS1特異的抗體。在其他實施方式中，該試劑盒還可以包括一種裝置，例如設(shè)備或者系統(tǒng)，用于從生物樣本的其他潛在干擾物質(zhì)中去除流感病毒PL。如果需要，該試劑盒還可以包括，一種或者多種對進行分析有用的不同組分例如，一種或者多種分析容器；一種或者多種對照或者校準(zhǔn)試齊U;—種或者多種在其上進行分析的固相表面；或者，一種或者多種緩沖液、添加劑或者檢測劑或者抗體；一種或者多種打印說明書，例如包裝插入物和/或容器標(biāo)簽，標(biāo)明用于進行分析的各組分的量，以及，用于評價分析結(jié)果的指導(dǎo)。該試劑盒能包含用于進行各種不同類型分析形式的組分，包括例如測試條，夾心ELISA，Western印跡分析，膠乳凝集等等。該試劑盒內(nèi)的參照、對照和校準(zhǔn)物可以包含，例如，一種或者多種天然和非天然的流感PL蛋白，重組PL多肽，'合成PL肽，PDZ結(jié)構(gòu)域多肽，PDZ結(jié)構(gòu)域肽和/或用于評價本方法的性能和準(zhǔn)確度的合適比色和酶標(biāo)準(zhǔn)品。用于實施本方法的說明書通常記錄在合適的記錄介質(zhì)上，并包括在試劑盒中，例如，作為包裝插入物。例如，說明書可以打印在基質(zhì)例如紙或者塑料上。在其他實施方式中，說明書可以數(shù)字'記錄在電子計算機可讀的存儲介質(zhì)上，例如CD-ROM，磁盤等等。在其他實施方式中，用戶能夠從遠程數(shù)字源，例如在因特網(wǎng)網(wǎng)點，以可下載的文檔文件形式獲得用于進行本方法的說明書。任選，該試劑盒可以包括用于進行流感A常規(guī)試驗以及特異試驗的試劑。例如側(cè)向流試驗可以包括鑒定普通流感A病毒存在的道和鑒定病毒是否是禽流感A的道。常規(guī)試驗可以是鑒定流感A病毒存在的任何試驗，包括針對NS1存在的試驗?？梢园ǖ钠渌愋偷钠胀鞲蠥可以鑒定任何流感A蛋白?；蛘吒鶕?jù)患者血液中抗體的存在可以鑒定流感A的存在。最后，通常可以使用PCR試驗鑒定流感A的存在。K.陣列在其他實施方式中，本發(fā)明提供PDZ,抗體，和/或適配體陣列，所述陣列由固定在固相上可識別選定位置的不同PDZ多肽、抗體和/或適配體或者類似的結(jié)合劑組成。陣列中每個固定的PDZ多肽、抗體和/或適配體對PL配體都對PL配體具有明確的結(jié)合親合力和特異性，即，包括已鑒定的與流感病毒蛋白中.PL的結(jié)合相互作用。陣列的區(qū)分活性由下列因素確定(i)各自不同PDZ多肽、抗體和/或適配體的結(jié)合親合力；(II)各自不同PDZ多肽、抗體和/或適配體對PL的結(jié)合特異性；禾B，(iii)分析條件，例如，離子強度，時間，pH等等。PDZ結(jié)構(gòu)域是高度特異的，例如，MAST205中的PDZ結(jié)構(gòu)域能夠區(qū)別包含TDV和SDV的C端PL序列。同樣地，相同PDZ蛋白內(nèi)，不同的各自結(jié)構(gòu)域可能具有不同的結(jié)合特異性和親合力，即，PSD-95結(jié)構(gòu)域-1、-2和-3具有不同的結(jié)合特異性和親合力。申請人已經(jīng)在先前的美國專利申請中克隆、表達和公開了超過255個不同的人PDZ結(jié)構(gòu)域的序列，所述PDZ結(jié)構(gòu)域包括了人類基因組中超過90%的全部PDZ結(jié)構(gòu)域。對PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白與不同的PL肽的相互作用作圖，構(gòu)成選擇本流感陣列特定成員的基礎(chǔ)。出乎意料地，陣列的選擇性基于以下發(fā)現(xiàn)(i)不同流感A株中有區(qū)別的不同NS1PL氨基酸序列模體，如下面實施例部分所述；和，聯(lián)合(ii)不同流感病毒蛋白中不同的PL序列模體，即，HA，NP，MA1，NS1等等。本發(fā)明的實施方式提供區(qū)別待測樣本中流感A病毒或者流感B的不同株的方法，根據(jù)是流感病毒蛋白中PL的組成結(jié)合性質(zhì)，例如，HA，NP，MA1，NS1等等，其中流感A和B的不同株和/或亞型在陣列中產(chǎn)生獨特的結(jié)合模式。該方法包括以下步驟(a)在陣列不同預(yù)定位置接觸等份待測樣本；(b)在陣列的特定位置檢測結(jié)合的存在或者缺失；(c)根據(jù)陣列中的結(jié)合模式確定(i)待測樣本中存在流感PL和(ii)陣列中PL結(jié)合的模式構(gòu)成流感A或者B病毒特定毒株的區(qū)別標(biāo)記。根據(jù)陣列可區(qū)別的流感A病毒的代表性實例包括例如H1N1，H2N2，H2N3,H2N5,H3N2，H3兩，H4N6,H5N1，H6N1,H6N2,H7N2,H7N3禾口H7N7。優(yōu)選，該陣列至少部分基于和NS1PL的結(jié)合。更優(yōu)選，PDZ、抗體和/或適配體陣列特異地鑒定至少一種NS1PL的存在，包括ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9),GSKV(SEQIDNO:10),NICI(SEQIDNO:ll),TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQIDNO:13)，DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17)，SICL(SEQIDNO:18)，SEV,SEI，SKV禾口SKI。更優(yōu)選，NS1PL是ESEV(SEQIDNO:2)。優(yōu)選，PDZ蛋白是選自表1或者2中的至少一種、片段或者類似物。更優(yōu)選，陣列包括至少一種PDZ蛋白，抗體或者模擬表1和2中所列任意PDZ蛋白的適體，類似物和活性片段。更優(yōu)選的，陣列包括PDZ蛋白，抗體模擬物和/或適配體，包括外膜蛋白，PSD95(PDZ#2);PSD95(PDZ#1,2,3);DLGl(PDZ#1);DLGl(PDZ#1,2);DLGl(PDZ#2);DLG2(PDZ#1);DLG2(PDZ#2);Magi3(PDZ#1);PTN3(PDZ#1);MAST2(PDZ#1);NeDLG(PDZ#1，2);Shankldl;Shank2dl;Shank3dl;Syntrophinla;Syntrophinyl;Magil(PDZ#1);Magil(PDZ#4);Tipl;PTPL1(PDZ#1);Mint3(PDZ#1);LymMystique(PDZ弁l);DLG2(PDZ#3);MUPPl(PDZ#8);NeDLG(PDZ#1);DLG5(PDZ#1);PSD95(PDZ#1);NumBP(PDZ#3);LIMK1(PDZ#1);KIAA0313;DLGl(PDZ#2);Syntenin(PDZ#2);Pickl或者類似物或者片段和/或模擬任何PDZ蛋白的抗體(或者適配體)。L.側(cè)向流設(shè)計類似于家庭妊娠試驗，側(cè)向流裝置通過將液體施加于測試條起作用，所述測試條已經(jīng)經(jīng)過特異生物制劑處理。通過攜帶液體樣本，用相應(yīng)生物制劑標(biāo)記的熒光體流過測試條，當(dāng)它們進入特異區(qū)時能被捕獲。測試條上發(fā)現(xiàn)的熒光體信號的量與靶分析物的量成比例。采用一些方法將懷疑含有流感A的樣本添加到側(cè)向流裝置中，令樣本通過擴散移動，線或者有色的區(qū)帶表明流感A的存在。側(cè)向流通常包括固相支持物(例如硝酸纖維素膜)，其包含3個特定區(qū)域樣本添加區(qū)，包含一種或者多種固定的PDZ蛋白和抗體的捕獲區(qū)，和包含一個或者多個區(qū)帶的讀出區(qū)，各區(qū)帶包含一種或者多種標(biāo)記物。側(cè)向流還可以包括陽性和陰性對照。因此，例如側(cè)向流裝置在某些實施方式中將按照如下進行通過將等份生物樣本接觸測試條的一端，然后讓蛋白在測試條上遷移，例如通過毛細管作用例如側(cè)流，從生物樣本中的其他病毒和細胞蛋白分離流感PL蛋白。包括一種或者多種PL結(jié)合劑例如PDZ多肽試劑、抗體和/或適配體作為捕獲和/或檢測劑。用于側(cè)向流分離、檢測和定量的方法和裝置是本領(lǐng)域已知的，例如，美國專利號5,569,608;6,297,020;禾B6,403,383，在此完整引入作為參考。在一個非限制性實施例中，測試條包括用于上樣的近端區(qū)域(上樣區(qū))和包含PDZ多肽捕獲劑和緩沖試劑和添加劑的遠端試驗區(qū)，所述緩沖試劑和添加劑適于建立遷移的生物樣本中PDZ多肽和任何流感PL蛋白之間的結(jié)合相互作用。在其他實施方式中，測試條包括兩個試驗區(qū)域，該區(qū)域包含不同的PDZ結(jié)構(gòu)域多肽，即，每個能夠特異地與不同的流感PL蛋白分析物相互作用。XI.藥物組合物上述篩查過程可以鑒定一種或者多種類型的化合物，所述化合物可以摻入藥物組合物。這些化合物包括試劑，所述試劑是至少一種NS1蛋白或者至少一種PDZ蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后處理的抑制劑。該試劑還可能抑制或者阻斷NS1和PDZ蛋白或者其混合物的結(jié)合。這些化合物還包括試劑，所述試劑是一種或者多種NS1蛋白/一種或者多種PDZ蛋白或者NS1和PDZ蛋白之間相互作用的抑制劑，并且所述試劑具有固有的呼吸和/或消化或者上皮細胞一特異活性或者成像活性。該化合物還包括偶聯(lián)物，其中藥劑或者成像組分與抑制劑連接，所述抑制劑是NSl、PDZ蛋白或者NS1蛋白和PDZ蛋白之間相互作用的抑制劑。還提供偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包括具有藥物活性的試劑和相對單獨試劑對PDZ蛋白具有降低的底物能力的偶聯(lián)基團，是為了減少該試劑轉(zhuǎn)運入未感染細胞，在那里試劑將產(chǎn)生不需要的副作用。優(yōu)選，該化合物或者試劑抑制或者阻斷至少一種下列PL與PDZ蛋白的結(jié)合ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4),TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6)，RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11)，TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQIDNO:13),DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18),SEV，SEI，SKV和SKI。更優(yōu)選，被阻斷或者抑制的NS1PL是ESEV。優(yōu)選，該化合物或者試劑抑制與至少一種來自表1或者2的PDZ蛋白的結(jié)合。更優(yōu)選，被抑制的PDZ蛋白或者相互作用是是下列至少一種PSD95(PDZ#2);PSD95(PDZ#1,2,3);DLG1(PDZ#1);DLG1(PDZ#1,2);DLG1(PDZ#2);DLG2(PDZ#1);DLG2(PDZ#2);Magi3(PDZ#1);PTN3(PDZ#1);MAST2(PDZ#1);NeDLG(PDZ#1,2);Shankldl;Shank2dl;Shank3dl;Syntrophinla;Syntrophinyl;Magil(PDZ#1);Magil(PDZ#4);Tipl;PTPLl(PDZ#1);Mint3(PDZ#1);LymMystique(PDZ#1);DLG2(PDZ#3);MUPPl(PDZ#8);NeDLG(PDZ#1);DLG5(PDZ#1);PSD95(PDZ#1);NumBP(PDZ#3);LIMK1(PDZ#1);KIAA0313;DLGl(PDZ#2);Syntenin(PDZ#2);Pickl或者類似物或者片段和/或模擬任何PDZ蛋白的抗體(或適配體)。一種或者多種上述實體可以與藥物可接受的、無毒的載體或者稀釋劑組合，所述載體或者稀釋劑定義為通常用來配制用于動物或者人類給藥的藥物組合物的介質(zhì)。選擇稀釋劑以便不影響組合的生物活性。這類稀釋劑的實例是蒸餾水，緩沖水，生理鹽水，磷酸鹽緩沖液(PBS)，Ringer氏溶液，右旋糖溶液和Hank氏溶液。此外，藥物組合物或者制劑還可以包括其他載體，佐劑，或者無毒的非治療性非免疫性穩(wěn)定劑、賦形劑等等。組合物還可以包括其他物質(zhì)以接近生理條件，例如pH調(diào)節(jié)和緩沖齊U，毒性調(diào)節(jié)齊U，濕潤齊U，去污劑等等(參見，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences，MacePublishingCompanyPublishingCompany,Philadelphia,PA，第17版(1985);用于藥物投放方法的簡要綜述可以參見，Langer,Science249:1527-1533(19卯)；這些參考文件中的每一篇均在此完整引入作為參考)。用于口服給藥的藥物組合物可以是例如下列形式，片劑，丸劑，粉劑，錠劑，袋劑，囊劑(catchet)，酏劑，懸浮液，乳劑，溶液，或者糖漿劑。合適賦形劑的一些實例包括乳糖，右旋糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯樹膠，磷酸鈣，藻酸鹽，黃芪膠，明膠，硅酸鈣，微晶纖維素，聚乙烯吡咯垸酮，纖維素，無菌水，糖漿，和甲基纖維素。還可以包括防腐劑例如甲基-和羥丙基苯甲酸鹽(pr叩ylhydroxy-benzoates);甜味劑；和調(diào)味劑。根據(jù)劑型，在對患者給藥后組合物可以提供快速的、持續(xù)的或者延遲的活性成分釋放。聚合材料可以用于口服緩釋投放(參見"MedicalApplicationsofControlledRelease,"Langer和Wise(編著)，CRCPres.,'BocaRaton,Florida(1974);"ControlledDrugBioavailability,"DrugProductDesignandPerformance,Smolen和Ball(編著)，Wiley,NewYork(1984);Ranger禾口Peppas，1983,JMacromol.Sci.Rev.MacromolChem.23:61;還可參見Levy等人，1985，Science228:190;During等人，1989,Ann.Neurol.25:351;Howard等人，1989，J.Ne藤urg.71:105)。通過將偶聯(lián)物包裹在膠囊內(nèi)或者緩慢溶解的多聚體內(nèi)，能夠?qū)崿F(xiàn)緩釋。優(yōu)選的多聚體包括羧甲基纖維素鈉，羥丙纖維素，羥丙基甲基纖維素和羥乙基纖維素(最優(yōu)選，羥丙基甲基纖維素)。其他優(yōu)選的纖維素醚已經(jīng)被描述(Alderman,Int.J.Pharm.Tech.&Prod.Mfr.,1984，5(3)1-9)。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了影響藥物釋放的因素(Bamba等人，Int.J.Pharm.，1979，2,307)。為了通過吸入給藥，根據(jù)此處公開的內(nèi)容應(yīng)用的化合物采用氣溶膠噴霧制劑形式可以方便地投放，所述制劑來自增壓包裝或者噴霧器，借助于合適的噴射劑，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或者其他合適的氣體，或者來自無噴射劑的干粉吸入器。就增壓氣霧劑而言，劑量單位可以通過設(shè)置投放計量的閥來確定。例如在吸入器或者吹入器中使用的明膠的膠囊和藥筒，可以制成包含化合物和合適的粉末基質(zhì)例如乳糖或者淀粉的粉末混合物。根據(jù)幾個良好確立的方案的任意一個，容易確定藥物組合物的有效劑量和給藥方式(給藥的量和頻度)。例如，通常利用動物研究(例如，小鼠，大鼠)確定生物活性試劑的每千克重量的最大耐受劑量。通常，至少一種被測的動物種類是哺乳動物。來自動物研究的結(jié)果可以推斷確定在其他種類中使用的劑量，例如人類。可以向患者施用化合物用于預(yù)防性和/或治療性處理。治療量是指無論以任何方式，足以治療疾病狀態(tài)或者癥狀，或者其它預(yù)防、阻止、延緩、或者逆轉(zhuǎn)疾病或者任何其他不良癥狀進程的量。在預(yù)防性應(yīng)用中，向易感特定疾病或者感染或者處于該風(fēng)險下的患者施用化合物。因此，"預(yù)防有效的"量是足以預(yù)防、阻止或者延緩疾病狀態(tài)或者其癥狀的量。在任一種情況下，組合物中包含的化合物的準(zhǔn)確量取決于患者的健康和體重情況。確定藥物組合物的合適劑量，例如，通常利用動物研究(例如，小鼠，大鼠)確定生物活性試劑的每千克重量的最大耐受劑量。通常，至少一種被測的動物種類是哺乳動物。來自動物研究的結(jié)果可以推斷確定在其他種類中使用的劑量，例如人類。藥物組合物的組分優(yōu)選是高純度的，并且基本上不含潛在有害的污染物(例如至少國家食品(NF)級的，通常至少分析級的，和更常見至少藥物級的)。為了給定化合物必須在使用前合成的程度，所得產(chǎn)物通?；旧喜缓魏螡撛诘亩緞绕涫侨魏蝺?nèi)毒素，內(nèi)毒素可能在合成或者凈化步驟期間存在。通常在GMP條件下制備組合物。用于腸胃外給藥的組合物通常是無菌的和基本上等滲的。A.抗病毒劑適合本發(fā)明使用的藥物組合物包括其中包含有效劑量活性劑的組合物。抗病毒劑包括NS1、PDZ和/或NS1/PDZ相互作用的抑制劑，所述抑制劑優(yōu)選顯示出對NS1或者PDZmRNA或者蛋白水平的至少30，50，75，95，或者99%的抑制。利用特異結(jié)合蛋白的抗體然后檢測抗體和蛋白之間形成的復(fù)合物，可以通過建立免疫分析定量蛋白的表達?？梢酝ㄟ^例如，點印跡分析，原位雜交，RT-PCR，定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(即，稱為"TaqMan"方法)，Northern印跡和核酸探針陣列方法，定量mRNA水平。優(yōu)選，用于鑒定抑制劑的NS1PL是下列一種ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5),GSEV(SEQIDNO:6)，RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQIDNO:13),DMAL(SEQIDNO:14)，DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16)，DLDY(SEQIDNO:17)，SICL(SEQIDNO:18),SEV,SEI,SKV和SKI。更優(yōu)選，用于鑒定抑制劑的NS1PL是ESEV(SEQIDNO:2)。優(yōu)選，用于鑒定抑制劑的PDZ蛋白是選自表1或者2中的至少一種、片段或者類似物。更優(yōu)選，用于鑒定抑制劑的PDZ蛋白是下列至少一種外膜蛋白，PSD95(PDZ#2);PSD95(PDZ弁1,2，3);DLGl(PDZ#1);DLGl(PDZ#1，2);DLGl(PDZ#2);DLG2(PDZ#1);DLG2(PDZ#2);Magi3(PDZ#1);PTN3(PDZ#1);MAST2(PDZ#1);NeDLG(PDZ#1,2);Shankldl;Shank2dl;Shank3dl;Syntrophinla;Syntrophinyl;Magil(PDZ#1);Magil(PDZ#4);Tipl;PTPLl(PDZ#1);Mint3(PDZ#1);LymMystique(PDZ#1);DLG2(PDZ#3);MUPP1(PDZ#8);NeDLG(PDZ#1);DLG5(PDZ#1);PSD95(PDZ#1);NumBP(PDZ#3);LIMK1(PDZ#1);KIAA0313;DLGl(PDZ#2);Syntenin(PDZ#2);Pickl或者類似物或者片段和/或模擬任意PDZ蛋白的抗體(或者適配體)。抗病毒劑可以包括經(jīng)鑒定與PDZ蛋白結(jié)合的PL肽治療劑，所述PDZ蛋白與流感NS1或者其他PL蛋白相互作用?？共《緞┌ɑ赑L模體或者PDZ結(jié)構(gòu)域的肽。用于抑制流感病毒PL和與PL結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用的一些示范性肽顯示于表11(SEQIDNOS:89-987)。其他有用的肽是SEQIDNOS:2，48，53，996和997,如實施例所述。本發(fā)明的治療劑包括肽本身，包括從C端開始的至少5、10、15或者20個連續(xù)殘基的其截短型，和所有這些肽的保守取代變異體和模擬物，任選將它們摻入藥物組合物中。保守取代，如果有的話，優(yōu)選發(fā)生于所述肽的C端3-4個氨基酸外。阻斷致病性流感PL與PDZ結(jié)合的肽可用于治療致病性流感。優(yōu)選，表ll所示的肽，其截短型、保守取代的變異體或者模擬物與轉(zhuǎn)運蛋白肽(蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)在肽序列的N端連接。可以使用數(shù)個轉(zhuǎn)運蛋白肽序列，包括Tat和觸足蛋白(antennapedia)(參見實施例7)?？共《局委焺┻€包哮抑制病毒PL和PDZ之間相互作用的小分子，以及Cox2抑制劑(如此處表8中鑒定的)。己經(jīng)在此處的表9和10中鑒定了一些小分子抑制劑。B.篩選抗病毒劑的方法此處公開了篩選與NS1PL蛋白和/或PDZ蛋白結(jié)，的試劑的方法。最初篩選的是與NS1PL或者PDZ蛋白的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合的試劑。然后檢測它們抑制PDZ/PL相互作用的能力。在下面的"B:抗病毒劑分析"中也提供了這些方法?？梢栽隗w外利用天然或者合成的PL蛋白進行結(jié)合分析?；蛘?，包含天然或者合成的PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白可用于鑒定能夠結(jié)合特定PDZ蛋白的試劑。此處公開的篩選抗病毒劑的方法鑒定阻斷或者抑制病毒PL和任何與其有相互作用的PDZ蛋白之間相互作用的試劑。篩選抑制劑和編碼其的DNA的抑制NS1和/或PDZ表達的能力。進行初篩，選擇能夠抑制或者終止PDZ/PL相互作用的試劑亞組。這樣的分析可以在體外進行，利用分離的PDZ蛋白和PL蛋白或者其能夠彼此結(jié)合的片段。這樣的篩選鑒定的試劑然后能夠進行功能分析。還可以在表達PL蛋白的細胞中篩選試劑，所述細胞或者天然表達PDZ蛋白，或者經(jīng)轉(zhuǎn)化表達PDZ蛋白。除了以上公開和說明的診斷試驗外，實施方式提供鑒定能夠調(diào)節(jié)一種或者多種結(jié)合相互作用的候選抗病毒劑的分析法，所述結(jié)合相互作用發(fā)生在流感A感染的細胞中流感病毒PL和宿主細胞PDZ多肽之間。該方法包括在抗病毒劑存在下，檢測對照PL例如合成PL肽，與PDZ結(jié)構(gòu)域多肽例如重組PDZ融合蛋白的結(jié)合。候選抗病毒劑調(diào)節(jié)對照PL和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽之間的結(jié)合。申請人之前在美國和國際專利申請中，例如在此完整引入作為參考的美國專利號5,569,608;6，297，020;和6,403,383中，己經(jīng)公開了測定對照PL和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽之間結(jié)合相互作用的分析。特別有用的篩選分析使用既表達一種或者多種流感NS1PL又表達一種或者多種PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白的細胞。這類細胞能夠通過用編碼蛋白的多核苷酸共轉(zhuǎn)染細胞重組產(chǎn)生，或者能夠通過用第二種蛋白轉(zhuǎn)染天然包含蛋白之一的細胞產(chǎn)生。在一個特定實施方式中，這類細胞在多孔培養(yǎng)皿中生長，與不同濃度的待測化合物接觸預(yù)定的時間段，所述時間段能夠根據(jù)經(jīng)驗確定。分析全細胞裂解產(chǎn)物、培養(yǎng)基或者細胞膜對PL/PDZ相互作用的抑制。與對照相比顯著抑制活性的待測化合物被認(rèn)為是治療劑候選物。分離的PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白或者其PL結(jié)合片段，可以在任何的各種藥物篩選技術(shù)中用于篩選治療化合物。或者，能夠使用包含PL模體的分離NS1PL蛋白或者片段。用于這類試驗的蛋白可以是膜結(jié)合的，在溶液中游離的，固著在固相支持物上，帶在細胞表面的，或者位于細胞內(nèi)的。可以測定PDZ結(jié)構(gòu)域或者NS1PL和待測試劑之間結(jié)合復(fù)合物的形成。更具體地，如果相互作用比無待測化合物存在時測量的相互作用顯著更低，則待測化合物被認(rèn)為是PDZ/PL相互作用的抑制劑。在該背景下，術(shù)語"顯著更低"是指在待測化合物存在下，PDZ/PL相互作用與無待測化合物存在條件下測量的相互作用相比時顯著更低，在分析法的置信限內(nèi)。還可以篩選肽或者其他化合物的隨機文庫適合作為PDZ/PL結(jié)合的抑制劑，或者單純結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白或者NS1PL蛋白。許多類型的化合物都可以產(chǎn)生組合文庫，其可以釆用逐步方式合成。這類化合物包括多肽，/3-轉(zhuǎn)角模擬物，多糖，磷脂，激素，前列腺素，類固醇，芳香族化合物，雜環(huán)化合物，苯二氮平，低聚N-取代甘氨酸和低聚氨基甲酸酯(oligocarbamates)。通過編碼合成文庫(ESL)方法可以構(gòu)建化合物的大組合文庫，所述方法描述于Affymax,WO95/12608，Affymax，WO93/06121,ColumbiaUniversity,WO94/08051，Pharmacopeia,WO95/35503和Scripps,WO95/30642(各在此引入作為參考用于所有目的)。用于篩選治療劑或者治療先導(dǎo)物的待測化合物的優(yōu)選來源是噬菌體展示文庫。參見，例如，Devlin,W091/18980;Key,B.K.,等人編著，PhageDisplayofPeptidesandProteins,ALaboratoryManual,AcademicPress,SanDiego,CA,1996。噬菌體展示是一種強大的技術(shù)，能夠令人從包含108-109個不同序列的文庫中，使用噬菌體遺傳學(xué)選擇和擴增具有所需特征的肽或者蛋白?？梢栽O(shè)計文庫，用于氨基酸序列在所需位置的選擇性上色(variegation)，允許文庫對所需特征的偏好。設(shè)計文庫使肽表達為與噬菌體表面展示的蛋白融合。挑選具有所需特征的噬菌體展示肽，并能再生長進行擴增。因為肽是通過噬菌體的增殖擴增的，可以方便的測序所選噬菌體的DNA，從而促進所選肽的快速分析。通過選擇特異結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白和/或NS1PL的噬菌體，能夠挑選出編碼肽抑制劑的噬菌體。產(chǎn)生融合到蛋白的文庫，例如表達在噬菌體表面上的基因II。文庫可以由不同長度的、線性的或者通過包含兩個Cys氨基酸進行限制的的肽組成，與噬菌體蛋白融合，或者還能夠融合到其他作為支架的蛋白。還能夠設(shè)計文庫偏好此處公開的PL區(qū)或者偏好從初始文庫選擇的結(jié)合噬菌體得到的肽序列，所述初始文庫提供其他的待測抑制劑化合物。C.抗病毒劑的類型下面闡明的任意試劑可以用作藥物以及那些在篩選方法中鑒定者。抑制劑可以從任意類型的文庫鑒定，包括RNA表達文庫，噬菌體表達文庫，小分子文庫，肽文庫。還可以利用核酸和/或多肽的已知序列產(chǎn)生抑制劑?；衔镞€包括幾類已知調(diào)控基因表達的分子，例如鋅指蛋白，核糖酶，siRNAs和反義RNAs。(a)siRNA抑制劑siRNAs是相對較短的、至少部分雙鏈的RNA分子，其用于抑制互補mRNA轉(zhuǎn)錄體的表達。盡管實現(xiàn)本發(fā)明不需要理解機理，伹是認(rèn)為siRNAs通過誘導(dǎo)互補mRNA轉(zhuǎn)錄體的降解起作用。設(shè)計和使用siRNAs的原理通常描述于WO99/32619，Elbashir,EMBOJ.20，6877-6888(2001)禾卩Nykanen等人，Cell107,309-321(2001);WO01/29058。本發(fā)明的siRNAs由至少部分互補的RNA的兩條鏈形成，每條鏈優(yōu)選長度為10-30,15-25,或者17-23或者19-21個核苷酸。所述鏈可以在全長彼此完全互補，或者在另外雙鏈分子的一端或者兩端具有單鏈3'-突出端。單鏈突出端，如果存在，通常是l-6個堿基，優(yōu)選1或者2個堿基。選擇siRNA的反義鏈與NS1或者PDZ轉(zhuǎn)錄體的片段基本上互補(例如，至少80,卯，95°/。和優(yōu)選的100%)。任何錯配的堿基優(yōu)選存在于siRNA鏈的末端或者在末端附近。末端錯配的堿基能夠是脫氧核糖核苷酸。siRNA的有義鏈顯示與NS1或者PDZ轉(zhuǎn)錄體片段的互補體相似的關(guān)系。特別合適的siRNAs具有兩條鏈，每條具有19個堿基的完全互補性，并且在有義鏈的3'端具有兩個不配對的堿基，在反義鏈的3'端具有一個不配對的堿基。如果就這樣施用siRNA,因為編碼siRNA的DNA的形式不同，則siRNA的鏈可以包含一種或者多種核苷酸類似物。核苷酸類似物位于那些抑制劑活性基本上不受影響的位置，例如在5'-端和/或3'端區(qū)域，尤其是單鏈突出區(qū)。優(yōu)選核苷酸類似物是糖-或者骨架-修飾的核糖核苷酸。核酸堿基-修飾的核糖核苷酸，即核糖核苷酸，包含非天然存在的核酸堿基而不是天然存在的核酸堿基，例如5-位修飾的尿苷或者胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷，5-溴尿苷；8位修飾的腺苷和鳥苷，例如8-溴鳥苷；去氮核苷酸，例如7-去氮-腺苷；O-和N-垸基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷也是合適的。在優(yōu)選的糖修飾核糖核苷酸中，2'OH-基團被選自H，OR,R,鹵素，SH，SR,NH2，NHR,NR2或者CN的基團取代:其中R是Cl-C6烷基，烯基或者炔基，鹵素是F，Cl，Br或者I。在優(yōu)選的骨架-修飾的核糖核苷酸中，與相鄰核糖核苷酸連接的磷酸酯基團被修飾的基團例如硫代磷酸酯基團取代。在siRNA5'羥化殘基上的磷酸基中引入其他優(yōu)選的修飾。通過用ATP和T4激酶處理siRNA,可以引入這樣的基團。還可以修飾天然RNA的磷酸二酯鍵，以包括至少一種氮或者硫雜原子?？梢允筊NA結(jié)構(gòu)中的修飾適合于特定的基因抑制，同時避免一些生物體中由dsRNA引起的常見恐慌反應(yīng)。同樣地，可以修飾堿基以阻斷腺苷脫氨酶的活性。NS1或者PDZ轉(zhuǎn)錄體內(nèi)的許多片段是設(shè)計siRNAs的合適目標(biāo)。當(dāng)NS1PL的選定片段用于選擇性靶定亞型時，該片段優(yōu)選顯示與轉(zhuǎn)錄體的其他NS1PL區(qū)缺少完全的序列同一性。優(yōu)選，NS1或者PDZ蛋白的選定片段顯示出與NS1PL的相應(yīng)片段(如果有的話)至少l、2、3、4或者更多個核苷酸差異。可以從NS1或者PDZ的編碼區(qū)、5'UTR和3'UTR選擇靶位點，在一些情況下，NS1的PL位點是優(yōu)選的。優(yōu)選的靶位點是稱為NS1PL的siRNA(參見實施例)。該位點在C端，并對流感A病毒亞型特異。其他優(yōu)選的位點包括PDZ蛋白的PL結(jié)合位點。通過在一對啟動子之間插入編碼siRNA的DNA片段，能夠重組合成siRNA，所述啟動子定向驅(qū)動插入片段從反方向的轉(zhuǎn)錄。這類啟動子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生兩個互補RNA鏈，該互補RNA鏈隨后能退火形成所需的dsRNA。用于這類系統(tǒng)的示范性質(zhì)粒包括質(zhì)粒(PCR4.0TOPO)(由Invitrogen提供)。另一個實例是載體pGEM-T(Promega,Madison,WI)，其中反向定向的啟動子是T7和SP6;還可以使用T3啟動子?；蛘?，編碼siRNA鏈的DNA片段被插入到單啟動子的下游。在該系統(tǒng)中，共轉(zhuǎn)錄siRNA的有義和反義鏈，產(chǎn)生自身互補的單RNA鏈,從而能夠形成dsRNA。編碼siRNAs的載體可以在體外或者細胞培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)錄，或者可以導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動物或者患者用于原位表達。合適的載體描述如下。用于重組表達的啟動子和任選的其他調(diào)控序列的選擇可以決定表達的組織特異性。例如，PDGF，朊病毒，神經(jīng)烯醇酶，或者thy-l啟動子適合于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達。還能夠通過有機化學(xué)合成和體外退火，合成siRNAs的鏈。如果是化學(xué)合成或者通過體外酶促合成，RNA在導(dǎo)入細胞前可以純化。例如，通過用溶劑或者樹脂沉淀、電泳、層析、或者其組合來提取，可以從混合物中純化RNA。RNA可以被干燥用于儲存，或者溶于水溶液。溶液可包含促進退火和/或雙鏈穩(wěn)定的緩沖液或者鹽。通過各種方法，能夠?qū)iRNAs以RNA或者編碼RNA的DNA形式導(dǎo)入細胞或者生物體，如下面所述。(b)反義多核苷酸通過結(jié)合并干擾有義mRNA的翻譯，干擾轉(zhuǎn)錄，干擾RNA前體的加工或者定位，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄或者通過一些其它機理起作用，反義多核苷酸能夠造成抑制。反義分子通過何種特定機理減少表達不是最關(guān)鍵的。通常反義多核苷酸包括至少7至10到通常20或者更多個核苷酸的單鏈反義序列，所述序列與來自基因mRNA的序列特異雜交。一些反義多核苷酸來自長度約IO到大約50個的核苷酸，或者長度大約14到大約35個的核苷酸。一些反義多核苷酸是小于大約100個核苷酸或者小于大約200個核苷酸的多核苷酸。通常，如果需要，反義多核苷酸應(yīng)該足夠長以形成穩(wěn)定的雙鏈，但是還需足夠短以便體內(nèi)給藥，這取決于給藥方式。與靶序列特異雜交所需的多核苷酸最小長度取決于幾個因素，尤其是，例如G/C含量，錯配堿基(如果有的話)的位置，與靶多核苷酸群相比該序列的獨特程度，和多核苷酸的化學(xué)性質(zhì)(例如，甲基膦酸酯骨架，肽核酸，硫代磷酸酯)。為確保特異雜交，反義序列至少與編碼它們的靶mRNA或者基因的片段基本上互補。一些反義序列與它們的目標(biāo)靶序列完全互補。但是反義多核苷酸還能包括，核苷酸取代，添加，缺失，轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)座，或者修飾，或者其他核酸序列或者非核酸部分，只要將與對應(yīng)于RNA或者其基因的有關(guān)靶的序列特異結(jié)合保留作為該多核苷酸的功能性質(zhì)。用于抑制NS1或者PDZ蛋白表達的反義多核苷酸被設(shè)計成顯示出與特定NS1或者PDZ基因或者轉(zhuǎn)錄體的完全的或者相當(dāng)程度的序列一致性，和與不同PDZ基因的不完全的和較低程度的序列一致性。一些反義序列與mRNA相對易接近的序列(例如，相對缺少二級結(jié)構(gòu))互補。這可以通過分析預(yù)測的RNA二級結(jié)構(gòu)來確定，利用例如MFOLD程序(GeneticsComputerGroup,MadisonWI)和本領(lǐng)域己知的體外或者體內(nèi)檢驗。用于鑒定有效反義組合物的另一個有用的方法利用寡聚核苷酸的組合陣列(參見，例如，Milner等，1997,NatureBiotechnology15:537)。可以利用任何合適的生產(chǎn)核酸的方法制備反義核酸(PNA，RNA，修飾的，類似物，等等)，例如此處公開的化學(xué)合成和重組方法。反義RNA可以就這樣投放或者以編碼反義RNA的DNA形式投放。編碼反義RNA的DNA可以作為載體的成分或者非復(fù)制形式投放，例如下面所述。(c)鋅指蛋白鋅指蛋白還可以用于抑制NSl或者PDZ蛋白或者核酸或者特定NSl亞型的表達。鋅指蛋白可以工程化或者選擇結(jié)合靶基因內(nèi)的任意需要的耙位點。在一些方法中，靶位點在啟動子或者增強子內(nèi)。在其他方法中，耙位點在結(jié)構(gòu)基因內(nèi)。在一些方法中，鋅指蛋白與翻譯阻遏劑連接，例如來自人類KOX-l蛋白的KRAB抑制結(jié)構(gòu)域(Thiesen等人，NewBiologist2，363-374(1990);Margolin等人，Proc.Natl.Acad.ScLUSA91，4509-4513(1994);Pengue等人，Nucl.AcidsRes.22:2908-2914(1994);Witzgall等人，Proc.NatlAcad.SciUSA91,4514-4518(1994)。WO00/00388描述了選擇適合被鋅指蛋白靶定的靶位點的方法，和設(shè)計鋅指蛋白結(jié)合選定的靶位點的方法。EP.95908614.1描述了利用噬菌體展示選擇與靶結(jié)合的鋅指蛋白的方法。用于設(shè)計鋅指蛋白的靶位點通常是大約9-19個核苷酸。為了抑制NSl或者PDZ蛋白或者多核苷酸，在NSl或者PDZ蛋白或者多核苷酸內(nèi)選擇靶位點，所述位點顯示與上面討論的不同PDZ基因或者轉(zhuǎn)錄體是不完全的或者缺乏顯著的序列一致性。WO00/00409描述了利用鋅指蛋白調(diào)控內(nèi)源基因的方法。鋅指蛋白可以作為蛋白或者以編碼鋅指的核酸形式給藥。在后一種情況下，核酸可以利用載體或者如下所述的不可復(fù)制形式投放。(d)核糖酶核糖酶是充當(dāng)酶的RNA分子，并且能夠被工程化在特定位點切割其他RNA分子。該過程中核糖酶自身不消耗，并且能夠催化作用于切害UmRNA耙分子的多個拷貝。Haseloff&Gerlach，(1988)Nature334:585-591和Uhlenbeck,(1987)Nature328:596-603和US5,496,698描述了設(shè)計反向切割靶RNA的核糖酶的一般規(guī)則。核糖酶通常包括兩個側(cè)翼片段和側(cè)翼片段之間的催化區(qū)，所述側(cè)翼片段顯示與轉(zhuǎn)錄體(靶亞位點)上的兩個位點互補并與其結(jié)合。側(cè)翼片段通常長5-9個核苷酸，最佳長6-8個核苷酸。核糖酶催化區(qū)的長度通常是大約22個核苷酸。mRNA耙在靶亞位點之間包含一致的(consensus)切割位點，具有通式NUN，優(yōu)選GUC(Kashani-Sabet和Scanlon,(1995)CancerGeneTherapy2:213-223;Perriman,等人，(1992)Gene(Amst.)113:157-163;Ruffher,等人，(19%)Biochemistry29:10695-10702);Birikh,等人，(1997)Eur.J.Biochem.245:1-16;Perrealt，等人，(1991)Biochemistry30:4020-4025)。通過選擇靶亞位點，并從而選擇與該亞位點互補的核糖酶側(cè)翼片段，可以控制核糖酶的特異性。對于NS1或者PDZ蛋白的抑制劑，優(yōu)先選擇耙亞位點，使在其他PDZ蛋白中不存在準(zhǔn)確的相應(yīng)亞位點，并優(yōu)選沒有具有顯著序列一致性的相應(yīng)亞位點。核糖酶可以作為RNA分子，或者以編碼核糖酶的DNA作為可復(fù)制載體組分的形式，或者采用如下所述的不可復(fù)制的形式，進行投放。(e).抗體化合物包括抗體，完整的和其結(jié)合片段二者都是，例如Fabs，F(xiàn)vs，它們與本發(fā)明基因編碼的蛋白特異結(jié)合。通?？贵w是單克隆抗體，盡管多克隆抗體也能重組表達(參見，例如，US6,555,310)。能夠表達的抗體實例包括小鼠抗體，嵌合抗體，人源化抗體，鑲嵌(veneered)抗體和人類抗體。嵌合抗體是輕和重鏈基因已經(jīng)構(gòu)建的抗體，通常通過遺傳工程對屬于不同種類的免疫球蛋白基因片段進行構(gòu)建(參見，例如，Boyce等人，AnnalsofOncology14:520-535(2003))。例如，小鼠單克隆抗體基因的可變(V)片段可以與人的恒定(C)片段連接。典型的嵌合抗體因此是一種雜合蛋白，由小鼠抗體的V或者抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人抗體的C或者效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域組成。人源化抗體具有基本上來自人抗體的可變區(qū)骨架殘基(稱為受體抗體)和基本上來自小鼠抗體的互補決定區(qū)，(稱為供體免疫球蛋白)。參見Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)和WO90/07861,US5,693,762,US5,693,761,US5，585，089,US5,530,101禾BWinter,US5,225,539。恒定區(qū)(constantregion),如果存在，也基本上或者全部來自人免疫球蛋白。特別是，通過常規(guī)雜交瘤方法，噬菌體展示(參見，例如，Dower等人，WO91/17271和McCafferty等人，WO92/01047)，利用具有人免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠(Lonberg等人，W093/12227(1993))，可以獲得抗體。編碼免疫球蛋白鏈的核酸可以從產(chǎn)生抗體的雜交瘤或者細胞系獲得，或者基于已出版文獻中的免疫球蛋白核酸或者氨基酸序列。(f).模擬化合物在特定實施方式中，本篩選法化合物中鑒定的該候選抗病毒化合物是所述PDZ結(jié)構(gòu)域多肽或者PL的模擬肽，即，與所述PDZ結(jié)構(gòu)域或者PL具有基本上相同的結(jié)構(gòu)和/或功能特點的合成化合物。所述模擬物可以完全由氨基酸的合成、非天然類似物組成，或者，是部分天然肽氨基酸和部分氨基酸非天然類似物的嵌合分子。模擬物還包括任意量的天然氨基酸保守取代，只要這類取代也是基本上不改變模擬物的結(jié)構(gòu)和/或抑制或者結(jié)合活性。至于是保守變異體的本發(fā)明多肽，常規(guī)實驗法確定模擬物是否在本發(fā)明的范圍內(nèi)，即，其結(jié)構(gòu)和/或功能基本上不改變。因此，如果模擬組合物能夠抑制所述多肽之間的結(jié)合，則該模擬組合物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。模擬物可以包含非天然結(jié)構(gòu)組分的任意組合，它們通常來自3個結(jié)構(gòu)組a)除了天然酰胺鍵("肽鍵")連接外的殘基連接組；b)代替天然存在的氨基酸殘基的非天然的殘基；或者c)誘導(dǎo)二級結(jié)構(gòu)模擬的殘基，艮卩，誘導(dǎo)或者穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，例如，卩轉(zhuǎn)角，Y轉(zhuǎn)角，/3折疊，a螺旋構(gòu)象，等等。當(dāng)多肽殘基的全部或者一些通過除了天然肽鍵外的化學(xué)方法連接時，多肽可以表征為模擬物。個體模擬肽殘基可以通過肽鍵、其他化學(xué)鍵或者偶聯(lián)方法連接，例如，戊二醛，N-羥基琥珀酰亞胺酯，雙官能馬來酰亞胺，N,N--二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或者N,N--二異丙基碳二亞胺(DIC)?？梢蕴娲Ｒ?guī)酰胺鍵("肽鍵")連接的連接基團包括，例如，酮亞甲基(例如，對于-C(0)-NH-的-C(0)-CHr),氨基亞甲基(CH2-NH)，乙烯，烯烴(CH=CH)，醚(CH2-0)，硫醚(CH2-S)，四唑(CN4-)，噻唑，逆酰胺(retroamide)，硫代酰胺，或者酯(參見，例如，Spatola(1983)ChemistryandBiochemistryofAminoAcids,PeptidesandProteins,Vol.7,pp267-357,APeptideBackboneModifications,MarcellDekker,NY)。通過包含全部或者一些非天然殘基取代天然存在的氨基酸殘基，多肽也可以表征為模擬物。在科學(xué)和專利文獻中詳盡描述了非天然殘基；下面描述了可用作天然氨基酸殘基模擬物的一些示范性非天然組合物和指導(dǎo)方針。芳香族胺基酸的模擬物能夠通過用以下物質(zhì)取代而產(chǎn)生，例如，D-或者L-萘基丙氨酸(naphylalanine);D-或者L-苯基甘氨酸；D-或者L-2噻吩丙氨酸；D-或者L-l，2，3，或者4-芘基丙氨酸(pyreneylalanine);D-或者L-3噻吩丙氨酸；D-或者L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或者L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或者L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或者L-(4-異丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基丙氨酸；D-對-氟苯丙氨酸；D-或者L-對-二苯基苯丙氨酸；K-或者L-對-甲氧基二苯基苯丙氨酸；D-或者L-2-吲哚(垸基)丙氨酸；和，D-或者L-垸基丙氨酸(alkylainines)，其中烷基可以是取代的或者未取代的甲基，乙基，丙基，己基，丁基，戊基，異丙基，異丁基，sec-isotyl，異戊基，或者非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳環(huán)包括，例如，噻唑基，苯硫基，吡唑基，苯并咪唑基，萘基，呋喃基，吡咯基，和吡啶基芳環(huán)。通過用下列物質(zhì)取代，例如，非羰酸鹽氨基酸同時維持負電荷；(膦?；?丙氨酸；硫酸蘇氨酸，能夠產(chǎn)生酸性氨基酸的模擬物。羧基側(cè)基(例如，天冬氨?；蛘吖劝滨；?還可以通過與碳二亞胺(R-N-C-N-R^反應(yīng)進行選擇性修飾，所述碳二亞胺例如，1^-環(huán)己基-3(2-嗎啉基-(4-乙基)碳二亞胺或者L-乙基-3(4-氮鑰-4,4-二甲基苯基(dimetholpentyl))碳二亞胺。通過與銨離子反應(yīng)，天冬氨?；蛘吖劝滨＿€可以轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０孵：凸劝滨０孵埢Ｍㄟ^用下列物質(zhì)取代，例如，(除賴氨酸和精氨酸外)氨基酸鳥氨酸，瓜氨酸，或者(胍基)-乙酸，或者(胍基)垸基乙酸，其中烷基按上面所定義，可以產(chǎn)生堿性氨基酸的模擬物。腈衍生物(例如，包含CN-部分取代COOH)可以被天門冬酰胺或者谷氨酰胺取代。天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰殘基可以脫氨基，成為相應(yīng)的天冬氨酰或者谷氨酰殘基。通過精氨酰與下列物質(zhì)反應(yīng)，例如，一種或者多種常規(guī)試劑，包括，例如，苯基乙二醛，2，3-丁二酮，1,2-環(huán)己二酮，或者水合茚三酮，優(yōu)選在堿性條件下反應(yīng)，能夠產(chǎn)生精氨酸殘基模擬物。通過酪氨酰與例如芳香族重氮化合物或者四硝基甲垸反應(yīng)，能夠產(chǎn)生酪氨酸殘基模擬物。N-乙酰基咪唑(acetylimidizol)和四硝基甲垸可分別用于生成O-乙酰酪氨酰類和3-硝基衍生物。通過半胱氨酰殘基與下列物質(zhì)反應(yīng)，例如，a-卣代乙酸酯例如2-氯乙酸或者氯乙酰胺和相應(yīng)的胺，得到羧甲基或者羧酰胺，基衍生物，可以產(chǎn)生半胱氨酸殘基模擬物。通過半胱氨酰殘基與下列物質(zhì)反應(yīng)，例如，溴-三氟丙酮，0!-溴-/3-(5-咪唑酰基丙酸；磷酸氯乙酰，N-烷基馬來酰亞胺，3-硝基-2-吡啶二硫化物；甲基2-吡啶二硫化物；對氯汞苯甲酸；2-氯汞基-4硝基苯酚；或者，氯-7-硝基苯并-氧-l,3-二唑，也能夠產(chǎn)生半胱氨酸殘基模擬物。通過賴氨酰與例如琥珀酸或者其他羧酸酐反應(yīng)，能產(chǎn)生賴氨酸模擬物(和可以改變氨基末端殘基)。通過與亞氨酯反應(yīng)，例如甲基皮考林亞氨酯(picolinimidate)，磷酸吡眵醛，吡哆醛，氯代硼氫化物，三硝基苯磺酸，O-甲基異脲，2，4-戊二酮，以及與乙醛酸的轉(zhuǎn)酰胺基酶催化反應(yīng)，也可以產(chǎn)生賴氨酸和其他包含a-氨基的殘基模擬物。通過與例如甲硫氨酸亞砜反應(yīng)，可以產(chǎn)生甲硫氨酸的模擬物。脯氨酸的模擬物包括，例如，哌啶酸，噻唑烷羧酸，3-或者4-羥基脯氨酸，脫氫脯氨酸，3-或者4-甲基脯氨酸，或者3,3，-二甲基脯氨酸。通過組氨酰與例如二乙基焦碳酸酯或者對溴苯酰甲基溴反應(yīng)，可以產(chǎn)生組氨酸殘基模擬物。其他模擬物包括，例如，通過以下作用產(chǎn)生的那些脯氨酸和賴氨酸的羥化作用；絲氨?；蛘咛K氨酰殘基的羥基磷酸化作用；賴氨酸，精氨酸和組氨酸的a-氨基甲基化；N端胺的乙?；恢麈滜０窔埢募谆蛘哂肗-甲基氨基酸取代；或者C端羧基的酰胺化。所述多肽的氨基酸還可以用相反手性的氨基酸(或者模擬肽殘基)取代。因此，以L-構(gòu)型天然存在的任意氨基酸(還可以稱為R或者S，取決于化學(xué)實體的結(jié)構(gòu))可以用相同化學(xué)結(jié)構(gòu)類型的氨基酸或者模擬肽取代，但它們具有相反的手性，通常稱為D-氨基酸，但此外還可以稱為R-或者S-形。本發(fā)明的模擬物還可以包括組合物，該組合物包含結(jié)構(gòu)模擬殘基，尤其是誘導(dǎo)或者模擬二級結(jié)構(gòu)的殘基，例如P轉(zhuǎn)角，^折疊，a螺旋結(jié)構(gòu)，Y轉(zhuǎn)角，等等。例如，在肽內(nèi)用D-氨基酸；N-a-甲基氨基酸；C-ce-甲基氨基酸；或者脫氫氨基酸取代天然氨基酸殘基，可以誘導(dǎo)或者穩(wěn)定0轉(zhuǎn)角，Y轉(zhuǎn)角，/折疊或者a螺旋構(gòu)象。/3轉(zhuǎn)角模擬結(jié)構(gòu)已得以描述，例如，Nagai(1985)Tet.Lett.26:647-650;Feigl(1986)J.Amer.Chem.Soc.108:181-182;Kahn(1988)J.Amer.Chem.Soc.110:1638-1639;Kemp(1988)Tet.Lett.29:5057-5060;Kahn(1988)J,Molec.Recognitionl:75-79。/3折疊模擬結(jié)構(gòu)已得以描述，例如，Smkh(1992)J.Amer.Chem.Soc.114:10672-10674。例如，Beusen(1995)Biopolymers36:181-200，描述了順式酰胺替代物，1，5-二取代四唑，誘導(dǎo)VI型]8轉(zhuǎn)角。Banerjee(1996)Biopolymers39:769-777,描述了摻入非手性(O-氨基酸殘基以產(chǎn)生聚亞甲基單位作為酰胺鍵的取代。通過例如強場1HNMR或者2DNMR光譜，可以分析多肽的二級結(jié)構(gòu)，參見，例如，Higgins(1997)J.Pept.Res.50:421-435。還可以參見，Hruby(1997)Biopolymers43:219-266，Balaji等人，美國專利號5,612,895。D.改進抗病毒劑為改進抗病毒劑在所選細胞中的接受和導(dǎo)入，存在許多已知的方法。例如，蛋白的PEG化可使它們更能抵抗免疫系統(tǒng)?；蛘撸梢栽诘鞍缀洼d體中添加胞內(nèi)信號或者部分使它們更易進入所選細胞?？梢蕴砑邮沟鞍谆蛘咻d體易被感染細胞特異攝取的部分，在這種情況下是對呼吸細胞表達的受體特異的配體。該部分可以對流感受體或者細胞類型特異的受體具有特異性。該治療化合物還可以進一步修飾，以便該化合物更容易溶解或者促進其進入細胞。例如，化合物可以在任意位置PEG化，或者化合物可以偶聯(lián)到膜易位(translocating)肽例如tat、觸足蛋白或者信號序列膜易位肽，如U丄angel所述，"CellPenetratingPeptides",CRCPress,BocaRotan,2002，即，在此完全引入作為參考。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了許多肽序列，它們能夠促進與這些序列連接的肽通過胞質(zhì)膜進入細胞(Derossi等人，1998，TrendsinCellBiol.8:84)。為了本發(fā)明的目的，這類肽統(tǒng)稱為"跨膜轉(zhuǎn)運蛋白肽"，這與"細胞穿透肽"互換使用。后者細胞穿透肽的實例包括，但不限于下列肽即，源自HIV的tat(Vives等人，1997,J.Biol.Chem.272:16010;Nagahara等人，1998，Nat.Med.4:1449)，來自果蠅(Drosophila)的觸足蛋白(Derossi等人，1994，J.Biol.Chem.261:10444),來自單純皰疹病毒的VP22(Elliot和D'Hare,1997,Cell88:223-233)，抗DNA抗體的互補決定區(qū)(CDR)2禾B3(Avrameas等人，1998,Proc.NatlAcad.SciU.S.A.,95:5601-5606)，70KDa熱休克蛋白(Fujihara,1999,EMBOJ.18:411-419)和轉(zhuǎn)運蛋白(transportan)(Pooga等人，1998，F(xiàn)ASEBJ.12:67-77)。在某些實施方式中，可以使用截短的HIVtat肽。E.干擾素產(chǎn)生干擾素a和/3(IFN-a//3)在抗病毒抵抗的固有細胞機制中起著重要作用，例如，抑制病毒序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。IFN-ce/Z受體信號復(fù)合物的組裝需要給受體復(fù)合物募集因子，包括轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kB，STAT和INF-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子-3;和蛋白激酶。據(jù)認(rèn)為RACK1可以作為支架蛋白，給復(fù)合物募集和/或結(jié)合PKC和STAT;可能結(jié)合網(wǎng)蛋白，艮P，半橋粒(hemidesmasome)組織者(organizer)。最近來自其他實驗室的數(shù)據(jù)表明腮腺炎和麻疹病毒可能破壞INF-o;/i3信號復(fù)合物，即，據(jù)報道腮腺炎V-蛋白結(jié)合RACK1，并誘導(dǎo)STAT從受體復(fù)合物解離；禾口，在麻疹病毒感染細胞中，據(jù)報道病毒C和/或V蛋白通過結(jié)合和"凍結(jié)"INF-o^受體復(fù)合物，來抑制信號激酶的磷酸化作用。干擾素-/|3信號抑制促-細胞凋亡應(yīng)答，通過STAT和NFkB14的核轉(zhuǎn)移提高細胞存活率"。干擾素受體信號觸發(fā)PKC-S"的活化，其又能下調(diào)半胱天冬酶3'以及，通過STAT17和，在氣道中，通過NFKB18，19，下調(diào)促炎癥信號。據(jù)報道PKC-S活化還抑制TNFa誘導(dǎo)的凋亡"'21。在這方面，IFN-o/z3信號的禽流感NSl抑制看來會促進細胞死亡和決定疾病的嚴(yán)重程度。因此，用于藥物研發(fā)的候選藥劑和新的分子靶標(biāo)是干擾和/或阻斷NS1對IFN-o/j8信號作用的那些。這些試劑在感染流感A的對象中促進改善一種或者多種癥狀的所需治療效果。流感A的高危(也參見致病性)禽類株在人類中造成爆發(fā)性感染，即，快速越過粘膜肺組織傳播進入循環(huán)和CNS。不受特定理論束縛，很有可能某些后來的效應(yīng)源自受非結(jié)構(gòu)流感A病毒蛋白介導(dǎo)INB-a//3信號的抑制。此外，很有可能病毒蛋白例如NS1和NS2抑制胞內(nèi)PDZ結(jié)構(gòu)域-PL的相互作用，而這種相互作用對于有效的INB-ce/Z3信號信號和誘導(dǎo)細胞抗病毒抵抗機理是必需的。此處鑒定了INF-o/Z3受體-l中可能的PDZ-配體(PL)序列(檢索號16166194)，C端序列"QDFV，，(SEQIDN0:31)，即，可能的1-型PL序列。相似的，INF-a/0-受體-l信號復(fù)合物的其他潛在成員還包括下列推斷的C端PL序列模體即，MAP-1A(檢索號2119250)包含"KSRV"(SEQIDNO:32);MAP-1B(檢索號14165456/5174525)包含"KIEL"(SEQIDNO:33);MAP-1A/1B輕鏈-3(檢索號12383056A8551443)包含C端"KLSV"(SEQIDNO:34);網(wǎng)蛋白-1(檢索號4505877)包含C端PL序列模體"SAVA"(SEQIDNO:35);PKC-5(檢索號509050)包含"KVLL"(SEQIDNO:36);INF-可誘導(dǎo)蛋白激酶(檢索號13637584和4506103-elf2a)包含C端序列模體"RHTC"(SEQIDNO:37);干擾素o;應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子-3(檢索號5174475)具有C端模體"LSLV"(SEQIDNO:38);禾口，干擾素調(diào)節(jié)因子-2(檢索號20141499/4504723)包含"VKSC"(SEQIDNO:39)。因此，很有可能PDZ結(jié)構(gòu)域-PL相互作用在病毒發(fā)病機理中起著重要作用，并從而成為開發(fā)藥物化合物的靶標(biāo)。能夠抑制NS1與IFN-o/j8受體復(fù)合物的胞內(nèi)PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用的藥物化合物包括PL肽，和其模擬物，NSlPL/IFN-oZ/3相互作用的肽抑制劑，NS1表達的抑制劑，細胞可滲透的非天然PDZ結(jié)構(gòu)域多肽，和其模擬物，和能夠抑制NS1PL與人特異PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合的小分子抑制劑，所述PDZ結(jié)構(gòu)域參與IFN-o/jS反應(yīng)。F.5.4治療方法此處公開的藥物組合物用于流感A疾病預(yù)防或治療方法。從上面公開的內(nèi)容可知，本發(fā)明具有多種應(yīng)用。例如，NS1蛋白、PDZ蛋白或者NS1和PDZ蛋白之間相互作用的抑制劑，可用于鑒定與轉(zhuǎn)運蛋白相互作用并且能夠進入感染細胞的試劑或者偶聯(lián)物。NS1蛋白、PDZ蛋白或者NS1和PDZ蛋白之間相互作用的抑制劑還能通過鑒別結(jié)合感染細胞的偶聯(lián)部分并將偶聯(lián)部分與試劑連接，用于增強試劑結(jié)合感染細胞的能力。在預(yù)防應(yīng)用中，給對流感A感染易感、或者處于患流感A感染發(fā)展風(fēng)險的對象施用一定量的藥物組合物或者藥物，所述的量足夠預(yù)防、減弱或者阻止流感A感染的發(fā)展。在治療應(yīng)用中，給被懷疑患有、或者已經(jīng)患有流感的患者施用一定量的組合物或者藥物，，述的量足夠逆轉(zhuǎn)、阻止或者至少部分阻止，流感A感染的癥狀。在預(yù)防和治療方案中，作為NS1、PDZ和/或NSl-PDZ相互作用抑制劑形k的本發(fā)明活性劑，通常分幾次劑量給藥，直到實現(xiàn)充分的應(yīng)答。但是，在預(yù)防和治療方式中，活性劑還可以單次劑量給藥，直到實現(xiàn)充分的應(yīng)答。通常，對治療進行監(jiān)控，并可以給予重復(fù)劑量。此外，對于那些治療流感A感染治療或者流感A感染發(fā)展的患者，治療方式可以使用相似的劑量；給藥途徑和給藥頻率。根據(jù)治療的疾病、哺乳動物種類和特定給藥方式，可以與載體組合產(chǎn)生單一劑型的NS1蛋白、PDZ蛋白和/或NS1/PDZ相互作用和其他活性劑的抑制劑的量是不同的。對于任意特定患者，"有效劑量"，"藥理可接受劑量"或者"藥理可接受量"可能取決于各種因素，包括使用的特定化合物的活性，接受治療的患者的物種，年齡，體重，健康狀況、性別和飲食；給藥時間和途徑；代謝或者排泄速度；同時或者先前給藥的其他藥物；疾病的類型和嚴(yán)重度；副作用的嚴(yán)重程度，患者是否是動物或者人類，等等。通常患者是人類，但還可以治療非人類的哺乳動物，包括轉(zhuǎn)基因哺乳動物?？梢允┯糜行┝康娜L活性劑或者其活性片段。對于用于本發(fā)明方法的NS1蛋白、PDZ蛋白和/或NS1/PDZ相互作用的任意抑制劑和其他活性劑，用于人類的有效量最初可以從非人類動物模型估算。臨床醫(yī)生利用本領(lǐng)域已知的參數(shù)可以確定有效量。通常，開始的給藥劑量稍微低于最佳有效量。此后小量增加給藥量直至廿達至lj有效劑量。(參見TheMerckManualofDiagnosisandTherapy,第16半,§22,1992,Berkow，MerckResearchLaboratories,Rahway，NewJersey,在此引入作為參考)。劑量需要逐步增高以最優(yōu)化安全性和效果?？梢酝ㄟ^實驗動物的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)步驟檢測此處描述的化合物的毒性和治療效果，例如通過測定LD5Q(導(dǎo)致50%試驗群體死亡的劑量)和ED5。(在50%試驗群體中治療有效的劑量)。有毒和治療效果之間的劑量比例是治療指數(shù)，可以表達為LD5Q和ED5Q之間的比例。優(yōu)選顯示高治療指數(shù)的化合物。從這些非人類動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于配制對于人用無毒的劑量范圍。這類化合物的劑量優(yōu)選處于循環(huán)濃度范圍內(nèi)，該范圍包括幾乎沒有或者沒有毒性的ED5()。個人醫(yī)生根據(jù)患者情況可以選擇正確的劑型、給藥途徑和劑量。(參見，例如，F(xiàn)ingl等人(1975)In:ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,Chapter1,在此弓l入作為參考)。G.給藥方法NS1蛋白、PDZ蛋白和/或NS1/PDZ相互作用的抑制劑和其他活性劑可以被單獨投放或者施用于哺乳動物，例如，人類患者或者對象，以藥物可接受的鹽或者其可水解前體的形式，或者以藥物組合物形式，其中有效劑量的化合物與合適的載體或者賦形劑混合。有效方案是指藥物或者藥物組合以足夠的量和頻率并且通過合適途徑給藥，以便至少可檢測地預(yù)防、延緩、抑制或者逆轉(zhuǎn)流感A感染至少一種癥狀的發(fā)展。"有效劑量"，"藥理可接受劑量"，"藥理可接受量"是指當(dāng)以合適的方式給藥時，存在足夠量的NS1蛋白或者表達、PDZ蛋白或者表達和/或NS1/PDZ蛋白相互作用的抑制劑、活性劑或者NS1、PDZ蛋白和/或NS1/PDZ蛋白相互作用的抑制劑與其他活性劑聯(lián)合，以獲得所需要的結(jié)果，例如，預(yù)防、延緩、抑制或者逆轉(zhuǎn)流感A感染的癥狀或者流感A感染的進展。'用于本發(fā)明方法的的流感A的NS1、一種或者多種PDZ蛋白和/或NS1/PDZ蛋白相互作用的抑制劑和其他活性劑可以作為藥物組合物給藥，所述藥物組合物包括NS1、PDZ蛋白和/或NS1/PDZ蛋白相互作用的抑制劑或者活性劑，和各種其他藥學(xué)可接受的組分。藥物組合物可以是以下形式固體(例如粉劑，顆粒，糖衣丸，片劑或者丸劑)，半固體(例如凝膠劑，漿劑，或者膏劑)，液體，或者氣體(例如氣霧劑或者吸入劑)。本發(fā)明使用的合適劑型可以參考Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCompany1985)Philadelphia,PA，第17版)禾口Langer,Science(1990)249:1527-1533，在此引入作為參考。此處描述的藥物組合物可以釆用常規(guī)方式制備，即，混合，溶解，?；?，制備糖衣丸，磨粉，乳化，包囊，捕獲或者凍干步驟。NS1/PDZ蛋白和/或NS1/PDZ蛋白相互作用的抑制劑和其他活性劑可以與常見的賦形劑、稀釋劑或者載體一起配制，壓成片劑，或者配制成酏劑或者方便口服給藥的溶液。NS1、PDZ蛋白和/或NSl/PDZ蛋白相互作用的抑制劑和其他活性劑還可以配制緩釋劑型等等。可以多種方式實現(xiàn)化合物的給藥，包括口服，含服，直腸，胃腸外，腹膜內(nèi)，經(jīng)皮，透皮，氣管內(nèi)，.靜脈內(nèi)，和肌內(nèi)給藥。該化合物可以在長效或者緩釋的劑型中，局部而不是全身方式給藥。此外，化合物可以在脂質(zhì)體中給藥。此外，化合物可以通過基因治療方式給藥。為了口腔給藥，組合物可以采用按常規(guī)方式配制的片劑或者錠劑的形式。為了吸入給藥，本發(fā)明應(yīng)用的化合物以氣溶膠噴物制劑形式可以方便地投放，所述制劑來自增壓包裝、噴霧器(nebulizer)或者注射噴霧器(syringesprayer)，借助于合適的噴射劑，例如，二氯二氟甲垸，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或者其他合適的氣體，或者來自無噴射劑的干粉吸入器。就增壓氣霧劑而言，劑量單位可以通過設(shè)置投放計定量的閥來確定。例如在吸入器或者吹入器中使用的明膠的膠囊和藥筒，可以制成包含化合物和合適的粉末基質(zhì)例如乳糖或者淀粉的粉末混合物。化合物可以配制成通過注射進行腸胃外給藥，例如，通過彈丸注射(bolusinjection)或者連續(xù)輸注。用于注射的劑型可以存在于單位劑型，例如，在安瓿中或者多劑量容器中，含有添加的防腐劑。組合物可以采用以下形式油基或水性介質(zhì)中的懸浮液、溶液、或者乳液，并且可以包含配制劑(formulatoragents)例如懸浮、穩(wěn)定和/或分散劑。組合物配制成無菌、基本等滲的和完全符合美國食品和藥物管理局(theU.S.FoodandDragAdministration)的所有藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GoodManufacturingPractice,GMP)。NSl、PDZ蛋白和/或NS1/PDZ蛋白相互作用的抑制劑和其他活性劑還可以配制為直腸組合物，例如栓劑或者保留灌腸劑，.例如，包含常用栓劑基質(zhì)例如可可脂，碳蠟，聚乙二醇或者其他甘辨酯，所有這些在體溫下溶化，而在室溫下凝固。除以上描述的劑型外，化合物還可以配制為長效制劑(dep6tpreparation)。這類長效劑型可以通過植入(例如，皮下或者肌內(nèi))或者通過肌肉注射給藥。因此，例如，化合物可以用合適的聚合或者疏水性材料(例如，作為可接受的油中的乳劑)或者離子交換樹脂配制，或者作為微溶的衍生物，例如，微溶的鹽。(參見，例如，Urquhart等人，(1984),AnnRev.Pharmacol.Toxicol.24:199;Lewis,ed.,1981,ControlledReleaseofPesticidesandPharmaceuticals,PlenumPress,NewYork,N.Y.，美國專利號3,773,919,和3,270,960,在此引入作為參考)?；蛘?，可以使用用于疏水性藥物化合物的其他運送系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是疏水性的藥物運送介質(zhì)或者載體的公知實例。在一些方法中，可以使用循環(huán)時間長，即，隱形脂質(zhì)體。Woodle等人的美國專利號5,013,556—般性地描述了這類脂質(zhì)體，其教示在此引入作為參考。本發(fā)明的化合物還可以通過控釋工具和/或運送裝置給藥，所述工具和裝置描述于美國專利號3,845,770;3,916,899;3,536,809;3,598,123;和4,008,719;其公開內(nèi)容在此引入作為參考。為了通過基因治療給藥，目標(biāo)遺傳物質(zhì)(例如，DNA或者RNA)被轉(zhuǎn)移到宿主中以治療或者預(yù)防流感A感染。在本發(fā)明中，目標(biāo)遺傳物質(zhì)編碼NS1、PDZ和域NS1/PDZ相互作用的抑制劑、活性劑或者其片段。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，遺傳物質(zhì)應(yīng)該是有療效的。許多這類蛋白、載體、DNA本身是已知的。(參見Culver,K.W.，"GeneTherapy",1994,p.xii,MaryAnnLiebert,Inc.,Publishers,NewYork,N.Y.,在此完整引入作為參考)。只為了示例的目的，載體可以選自莫洛尼小鼠白血病病毒載體，帶有組織特異啟動子的腺病毒載體，單純性皰疹載體，牛痘的載體，人工染色體，受體介導(dǎo)的基因運送，和上述載體的混合物?；蛑委熭d體是由不同的實驗室商品化供應(yīng)的，例如Chiron,Inc.,Emeryville,Calif.;GeneticTherapy,Inc.,Gaithersburg,Md.;Genzyme，Cambridge,Mass.;Somtax，Alameda,Calif;TargetedGenetics,Seattle,Wash.;Viagene禾卩Vical，SanDiego，Calif。腺病毒是遺傳物質(zhì)的有希望的基因治療載體，所述遺傳物質(zhì)編碼NS1、PDZ和/或NS1/PDZ相互作用的抑制劑、活性劑或者其片段?？梢圆倏v腺病毒使其編碼和表達所需基因產(chǎn)物(例如，NS1、PDZ和/或NS1/PDZ相互作用的抑制劑或者其片段)，并且同時其在正常裂解病毒生活周期中的復(fù)制能力被滅活。無需將病毒DNA整合入宿主細胞染色體就可以實現(xiàn)腺病毒表達，從而緩解了關(guān)于插入突變發(fā)生的擔(dān)心。此外，腺病毒作為活的傷寒疫苗已經(jīng)使用很多年，具有優(yōu)異的安全特征(Schwartz,A.R.等人(1974)Am.Rev.Respir.Dis.109:233-238)。最后，在許多例子中已經(jīng)證明了腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，包括a-l-抗胰蛋白酶和CFTR轉(zhuǎn)移到棉鼠的肺中(Rosenfeld，M.A.等人(1991)Science252:431-434;Rosenfeld等人，(1992)Cell68:143-155)。此外，試圖確認(rèn)腺病毒為人類癌癥致病劑的廣泛研究一律是陰tf的(Green,M.等人(1979)PNASUSA76:6606)。藥物組合物還能包括合適的固體或者膠體相載體或者賦形劑。這類載體或者賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣，磷酸鈣，各種糖，淀粉，纖維素衍生物，明膠，和多聚體例如聚乙二醇。實施例實施例l:流感ANSI蛋白具有PDZ結(jié)構(gòu)域配體(PL)模體NCBI流感資源數(shù)據(jù)庫的檢查顯示，NSl蛋白序列具有符合結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域能力的特征。這類序列被命名為PDZ結(jié)構(gòu)域配體或者PL。經(jīng)鑒定這些流感NSl蛋白的PL模體是S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸，X是任意氨基酸。NCBI數(shù)據(jù)庫747個全長人NSl序列中，572個具有該模體。NCBI數(shù)據(jù)庫345個全長雞NS1序列中，237個具有該模體。該數(shù)據(jù)概述于表3a-3e,和圖1-3。該數(shù)據(jù)提供了特定NS1PL模體在不同的動物和人類中出現(xiàn)的統(tǒng)計表述。統(tǒng)計分析可用于分析各種動物中發(fā)現(xiàn)了何種PL模體，它們?nèi)绾卧谖锓N之間穿梭，以及在一些情況下，通常發(fā)現(xiàn)何種PL具有特定H或者N蛋白。人PL分成5個序列組(參見表3a):RSKI(SEQIDNO:40),ESEV(SEQIDN0:2)，KSEV(SEQIDNO:41),RSEV(SEQIDNO:7)，和RSKV(SEQIDNO:8)。亞型和特定PL模體間存在著強相關(guān)性；RSKI(SEQIDNO:40)和H3N2(93%),ESEV(SEQIDNO:2)和H5N1(100%)，KSEV(SEQIDNO:41)和H1N1(100%，盡管數(shù)量少)，RSEV(SEQIDNO:7)和H3N2(98%),以及RSKV(SEQIDNO:8)和H3N2(95%)。雞PL分成5個序列組(參見表3b):ESEI(SEQIDNO:3),ESEV(SEQIDNO:2)，GSEV(SEQIDNO:6),ESKV(SEQIDNO:4)和GSKV(SEQIDNO:10)。亞型或亞型組與特定PL模體間存在著強相關(guān)性；ESEI(SEQIDNO:3)和H7N2(90%)，ESEV(SEQIDNO:2)禾卩H5N1(64%)，ESKV(SEQIDNO:4)和H5N2(84%)以及GSKV(SEQIDNO:10)和H5N2(100%-但數(shù)量稍小)。如果匯總需通報的禽流感或者H5和H7，ESEI(SEQIDNO:3)與NAI100%相關(guān)，ESEV(SEQIDNO:2)與NAI83%相關(guān)。鴨PL分成3個序列組(參見表3c)。豬PL分成7個序列組(參見表3d)。馬PL分成1個序列組(參見表3e)。NS1PL序列與HN分亞型的非隨機組合表明了通過NS1PL分型鑒定HN亞型的方法。PDZ結(jié)合模式可用于區(qū)分不同的PL序列，并作為流感分亞型的基礎(chǔ)。表3a-e表3a:人NSlPL572PL/747分離物<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>表3b:雞NSlPL237PL/345分離物<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>表3c:鴨NS1PL72PL/110分離物<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>表3e:馬NS1PL3PL/21分離物<table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table>檢查3個代表性的PL序列基團，ESEV(SEQIDN0:2)、EPEV(SEQIDNO:27)和RSKV(SEQIDNO:8),揭示了PL可能的起源。ESEV(SEQIDNO:2)首先出現(xiàn)在禽類分離物中，直到2003年才進入人類和哺乳動物宿主(參見圖1)。EPEV(SEQIDNO:27)首先出現(xiàn)在馬分離物中，在1997年進入人類、禽類和其他哺乳動物宿主(參見圖2)。RSKV(SEQIDNO:8)首先出現(xiàn)在人類分離物中，直到1997年才進入其他物種，具體是豬(參見圖3)。這類分析對評價流行性感冒的物種起源可以是非常重要的。上述分析證明了一種檢測流感病毒NS1多肽存在的新方法，它利用了對流感A特異和特定亞型特異的PL模體。特定PL的鑒定是鑒定樣本存在何種流感病毒株的方法。實施例2:PDZ分析本實施例描述PDZ蛋白與不同流感APL模體的結(jié)合。利用改良ELISA評定PDZ蛋白。簡單來說，產(chǎn)生GST-PDZ融合，其包含PDZ蛋白的完整PDZ結(jié)構(gòu)域。此外，合成對應(yīng)于不同流感A株NS1蛋白的C端20個箅基酸的生物素化的肽，并利用HPLC純化。這些實體之間的結(jié)合通過"G"分析檢測，這是一種比色分析，利用抗生物素蛋白-HRP結(jié)合生物素和過氧化物酶底物。來自特定流感株的NS1蛋白的序列如SEQIDNOS:42-47所顯示。檢觀IJNS1PL(或者就H5N1A來說是C末端)與人PDZ蛋白的結(jié)合，利用(i)選擇模擬流感AH5N1、H1N1和H3N2株中某些NS1PL(或者C末端)序列的生物素化的合成20-mer肽；禾B，(ii)重組系統(tǒng)中合成基因編碼的重組NS1蛋白，即，表達系統(tǒng)中合成NS1DNA并與編碼MBP免疫化學(xué)標(biāo)簽的序列融合(麥芽糖結(jié)合蛋白；NEB;根據(jù)廠商的說明書產(chǎn)生)。在人類基因組中所有不同PDZ結(jié)構(gòu)域的幾乎全套(255)組成的陣列形式中檢測基質(zhì)graphPeptides和蛋白。每個PDZ結(jié)構(gòu)域多肽都可以在商品化的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽的表達系統(tǒng)中表達為重組GST-PDZ多肽。利用鏈霉親和素-HRP和TMB底物，檢測生物素化的PL肽與PDZ結(jié)構(gòu)域多肽的特異結(jié)合。同樣地，利用生物素化的抗MBP、鏈霉親和素-HRP和TMB底物，可顯示NS1-MBP融合蛋白與PDZ結(jié)構(gòu)域多肽的特異結(jié)合。分析結(jié)合的相對強度，顯示每個PL的強和弱結(jié)合劑。當(dāng)用于捕獲或者鑒定PL蛋白時，優(yōu)選結(jié)合更強的。PDZ蛋白。但是對于利用PDZ蛋白與不同PL蛋白差異結(jié)合的試驗，'弱結(jié)合PDZ蛋白仍然可能是有用的。結(jié)果如下檢測來自A/Taiwan/1996AcJAAC14269株的MBP,NS1H1N1(RSEV)PL(SEQIDNO:42)與多種PDZ蛋白的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)下列PDZ蛋白結(jié)合強Rho-Gap10,Syntrophin1a，外膜，Magi2d3，Magild4，Tip43dl，Magildl，Tip1,PSD95dl，2,3,PTPL1d2,PSD95d2，INADLd8,DLGldl,2,Vartuld2，PSD95dl,Magil3dl，DLGld2.Mast2dl，NeDLGdl,2，SNPClla，DLG2d2。發(fā)現(xiàn)下列PDZ蛋白結(jié)合弱:Magi3d2，PTN3dl,DLG2dl.在利用直接結(jié)合夾心分析的滴定研究中，發(fā)現(xiàn)PSD95dl,2,3結(jié)合的EC50為1.29/ig/ml，外膜蛋白結(jié)合的ECso為1.25pg/ml.。其他測定結(jié)果顯示于4a。表4a:滴定EC50:MBP.NSlH1N1(RSEV-SEQIDNO:7)<table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table>檢測來自A/NewYork/31/2004Ac.#AAX56415株的MBP.NS1H3N2(RSKV)PL(SEQIDNO:43)與多種PDZ蛋白的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)下列PDZ蛋白結(jié)合強:外膜，PSD95d1,2，3，INADLd8,DLGldl,2,Grip1d4，Shank1,GoRaspldl，SimGoRasp65,Syntenind2,NeDLGd3，F(xiàn)LJ12615,KIAA0967,PTN3dl,DLG2dl，NeDLGl，dl,2，DLG2d2,mastldl，Kiaal719d4,Kiaal415dl，和PicklFL。發(fā)現(xiàn)下列結(jié)合弱Shank2，NumbBPd3，psd95dl,2，3，和Mast2dl。在利用直接結(jié)合夾心分析的滴定研究中，發(fā)現(xiàn)PSD95dl，2,3結(jié)合的ECso為25.3/xg/ml，發(fā)現(xiàn)INADL結(jié)合的ECso為0.869pg/ml。其它測定結(jié)果顯示于表4b。表4b:滴定EC50:MBP.NSlH3N2(RSKV-SEQIDNO:8)<table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table>檢測來自A/HongKong/97/1998Ae.#AAK49317株的MBP.NS1H5N1A(EPEV)PL(SEQIDN0:44)與多種PDZ蛋白的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)下列PDZ蛋白結(jié)合強ALP，PSD95dl,和PICKFL。發(fā)現(xiàn)下列結(jié)合弱INADLd8,NeDLGdl,2，和KIAA1719d4。在利用直接結(jié)合夾心分析的滴定研究中，發(fā)現(xiàn)外膜蛋白結(jié)合的ECso為12.55/tg/ml，發(fā)現(xiàn)PSD95dl，2，3結(jié)合的EQo為15.76/xg/ml。其它測定結(jié)果顯示于表4c。表4c:滴定EC50:MBP.NS1H5N1A(EPEV-SEQIDNO:27)<table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table>檢測來自A/Vietnam/1194/2004Ac.#AAT73394株的MBP,NSlH5N1B(ESEV)PL(SEQIDNO:45)與不同PDZ蛋白的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)下列DZ蛋白結(jié)合強:DLG1dl,2,LIMmystiquedl，DLG2d3,Vartuld2,PSD95dl，Magi3dl,DLGld2,PTN-3dl,DLG2dl，NeDLGldl,2，Magi2d5,DLG2d2,禾口PSD95d3CSBound,Magi2dl,DLGldl,RhoGaplO，外膜，Magild4，Tip43，Tipldl，PSD95dl,2,3,Tip33dl，PSD95d2。發(fā)現(xiàn)下列結(jié)合弱:SIP1d2,LimRiL，mint3d2，ALP1,PSD95d3:SEMCAP3dl,LIMK1,Kiaa0613，Syntrophinyl，Magi2d6,Mast2dl，Magild5，INADLd3,Magi3d2,syntrophin1a，magi2d3,par3Ld2，Magildl,Kiaal719d5，Vartuldl,和PTPLldl。在利用直接結(jié)合夾心分析的滴定研究中，發(fā)現(xiàn)PSD95dl,2，3結(jié)合的EC5o為0.29/xg/ml，發(fā)現(xiàn)外膜蛋白結(jié)合的ECso為0.18Mg/ml。其它測量結(jié)果顯示于表4d(ND表示未進行)。表4d:滴定EC50:MBP.NS1H5N1B(ESEV-SEQIDNO:2)<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table>檢測來自A/duck/ST/4003/2003Ac.#AAF02349/6048830株的肽1958H5N1A(EPEV)PL(SEQIDNO:46)與不同PDZ蛋白的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)下列DZ蛋白結(jié)合弱MAST2dl，PSD95dl，2，3'和PSD95d2。在利用直接結(jié)合夾心分析的滴定研究中，發(fā)現(xiàn)PSD95d2結(jié)合的EC50為3.8/ig/ml，發(fā)現(xiàn)PSD95dl,2,3結(jié)合的ECso為4.1jLtg/ml。其它測定結(jié)果顯示于表4e。表4e滴定EC50:1958H5N1A肽(EPEV-SEQIDNO:27)<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>檢測來自A/chicken/HongKong/915/1997Ac.#AAT73457/50296374株的肽1959H5N1B(ESEV)PL(SEQIDNO:47)與不同PDZ蛋白的結(jié)合。符合碰撞分類(hitclassification)特定標(biāo)準(zhǔn)的PDZ匯總于基質(zhì)碰撞列表(MatrixHitsList)的表4a-e，顯示相互作用的相對強度。為了按碰揸(hit)分類，NS1-PDZ相互作用的OD必須大于T均背景的兩倍，并且它必須在至少兩個樣本中符合碰撞。分類為"弱"的碰撞具有小于0.5的OD，分類為"強"的碰撞具有大于0.5的OD。利用如上所述的用于基質(zhì)分析的相同檢測系統(tǒng)進行肽和融合蛋白滴定。基質(zhì)碰撞列表用于確定何種PDZ與NS1滴定來測定相互作用的強度。上面顯示了每種檢測的特定PL的滴定結(jié)果。列出了滴定NSl-PDZ相互作用計算出的EC5Qs。下面提供使用的特定分析和方法。A.肽純化代表不同流感ANS1蛋白C端20個氨基酸的肽，通過標(biāo)準(zhǔn)FMOC化學(xué)方法合成，如果不用作未標(biāo)記的競爭性試劑，則將其生物素化。利用大小為10*25mm，5um的Vydac218TPCI8反相柱，通過反相高效液相色譜法(HPLC)純化肽。大約40mg的肽溶于2.0mL49.9%乙腈和0.1。/。三氟乙酸(TFA)的水溶液中。然后通過25微米注射過濾器(Millipore)將該溶液注入HPLC設(shè)備。用于獲得好的分離的緩沖液是(A)含有0.1。/。TFA的蒸餾水和(B)含有乙腈的0.1%TFA。分離是基于肽的性質(zhì)發(fā)生的?？傮w上疏水性的肽比親水性的肽更晚洗脫。收集包含"純"肽的級份，利用質(zhì)譜儀(MS)核查。純化的肽進行凍干以保持穩(wěn)定和以后使用。B.鑒定肽和融合蛋白試劑和材料之間相互作用的"G"分析NuncPolysorp96孑L酶標(biāo)板(Nunccat#62409-005)(Maxisorp板顯示有較高的背景信號)PBSpH7.4(GibcoBRLcat#l6777-148)或者(AVC磷酸鹽緩沖鹽水，8gNaCI，0.29gKCl，1.44gNa2HP04,0.24gKH2P04，力口H20到1L和pH7.4;0.2阿過濾2%BSA/PBS(10g牛血清白蛋白，級份V(ICNBiomedicalscat#IC15142983)溶于500mlPBS山羊抗-GSTmAb儲存液5mg/ml，4°C保存，(AmershamPharmaciacat#27-4577-01),PBS1:1000稀釋，終濃度5jug/mlHRP-鏈霉親和素，2.5mg/2ml儲存液4°C保存(Zymedcat#43-4323)，2%BSA1:2000稀釋，終濃度0.5pg/ml'洗滌緩沖液，0.2%Tween20溶于50mMTrispH8.0即用TMB(Dakocat#S1600)1MH2S0412w多道移液器，50ml試劑庫，15ml聚丙烯錐形管方案1)用100pi5jug/ml山羊抗GST包被板，在4°CO/N2)倒出包被抗體，輕拍干3)封閉一每孔添加200]ul2%BSA，4°C2小時4)在2。/。BSA中準(zhǔn)備蛋白(每排或者每兩列2ml)5)用冷的PBS洗滌3次(在整個實驗中必須是冷的)(洗滌最后在孔中殘留PBS直到立即添加下一步)6)在冰上每孔添加50pl蛋白(4"Cl-2小時)'7)在2。/。BSA中準(zhǔn)備肽(2ml/排或者/列)8)用冷的PBS洗滌3次9)在冰上每孔添加50/d肽(開始時間/結(jié)束時間)a.在添加最后一次肽后在冰上放置恰好IO分鐘.b.在室溫放置恰好20分鐘a10)準(zhǔn)備12ml/板的HRP-鏈霉親和素(在2%BSA中1:2000稀釋)11)用冷的PBS洗滌3次12)在冰上每孔添加100plHRP-鏈霉親和素，4'C20分鐘13)打開讀板器，準(zhǔn)備文件14)洗滌5次，避免起泡15)用手套，每孔添加100/ilTMB底物。a.在室溫下暗處孵育b.定期檢查板(5，10&20分鐘)c.如果需要，在650nm(藍色)讀取早期讀數(shù)d.在20分鐘時，用100/il1MH2S04終止反應(yīng)e.在450nm(黃色)讀取最終讀數(shù)實施例3:NS1蛋白在人臨床樣本中的表達檢查人鼻分泌物中流感ANS1的存在和量。收集人鼻抽吸物，-80'C保存于M4病毒轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基(Remel,Inc，Lenexa，KS)中。解凍保存的材料，在10。/。SDS-PAGE上電泳。用NS1，3H3和1A10的單克隆抗體(ArborVitaCorporation,sSunnyvale,Ca)進行Western印跡分析。6個樣本的結(jié)果顯示于圖4。該結(jié)果顯示NSl在鼻分泌物中大量存在。為了研究感染流感A病毒的細胞產(chǎn)生和分泌NS1的時間線，MDCK細胞在0.1的MOI下被人流感A/PR/8感染。收集上清液以及細胞，在1%TritonX-100中裂解，利用對NS1泛反應(yīng)性的單克隆抗體3H3進行SDS-PAGE和Western分析。感染后24小時內(nèi)在感染細胞中檢測到NS1，48小時內(nèi)在感染細胞的上清中檢測到NS1(參見圖5)。這表明基于NS1的診斷也許能在48小時內(nèi)和可能24小時內(nèi)檢測流感A造成的感染。實施例4:細胞中NS1與PDZ的相互作用為驗證細胞中NS1與PDZ蛋白的相互作用，進行一系列PDZ牽出(pull-down)實驗。用包含HA-NS1-H5N1B的質(zhì)?；蛘哂肏A-NS1-H3N2轉(zhuǎn)染293HEK細胞。按照此處所述制備裂解產(chǎn)物。制備谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠-PDZ珠(10ugDLGld1，2，10ugNeDLGdl，2，和10ugPSD95dl,2，3)，用于牽出(pulldown)來自轉(zhuǎn)染的293ET細胞的150ug裂解產(chǎn)物，如圖6和7所示。在4'C過夜孵育并用HNTG緩沖液多次洗滌后，用牽出物制備膜。該膜用F63-3G1上清(l:5)探測。全部3個檢測的PDZs成功地從表達HA-H5N1B的細胞中牽出NS1(參見圖6)。類似地，制備谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠-PDZ珠(40uglNADLd8)，用于牽出轉(zhuǎn)染H3N2的293ET細胞的150ug裂解產(chǎn)物。在4'C過夜孵育和用PBS多次洗滌后，準(zhǔn)備Western印跡，用a-HA(1:500)(Roche)檢測。INADLd8成功地從細胞裂解產(chǎn)物中牽出HA-H3N2NS1(圖7)。結(jié)論是如基質(zhì)(MATRIX)分析所確定，NS1PL在細胞內(nèi)是有功能的，它可以與PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用。實施例5:NS1的單克隆抗體制備與NS1蛋白亞型、NS1PL類特異結(jié)合和具有泛特異性的單克隆抗體。產(chǎn)生NS1單克隆抗體的策略如下，結(jié)果顯示于表5、6和7:1.制備用于表5匯總的亞型的NS1的GST和MBP融合蛋白。克隆載體獲自Pharmacia(GST)或者NewEnglandBiolabs(MBP)。通過DNA2.0(MenloPark，Ca)利用重疊寡核苷酸合成NS1編碼區(qū)。2.用MBP-NS1融合蛋白免疫小鼠，劑量范圍是每劑量10-100ug，開始在CFA中，然后是在IFA和PBS中。3.根據(jù)Kohler和Milstein所述(Nature1975),在用相應(yīng)GST-NS1融合蛋白最后一次加強免疫后3天，收集脾細胞和淋巴細胞，并與FOX-NY骨髓瘤細胞融合。4.首先在ELISA(參見表5-7的直接ELISA)中用MBP-NSl篩選雜交瘤?？寺￡栃钥?，用一組MBP和GSTNSl再篩選，并將其分為泛反應(yīng)性的或者亞型活性的5.利用Western印跡進一步篩選，證實符合NSl的靶蛋白的分子6.利用S2分析形式(參見實施例4)進行另外的篩選，用于與PDZ捕獲的相容性(參見表5-7的S2ELISA)。7.用細胞裂解產(chǎn)物形式的真核表達NS1重復(fù)步驟5和6。8.檢查抗體對實施例6所述側(cè)向流形式的相容性。9.最后，檢查抗體檢測臨床樣本中NSl的能力。該工作流程對獲得識別人臨床樣本的抗體是關(guān)鍵的。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table>表5(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table>表6<table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>實施例6:側(cè)向流圖8,9和11提供用于NS1檢測的側(cè)向流形式的實施例。圖8提供一種側(cè)向流，利用PDZ捕獲繼之以單克隆抗體檢測。對所有情況，利用提條器(striper)將重組PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白或者抗體沉積在RF120Millipore膜上。對圖8，PDZ蛋白PSD95Dl-3，和INADLD8沉積濃度為0.5mg/ml。還沉積對照條帶，其由山羊抗小鼠抗體(GAM)組成，濃度也為0.5mg/ml。NS1蛋白與lOOul體積溶于TBS-T緩沖液的金交聯(lián)單克隆的抗NSl例如4B2結(jié)合。使用的NSl蛋白來自HlNl，H3N2,H5N197,H5N1，而對照道(controllane)不包含NS1。在所有情況下，稀釋人鼻抽吸物并保存于鹽水或者M4，按指示。樣本與如下所述量的金交聯(lián)抗體直接混合。將PDZ條膜插入NSl/抗NSl蛋白溶液，流動起始于毛細管作用和導(dǎo)濕墊。根據(jù)PDZ反應(yīng)性模式對NS1進行分型；H1N1與PSD95和INADLd8均結(jié)合；H3N2只結(jié)合INADLd8;H5N1只結(jié)合PSD95。利用與PDZ的反應(yīng)性和用金交聯(lián)的泛反應(yīng)性抗NSl單克隆抗體，根據(jù)NSl側(cè)向流的結(jié)果進行流感A分型。在圖9中，13種不同的單克隆抗體沉積在側(cè)向流裝置中。這13種使用的抗體是F64-lAO,F64-3H3，F(xiàn)64-6G12,F64-7A8,F64-7D1，F(xiàn)68-1D10，F(xiàn)68-4B2，F(xiàn)68-4H9,F68-6A12,F68-6B7，F(xiàn)68-6D6,F68-7B10。向包含H1N1流感病毒的樣本中添加亞型特異的金交聯(lián)泛NS1抗體。將樣本加入側(cè)向流裝置，結(jié)果顯示于圖9。該結(jié)果顯示，泛特異抗體可以用于鑒定何種抗體與H1N1結(jié)合最好的試驗和測定。利用下列符號定量結(jié)合強度(-)是指沒有結(jié)合，(+)是指弱結(jié)合，(+++)是指強結(jié)合和(++)是指中等結(jié)合。在膜上沉積泛特異抗體，產(chǎn)生鑒定患者樣本中致病性流感A的側(cè)向流試驗。患者樣本與金標(biāo)記抗體的混合物混合，所述抗體識別全部NS1PL。樣本加入側(cè)向流測試條，如果存在流感A的致病株，條上將形成一條線。利用下列方案和材料進行條測試檢驗使用的材料包括:之前用山羊抗小鼠/PSD95dl，2，3/INADLd8涂條的測試條；TBST/2%BSA/0.25%Tween20緩沖液；NS1蛋白MBP-H1N1、MBP-H3N2、MBP-H5N1A、和MBP-H5N1B"舊"(Jon's)快速金交聯(lián)F68-4B2抗體的儲存液；和MaxisorpELISA板。按如下步驟進行1.)NS1蛋白儲存液在TBST/2%BSA/0.25%Tween20中稀釋到100ng/uL(利用不少于5uL蛋白進行稀釋)2.)通過向lOuLTBST/2%BSA/0.25%Tween20中添加10uL蛋白，將100ng/uL稀釋液被稀釋到50ng/uL3.)制備溶于TBST/2%BSA/0.25%Tween20緩沖液的金交聯(lián)抗體儲存液。每lOOuL緩沖液中添加4uL抗體，準(zhǔn)備足夠6個lOOuL反應(yīng)(這提供了額外的死體積)使用的緩沖液。4.)ELISA板各孔中添加98uL抗體/緩沖液混合物5.)向含有緩沖液的孔中添加2uLNSl稀釋液(每孔一種NS1)6.)—個孔中只有抗體和緩沖液作為陰性"無NS1"對照7.)輕敲ELISA板若干次以混合孔的內(nèi)含物8.)在孔中加入預(yù)涂條(pre-striped)的測試條，在進展期間觀察。在大約15分鐘后(當(dāng)全部液體已經(jīng)被吸收，但條還未干燥時)，從孔中取出條，掃描進計算機。圖10a和10b中提供的試驗按如下方式制備GST-PSD95d1，2，3蛋白以3mg/mL涂條在膜上用于禽類試驗，或者可以使用兩種單克隆抗體的混合物(l.lmg/mLF64-3H3和0.075mg/mLF68-4H9用于泛流感A試驗)。lmg/mL多克隆山羊抗小鼠抗體的第二條線用于試驗捕獲線。下面闡明試驗步驟。1.制備具有樣本膜和接收墊(sinkpad)的卡片。2.用PDZ蛋白和/或抗體對膜涂條(參見上面對濃縮的說明)3.膜在56度干燥過夜，然后將卡片切成4.26mm寬的條。4.將玻璃纖維樣本墊與條的底部連接，將完整的條放置于盒內(nèi)用于測試。5.解凍待測樣本，添加80m1樣本到20/xl緩沖液中。上下抽吸若干次進行混合。6.在樣本/緩沖溶液中摻加8^1金交聯(lián)(Au-)檢測體混合物。該檢測體混合物是4/xlAu-F68-4B2和4piAu-F68-3D5。上下抽吸若干次進行混合。7.在盒的樣本孔中添加100/d制備的樣本。8.在樣本添加后15分鐘讀取盒上的試驗和對照線。對于任何讀數(shù)可信的試驗結(jié)果，對照線都是清晰可見的。流感A陽性樣本標(biāo)注為(+)。流感A陰性樣本標(biāo)注為(-)。上箭頭(toparrow)指向?qū)φ?，下箭頭(bottomarrow)指向測試。在兩種情況下，頂部線是對照線(山羊抗小鼠mAb)，下面第二條線是測試線(用于泛流感A試驗的F64-3H3和F68-4H9mAbs的混合物以及用于禽類試驗的PSD95dl,2，3)。對禽類試驗檢測2ngH5Nl蛋白。底部環(huán)狀斑點是樣本孔。在圖10a中，兩個試驗都是陽性的。圖10c顯示用圖10a和10b所示形式檢測的20個人樣本中的3個。所述樣本顯示各種結(jié)果，例如，樣本1對流感A是陽性的，但對禽流感A是陰性的，樣本14對兩者都是陰性的。圖10d顯示對HlNl,H3N2，和H5N1重組蛋白相同的試驗。泛FluA試驗對這三個都是陽性的。禽流感試驗只對H5N1是陽性的。在圖10e中，金交聯(lián)PDZ用作檢測體，而單個或者多個mAb用于捕獲。圖10e具有以含有F6S-4B2mAb捕獲劑的Au-PSD95dl,2，3形式添加的液體金(liquidgold)。1.7ngNS1H5N1蛋白檢測陽性。這是禽流感特異性試驗。在圖10f中，使用干金(driedgold)方法?？ㄆ闹苽渑c液體金方案相同，除了在進行任何涂條前樣本墊被固定到卡片上。當(dāng)捕獲劑被涂下條后，在卡片底部的樣本墊上噴射金交聯(lián)檢測體混合物(其這時還包含偶聯(lián)稀釋劑)?？ㄆ桓稍?，切割，并像液體試驗一樣放入盒中。當(dāng)制備人樣本時，在100/Xl人樣本在盒中進行反應(yīng)時，它們只用緩沖溶液處理(不添加其他的金交聯(lián)檢測體混合物)。流感A陽性樣本標(biāo)注為(+)，流感A陰性樣本標(biāo)注為(-)。這些盒的設(shè)計和讀數(shù)與液體金盒一樣。在圖10f中，樣本7和9對流感A和禽流感都是陽性的，樣本12對流感A和禽流感都是陰性的。實施例7:PDZ/PDZ配體相互作用的抑制劑在該實施例中，選擇化合物分析其作為PDZ/PDZ配體相互作用的抑制劑。對于挑選的PDZ/PL對，篩選了下列23種藥物(1-17號是COX抑制劑)。l.氟尼酸，2.布洛芬，3.奈普生鈉，4.雙氯芬酸鈉鹽，5.乙酰水楊酸，6.水楊酸，7.氟吡洛芬，8.舒林酸硫醚，9.舒林酸，10.依托度酸，11.吲哚美辛，12.酮咯酸氨丁三醇鹽，13.酮基布洛芬，14.甲芬那酸，15.卡洛芬，16.巴氯芬，17.菲諾洛芬，18.甲磺酰苯扎托品，19.鹽酸阿米替林，20.色甘酸鈉，21.鹽酸去甲丙咪嗪，22.鹽酸氯丙咪嗪，和23.鹽酸去甲替林。在下面的說明中，A部分提供利用COX抑制劑進行的實驗，B部分提供利用小分子抑制劑進行的實驗，C部分提供利用肽抑制劑進行的實驗。表8提供A-C部分中用于鑒定抑制劑的PDZ/PL相互作用。使用的PL序列是SEQIDNOS:54-59。結(jié)果顯示于表1-13。表8:用于藥物篩選的PDZ/PL相互作用<table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table>A.根據(jù)以下兩個標(biāo)準(zhǔn)選擇COX抑制劑:l.存在好在PDZ的零位發(fā)生相互作用的羰酸基團，和2.可以位于PDZ零位的羰酸基團附近的疏水性或者芳香族基團。疏水性或者芳香族基團不是絕對必需的，但是優(yōu)選的。濃度為250uM藥物濃度的COX分子在基質(zhì)/陣列競爭性分析形式中接受篩選，5卩，該分析中在前面描述的小分子競爭物存在或者缺失的條件下，測定配體與融合蛋白中固相PDZ結(jié)構(gòu)域的對接(docking)。結(jié)果如下。舒林酸硫醚抑制Magildl/AVC1857。菲諾洛芬抑制PSD95dl/AVC1912相互作用。分析中沒有任何藥物顯著抑制PSD95d2/AVCAA345相互作用。菲諾洛芬抑制PSD95d2/AVCAA348相互作用。菲諾洛芬抑制PSD95d3/AVC1916相互作用。菲諾洛芬抑制SHANK1/AVC1965相互作用。舒林酸硫醚抑制TIP1/AVCAA56相互作用。其他藥物在該分析中未顯示顯著的抑制。兩個主要小分子碰撞是舒林酸硫醚和苯氧苯丙酸。結(jié)果表明COX抑制劑可以用作PDZ/PDZ配體相互作用的抑制劑，這些抑制劑的衍生物可能是基于PDZ的靶標(biāo)的有效治療劑，那些被測的舒林酸硫醚和菲諾洛芬顯示出最強的抑制作用。B.根據(jù)分子模型預(yù)測PDZ/PDZ配體相互作用的小分子抑制劑。禾廿用Accelryssoftware(Accehys，SanDiego，CA)的insilico蹄選構(gòu)建模型，和用4種不同PDZ結(jié)構(gòu)域模擬物對接(dock)650,000分子文庫(ChemDiv,SanDiego,CA;BlancaPharmaceuticals,MountainView,CA)。該分子模型基于發(fā)現(xiàn)的化合物具有通過靜電、氫鍵鍵合和疏水性相互作用與PDZ相互作用的能力。從insilico篩選得到的最佳碰撞用于在基質(zhì)/陣列競爭性分析形式中接受篩選，即，該分析中在別處描述的小分子競爭物存在或者缺失的條件下，測定配體與融合蛋白中固相PDZ結(jié)構(gòu)域的對接(docking)。表9列出了篩選的抑制PDZ/PDZ配體相互作用的小分子?？梢詤⒖急绢I(lǐng)域技術(shù)人員任何已知的小分子公共數(shù)據(jù)庫，獲得待測小分子抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)式。小分子抑制劑的其他實施例可見于美國臨時申請ARBV:002USP1，標(biāo)題為"SmallMoleculeInhibitorsofPDZInteractions",_提交，在此完整引入作為參考。用于篩選的小分子濃度是250uM。這些篩選的結(jié)果顯示于表10。表9250UM小分子濃度下，藥物篩選中用于碰撞的碰撞相對強度<table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table>表10<table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table>參考總結(jié)結(jié)果的表10和11，根據(jù)分析的OD(450)讀數(shù)，小分子被認(rèn)為是碰撞弱、中或者強弱碰撞OD相對于對照降低〉40y。，中碰撞OD相對于對照降低40-60%，強碰撞OD降低〉40%。在該后來分析中最好的碰撞然后進行滴定結(jié)合研究，即，在相同競爭性分析中滴定小分子進行估算，IC5o值和結(jié)果總結(jié)于表10。根據(jù)insilico篩選，鑒定出PDZ/PL相互作用的不同小分子抑制劑。這些分子可用于阻斷治療值的PDZ/PL相互作用，包括流感ANS1/PDZ相互作用。C.鑒定和檢測肽治療抑制劑(參見表11)。每個包含PL(H5N1，H3N2和H1N1)的流感ANS1蛋白類型具有與若干種PDZs相互作用的潛力。這些PDZ的每一個本身可能就是抗有關(guān)流感A株的潛在治療革巴標(biāo)，這樣的話，用肽阻斷PDZ可能具有治療功用。為了鑒定潛在的治療肽，搜索AVC專利數(shù)據(jù)庫尋找每個PDZ的PDZ配體。AVC數(shù)據(jù)庫包含PL/PDZ相互作用，這是基于經(jīng)先前描述的專利ELISA試驗(G分析)鑒定的。用于鑒定有希望的PL的標(biāo)準(zhǔn)基于下列3個標(biāo)準(zhǔn)1)OD(450nm)>=0.5，2)測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<0.25，3)肽濃度=<20微摩爾。根據(jù)PDZ/PL結(jié)合相互作用、結(jié)構(gòu)和結(jié)合數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，鑒定C端序列最可能與根據(jù)PSD95d2結(jié)構(gòu)和結(jié)合數(shù)據(jù)的PSD95d2結(jié)構(gòu)(SEQIDNO:l，例如)結(jié)合。因此，禽流感A(H5N1)優(yōu)選的肽治療抑制劑基于結(jié)合PSD95d2的肽和，與符合共有序列E/D/N/Q-S/T-D/E/Q/N-V/L(SEQIDNO:48)的PSD95d2結(jié)合的最佳和優(yōu)選的肽序列。利用這些共有序列，以下是用作結(jié)合PSD95d2結(jié)構(gòu)域的肽抑制劑優(yōu)選C端序列的實例1)ESDV(SEQIDNO:49)2)ESEV(SEQIDNO:2)3)ETDV(SEQIDNO:50)4)ETEV(SEQIDNO:51)5)DTDV(SEQIDNO:52)6)DTEV(SEQIDNO:53)7)DSDV(SEQIDNO:996)8)DSEV(SEQIDNO:997)針對各PDZ的潛在PDZ配體治療肽匯總于表11。表11在第一列顯示PL肽標(biāo)識符(AVCID)，第二列顯示PL肽名稱(源自作為其來源的蛋白)，第三列顯示肽序列，最后一列顯示序列識別號。表的每個部分包含一個題頭，表明PLs將結(jié)合的PDZ蛋白。表11所示的肽或者其保留C端PL的截短型是適于治療流感的試劑。阻斷致病性流感PL與PDZ結(jié)合的PL肽治療劑可用于治療致病性流感。例如，通過將轉(zhuǎn)運蛋白肽(蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)連接到該肽序列的N端，這些肽(SEQIDNOS:89-987)中每個肽的C端序列(長3到20個氨基酸)可以轉(zhuǎn)變成治療劑。具有C端保守的3個氨基酸的至少長5個氨基酸的這些肽的亞片段被用作表11所列各PDZ的病毒PL/PDZ相互作用的治療抑制劑，優(yōu)選，至少6個氨基酸長，7個氨基酸長，8個氨基酸長，9個氨基酸長，和10個氨基酸長。優(yōu)選至少C端4個氨基酸是保守的，更優(yōu)選，C端5個氨基酸是保守的，C端6個氨基酸，或者C端7個氨基酸。肽治療劑還包括包含肽模擬物中氨基酸保守取代的肽。但是，優(yōu)選保守取代位于除了最后3或者4個氨基酸以外的區(qū)域中。使用若干種轉(zhuǎn)運蛋白肽序列，包括Tat和觸足蛋白。利用實施例2描述的A或者GPDZ分析，鑒定那些抑制PDZ/PL相互作用的肽，對所述肽進行進一步分析。對那些被證明具有抑制作用的肽在體外和流感動物模型中進行進一步研究。實施例8:與毒性相關(guān)的NS2模體在前面部分，NS1PL模體，ESEV(SEQIDno:2)，與禽亞型H5N1中所見的高度毒性/致死表型有關(guān)。因為NS1的PL部分與NS2重疊，分析了禽pl保守性對重疊區(qū)中NS2序列的影響。NS1和NS2對重疊區(qū)使用不同的讀碼框，這對可以使用的密碼子的選擇構(gòu)成了限制。所述分析確認(rèn)，該區(qū)域的序列變化改變了NS1而不是NS2的蛋白序列(參見表12和13—在表12中STYPE是指病毒的亞型)。具體地，在H5N1中，pl序列ESEV(SEQIDNO:2)，EPEV(SEQIDNO:27)和ESKV(SEQIDNO:4)不改變NS2的蛋白序列，在NS2的70位保持絲氨酸(S或者Ser)。相反，良性亞型例如H3N2包含導(dǎo)致70位為甘氨酸的核苷酸序列。這種情況的唯一例外是導(dǎo)致1918年致命大流行病的1918株H1N1，其表達PL，KSEV(SEQIDNO:41)，這導(dǎo)致與H5N1株一樣的70位絲氨酸。表12所示的NSlPL序列是ESEV(SEQIDNO:2),EPEV(SEQIDNO:27),ESKV(SEQIDNO:4)，RSKV(SEQIDNO:8),KSEV(SEQIDNO:41)，和RSEV(SEQIDNO:7)，在表中鑒別NSlC端編碼區(qū)域的SEQIDNO與NS2區(qū)域的SEQIDNO相同s(參見表12和13)。因此，流感A病毒NS2蛋白中70位的絲氨酸與病毒的毒性相關(guān)。因而，70位絲氨酸可以用作高毒性的標(biāo)記物，而NS2中70位甘氨酸可以用作更良性的臨床病程的標(biāo)記物。下文中NS270位的變化被用作診斷標(biāo)記物和治療靶標(biāo)。絲氨酸取代允許該序列被磷酸化，可能被激酶調(diào)控。表12/S70與高毒性臨床病程相關(guān)<table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table>用作診斷標(biāo)記物從表現(xiàn)流感A癥狀的患者中提取粘液樣本。該樣本經(jīng)過處理使其更具流動性以便用于側(cè)向流形式。利用實施例6中提出的方案產(chǎn)生側(cè)向流形式，除了用一種核酸鑒定捕獲劑來捕獲樣本中存在的任何包含70位絲氨酸的NS2，所述核酸與包括重疊區(qū)并包含來自表12的NS2蛋白中的絲氨酸70的序列互補。所述捕獲劑包括與所有已知的毒性流感A株互補的核酸。陽性結(jié)果表明患者應(yīng)該接受針對流感A病毒高毒性形式的治療。<table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table>基于單克隆抗體的試驗是相似的，除了一系列特異識別包括來自表12絲氨酸70的重疊區(qū)的抗體被用作捕獲劑。用于治療劑設(shè)計使用阻斷NS2和靶標(biāo)之間相互作用的治療劑。具體地，治療劑阻斷NS2蛋白在70位絲氨酸處的結(jié)合。給已經(jīng)感染流感A的患者或者在感染前施用肽或者小分子治療劑，給藥量足以阻斷NS2和其靶標(biāo)之間的相互作用。通過吸入給藥，繼續(xù)治療直到患者癥狀消失和/或患者不再有感染疾病的危險。本說明書引用的全部出版物和專利在此引入作為參考，就如各個獨立出版物或者專利是具體和單獨地表明引入作為參考。通過GID或者檢索號引用的Genbank記錄，尤其是任何多肽序列、多核苷酸序列或者其注釋在此引入作為參考。任何出版物的引用是因為其公開在提交日期前，不應(yīng)被認(rèn)為是承認(rèn)因為先前的發(fā)明，本發(fā)明不享有居先于這類出版物的權(quán)利。盡管本發(fā)已經(jīng)明參考其特定實施例進行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，可以做出各種改變和等同替換，而不脫離本發(fā)明的真實精神和范圍。此外，可以做出許多改進以使特定情況、材料、物質(zhì)的組成、方法、工序或者步驟適應(yīng)本發(fā)明的目標(biāo)、精神和范圍。所有這類改進認(rèn)為是在此處所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本說明書中提及的全部出版物和專利申請在此相同程度引入作為參考，就如各個獨立出版物或者專利申請是具體和單獨地指出用來引入作為參考。表11:結(jié)合DLG2dl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合GORASPdl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合GRIP1d4的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合INADLd8的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage149</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合KIAA1415dl的PL序列(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合KIAA1719d4的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage151</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合LimMystiquedl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合LimMystiquedl的PL序列(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合MAGIldl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage154</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合MAGIldl的PL序列(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage155</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合MAGI2d5的PL序列(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合MAGI2d5的PL序列(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合MAGI3dl的PL序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage158</formula>3表11續(xù)結(jié)合MAGI3dl的PL序列(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合MAGI3d2的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合NeDLGd2的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage163</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合NeDLGd2的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage164</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合外膜蛋白的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合外膜蛋白的PL序列AVCID肽序列Seq.IDNo.AA07CD34ATSRNGHSARQHVVADTEL635636AA244—a-2B腎上腺素能受體f丁AXispgg;leppsekhfretev637AA"2iGluR5-2PTPT!LGI;NIiGNDPDRGTSI638AA240多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白ELVDRGEV，TIiRHWLKV639AA240多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白iEIiVDRGEVRQFTLRHWLKV640Nedasin(S-型)NIEEVYVGGKQVVPFSSSV641AA181BAI-1(腦特異性血管生成抑制劑1)SGAT工PLVGQDIIDLQTEV642AA095GluR5-2(.大,)FTSIIiTCHQRRTQRKETVA643AA70.1HPVE6#"SGGNRARQERIiQRRRETQV644AA06CD6SPQPDSTDNDDYDDISAA645AA23.3Fas配體SSKSKSSEESGTBTGLYKL646AA228柄蛋白2SPDSSYQGKGFVMSRAMYV647AA223密蛋白lYPTPRPYPKPAPSSGKDYV648A入36神經(jīng)配蛋白TFAAGFNSTGLPHSTTRV649AA200LHER2受體FKGTPTAENPEYLGLDVPV650AA69.1HPVE6針6(修飾的)TGRGMSGGRSSRTRRETQL651AA66.1HPVE6#66(無半胱氨酸)(^"K:lq'awrht^rqStESTV652AA化ONMDA谷氨酸受體2C(無半胱氨酸)QGFPGPATWRRISSLESEV653AA22DNAM-1RED工YVNYPTFSRRPKTRV654AA33KV1.3TTNNNPNSAVN工KK工FTDV655AA114_GLUR7(代謝型谷氨酸擎體).|DPNSPAAKKKYVSYNNIjV工656AdenoE4typ9GTIiUjERVIFPSVKIATLV657AA125緊密連合蛋白3(ZO-3)HDAESSDEDGYDWGPATDL658AA77HPV-E6#63HKVRNKFKAKCSiLCRLYII659AA123a-輔肌動蛋白2PGALDYAAFSSALYGESDL660AA348TAT國DA2B9grkkrrqrrrk;lssiesdv6611777Tat-M-蛋白-SARS|GRKKRRQRRRNDNIALLVQ6621776Tat-E-蛋白-SARSGRKKRRQRRRSEGVPDLIjV663166表11續(xù)結(jié)合Pickldl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage167</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合PSD95dl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合PSD95dl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage169</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合PSD95dl,2的PL序歹iJ(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage171</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合PSD95d2的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage172</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合PSD95d2的PL序歹!j(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage173</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合PTN-3的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合SHANKl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合SHANKl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage175</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合TIP43dl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage176</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合Vartuld2的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage177</column></row><table>引文1.Fauci,2005，Nature435(7041):423-424.2.Normile，2005，Science308(5726):1234-1235.3.Guan，2002,PNAS99(13):8950-8955.4.Jin,2004,AvianDis.48(4):870-878.5.Webster,2004,Rev.ScLTech.23(2):453-465.6.Noah，2003Virology307(2):386-395.7.Chien，Biochemistry43(7):1950-62.8.Dauber，J.Fzro/.78(4):1865-1872.9.Quinlivan，2005J.Fifro/.79(13):8431-8439.10.Solorzano，2005JVirol,79(12):7535-7543.11.Stasakova,2005,JGe/Virol.86(Pt1):185-195.12.Diebold，2003,Nature424(6946):324陽328.13.Theoftlopoulos,2005，Ann.Rev.Immunol.23:307-336.14.Yang,2005J.Biol.Chem.280(36):31530-31536.15.Uddin，2002.J.Biol.Chem.277(17):14408-14416.16.Voss,2005JBiol.Chem.2ni:17371-17379.17.DeVries2004JBiol,Chem.279(44):45603-45612.18.Page2003J.Immunol.170(11):5681-5689.19.Farshori,2003,J.SteroidBiochem.Mol.Biol.85(2-5):337-347.20.Akca,2003，GrowthFactors21(1):31-39.21.Mmami2003，J.Biol.Chem.278(9):6976-6984.22.Greenspan,1988J.Virol.62:3020-3026.23.Compans，1973，Virology51:56-70.24.Krug，1973，Virology56:334-348.25.Seo2004,VirusRes.103(1-2):107-1326.Solorzano,2005,J.Virol.79(12):7535-7543.27.Quinlivan,2005J.Virol.79(13):8431-8439.28.Garcia-Sastre,1998，Virology252:324-330.29.Lipatov,2005，J.Gen.Virol.86(4):1121-1130.30.Usacheva,2001，J.Biol.Chem.276(25):22948-22953.31.Usacheva，2003J,Immunol.171(6):2989-2994.32.Osmanagic-Myers;2004.Plectin-RACKl，J.Biol.Chem.279(8):18701-18710.33.Litjens,2005，J,Biol.Chem.280(23):22270-7.34.Kubota,2002，J,Virology16(24):12676-12682.35.Yokota,2003,Virology306(1):135-146.36.Spackman,2005,J.Vet..Diagn..Invest.17(1):76-80.37.Lee,J.Virol,Methods119(2):151-158.38.Munch,2001,Arch.Virol.146(1):87-97.39.Xu，2005，J.Clin.Microbiol.43(4):1953-1955.40.Tumpey,2005,J.Clin.Microbiol.43(2):676-682.41.Steininger,2002，J.Clin.Microbiol.40(6):2051-2056.42.Cattoli,2004,AvianPathol.33(4):432-437.43.Kaiser,1999"J.Clin.Virol.14(3):191-197.44.Tucker,2001.Philos.Trans.R.Soc丄ondBBiol.Sci.356(1416):1915-1924.45.Sharma，2002,Arch.Pediatr.Adolesc.Med.156(1):41-43.50.B層n，1983,NS1.Virology130(1):134-143.'51.Seo，2000,NatureMedicine8(9):950-954.52.Govorkova,2005J.Virol.19(4):2191-2198.權(quán)利要求1.一種鑒定患者是否感染A型流感病毒的方法，包括確定患者樣本中是否存在A型流感病毒的NS1蛋白，存在表明患者感染A型流感病毒。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其中確定包括將患者樣本與特異結(jié)合A型流感病毒蛋白NS1的試劑接觸；和檢測該試劑和NS1蛋白之間的特異結(jié)合，特異結(jié)合表明A型流感病毒的存在。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中確定包括確定編碼NS1蛋白PDZ配體模體(PL)的mRNA的存在，并由mRNA的存在推斷出NS1蛋白的存在。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中NS1蛋白PL具有模體S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸，和X是任意氨基酸。5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中試劑是至少一種PDZ多肽。6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中試劑是至少一種抗體。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中抗體對NS1蛋白的保守區(qū)特異。8.如權(quán)利要求2所述的方法，其中接觸步驟包括，將患者樣本與特異結(jié)合A型流感病毒蛋白NS1不同表位的第一和第二試劑接觸，第一試劑固定在支持物上，并且檢測步驟檢測其中第一和第二試劑與NS1蛋白特異結(jié)合的夾心，以表明病毒的存在。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中第一和第二試劑是第一和第二抗體。10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中第一試劑是一種或者多種PDZ多肽，和第二試劑是一種或者多種抗體。11.如權(quán)利要求8所述的方法,其中第一試劑是一種或者多種PDZ多肽和一種或者多種抗體的混合物。12.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述抗體是對A型流感病毒NS1的所有亞型特異的抗體。13.如權(quán)利要求5所述的方法，其中至少一種PDZ多肽選自外膜，PSD95(PDZ弁2),PSD95(PDZ#1,2,3),DLG1(PDZ#1)，DLG1(PDZ#1,2),DLG1(PDZ#2)，DLG2(PDZ#1)，DLG2(PDZ#2),Magi3(PDZ#1),PTN3(PDZ#1),MAST2(PDZ#1),NeDLG(PDZ#1,2),Shankldl，Shank2dl,Shank3dl,Syntrophinla,Syntrophinyl，Magil(PDZ#1)，Magil(PDZ#4)，Tipl;PTPLl(PDZ#1),Mint3(PDZ#1)，LymMystique(PDZ#1)，DLG2(PDZ#3),MUPPl(PDZ#8)，NeDLG(PDZ#1),DLG5(PDZ#1)，PSD95(PDZ#1)，NumBP(PDZ#3)，LIMK1(PDZ#1)，KIAA0313,DLGl(PDZ弁2),Syntenin(PDZ#2),Pickl，MAST2，PTN3(PDZ#1)，NOSl(PDZ#1,2，3),M證l(PDZ#2)，ZO-1(PDZ#2)，NSP和RIM212。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述患者樣本選自血液，組織，鼻分泌物，肺滲出液，泄殖腔樣本，糞便樣本，喉拭子和唾液。15.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述患者選自人，鳥，豬，馬，和哺乳動物。16.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述PDZ多肽是包括PSD95d2的PL結(jié)合區(qū)SEQIDNO:l(80-100氨基酸區(qū)域)的蛋白。17.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述PDZ多肽是選自下列的蛋白PSD95dl,PSD95d2,PSD95d3,歸DL8dl，Magildl,DLGld2,DLGld3,NeDLGldl，和NeDLGld2。18.—種用于A型流感感染診斷和分型的方法，包括鑒定亞型特異性A型流感病毒蛋白NS1PDZ配體模體(PL)區(qū)的存在。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中PL區(qū)具有模體S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸，和X是任意氨基酸。20.—種檢測待測樣本中包含PL區(qū)的A型流感病毒蛋白的存在和量的方法，包括在適于結(jié)合的條件下，將等份待測樣本和至少一種PDZ肽和至少—種PDZ配體(PL)檢測劑混合；和測定PDZ肽和PL檢測劑之間的結(jié)合，其中結(jié)合降低表明待測樣本中存在A型流感病毒蛋白。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中A型流感病毒蛋白選自NP，HA，Ml和腦。22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中PL檢測劑包括來自A型流感病毒蛋白C末端的PL模體，所述A型流感病毒蛋白選自NP，HA，Ml禾卩NS1。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中PL模體是S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸，和X是任意氨基酸。24.—種鑒定患者是否感染A型流感病毒的方法，包括確定患者的鼻分泌物、痰樣本或者喉拭子中是否存在A型流感病毒的NS1蛋白，存在表明患者感染A型流感病毒。25.—種檢測待測樣本中包含PL區(qū)的A型流感病毒蛋白的存在和量的方法，包括將等份待測樣本和至少一種PDZ肽混合；和測定PDZ肽和PLA型流感病毒蛋白之間的結(jié)合，其中結(jié)合表明待測樣本中存在A型流感病毒蛋白。26.—種確定患者是否感染流感A致病株的方法，包括確定患者是否感染流感A,'如果患者被感染；和確定患者樣本中帶有PL模體的非結(jié)構(gòu)蛋白的存在，存在表明患者感染A型流感病毒的致病株。27.—種鑒定患者樣本中A型流感病毒的特異性亞型存在的方法，包括將患者樣本與至少一種PDZ多肽或者至少一種捕獲抗體接觸，所述捕獲抗體與對流感病毒A亞型特異的NS1蛋白的PL模體特異結(jié)合；和檢測PDZ多肽或者捕獲抗體是否與樣本中的PL模體特異結(jié)合，特異結(jié)合表明亞型的存在。28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中接觸步驟包括將患者樣本與多個PDZ多肽接觸，所述PDZ多肽特異結(jié)合多個NS1蛋白中的多個PL模體，所述PL模體對流感病毒A的多個亞型特異；并且檢測包括確定哪種PDZ多肽特異結(jié)合其PL模體，與一種或者多種PDZ多肽結(jié)合從而表明亞型的存在。29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述捕獲抗體識別NS1的羧基末端。30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述捕獲抗體或者PDZ多肽識別選自下列的一種或者多種PDZ配體模體(PL):ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQID戮4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6)，RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9),GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12),RICI(SEQIDNO:13)，DMAL(SEQIDNO:14)'畫TL(SEQIDNO:15),DIAL(SEQIDNO:16)，DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18),SEV,SEI，SKV和SKI。31.如權(quán)利要求27所述的方法,其中所述PDZ多肽選自外膜，PSD95(PDZ#2)，PSD95(PDZ#1,2,3)，DLGl(PDZ#1),DLGl(PDZ#1,2)，DLGl(PDZ弁2),DLG2(PDZ#1),DLG2(PDZ#2),Magi3(PDZ#1),PTN3(PDZ弁l)，MAST2(PDZ#1),NeDLG(PDZ#1，2)，Shankldl,Shank2dl，Shank3dl，Syntrophinla，Syntrophinyl,Magil(PDZ#1),Magil(PDZ#4),Tipl;PTPLl(PDZ弁l),Mint3(PDZ#1),LymMystique(PDZ#1),DLG2(PDZ#3),MUPP1(PDZ#8),NeDLG(PDZ#1)，DLG5(PDZ#1)，PSD95(PDZ#1)，NumBP(PDZ#3),LIMK1(PDZ#1),KIAA0313,DLGl(PDZ#2)，Syntenin(PDZ#2),Pickl,MAST2,PTN3(PDZ#1)，NOS1(PDZ#1，2，3)，M證l(PDZ#2)，ZO-1(PDZ#2)，NSP和RIM2。32.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述患者樣本選自鼻分泌物，痰樣本，喉拭子，泄殖腔樣本，糞便樣本，肺滲出液和唾液。33.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述亞型是禽流感A，所述PL是PL模體ESEV/I/A(SEQIDNO:19)。34.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述亞型是H3N2，PL是PL模體RSKV。35.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述PL是PL模體ESKV(SEQIDNO:4)。36.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述亞型是H1N1，PL是PL模體RSEV。37.如權(quán)利要求27所述的方法，還包括將樣本與檢測抗體接觸。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述檢測抗體包括信號發(fā)生化合物。39.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述檢測抗體不抑制PL與PDZ的結(jié)合或者捕獲抗體與NS1的結(jié)合。40.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述PDZ多肽或者所述抗體固定在固體支持物上。41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述固體支持物是毛細管流動分析裝置，所述接觸步驟包括將小棒浸在所述患者樣本中。42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中毛細管流動分析是免疫分析。43.如權(quán)利要求40所述的方法，其中固體支持物是側(cè)向流分析。44.一種用于患者樣本中流感A病毒的鑒定和分型的試劑盒，包括，與流感A病毒NS1特異結(jié)合的試劑，其中所述試劑固定在固體支持物上。45.如權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中所述試劑是抗體，PDZ多肽，寡核苷酸適配體，或者其混合物。46.—種用于患者樣本中流感A病毒鑒定和/或分型的試劑盒，包括與流感A的病毒編碼蛋白特異結(jié)合的試劑；和與NS1蛋白特異結(jié)合的試劑。47.如權(quán)利要求46所述的試劑盒，其中特異結(jié)合NS1蛋白的試劑與蛋白上的PL區(qū)結(jié)合。48.如權(quán)利要求46所述的試劑盒，其中所述試劑是抗體，PDZ多肽，寡核苷酸適配體，或者其混合物。49.如權(quán)利要求46所述的試劑盒，其中所述流感A的病毒編碼蛋白是NS1。50.—種用于患者樣本中流感A病毒鑒定和/或分型的試劑盒，包括與NS1在PL模體以外處特異結(jié)合的試劑；和與NS1在PL模體處特異結(jié)合的試劑。51.—種包括多個PDZ多肽的試劑盒，所述PDZ多肽對多個流感A病毒的多個NS1蛋白中的多個PL模體特異。52.—種鑒定能夠特異結(jié)合流感病毒PDZ配體(PL)的PDZ多肽的方法，包括將流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白PL與具有PDZ結(jié)構(gòu)域的候選多肽在適于結(jié)合的條件下接觸；和檢測PL與候選多肽的特異結(jié)合；和確認(rèn)PL與PDZ結(jié)合位點結(jié)合。53.—種分離的抗體，所述抗體與A型流感病毒NS1蛋白的羧基末端模體特異結(jié)合。54.如權(quán)利要求53所述的分離的抗體，其中所述羧基末端模體包括選自下列的PL模體ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3)，ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9),GSKV(SEQIDNO:10),NICI(SEQIDNO:11)，TICI(SEQIDNO:12),RICI(SEQIDNO:13)，DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15),DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18),SEV,SEI,SKV和SKI。55.如權(quán)利要求53所述的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體或者抗體片段。56.如權(quán)利要求53所述的抗體，其中所述PL模體是ESEV/I/A(SEQIDNO:19)。57.—種用于患有A型流感病毒感染或者處于A型流感病毒感染風(fēng)險下的患者的治療或者預(yù)防的方法，包括對患者給藥試劑的有效方案，所述試劑抑制病毒NS1蛋白與細胞PDZ蛋白的相互作用，從而實現(xiàn)治療或者預(yù)防感染。58.如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述試劑是特導(dǎo)結(jié)合A型流感病毒NS1蛋白PL模體的抗體。59.如權(quán)利要求57所述的方法，其中試劑選自反義寡核苷酸，小分子，siRNA和鋅指蛋白，其中所述試劑抑制流感ANh蛋白或者PDZ蛋白的表達。'60.如權(quán)利要求58所述的方法，其中NS1的PL模體選自ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8)，GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12),RICI(SEQIDNO:13),DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18)，SEV，SEI,SKV和SKI。61.如權(quán)利要求58所述的方法，其中試劑是PDZ多肽。62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中PDZ多肽至少包括與PL相互作用的結(jié)合區(qū)，SEQIDNO:l。63.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述PDZ多肽選自外膜，PSD95(PDZ#2)，PSD95(PDZ#1,2,3)，DLGl(PDZ#1)，DLGl(PDZ#1,2),DLGl(PDZ#2)，DLG2(PDZ#1)，DLG2(PDZ#2)，Magi3(PDZ#1),PTN3(PDZ弁l),MAST2(PDZ#1),NeDLG(PDZ#1,2)，Shankldl，Shank2dl,Shanl(3dl，Syntr叩hinla，Syntrophinyl,Magil(PDZ#1)，Magil(PDZ#4),Tipl;PTPLl(PDZ#1),Mint3(PDZ#1),LymMystique(PDZ#1)，DLG2(PDZ#3)，MUPPl(PDZ#8),NeDLG(PDZ#1)，DLG5(PDZ#1)，PSD95(PDZ#1),NumBP(PDZ#3),LIMKl(PDZ#1),KIAA0313,DLGl(PDZ#2)，Syntenin(PDZ#2),Pickl,MAST2,PTN3(PDZ#1),NOSl(PDZ#1,2,3)，M窗l(fā)(PDZ#2)，ZO-1(PDZ弁2),NSP和RIM2。64.—種篩選抗病毒劑的方法，包括-在待測化合物存在或者缺失的條件下，將PDZ多肽和流感病毒PDZ配體(PL)接觸；和將待測化合物存在時PDZ/PL結(jié)合的量與待測化合物缺失時相比較，其中所述抗病毒劑減少PDZ/PL結(jié)合。65.如權(quán)利要求64所述的方法，還包括在體內(nèi)或者胞內(nèi)檢測所述試劑以鑒定其是否干擾干擾素產(chǎn)生。66.—種非天然的PDZ配體(PL)肽診斷劑，包括選自流感A蛋白C端氨基酸序列以內(nèi)的氨基酸線性陣列，其中所述PL能夠結(jié)合哺乳動物PDZ多肽。67.如權(quán)利要求66所述的非天然PDZ配體(PL)肽試劑，其中PL具有模體S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸，和X是任意氨基酸。'68.如權(quán)利要求66所述的非天然PL肽診斷劑，其中流感ANS1蛋白的氨基酸線性陣列選自ESEV(SEQIDN0:2)，ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6)，RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9),GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12),RICI(SEQIDNO:13),固AL(SEQIDNO:14)，DMTL(SEQIDNO:15),DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18)，SEV，SEI,SKV和SKI。69.如權(quán)利要求66所述的非天然PL肽診斷劑，還包括選自下列的診斷劑陽性對照，陰性對照，分析標(biāo)準(zhǔn)品，分析校準(zhǔn)品，競爭性分析配體，標(biāo)記的肽檢測劑或者固相捕獲劑。70.如權(quán)利要求66所述的非天然PL肽診斷劑，還包括合成肽，重組多肽，基本上純化的天然PL多肽，基本上純化的天然PL多肽的片段，模擬PL的肽，寡核苷酸適配體PL和多肽適配體PL。71.如權(quán)利要求70所述的非天然PL肽，其中所述PL肽來自流感ANSI蛋白。72.—種用于檢測生物樣本中流感APL的非天然PDZ多肽診斷劑，包括能夠結(jié)合流感ANS1蛋白的非天然PDZ多肽，其中PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白診斷劑選自陽性對照、陰性對照、分析標(biāo)準(zhǔn)品、分析校準(zhǔn)品、競爭性配體、標(biāo)記的蛋白檢測結(jié)合伴侶和捕獲劑的診斷劑。73.如權(quán)利要求72所述的非天然PDZ多肽診斷劑，選自外膜，PSD95(PDZ#2)，PSD95(PDZ#1,2,3),DLGl(PDZ#1)，DLGl(PDZ#1,2)，DLGl(PDZ弁2)，DLG2(PDZ弁l)，DLG2(PDZ弁2),Magi3(PDZ#1)，PTN3(PDZ#1)，MAST2(PDZ#1)，NeDLG(PDZ#1,2)，Shankldl，Shank2dl，Shank3dl，Syntrophinla，Syn加phinyl，Magil(PDZ#1)，Magil(PDZ#4),Tipl;PTPLl(PDZ#1)，Mint3(PDZ#1)，LymMystique(PDZ#1),DLG2(PDZ#3)，MUPPl(PDZ弁8)，NeDLG(PDZ弁l)，DLG5(PDZ#1),PSD95(PDZ#1),NumBP(PDZ#3)，LIMK1(PDZ#1)，KIAA0313,DLGl(PDZ#2),Syntenin(PDZ#2),Pickl,MAST2，PTN3(PDZ#1),NOSl(PDZ#1,2，3),M證l(PDZ#2)，ZO-l(PDZ#2),NSP和RIM2。74.—種用于檢測待測樣本中流感A蛋白的信號發(fā)生結(jié)合劑，包括非天然PL或者非天然PDZ，其中PL或者PDZ任一種包括與信號發(fā)生化合物共價連接的肽或者多肽。75.—種鑒定患者是否感染致病流感A的方法，包f舌確定患者樣本中是否存在A型流感病毒的NS2蛋白，所述蛋白包括第70位的絲氨酸，該蛋白的存在表明患者感染流感A的致病株。76.如權(quán)利要求75所述的方法，其中確定包括將患者樣本與特異結(jié)合NS2蛋白的試劑接觸，所述NS2蛋白中第70位被絲氨酸所占據(jù)。77.如權(quán)利要求76所述的方法，其中試劑是抗體。78.如權(quán)利要求75所述的方法，其中確定包括確定編碼NS2蛋白的核酸密碼子70中的一個或者多個核苷酸的一致性。79.如權(quán)利要求78所述的方法，其中確定包括將核酸與探針或者引物接觸，所述探針或者引物與包括或者靠近一個或者多個核苷酸的核酸序列雜交。80.—種鑒定患者是否感染致病性A型禽流感病毒的方法，包括將患者樣本與PSD-95PDZ蛋白接觸；和檢測PSD-95PDZ蛋白與樣本之間的特異結(jié)合，特異結(jié)合表明存在A型流感病毒，存在表明患者感染致病性A型禽流感病毒。81.如權(quán)利要求80所述的方法，其中致病性A型流感病毒是H5N1。82.如權(quán)利要求80所述的方法，其中PSD-95PDZ蛋白是PSD-95的結(jié)構(gòu)域2。83.如權(quán)利要求80所述的方法，其中流感NS1蛋白PL具有以下模體ESKV(SEQIDN0:4),ESEI(SEQIDNO:3),或者ESEV(SEQIDNO:2)。84.如權(quán)利要求80所述的方法，其中接觸步驟包括將患者樣本與PSD-95PDZ蛋白和抗體接觸，所述抗體與A型流感病毒蛋白NSl的不同表位而不是PSD-95PDZ蛋白特異結(jié)合，PSD-95固定在支持物上，檢測步驟檢測與抗體特異結(jié)合的NS1蛋白。85.如權(quán)利要求80所述的方法，還包括將患者樣本與作為對照的第二種PDZ蛋白INADLd8接觸，并確定特異結(jié)合，第一種PDZ-95蛋白相對于第二種PDZ蛋白的特異性結(jié)合更高表明患者感染致病性A型禽流感病毒。86.NS-1蛋白在取自患者的樣本中檢測流感A的用途。87.如權(quán)利要求l所述的用途，其中樣本是鼻分泌物。88.與流感A致病株的PL模體結(jié)合的抗體在鑒定流感A中的用途。89.PDZ多肽在檢測流感A致病株中的用途。90.NS-1蛋白在取自患者的樣本中檢測流感A的用途。91.如權(quán)利要求l所述的用途，其中樣本是鼻分泌物。92.與流感A致病株的PL模體結(jié)合的抗體在鑒定流感A中的用途。93.PDZ多肽在檢測流感A致病株中的用途。94.來自流感A致病株的NS-1蛋白和結(jié)合NS-1的PDZ蛋白在篩選具有用于治療流感A致病株活性的化合物中的用途。全文摘要本發(fā)明提供用于檢測樣品中流感病毒的存在和量的方法和組合物，包括高危流感A株。本發(fā)明還提供檢測對象是否感染流感病毒以及檢測流感病毒類型和株的方法。該方法包括將對象的樣本與PDZ多肽(PDZ)和/或PDZ配體(PL)接觸，并檢測PDZ和PL之間是否發(fā)生結(jié)合相互作用。還提供鑒定抗病毒劑的分析，以及利用組合物改變流感感染細胞中PDZ與PL結(jié)合的方法。文檔編號A61K39/00GK101287988SQ200680032034公開日2008年10月15日申請日期2006年7月3日優(yōu)先權(quán)日2005年7月1日發(fā)明者喬舒亞·D·拉比諾維茨,彼得·S·盧,邁克爾·P·貝爾馬雷什申請人:阿波維塔公司