專利名稱：：制備美登木素生物堿抗體綴合物的方法制備美登木素生物堿抗體綴合物的方法
技術領域：
[oooii本發(fā)明涉及制備相當高純度和穩(wěn)定性的綴合物的方法，其中所述綴合物包含與藥物化學偶聯(lián)的細胞結(jié)合劑。發(fā)明技術為了這個目的，噬菌體展示可用于產(chǎn)生這種抗體。在這點上，應用標準分子生物學和重組DNA技術，可產(chǎn)生編碼抗體的抗原結(jié)合可變(V)域的噬菌體文庫(參見，例如，Sambrook等(編輯)，Afo/ecw/arC7ow/"g，爿丄fl6on^，Afaw/，第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(2001))。為了特異性結(jié)合期望的抗原，選擇編碼具有期望特異性的可變區(qū)的噬菌體，并重新構(gòu)建包含所選可變域的完全人抗體。將編碼重構(gòu)抗體的核酸序列引入適當?shù)募毎等缬糜陔s交瘤生產(chǎn)的骨髓瘤細胞中，使得具有單克隆抗體特性的人抗體由該細胞分泌(參見，例如，Janeway等，上文，Huse等，上文和美國專利6,265,150)。替代選擇地，單克隆抗體可由對特異性人重和輕鏈免疫球蛋白基因是轉(zhuǎn)基因的小鼠生產(chǎn)。這樣的方法是本領域已知的，并被描述于例如美國專利5，545，806和5,569,825以及Janeway等，上文中。0024最優(yōu)選地，抗體是人源化抗體。本文所用的"人源化，，抗體是其中小鼠單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDR)(其形成抗體的抗原結(jié)合環(huán))嫁接在人抗體分子的框架上的抗體。由于小鼠和人抗體框架的相似性，本領域中公認這種方法產(chǎn)生的單克隆抗體與人抗體是抗原相同的，但能與產(chǎn)生CDR序列的小鼠單克隆抗體結(jié)合相同的抗原。生產(chǎn)人源化抗體的方法是本領域中眾所周知的，并被詳細地描述在例如Janeway等，上文，美國專利5,225,539、5,585,089和5,693,761，歐洲專利號0239400Bl，和英國專利號2188638中。也可應用美國專利5,639,641和Pedersen等，/Mo/5/o/，"5:959-973(1994)中所述的抗體表面再建技術，產(chǎn)生人源化抗體。盡管本發(fā)明組合物的綴合物中所用的抗體最優(yōu)選為人源化單克隆抗體，但如上所述的人單克隆抗體和小鼠單克隆抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。具有至少一個抗原結(jié)合部位并因此識別和結(jié)合位于乾細胞表面上的至少一個抗原或受體的抗體片斷，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在此方面，完整抗體分子的蛋白酶剪切可產(chǎn)生多種抗體片斷，所述抗體片斷保留識別和結(jié)合抗原的能力。例如用木瓜蛋白酶有限消化抗體分子一般產(chǎn)生三個片斷，其中兩個是相同的且稱作Fab片斷，因為它們保留母體抗體分子的抗原結(jié)合活性。用胃蛋白酶裂解抗體分子正常產(chǎn)生兩種抗體片斷，其中一種保留了該抗體分子的兩個抗原結(jié)合臂，因此稱作F(ab')2片斷。用二硫蘇糖醇或巰基乙胺還原F(ab，)2片斷產(chǎn)生稱作Fab'片斷的片斷。應用常規(guī)重組DNA技術，可產(chǎn)生單鏈可變區(qū)片斷(sFv)抗體片斷，它由截短的Fab片斷組成，所述Fab片斷包含經(jīng)合成肽與抗體輕鏈的V域連接的抗體重鏈的可變(V)域(參見，例如，Janeway等，上文)。類似地，通過重組DNA技術，可制備二硫化物穩(wěn)定的可變區(qū)片斷(dsFv)(參見，例如，Reiter等，五Mgi7i"r/"g，7,697-704(1994))。然而，本發(fā)明上下文中的抗體片斷不限于這些抗體片斷的示例類型。可應用任何適合的能識別和結(jié)合期望細胞表面受體或抗原的抗體片斷?？贵w片斷進一步描述在例如Parham，/./畫w《"/.2895-2902(1983)，Spring等/./附層一"3..470-478(1974)，和Nisonoff等AV由附."狄230-244(1960)。應用本領域已知的任何適用方法例如放射性免疫測定法(RIA)、ELISA、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀法和竟爭性抑制測定法，可以測定抗體-抗原結(jié)合(參見，例如，Janeway等，上文，和美國專利申請公布號2002/0197266Al)。藥物例如氨甲蝶呤、柔紅霉素、多柔比星、長春新堿、長春堿、美法侖、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、加利車霉素、小管素(tubulysin)和小管素類似物、倍癌霉素和倍癌霉素類似物、多拉司他汀和多拉司他汀類似物，也可用于本發(fā)明的上下文中。多柔比星和柔紅霉素化合物(參見，例如，美國專利6，630，579)也可用作藥物。0057藥物綴合物可通過體外方法制得。為了連接藥物或前體藥物至抗體上，應用連接基團。適合的連接基團是本領域眾所周知的，包括二硫基、對酸不穩(wěn)定的基團、對光不穩(wěn)定的基團、對肽酶不穩(wěn)定的基團和對酯酶不穩(wěn)定的基團。優(yōu)選的連接基團為二硫基。例如，使用抗體和藥物或前體藥物之間的二硫化物交換反應可構(gòu)成綴合物。通過中間載體分子例如血清白蛋白，藥物分子也可與細胞結(jié)合劑連接。該分析結(jié)果數(shù)據(jù)描述于表6中。表6:藥物綴合物產(chǎn)物相對于pH的特性<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>如表7中描述的結(jié)果所證明的，在本發(fā)明上下文中可除去純化修飾的抗體的步驟。實施例7第五綴合物樣品應用CHT樹脂柱(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)純化，所述柱在50mM磷酸鈉(pH6.5)中平衡，并用0.3MNaCl和50mM磷酸鈉(pH6.5)洗脫。除CHT(陶瓷羥磷灰石)之外，在相似色謙法條件下也可應用CFT(陶瓷氟磷灰石)。替代選擇地，CHT和CFT樹脂二者都可用于非吸附的方式，使得期望的產(chǎn)物(實質(zhì)上單體綴合物)不被該樹脂保留，而保留高分子量種類，因而與期望的產(chǎn)物分離。在描述本發(fā)明的上下文中(尤其在下列權(quán)利要求的上下文中)應用術語"a"和"an"和"the，，和相似指代，均應被解釋為涵蓋單數(shù)和復數(shù)，除非本文另外指明或明顯與上下文相矛盾。術語"包含，，、"具有"、"包括"和"含有"，除非另外注明均應被解釋為開放式術語(即意指"包括但不限于，，)。本文列舉的值范圍除非本文另外指明，僅僅旨在用作個別表示落在這個范圍的各個單獨值的速記方法，各個單獨的值被并入說明書中，如同本文個別地列舉一樣。本文所述的所有方法可以以任何合適的次序進行，除非本文另外指明或另外明顯與上下文相矛盾。本文提供的任何和所有實例或示例性語言(例如,"例如")的應用僅僅旨在更好地闡釋本發(fā)明而不形成對本發(fā)明范圍的限制，除非另外聲明。:明所必需的。[0119j本文描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，包括發(fā)明人已知的實施本發(fā)明的最好方式。本領域普通技術人員在閱讀上述說明后，那些優(yōu)選的實施方案的變化可變得明顯。發(fā)明人預期技術人員適當時應用這樣的變化，發(fā)明人打算以本文明確描述以外的方式實施本發(fā)明。因此，本發(fā)明包括可適用法律允許的在此所附權(quán)利要求中所述的主題的所有修飾和等同物。而且，上述要素以其所有可能變化的任何組合都包括在本發(fā)明中，除非本文另外指明或另外明顯與上下文相矛盾。權(quán)利要求1.制備細胞結(jié)合劑-藥物綴合物的方法，該方法包括下列步驟(a)用雙功能交聯(lián)試劑接觸細胞結(jié)合劑，以使連接體與細胞結(jié)合劑共價連接，從而制備第一混合物，該混合物包含其上結(jié)合了連接體的細胞結(jié)合劑，(b)使第一混合物經(jīng)受切向流過濾、選擇性沉淀、吸附過濾或吸附色譜法樹脂，從而制備純化的其上結(jié)合了連接體的細胞結(jié)合劑的第一混合物，(c)通過在pH為大約4至大約9的溶液中使其上結(jié)合了連接體的細胞結(jié)合劑與藥物起反應，以制備第二混合物，該混合物包含(i)通過連接體與藥物化學偶聯(lián)的細胞結(jié)合劑，(ii)游離藥物和(iii)反應副產(chǎn)物，來使藥物與純化的第一混合物中其上結(jié)合了連接體的細胞結(jié)合劑綴合，以及(d)使第二混合物經(jīng)受切向流過濾、選擇性沉淀、吸附過濾或吸附色譜法樹脂，以從第二混合物的其它成分中純化通過連接體與藥物化學偶聯(lián)的細胞結(jié)合劑，從而制備純化的第二混合物。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的吸附色譜法樹脂選自羥磷灰石、疏水電荷誘導色i普法(HCIC)、疏水作用色語法(HIC)、離子交換色鐠法、混合式離子交換色譜法、固定化金屬離子親和色譜法(1MAC)、染料配體色譜法、親和色鐠法、反相色鐠法及其組合。3.權(quán)利要求l的方法，其中在步驟(b)和(d)中使用切向流過濾。4.權(quán)利要求1或2的方法，其中在步驟(b)和(d)中使用吸附色譜法樹脂。5.權(quán)利要求1或2的方法，其中在步驟(b)和步驟(c)中使用的切向流過濾在pH6-6.5之間進行，在步驟(d)中使用的吸附色譜法樹脂不是離子交換樹脂。6.權(quán)利要求1或2的方法，其中在步驟(b)中使用吸附色譜法樹脂并在步驟(d)中使用切向流過濾。7.權(quán)利要求l-6任何一項的方法，其中步驟(c)中的溶液的pH為大約4至大約6。8.權(quán)利要求l-6任何一項的方法，其中步驟(c)中的溶液的pH為大約6.5至大約9。9.權(quán)利要求l-8任何一項的方法，其中所述的細胞結(jié)合劑選自抗體、干擾素、白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素3(IL-3)、白細胞介素4(IL誦4)、白細胞介素6(IL-6)、胰島素、EGF、TGF-a、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM國CSF和轉(zhuǎn)鐵蛋白。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述的細胞結(jié)合劑為抗體。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的抗體為單克隆抗體。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述的抗體為人源化單克隆抗體。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述的抗體選自huN901、huMy9-6、huB4、huC242、曲妥單抗、比伐單抗、西羅珠單抗、CNTO95、huDS6和利妥昔單抗。14.權(quán)利要求l-13任何一項的方法，其中所述的藥物為細胞毒性劑。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述的細胞毒性劑選自美登木素生物堿、紫杉烷類和CC1065。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述的藥物為美登木素生物堿。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述的美登木素生物堿包含硫醇基。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的美登木素生物堿為DM1。19.權(quán)利要求17的方法，其中所述的美登木素生物堿為DM4。20.權(quán)利要求l-19任何一項的方法，其中所述的細胞結(jié)合劑經(jīng)化學鍵與所述的藥物化學偶聯(lián)，所述化學鍵選自二硫鍵、對酸不穩(wěn)定的鍵、對光不穩(wěn)定的鍵、對肽酶不穩(wěn)定的鍵、硫醚鍵和對酯酶不穩(wěn)定的鍵。21.權(quán)利要求l-20任何一項的方法，其中步驟(c)中的溶液包含蔗糖。22.權(quán)利要求l-21任何一項的方法，其中步驟(c)中的溶液進一步包含選自檸檬酸鹽緩沖劑、乙酸鹽緩沖劑、琥珀酸鹽緩沖劑和磷酸鹽緩沖劑的緩沖劑。23.制備細胞結(jié)合劑-藥物綴合物的方法，該方法包括下列步驟(a)用雙功能交聯(lián)試劑接觸細胞結(jié)合劑，以使連接體與細胞結(jié)合劑共價連接，從而制備第一混合物，該混合物包含其上結(jié)合了連接體的細胞結(jié)合劑，(b)使第一混合物經(jīng)受切向流過濾、選擇性沉淀、吸附過濾或吸附色譜法樹脂，從而制備純化的其上結(jié)合了連接體的細胞結(jié)合劑的第一混合物，(c)通過在pH為大約4至大約6或pH為大約6.5至大約9的溶液中使其上結(jié)合了連接體的細胞結(jié)合劑與藥物起反應，以制備第二混合物，該混合物包含(i)通過連接體與藥物化學偶聯(lián)的細胞結(jié)合劑、(ii)游離藥物和(iii)反應副產(chǎn)物，來使藥物與純化的第一混合物中其上結(jié)合了連接體的細胞結(jié)合劑綴合，以及(d)使第二混合物經(jīng)受切向流過濾、選擇性沉淀、吸附過濾或吸附色鐠法樹脂，以從笫二混合物的其它成分中純化通過連接體與藥物化學偶聯(lián)的細胞結(jié)合劑，從而制備純化的第二混合物。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述的吸附色i普法樹脂選自羥磷灰石、疏水電荷誘導色語法(HCIC)、疏水作用色譜法(HIC)、離子交換色鐠法、混合式離子交換色譜法、固定化金屬離子親和色語法(IMAC)、染料配體色傳法、親和色諳法、反相色i瞽法及其組合。25.權(quán)利要求23的方法，其中在步驟(b)和(d)中使用切向流過濾。26.權(quán)利要求23或24的方法，其中在步驟(b)和(d)中使用吸附色鐠法樹脂。27.權(quán)利要求23或24的方法，其中在步驟(b)中使用吸附色譜法樹脂并在步驟(d)中使用切向流過濾。28.權(quán)利要求23-27任何一項的方法，其中所述的細胞結(jié)合劑選自抗體、干擾素、白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素3(IL-3)、白細胞介素4(IL畫4)、白細胞介素6(IL-6)、胰島素、EGF、TGF-a、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF和轉(zhuǎn)鐵蛋白。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述的細胞結(jié)合劑為抗體。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的抗體為單克隆抗體。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述的抗體為人源化單克隆抗體。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述的抗體選自huN901、huMy9-6、huB4、huC242、曲妥單抗、比伐單抗、西羅珠單抗、CNTO95、huDS6和利妥昔單抗。33.權(quán)利要求23-32任何一項的方法，其中所述的藥物為細胞毒性劑。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述的細胞毒性劑選自美登木素生物堿、紫杉烷類和CC1065。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述的藥物為美登木素生物堿。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述的美登木素生物堿包含硫醇基。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述的美登木素生物堿為DM1。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述的美登木素生物堿為DM4。39.權(quán)利要求23-38任何一項的方法，其中所述的細胞結(jié)合劑經(jīng)化學鍵與所述的藥物化學偶聯(lián)，所述化學鍵選自二硫鍵、對酸不穩(wěn)定的鍵、對光不穩(wěn)定的鍵、對肽酶不穩(wěn)定的鍵、硫醚鍵和對酯酶不穩(wěn)定40.權(quán)利要求23-39任何一項的方法，其中步驟(c)中的溶液包含庶糖。41.權(quán)利要求23-40任何一項的方法，其中步驟(c)中的溶液進一步包含選自檸檬酸鹽緩沖劑、乙酸鹽緩沖劑、琥珀酸鹽緩沖劑和磷酸鹽緩沖劑的緩沖劑。全文摘要本發(fā)明提供一種制備與藥物化學偶聯(lián)的細胞結(jié)合劑的方法。該方法包括使連接體與細胞結(jié)合劑共價連接、純化步驟、使藥物與細胞結(jié)合劑綴合和隨后的純化步驟。文檔編號A61K47/48GK101267841SQ200680034242公開日2008年9月17日申請日期2006年8月14日優(yōu)先權(quán)日2005年8月24日發(fā)明者D·H·梅舒拉姆,G·W·阿姆弗萊特,勇戴,晉圣瑾,勇王申請人:免疫原公司