專利名稱：生產(chǎn)蜘蛛絲蛋白的納米膠囊和微膠囊的方法
生產(chǎn)蜘蛛絲蛋白的納米膠囊和微膠囊的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從蜘蛛絲蛋白質(zhì)生產(chǎn)納米膠囊和微膠囊的方法。本發(fā)明 還涉及通過(guò)該方法可以獲得的納米膠囊或微膠囊以及含有所述納米膠囊 或微膠囊的藥物、化妝品和食品組合物。
小規(guī)模的結(jié)構(gòu)作為用于未來(lái)設(shè)備的運(yùn)輸囊和作為潛在的結(jié)構(gòu)單元具 有巨大利益。 一項(xiàng)任務(wù)是能夠以小規(guī)模包封反應(yīng)物或顆粒，并且在將它 們放在特定的位置以后容許包封物質(zhì)的觸發(fā)釋放。這樣的問(wèn)題的一個(gè)解 決方案是使用化學(xué)囊，所謂納米膠囊。將納米膠囊設(shè)計(jì)成在外部觸發(fā)或 刺激時(shí)釋放所述反應(yīng)物。由這樣的要求引起數(shù)個(gè)問(wèn)題最重要的一個(gè)是 如何在例如化學(xué)或生物學(xué)活性的反應(yīng)物周圍以限定的方式制造這樣的納 米膠囊。
最近，已經(jīng)開發(fā)了"雜化物"刺激響應(yīng)性納米膠囊以達(dá)到這樣的需
要。從例如具有pH-敏感構(gòu)象的兩親性聚丁二烯(PB)-b-聚(谷氨酸)(PGA) 二嵌段共聚物的自裝配獲得所述結(jié)構(gòu)(囊以及微團(tuán))。PH-敏感性可用于卸 載所述囊。已經(jīng)通過(guò)組合陰離子的和開環(huán)聚合合成了那些含有可交聯(lián)的 疏水性嵌段和親水性肽嵌段的PB-b-PGA共聚物(Ch6cot等，2002)。所述 共聚物的多分散性是足夠小的以獲得充分限定的自裝配聚集體。例如 PB40-b-PGA100共聚物在水中時(shí)形成封閉的雙層囊，稱為聚合物體 (polymersomes)(Won等，1999)。所述囊的一個(gè)性質(zhì)是它們通過(guò)在尺寸上 改變而響應(yīng)外部pH改變(

圖1)。這個(gè)在pH改變時(shí)的轉(zhuǎn)換是可逆的并且對(duì) 于鹽度僅是中度敏感的，因?yàn)樗皇腔诤?jiǎn)單的聚電解質(zhì)溶脹效應(yīng)，而 是基于PGA嵌段的肽屬性(圖1)。這些囊不僅能包封低分子量化合物(像 溶劑分子諸如熒光團(tuán)(Ch&ot等，2003))，而且可以穩(wěn)定較大的納米顆 粒。這樣的體系的缺點(diǎn)是與生物體系的部分不相容性，所述生物體系通 常對(duì)于顯著的pH改變是高度敏感的，因?yàn)閜H改變可以導(dǎo)致包封樣品的 生物活性損失。用于說(shuō)明的圖1顯示(a)peptosome的流體動(dòng)力學(xué)半徑RH的動(dòng)態(tài)光散射 作為NaCl濃度和pH的函數(shù)。(b) peptosome和作為pH函數(shù)的它的尺寸改 變的示意圖，其原因在于所述肽部分中的巻曲向a-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換。
另一個(gè)建立的包封方法是膠態(tài)顆粒在油/水界面的自裝配。所述自裝 配方法的驅(qū)動(dòng)力是總表面能量的最小化-由此可以使用各式各樣的顆粒和 溶劑。眾所周知的這樣的穩(wěn)定乳劑是Pickering乳劑。所述顆粒的穩(wěn)定或 交聯(lián)導(dǎo)致機(jī)械穩(wěn)定的外層，然后可以將其傳遞到連續(xù)相。所謂的微球粒 (colloidosomes)的優(yōu)點(diǎn)是包封的控制和調(diào)整外殼的機(jī)械和化學(xué)穩(wěn)定性的容 易性。所述顆粒的自裝配產(chǎn)生幾乎結(jié)晶的結(jié)構(gòu)并且由此存在所述顆粒之 間的孔。這些孔是尺寸選擇性的過(guò)濾器，其容許穿過(guò)所述膜的擴(kuò)散的控 制(Dimmore等，2000)。所述全部方法可以以生物相容的方式進(jìn)行。然 而，膠態(tài)顆粒自身不必是生物相容的。
WO 02/47665描述用于制備自裝配的選擇性可滲透的彈性顯微結(jié)構(gòu)的 方法，所述結(jié)構(gòu)稱為微球粒，其具有受控的孔尺寸、孔隙率和有利的機(jī) 械性質(zhì)。所述方法包括(a)提供由生物相容材料在第一溶劑中形成的顆 粒；(b)通過(guò)將第一流體添加到所述第一溶劑而形成乳狀液，所述乳狀液 是由所述第一溶劑圍繞的所述第一流體的小滴限定的；(c)用所述顆粒涂 布所述小滴的表面；和(d)將所述顆粒穩(wěn)定在所述小滴的所述表面上以形 成具有至少約20帕斯卡的屈服強(qiáng)度的微球粒。WO 02/47665使用生物相 容的合成聚合物用于生產(chǎn)這些微球粒。實(shí)例是聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸 甲酯、聚亞垸基、二氧化硅及其組合。例如通過(guò)燒結(jié)、化學(xué)交聯(lián)等穩(wěn)定 而從其獲得微球粒的顆粒。然而，制備那些微球粒的方法是比較困難的 并且使用的膠質(zhì)顆粒對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用可以顯示有害的性質(zhì)，原因在于它們 的人工的和非天然的屬性。通過(guò)使用膠質(zhì)顆粒也限制所述殼的尺寸范 圍，因?yàn)槔媚z體限制具有限定孔的最小尺寸袋。
因此，本發(fā)明面臨的問(wèn)題是提供高度生物相容的并且因而適于體內(nèi) 應(yīng)用的納米膠囊和微膠囊。本發(fā)明的另一個(gè)問(wèn)題是獲得能夠適應(yīng)不同類 型和多種量的有效試劑或營(yíng)養(yǎng)物等的納米膠囊和微膠囊。本發(fā)明面臨的 另外問(wèn)題是提供可生物降解的納米膠囊和微膠囊，即所述納米膠囊和微膠囊能夠在體內(nèi)控制釋放所述有效試劑等，例如在局部的或全身性應(yīng)用 中。
這些問(wèn)題是通過(guò)獨(dú)立權(quán)利要求的主題解決的。優(yōu)選實(shí)施方案陳述在 從屬權(quán)利要求中。
在本發(fā)明中，出人意料地證明蜘蛛絲蛋白質(zhì)可以充當(dāng)形成可以用于 多種體內(nèi)應(yīng)用的微膠囊和納米膠囊的基質(zhì)。特別證實(shí)這可以通過(guò)生產(chǎn)所 述膠囊的改進(jìn)方法進(jìn)行，所述方法避開使用通過(guò)添加化學(xué)品樣的交聯(lián)劑 而從其形成膠囊以連接或穩(wěn)定所述顆粒的步驟的需要，或者其需要對(duì)于 要包裝到所述微膠囊和納米膠囊中的試劑可以具有有害作用的燒結(jié)等。
因?yàn)榇蠖鄶?shù)當(dāng)前使用的包封技術(shù)(見例如WO 02/47665)依賴于非生物 學(xué)顆?；虼蠓肿樱景l(fā)明人開發(fā)了基于自裝配蜘蛛絲蛋白質(zhì)的新的穩(wěn)定 的包封方法。不像其它的包封技術(shù)，在本方法中，乳狀液表面的疏水性/ 親水性屬性不僅用于裝配膠體顆粒，而且它也用作通過(guò)聚結(jié)和聚合物網(wǎng) 絡(luò)形成(穩(wěn)定作用)的膠體固定化的驅(qū)動(dòng)力。該方法不僅代表產(chǎn)生由新類別 的生物相容膠體形成的聚合納米膠囊和微膠囊的方法，它也代表利用蛋 白質(zhì)的聚合物網(wǎng)絡(luò)形成的新方法。由該方法形成的納米膠囊和微膠囊的 巨大優(yōu)點(diǎn)是由所述蛋白質(zhì)給予的微膠囊的生物相容性和功能性。這可以 通過(guò)數(shù)種方式控制釋放機(jī)理pH改變、溫度改變、或蛋白酶的活性。
例如，納米膠囊或微膠囊可能被破壞并且它們的組分可以化學(xué)地、 物理地(例如通過(guò)剪切力)或生物學(xué)地(通過(guò)蛋白水解消化)在體內(nèi)釋放。
蜘蛛絲蛋白質(zhì)在界面的自裝配是通過(guò)將所述蛋白質(zhì)引入到水/油乳狀 液的水相而實(shí)現(xiàn)的(參見圖2)。表面能量的最小化將所述蛋白質(zhì)驅(qū)動(dòng)到界 面并且誘導(dǎo)單體聚集成致密的聚合物網(wǎng)絡(luò)(圖3)。
例如，由該方法形成的蜘蛛袋/氣囊充滿水相的內(nèi)容物并且可以存在 于有機(jī)溶劑、醇中以及水中(圖3)。因此，它們?cè)趶?qiáng)烈不同的環(huán)境中顯示 出乎意料的穩(wěn)定性。原則上，在反向乳狀液表面的蛋白質(zhì)自裝配也是可 能的-因而包封油相的內(nèi)容物(參見下文)。
顯著地，所述袋/氣囊可以充滿蛋白質(zhì)、化學(xué)反應(yīng)物、納米和微米規(guī) 模的顆粒等，這是通過(guò)用熒光(FITC)標(biāo)記的葡聚糖顆粒填充顆粒而例舉性 地顯示的(圖4)。鑒于所述膜的厚度，膜的不滲透性和袋對(duì)于滲透壓的機(jī)械穩(wěn)定性都
相對(duì)較高。電子顯微圖像揭示所述厚度是10 70nm(圖5)。
在本方法中，已經(jīng)采用合成的蜘蛛絲蛋白質(zhì)，特別是C,6的合成序列
(Huemmerich等，2004)以產(chǎn)生活性劑的生物學(xué)包封。
蜘蛛絲通常是顯示特殊物理性質(zhì)的蛋白質(zhì)聚合物，但是關(guān)于由不同 的蜘蛛產(chǎn)生的多種絲的組成僅存在有限的信息(見Scheibel， 2004)。在不 同類型的蜘蛛絲之中，來(lái)自金網(wǎng)蜘蛛(golden orb weaver)(棒絡(luò)新婦蛛 (臉盧7<3 c/謂》e力)禾口十字園蛛(garden cross spider)(十字園蛛( ^^/em^w))是研究最深的。拖絲的絲一般由兩種主要蛋白質(zhì)組成，并且 還不清楚另外的蛋白質(zhì)是否在絲裝配和最終的絲結(jié)構(gòu)中起顯著作用。來(lái) 自十字園蛛的拖絲的兩種主要蛋白質(zhì)組分是ADF-3和ADF-4(十字園蛛絲
編碼蜘蛛絲樣蛋白質(zhì)的基因是利用克隆策略產(chǎn)生的，所述策略基于 合成的DNA組件和PCR擴(kuò)增的真實(shí)基因序列的組合(Huemmerich等， 2004)。選擇來(lái)自園蛛十字園蛛的拖絲絲蛋白質(zhì)ADF-3和ADF-4作為合成 構(gòu)建體的模板。連續(xù)克隆策略容許不同的合成DNA組件以及真實(shí)基因片 段的受控制的組合。將克隆載體設(shè)計(jì)成包括具有間隔區(qū)的克隆盒，所述 間隔區(qū)作為合成基因的占位符(placeholder)(Huemmerich等，2004)。
為了模擬ADF-4的重復(fù)序列，已經(jīng)將單一保守重復(fù)單元設(shè)計(jì)成得到 一個(gè)稱為C的共有組件，將其多聚化以獲得重復(fù)的蛋白質(zhì)C,6,將其以給 定方法采用為實(shí)例。
對(duì)于提供的蜘蛛絲袋/氣囊存在許多可能的應(yīng)用，從功能食品到藥物 到化妝品應(yīng)用。例如食品技術(shù)中的包封可以保護(hù)某些組分諸如維生素不 受氧化環(huán)境影響。在另一種食品技術(shù)應(yīng)用中，可以掩蔽組分諸如魚油的 味道。在藥物應(yīng)用中，蛋白質(zhì)殼的擴(kuò)散屏蔽容許包封材料的緩慢的(控制 的)釋放過(guò)程。蛋白質(zhì)殼的另外設(shè)計(jì)可以產(chǎn)生限定的釋放容器，其僅在利 用某些蛋白酶或其它觸發(fā)劑的活化以后釋放內(nèi)容物。在化妝品中，在例 如由皮膚的蛋白酶緩慢降解蛋白質(zhì)殼以后，可以通過(guò)提供的袋/氣囊促進(jìn) 水有效成分到皮膚中的輸送。另外，機(jī)械剪切可用于在暴露到皮膚時(shí)釋
心蛋白)。本發(fā)明特別涉及下列方面和實(shí)施方案
根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)納米膠囊和微膠囊的方法，所述方 法包括下列步驟
a) 提供蜘蛛絲蛋白質(zhì)；
b) 在適合的溶劑中形成所述蛋白質(zhì)的溶液或懸浮液；
c) 產(chǎn)生至少兩相的乳狀液，所述乳狀液含有b)中形成的溶液或懸浮液 作為第一相以及至少一個(gè)基本上與所述第一相不可混合的另外的相；
d) 在至少兩相的界面處形成蜘蛛絲蛋白質(zhì)的聚合物網(wǎng)絡(luò)；
e) 從所述乳狀液分離(d)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)聚合物網(wǎng)絡(luò)。
如上所述，意外地證實(shí)，步驟d)中形成聚合物網(wǎng)絡(luò)不需要添加任何 另外的組分(例如交聯(lián)劑)并且不需要另外的步驟如燒結(jié)、交聯(lián)等。
應(yīng)當(dāng)注意，如這里所用的術(shù)語(yǔ)"蜘蛛絲蛋白質(zhì)"不僅包括所有天然的 序列而且包括由此衍生的所有人工或合成的序列。
因此，蜘蛛絲序列可以衍生自這里稱為"真實(shí)的"序列。該術(shù)語(yǔ)指的 是基本核酸序列是從它們的天然環(huán)境分離的而沒(méi)有在序列本身中進(jìn)行實(shí) 質(zhì)的修改。被接受其存在的唯一修飾是其中真實(shí)的核酸序列被修飾，以 便適應(yīng)所述序列在宿主中表達(dá)而不改變編碼的氨基酸序列。優(yōu)選的序列 是NR3(SEQ ID NO:10;衍生自ADF-3)和NR4(SEQ ID NO:ll;衍生自 ADF-4)。在兩者序列中，為了更有效的翻譯，將很少在大腸桿菌中翻譯 的密碼子AGA(Arg)利用PCR誘變突變到CGT(Arg)。
真實(shí)的非重復(fù)序列優(yōu)選是從天然存在的蜘蛛絲蛋白質(zhì)的氨基末端非 重復(fù)區(qū)域(鞭形蛋白質(zhì))和/或羧基末端非重復(fù)區(qū)域(鞭形和拖絲蛋白質(zhì))衍生 的。那些蛋白質(zhì)的優(yōu)選實(shí)例將表示在下面。
根據(jù)另外的實(shí)施方案，所述真實(shí)的非重復(fù)序列是從天然存在的蜘蛛 絲蛋白質(zhì)的氨基末端非重復(fù)區(qū)域(鞭形蛋白質(zhì))和/或羧基末端非重復(fù)區(qū)域 (鞭形和拖絲蛋白質(zhì))衍生的。
鞭形蛋白質(zhì)的優(yōu)選真實(shí)序列是FlagN-NR(SEQ ID NOs:31禾Q 32)和 FlagC-NR(SEQ IDNOs:33和34)的氨基酸序列和核酸序列。
本發(fā)明的重組蜘蛛絲蛋白質(zhì)一般可以從來(lái)自蜘蛛的主要壺腹?fàn)钕俚?蜘蛛拖絲蛋白質(zhì)和/或源自鞭形腺的蛋白質(zhì)所衍生。根據(jù)實(shí)施方案，可被用于本發(fā)明的重組(合成的/人工的)蜘蛛絲蛋白 質(zhì)--般從來(lái)自蜘蛛的主要壺腹?fàn)钕俚闹┲胪辖z蛋白質(zhì)和/或從來(lái)源于鞭形 腺的蛋白質(zhì)所衍生。
一般優(yōu)選從圓網(wǎng)蜘蛛(圓蛛科(Araneidae)和Araneoids)的拖絲或鞭形蛋 白質(zhì)選擇拖絲和/或鞭形序列。
更優(yōu)選地，所述拖絲蛋白質(zhì)和/或鞭形蛋白質(zhì)來(lái)源于一種或多種下列蜘 蛛希氏尾園蛛(Arachnura higginsi) , Araneus circulissparsus,十字園蛛， Argiope picta，條帶園蛛(Banded Garden Spider)(三帶金蟲朱(Argiope trifasciata) ), Batik花園網(wǎng)蛛(Batik Golden Web Spider)(星絡(luò)新婦蛛 (Nephila antipodiana)), Beccari's帳篷蛛(Beccari's Tent Spider) (Cyrtophora beccarii)，鳥糞蛛(Bird-dropping Spider) (Celaenia excavata)，黑白棘蛛
(Black-and-White Spiny Spider)(庫(kù)氏棘腹蛛(Gasteracantha kuhlii))，黑 黃園蛛(Black-and-yellow Garden Spider) (Argiope aurantia),流星錘蛛
(Bolas Spider) (Ordgarius furcatus)，流星錘蛛-巨敏U蟲朱(Bolas Spiders -Magnificent Spider) (Ordgarius magnificus)，棕色水手蛛(Brown Sailor Spider)(嗜水新園蛛(Neoscona nautica))，棕腿蛛(Brown-Legged Spider) (Neoscona rufofemorata),帶帽黑頭蛛(Capped Black-Headed Spider)(帆楚 蛛(Zygiella calyptrata)),普通園蛛(Common Garden Spider) (Parawixia dehaani)，普通圓蛛(Common Orb Weaver) (Neoscona oxancensis),蟹樣棘 圓蛛(Crab-like Spiny Orb Weaver) (Gasteracantha cancriformis (elipsoides)), 彎曲$束蛛(Curved Spiny Spider ) (Gasteracantha arcuata),皿云斑蛛
(Cyrtophora moluccensis) ， Cyrtophora parnasia, Dolophones conifera, Dolophones turrigera, Doria's棘蛛(Doria's Spiny Spider ) (Gasteracantha doriae),雙點(diǎn)榮束蛛(Double-Spotted Spiny Spider) (Gasteracantha mammosa), 雙尾帳篷蛛(Double-Tailed Tent Spider )(方格云斑蛛(Cyrtophora exanthematica))，塞若尖腹蛛(Aculeperia ceropegia) , Eriophora pustulosa, Flat Anepsion (Anepsion depressium), 四棘寶石蛛 (Four-spined Jewel Spider ) (Gasteracantha quadrispinosa)， 花園圓網(wǎng)蛛 (Garden Orb Web Spider) (Eriophora transmarina),巨大地衣網(wǎng)蛛(Giant Lichen Orbweaver ) (Araneus bicentenarius)，金色網(wǎng)蟲朱(Golden Web Spider) (Nephila maculata),Hasselt's棘蛛(Hasselt's Spiny Spider) (Gasteracantha hasseltii), Tegenaria atrica, Heurodes turrita, Island Cyclosa Spider(島艾蛛(Cyclosa insulana))，寶 石或棘蛛(Jewel or Spiny Spider) (Astracantha minax)，腎開》園蛛(Kidney Garden Spider)(麗園蛛(Araneus mitificus)) ， Laglaise's園蛛(Laglaise's Garden Spider) (Eriovixia laglaisei), Long-Bellied Cyclosa Spider (Cyclosa bifida), Malabar Spider (Nephilengys malabarensis),多色圣安德魯十字蛛
(Multi-Coloured St Andrew's Cross Spider )(多色金蛛(Argiope versicolor)),觀賞性樹干蛛(Ornamental Tree-Trunk Spider)(裂腹蛛 (Herennia ornatissima)),卵形圣安德魯十字蛛(Oval St. Andrew's Cross Spider)(好勝金蛛(Argiope aemula)),紅帳篷蛛(Red Tent Spider)(單色 云斑蛛(Cyrtophora unicolor)),俄羅斯帳篷蛛(Russian Tent Spider) (Cyrtophora hirta),圣安德魯十字蛛(Saint Andrew's Cross Spider)(凱氏金 蛛(Argiope keyserlingi)),猩紅阿秋蛛(Scarlet Acusilas)(猩紅阿秋蛛 (Acusilas coccineus)),銀色金蛛(Silver Argiope) (Argiope argentata)，棘 背圓蛛(Spinybacked Orbweaver) (Gasteracantha cancriformis),斑點(diǎn)圓蛛
(Spotted Orbweaver ) (Neoscona domiciliorum), 圣安德魯十字 (St. Andrews ) Cross (Argiope aetheria),圣安德魯十字蛛(St. Andrew's Cross Spider) (Argiope Keyserlingi),樹干蛛(Tree-Stump Spider)(無(wú)鱗波蛛 (Poltys illepidus))，三角蛛(Triangular Spider) (Arkys clavatus)，三角蛛 (Arkys lancearius),雙束束蛛(Two-spined Spider) (Poecilopachys australasia), 絡(luò)新婦蛛屬(Nephila)物種，例如棒絡(luò)新婦蛛(Nephila clavipes) , Nephila senegalensis， Nephila madagascariensis和更多(對(duì)于另外的蜘蛛物種，還見 下文)。最優(yōu)選地，拖絲蛋白質(zhì)來(lái)源于十字園蛛并且鞭形蛋白質(zhì)來(lái)源于棒絡(luò) 新婦蛛。
在本發(fā)明的上下文中，應(yīng)該清楚，重組蜘蛛絲蛋白質(zhì)可能不僅包括 來(lái)自一個(gè)物種的蛋白質(zhì)序列，而且還可以含有來(lái)源于不同的蜘蛛物種的 序列。作為實(shí)例， 一種或多種合成的重復(fù)蜘蛛絲蛋白質(zhì)序列可以來(lái)源于 一個(gè)物種， 一種或多種真實(shí)的非重復(fù)蜘蛛絲蛋白質(zhì)序列來(lái)自另一種。作 為另外的實(shí)例，還可能設(shè)計(jì)重組蜘蛛絲蛋白質(zhì)，其含有大于一種類型的 重復(fù)序列，其中所述不同類型來(lái)源于不同的物種。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，拖絲蛋白質(zhì)是野生型ADF-3、 ADF-4、 MaSpI、 MaSpII ，并且鞭形蛋白質(zhì)是FLAG。術(shù)語(yǔ)ADF-3/-4用于由十字 園蛛(十字園蛛絲心蛋白-3A4)產(chǎn)生的MaSp蛋白質(zhì)的上下文中。兩種蛋白 質(zhì)，ADF-3和-4屬于MaSp II蛋白質(zhì)的類另ij(主要壺腹?fàn)钪虢z蛋白(spidroin) 11)。
在另外的實(shí)施方案中，提供的核酸序列是ADF-3(SEQIDNO:l)和/或 ADF-4(SEQ ID N0:2)，或其變體。
應(yīng)當(dāng)注意，兩種不同種類的ADF-3和ADF-4編碼序列和蛋白質(zhì)在本 發(fā)明中是預(yù)期的第一，已經(jīng)公開的ADF-3和ADF-4序歹l」(在本文"野 生型，，序列)和，第二，其變體，由SEQ ID N0:l(ADF-3)和2(ADF-4)編 碼。野生型序列是已經(jīng)公開的并且是在登記號(hào)U47855和U47856(SEQ ID NO:8和9)之下可以得到的。
可被用于本發(fā)明(即單獨(dú)或與另外的蛋白質(zhì)組合)的另外的蜘蛛絲蛋白 質(zhì)和它們的數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)是
蛛絲蛋白2 [Ara腦s bicentenarius]gi|2911272
主要壺腹?fàn)钕偻辖z絲蛋白-1 [大腹園蛛(Araneus ventricosus)] gi|27228957
主要壺腹?fàn)钕偻辖z絲蛋白-2 [大腹園蛛]gil27228959壺腹?fàn)钪虢z蛋白 1 [Nephila madagascariensis]gi| 13562006
主要壺腹?fàn)钪虢z蛋白1 [Nephila senegalensis]gi| 13562010 主要壺腹?fàn)钪虢z蛋白1 [Latrodectusgeometricus]gil 13561998 主要壺腹?fàn)钪虢z蛋白1 [三帶金蛛(Argiopetrifasciata)]gil13561984 主要壺腹?fàn)钪虢z蛋白1 [Argiopeaumntia]gil 13561976 拖絲絲蛋白蛛絲蛋白2 [棒絡(luò)新婦蛛]gil16974791 主要壺腹?fàn)钪虢z蛋白2 [Nephilasenegalensis]gil 13562012 主要壺腹?fàn)钪虢z蛋白2 [Nephilamadagascariensis]gil 13562008 主要壺腹?fàn)钪虢z蛋白2 [Latrodectus geometricus]gi| 13562002
根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，鞭形蛋白質(zhì)是SEQ ID NO:6(Flag-N)和/或 SEQ ID N0:7(Flag-C)或其變體。然而，在本文也可以使用已經(jīng)知道和公開的鞭形序列，特別是下
列
鞭形絲蛋白部分cds [Nephila clavipes]gi|2833646 鞭形絲蛋白部分cds [Nephila clavipes]gi|2833648
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，重組蜘蛛絲蛋白質(zhì)包括一種或多種合成的 重復(fù)序列，所述序列含有一種或多種含有共有序列的聚丙氨酸。那些聚 丙氨酸序列可以含有6至9個(gè)丙氨酸殘基。見，例如SEQIDNO:l，含有 6個(gè)丙氨酸殘基的數(shù)個(gè)聚丙氨酸基序。
優(yōu)選地，含有共有序列的聚丙氨酸是從ADF-3衍生的并且具有SEQ ID NO:3(組件A)的氨基酸序列或其變體。組件A含有具有6個(gè)丙氨酸殘 基的聚丙氨酸。另外優(yōu)選的從ADF-4衍生的，含有共有序列的聚丙氨 酸，是組件C(SEQIDNO:5)，含有8個(gè)丙氨酸殘基。
根據(jù)另外的優(yōu)選實(shí)施方案，在本發(fā)明的重組蜘蛛絲蛋白質(zhì)中，合成 的重復(fù)序列是從ADF-3衍生的并且包括SEQ ID NO:4(組件Q)的氨基酸序 列或其變體的一個(gè)或多個(gè)重復(fù)。
更一般而言，合成的重復(fù)序列也可以含有一般基序GGX或 GPGXX， S口，富含甘氨酸的區(qū)域。如上所述，這些區(qū)域?qū)?duì)于蛋白質(zhì)并 且因而對(duì)于由含有所述基序的重組蜘蛛絲蛋白質(zhì)形成的線提供柔性。
應(yīng)當(dāng)注意，在本發(fā)明中使用的合成重復(fù)序列的具體組件還可以相互 組合，即，組合A和Q、 Q和C等的組件(重復(fù)單元)也由本發(fā)明所包括。 雖然要在蜘蛛絲蛋白質(zhì)中引入的組件數(shù)量不受限制，但是優(yōu)選對(duì)于每個(gè) 重組蛋白質(zhì)采用許多合成的重復(fù)序列的組件，其數(shù)量?jī)?yōu)選在5-50個(gè)組 件、更優(yōu)選10-40并且最優(yōu)選在15-35個(gè)組件之間的范圍內(nèi)。
合成的重復(fù)序列優(yōu)選包括一個(gè)或多個(gè)作為重復(fù)單元的(AQ)和/或 (QAQ)。甚至更優(yōu)選，合成的重復(fù)序列是(AQ),2， (AQ)24, (QAQ)8或 (QAQ)16。
無(wú)論合成的重復(fù)序列是何時(shí)從ADF-4衍生的，它也可以優(yōu)選包括一 個(gè)或多個(gè)SEQ ID NO:5(組件C)的氨基酸序列或其變體的一個(gè)或多個(gè)重
復(fù)，如上所述，其中總的合成的重復(fù)序列是C,6或C32。對(duì)于本發(fā)明的完全重組蜘蛛絲蛋白質(zhì)的優(yōu)選實(shí)施方案是(QAQ)sNR3， (QAQ)16NR3,(AQ)12NR3,(AQ)24NR3，C16NI^^^PC32NR4，艮卩，包含或由所 述序列組成的蛋白質(zhì)。
應(yīng)當(dāng)注意，上述合成的重復(fù)序列的構(gòu)型(利用A、 Q和C系統(tǒng))也適用 于以上公開的全部其它的重復(fù)單元，例如對(duì)于A和/或C，可以采用全部 含有聚丙氨酸的序列，并且全部富含甘氨酸的序列可以用作Q。
用于從鞭形序列衍生的合成的重復(fù)序列的新的組件是組件K(SEQ ID NO:35和36)， sp(SEQ ID NO:37和38)， X(SEQ ID NO:39禾口 40)，和 Y(SEQ IDNO:41和42):
合成的重復(fù)序列還優(yōu)選包括或由Y8, Y16, X8, X16， K8， Kw組成。
而且，也可以將那些從ADF-3和ADF-4衍生的序列和Flag組合在一 個(gè)重組序列中。
然而，在本發(fā)明中，仍然強(qiáng)烈優(yōu)選采用步驟a)中的蜘蛛絲蛋白質(zhì)，其 選自或含有ADF-4序列及其衍生物，包括C16、 C16NR4、 C32、和/或
C32NR4的組的序列。
在本發(fā)明中，蜘蛛絲蛋白質(zhì)可以另外改造成在膠囊生產(chǎn)以前含有單 一氨基酸取代或直接的化學(xué)修飾，或后者也在膠囊生產(chǎn)以后。這可用于 將例如特異性結(jié)合親和性引入到所述袋或引入蛋白酶特異性氨基酸序 列。這可以產(chǎn)生通過(guò)絲膜的蛋白水解消化的包封物的受控制釋放。
通過(guò)引入例如單一的半胱氨酸，可以實(shí)現(xiàn)所述袋的交聯(lián)或不同的官 能團(tuán)的共價(jià)偶聯(lián)。例如，用編碼賴氨酸或半胱氨酸的核酸序列替代編碼 蜘蛛絲蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的核酸，和/或?qū)⒑芯幋a賴氨酸和/或 半胱氨酸的核酸的核酸序列添加到所述序列，可以實(shí)現(xiàn)此。
另外，可以將試劑在納米膠囊或微膠囊形成前后偶聯(lián)至所述蜘蛛絲 蛋白質(zhì)，以便將所述膠囊定向到特定的細(xì)胞或組織。例如，這可以通過(guò) 引入或共價(jià)偶聯(lián)特定的RGD序列而實(shí)現(xiàn)。因而，可以將RGD肽在納米膠 囊或微膠囊形成前后交聯(lián)到所述蜘蛛絲蛋白質(zhì)。環(huán)狀RGD分子的實(shí)例顯 示在圖10中。
而且，可以將細(xì)胞或組織特異性抗體和細(xì)胞或組織特異性受體偶聯(lián) 到所述蜘蛛絲蛋白質(zhì)而將所述膠囊定向到特定的靶標(biāo)。根據(jù)另外的實(shí)施方案，b)中的溶劑和/或至少一個(gè)另外相的溶劑選自 由下列各項(xiàng)組成的組親水性溶劑優(yōu)選地水、醇如乙醇、甘油，或親脂 性溶劑優(yōu)選地天然油，諸如植物油或動(dòng)物來(lái)源的油，合成的油，諸如 miglyol、硅油，有機(jī)溶劑，諸如芳香烴，例如甲苯、苯等。應(yīng)當(dāng)注意， 一個(gè)單一的相也可以含有多于一種溶劑(即混合物)，只要 所述溶劑基本上相同。"基本上相同"指的是所述溶劑具有類似的溶解度 性質(zhì)因而僅形成一個(gè)共同的相。因而，"基本上相同的"溶劑在所述溶劑 共混的情況下包括其中不能觀察到分離的相的溶劑。作為實(shí)例，可以將 兩種或多種親脂性溶劑組合成一個(gè)相，例如植物油(例如橄欖油和蓖麻油)和miglyol和/或十六烷?；蛘?，作為備選方案，親水性相可以包括兩種或 多種親水性組分，例如水、甘油等。如上所述，唯一需要的是，用于生產(chǎn)本發(fā)明的納米膠囊和微膠囊的 乳狀液體系具有至少兩個(gè)相，其中所述相基本上不可混溶。全部已知的乳狀液類型可以采用在本發(fā)明方法的步驟c)中，例如 W/0、 0/W、 0/W/0或W/0/W類型乳狀液。這些乳狀液類型在本領(lǐng)域中 是眾所周知的并且對(duì)于另外的信息例如參考"雷明頓藥物科學(xué)(Remington's Pharmaceutical Sciences)", Mack出版公司，Easton， PA，最新版或另外 可以得到的信息。用于形成本發(fā)明的乳狀液的優(yōu)選方法是產(chǎn)生微乳狀液。微乳狀液是 尺寸在50和500 nm之間的臨界穩(wěn)定的油滴的分散體，是通過(guò)剪切含有 油、水、表面活性劑和疏水性試劑的體系而制備的。這樣的微乳狀液中 的聚合，當(dāng)仔細(xì)制備時(shí)，產(chǎn)生具有約與初始小滴相同尺寸的顆粒。這指 的是，微乳狀液的適當(dāng)制劑抑制小滴的聚結(jié)或奧斯特瓦爾德熟化。微乳 狀液的制備是通過(guò)高剪切設(shè)備諸如超聲和高壓勻漿器而進(jìn)行的。其涉及 K丄andfester和同事的多種出版物。在w/o類型乳狀液的情況下，W(親水性的)相形成乳狀液小滴并且在 該情況下，蜘蛛絲蛋白質(zhì)包含在W相中。O相是親脂性相并且形成連續(xù) 相。在0/W類型乳狀液的情況下，O(親脂性的)相形成乳狀液小滴并且在 該情況下，蜘蛛絲蛋白質(zhì)包含在O相中。W相是親水性相并且形成連續(xù)相。
上述乳狀液中使用的表面活性劑可以選自技術(shù)人員將基于藥物和相 關(guān)科學(xué)領(lǐng)域中的可以得到的知識(shí)所使用的那些化合物。在獲得本發(fā)明乳 狀液中使用的表面活性劑的例舉性選擇是甘油、山梨糖醇及其它多官能 醇的脂肪酸酯，優(yōu)選地，單硬脂酸甘油酯、脫水山梨醇單月桂酸酯、或
脫水山梨醇單油酸酯；聚乙二胺(poioxamines);聚氧乙烯醚和聚氧乙烯 酯；乙氧基甘油三酸酯；乙氧基酚和乙氧基聯(lián)苯酚；脂肪酸的金屬鹽， 脂族醇硫酸酯的金屬鹽，十二烷基硫酸鈉；和磺基丁二酸酯的金屬鹽； 聚山梨酯，更優(yōu)選聚山梨酯20、 40、 60和80;泊洛沙姆，聚氧乙烯二 醇；和所述物質(zhì)的混合物。
然而，應(yīng)當(dāng)明確注意，使用表面活性劑不是本發(fā)明的必需特征。技 術(shù)人員知道不需要表面活性劑的乳狀液體系。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，lb)中使用的溶劑還含有一種或多種藥 劑、化妝品試劑、食品或食品添加劑。換言之，另外的成分通常將存在 于所述相中，其也含有蜘蛛絲蛋白質(zhì)。在該情況下， 一種或多種成分/試 劑將被包封到在相界面形成的聚合物網(wǎng)絡(luò)中。作為備選方案，也可以將上述試劑添加到不含蜘蛛絲蛋白質(zhì)的連續(xù) 相。在該情況下，本發(fā)明的納米膠囊和微膠囊將用所述試劑涂布。
作為另外的備選方案，可以將所述試劑在通過(guò)本發(fā)明方法獲得它們 以后引入到本發(fā)明的納米膠囊和微膠囊中。
這可以通過(guò)用某些溶劑溶脹所述膜并且使包封物(有效試劑)在內(nèi)部擴(kuò) 散而進(jìn)行。還可以通過(guò)溫度、壓力或者不僅溶劑而且還有其它化學(xué)方法(諸 如化學(xué)試劑、pH，及其它)而進(jìn)行溶脹。
也可以將所述包封物結(jié)合到所述膜中。該方法可以得到比將所述包封 物包封到其中而改良的或改進(jìn)的釋放性質(zhì)。
另外結(jié)合到本發(fā)明的納米膠囊和微膠囊中的試劑類型不以任何方式 進(jìn)行限制。選自由下列各項(xiàng)組成的組鎮(zhèn)痛藥；催眠藥和鎮(zhèn)靜藥；用于治療精神病病癥諸如抑郁和精神分裂癥的藥物；抗癲癇藥 和抗驚厥藥；用于治療帕金森病和亨廷頓舞蹈病、衰老和阿爾茨海默病 的藥物；目的在于治療CNS損傷或中風(fēng)的藥物；用于治療成癮和藥物濫 用的藥物；用于寄生蟲感染和由微生物所引起的疾病的化療劑；免疫抑 制劑和抗癌藥物；激素和激素拮抗藥；用于非金屬毒性試劑的拮抗藥； 用于治療癌癥的細(xì)胞抑制劑；供醫(yī)學(xué)用的診斷物質(zhì)；免疫活性和免疫反 應(yīng)性試劑；抗生素；抗痙攣藥；抗組胺劑；止惡心藥；松弛劑；刺激 物；腦擴(kuò)張藥(dilator);促精神藥；脈管擴(kuò)張藥和收縮藥；抗高血壓藥； 用于偏頭痛治療的藥物；催眠藥，高血糖和低血糖藥劑；抗哮喘藥；抗 病毒劑；及其混合物。食品和食品添加劑可以選自由下列各項(xiàng)組成的組維生素(抗壞血 酸，醋酸維生素E等)，無(wú)機(jī)物(例如，鈣、鎂、鉀、鈉)，微量元素(硒)， 天然來(lái)源的提取物，天然油(魚油)等。例如化妝品試劑可以選自醋酸維生素E，天然或合成來(lái)源的油，泛 醇，植物提取物，UV吸收劑，消毒劑(desinfectant)，抗刺激物試劑，驅(qū) 除劑。應(yīng)當(dāng)注意，所述試劑可以存在于溶解的、懸浮的或固體形態(tài)的溶劑 中。在后者情況中，提供由本發(fā)明的蜘蛛絲蛋白質(zhì)涂布的固體核心。在優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟e)中聚合物網(wǎng)絡(luò)的分離是通過(guò)離心或通過(guò) 破壞步驟c)中形成的乳狀液并形成單相溶液而進(jìn)行的。然而，也可以使 用其它方法以便從乳狀液體系分離本發(fā)明的納米膠囊和微膠囊。步驟b)-e)中使用的溫度是5-40。C，優(yōu)選10-30并且更優(yōu)選室溫。步驟 b)-e)中使用的pH是3-9，優(yōu)選5-8，更優(yōu)選7。乳狀液小滴的尺寸和由此衍生的納米顆粒和微顆粒優(yōu)選10 nm至40 pm，優(yōu)選在500 nm和10(im之間，最優(yōu)選約5pm。獲得的納米膠囊和微 膠囊的壁厚優(yōu)選是5 100nm，更優(yōu)選10-70 nm(例如見圖5)。在第二方面中，本發(fā)明提供由以上公開的方法可獲得的納米膠囊和 微膠囊。本發(fā)明的第三方面涉及含有如上所限定的納米膠囊和微膠囊和一種 或多種藥用載體的藥物組合物。因而，本發(fā)明的有效組分優(yōu)選用于以與 可接受的載體或載體材料混合的劑量的這樣一種藥物組合物，從而可以 治療或至少緩和所述疾病。這樣一種組合物可以(除所述活性成分和所述 載體之外)包括填充材料、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑及其它材料，這 是已知的本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)。術(shù)語(yǔ)"藥用的"規(guī)定為非毒性的材料，其不干擾活性成分的生物活性 的效力。所述載體的選擇取決于應(yīng)用。所述藥物組合物可以含有增強(qiáng)活性成分活性或者補(bǔ)充治療的另外成 分。這樣的另外的成分和/或因素可以是藥物組合物的部分以實(shí)現(xiàn)協(xié)同效 應(yīng)或使不利的或不希望的效應(yīng)最小化。用于本發(fā)明的化合物的制劑或制備和應(yīng)用/藥物療法的技術(shù)發(fā)表在"雷明頓藥物科學(xué)(Remington's Pharmaceutical Sciences)", Mack出版公司， Easton， PA，最新版(也參見以上)。適當(dāng)?shù)氖┯每梢园ɡ?，口服的?皮膚的或跨粘膜的施用和腸胃外的施用，包括肌肉內(nèi)的、皮下的、髓內(nèi) (intr腿edular)的注射以及鞘內(nèi)的、直接心室內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的或 鼻內(nèi)的注射。在第四方面中，本發(fā)明提供含有如本文以上所公開的納米膠囊和微 膠囊的化妝品或食物產(chǎn)品。將在這里提到的全部出版物，專利申請(qǐng)，專利，及其它參考文獻(xiàn)通 過(guò)參考全部結(jié)合于此。在沖突的情況下，包括定義的本說(shuō)明書將控制。 另外，材料、方法、和實(shí)例僅是說(shuō)明性的并且不意欲是限制性的?，F(xiàn)在還將由附圖舉例說(shuō)明本發(fā)明，其中圖1顯示(a)作為NaCl濃度和pH的函數(shù)的peptosome的流體動(dòng)力學(xué)半 徑Rh的動(dòng)態(tài)光散射。(b) peptosome和作為pH函數(shù)的它的尺寸改變的示意 圖，其原因在于所述肽部分中的巻曲向ot-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換。圖2是蜘蛛袋/氣囊形成方法的示意圖。(A)蛋白質(zhì)水懸浮液在甲苯中 乳化。(B)蛋白質(zhì)吸附在水-甲苯界面并且變性形成聚合物網(wǎng)絡(luò)(插入物)。 (C)一旦吸附，所述蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)可以通過(guò)離心傳遞到水中。最終的袋/氣囊結(jié)構(gòu)具有內(nèi)部的水和在外面的水。(D)備選地， 一旦吸附，所述蛋白質(zhì)網(wǎng) 絡(luò)可以通過(guò)添加乙醇而傳遞到單相溶液。圖3顯示(A)甲苯/乙醇(50:50)和(B)在傳遞到水中以后的蜘蛛袋/氣囊的圖像。圖4是在傳遞到連續(xù)水相中后的充滿FITC-標(biāo)記的葡聚糖(MW 500 kDa)蜘蛛袋汽囊的圖像(A)明亮區(qū)域圖像。(B)熒光圖像。圖5顯示由SEM產(chǎn)生的干燥蜘蛛袋/氣囊圖像。己經(jīng)確定膜厚度是小 于70 nm。圖6在微膠囊形成以前(----)和以后(-)的D20中的IR光譜。光譜中的移位顯示在微膠囊形成期間蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。具體而言， 該移位顯示P-折疊的形成。微膠囊IR光譜的消巻積和高斯擬合顯示四個(gè) 峰。消巻積的峰是在1621 cm"， 1642 cm人1661 cm"禾Q 1683 cm-1并且分 別指定為卩-折疊、無(wú)規(guī)巻曲結(jié)構(gòu)和兩個(gè))3-轉(zhuǎn)角的峰。圖7微膠囊滲透性測(cè)量。(A)水中微膠囊的樣品共焦圖像，在所述微 膠囊外部添加0.3%的4 kDa的FITC葡聚糖。 一部分葡聚糖透過(guò)所述膜。 (B)如用GPC熒光測(cè)量的葡聚糖的分子量分布。(C)51微膠囊的測(cè)量截留 分子量的直方圖。平均截留分子量是2.2kDa。圖8 C,6微膠囊的蛋白酶K消化。頂部橫行是相對(duì)比圖像。底部橫行 是熒光圖像。如用熒光損失所表示，在添加蛋白酶K以后立即釋放葡聚糖。 在13±1分鐘以后發(fā)生完全的微膠囊消化。圖9對(duì)比微膠囊變形所施加的力，如用AFM測(cè)量。插入的圖是小變 形期間的線性力方式(s < 1 %)。圖10合成本發(fā)明中使用的環(huán)狀RGD分子的最終步驟。實(shí)施例 歪就劍吝形成蜘蛛氣囊的蛋白質(zhì)溶液是用第一溶解的重組蜘蛛拖絲絲蛋白 (C16，見Huemmerich等，2004)在10 mg/ml在6 M硫氰酸胍中制備的。將 蛋白質(zhì)溶液冷卻至4。C，并且利用截留分子量為14 kDa的來(lái)自Carl Roth GmbH的透析管，通過(guò)將所述蛋白質(zhì)溶液對(duì)lOmMTris緩沖液，pH8.0過(guò)夜透析，將硫氰酸胍的濃度減少到1 mM以下。通過(guò)在100.000xG的力同 時(shí)將溶液溫度保持在4°C而將透析溶液離心30分鐘而除去任何不分散的 蛋白質(zhì)。利用UV吸附確定最終的蛋白質(zhì)濃度，在276 nm的波長(zhǎng)采用蛋 白質(zhì)消光系數(shù)為0.859?？k郝成通過(guò)在300 pi甲苯中將5 ^的透析蛋白質(zhì)懸浮液乳化90秒而形成蜘 蛛絲的微膠囊(圖2A)。在乳化作用期間，絲蛋白質(zhì)在乳狀液小滴的表面 吸附并且改變它的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，產(chǎn)生包封乳狀液小滴的聚合物網(wǎng)絡(luò)(圖 2B)。利用濃度在1至6mg/ml范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)懸浮液并且用短至20秒的 乳化時(shí)間，形成蜘蛛絲微膠囊。形成的微膠囊的尺寸取決于乳狀液小滴 的尺寸。一旦形成，圍繞乳狀液小滴的蛋白質(zhì)殼從兩相乳狀液傳遞到單相溶 液中。在傳遞所述蛋白質(zhì)殼中兩個(gè)不同的方法是有效的。在第一方法 中，將300 ^il的水加入到甲苯形成水次層。將圍繞水小滴的蛋白質(zhì)殼從 甲苯層以100xg的力離心4分鐘進(jìn)入到水次層中(圖2C)。在第二方法中， 通過(guò)將300 乙醇加入到兩相乳狀液中而形成單相溶液，以便增溶甲苯 和水(圖2D)。在使用任何一個(gè)方法將所述微膠囊傳遞至單相溶液以后， 用光學(xué)顯微鏡研究得到的結(jié)構(gòu)(圖3)。不像可溶的C,6，其結(jié)構(gòu)主要是無(wú)規(guī)巻曲，裝配的蛋白質(zhì)具有P-折疊-豐富的構(gòu)象。利用IR顯微術(shù)觀察C,6構(gòu)象在裝配時(shí)的改變。最初，溶解在 D20中的Cw在1645 cm"吸收，其是無(wú)規(guī)巻曲結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的特征(圖 6)。在微膠囊形成以后，吸附光譜中的兩個(gè)谷肩(shoulder)出現(xiàn)，表明C16 二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。光譜的消巻積揭示在1621 cm—\ 1642 cm'1、 1661 cm—1 和1683 cm—1的四個(gè)高斯峰的貢獻(xiàn)。通過(guò)在乳化之前向蛋白質(zhì)溶液添加0.5重量％， FITC標(biāo)記的，500 kDa葡聚糖(西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich))而證實(shí)離心的微膠囊狀蛋白 質(zhì)殼的完整性。在乳化和離心以后，形成的微膠囊狀結(jié)構(gòu)繼續(xù)發(fā)熒光， 表明這些結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)殼在離心期間不分開(圖4)。微膠囊膜可以截留大 分子諸如高分子量葡聚糖但是對(duì)于小分子諸如熒光素是可滲透的。如果將低分子量FITC標(biāo)記的葡聚糖加入到離心的微膠囊的外部，則一部分葡 聚糖透過(guò)膜并進(jìn)入膠囊(圖7A)。低分子量葡聚糖的部分許可進(jìn)入發(fā)生是因?yàn)槠暇厶蔷哂蟹窍薅ǖ亩喾稚⑿裕ǖ秃透叩钠暇厶欠肿?圖7B)。從而所述膜接納某一截留分子量下的葡聚糖并且排除大于該截留的葡聚 糖。通過(guò)測(cè)量微膠囊內(nèi)部熒光強(qiáng)度的量并且通過(guò)利用葡聚糖的熒光分子量分布(圖7B)，如通過(guò)凝膠滲透層析法測(cè)量，確定膜的截留分子量。測(cè) 量了在13個(gè)不同的樣品中的52個(gè)不同微膠囊的滲透性。這些微膠囊的截 留分子量在0.3 kDa至6.0 kDa范圍內(nèi)，平均截留分子量為2.2 kDa(rg 18A)(圖7C)。內(nèi)容物諸如FITC-標(biāo)記的葡聚糖的酶促觸發(fā)釋放是利用酶蛋白酶K證 明的(圖8)。如熒光損失所示，在添加蛋白酶K以后不久，微膠囊膜的完 整性被破壞并且釋放葡聚糖。在葡聚糖釋放以后，酶繼續(xù)消化微膠囊直 到在13士1分鐘發(fā)生完全的消化?？梢酝ㄟ^(guò)光啟動(dòng)的用過(guò)氧化硫酸銨(APS)和Tris(2，2'-聯(lián)吡啶)二氯釕 (II)(Rubpy)的氧化用化學(xué)交聯(lián)Ci6而防止微膠囊的酶促消化。為了化學(xué)交 聯(lián)C16，將10 mM的APS和100 mM的Rubpy加入到離心的溶液，并且 通過(guò)將所述混合物暴露于來(lái)自鎢燈的光達(dá)5分鐘而光啟動(dòng)所述反應(yīng)。該交 聯(lián)致使Cw微膠囊對(duì)于用蛋白酶K的處理是穩(wěn)定的。在交聯(lián)以后，即使在 37。C溫育一小時(shí)以后，添加100^m蛋白酶K至交聯(lián)的微膠囊對(duì)于膠囊完 整性也沒(méi)有影響。該行為顯著不同于在相同條件之下幾乎立即釋放包封的 葡聚糖的非交聯(lián)微膠囊。觀察到形成的微膠囊是高度彈性的。用AFM通過(guò)壓縮測(cè)量微膠囊的 彈性。對(duì)于壓縮測(cè)量，對(duì)于尺寸在1至4微米范圍內(nèi)的微膠囊，獲得了用 彈簧常數(shù)為10 pN/nm的附著于AFM懸臂的35微米的玻璃球和對(duì)比變形 曲線的力(圖9)。在小的變形，施加的力，f，和得到的變形，s，之間的關(guān) 系由下式描述/oc ￡/ Wl2(l-C72)其中h是膜厚度，E是楊氏模量，O是泊松比，并且前因子是一級(jí)常 數(shù)。利用由使用的絲單體初始濃度計(jì)算的最大膠囊壁厚并且通過(guò)假定泊松 比為0.5，確定所述微膠囊具有楊氏模量在E二0.7-3.6GPa之間。所述膠囊也表明優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)變性劑諸如2。/。十二烷基硫酸鈉(SDS)
和8 M脲的添加對(duì)于膠囊完整性沒(méi)有影響。觀察所述微膠囊在這些條件之
下穩(wěn)定數(shù)周。
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1.生產(chǎn)納米膠囊和微膠囊的方法，所述方法包括下列步驟a)提供蜘蛛絲蛋白質(zhì)；b)在適合的溶劑中形成所述蛋白質(zhì)的溶液或懸浮液；c)產(chǎn)生至少兩相的乳狀液，所述乳狀液含有b)中形成的溶液或懸浮液作為第一相以及至少一個(gè)基本上與所述第一相不可混溶的另外的相；d)在至少兩相的界面處形成蜘蛛絲蛋白質(zhì)的聚合物網(wǎng)絡(luò)；e)從所述乳狀液分離(d)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)聚合物網(wǎng)絡(luò)。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中a)中提供的蜘蛛絲蛋白質(zhì)選自ADF-4及 其衍生物，包括C16、 C16NR4、 C32、 C32NR4的組。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中b)中的溶劑和/或所述至少一個(gè)另外 的相的溶劑選自由親水性溶劑優(yōu)選地水和醇，或親脂性溶劑優(yōu)選天然油 或合成油組成的組。
4. 上述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中c)中形成的乳狀液是 W/0、 0/W、 0/W/0或W/0/W類型的。
5. 上述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中l(wèi)b)中使用的溶劑還含有 一種或多種藥劑、化妝品試劑、食品或食品添加劑。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述藥劑以溶解的、懸浮的或固體形態(tài)存 在于所述溶劑中。
7. 上述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中步驟e)中聚合物網(wǎng)絡(luò)的 分離是通過(guò)離心或通過(guò)破壞步驟c)中形成的乳狀液并形成單相溶液而進(jìn) 行的。
8. 上述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中步驟b—e)中使用的溫度 是5-40。C，優(yōu)選10-30并且更優(yōu)選室溫，并且其中步驟b)-e)中使用的pH 是3-9，優(yōu)選5-8，更優(yōu)選7。
9. 上述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中所述乳狀液小滴和由此 衍生的納米顆粒和微顆粒的尺寸是10nm-40pm，優(yōu)選500 rnn-lO (im，最 優(yōu)選約5 ,。
10. 上述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中獲得的納米膠囊和微膠囊的壁厚是5-100 nm，優(yōu)選地10-70 nm。
11. 上述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中步驟a)中提供的蜘蛛 絲蛋白質(zhì)是改造的以便引入容許組織特異性蛋白酶解的蛋白酶特異性識(shí) 別序列。
12. 上述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中在所述納米膠囊或微 膠囊形成前后將試劑偶聯(lián)到所述蜘蛛絲蛋白質(zhì)，以便將所述膠囊定向到 特定的細(xì)胞或組織。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述試劑選自交聯(lián)到所述蜘蛛絲蛋白 質(zhì)的RGD肽、細(xì)胞或組織特異性抗體、偶聯(lián)到所述蜘蛛絲蛋白質(zhì)的細(xì)胞 或組織特異性受體。
14. 通過(guò)權(quán)利要求1-13的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法可以獲得的納米膠囊和 微膠囊。
15. 含有權(quán)利要求14的納米膠囊和微膠囊和藥用載體的藥物組合
16. 含有權(quán)利要求14的納米膠囊和微膠囊的化妝品或食物產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及從蜘蛛絲蛋白質(zhì)生產(chǎn)納米膠囊和微膠囊的方法。本發(fā)明還涉及通過(guò)該方法可以獲得的納米膠囊或微膠囊以及含有所述納米膠囊或微膠囊的藥物、化妝品和食品組合物。
文檔編號(hào)A61K9/51GK101309676SQ200680035440
公開日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2006年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月1日
發(fā)明者丹尼爾·許梅里希, 凱文·赫爾曼松, 安德烈亞斯·鮑施, 托馬斯·沙伊貝爾 申請(qǐng)人:慕尼黑技術(shù)大學(xué)