專利名稱：：芳基/脂族烴基琥珀酸酐乙酰透明質(zhì)酸衍生物的制作方法芳基/脂族烴基琥珀酸酐乙酰透明質(zhì)酸衍生物發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及以芳基-或脂族烴基琥珀酸酐(ASA)修飾透明質(zhì)酸(HA)以產(chǎn)生芳基/脂族烴基琥珀酸酐HA衍生物(ASA-HA)，涉及這樣的ASA-HA衍生物，并涉及它們的應(yīng)用和用途，尤其是在化妝品(cosmetics)和生物醫(yī)學(xué)工業(yè)中的應(yīng)用和用途。背景人體最豐富的雜多糖是糖胺聚糖(glycosaminoglycan)。糖胺聚糖是無支鏈的糖聚合物，由重復(fù)的二糖單元組成(僅硫酸角質(zhì)素在糖的核心區(qū)是分支的)。所述二糖單元通常包含兩種修飾的糖一N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)之一，作為第一糖單元。另一單元通常是糖醛酸，例如葡糖醛酸(GlcUA)或艾杜糖醛酸(iduronate)。糖胺聚糖是負(fù)電分子，并且在溶液中(insolution)具有賦予高粘性的延伸構(gòu)象。糖胺聚糖主要位于細(xì)胞表面上或胞外基質(zhì)中。糖胺聚糖在溶液中還具有低壓縮性，并因此理想的作為生理潤(rùn)滑液體，例如關(guān)節(jié)(joint)。糖胺聚糖的剛性為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)的整體性并且提供細(xì)胞之間允許細(xì)胞遷移的通道。具有最高生理重要性的糖胺聚糖是乙酰透明質(zhì)酸(hyaluronan)、硫酸軟骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素和硫酸角質(zhì)素。多數(shù)糖胺聚糖通過特異的寡糖結(jié)構(gòu)共價(jià)結(jié)合至蛋白聚糖核心蛋白。乙酰透明質(zhì)酸與某些蛋白聚糖形成大聚集體(largeaggregate),但例外是游離糖鏈與蛋白聚糖形成非共價(jià)復(fù)合體。已鑒定乙酰透明質(zhì)酸在人體中的許多功能(參見，LaurentT.C.和FraserJ.R.E.，1992,FASEBJ.6:2397-2404;和TooleB.P"1991,"Proteoglycans和hyaluronaninmorphogenesisanddifferentiation."In:CellBiologyoftheExtracellularMatrix,pp.305-341，HayE.D.,ed.，Plenum,NewYork)。乙酰透明質(zhì)酸存在于透明軟骨、滑膜關(guān)節(jié)液(synovialjointfluid)以及真皮和表皮皮膚組織中。還猜測(cè)乙酰透明質(zhì)酸在許多生理功能中具有作用，例如粘附、發(fā)育、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、癌癥、血管發(fā)生和愈傷。由于乙酰透明質(zhì)酸獨(dú)特的物理和生物特性，將其使用在眼和關(guān)節(jié)外科中，并且正在其它醫(yī)學(xué)操作(procedure)中對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。術(shù)語"乙酰透明質(zhì)酸"或"透明質(zhì)酸"用于文獻(xiàn)中的意思是具有不同分子量的酸性多糖，其由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺的殘基構(gòu)成，其天然存在于細(xì)胞表面、脊推動(dòng)物結(jié)締組織的基本胞外物質(zhì)(basicextracellularsubstance)、關(guān)節(jié)的滑液、眼內(nèi)球液(endobulbarfluid)、人臍帶組織和雞冠(cocks，comb)中。術(shù)語"透明質(zhì)酸，，事實(shí)上通常用來指具有不同分子量的帶有交替D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺殘基的全系列多糖，或甚至其降解的級(jí)分，并且因此看上去使用復(fù)數(shù)術(shù)語"透明質(zhì)酸，，更加正確。然而該單數(shù)術(shù)語將仍然用在本說明書中；另外，將頻繁地使用縮寫"HA(透明質(zhì)酸；透明質(zhì)酸)"以代替此集合術(shù)語。HA在生物體中扮演重要的角色，作為許多組織(例如皮膚、腱、肌肉和軟骨)的細(xì)胞的機(jī)械支持，其是胞間基質(zhì)的主要成分。HA在生物過程中也扮演其它重要的角色，例如組織的潤(rùn)濕和潤(rùn)滑作用。盡管HA可從上述天然組織中提取，但現(xiàn)今優(yōu)選通過微生物方法制備HA以最小化傳遞傳染物質(zhì)(infectiousagent)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，并且提高產(chǎn)品的均勻性、質(zhì)量和可用性。已將HA和它不同分子大小的級(jí)分和它們各自的鹽用作藥物，特別在治療關(guān)節(jié)病(arthropathy)方面；作為天然器官和組織的輔助和/或替代物，特別在眼科學(xué)和整容手術(shù)方面；以及作為化妝品制品中的試劑(agent)。也已開發(fā)乙酰透明質(zhì)酸的產(chǎn)品用于整形外科學(xué)(orthopaedics)、風(fēng)濕病學(xué)(rheumatology)和皮膚病學(xué)(dermatology)。還可使用HA作為用于衛(wèi)生和外科用品的多種聚合材料(例如聚氨酯、聚酯等)的添加劑，其具有使這些材料生物相容的效果。ASA修飾或衍生化在造紙工業(yè)中沿用已久，其中已使用脂族烴基琥珀酸酐以使紙表面(纖維素的)更加防水(waterresistant)(Chen,G.C.I.,Woodward,T.W.(1986)Optimizingtheemulsificationandsizingofalkenylsuccinicanhydride,TappiJournal,August,95-97)。在食品工業(yè)中，已使用2-辛烯-l-基琥珀酸酐(2畫octen-l-ylsuccinicanhydride)(OSA)改性的淀4分(modifiedstarch)以使油/水乳劑(例如，低脂人造奶油(lowfatmargarine)和蛋黃醬(mayonnaises))穩(wěn)定化，(Jarowenko，W.(In:Propertiesandusesofmodifiedstarches,1986,Ed.:O.^Wurzburg)Acetylatedstarch禾口miscellaneousorganicesters,pp55-77)。it匕夕卜,OSA改性的淀粉的流變性質(zhì)(rheologicalproperties)與未-改性的淀粉相比是非常不同的(Park，S.，Chung,M.-G"Yoo，B.(2004)Effectsofoctenylsuccinylationonrheologicalpropertiesofcomstarchpastes,Starch56:399-406)。ASA衍生化方法的優(yōu)勢(shì)在于，例如，產(chǎn)物是無毒的，化學(xué)品價(jià)廉，以及反應(yīng)是一步過程(Trubiano,PC.[In:Propertiesandusesofmodifiedstarches,1986,Ed.:O.Wurzburg]Succinateandsubstitutedsuccinatederivativesofstarch,pp131-147;Wurzburg,OB.1995.Modifiedstarches,In:FoodScienceandTechnology,Vol.67，NewYork,pp.67-97)。根據(jù)先前對(duì)于淀粉的研究，伯羥基和仲羥基均與OSA反應(yīng)(Shogren,RL，Viswanathan,A,,Felker，F(xiàn).,Gross,RA(2000)，Distributionofoctenylsuccinategroupsinoctenylsuccinicanhydridemodifiedwaxymaizestarch,Starch52:196-204)。發(fā)明概述對(duì)于與未-修飾的HA相比具有某些改變特性的透明質(zhì)酸類化合物或衍生物存在著需要，尤其是在化妝品和生物醫(yī)學(xué)工業(yè)中。感興趣的性質(zhì)是改進(jìn)的穩(wěn)定泡沫物質(zhì)的能力，和與非-親水材料混合的能力，這些性質(zhì)通常用于化妝玄O口口廠口口o本發(fā)明提供了兩親性HA-衍生產(chǎn)物，具有在化妝品或生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中有益的性質(zhì)。這些產(chǎn)品更強(qiáng)地結(jié)合于皮膚，以使它們不那么容易洗掉。ASA-HA衍生物還適用于更先進(jìn)的化妝品或生物醫(yī)學(xué)制劑，例如形成納米膠嚢/微膠嚢(nano/macrocapsule)或納米J求/孩支J求(nano/macrosphere)用于遞送活性化合物或藥物。較低分子量(MW)的ASA-HA衍生物將比具有可比較的MW的非-衍生化HA更有效地穿透皮膚。在本文的實(shí)例中，在水中在堿性條件下(pH>8.0)用脂族烴基/芳基琥珀酸酐(ASA)修飾透明質(zhì)酸(HA)。純化所得的產(chǎn)物(沉淀或透析)。這些純化的產(chǎn)物在水中形成部分水不溶性的聚集物(aggregate)。顯示1%溶液使泡沫穩(wěn)定化(減少的表面張力+增加的界面粘性)。^NMR光傳證實(shí)，在所得產(chǎn)物中HA"骨架，，的化學(xué)結(jié)構(gòu)不變，只是ASA半-酯基的引入多至取代度(degreeofsubstitution)(DS)為大約18%。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸衍生物，其包含'n，個(gè)重復(fù)單元并在pH8-9具有結(jié)構(gòu)通式(I):(I)其中在至少一個(gè)重復(fù)單元中，Rl、R2、R3、R4中的一個(gè)或多個(gè)包含在pH8-9具有結(jié)構(gòu)通式(11)的酯鍵合的脂族烴基-/芳基-琥珀酸，否則R1、R2、R3、R4是羥基OH(whereininatleastonerepeatingunitoneormoreofRl，R2,R3,R4comprisesanesterboundalkyWaryl-succinicacidhavingthegeneralstructuralfomula(II)atpH8-9,andotherwiseRl，R2，R3,R4arehydroxylgroups,OH):其中R5、R6、R7、R8中的至少一個(gè)包含脂族烴基-或芳基，否則R5、R6、R7、R8是氫原子H,而且其中標(biāo)記"酯"的氧參與與結(jié)構(gòu)(I)形成酯鍵。換句話說，本發(fā)明的一方面涉及透明質(zhì)酸衍生物，其中透明質(zhì)酸的一個(gè)或多個(gè)羥基在與一個(gè)或多個(gè)脂族烴基V芳基-琥珀酸酐(ASA)的反應(yīng)中被取代，以形成透明質(zhì)酸和所得的一個(gè)或多個(gè)脂族烴基-/芳基-琥珀酸之間的酯鍵。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生透明質(zhì)酸書f生物的方法，其包括如下步驟(a)在堿性條件下在水溶液中，使透明質(zhì)酸(HA)與一種或多種具有(m)中所示結(jié)構(gòu)通式的脂族烴基-Z芳基-琥珀酸酐(ASA)反應(yīng)，由此形成所述透明質(zhì)酸書f生物；和(b)回收所述透明質(zhì)酸書f生物。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及組合物，其包含如第一個(gè)方面限定的透明質(zhì)酸衍生物，和活性成分，優(yōu)選所述活性成分是藥理學(xué)活性劑。本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及藥用組合物，其包含有效量的如第一個(gè)方面限定的透明質(zhì)酸衍生物，連同可藥用的載體、賦形劑或稀釋劑。第五個(gè)方面涉及藥用組合物，其包含有效量的如第一個(gè)方面限定的透明質(zhì)酸衍生物作為媒介物，連同藥理學(xué)活性劑。第六個(gè)方面涉及化妝品用品，其包含有效量的如第一個(gè)方面限定的透明質(zhì)酸衍生物或如第二、第三或第四方面中任一方面限定的組合物作為活性成分。在第七個(gè)方面，本發(fā)明涉及衛(wèi)生、醫(yī)藥或外科用品，其包含如第一個(gè)方面限定的透明質(zhì)酸衍生物或如第二、第三或第四方面中任一方面限定的組合物，優(yōu)選所述用品是尿布、衛(wèi)生巾、外科海綿(surgicalsponge)、愈傷海綿(woundhealingsponge),或包含于急救繃帶(bandaid)或其它創(chuàng)傷敷裹材料中的部分。重要的方面涉及藥物月交嚢，孩O交嚢(microcapsule)，納米膠嚢(nanocapsule)、微球(microsphere)或納米球(nanosphere),其包含如第一個(gè)方面限定的透明質(zhì)酸衍生物或如第三、第四或第五方面中任一方面限定的組合物。本發(fā)明最后的方面涉及方法，其為在眼科學(xué)中、在治療骨關(guān)節(jié)炎或癌癥、脫發(fā)或禿發(fā)中執(zhí)行程序(performingprocedure)的方法，處理創(chuàng)傷的方法，藥理學(xué)活性劑的皮月夫施用或透皮施用(dermalortransdermaladministration)的方法，或皮膚施用化妝品的方法，改進(jìn)，其包含使用如第一個(gè)方面限定的透明質(zhì)酸書亍生物或如第二、第三或第四方面中任一方面限定的組合物。許多方面涉及如第一個(gè)方面所限定的透明質(zhì)酸衍生物或第三、第四或第五方面中任一方面所限定的組合物的用途，其用于制備治療骨關(guān)節(jié)炎、癌癥的藥物，制備用于眼科治療的藥物，制備用于創(chuàng)傷處理的藥物，制備用于血管發(fā)生的藥物，制備用于治療脫發(fā)或禿發(fā)的藥物，或制備保濕劑(moisturizer)。附圖簡(jiǎn)述圖1,示意性的HA的ASA修飾描述于圖1。圖2.實(shí)施例5和6中100kDaOSA-HA(14919-033)部分確定的(assigned)!H畫R光譜。圖3.用于修飾HA的ASA的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖4.Haug氏三角(Haug，striangle)總結(jié)了不同聚合物構(gòu)象的Rg和Mw之間的關(guān)系。通過在雙對(duì)數(shù)標(biāo)度(doublelogarithmicscale)中將回轉(zhuǎn)半徑(radiusofgyration)(Rg)對(duì)分子量(Mw)作圖，可得到關(guān)于聚合物構(gòu)象的信息。圖5.下面實(shí)施例12中ASA修飾的LMWHA的濃度分布曲線(Concentrationprofile)(RI)。圖6.如實(shí)施例13所述，使用表面張力計(jì)(surfacetensiometer)(Wilhelmy圖7.顯示如實(shí)施例15所述用棕櫚酸乙基己酯(ethylhexylpalmitate)(化妝油(cosmeticoil))配制24小時(shí)和8周后ASA-HA的乳化性質(zhì)。圖8.如實(shí)施例18所述，通過量熱法(calorimetry)測(cè)定OSA-HA衍生物的臨界聚集濃度(criticalaggregationconcentration)(CAC),如圖8所示，隨時(shí)間記錄樣品池(samplecell)中的焓變(Enthalpyvariation)(AH)。圖9.將實(shí)施例18的焓變(AH)繪制為樣品池中OSA--HA濃度的函數(shù)，并在曲線的轉(zhuǎn)折(break)測(cè)定OSA-HA的CAC。將每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次并作為平均值提供CAC。例如，取代度(DS)為16%的OSA-HA的CAC是0.45mg/mL。圖10.顯示如實(shí)施例19所述，最大發(fā)射波長(zhǎng)作為緩沖液1中OSA-HA(DS=44%)濃度的函數(shù)。圖11.顯示如實(shí)施例20所述，最大發(fā)射波長(zhǎng)作為OSA-HA(DS=44%)濃度的函數(shù)，而CAC隨NaCl濃度增加而減小。圖12.顯示如實(shí)施例21所測(cè)定的，10-3MNaCl中OSA-HA(DS=44%,1mg/mL)的；電勢(shì)(Zetapotential)。圖13,顯示實(shí)施例22的OSA—HA(DS=44%)聚合微團(tuán)(polymericmicelle)的電子透射顯微照片(transmissionelectronmicrograph),它們是球形的并具有通常為50至200nm的亞微粒尺度(submicronicdimension)。發(fā)明詳述透明質(zhì)酸"透明質(zhì)酸(hyaluronicacid)"在本文中定義為由通過交替的卩-1，4和|3-1,3糖苷鍵連接到一起的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)的重復(fù)二糖單元組成的未硫酸化糖胺聚糖。透明質(zhì)酸也稱作乙酰透明質(zhì)酸(hyaluronan)、透明質(zhì)酸鹽(hyaluronate)或HA。術(shù)語乙酰透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸在本文可以互換使用。雞冠是乙酰透明質(zhì)酸重要的商業(yè)來源。；欽生物是可替換的來源。美國(guó)專利No.4，801，539公開了用于制備透明質(zhì)酸的發(fā)酵方法，其涉及獸瘟鏈球菌(&/7toco"wzoo^/(ie/m'cw力菌抹，l艮道的產(chǎn)率是每升約3.6g透明質(zhì)酸。歐洲專利No.EP0694616公開了使用改進(jìn)的獸瘟鏈球菌菌抹的發(fā)酵方法，報(bào)道的產(chǎn)率是每升約3.5g透明質(zhì)酸。如完整并入本文的WO03/054163(Novozymes)中所公開的，可以重組地產(chǎn)生透明質(zhì)酸或其鹽，例如在革蘭氏陽性芽孢桿菌屬宿主中重組產(chǎn)生。已描述了乙酰透明質(zhì)酸合酶來自于脊推動(dòng)物、細(xì)菌病原體和藻病毒(DeAngelis，P,L.，1999,Cell.Mol.LifeSci.56:670-682)。WO99/23227公開了來自"f以馬《連玉求菌(5^eptococcwse《w/w.mz7/力的I纟且透明質(zhì)酸鹽合酶(hyaluronatesynthase)。WO99/51265和WO00/27437描述來自多殺巴斯德氏菌CPa^wM〃aww/toc^a)的II組透明質(zhì)酸鹽合酶。Ferretti等^>開了釀膿鏈球菌(5^印tococcws;;/ogewas)的乙酰透明質(zhì)酸合酶才喿縱子，其由三個(gè)基因hasA、hasB和hasC組成，其分別編碼透明質(zhì)酸鹽合酶、UDP葡糖脫氫酶和UDP-葡糖焦磷酸化酶(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98,4658-4663,2001)。WO99/51265描述具有似馬鏈球菌乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼區(qū)的核酸片段。由于重組芽孢桿菌屬細(xì)胞的乙酰透明質(zhì)酸直接表達(dá)至培養(yǎng)基，可以使用簡(jiǎn)單的方法從該培養(yǎng)基中分離乙酰透明質(zhì)酸。首先，將芽孢桿菌屬細(xì)胞和細(xì)胞碎片從培養(yǎng)基中物理去除。如果需要，首先可將培養(yǎng)基稀釋以降低培養(yǎng)基的粘性。用于從培養(yǎng)基去除細(xì)胞的許多方法對(duì)于本領(lǐng)域那些技術(shù)人員是已知的，例如離心和微濾。如果需要，然后可將剩余的上清液(例如通過超濾)過濾以進(jìn)行濃縮和從乙酰透明質(zhì)酸去除d、分子污染物。去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片之后，通過已知機(jī)制從培養(yǎng)基簡(jiǎn)單沉淀乙酰透明質(zhì)酸。鹽、醇或鹽和醇的組合可以用于從濾液沉淀乙酰透明質(zhì)酸。一旦變?yōu)?reduceto)沉淀物，能夠容易地將乙酰透明質(zhì)酸通過物理方法從溶液中分離。可通過使用本領(lǐng)域已知的蒸發(fā)技術(shù)(例如噴霧干燥)，從濾液溶液干燥或濃縮乙酰透明質(zhì)酸。本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及透明質(zhì)酸書f生物，其包含n個(gè)重復(fù)單元并在pH8-9具有結(jié)構(gòu)通式(I):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>其中在至少一個(gè)重復(fù)單元中，Rl、R2、R3、R4中的一個(gè)或多個(gè)包含在pH8-9具有結(jié)構(gòu)通式(11)的酯鍵合的脂族烴基-/芳基-琥珀酸，否則R1、R2、R3、R4是羥基OH:其中R5、R6、R7、R8中的至少一個(gè)包含脂族烴基-或芳基，否則R5、R6、R7、R8是氫原子H，而且其中標(biāo)記"酯"的氧參與與結(jié)構(gòu)(I)形成酯鍵。在第一個(gè)方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，Rl、R2、R3、R4中的兩個(gè)或更多個(gè)包含在pH8-9具有結(jié)構(gòu)通式(11)的一個(gè)或多個(gè)酯鍵合的脂族烴基-/芳基-琥珀酸；優(yōu)選Rl、R2、R3、R4中的三個(gè)或更多個(gè)包含在pH8-9具有結(jié)構(gòu)通式(II)的一個(gè)或多個(gè)酯鍵合的脂族烴基-/芳基-琥珀酸。在第一個(gè)方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R5、R6、R7、R8中的至少一個(gè)包含脂族烴基，優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少兩個(gè)包含脂族烴基，更優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少三個(gè)包含脂族烴基；優(yōu)選所述脂族烴基包含C廣C20脂族烴基，優(yōu)選丙基、2-辛烯基、2-壬烯基、2-十二烯基、2-十六烯基或2-十八烯基。又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及第一個(gè)方面的HA衍生物，其中R5、R6、R7、R8中的至少一個(gè)包含芳基，優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少兩個(gè)包含芳基，更優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少三個(gè)包含芳基；且優(yōu)選所述芳基是苯基。優(yōu)選R5、R6、R7、R8包含兩個(gè)或更多個(gè)不同的脂族烴基和/或芳基，優(yōu)選選自丙基、2-辛烯基、2-壬烯基、2-十二烯基、2-十六烯基、2-十八烯基，和苯基。分子量可以根據(jù)改進(jìn)的呼唑方法(Bitter和Muir，1962,AnalBiochem.4:330-334)測(cè)定透明質(zhì)酸的水平。此外，可以使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定透明質(zhì)酸的平均分子量，例如由Uenoetal.,1988,Chem.Pharm.Bull,36，4971-4975;Wyatt，1993,Anal.Chim,Acta272:1-40;和WyattTechnologies,1999，"LightScatteringUniversityDAWNCourseManual"和"DAWNEOSManual"WyattTechnologyCorporation,SantaBarbara,California所述的那些方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過本發(fā)明方法獲得的透明質(zhì)酸」肝生物具有大約800至大約10,000，000Da的分子量。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過本發(fā)明方法獲得的透明質(zhì)酸書f生物具有大約1,000至大約9,000,000Da;大約2,000至大約10,000,000Da;大約4,000至大約10，000，000Da;大約8,000至大約10,000,000Da;大約10,000至大約10,000,000Da;或大約25,000至大約5，000，000Da的分子量。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過本發(fā)明方法獲得的透明質(zhì)酸衍生物具有大約50,000至大約3,000，000Da的分子量。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及第一方面的產(chǎn)品，其中所述透明質(zhì)酸或其鹽具有300,000-3,000,000;優(yōu)選400,000-2,500,000;更優(yōu)選500,000-2,000，000;和最優(yōu)選600,000-1,800,000的分子量。將重組產(chǎn)生的透明質(zhì)酸或其鹽用于本發(fā)明的方法以制備本發(fā)明的產(chǎn)物或組合物時(shí)，對(duì)于一些應(yīng)用可有利地先降低透明質(zhì)酸或其衍生物或鹽的平均分子量。例如，其已由所謂的透明質(zhì)酸低分子量級(jí)分的幾個(gè)制造者所述，能夠穿透皮膚屏障(skinbarrier)以在皮膚中重建透明質(zhì)酸的天然含量，因此，這樣的級(jí)分特別適于作為抗皮膚老化劑和抗皺劑出售的化妝品組合物。對(duì)于食品應(yīng)用，已顯示低MW透明質(zhì)酸穿透胃腸道屏障(gastrointestinalbarrier),由此增加其生物可用性。最后，〗氐MW透明質(zhì)酸顯示抗炎作用(anti-inflammatoryeffect)并在炎性疾病的治療中具有潛在應(yīng)用。減小透明質(zhì)酸或其衍生物或鹽的平均分子量可通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)現(xiàn)，例如，簡(jiǎn)單熱處理、酶降解、超聲聲處理(ultrasoundsonication)或酸水解(acidhydrolysis)。參見，例如，美國(guó)專利6,020,484，其描述了包括NaOCH乍為添加劑的HA的超聲處理技術(shù)(ultrasonicationtechnique),禾口T.Miyazaki等(2001)PolymerDegradationandStability,74:77-85。因此，優(yōu)選的實(shí)施方案涉及本發(fā)明的HA衍生物，其中透明質(zhì)酸或其衍生物或鹽的低平均分子量為800-10,000,000Da;優(yōu)選10,000-1,500,000Da;優(yōu)選10,000-50,000Da;或優(yōu)選50,000-500,000Da;甚至更優(yōu)選80,000-300,000Da。取^度(Degreeofsubstitution)(DS)根據(jù)如下實(shí)施例6,通過'HNMR光i普測(cè)定DS(10mg/ml,D20，80°C,128掃描，400MHz),其中使用2D-NMR(gCOSY)確定OSA基團(tuán)的峰。通過比較OSA的乙烯基質(zhì)子的強(qiáng)度(5.4和5.6ppm)與乙?；|(zhì)子的強(qiáng)度(2.0ppm)來計(jì)算DS。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一方面的HA衍生物的取代度(DS)為0.1-100%,優(yōu)選1-90%,更優(yōu)選2-80%,還更優(yōu)選4-70%,甚至更優(yōu)選8-60%，或10-50%，14-40%，16-300/0或最優(yōu)選18-25%。脂族烴基-/芳基-琥珀酸酐(ASA)在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)脂族烴基V芳基-琥珀酸肝(ASA)具有結(jié)構(gòu)通式(ni):O在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R5、R6、R7、R8中的至少一個(gè)包含脂族烴基，優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少兩個(gè)包含脂族烴基，更優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少三個(gè)包含脂族烴基；而且優(yōu)選所述脂族烴基包含C廣C2o脂族烴基，優(yōu)選丙基、2-辛烯基、2-壬烯基、2-十二烯基、2-十六烯基或2-十八烯基。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，R5、R6、R7、R8中的至少一個(gè)包含芳基，優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少兩個(gè)包含芳基，更優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少三個(gè)包含芳基，其優(yōu)選包含苯基。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選R5、R6、R7、R8包含兩個(gè)或更多個(gè)不同的脂族烴基和/或芳基，優(yōu)選選自丙基、2-辛烯基、2-壬烯基、2-十二烯基、2-十六烯基、2-十八烯基，和苯基。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)ASA包含圖3所示的任何結(jié)構(gòu)式。在本發(fā)明的方法中，可使用重組產(chǎn)生的HA,其是通過如下方法產(chǎn)生的，其中使用本領(lǐng)域已知的方法在適于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生HA的宿主細(xì)胞。例如，可以通過在合適的培養(yǎng)基中以及允許涉及透明質(zhì)酸合成的酶表達(dá)和允許透明質(zhì)酸分離的條件下，在實(shí)驗(yàn)室中或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。在包含碳源和氮源和無機(jī)鹽的合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可以從商業(yè)供應(yīng)商獲得，或可以根據(jù)已公開的組成(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。分泌的透明質(zhì)酸能夠直接從培養(yǎng)基中回收。可以通過本領(lǐng)域已知的方法分離所得透明質(zhì)酸。例如，可以從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中通過常規(guī)方法分離透明質(zhì)酸，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。然后可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)一步純化分離的透明質(zhì)酸，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、色譜聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備等電聚焦)、差示溶解度(例如，辟L酸4妄沉淀)或^是取(參見，例如，ProteinPurification,J.國(guó)C.JansonandLarsRyden，editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。宿主細(xì)胞優(yōu)選實(shí)施方案涉及所述透明質(zhì)酸或其鹽是在何處重組產(chǎn)生的，優(yōu)選通過革蘭氏-陽性細(xì)菌或宿主細(xì)胞，更優(yōu)選通過芽孢桿菌屬(genus^^///^)細(xì)菌重組產(chǎn)生。宿主細(xì)胞可以是適于重組產(chǎn)生透明質(zhì)酸的任何芽孢桿菌屬細(xì)胞。芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞可以是野生型芽孢桿菌屬細(xì)胞或其突變體。在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的芽孢桿菌屬細(xì)胞包括但不限于，5a"7/wsagaracfeAera、嗜石威芽孢桿菌(Bacz'〃1^a汰a/o//w7i^)、解^定粉芽孑包4干菌(jBac7'〃usamy/o/^i/^rc/erah-豆芽孑包才干菌(Ba"'〃w51Zrev/力、環(huán)^)犬芽孑包才干菌(Bac/〃Mc/;-cw/ara)、5a"7/wsc/aus7z'、凝結(jié)芽孑包桿菌(5ac/〃wcoagw/ora)、堅(jiān)強(qiáng)芽孑包桿菌(5<3cz7/iy^mtw)、杣爛芽孑包桿菌(5ac/〃w/aw/w)、遲緩芽孑包斥干菌(5ac///1^/ew/w》、；也衣芽孑包4干菌C8"c/〃m//c/zewybrw/j1)、巨大芽孑包4干菌(5ac/〃uswega&n'ww)、#豆小芽孑包4干菌(5ac〃/ws;w脂7ms)、嗜熱月旨肪芽孑包桿菌(5ac/〃ws1ytoaro^zermo//z//"1y)、枯草芽孑包桿菌(5ac/〃"ssw6"to)和蘇云金芽孢桿菌(5ac/〃ws^2wn'"gz'e"w》纟田胞。特別適于重組表達(dá)的突變枯草芽孢桿菌細(xì)胞在WO98/22598有所描述。無被嚢的(non-encapsulating)芽孢桿菌屬細(xì)胞在本發(fā)明中是特別有用的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、B""7/wc/m^z'、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬細(xì)胞^S"c/〃wc/m^/細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌A164A5(參見美國(guó)專利號(hào)5,891,701)或枯草芽孢桿菌168A4?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，例如，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，ChangandCohen,1979，MolecularGeneralGenetics168:111-115)，通過使用感受態(tài)細(xì)胞(參見，例如，YoungandSpizizen，1961，JournalofBacteriology81:823-829,或DubnauandDavidoff-Abelson，1971,JournalofMolecularBiology56:209-221)，通過電穿孔(參見，例如，ShigekawaandDower，1988，Biotechniques6:742-751),或通過才妄合(參見，例如，KoehlerandThome,1987，JournalofBacteriology169:5271-5278)。鹽和交聯(lián)的HA優(yōu)選的實(shí)施方案涉及第一方面的透明質(zhì)酸衍生物，其包含透明質(zhì)酸的無機(jī)鹽，優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸銨、透明質(zhì)酸鉤、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鋅或透明質(zhì)酸鈷。EP0161887Bl中公開了交聯(lián)的HA或其鹽的制備物，其通過用多官能環(huán)氧化合物交聯(lián)HA來制備。HA與脂族醇全部或部分交聯(lián)的酯和這些偏酯與無機(jī)或有枳"喊形成的鹽公開于US4,957,744。交聯(lián)HA的其它方式公開于美國(guó)專利號(hào)5,616,568、5,652,347和5,874,417。交聯(lián)的HA還可通過用硼酸處理HA來制備，如下將通過發(fā)酵(WO03/054163;Novozymes)在枯草芽孢桿菌中重組產(chǎn)生的干燥的透明質(zhì)酸鈉(Na-HA，203mg)溶于0.2MNaOH以得到4%溶液。加入硼酸(35mg(大約1當(dāng)量的HA二糖)并在室溫將該樣品攪拌1.5h,然后在5。C貯存大約2.5天。完全如上所述平行地制備對(duì)照樣品，只是不加硼酸。使用CarrimedCSL可控的應(yīng)力流變儀(controlledstressrheometer)(錐體幾何形狀(conegeometry):6cm,2°)在25。C測(cè)定所得HA-硼酸鹽水凝膠(HA-boratehydrogel)的粘度。該粘度取決于剪切速率并且與對(duì)照樣品相比在HA-硼酸鹽水凝膠中增加到至少4-倍(4.2-至8.4倍)，這說明形成了交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。與Na-HA的標(biāo)準(zhǔn)光譜相比，在HA-硼酸鹽水凝"交的FT-IR光i普上觀察到在1200和945cm-1的新的峰，其對(duì)應(yīng)于在交聯(lián)的HA-硼酸鹽水凝膠中新形成的硼酸酯的存在。因此，優(yōu)選的實(shí)施方案涉及第一個(gè)方面的HA衍生物，其包含交聯(lián)的透明質(zhì)酸或其鹽，優(yōu)選透明質(zhì)酸與硼酸交聯(lián)，更優(yōu)選交聯(lián)的透明質(zhì)酸包含硼酸酯。粒度(Tarticlesize)第一個(gè)方面的優(yōu)選的HA衍生物具有50百分位數(shù)(percentile)的粒度，其050為10-1,000微米，優(yōu)選100-1，000微米，更優(yōu)選150-900微米，甚至更優(yōu)選200-800微米，如通過懸浮于異丙醇中的粒子的激光衍射測(cè)量法(laserdiffractionmeasurement)所觀'J定的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將第一個(gè)方面的HA衍生物的多分散性(polydispersity)測(cè)定為SPAN值，其根據(jù)下式計(jì)算SPAN=(D90-D10)/D50,且SPAN值為1.0-2.5;優(yōu)選SPAN值為1.2-2.2;更優(yōu)選SPAN值為1.5-1.9;和最優(yōu)選SPAN值為1.6-1.8。微粒0V[icroparticles)如下面的實(shí)施例所示，本發(fā)明提供ASA-HA衍生物，其能夠形成微?；蚣{米粒子，或微膠嚢或納米膠嚢。這些粒子或膠嚢或包含這些的組合物可用于大量的商業(yè)和科學(xué)應(yīng)用，如用于化妝品或用于一般的藥物輸送(drug-delivery)。其它成分在優(yōu)選實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的HA衍生物的組合物還可包含其它成分，優(yōu)選一種或多種活性成分，優(yōu)選一種或多種藥理學(xué)活性物質(zhì)，并且還優(yōu)選水溶性j陚形劑，例如乳糖?？捎糜诒景l(fā)明中的活性組分或藥理學(xué)活性物質(zhì)的非限定性實(shí)例包括蛋白質(zhì)和/或肽藥物，例如，人生長(zhǎng)激素、牛生長(zhǎng)激素、豬生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)激素釋放激素/肽、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、紅細(xì)胞生成素、骨形態(tài)形成性蛋白質(zhì)(bonemorphogenicprotein)、干擾素或其衍生物、胰島素或其衍生物、心房肽III(atriopeptin-III)、單克隆抗體、腫瘤壞死因子、巨噬細(xì)胞活化因子、白細(xì)胞介素、腫瘤退化因子(tumordegeneratingfactor)、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、組織纖溶酶原;敫5舌凈勿(tissueplasminigenactivator)、因子VII、因子VIII和尿5敫酶?？砂ㄋ苄再x形劑用于穩(wěn)定活性成分的目的，這種賦形劑可包括蛋白質(zhì)，例如，白蛋白或明膠；氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸和它們的鹽；糖例如葡萄糖、乳糖、木糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、葡聚糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖和硫酸軟骨素；無機(jī)鹽例如磷酸鹽；表面活性劑例如TWEEN(ICI)、聚乙二醇，及其混合物?？梢园串a(chǎn)品重量計(jì)0.001至99%的量使用賦形劑或穩(wěn)定劑。本發(fā)明的幾個(gè)方面涉及各種組合物和藥物，其中包含有效量的如第一方面所限定的產(chǎn)品，和活性成分，優(yōu)選所述活性成分是藥理學(xué)活性劑；可藥用的載體、賦形劑或稀釋劑，優(yōu)選水溶性賦形劑，并且最優(yōu)選乳糖。此外，本發(fā)明的多個(gè)方面涉及用品(article),其包含如第一方面所定義的HA衍生物或如上多個(gè)方面和實(shí)施方案中所限定的組合物，例如化妝品、衛(wèi)生用品、醫(yī)藥或外科用品。在最后的方面，本發(fā)明涉及藥物膠嚢或微膠嚢，其包含如第一方面所限定的產(chǎn)品或如本發(fā)明其它方面和實(shí)施方案所限定的組合物。實(shí)施例材料高分子量(High-MW)透明質(zhì)酸(HA):-(批號(hào)(batch)MAG30014)畫(批號(hào)MAF145SD)低分子量(Low-MW)HA:-100kDa(批號(hào)14919-021)-30kDa(批號(hào)14919-032)-23kDa-14kDa脂肪烴基/芳基琥珀酸酐-順/反-2-辛烯畫l畫基琥珀酸酐(OSA),AldrichChemicalCompany(d.:1,000，MW220.27,97%純度)。-苯基琥珀酸酐(PhSA)(干粉，MW176.17)。-壬烯基琥珀酸酐(NSA)AldrichChemicalCompany(d.:1.032,MW224.30，95+%純度，1JS38，246-00198-1)。-十二烯基琥珀酸酐(DSA)(d.:1.01，MW266.38,1JS38,246-00168)。-四丙基琥珀酸酐(TpSA)。-十六烯基琥珀酸酐(HDSA)-十八烯基琥珀酸肝(ODSA)-ODSA和HDSA的混合物(50:50)乙醇96%，變性的。4MHC1和4MNaOH。Na2C03Milli-(/超純水(Millipore)。再生纖維素的透析管，其截留分子量為12-14kDa,Spectr/PorTM(SpectrumMedicalIndustries)。超濾膜(MWCO10kDa和3kDa)。實(shí)施例1.高-MWOSA-HA，初始pH9.0，乙醇沉淀在室溫將HA(批號(hào)MAF145SD，1.42g)過夜溶于Milli-Q水(200mL)中，然后用4MNaOH將pH調(diào)節(jié)到9.0。在強(qiáng)的攪拌下加入OSA(1mL,4.54mmol)。使溶液維持在環(huán)境溫度在強(qiáng)攪拌下(大約600rpm)反應(yīng)16小時(shí)。加入20mL飽和NaHC03以緩沖反應(yīng)。反應(yīng)后，用1MHC1將pH調(diào)節(jié)到6.8。加入96°/。乙醇(4體積)以得到80。/。v/v的終濃度從而通過乙醇沉淀回收產(chǎn)物。通過離心(3000rpm，15min和4。C)回收沉淀物。用96%乙醇洗滌沉淀，然后再溶于MQ水并冷凍干燥(freezedrying)。實(shí)施例2.高-MWOSA-HA，初始pHll，乙醇沉淀向Milli-Q水的三個(gè)50mL溶液中每一個(gè)加入HA(批號(hào)MAF145SD,1.13g)，并在室溫溶解過夜。用4MNaOH將pH調(diào)節(jié)到11。在強(qiáng)的攪拌下將不同量的OSA(1.10mL(5.23mmol),0.505mL(2.62mmol)，0.110mL(0,52mmol))加入三個(gè)溶液中的每一個(gè)。使溶液維持在環(huán)境溫度在強(qiáng)攪拌下(大約600rpm)反應(yīng)21小時(shí)。反應(yīng)后所有的樣品具有大約4-5的pH。加入96%乙醇(4體積)以得到80%v/v的終濃度從而通過乙醇沉淀回收產(chǎn)物。通過離心(3000rpm，15min和4。C)回收沉淀物。用96%乙醇洗滌沉淀，然后再溶于MQ水并冷凍干燥。實(shí)施例3.高-MWOSA-HA，初始pH9.0，pH保持在9-11，透析在室溫將HA(批號(hào)MAF145SD，0.75g)過夜溶于Milli-Q水(150mL)，然后將pH調(diào)節(jié)到9.0。在強(qiáng)攪拌下加入OSA(1.42mL,6.25mmo1)。使溶液維持在環(huán)境溫度在強(qiáng)攪拌下(大約600rpm)反應(yīng)16小時(shí)。通過使用恒ph器(pHstat)(加入1MNaOH)將pH維持在大約9-11。將產(chǎn)物相對(duì)于MQ水透析3x3h(4。C,7L，MWCO12-14,000Da)，冷凍(frozen)并凍干(lyophilised)。實(shí)施例4.高-MWOSA-HA，初始pH8.5，pH保持在9-11，透析在室溫將HA(批號(hào)MAG30014，0.75g)過夜溶于Milli-Q水(lSOmL),然后將pH調(diào)節(jié)到8.5。在強(qiáng)攪拌下加入OSA(1.42mL,6.25mmol)。使溶液維持在環(huán)境溫度在強(qiáng)攪拌下(大約600rpm)反應(yīng)16小時(shí)。通過使用恒ph器(pHstat)(力口入1MNaOH)將pH維持在大約9-ll。通過使用1MHCl將pH調(diào)節(jié)到6.5。將產(chǎn)物相對(duì)于0.2MNaOH透析3x3h,并相對(duì)于MQ水透析3x3h(4°C,7L，MWCO12-14,000Da),冷凍并凍干。實(shí)施例5.低-MWOSA-HA(30和100kDa)在室溫將低-MWHA(30或100kDa，2.5g)過夜溶于Milli-Q水(50mL)，然后將pH調(diào)節(jié)到8.5。在強(qiáng)攪拌下加入等摩爾量的OSA(3.35mL,HA:OSA比例l:l)或?yàn)镠A的摩爾濃度1/10的OSA(0.35mL,HA:OSA比例10:1)。使溶液維持在環(huán)境溫度在強(qiáng)攪拌下(大約600rpm)反應(yīng)16小時(shí)。通過使用恒ph器(pHstat)(加入1M或0.5MNaOH)將pH維持在大約8.5-9.0。將產(chǎn)物相對(duì)于MQ水透析3x3h(4°C,7L,MWCO12-14,000Da)，冷凍并凍干。實(shí)施例6.產(chǎn)物表征-結(jié)果和討論分f量使用SEC-MALLS-VISC(流動(dòng)相150mMNaCl，50mMNaH2P04,pH7.0，0.5ml/min,注射體積(injectedvolume):0.5ml)分析實(shí)施例5的100kDaOSA-HA。使用的柱PL水凝膠(aquagel)OH-40/OH-50/OH60。系統(tǒng)WatersAllianceHPLC系統(tǒng)Waters2410RI檢測(cè)器和WyattMALLS檢測(cè)器。使用來自WyattTechnologyCorp.的ASTRAV軟件處理數(shù)據(jù)。城,卿通過^NMR光i普測(cè)定DS(10mg/ml,D20，80°C，128掃描，400MHz)。通過使用2D-NMR(gCOSY)確定OSA基團(tuán)的峰。潛果和論務(wù)MPF股在高-MWHA的所有實(shí)驗(yàn)過程中，觀察是相同的OSA形成琥珀色油滴(amber-colouredoildrop),其由于攪拌逐漸分成較小的滴。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，溶液是白色的和不透明像奶一樣，這能夠解釋為形成微團(tuán)或微尺度聚集物/液滴。甚至在通過沉淀或透析進(jìn)行純化后，此時(shí)將過量的OSA除去，仍在不同程度觀察到此現(xiàn)象。在高-MWHA的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，使用在80%乙醇中的沉淀以除去OSA修飾的剩余物/副產(chǎn)物(surplus/by-product)。然而，由于使所述產(chǎn)物沉淀完全的問題，選擇對(duì)Milli-Q水的透析作為更好的方法。高-MWOSA-HA的初始制備物都顯示溶液性質(zhì)的變化。一個(gè)實(shí)施例是它們都使泡沫非常有效的穩(wěn)定若干小時(shí)；這通過搖動(dòng)1%溶液繼之以目視檢查(visualinspection)來簡(jiǎn)單地測(cè)試。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中另一個(gè)觀察是，溶液的pH值在反應(yīng)過程中逐漸下降。因此，需要緩沖該系統(tǒng)，例如用NaC03緩沖或使用恒pH器。重要的是，將pH值保持在8.0以上以使反應(yīng)進(jìn)行，且在9.0以下以避免通過水解除去OSA基團(tuán)。嘗試高-MWOSA-HA產(chǎn)物的NMR光譜，但由于溶解度問題，僅僅觀察到OSA和HA的一些非常弱的峰，而且不能測(cè)出DS。在所有情況下，產(chǎn)量接近或稍高于起始材料HA的量(通過稱量?jī)龈傻漠a(chǎn)物來測(cè)定)。4更>^:rf乂《A/fM/JL//1進(jìn)行四個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)，并連同！H-NMR光譜的DS和產(chǎn)量(yield)總結(jié)于表1。通過比較OSA的乙烯基質(zhì)子的強(qiáng)度(5.4和5.6ppm)與乙?；|(zhì)子的強(qiáng)度(10ppm)來計(jì)算DS。通過2DNMR光譜(gCOSY)闡明了30kDaOSA-HA的NMR光譜，并在圖2中給出了部分確定的峰，顯示100kDaOSA-HA(14919-033)的^NMR光譜。最終，在這些實(shí)驗(yàn)中，高-和低-MW透明質(zhì)酸均用2-辛烯-l-基琥珀酸酐(OSA)成功地修飾。表l.制備低-MWOSA-HA的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實(shí)施例7.低-MWOSA-HA衍生物(14kDa)在室溫將^氐-MWHA(14kDa，2.5g)溶于Milli-Q水(50mL)，然后將pH調(diào)節(jié)到8.5。在強(qiáng)攪拌下加入等摩爾量的OSA(3.35mL,HA:OSA比例l:l)或?yàn)镠A的摩爾濃度1/10的OSA(0.34mL，HA:OSA比例10:1)。使溶液維持在環(huán)境溫度在強(qiáng)攪拌下(大約600rpm)反應(yīng)16小時(shí)。通過使用恒ph器(力口入0.5MNaOH)將pH維持在大約8.5-9.0。將產(chǎn)物相對(duì)于MQ水透析3x3h(4°C,7L,MWCO12-14,000Da)，冷凍并凍干。純化和冷凍-干燥后的產(chǎn)量分別為2.1g和2.1g。如實(shí)施例6所述，DS分別測(cè)定為11.5%和2.6%。實(shí)施例8.低-MW苯基-琥珀酸酐(PhSA)HA衍生物(14kDa)在室溫將低-MWHA(14kDa,2.5g)溶于Milli-Q水(50mL)，然后將pH調(diào)節(jié)到8.5。在強(qiáng)攪拌下逐漸加入等摩爾量的PhSA(2.8g，HA:PhSA比例l:l)或?yàn)镠A的摩爾濃度1/10的PhSA(0.28g,HA:PhSA比例10:1)。^f吏溶液維持在環(huán)境溫度在強(qiáng)攪拌下(大約600rpm)反應(yīng)16小時(shí)。通過使用恒ph器(加入0.5MNaOH)將pH維持在大約8.5-9.0。將產(chǎn)物相對(duì)于MQ水透析3x3h(4°C,7L,MWCO12-14,000Da),冷凍并凍干。純化和冷凍-干燥后的產(chǎn)量分別為2.5g和2.4g。如實(shí)施例6所述，DS分別測(cè)定為15.1%和2.6%。實(shí)施例9.低-MW2-壬烯-l-基琥珀酸酐(NSA)HA衍生物(14kDa)在室溫將低-MWHA(14kDa，2.5g)溶于Milli-Q水(50mL),然后將pH調(diào)節(jié)到8.5。在強(qiáng)攪拌下加入等摩爾量的NSA(3.55mL,HA:NSA比例l:l)或?yàn)镠A的摩爾濃度1/10的NSA(0.35mL,HA:NSA比例10:1)。使溶液維持在環(huán)境溫度在強(qiáng)攪拌下(大約600rpm)反應(yīng)16小時(shí)。通過使用恒ph器(力口入0.5MNaOH)將pH維持在大約8.5-9.0。將產(chǎn)物相對(duì)于MQ水透析3x3h(4°C,7L，MWCO12-14,000Da),冷凍并凍干。純化和冷凍-干燥后的產(chǎn)量分別為2.4g和2.2g。如實(shí)施例6所述，DS分別測(cè)定為11.4%和2.1%。實(shí)施例10.低-MW2-十二烯-l-基琥珀酸酐(DSA)HA衍生物(14kDa)在室溫將低-MWHA(14kDa,2.5g)溶于Milli-Q水(50mL)，然后將pH調(diào)節(jié)到8.5。在強(qiáng)攪拌下加入等摩爾量的DSA(4.20mL，HA:DSA比例l:l)或?yàn)镠A的摩爾濃度1/10的DSA(0.42mL，HA:DSA比例10:1)。4吏溶液維持在環(huán)境溫度在強(qiáng)攪拌下(大約600rpm)反應(yīng)16小時(shí)。通過使用恒ph器(加入0.5MNaOH)將pH維持在大約8.5-9.0。將產(chǎn)物相對(duì)于MQ水透析3x3h(4°C，7L,MWCO12-14,000Da)，冷凍并凍干。純化和冷凍-干燥后的產(chǎn)量分別為2.2g和2.2g。如實(shí)施例6所述，DS分別測(cè)定為2.2%和1.7%。實(shí)施例ll.低-MW四丙基琥珀酸酐(TpSA)HA衍生物(14kDa)在室溫將低-MWHA(14kDa,2.5g)溶于Milli-Q水(50mL)，然后將pH調(diào)節(jié)到8.5。在強(qiáng)攪拌下加入等摩爾量的TpSA(3.25mL,HA:TpSA比例l:l)或?yàn)镠A的摩爾濃度1/10的TpSA(0.33mL，HA:TpSA比例10:1)。1吏溶液維持在環(huán)境溫度在強(qiáng)攪拌下(大約600rpm)反應(yīng)16小時(shí)。通過使用恒ph器(加入0.5MNaOH)將pH維持在大約8.5-9.0。將產(chǎn)物相對(duì)于MQ水透析3x3h(4°C，7L，MWCO12-14,000Da),冷凍并凍干。實(shí)施例12.不同的低-MWASAHA衍生物(14kDa)進(jìn)行十一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)，其中用五種不同的ASA(ASA名稱、結(jié)構(gòu)和縮寫參見圖3)以兩種不同的HA:ASA摩爾比例(l:l和IO:I)修飾LMWHA(14kDa)。通過透析純化所得的產(chǎn)物以除去過量的試劑和副產(chǎn)物。通過^NMR光譜基于單體(onmonomerbasis)測(cè)定取代度(DS)。通過重量分析冷凍干燥的樣品來測(cè)定產(chǎn)量。通過SEC-MALLS-VISC測(cè)定分子量。為了避免材料粘在GPC柱上，將自動(dòng)注射器(auto-injector)中的溫度從4。C調(diào)節(jié)到15°C。分析的所有結(jié)果總結(jié)于表2中。表2.制備和表征ASA修飾的LMWHA(14kDa起始材料)的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>(a):14658-148的重復(fù)且按比例縮減的形式。以小部分添加PhSA而不是立即全部加入。(b):DSA的問題-太濃以致于不能以正常攪拌有效分散；在透析過程中形成油相，其必須通過吸取去除和丟棄。(c):雙峰式分布(Bimodaldistribution);第1個(gè)峰15.5kDa,第2個(gè)峰27.2kDa;(*):目前正在分析中。如總結(jié)于表2的結(jié)果所示，當(dāng)較低的DS是預(yù)期結(jié)果時(shí)，衍生化反應(yīng)進(jìn)行更加順利。所得的DS十分類似于所有不同的ASA，除了在水中顯然非常不穩(wěn)定的PhSA，其對(duì)于樣品14658-148得到低DS值(2.19)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其中將PhSA粉逐漸加入HA-溶液。這樣得到15°/。的DS(15286-017),這顯示逐漸加入ASA可為在HA上增加取代的方法。對(duì)于用DSA修飾的LMWHA,在較高的ASA:HA比例，DS值也是非常低的。這可能是由于DSA相的高粘度造成的。此外，在透析和冷凍干燥之后仍然可以看到不反應(yīng)的ASA的小滴。它們必須通過吸液器人工去除?？赡艿?，可通過在與更強(qiáng)的攪拌組合的反應(yīng)過程中增加溫度來改進(jìn)DSA-HA的DS和純度。逐漸增加DSA還可增加與HA反應(yīng)的DSA的量。TpSA樣品(l5286-037和15286-028)還未進(jìn)行分析。通過在雙對(duì)數(shù)標(biāo)度中繪制回轉(zhuǎn)半徑(radiusofgyration)(Rg)相對(duì)于分子量(Mw)的圖，可得到關(guān)于聚合物構(gòu)象的信息。Rg和Mw的關(guān)系總結(jié)于Haug氏三角(Haug，striangle)中(圖4)。對(duì)于所有不同的ASA-HA繪制構(gòu)象圖，并在表2中給出結(jié)果。大部分樣品顯示的因數(shù)(factor)類似于隨機(jī)巻曲(randomcoil),隨機(jī)巻曲也是未修飾的HA的構(gòu)象。僅有的例外是高度修飾的OSA-HA，其具有類似于球體的構(gòu)象，以及也顯示非常低的構(gòu)象因數(shù)(0.20和0.04)的NSA-HA,顯示出聚集或不良的(impaired)柱分離，或許是由于與柱材料的相互作用。類似地，考察來自SEC-MALLS-VISC分析的濃度分布曲線(concentrationprofile)(RI-信號(hào))(參見圖5)，對(duì)于樣品15286-010(11%NSA)在較早的洗脫時(shí)間(在大約35min)存在聚集峰。還通過樣品14658-142(9.7%OSA修飾的HA)和15286-010(11%修飾的NSA-HA)的表觀MW的輕微增加(表2)顯示此聚集現(xiàn)象。總之，用不同的脂族烴基-/芳基琥珀酸酐成功修飾了低MW透明質(zhì)酸(14kDa)。OSA-HA和NSA-HA的高DS產(chǎn)物顯示一些聚集趨勢(shì)和構(gòu)象改變，其可能是由于疏水相互作用引起的。實(shí)施例13OSA-HA(14kDa)在水溶液中表面活性根據(jù)表3中給出的濃度，在MQ-水中制備14kDaOSA-HA(DS:9.7。/。，批號(hào)14658-142)和未修飾的LMWHA(30kDa)的溶液。使用表面張力計(jì)(surfacetensiometer)(Wilhelmy片)在通過表面張力測(cè)量來分析樣品。用同樣的方法測(cè)定溶劑(水)的表面張力為72mN/m。表面張力測(cè)量的結(jié)果在圖6中給出并總結(jié)于表3。可以看出，表面張力隨OSA-HA濃度增加而減小。與純?nèi)軇?MQ-水)和LMW-HA(30kDa)相比，HA書f生物的表面張力4氐得多。此外，可以看出OSA-HA的表面張力以時(shí)間依賴性方式繼續(xù)降低。這可通過OSA-HA作為高M(jìn)W表面活性劑的事實(shí)來解釋，其使用長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)散到溶液的表面(由于擴(kuò)散速度與MW成反比)。表面活性更高的(Moresurfaceactive)聚合物在表面給出較低的表面張力。此時(shí)間依賴性也是OSA部分不僅在溶液中與HA共存而且實(shí)際上共價(jià)連接于HA的進(jìn)一步證據(jù)。這進(jìn)一步暗示HA的OSA修飾并未賦予其疏水性，而賦予其兩親性(amphiphillic)。這些性質(zhì)可能在如下系統(tǒng)中充分利用需要更低的表面張力的系統(tǒng)(例如，局部的眼科系統(tǒng))或需要乳化性質(zhì)使化妝品或藥物制劑中的乳劑或泡沫穩(wěn)定的系統(tǒng)。表3.OSA-HA溶液在MQ-水中在3200秒(second)的表面張力測(cè)量。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實(shí)施例14.通過高剪切混合制備高M(jìn)WASA衍生物將HA(4g,MAG30021)過夜溶于400mLMQ水。將溶液保持在室溫(25。C)或加熱到60。C,然后在剪切(ULTRA-TURRAX24000min'1，5min)下加入Na2C03(2g)。然后根據(jù)表4中提供的反應(yīng)方案加入ASA并在強(qiáng)剪切(ULTRA-TURRAX24000min"，5min)下混合。使得到的乳劑在給定的溫度(表4)反應(yīng)6小時(shí)，然后移至室溫過夜。將pH調(diào)節(jié)到中性，然后通過超濾和凍干。NMR光譜證實(shí)所有的產(chǎn)物均被修飾。所有樣品都得到在O.lMNaCl中濃度為1%w/v的混濁溶液。表4.用于制備高M(jìn)WASA-衍生物的反應(yīng)方案<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>ODSA:十八烯基琥珀酸酐，HDSA:十六烯基琥珀酸酐，DSA:十二烯基琥珀酸酐。實(shí)施例15.ASAHA穩(wěn)定O/W乳劑根據(jù)如下配方，將實(shí)施例14中制備的ASA-HA編號(hào)1，3，4，5，6，7和未修飾的HA(MAG30014)與三種化妝油(礦物油(mineraloil)、碳酸二乙基己酯(diethylhexylcarbonate)和棕櫚酸乙基己酯(ethylhexylpalmitate))酉己制在一起1.將6mL油加入14mL0.1MNaCl和0.29。/。ASA-HA的水溶液2.在強(qiáng)剪切(ULTRA-TURRAX在24000min一)下將所述溶液混合25秒。3.將乳劑在室溫在黑暗中保持8周，在24小時(shí)和8周后通過目視評(píng)價(jià)穩(wěn)定性。所有衍生物與對(duì)照和未修飾的起始HA相比顯示增加的乳劑穩(wěn)定性(參見圖7棕櫚酸乙基己酯的24小時(shí)和8周后的樣品)。這顯示可將ASA-HA用作化妝品中的乳劑或基于乳劑的高級(jí)給藥系統(tǒng)(advanceddrugdeliverysystem)。實(shí)施例16.具有長(zhǎng)脂族烴基鏈的各種低-MWASAHA衍生物如用于高M(jìn)WHA的實(shí)施例15所述制備低MWASAHA,僅有的差別是HA(23kDa)的起始濃度為2%w/v。表5中所有樣品在60。C制備并通過超濾(MWCO3000kDa)和凍干進(jìn)行純化。如實(shí)施例6所述，通過&NMR光i普測(cè)定DS。表5.制備具有較長(zhǎng)脂族烴基鏈的低MWHA衍生物的反應(yīng)方案。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實(shí)施例17.苯基琥珀酸的自由基清除性質(zhì)(Freeradicalscavengingproperties)通過掃描照相機(jī)(streakcamera)觀察和光散射(lightscattering)(DLS/SLS)研究監(jiān)測(cè)，已顯示在羥基(hydroxylradical)(通過012+/11202產(chǎn)生)存在下，水溶液中的PhSA-HA(14kDa)(10mg/ml)比未修飾的HA降解快得多。這顯示PhSA-HA具有作為自由基清除劑可能用于化妝品制劑的潛力。實(shí)施例18.測(cè)定辛烯基琥珀酸酐-透明質(zhì)酸衍生物(OSA-HA，DS16%)的臨界聚集濃度(criticalaggregationconcentration)(CAC)使用等溫滴定(isothermaltitration)量熱計(jì)VP-ITC(MicrocalLLC,USA)通過量熱法(calorimetry)OSA-HA衍生物的臨界聚集濃度(CAC)。使用OSA-HA的濃縮溶液(0.294mL,15mg/mL溶于蒸餾水)滴定(titrate)量熱計(jì)樣品池中的蒸餾水(1.4615mL)。每300秒注入OSA-HA的溶液(2^L,15mg/mL),并如圖8所示隨時(shí)間記錄樣品池中的焓變(AH)。將AH繪制為樣品池中OSA-HA濃度的函數(shù)，并在曲線的轉(zhuǎn)折處(atthebreakofthecurve)測(cè)定OSA-HA的CAC。每個(gè)實(shí)-瞼重復(fù)三次并將CAC作為平均值提供。例如，取代度(DS)為16%的OSA-HA的CAC為0.45mg/mL(圖9)。此研究證實(shí)OSA-HA的結(jié)合性(associativeproperties)的存在。而且，顯示可能將這些衍生物配制成微團(tuán)和/或微粒/納米粒子，這使它們適用于膠嚢化(encapsulation)和遞送疏水的化合物，如疏水的化妝品生物活性劑和藥物。實(shí)施例19.測(cè)定辛烯基琥珀酸酐-透明質(zhì)酸衍生物(OSA-HA，DS44%)的臨界聚集濃度(CAC)使用以水浴(JulaboF10，Merck，UnitedStates)恒溫的熒光分光光度計(jì)(FluoroMax，Spex,UnitedStates),通過熒光光譜測(cè)定取代度為44°/。的OSA-HA的CAC。使用尼羅紅(NileRed)作為熒光探針。對(duì)于在不同的磷酸鹽緩沖液(表7)中制備的一定范圍的OSA-HA溶液(表6)測(cè)量熒光。表6:OSA-HA溶液溶液OSA-HA濃度(mg/mL)1O扁l20.0002<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>將尼羅紅(3.184mg)溶于THF和丙酮的混合物(50/50,10mL)。在攪拌、過夜、黑暗和室溫的條件下將此溶液(IOpL)與各OSA-HA溶液(IOmL)溫育。在25。C在543nm的激發(fā)波長(zhǎng)(excitationwavelength)分析各溶液，同時(shí)記錄580至700nm的發(fā)射光譜(emissionspectra)。激發(fā)狹縫設(shè)為1并對(duì)于各溶液調(diào)節(jié)發(fā)射狹縫。熒光發(fā)射(I)的強(qiáng)度繪制為波長(zhǎng)(X)的函數(shù)。通過相對(duì)于人用六次多項(xiàng)式函數(shù)擬合曲線I來測(cè)定對(duì)應(yīng)于最大強(qiáng)度的波長(zhǎng)(入max)。每個(gè)Xmax值是三次測(cè)量的平均值。為了測(cè)定CAC，將Xmax繪制為聚合物濃度(C)的函數(shù)。在Xmax相對(duì)C的曲線的轉(zhuǎn)折點(diǎn)(inflexionpoint)推斷CAC(圖10)。在圖10，OSA—HA(DS=44%)的CAC為0.003-0.004mg/mL中的某處。而未修飾的HA觀察不到此現(xiàn)象。實(shí)際上，在任何HA濃度都檢測(cè)不到熒光，這表示不可能在HA溶液中使尼羅紅增溶(solubilize)。這證明了在OSA-HA溶液中聚合裝閨己體(polymericassemblies)的存在。實(shí)施例20.鹽濃度對(duì)OSA-HA(DS=44%)的CAC的影響使用與前面實(shí)施例中所述相同的實(shí)驗(yàn)配置(set-up)來研究鹽濃度對(duì)OSA-HA(DS=44%)的CAC值的影響。結(jié)果示于下表8以及圖11中。表8.<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實(shí)施例21.OSA—HA(DS=44%)聚合微團(tuán)的；電勢(shì)(zetapotential)通過與多普勒激光干涉儀(Dopplerlaserinterferometer)偶4關(guān)的毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis)(Zetasizer3000HS,Malvem，英國(guó))測(cè)定OSA-HA(DS=44%)聚合微團(tuán)的；電勢(shì)。在25。C記錄測(cè)量結(jié)果。在測(cè)量之前將OSA-HA溶于10-3MNaCl(濃度為1mg/mL)。將OSA-HA(DS=44%,在10-3MNaCl中為1mg/mL)的；電勢(shì)確定為大約-25mV(圖12)。實(shí)施例22.OSA-HA(DS=44%)聚合微團(tuán)的透射電子顯微術(shù)(Transmissionelectronmicroscopy),使用透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope)(EM410，Philips,荷蘭)進(jìn)行OSA-HA(DS=44%)聚合微團(tuán)的顯微觀察(Microscopicobservation)。將樣品沉積(deposit)在離子化的碳涂覆的銅網(wǎng)(ionisedcarboncoatedcoppergrids)上并用乙酸雙氧鈾(uranylacetate)水溶液(2。/o)染色。顯微快照(Microscopicsnapshot)明確顯示OSA-HA聚合孩t團(tuán)是球形的并具有通常為50至200nm的亞微粒尺度(數(shù)據(jù)未顯示)。這示于圖13。權(quán)利要求1.一種透明質(zhì)酸衍生物，其包含n個(gè)重復(fù)單元并在pH8-9具有結(jié)構(gòu)通式(I)id="icf0001"file="S2006800354457C00011.gif"wi="121"he="29"top="51"left="50"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中在至少一個(gè)重復(fù)單元中，R1、R2、R3、R4中的一個(gè)或多個(gè)包含在pH8-9具有結(jié)構(gòu)通式(II)的酯鍵合的(esterbound)脂族烴基-/芳基-琥珀酸，否則R1、R2、R3、R4是羥基OHid="icf0002"file="S2006800354457C00012.gif"wi="68"he="27"top="110"left="56"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中R5、R6、R7、R8中的至少一個(gè)包含脂族烴基或芳基，否則R5、R6、R7、R8是氫原子H，而且其中標(biāo)記“酯”的氧參與與結(jié)構(gòu)(I)形成的酯鍵。2.權(quán)利要求1的透明質(zhì)酸衍生物，其中R1、R2、R3、R4中的兩個(gè)或更多個(gè)包含一個(gè)或多個(gè)在pH8-9具有結(jié)構(gòu)通式(11)的酯鍵合的脂族烴基-/芳基-琥珀酸。3.權(quán)利要求1或2的透明質(zhì)酸衍生物，其中Rl、R2、R3、R4中的三個(gè)或更多個(gè)包含一個(gè)或多個(gè)在pH8-9具有結(jié)構(gòu)通式(11)的酯鍵合的脂族烴基-/芳基-琥珀酸。4.詩又利要求1-3中任一項(xiàng)的透明質(zhì)酸書f生物，其中R5、R6、R7、R8中的至少一個(gè)包含脂族烴基，優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少兩個(gè)包含脂族烴基，更優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少三個(gè)包含脂族烴基。5.權(quán)利要求4的透明質(zhì)酸衍生物，其中所述脂族烴基包含C廣C2o脂族烴基，優(yōu)選丙基、2-辛烯基、2-壬烯基、2-十二烯基、2-十六烯基或2-十八烯基。6.權(quán)利要求4的透明質(zhì)酸衍生物，其中R5、R6、R7、R8中的至少一個(gè)包含芳基，優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少兩個(gè)包含芳基，更優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少三個(gè)包含芳基。7.權(quán)利要求6的透明質(zhì)酸衍生物，其中所述芳基是苯基。8.權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的透明質(zhì)酸衍生物，其中R5、R6、R7、R8包含兩個(gè)或更多個(gè)不同的脂族烴基和/或芳基，優(yōu)選選自丙基、2-辛烯基、2-壬烯基、2-十二烯基、2-十六烯基、2-十八烯基，和苯基。9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的透明質(zhì)酸衍生物，其平均分子量為800-10，000，000Da;優(yōu)選10,000-1，500，000Da。10.權(quán)利要求9的透明質(zhì)酸衍生物，其平均分子量為10,000-50,000Da。11.權(quán)利要求9的透明質(zhì)酸衍生物，其平均分子量為50，000-500，000Da,優(yōu)選80，000-300,000Da。12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的透明質(zhì)酸衍生物，其中取代度(DegreeofSubstitution)(DS)為0.1-100°/。，優(yōu)選1-卯％，更優(yōu)選2-80%，還更優(yōu)選4-70%，甚至更優(yōu)選8-60%,或10-50%,14-40%,16-30%,或最優(yōu)選18-25%，如本文中的定義測(cè)定的。13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的透明質(zhì)酸衍生物，其中透明質(zhì)酸是重組產(chǎn)生的，優(yōu)選在芽孢桿菌屬宿主中重組產(chǎn)生。14.透明質(zhì)酸衍生物，其中透明質(zhì)酸的一個(gè)或多個(gè)羥基在與一個(gè)或多個(gè)脂族烴基-Z芳基-琥珀酸酐(ASA)的反應(yīng)中被取代，以形成透明質(zhì)酸和所得的一個(gè)或多個(gè)脂族烴基-/芳基-琥珀酸之間的酯鍵。15.權(quán)利要求14的透明質(zhì)酸衍生物，其平均分子量為10，000-1,500，000Da。16.權(quán)利要求15的透明質(zhì)酸衍生物，其平均分子量為20，000-50，000Da。17.權(quán)利要求15的透明質(zhì)酸衍生物，其平均分子量為50，000-500,000Da,優(yōu)選80,000-300,000Da。18.權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)的透明質(zhì)酸衍生物，其中所述一個(gè)或多個(gè)脂族烴基-/芳基-琥珀酸酐(八8八)具有結(jié)構(gòu)通式(111):19.權(quán)利要求18的透明質(zhì)酸衍生物，其中R5、R6、R7、R8中的至少一個(gè)包含脂族烴基，優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少兩個(gè)包含脂族烴基，更優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少三個(gè)包含脂族烴基。20.權(quán)利要求19的透明質(zhì)酸衍生物，其中所述脂族烴基包含C廣C2o脂族烴基，優(yōu)選丙基、2-辛烯基、2-壬烯基、2-十二烯基、2-十六烯基或2-十八烯基。21.權(quán)利要求18的透明質(zhì)酸衍生物，其中R5、R6、R7、R8中的至少一個(gè)包含芳基，優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少兩個(gè)包含芳基，更優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少三個(gè)包含芳基。22.權(quán)利要求21的透明質(zhì)酸衍生物，其中所述芳基包含苯基。23.權(quán)利要求18-22中任一項(xiàng)的透明質(zhì)酸衍生物，其中R5、R6、R7、R8包含兩個(gè)或更多個(gè)不同的脂族烴基和/或芳基，優(yōu)選選自丙基、2-辛烯基、2-壬烯基、2-十二烯基、2-十六烯基、2-十八烯基，和苯基。24.權(quán)利要求14-23中任一項(xiàng)的透明質(zhì)酸衍生物，其中取代度(DS)為0.1-100%,優(yōu)選1-90%,更優(yōu)選2-80%,還更優(yōu)選4-70%，甚至更優(yōu)選8-60%,或10-50%,14-40%，16-30%,或最優(yōu)選18-25°/。，如本文中的定義測(cè)定的。25.權(quán)利要求14-24中任一項(xiàng)的透明質(zhì)酸衍生物，其中透明質(zhì)酸是重組產(chǎn)生的，優(yōu)選在芽孢桿菌屬宿主中重組產(chǎn)生。26.產(chǎn)生透明質(zhì)酸^f汙生物的方法，包括如下步驟(a)在堿性條件下在水溶液中，使透明質(zhì)酸(HA)與一種或多種具有(III)中所示結(jié)構(gòu)通式的脂族烴基V芳基-琥珀酸酐(ASA)反應(yīng)，由此形成所述透明質(zhì)酸書t生物；和(b)回收所述透明質(zhì)酸衍生物。27.權(quán)利要求26的方法，其中(III)中R5、R6、R7、R8的至少一個(gè)包含脂族烴基，優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少兩個(gè)包含脂族烴基，更優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少三個(gè)包含脂族烴基。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述脂族烴基包含CVC2o脂族烴基，優(yōu)選丙基、2-辛烯基、2-壬烯基、2-十二烯基、2-十六烯基或2-十八烯基。29.權(quán)利要求26的方法，其中R5、R6、R7、R8中的至少一個(gè)包含芳基，優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少兩個(gè)包含芳基，更優(yōu)選R5、R6、R7、R8中的至少三個(gè)包含芳基。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述芳基是苯基。31.權(quán)利要求26-30中任一項(xiàng)的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)ASA包含圖3所示的任何結(jié)構(gòu)式。32.權(quán)利要求26-30中任一項(xiàng)的方法，其中R5、R6、R7、R8包含兩個(gè)或更多個(gè)不同的脂族烴基和/或芳基，優(yōu)選選自丙基、2-辛烯基、2-壬烯基、2-十二烯基、2-十六烯基、2-十八烯基，和苯基。33.權(quán)利要求26-32中任一項(xiàng)的方法，其中透明質(zhì)酸的平均分子量為10，000-1，500,000Da。34.權(quán)利要求33的方法，其中透明質(zhì)酸的平均分子量為20,000-50,000Da。35.權(quán)利要求33的方法，其中透明質(zhì)酸的平均分子量為50,000-500，000Da,優(yōu)選80,000-300,000Da。36.權(quán)利要求26-35中任一項(xiàng)的方法，其中透明質(zhì)酸衍生物的取代度(DS)為0.1-100%，優(yōu)選1-90%，更優(yōu)選2-80%，還更優(yōu)選4-70%,甚至更優(yōu)選8-60%，或10-500/。，14-40%,16-30%,或最優(yōu)選18-25%，如本文中的定義測(cè)定的。37.權(quán)利要求26-36中任一項(xiàng)的方法，其中透明質(zhì)酸是重組產(chǎn)生的，優(yōu)選在芽孢桿菌屬宿主中重組產(chǎn)生。38.—種組合物，其包含權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸書f生物和活性成分，優(yōu)選所述活性成分是藥理學(xué)活性劑。39.根據(jù)權(quán)利要求38的組合物，其還包含水溶性賦形劑，優(yōu)選乳糖。40.藥用組合物，其包含有效量的權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物，連同可藥用的載體、賦形劑或稀釋劑。41.藥用組合物，其包含有效量的權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物作為媒介物，連同藥理學(xué)活性劑。42.—種化妝品，其包含權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)S吏衍生物或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物。43.—種化妝品，其包含有效量的權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物作為活性成分。44.衛(wèi)生、醫(yī)藥或外科用品，其包含如權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)所限定的透明質(zhì)酸衍生物或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物；優(yōu)選所述用品是尿布、衛(wèi)生巾、外科海綿、愈傷海綿，或包含于急救繃帶或其它創(chuàng)傷敷裹材料中的部分。45.藥物膠嚢、微膠嚢、納米膠嚢、微球或納米球，其包含如權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)所限定的透明質(zhì)酸衍生物或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物。46.在眼科學(xué)中執(zhí)行程序的方法中的改進(jìn)，其包含使用權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物，或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物。47.在骨關(guān)節(jié)炎治療中執(zhí)行程序的方法中的改進(jìn)，其包含使用權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物，或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物。48.在癌癥治療中執(zhí)行程序的方法中的改進(jìn)，其包含使用權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物，或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物。49.在進(jìn)行透皮施用藥理學(xué)活性劑的方法中的改進(jìn)，其包含使用權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物，或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物。50.在進(jìn)行皮膚施用藥理學(xué)活性劑的方法中的改進(jìn)，其包含使用權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物，或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物。51.在進(jìn)行皮膚施用化妝品的方法中的改進(jìn)，其包含使用權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物，或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物。52.在脫發(fā)或禿發(fā)治療中執(zhí)行程序的方法中的改進(jìn)，其包含使用權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸書f生物，或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物。53.使用權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物的眼科學(xué)方法。54.治療骨關(guān)節(jié)炎的方法，其包括將有效量的權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物施用于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選所述施用是皮膚施用、透皮施用、口服施用或通過注射施用。55.處理創(chuàng)傷的方法，其包含將有效量的權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物或如權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物施用于哺乳動(dòng)物。56.治療脫發(fā)或禿發(fā)的方法，其包括將有效量的權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物施用于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選所述施用是皮膚施用、透皮施用、口l良施用或通過注射施用。57.權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物用于制備治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物的用途。58.權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物用于制備眼科學(xué)治療的藥物的用途。59.權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物用于制備治療癌癥的藥物的用途。60.權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物用于制備處理創(chuàng)傷的藥物的用途。61.權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物用于制備用于血管發(fā)生的藥物的用途。62.權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物用于制備保濕劑的用途。63.權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)限定的透明質(zhì)酸衍生物或權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)限定的組合物用于制備治療脫發(fā)或禿發(fā)的藥物的用途。全文摘要本發(fā)明涉及以芳基-或脂族烴基琥珀酸酐(ASA)修飾透明質(zhì)酸(HA)以產(chǎn)生芳基-/脂族烴基琥珀酸酐HA衍生物(ASA-HA)，涉及這樣的衍生物，并涉及它們的應(yīng)用和用途，尤其是在化妝品和生物醫(yī)學(xué)工業(yè)中的應(yīng)用和用途。預(yù)期所述ASA-HA衍生物具有令人感興趣的性質(zhì)，這些性質(zhì)可用于高級(jí)的配制物(與不修飾的HA相比，更強(qiáng)地結(jié)合于皮膚)，通過包囊(納米/微米膠囊劑)或形成納米/微米球也可能用于活性劑或藥物的遞送系統(tǒng)中。此外，預(yù)期低分子量ASA-HA衍生物比相同分子量的不修飾的HA更有效地透過皮膚。文檔編號(hào)A61K9/50GK101273065SQ200680035445公開日2008年9月24日申請(qǐng)日期2006年9月26日優(yōu)先權(quán)日2005年9月26日發(fā)明者克里斯托弗·托梅拉斯,科琳娜·恩斯庫滕申請(qǐng)人:諾維信生物聚合物公司